Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модифицированные пиримидиновые рибонуклеозиды - ингибиторы РНК-содержащих вирусов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Модифицированные пиримидиновые рибонуклеозиды - ингибиторы РНК-содержащих вирусов"

На правах рукописи

005055539

ИВАНОВ Максим Андреевич

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПИРИМИДИНОВЫЕ РИБОНУКЛЕОЗИДЫ -ИНГИБИТОРЫ РЕПЛИКАЦИИ РНК-СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055539

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской

академии наук.

Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Л.А. Александрова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, заведующая

Лабораторией химии нуклеиновых кислот Химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования науки Московского государственного университета им М.В. Ломоносова. Т.С. Орецкая.

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук. Э.Н. Тимофеев.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский Институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе». РАМН.

Защита диссертации состоится « С » С (¿К <Э 2012 г. в ^ ^ часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32)

^ С

Автореферат разослан « С » И СУ 22012 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

Список использованных сокращений:

БПН - бициклический пиримидиновый нуклеозид; ФПН - фуранопиримидиновый нуклеозид; HCV - вирус гепатита С; BVDV - вирус диареи крупного рогатого скота;

ECso - эфективная концентрация (мкМ), подавляющая репликацию вируса на 50%;

CCso - доза препарата, вызывающая гибель 50% неинфицированных клеток;

IS - индекс селективности (отношение сс50 к ес5о);

Pd[PPh3]4 - тетракис(трифенилфосфин)палладий (0);

Протонная губка -1,8-бис(диметиламино)нафталин;

NHC - ЬҐ-гидроксицитадин;

Ada - Адамантан;

CDI — NjN'-карбонилдиимидазол.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы. Проблема создания эффективных противовирусных средств по-прежнему актуальна. Выявление соединений, способных подавлять репликацию вирусов, не затрагивая процессов жизнедеятельности клеток организма-хозяина, является достаточно сложной задачей. Строгая направленность действия - один из основных критериев в отборе соединений с противовирусной активностью. Модифицированные нуклеозиды удовлетворяют данным требованиям и являются «популярными» объектами исследований. Мишенями их действия могут выступать ферменты: ДНК- и РНК-полимеразы, синтазы, киназы и др, участвующие в метаболизме нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, в том числе. К настоящему времени на основе модифицированных нуклеозидов создано несколько десятков эффективных препаратов для терапии вирусных заболеваний.

Одним из наиболее распространенных и опасных заболеваний человека является гепатит С, вызываемый соответствующим вирусом (HCV). К настоящему времени известно несколько аналогов нуклеозидов, ингибирующих репликацию HCV в культуре клеток, однако пока единственным разрешенным лекарственным препаратом нуклеозидной природы, применяемым в терапии гепатита С, остается препарат широкого спектра действия - рибавирин (Virazole®), который, несмотря на его достаточно высокую токсичность, используется в комбинации с интерфероном а. Таким образом, создание новых соединений, эффективно подавляющих репликацию HCV, является весьма актуальной задачей.

Целью работы явился синтез и изучение свойств потенциальных ингибиторов HCV, BVDV и вирусов оспы на основе нуклеозидов, модифицированных как по нуклеиновому основанию, так и по углеводному остатку.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- разработка рациональных методов синтеза трех классов модифицированных нуклеозидов: бициклических фурано- и пирролопиримидиновых рибонуклеозидов, производных Ы4-гидроксицитидина, производных 4'-фторрибонуклеозидов пиримидинового ряда;

- испытание полученных соединений в качестве потенциальных ингибиторов репликации вирусов: HCV в системе репликона, BVDV в инфицированных клетках коронарных сосудов теленка и вирусов семейства оспы в культурах клеток Vero и МК-2;

- синтез трифосфатов указанных выше модифицированных нуклеозидов;

- исследование субстратных и ингибиторных свойств нуклеозид трифосфатов в отношении нуклеотид-зависимых ферментов HCV .

Научная новизна н практическая значимость работы. Оптимизированы разработанные ранее методы получения модифицированных нуклеозидов. Впервые синтезированы фуранопиримидиновые нуклеозиды рибо-ряда, отработана одностадийная методика получения БПН; разработан удобный метод синтеза пирролопиримидиновых нуклеозидов. Модифицирована схема синтеза 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденуридина с увеличением общего выхода с 19% до 37%. Впервые проведен химический синтез трифосфатов БПН. Осуществлен дизайн и синтез депо-форм 4'-фторуридина. В ходе работы синтезировано 31 новое соединение, структура которых подтверждена данными УФ- и ЯМР-спектроскопии.Проведенная модификация методик имеет практическую значимость, поскольку существенно упрощает синтезы биологическиактивных нуклеозидов. Среди синтезированных производных нуклеозидов выявлены ингибиторы репликации in vitro вирусов гепатита С, бычьей диареи и оспы. Показано, что трифосфат 4'-фторуридина является эффективным ингибитором РНК-полимеразы HCV и субстратом хеликазной и ЫТРазной реакций, катализируемой ферментом NS3 HCV, полученные данные внесут определенный вклад в создание новых противовирусных препаратов.

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на конференции: XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Bern, Switzerland,

2006 г.); Humboldt-kolleg conference: Technologies and threats of the 21st century (Chisinau, Moldova, 2006 r); International Conference for Young Scientists and Ph.D. Students on Molecular Biology and Genetics (Kiev, Ukraine, 2007 г.); International conference Biocatalysis-

2007 (Moscow - St.Peterburg, Russian Federation, 2007 г.); XVIII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Kioto, Japan 2008 г.); XIX International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Lyon, France, 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 7 тезисов.

Объем диссертации. Диссертация изложена на _ страницах и состоит из

введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной

части и выводов. Материал иллюстрирован _ таблицами, _ рисунками и _

схемами. Список цитированной литературы включает_наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 05-04-49492, 08-04-00549), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Международного научно-технического центра (№1989).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Как указывалось выше, к настоящему времени единственным утвержденным анти-HCV препаратом нуклеозидной природы является рибавирин (в комбинации с интерфероном а). Среди наиболее привлекательных мишеней действия противогепатитных агентов можно выделить два неструктурных белка: РНК-зависимые ферменты HCV - РНК-зависимую РНК-полимеразу (белок NS5B) и протеиназу/хеликазу/ЫТРаза (NS3). В настоящее время известно значительное число ингибиторов данных ферментов, в том числе и нуклеозидной природы. Однако эффективность этих соединений или невелика, или они токсичны, поэтому создание новых ингибиторов ферментов HCV по прежнему актуально.

В последние годы синтезировано значительное число бициклических производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов и изучена их противовирусная активность [McGuigan С., et al, J. Med. Chem. 1999, 42, 4479; Sienaert Я, et al, J. Antimicrob. Chemotherapy. 2002, 50, 5]. В инфицированных культурах клеток эти соединения эффективно подавляли репликацию ДНК-содержащего вируса варицелла-зостер, значительно превышая активность антигерпетического препарата ганцикловира. Наилучшую активность проявил 3-(дезокси-(3-£)-рибофуранозил)-6-р-пентилфенил-2,3-дигидрофурано[2,3-г/]пиримидин-2-он. Его ЕС50 по отношению к вирусу варицелла зостер составляло менее 1 нМ и значение IS примерно 106 [Luoni G., et al, BioOrg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3791].

В то же время анализ литературных данных показал, что бициклические рибонуклеозиды подобного типа практически не описаны. Представлялось целесообразным осуществить синтез ряда новых бициклических фурано- и пирроло[2,3-¿]пиримидиновых рибонуклеозидов для проверки их активности как ингибиторов репликации вируса гепатита С в системе HCV-репликона и вируса диареи крупного рогатого скота (BVDV), являющегося суррогатной моделью HCV. Для изучения взаимодействия полученных нуклеозидов с нуклеотид-зависимыми ферментами HCV (белков NS5B и NS3) был произведен синтез соответствующих 5'-0-трифосфатов.

Получение 6-замещенных 3-(В-Р-г>ибо<ЬуранозилУ2,3-дигидро<Ьурано[2,3-</]пиримндин-2-онов (3aV(3g). На схеме 1 представлены методы получения ФПН, апробированные в данной работе. Первоначально применялись схемы, описанные в работе К. МкГьюгана [McGuigan С., et al, J. Med. Chem. 1999, 42, 4479] (методы А и В). Ключевыми стадиями синтеза являлись замещение йода на алкин при катализе Pd(0) и Cul и последующая циклизация полученного (5-алкинил)уридина (2) в присутствии избытка Cul и Et3N с образованием соответствующего ФПН (3). Этот синтез можно проводить как

с выделением промежуточного алкинированного нуклеозида (метод В), так и без его выделения. .

