Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов

Щербаченко, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов"

На правах рукописи

003454 137

ЩЕРБАЧЕНКО ИРИНА МИХАЙЛОВНА

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОКИСЛЕНИЕМ ЭРИТРОЦИТЫ КАК ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ.

03.00.04. — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 уг.п -

Москва-2008

003454137

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Лисовская Ирина Львовна

Официальные оппоненты: Д.б.н., профессор Азизова O.A. Д.м.н, профессор Погорелов В.М.

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский Государственный медицинский университет Росздрава, г. Москва

на заседании Диссертационного совета Д 001.042.02 при ГУ Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН

Защита состоится «"{О » 2008 г в

Автореферат разослан « с»

'2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.042.02,

кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кислород, необходимый для энергообеспечения клеток и тканей млекопитающих, служит одновременно источником так называемых активных форм кислорода (АФК), являющихся промежуточными продуктами окислительного метаболизма. Механизмы действия АФК сложны, разнообразны и до настоящего времени не вполне изучены. Не вызывает сомнения определяющая биологические эффекты роль клеточных мембран и изменение их структуры и функций под действием АФК.

Эритроциты млекопитающих являются удобной моделью для изучения механизмов окислительных повреждений, поскольку они доступны в больших количествах, не содержат ядер и митохондрий и не способны к синтезу белков. Они циркулируют в крови 120 дней и более других клеток контактируют с кислородом и его активными формами. Постоянное взаимодействие с кислородом вызывает аутоокисление содержащегося в эритроцитах гемоглобина с образованием супероксид-радикалов (Ог' ~~), а также других АФК, главным образом, перекиси водорода (Н2О2) и гидроксил-радшсалов (ОН'). В организме источниками экзогенных для эритроцитов АФК являются другие клетки крови (тромбоциты, моноциты, нейтрофилы и макрофаги), а также эндотелий сосудов. Кроме того, появлению избыточных количеств АФК в эритроцитах могут способствовать действие радиации и некоторых ксенобиотиков

Нарушение равновесия между количеством образующихся АФК и антиоксидантными защитными механизмами клетки приводит к избыточному образованию радикалов и создает условия, которые часто называют «окислительным стрессом».

В норме окислительный стресс индуцирует старение эритроцитов, которое, как известно, сопровождается уменьшением клеточного объема, потерей клеточной поверхности, снижением деформируемости и нарушением асимметричного распределения фосфолипидов мембраны. Как известно, постаревшие эритроциты выводятся из кровотока ретикуло-эндотелиальной системой, в частности, поглощаются макрофагами.

Хорошо известно, что образование АФК в различных тканях усиливается при воспалении, иммунологических нарушениях, гипоксии и гипероксии, действии ионизирующего излучения, шоке, ишемии-реперфузии, дефиците витаминов и во многих других патофизиологических ситуациях. Свободно-радикальные формы кислорода принимают участие в патогенезе многих наследственных заболеваний,

таких как серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-б-фосфат дегидрогеназы. Спровоцированное окислительным стрессом повреждение мембран эритроцитов приводит к ухудшению их реологических свойств: снижению деформируемости и повышению адгезивпости, спосбствуя развитию ишемии, анемии и гиперкоагуляции, усугубляющих первичную патологию.

В некоторых случаях патологические проявления уменьшаются под действием препаратов, препятствующих развитию окислительных повреждений клеток и тканей - антиоксидантов. В последние годы в мире ведутся интенсивные исследования механизмов действия АФК, а также основанные на результатах этих исследований поиски веществ, обладающих антиоксидантной активностью и пригодных, в первую очередь, для терапии различных заболеваний, связанных со свободно-радикальными повреждениями клеток и субклеточных структур.

Одним из необходимых условий для скрининга и количественной оценки эффективности таких препаратов является наличие адекватных экспериментальных моделей, позволяющих осуществлять сравнительное исследование.

Цель работы: Создание экспериментальной модели для оценки активности антиоксидантов с использованием эритроцитов, подвергнутых окислительным воздействиям.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние окислительной системы феназин метосульфат (ФМС) + аскорбат на эритроциты человека

2. Изучить влияние третбутиловой гидроперекиси (ЬВНР) на эритроциты человека.