Метод Б (гетерогенный катализ), предложенный Толстиковым [Толстиков Г.А., и др., Известия АН. Сер. Хим. 1993, 596] выгодно отличается от метода А, поскольку 10% Рс1/С (палладий на угле) значительно дешевле Рс1[РРЬз]4, причем процесс можно проводить в одну стадию. Если при синтезе по методу А реакция проходила при температуре 70'С примерно за сутки, то по методу Б для полного превращения исходного вещества было достаточно 1.5 часа. Оптимальным растворителем в методе Б оказался ацетонитрил.

Схема 1.

ОН он (За-с, e-f)

(2): R= а) С6Н|3, Ь) СЮН21, с) С12Н2;, d) С6Н5;

(3): R = а) С6Н,з, Ь) С10Н21. с) С,2Н25, d) С6Н5, е) С5НП, f) СН2ОС(С6Н5)3; g); СН2ОН

Метод А: (i), затем(н), Метод Б: (i/i), Метод В: (2), (ív). /: DMF, 1-алкин, Pd(PPh3)2CI2, Cul, Et3N, 20°C, 18 ч; //: Cul, Et3N, 70°C, 5 ч; //ï: Pd/C, Cul (кат ), CH3CN, Et3N, кипячение 1.5 ч; /V: Cul (кат.), MeOH, Et3N, кипячение; v: CH3COOH, 37 °C, 12 ч.

Таким образом, наиболее удобным и экономичным оказался метод Б. Выходы одностадийной реакции по Толсгикову превышали таковые по методам А и В на 15%. В результате нами был синтезирован широкий набор ФПН.

Следующим этапом работы явился синтез пирролопиримидиновых нуклеозидов, который проводился в соответствии со схемой 2. В работе [Janeba Z, et al, i. Med. Chem. 2005, 48, 4690] замещение кислорода в фуранозном цикле фуранопиримидиновых ациклических нуклеозидов на NH-группу проводили нагреванием в запаянных ампулах с

ЫНз/МеОН. Нами было обнаружено, что такое замещение можно проводить в водном растворе при комнатной температуре, что методологически значительно проще и безопаснее.

(4) (3) ^

<: 25% водный Ш3, МеОН, 20°С, 24 ч; П: 40% водный Ш2СН3, МеОН, 20°С, 24 ч.

Синтез >}7-метилпирроло[2,3-йГ]пиримидинового нуклеозида (5) осуществляли взаимодействием ФПН (3) с М-метиламином в водно-метанольном растворе при комнатной температуре (схема 2). В данном случае реакция протекала значительно медленнее, чем при получении нуклеозида (4), выход соединения (5) составил 52%. Структура синтезированных соединений подтверждена УФ-, 'Н- и 13С-ЯМР-спектрами.

Ниже приведены 'Н-ЯМР фрагменты спектров 5-тетрадецинилуридина (2с) (Рис 1) и полученного из него фуранопиримидина 3-(р-0-рибофуранозил)-6-додецил-2,3-дигидрофурано-[2,3-£/]пиримидин-2-она (Зс) (Рис 2).

В спектре соединения (2с) присутствуют характерные сигналы 5-замещенного пиримидинового основания: 11.50 м.д. (синглет) протона >1Н-группы и 8.13 м.д. (синглет) протона при 6-ом атоме углерода. В спектре (Зс) указанные сигналы не наблюдаются; однако, присутствует синглет протона Н4 при 8.77 м.д., принадлежащий пиримидиновому циклу, и синглет Н5 при 6.40 м.д., принадлежащий менее электронодефицитному фурановому кольцу. Представляет интерес расположение сигналов ОН-групп рибозного фрагмента 5-тетрадецинилуридина (2с): 5.31 м.д. (1Н, д, 2'-ОН), 5.10 м.д. (1Н, т, 5'-ОН), 4.99 м.д. (1Н, д, З'-ОН) и 3-(Р-0-Рибофуранозил)-6-додецил-2,3-дигидрофурано-[2,3-й(]-2-она (Зс): 5.46 м.д. (1Н, д, 5'-ОН), 5.19 м.д. (1Н, т, 5'-ОН), 4.97 м.д. (1Н, д, З'-ОН). Такая последовательность сигналов необычна. Как правило, 2'-ОН группа находится в слабом поле (слева) относительно З'-ОН и 5'-ОН групп. Сигнал 5'-ОН группы расположен в сильном поле (справа) и между ними сигнал З'-ОН. Обычно, в отсутствие обьемных заместителей в положениях 5 и 6 пиримидинового кольца, основание занимает чаще антиположение, в котором кислород при 2-ом атоме углерода не «нависает» над углеводным остатком. Однако, в случае наших соединений, объемный заместитель при С6 и

фурановый цикл вероятно разворачивают пиримидиновое основание в син-положение. В результате 02-группа пиримидинового основания оказывает влияние на 5'-углеродный атом углеводного остатка и, как следствие, уменьшает электронную плотность на атоме водорода 5'-гидроксила.

Нб

NH,

Н1;

5'-ОН

±

¡'-ОН

-'-OR

Рис 1. Фрагмент 'Н-ЯМР спектра. 5-Тетрадецинилуридин (2с).

Н4

!»

О.

<< ON

ч-i

I Iii

H5

Hl'

S'-OH

З'-ОН

JuiLtta

Рис 2. Фрагмент Н-ЯМР спектра. 3-(Р-Д-Рибофуранозил)-6-додецил-2,3-дигидрофурано-[2,3-d]-2-OHa (Зс).

Ингибнрование репликации HCV и BVDV фурано- и пирроло|2,3-</| пирнмиднновыми нуклеозидами. Фурано- и пирролопиримидиновые нуклеозиды были испытаны в нашей лаборатории как потенциальные ингибиторы репликации HCV в системе репликона вируса HCV по методу [Lohmann V., et al, Science. 1999, 285, 110]. Испытания на вирусе BVDV проведены в НПО "Вектор" по методу [Baker R.O., // Antiviral

Res. 2003, 57, 13]. Вирус BVDV относится, как и HCV, к флавивирусам и имеет сходную репликацию в клетке. Соединения (За), (Зс - Зе), (4) и (5) оказались неактивны в системе репликона вируса HCV и не обладали цитотоксичностью в концентрации до 500 мкМ в культуре гепатоцитов человека Huh7. Лишь бициклический нуклеозид (ЗЬ), содержащий протяженный алкильный заместитель (R = С10Н21), проявил умеренную анти-HCV-активность (ЕСзо~25 мкМ) в отсутствие заметной токсичности (СС5О>500 мкМ). Следует отметить, что известные в литературе ингибиторы репликации HCV - 2'-метил- и 4'-азидоцитидины обладали на порядок более высокой активностью в системе репликона HCV [Klumpp К., et al, Biol. Chem. J. 2006, 281, 3793]. Тот же 3-(Р-£>-рибофуранозил)-6-децил-2,3-дигидрофуро-[2,3-;/]пиримидин-2-он (ЗЬ) эффективно (ЕС50 1.9 мкМ) подавлял репликацию BVDV в культуре клеток коронарных сосудов теленка. На рис. 3 представлены результаты типичного эксперимента по проверке активности соединений (2Ь) и (ЗЬ) по отношению к BVDV. Как можно видеть, в этой системе исходный для синтеза (ЗЬ) 5-додецинилуридин (2Ь) продемонстрировал на порядок меньшую активность и значительную токсичность.

I ю

Концентрация, мкг/мл

Рис.3. Данные типичного эксперимента по проверке активности соединений против BVDV, штамм БТ-1 в культуре клеток коронарных сосудов теленка. Данные анализировали с помощью программы SoftMax (версия 4.0, Molecular Devices, Menlo Park, USA) (1) и (2) - активность и токсичность ЗЬ , (3) и (4) — активность и токсичность 2Ь, соответственно.

Синтез 5'-трифосфатов фурано- и пирроло[2,3-</1пиримидиновых нуклеозидов.