3. Для каждой окислительной системы определить наиболее легко измеряемые и чувствительные к присутствию антиоксидантов параметры модифицированных эритроцитов.

4. Предложить метод оценки антиоксидантной активности на основе выбранной окислительной системы.

Научная новизна.

Показало, что действие на эритроцита! окислителей (феназин метосульфат, третбутиловая гидроперекись) приводит к активации кальций-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффекг). Активация Гардос-каналов при действии феназин метосульфата вызывает сжатие (дегидратацию) эритроцитов, а при действии третбутиловой гидроперекиси часгачио компенсирует увеличение объема клеток. Высказано

предположение, что активация Гардос-каналов является общим свойством клеточного ответа при окислительных воздействиях.

Впервые показано, что присутствие клотримазола приводит к существенному усилению гемолиза, индуцированного третбутнловой гидроперекисью. Преинкубацця суспензии эритроцитов с антиоксидантами достоверно снижает степень гемолиза

Предложен новый метод оценки активности антиоксидантных препаратов по степени ингибирования гемолиза, индуцированпого третбут иловой гидроперекисью в присутствии клотримазола.

Практическая значимость.

Предложенный нами метод впедрен в систему контроля качества на ОАО Завод экологической техники и экопитания «Диод» (г. Москва) как один из способов контроля биологической активности выпускаемой продукции. С помощью данного метода проводится оценка антиоксидантной активности веществ, используемых в производстве в настоящее время, а также скрининг потенциально обладающих антиоксидантной активностью соединений в процессе разработки новых препаратов

Этот метод оценки аптиоксидшшюй активности (АОА) может быть рекомендован для использования при разработке и производстве лекарственных препаратов. Для внедрения предложенного метода не требуется сложпого и дорогостоящего оборудования. Для проведения апализа достаточно небольшого объема крови (~ 100 цл). Метод является высоко чувствительным и хорошо воспроизводимым.

Положения, пыпосимые на защиту.

1 Инкубация эритроцитов в присутствии двух разных окислителей' феназин

метосульфат (0 025 - 1 мМ) + аскорбат (10 мМ) и третбутиловая гидроперекись (1-3 мМ) приводит к активации Са-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект), вызывая сжатие эритроцитов, обработанных феназинметосульфатом, и частичную компенсацию набухания при действии t-BHP.

2. Впервые показано, что индуцированный t-BHP гемолиз значительно усиливается в присутствии 10 цМ клотримазола.

3. Антиоксиданты уменьшают эффекты, наблюдаемые при действии обоих окислителей.

4. Разработан чувствительный метод оценки антиоксидантной активности, основанный на измерении степени гемолиза эритроцитов, подвергнутых окислению третбутнловой гидроперекисью в присутствии клотримазола.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на: 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск), сентябрь 2005 г., объединенном симпозиуме «Oxidants and antioxidants in biology» (Oxygen Club ofCahfornia and Universityof Turin, Alba, Италия), сентябрь, 2006 г., 16-м конгрессе «European Association for Red Cell Research» (Oxford, Великобритания), март 2007 г., VII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2006 г, международной конференции «Oxidative stress ш diseases», (Bratislava, Словакия), апрель 2008 г.

Диссертационная работа апробирована 3 октября 2008 г. на заседании проблемной комиссии № VI «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ ГНЦ РАМН.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 219 источников. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 30 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Для работы использовали кровь здоровых доноров, взятую на цитрате натрия, и полученную на Станции переливания крови ГНЦ РАМН. Эритроциты осаждали путем центрифугирования. Исходную 40-60 % суспензию отмытых эритроцитов разбавляли HEPES-буфером до Hct = 5%. Для окислительной модификации суспензию эритроцитов (Hct=5%) инкубировали при 37°С и постоянном медленном перемешивании с исследуемыми окислителями (феназипметосульфат (ФМС) +аскорбат или третбутиловая гидроперекисью-ВНР)).