Механизм противовирусного действия большинства аналогов нуклеозидов включает их превращение в нуклеозид 5'-трифосфаты при действии нуклеозид- и нуклеотидкиназ с дальнейшим встраиванием в З'-конец вирусной ДНК или РНК, что приводит к ингибированию репликации вируса [De Clercq Е., Biochim. Biophys. Acta. 2002, 1587, 258]. ДНК- и РНК-полимеразы клеток эукариот и вирусов обладают различной субстратной

специфичностью и сродством к модифицированным нуклеозид трифосфатам. Это обстоятельство является одним из основных факторов, обеспечивающих избирательность антивирусного действия аналогов нуклеотидов, что, в конечном счете, делает перспективным синтез новых терапевтически значимых соединений этого класса [De ClercqE., Naí. Rev. Drug Discov. 2002, 1(1), 13]. Поэтому представлялось целесообразным синтезировать ряд 5'-0-трифосфатов полученных нуклеозидов для исследования их субстратной специфичности в отношении нуклеотид-зависимых ферментов HCV (Схема 3).

Схема 3.

он он (4)

\ /

V

НО - Р - О - Р - О - Р - о I I I

он он он

НО-Р-О-Р-О I I

он он

он он (5)

000

II II II

НО - Р - О - Р - О - Р - о

1 I I

он он он

■СЛ-

ОН он (6)

(3), (7): Я = СбНіз (а); СН2ОН (8).

і: 1) РОСІЗ, протонная губка, (ЕЮ)3РО, 4°С, 1 ч, 2) (Ви3МН)2Н2Р207, ОМИ, 20°С, 20 мин.

При синтезе 5'-<9-трифосфатов (6), (7а), (7%) и (8) бициклических нуклеозидов (схема 3) мы столкнулись с определенными трудностями, так как нуклеозиды (3)-(5) -довольно лабильные соединения. Ранее химический синтез подобных соединений в литературе описан не был. Фосфорилирование нуклеозида (За) с помощью РОСЬ в триэтилфосфате привело к разрушению гетероциклического основания. Мы

синтезировали трифосфаты (7а), (7g) и (8) действием РОС13 в триэтилфосфате в присутствии «протонной губки» (1,8-бис(диметиламино)нафталина) с последующей конденсацией с трибутиламмониевой солью пирофосфорной кислоты по методу, разработанному Т.Ковач [ÄTovaos Т., Otvos, L. Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4525]. Выходы составляли 5-14%. Даже в столь мягких условиях получить трифосфат (6) пирролопиримидинового нуклеозида (4) нам не удалось.

В результате были синтезированы трифосфаты нуклеозидов с выходами: 8% для (7а); 14% для (7е); 5% для (8). Структура синтезированных соединений была подтверждена УФ-, 'Н- и 31Р-ЯМР-спектрами. В jlP- спектрах соединений (7а), (7g) и (8) наблюдаются три сигнала Рр; Ра и Ру в диапазоне (-22 м.д) - (-8 м.д.), характерные для трифосфатной группы.

Субстратные свойства 5'-0-трифосфатов фурано- и пирроло|2,3-<Я пиримидиновых нуклеозидов по отношению к ферментам HCV: NS5B и NS3. Субстратные свойства трифосфатов (7а), (7g) и (8) были изучены в нашей лаборатории по отношению к РНК-зависимой РНК-полимеразе (белок NS5B) и NTP-зависимой NTP-азе / хеликазе (белок NS3 [Locatell G.A., et al, J. Mol. Biol. 2001, 313, 683; Borowski P., et al, Antiviral Res. 2002, 55, 397]). Реакции элонгации, катализируемые РНК-зависимой РНК-полимеразой HCV, проводили по методу [Maag D., et al, J. Biol. Chem. 2001, 276, 46094], используя в качестве праймер-матричного комплекса самокомплементарный рибоолигонуклеотид.

Было показано, что РНК-полимераза HCV не способна включать монофосфатный остаток синтезированных бициклических нуклеотидов в состав праймера. В то же время данный фермент проявлял высокую активность по отношению к контрольному 4'-азидоуридин-5'-трифосфату (Рис. 4).

5'GCAUGGGCCC3'

3'CCCGGGUACG5'

■n+2 n+1 ■n

1 2 зТТ 6 ~7 8 9 [0 11 12 M

Рис.4. Элонгация праймера в присутствии ATP (1-3), ATP и UTP (4-6), ATP и 4'N3UTP (7-9), ATP и соединение (7a) (10-12). Концентрация субстратов составляла 20 (1, 4. 7, 10), 50 (2, 5, 8, 11) и 100 мкМ (3, 6, 9, 12). Концентрации АТР в пробах 412 100 мкМ. М - исходный олигонуклеотид. Над гелем - структура праймера

Другим ферментом HCV, субстратами которого могут выступать рибо- и 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты, является белок NS3, обладающий тремя видами активности - сериновой протеиназы, РНК-хеликазы и NTP-азы. Для характеристики субстратных свойств аналогов NTP трифосфаты (7а), (7g) и (8) были инкубированы с белком NS3. Было показано, что все три трифосфата являются эффективными субстратами NTP-азы, лишь немного уступая природному UTP.

Суммируя приведенные данные, можно сделать заключение, что ингибирование репликации HCV бициклическими фурано- и пирролопиримидиновыми нуклеозидами не связано с ингибированием нуклеотидзависимых ферментов HCV: белков NS5B (РНК-зависимой РНК-полимеразы) и NS3 (NTP-зависимой РНК-хеликазы).

Синтез и биологическая активность производных 1\4-гилрокснцитндниа. В 2003 году появилось сообщение о том, что Ы4-гидросицитидин (NHC, 9) и его 2'-фторпроизводное проявляют высокую противовирусную активность. Гидроксицитидин подавлял репликацию вируса атипичной пневмонии SARS [Barnard D.L., et al, Antivir. Chem. Chemother. 2004, 15, 15], a также ряда флавивирусов, к которым относятся вирусы BVDV и HCV [Stuyver L.J., et al, Antimicrob. Agents and Chemother. 2003, 47, 244]. Представлялось целесообразным провести синтез ряда новых производных NHC и проверить их действие в культурах клеток, инфицированных HCV, и различными вариантами вирусов оспы.

i: BzCl, Ру; и: PivCl, Ру; Ш: адамантан-1-карбоновая кислота, DMF, CDI; iv: трифенилуксусная кислота, DMF.

Схема 4,

он он

(12)

ОН он

(13)

Было предположено, что введение в NHC молекулу гидрофобных групп ацильного типа может улучшить проникновение полученных производных внутрь клетки.

Синтез Ы4-ацилы1ых производных NHC (10-13) проводили ; в соответствии со схемой 5. Конденсировали NHC (9) в пиридине при О'С с небольшим избытком соответствующего ацилхлорида или имидазолида трифенилуксусной или адамантилкарбоновой кислот. Ранее было показано [Merles М.Р., et al, Chem. Commun. 1968, 33, 3304], что введение заместителей в М4-положение гетероциклического основания ]Ч4-гидрокси-6-азацигидина приводило к образованию только О-модифицированных производных. Как и предполагалось, реакционная способность гидроксила при атоме азота NHC за счет а-эффекта оказалась значительно выше, чем у гидроксильных групп рибозы. Структура соединений (10 -13) подтверждена УФ и 'Н-ЯМР-спектрами.

М4-Гидроксицитидин (9) и его Ы4-0-пивалоилыюе производное (11) были испытаны в нашей лаборатории как потенциальные ингибиторы репликации HCV в системе репликона. Активность (9) оказалось невысокой (ЕС50 =18 мкМ), при этом он проявлял цитотоксичность в концентрации 100 мкМ в культуре гепатоцитов человека Huh7. Ы4-0-Пивалоильное производное (11) оказалось в 3 раза менее активно (ЕС50 = 50 мкМ) и в те же 3 раза менее токсично (СС50 = 320 мкМ).

Таблица 1. Антивирусная активность и цитотоксичность производных NHC (9,10 -13) на культурах клеток Vero и МК-2.

Соединение Клеточная культура СС50 мкМ VV МРУ СРУ

ЕС50 мкМ IS ЕС;о мкМ IS ЕС50 мкМ IS

9 Vero 50 8,9 5,6 10,1 5 14 3,6

МК-2 77 15,1 5,1 5 15,3 13,9 5,76

10 Vero 165 4,1 40,2 7,9 20,7 19,7 8,4

МК-2 275 2,7 102 2,3 118 4,8 57,5

11 Vero 175 2,6 67 8,4 21 18 9,7

МК-2 480 4,7 103 2,6 186 6,7 77

12 Vero 31 6,7 4,7 4,6 6,7 5 6,2

МК-2 102 7,3 13,1 11,4 8,9 31,6 3,2

13 Vero 23 1,3 17,7 2,9 8,2 6,4 3,6

МК-2 47 1,4 34 4 11,7 22,5 2,1

Цидофавир Vero 360 44,1 8,1 37,6 9,5 47,7 7,5

МК-2 360 83,5 4,3 112,2 3 298,7 1,2

УУ - вирус осповакцины, МРУ - вирус оспы мышей, СРУ - вирус оспы коров

Известно, что вирус оспы содержит широкий набор ферментов, катализирующих процессы синтеза ДНК, РНК и белков [Knipe D.M., Fields virology, 2007, 2911]. В литературе сообщается, что рибопроизводные нуклеозидов подавляют репликацию вирусов семейства оспы [Капе М Е., Shuman S. J. Virol. 1995, 69, 6352; Baker R.O., et al, Antiviral. Res., 2003,57, 13].

Изучение противовируснрго действия NHC (9) и его производных (10 - 13) было проведено в культурах Vero и МК-2, инфицированных вирусами семейства оспы. Было установлено, что NHC (9) эффективно подавлял репликацию вирусов оспы человека (ECj0 = 1,26 мкМ). Ацильные производные NHC (10 - 13) наряду с незамещенным NHC (9) исследовали как ингибиторы репликации вирусов оспы коров, мышей и вируса осповакциниы (Табл. 1). Противовирусные свойства М4-(0-ацил)-ШС (10 - 13) оказались значительно лучше, чем у исходного NHC (9) и известного противооспенного препарата цидофавира для трех штаммов вируса семейства оспы. Синтезированные соединения оказались малотоксичными для культур клеток Vero и МК-2, их токсичность заметно ниже, чем у NHC (9), а антивирусная эффективность выше, в особенности у N4-(0-бензоил)-гидроксицитидина (10) и М4-(0-пивалоил)-гидроксицигидина (11).

Концентрация мкг/мл

Рис.5. Данные типичного эксперимента проверки активности соединения (10) против различных видов вируса оспы в культуре клеток МК-2. Данные приведены для одного цикла репликации. (1) активность соединения против вируса оспы коров (СРУ), (2) - оспы мышей (МРУ), (3) - вируса осповакцины (УУ), (4) - токсичность.

Синтез и биологическая активность пиримидиновых 4'-фториуклеозидов и 5'-

трифосфата 4'-фторуридина. В последнее время осуществлены синтезы

рибонуклеозидов, подавляющих репликацию вируса гепатита С в системе репликона in vitro, среди которых одним из наиболее эффективных оказался 4'-азидоцитидин (14), (ЕС5о = 1.28 мкМ) [Klumpp К., et al, J. Biol. Chem. 2006,28].

В работах [Clark J. L„ et al, J. Med. Chem. 2005, 48, 5504; Meier C„ et al, J. Med. Chem. 1999, 42, 1615] показано, что нуклеозиды содержащие фтор в углеводном остатке хорошо фосфорилируются клеточными киназами и могут быть субстратами ДНК- и РНК-полимераз. Последовательное фосфорилирование нуклеозидов приводит к их 5'-трифосфатам с дальнейшим встраиванием последних в З'-конец вирусной ДНК или РНК, что приводит к ингибированию репликации вируса.

В 70-х годах 20-го века были синтезированы производные 4'-Р-нуклеозидов [Owen G. R, et al, J. Org. Chem.1976, 41, ЗОЮ]. Однако противовирусные свойства полученных соединений не исследовались. Поэтому в рамках диссертационной работы был проведен синтез производных 4'-фторпиримидиновых нуклеозидов, а также 5'-0-трифосфата 4'-фторуридина для изучения взаимодействия последнего с теми же нуклеотид-зависимыми ферментами HCV, что и в первой части работы.

Синтез 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденуридина. Синтез пиримидиновых 4'-F-нуклеозидов осуществляли исходя, из 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденуридина (19), полученному из 1-(5-дезокси-р-0-эритро-пент-4-ен-фуранозил)урацила (15) по методу описанному в работе [Owen G. Я, et al, J. Org. Chem.1976, 41, ЗОЮ] (Схема 5)._Ключевой стадией при синтезе 4'-фторпроизводных нуклеозидов является введение псевдогалогена JF по двойной связи 4',5'-ненасыщенного соединения.

Схема 5

о

n

.Л

II,С

fa

/: AgF, 12, СН2С12, 20°С, 30 мин; ii: NaN3, DMF, 105°С, 17ч; iii: 1) NOBF„, CH3CN, 0°C, 20 мин; 2) 20°C, 45 мин; 3) DEAE-целлюлоза (НС03"), 20°C, 15 ч.

Цепь превращений (17) —» (18) —> (19) с приемлемым выходом осуществить не удалось. На стадии получения 2,5'-ангидро производного (18) выход продукта составил не более 10%, что связано, по-видимому, с лабильностью N-гликозидной связи фторпроизводного (18). Это подтверждалось присутствием до 60% урацила в реакционной смеси. Поэтому для разложения избытка нитрозонийтетрафторбората была использована водно-спиртовая смесь, содержащая DEAE-целлюлозу в (НСОз") форме. Процесс проводили, используя избыток смолы в большом объеме водного спирта, в течение длительного времени (15 ч), что привело к неожиданному результату - гидролизу связи между 5'-углеродом и кислородом пиримидинового кольца соединения (18). В результате соединение (19) было получено без выделения промежуточного 2,5'-ангидро производного (18). Целевое вещество очищали на колонке с силикагелем. В результате выход составил 37 %, исходя из 1-(5-дезокси-Р-£>-эритро-пент-4-ен-фуранозил)урацила (15) против 19% в работе [Owen G. R., et al, J. Org. Chem.1976,41,3010].

Синтез 5'-0-ацетнлированных пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов. Как было отмечено выше, JV-гликозидная связь в 4'-фтор замещенных нуклеозидах весьма лабильна, однако известно, что модификации 2',3'- или 5'-гидроксильных групп углеводного остатка значительно повышают стабильность 4'-фторнуклеозидов. Ацетильная группа легко гидролизуется клеточными эстеразами [YungN. С., et al, J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 4060], что позволяет исследовать активность соединений (24 - 26) в культуре клеток. Поэтому для изучения их биологических свойств представлялось целесообразным получить их 5'-0-ацетильные производные (Схема 6).

Для синтеза 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденцитидина (21) (Схема 6) 4'-фтор-2',3'-О-изопропилиденуридин (19) ацетилировапи, используя уксусный ангидрид в пиридине. Защищенный нуклеозид (20) превращали в соответствующий триазолид, в результате аммонолиза которого получали 2',3'-0-изопропилиденцитидин (21) [Divakar К. J., Reese C.B., J. Chem. Soc. 1982, 1, 1171]. Последний ацегшшровали и удаляли изопропилиденовую группу действием муравьиной кислоты с образованием целевого 5'-0-ацетил-4'-фторцитидина (25). Взаимодействие 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиден-5'-0-ацетилцитидина (22) с гидроксиламином в разбавленных водных растворах с удовлетворительным выходом привело к защищенному тИ-гидрокси-производному 4'-фторцитидина, из которого после деблокирования 2',3'-чис-диольной группы НСООН и был синтезирован целевой 5'-0-ацетил-4'-фтор-Д'4-гидроксицитидин (26).

Схема 6.

i: Ac20, Py, 20°C, 72 ч; /7: 90% HCOOH, 20°C, 1.5 ч; Hi: триазол, 4-С1РЮРОС12, Py, 20°C, 96 ч; iv: 34% водный NH3, диоксан, 20°C, 3 ч; v: диэтилацеталь М,М-диметилформамида, DMF, 20°C, 2.5 ч; vi: 1) Ac20, Py, 20°C, 18 ч; 2) h-Bu0H-H20-Ac0H, 5:3:2,20°C, 5 ч; vii: водный NH2OH-HCI, NaOH до pH 5.2,37°C, 24 ч.

Структура синтезированных соединений подтверждена УФ-, 'Н- и С-ЯМР-спектрами. Полученные соединения (24-26) оказались стабильными в PBS в течение >60 ч.

Для подтверждения /?-£>-структуры полученных 4'-фторнуклеозидов мы опирались на величину констант и У^рЯМР *Н спектров, равных 11.5 и 0 Гц как указано в работе [Owen G. R., et al, J. Org. Chem. 1976,41,3010].

Для всех полученных 4'-фторнуклеозидов константа Jrs мало отличалась от указанного значения и являлась подтверждением как наличия фтора в молекуле, так и

/ї-Д-конфигурации (схема 7). В качестве примера приведен фрагмент спектра 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденцитидина (21). Однако в случае некоторых соединений многочисленность пиков в ЯМР 'Н спектрах не позволяло достоверно выделить I

константы спин-спинового взаимодействия 19Р - *Н.