Распределение эритроцитов по плотности измеряли с помощью фталатного метода (Danon D., Mankovsky Y., 1964).

Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с помощью разработанной нами модификации метода Lew (Lew VL & Bookchin RM., 2005). Зависимость объема эритроцита человека от осмотичности суспендирующей среды рассчитывали по формуле- V/90 = A-300/U + В, где V - объем, ц3, U - осмотичность среды, мОсм, В - параметр, определяемый средним содержанием гемоглобина в

клетке, А - параметр, определяемый системой ионного гомеостаза эритроцита (Ataullakhanov F I., Vitvitskii V.M, Lisovskaya I.L., Tuzhilova Ye.G., 1994)

Образование АФК измеряли с помощью внутриклеточного флуоресцентного зонда 2',7'-dichlorodihydrofluorescem diacetate (DCFDA) на флоуцитометре Fluorescence Activated Cell Sorter (Becton-Dickinson FACS-Sort Flow Cytometer).

Содержание меттемоглобина в пробе определяли как отношение [MetHb]/[Hbi], количество связавшегося с мембраной гемоглобина определяли модифицированным методом Trotta (Trotta RJ, Sullivan SG, Stern A, 1982).

Концентрацию восстановленного глутатиона в исследуемых образцах суспензии эритроцитов определяли спектрофотометрически (Dize, 1986).

Для определения продуктов переклепого окисления лшщцов использовали модифицированный нами спектрофотометрический метод (Röhn Т.Т., Hinds TR., Vincenzi F.F., 1993).

Степень гемолиза определяли по концентрации гемоглобина в ресуспендирующей среде с использованием метода Драбкина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы изучали взаимодействие эритроцитов с окислительной системой ФМС - аскорбат Оценивали параметры эритроцитов, характеризующие клеточпый объем' распределение по плотности и по осмотической резистентности, а также окисление гемоглобина и продукцию активных форм кислорода (АФК).

Было показано, что обработка ФМС нормальных эритроцитов человека, суспедированных в калыщй-содержащих средах в присутствии 10 мМ аскорбата вызывает зависящие от концентрации ФМС продукцию АФК, окисление гемоглобина и дегидратацию (сжатие) клеток. Сжатие эритроцитов час го регистрируется уже при концентрациях ФМС 25 (J.M и достигает максимума при концентрациях около 500 цМ. Показано, что максимальное сжатие соответствует уменьшению средпего объема эритроцитов, сравнимому с эффектом, наблюдаемым при инкубации эритроцитов с ионофором А23187, т.е. свыше 20 % Отсутствие эффекта в бескальциевых средах, средах с высоким содержанием К+, а также действие ингибитора кальций - зависимых калиевых каналов (Гардос-каналов) клотримазола (Рис. 1, Рис. 2, Рис. 3) свидетельствует о том, что индуцированная окислением дегидратация эритроцитов является результатом повышения концентрации внутриклеточного Са2+ и активации Гардос-каналов.

ФМС, 100цМ

Рис. 1. Зависимость индуцированного окислением сдвига распределения Э по плотности от присутствия Си" в среде.

А. Клетки, ресуспендированные в Са-содержащем HEPES буфере (кривые 1, 2) или в HEPES буфере с 1 мМEGTA (кривая 3), инкубировали без оксиданта (кривая 1) или в присутствии 50 рМ ФМС +10 мМ аскорбата (кривые 2, 3). В. Сдвиг распределения эритроцитов по плотности (сжатие эритроцитов) под действием ФМС + 10 мМ аскорбата (Мс ± SEM), п - 6. Черные столбики - присутствие в среде Са2^, штрихованные столбики - отсутствие Са2\

20 4 0 60 60 100 120 140 160 U, мОсм/кг

140 120 I 100

о"

S 60 40 20 0

I I Мс-осмотичность среды, соответствующая лизису 60% клеток MB W-цжрина распределения

Рис. 2. Влияние кальция и ингибитора Гардос-каналов клотримазола на индуцированное окислением изменение распределения эритроцитов по осмотической резистентности