I ■ I I I11 |1-т-гтт-| ' ■ I I

S.Ofl

Рис 6. Фрагмент 'Н-ЯМР спектра 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденцитидина (21).

Иная картина наблюдалась в 13С спектрах 4'-фторнуклеозидов, интерпретация которых не представляла трудностей. Константы спин-спинового взаимодействия 19F - 13С значительно больше по величине и изменяются в определенных пределах при однотипных структурных изменениях: Jor.F 230.27 - 236.1 Гц; Jcy.r 35.3 - 38.3 Гц; Jcr.r 20.0 - 22.6 Гц. Таким образом, 13С - спектры позволили контролировать неизменность базовой фторсодержащей структуры нуклеозида в ходе синтеза, а так же выяснять влияние атома фтора на смещение электронной плотности в молекуле.

Ингибирование репликации HCV 5'-0-ацетилированными 4'-фторурнуклеозидами. Нуклеозиды были испытаны как потенциальные ингибиторы репликации HCV в системе репликона вируса HCV [Lohmann V., et al, Science 1999, 285, 110]. Цитотоксическое действие в культуре гепатоцитов человека Huh7, определенное по методу [Klumpp К., et al, J. Biol. Chem. 2006, 281, 3793], в исследуемом диапазоне концентраций (до 500 мкМ) не отмечено ни для одного из синтезированных 5'-ацетильных производных 4'-Р-нуклеозидов (24), (25) и (26). Соединения (25) и (26)

оказались неактивными в этой системе, нуклеозид (24) проявил умеренную анти-НСУ-активносгь (ЕС50 2 мкМ), то есть в 10 раз ниже, чем у 4'-азидоцитидина (ЕС50 0,2 мкМ).

Синтез 5'-0-трифосфата 4'-фторуридина. Для синтеза 5'-0-трифосфата 4'-фторуридина (29) была выбрана классическая схема, заключающаяся в конденсации нуклеозида (19) с фосфо-пирис-триазолидом по методу [Дяткина Н.Б. et al, Биоорган. Химия 1987, 13, 1366] и последующим удалении изопропилиденовой защиты действием 90% НСООН, что позволило получить нуклеозид-5'-монофосфат (28) (Схема 7). Соединение (28) после активации карбонилдиимидазолом вводили в реакцию с трет-бутиламмонийной солью пирофосфорной кислоты в DMF согласно работе [Hoard D.E., Ott .G.D. J. Amer. Chem. Soc. 1965, 87, 1785].

Схема 7.

(29)

/: фосфо-трис-триазолид, СНзСИ, 20°С, 1 ч; и: 90% НСООН, 20°С, 1.5 ч; Ш: 1) СШ, Виз1М, ОМР, 20°С, 40 мин; 2) (ВизШШгРгОт, ОМР, 20°С, 24 ч.

Таким образом, целевой 5'-0-трифосфат 4'-фторуридина (29) был получен с суммарным выходом 9.7%, считая на нуклеозид (19) (Схема 7).

Субстратные свойства 5'-0-трифосфата 4'-фторуридина в отношении нуклеотид зависимых ферментов НСУ. Действие трифосфата (29) исследовали в нашей лаборатории с ферментами НСУ, перечисленными в первой части работы. Ингибирование реакции элонгации, катализируемое РНК-зависимой РНК-полимеразой НСУ, проводили

по методу [Козлов М.В., и др., Биохимия. 2009, 74, 1028], используя поли(А)/олиго(11) в качестве праймер-матричного комплекса. Трифосфат (29) оказался эффективным ингибитором фермента с величиной ЕС50 2 мкМ. Значение ЕС50, найденное для трифосфата 4'-азидоуридина (контроль) в этом эксперименте, было 0.2 мкМ, что совпадает с данными работы [Perrone Р., J. Med. Chem. 2007, 50, 1840].

При исследовании действия трифосфата (29) на хеликазу/ЫТРазу NS3 было показано, что данное соединение является полноценным субстратом ЫТРазной реакции, катализируемой этим ферментом (степень гидролиза близка к таковой для АТР), и не ингибирует хеликазную активность. Это позволило исследовать его способность заменять АТР в качестве активатора (кофактора) хеликазной реакции. Мы продемонстрировали, что трифосфат (29) действительно способен к частичной активации ШЗ-хеликазы, хотя и несколько слабее, чем АТР.

Рис. 7. Ингибирование РНК-зависимой РНК-полимеразы 5'-0-трифосфатами (1)4'-азидоуридина и (2) 4'-фторуридина (29).

Таким образом, противовирусная активность 5'-0-ацетил-4'-фторнуклеозидов (24 -26) в культуре клеток может быть обусловлена их превращением в соответствующие нуклеозид трифосфаты и последующим ингибированием РНК-зависимой РНК-полимеразы НСУ.

Выводы:

1. Модифицированы методы синтеза четырех типов соединений: фурано- и пирроло[2,3-¿/]пиримидиновых нуклеозидов; производных пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов, а также М4-гидрокснцитидина.

2. Методами химического трифосфорилирования впервые получены 5'-0-трифосфаты бициклических пиримидиновых нуклеозидов и 4'-фторуридина.

3. Среди синтезированных производных нуклеозидов выявлены ингибиторы репликации

in vitro вирусов гепатита С (в системе клеточного репликона HCV) и бычьей диареи (3-(Р-Л-рибофуранозил)-6-децил-2,3-дигидрофуро-[2,3-</]пиримидин-2-он, 5'-0-ацетил-4'-Р-уридин) и оспы (М4-(0-пивалоил)-гидроксицкгидин и >)4-(0-бензоил)-гидроксицитидин).

4. Показано, что трифосфат 4'-фторуридина является эффективным ингибитором РНК-полимеразы вируса HCV, субстратом ЖРазной и хеликазной реакций, катализируемой белком NS3 HCV (NTP-зависимой РНК-хеликазой), в то время, как трифосфаты бициклических фурано- и пирролопиримидиновых нуклеозидов не ингибируют эти ферменты.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. Ivanov М.А.. Antonova E.V., Maksimov A.V., Pigusova L.K., Belanov E.F., Aleksandrova L.A. «New N4-hydroxycytidine derivatives: synthesis and antiviral activity». // Collect. Czech. Chem. Commun, 2006, v. 71, № 7, p. 1099-1106.

2. Alexandrova L.A., Ivanov M.A., Victorova L.S., and Kukhanova M.K.. «Furano- and pyrrolo[2,3-£/]pyrimidine ribonucleosides and their 5'-0-triphosphates: synthesis and enzymatic activity.» // Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2007, v. 26, №8-9, p. 1083-1086.

3. Голубева H.A., Иванов A.B., Иванов M.A.. Батюнина О.А., Шипицын А.В., Туницкая B.JI., Александрова JI.A. «Новые аналоги нуклеозидов и их 5'-трифосфаты: синтез и биологические свойства.» // Вестник Московского Университета, серия «Химия», 2008, №2, с. 112-117.

4. Иванов М.А.. Иванов А.В., Красницкая И.А., Смирнова О.А., Карпенко И.Л., Беланов Е.Ф., Прасолов B.C., Туницкая В.Л., Александрова Л.А. «Новые фурано- и пирроло[2,3-£>] пиримидиновые нуклеозиды и их 5'-трифосфаты: синтез и биологические свойства.» // Биоорган. Химия, 2008, т. 34, № 5, с. 661-670.

5. Иванов М.А.. Людва Г.С., Муковня А.В., Кочетков С.Н., Туницкая В.Л., Александрова Л.А. «Синтез и биологические свойства пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов и 5'-трифосфата 4'-фторуридина.» // Биоорган. Хим., 2010, т. 36, № 4, с. 1-9.

Тезисы

1 Ivanov M.A.. Alexandrova L.A. «Furo- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides and their 5'-0-triphosphates: synthesis, antiviral properties and enzymatic activity» IRT-XVIIXVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. (Bern, Switzerland, 2006 r.) Conference book, DCB of University.

2. Ivanov M.A.. Alexandrova L.A., «Furo- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides and their 5'-0-triphosphates: synthesis, antiviral properties and enzymatic activity.» Humboldt-kolleg conference: Technologies and threats of the 21st century. (Chisinau, Moldova, 2006 r.) Abstracts book, p. 55.

3. Ivanov M.A.. Tunitskaya V.L., Ivanov A.V., Krasnitskaya I.A., Alexandrova L.A. «Synthesis and biological properties of furrano- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides and their 5'-0-triphosphates.» Conference for young scientist, PhD students and students on molecular biology and genetics. (Kyiv, Ukraine, 2007 r.) Abstracts book, p. 125.

5. Golubeva N.A., Ivanov A.V., Ivanov M.A.. Batyunina O.A., Shipitsyn A.V., Tunitskaya V.L., Alexandrova L.A. «Novel ribonucleoside analogues and their 5'-0-triphosphates: synthesis, antiviral activity and substrate properties towards hepatitis C virus RNA-polymerase and RNA helicase/NTPase.» International conference Biocatalysis-2007. (Moscow - St.Peterburg, Russian Federation, 2007 r.) Abstracts book, p. 79-80.

6. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Golubeva N.A., Ivanov M.A.. Tunitskaya V.L., Shipitsyn A.V., Alexandrova L.A. «Base-modified ribonucleosides as potential anti-HCV virus agents.» Nucleic Acids Res. Symposium Series, 2008, v. 52, c. 619-620.

7. Ivanov M.A.. Alexandrova L.A. «4'-Fluoronucleoside derivatives: synthesis and biological activity.» // Наука и инновации в модернизации России и развитии мира (Ред. Т. Илларионова) 2010, с. 207-212.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 05-04-49492, 08-04-00549), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, "По молекулярной и клеточной биологии", МНТЦ (грант №1989).

Подписано в печать: 24.10.2012 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 667 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Иванов, Максим Андреевич

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ

3. Бициклические фурано-, пирроло- и тиофено[2,3-й]-производные пиримидиновых нукпеозидов - синтез и противовирусные свойств

Обзор литературы).

4-6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Синтез и биологическая активность фурано- и пирроло[2,3-(1/пиримидиновых нукпеозидов и их S'-O-трифосфатов.

4.1.1. Получение 6-замещенных 3-(|3-1>-Рибофуранозил)-2,3-дигидрофурано[2,3-^пиримидин-2-онов (3a)-(3g).

4.1.2. Получение 3-(Р-£>-Рибофуранозил)-6-гексил-2,3-дигидропирроло[2,3-£/]-пиримидин-2-онов (4а) и (5g).

4.1.3. Спектральные характеристики фурано- и пирроло[2,3-^]пиримидиновых нукпеозидов. 4.1.4. Ингибирование репликации HCV и BVDV фурано- и пирроло[2,3-^]-^ пиримидиновыми нуклеозидами.

4.1.5. Синтез 5'-0-трифосфатов фурано- и пирроло[2, пиримидиновых нуклеозидов.

4.1.6. Спектральные характеристики 5'-0-трифосфатов фурано- и пирроло[2,3-(Цпиримидиновых нуклеозидов.

4.1.7. Субстратные свойства 5'-Отрифосфатов фурано- и пирроло[2,Зч/]-пиримидиновых нуклеозидов по отношению к ферментам ВГС: белку NS5B и NS3.

4.1.8 5'-0-трифосфат 6-гексил-фурано[2,3-íi]пиримидина (7а) в реакциях элонгации, катализируемых TDT и RT.

5.1. Синтез и биолологическая активность производных Р^-гидроксицитидина 6.1. Синтез и биолологическая активность пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов и 5'-трифосфата 4'-фторуридина.

6.1.1. 4'-Замещенные фторпроизводные нуклеозиды.

6.1.2. Синтез 4'-фтор-2',3'-0-изопропилиденуридина.

6.1.3 Синтез 5'-0-ацетилцилированных пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов.

6.1.4. Спектральные характеристики пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов.

6.1.5. Токсичность 5'-Оацетилцилированных 4'-фторнуклеозидов. Ингибирование репликации HCV 5' - 0-ацетил цилированными 4'-фторнуклеозидами.

6.1.6. Синтез 5'-0-трифосфата 4'-фторуридина.

6.1.7. Исследование стабильности 5'-О-монофосфата и

5'-Отрифосфата 4'-фторуридина; субстратные свойства 5'-Отрифосфата 4'-фторуридина по отношению к ферментам ВГС: белку NS5B и NS3.

7. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

7.1. Реактивы и оборудование.

7.2.1. Методики к разделу 4.1.

7.2.2. Методики к разделу 5.1.

7.2.3. Методики к разделу 6.1.

8. ВЫВОДЫ.

9. БЛАГОДАРНОСТИ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванов, Максим Андреевич

8. ВЫВОДЫ

1. Модифицированы методы синтеза четырех типов соединений: фурано- и пирроло[2,3-йОпиримидиновых нуклеозидов; производных пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов, а также М4-гидроксицитидина.

2. Методами химического трифосфорилирования впервые получены 5'-0-трифосфаты бициклических пиримидиновых нуклеозидов и 4'-фторуридина.

3. Среди синтезированных производных нуклеозидов выявлены ингибиторы репликации in vitro вирусов гепатита С (в системе клеточного репликона HCV) и бычьей диареи (З-ф-Z)-рибофуранозил)-6-децил-2,3-дигидрофуро-[2,3-£/]пиримидин-2-он, 5' - О-ацетил-4' -F-уридин) и оспы (М4-(0-пивалоил)-гидроксицитидин и М4-(0-бензоил)-гидроксицитидин).

4. Показано, что трифосфат 4'-фторуридина является эффективным ингибитором РНК-полимеразы вируса HCV, субстратом ЫТРазной и хеликазной реакций, катализируемой белком NS3 HCV (NTP-зависимой РНК-хеликазой), в то время, как трифосфаты бициклических фурано- и пирролопиримидиновых нуклеозидов не ингибируют эти ферменты.

9. БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований гранты №№ 05-04-49492, 08-04-00549) и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, "По молекулярной и клеточной биологии".

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Л.А. Александровой за помощь и поддержку на всех этапах работы.

Автор благодарен сотрудникам лаборатории МОДФАС за проведение биологических экспериментов.

Автор благодарен д. физ. мат. наук Тимофееву В. П. (ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН) за регистрацию ЯМР-спектров, Беланову Е. Ф. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») за проверку соединений против вируса оспы и ВУОУ.

Автор признателен всем сотрудникам лаборатории МОДФАС за внимание проявленное к диссертационной работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Иванов, Максим Андреевич, Москва

1. De Clercq E. Looking back in 2009 at the dawning of antiviral therapy now 50 years ago an historical perspective. 1. Adv. Virus. Res. 2009. V. 73. P. 1-53.

2. De Clercq E. Anti-HIV drugs: 25 compounds approved within 25 years after the discovery of HIV. Hint. J. Antimicrob. Agents. 2009. V. 33. P. 307-320.

3. Watanabe K.A., Patterson S.E. 2004 in Frontiers in nucleosides and nucleic acids (Schinazi R. F. LiottaD. С.). IIIHL Press. Tucker. GA. 2004. P. 3-55.

4. Choo Q. L., Kuo G., Weiner A. J., OverbyL. R., Bradley D. W., Houghto, M. Isolation of acDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. // Science. 1989. V. 244. P. 359-362.

5. Boyer N., Marcellin P. Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C. // J. Hepatol. 2000. V. 32. P. 98-112.

6. Snell N.J. Ribavirin-current status of a broad spectrum antiviral agent. // Expert Opin. Pharmacother. 2001. V. 2. P. 1317-1324.

7. Koch U. and Narjes F. Recent progress in the development of inhibitors of the hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase. // Current Topics in Medicinal Chemistry. 2007. V. 7. P. 1302 -1329.

8. McHutchison G„ Ever son G.T., Gordon S.C., Jacobson I.M., Sulkowski M., Kauffman R„ McNair L., Alam J., Muir A.J. Telaprevir with peginterferon and ribavirin for chronic HCV genotype 1 infection. IIN. Engl. J. Med. 2009. V. 360. P. 1827-1838.

9. Yang P.L., Gao M., Lin K., Liu Q., Villareal V.A. Anti-HCV drugs in the pipeline. Curr. Opin. Virol 2011. V.6.1 P. 607-616.

10. De Clercq E. Strategies in the design of antiviral drugs. II Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. P. 13-25.

11. BalzariniJ., McGuigan C. Bicyclic pyrimidine nucleoside analogues (BCNAs) as highly selective and potent inhibitors of varicella-zoster virus replication. // J. Antimicrob. Chemotherapy. 2002. V.50. P. 5-9.

12. Luoni G„ McGuigan C., Andrei G., Shoek R. Bicyclic nucleoside inhibitors of Varicella-Zoster virus: the effect of branching in the p-alkylphenyl side chain. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. V.15. P. 3791 -3796.

13. PermanJ., Sharma R.A., BobekM. Synthesis of l-(2-deoxy-P-Z)-erytro-pentafuranosyl)-5-ethylnyl-l,2,3,4-tetrahydropyrymidine-2,4-dione (5-ethynyl-2'-deoxyuridine). // Tetrahedron Lett. 1976. P. 2427-2430.

14. Jones A.S., Walker R.T. IINucl. Acids Spec. Publ. № 1.1975. P. 1-4.

15. Barr P.J., Jones A.S., Walker R.T. Incorporation of 5-substituted uracil derivatives into nucleic acids. Part IV. The synthesis of 5-ethynyluracil. II Nucl. Acids Res. 1976. V. 3. P. 2845-2849.

16. Jones A.S., Serafinowski P., Walker R. T. Synthesis of 5-ethynylcytosine and 5- ethynylcytidine. // Tetrahedron Lett. 1977. P. 2459-2460.

17. DieckH.A., HeckF.R. II J. OrganometaL Chem. 1975. V. 93. P. 259-263.

18. CassarL. II J. OrganometaL Chem. 1975. V. 93. P. 253-257.

19. Sonogashira К., Tohda Y., Hagihara N. A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes, and bromopyridynes. // Trahedron Lett. 1975. P. 4467-4470.

20. Коршун В. А., Манасова E. В., Берлин Ю. А. Алкинированные нуклеозиды и их аналоги. Методы синтеза. // Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 324-387.

21. Agrofoglio L. A., Gillaizeau I, Saito Y Palladium-assisted routes to nucleosides. // Cliem. Rev. 2003. V. 103. P. 1875-1916.

22. Robins M.J., Barr P.J. Nucleic acid related compounds. 31. Smooth and efficient palladium-coper catalized coupling of terminal alkines with 5-iodouracil nucleosides. // Trahedron Lett. 1981. V. 22. P. 421-424.

23. Толстиков Г.А., Мустафин А.Г., Гатаулин А.Г., Спирихин JI.B., Султанова B.C., Абдрахманов КБ. Новый тип взаимодействия 5-иодпиримидиновых нуклеозидов с алкинами. II Изв. АН. Сер.хим. 1993. С. 596-597.

24. Sonogashira K., Tohda Y, Hagihara N. A convenien synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes, and bromopyridines. // Tetrahedron Lett. 1975. P. 4467.

25. Sonogashira К. Development of Pd Cu catalized cross-coupling of terminal acetylenes with sp2-carbon halides. // J. Org. Chem. 2002. V. 653. P. 46-49.

26. Джилкрист Т. //Химия гетероциклических соединений: Пер. с англ. М.: Мир, 1996. С. 81-83.

27. Aucagne К, AmblardF. //Synlett. 2004. P. 2406-2408.

28. Marshall J. A., WangX.L. Synthesis of furans by Ag(I)-promoted cyclization of allenyl ketones and aldehydes. II J. Org. Chem. 1991. V. 56. P. 960-969.

29. Marshall J.A., Bartley G.S. Observations regarding the Ag(I)-catalyzed conversion of allenones to furans. И J. Org. Chem. 1994. V. 59. P. 7169-7171.

30. Marshall J.A., WangX.L. Synthesis of macrocyclic homopropargylic alcohols through intramolecular SE' addition of allenylstannanes and their subsequent conversion to fiiranocycles. // J. Org. Chem. 1991. V. 56. P. 6264-6266.

31. Marshall J.A., Robinson E.D. A mild method for the synthesis of furans. Application to 2,5-bridged furano macrocyclic compounds. //J. Org. Chem. 1990. V. 55. P. 3450- 3451.

32. JJtimoto K. Palladium catalyzed synthesis of heterocycles. // Pure Apple. Chem. 1983. V. 55. P. 1845-1852.

33. ShengH., LinS., Huang Y. II Synthesis. 1987. P. 1022-1023.

34. Fukuda Y, Shiragami H., JJtimoto K, Nozaki H. Synthesis of substituted furans by palladium-catalyzed cyclization of acetylenic ketones. II J. Org. Chem. 1991. V. 56. P. 5816-5819.

35. Hashmi A.S.K., Schwarz L„ ChoiJ.-H., Frost T.M. A new gold-catalyzed C-C bond formation. И Angew. Chem. 2000. V. 39. P. 2285-2288.

36. Hashmi A.S.K., Schwarz L„ Rubenbauer P., Blanco M.C. The condensation of carbonyl compounds with electron-rich arenes: mercury, thallium, gold or a proton. II Adv. Synth. CataL 2006. V. 348. P. 705-708.

37. ZhouC.-Y., ChanP.W.H., CheC.-M. Gold(III)porphyrin-catalyzedcycloisomerizationof allenones. // Org. Lett. 2006. V. 8. P. 325-328.

38. MenardD., Vidal A., BarthomeufC., Gosselin P. H Synlett. 2006. P. 57-60.

39. Льюин Б. Клетки. // Бином. 2011.

40. Migliore М. FV-100: the most potent and selective anti-varicella zoster virus agent reported to date. // J. Antiv. Chenu Chemother. 2010. V. 20. P. 107 115.

41. Balzarini J., McGuigan C. Chemotherapy of varicella-zoster virus by a novel class of highly specific anti-VZV biciclic pirimidine nucleosides. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1587. P. 287 -295.

42. Srinivasan S., McGuigan C., Andrei G. Bicyclic nucleoside inhibitors of Varicella-Zoster virus (VZV): effect of terminal unsaturation in the side-chain. // Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 763 -766.

43. BrancaleA., Srinivasan S., Andrei G., ShoekR. Synthesis and anti-varicella-zoster virus activity of some novel bicyclic nucleoside inhibitors: effect of enhanced aqueous solubility. // J. Antiv. Chem & Chemother. 2000. V. 11. P. 383-393.

44. Carandio A., McGuigan C., Cachard D., Andrei G. Synthesis and in vitro evaluation of novel anti-varicella-zoster virus (VZV) nucleosides. // Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 653 656.

45. McGuigan C. Balzarini J. FV100 as a new approach for the possible treatment of varicella-zoster virus infection. II J. Antimicrob. Chemother. 2009. V. 64. P. 671-673.

46. SnoeckR., Andrei G., De Clercq E. Chemotherapy of varicella zoster virus infections. // Int. J. Antimicrob. Agents. 1994. V.4. P. 211-26.

47. Li N.S., Piccirilli J.A. Synthesis of the phosphoramidite derivative of 2'-deoxy-2'-C-beta-methylcytidine. //J. Org. Chenu 2003. V. 68. P 6799-6802.

48. Garangio A., McGuigan C., Andrei G„ Snoeck R., De Clercq E., BalzariniJ. Bicyclic nucleoside inhibitors of Varicella-Zoster virus: 5'-chloro and 3'-chloro derivatives. I I Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 2003. V. 22. P. 931-933.

49. McGuigan C., Wedgwood O.M., De ClercqE, BalzariniJ. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. P. 2359-2362.

50. LichtensteinJ., Barrier H. D, CohenS. S. II J. Biol Chem. 1960. V. 235. P. 457-465.

51. Du C.-B., LiuJ.-W., Su W„ Ren Y.-H., WeiD.-Z. The protective effect of Ascorbic acid derivative on PC 12 cells: involvement of its ROS scavenging ability. // Life Sci. 2003. V. 74. P. 771-780.

52. Wimalasena K., Mahindaratne M. Chemistry of L-Ascorbic acid: regioselective and stereocontrolled 2-C- and 3-C-allylation via thermal claisen rearrangement. // J. Org. Chem. 1994. V. 59. P. 3427-3432.

53. Veltri R. W., Fodor G., Liu C. M., Woolverton C. J., Baseler M. W. A new class of synthetic biological response modifiers: the methylfurylbutyrolactones (Nafocare). I I J. Biol. Res. Mod. 1986. V.5.P. 444-461.

54. Woolverton C. J., Veltri R. W, Snyder I. S. Stimulation of human Pmn in vitro by a succinimide molecular complex of methylfurylbutyrolactones. // J. Biol. Res. Mod. 1986. V. 5. P. 527-538.

55. Nihro Y., Miyataka H., Sudo T., Matsumoto H., Satoh T. J. 3-O-Alkylascorbic acids as free-radical quenchers: synthesis and inhibitory effect on lipid peroxidation. // J. Med. Chem. 1991. V. 34. P. 2152-2157.

56. El-Demerdash F. M., YousefM. I., Zoheir M. A. Stannous chloride induces alterations in enzyme activities, lipid peroxidation and histopathology in male rabbit: antioxidant role of vitamin C. food. II Chem. Toxicol. 2005. V. 43. P. 1743-1752.

57. Raic'-Malic'S., Brundic'H. A., NaglA., Grdis'aM., Pavelic'K, De ClercqE., MintasM. Novel pyrimidine and purine derivatives of L-ascorbic acid: synthesis and biological evaluation. // J. Med. Chenu 1999. V. 42. P. 2673-2678.

58. Michelson A.M., Dondon J., Granberg-monago M. The action of polynucleotide phosphorylase on 5-halogenouridine-5' pyrophosphates. // Biochem. Biophys. Acta. 1962. V. 55. P. 529 540.

59. Pretsch E., Buhmann P. II Structure determination of organic compounds. // Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 2006. P. 161.

60. Lohmann V., Korner F., Herian U., Theilmann L., Bartenschlager R. // Science. 1999. V. 285. P. 110-113.

61. Baker R.O., BrayM., Huggins J. W. 11 Antiviral Research. 2003. V. 57. P. 13-23.

62. De Clercq E. New developments in anti-HIV chemotherapy. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1587. P. 258-275.

63. Kovacs, T„ Otvos, L. II Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. P. 4525-4528.

64. Maag, D., Castro, C., Hong, Zh, Cameron, C.E. Hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) as a mediator of the antiviral activity of ribavirin. II J. Biol. Chenu 2001. V. 276. P. 46094-46098.

65. Wardel, A.D., Errington W., Ciaramella G., Merson J., McGarve, M.J. Characterization and mutational analysis of the helicase and NTPase activities of hepatitis C virus full-length NS3 protein. II J. Gen. Virol. 1999. V. 80. P. 701-709.

66. Borowski, P., Schalinski, S. andSchmitz, H. /I Antiviral Res. 2002, V. 55. P. 397-412.

67. Boule, J.-B.; Rougeon, F.; Papanicolaou, C. Terminal deoxynucleotidi 1 transferase indiscriminately incorporates ribonucleotides and deoxyribonucleotides. J. BioL Chem. 2001. V. 276. P. 31388-31393

68. ArzumanovA.A., VictorovaL.S., JaskoM.V., YesipovD.S., KrayevskyA.A. Terminal deoxynucleotidyl transferase catalyzes the reaction of DNA phosphorylation. // Nucl. Acids Res. 2000. V. 28. P. 1276-1281.

69. Barnard D.L., Hubbard V.D., Smee D.F., Sidwell R.W., Watanabe K.A., Stuyver L. J. II Ingibition of clinically important respiratory viruses by beta -D -N4-hydroxycytidine. Antivir.Research. 2003. V. 57. P. 81.

70. DivakarK. J., Reese С. В. II J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.1982. P. 1171-1176.

71. Mertes M. P. Smrt J. // Collect Czech. Chem. Commun. 1968. V. 33. P. 3304.

72. Ivanov M.A., Antonova E. V., MaksimovA. V., Pigusova L.K., Belanov E.F., Aleksandrova L.A. «New N4-hydroxycytidine derivatives: synthesis and antiviral activity». // Collect. Czech. Chem. Commun. 2006. V. 71. P. 1099-1106.

73. Александрова JI.А., Андронова В.Л., Карпенко И.Л., Скоблов Ю.С., АданиА., ГалеговГ.А. 5'-Фосфонаты 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина: синтез и антивирусные свойства. // Биоорган. Химия. 2002. Т. 28. С. 455-461.

74. Knipe D.M. II Fields virology. 2007. Philadelphia : Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. P. 2911.

75. Kane M. E., Shuman S. Adenosine N1-oxide inhibits vaccinia virus replication by blocking translation of viral early mRNAs. II J. Virol. 1995. V. 69, P. 6352-6358.

76. Jenkins I. D., Verheyden J. P., MoffattJ. G. Synthesis of the nucleoside antibiotic nucleocidin. И J.Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. P. 4323-4324.

77. Morton G. O., Lancaster J. E., VanLear G. E., Fulmor W., Meyer W. E. The structure of nucleocidin. 3. (A new structure). II J. Am. Chem. Soc. 1969. V. 91. P. 1535-1537.

78. O-Yang C., Wu H. Y., Fraser-Smith E. V., Walker K. A. M. II Tetrahedron Lett. 1992. V. 33. P. 37-40.

79. O-Yang C., Kurz W, Eugui E. M., McRoberts M. J., Verheyden J. P. H„ Kurz L. J., Walker K. A. M. // Tetrahedron Lett. 1992, V. 33. P. 41-44.

80. Bousquie I., Madiot V., Florent J. C., Monneret C. Potential of 4'-C-substituted nucleosides for the treatment of HIV-1. II Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 15. P. 1815-1818.

81. Hayakawa H„ Kohgo S„ Kitano K., Ashida N. Kodama E., Mitsuya H„ Ohru H. II Antivir. ChenuChemother. 2004. V.15. P. 169-187.

82. Li F., WuX., Huang S., Hong L., Tran T., Brandi M., Alfredson T. Chemical stability of 4'-azidocytidine and its prodrug balapiravir. II Drag. Dev. Ind. Pharm. 2010. V. 36. P. 413-420.

83. Verheyden, J. P. H.; Moffatt, J. G. The synthesis of a 4',5'-unsaturated nucleoside. // J. Am. Chem. Soc. 1966. V. 88. P. 5684-5685.

84. Verheyden J. P. H., Moffatt J. G. Halo sugar nucleosides. IV. Synthesis of some 4',5'-unsaturated pyrimidine nucleosides. II J. Org. Chem. 1974. V. 39. P. 3573-3579.

85. Robins M. J., McCarthy J. R„ Robins R. К. И J. Heterocycl Chem. 1967. V. 4. P. 313.

86. McCarthy J. R„ Robins R. K., Robins M. J. II J. Am. Chem. Soc. 1968. V. 90. P. 4993-4999.

87. Schmeisser M., Sartori P., Naumann D. // Chem. Ber. 1970. V. 103. P. 880

88. Owen G. R., Verheyden J. P. H., Moffatt J. G. 4'-substituted nucleosides. 3. Synthesis of some 4'-fluorouridine derivatives. II J. Org. Chem.\916. V. 41. P. 3010-3017.

89. Verdine G. L., A concise synthesis of 4'-fluoro nucleosides. // Organic Letters. 2007. V. 9, P. 5007-5009

90. Jenkins I. D., Verheyden J. P. H., Moffatt J. G. II J. Am. Chem. Soc. 1976. V. 98. P. 33463357.

91. Иванов M.A., Людва Г.С., Муковня A.B., Кочетков С.Н., Туницкая В.Л., Александрова Л.А. «Синтез и биологические свойства пиримидиновых 4'-фторнуклеозидов и 5'-трифосфата 4'-фторуридина.» // Биоорган. Химия. 2010. Т. 36. С. 1-9.

92. Lin T.-S., Gao Y.-S., Mancini W.R. Synthesis and biological activity of various З'-azido and 3'-amino analogues of 5-substituted pyrimidine deoxyribonucleosides. II Med. Chem. 1983. V. 26. P. 1691-1696.

93. Ferrero M., Gotor V. Biocatalytic selective modifications of conventional nucleosides, carbocyclic nucleosides, and C-nucleosides. // ChenuRev. 2000. V. 100. P. 4319-4347

94. Дяткина Н.Б., фон Янта-Липински M., Минасян Ш.Х., Куханова М.К., Краевский А.А., Чиджавадзе З.Г., Бибилашвили Р.Ш. II Биоорган. Химия. 1987. Т. 13. С. 1366-1374.

95. Pearlman W. М. //Tetrahedron Lett., 1967, v. 74, p. 567-571.

96. Козлов M.В., Поляков КМ., Филиппова С. Ф., Евстифеев В.В., Людва Г.С., Кочетков С.Н. // Биохимия. 2009. Т.74. С. 1028-1036.

97. SambrookJ., Fritsch E.F., Maniatis Т. // Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edn. Cold String Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989. P. 5.68-5.72.

98. Baker R.O., Bray M., Huggins J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. // Antiviral Research. 2003. V. 57. P. 13-23.

99. Муковня A.B., Туницкая B.JI., Хандажинская A.JI., Голубева H.A., Закирова Н.Ф., Иванов A.B., Куханова М.К., Кочетков СЛ. II Биохимия. 2008. Т. 73. С. 822-832.