А. клетки были проинкубированы в НЕРЕЗ-буфере, содержащем 1 мМ ЕГТА (кривые 1 и 3) или в НЕРЕБ-буфере с Са2+ (кривые 2 и 4) в течение 20 минут с 100 ¡хМ ФМС + 10 мМ аскорбата (кривые 3 и 4) или без них (кривые 1 и 2). Затем отбирали аликвоты для определения осмотической резистентности. В. клетки были преинкубированы в течение 15 минут при 37° С с 10 цМ клотримазола (3) или без него (1,2), после чего их инкубировали еще 20 минут с 25 цМ ФМС + 10 мМ аскорбата (2,3) или без них (1). Затем отбирали аликвоты для определения осмотической резистентности, п-3.

Контроль

I IФМС 50 иМ [ЩЦФМС 100 цМ

120-

100-

5 80-

и О

г бо-

40-

20-

Са^.бтМ К*, 5тМ

Са ,1.5 тМ К', ЮОтМ

Рис. 3. Влияние высокой концентрации К* в инкубационной среде на изменение осмотической резистентности эритроцитов под действием окислительной системы ФМС-аскорбат

Клетки ресуспендировали в стандартном НЕРЕ8-буфере (5 мМ К*) или в НЕРЕ8-буфере с высокой концентрацией ионов калия (100 мМ К* , 300 мОсм) и инкубировали 20 минут с 10 мМ аскорбата + 30 рМ или 100 цМ ФМС. Затем из каждой пробы отбирали аликвоты для регистрации кривых осмотической резистентности, и= 4-15.

Наличие легко измеряемых но осмотической резистентности объемных эффектов, вызываемых системой ФМС-аскорбат, генерирующей в эритроцитах образование АФК, могло бы послужить основой для создания клеточной модели, предназначенной для оценки антиоксидантной активности различных соединений. Однако оказалось, что чувствительность этой модели к действию исследованных антиоксидантов (АО): кверцетина, рутина и таксифолина - не очень велика. Заметные эффекты наблюдались только при концентрациях АО свыше 100 цМ.

Следующим этапом работы было изучение влияния на эритроциты трет-бутиловой гидроперекиси.

В нашей работе показано, что, подобно окислительной системе ФМС+аскорбат, 1-ВНР индуцирует образование в эритроцитах АФК и метгемоглобина. Однако влияние перекиси на объемные параметры эритроцитов отличается от действия ФМС.

Кратковременная (до 1 часа) инкубация с 1>ВНР в интервале концентраций 1-3 мМ, в отличие от окисления в присутствии системы ФМС+аскорбат, вызывает дозо-

зависимое набухание эритроцитов Степень этого набухания снижается, если в инкубационной среде присутствуют ионы Са2+, и увеличивается при добавлении ингибитора Гардос-каналов клотримазола (Рис. 4, Рис. 5) Максимальное увеличение клеточного объема в Са-содержащей среде, достигаемое за 20 мин в присутствии 3 мМ МЗНР, соответствует увеличению объема приблизительно на 9 %. В бескальциевой среде или при добавлении 10 |дМ клотримазола эта величина возрастает до 18 %. Присутствие в суспендирующей среде высоких концентраций (100 мМ) ионов К+ также приводит к увеличению степени набухания клеток. Существенное уменьшение степени набухания эритроцитов при кратковременной инкубации с ^ВНР в Са-содержащей среде по сравнению с бескальциевой или в Са-содержащей среде с клотримазолом свидетельствует о том, что и в этом случае происходит активация Гардос-каналов, частично компенсирующая увеличение объема клеток.

1.07 1,08 1,03 1,10 1,11 1,12

Плотность, г/мл

У г/' Vх»

1,07 1,08 109 1 10 1,11 1,12

Плотность, г/мл

Рис. 4. Зависимость индуцированного ВНР сдвига распределения Э по плотности от присутствия Са2+ и клотримазола в среде.

Клетки, ресуспендированные в Са-содержащем НЕРЕБ буфере (кривые 1, 2) или в НЕРЕБ буфере с 1 мМЭГТА (кривая 3), инкубировали без оксиданта (кривые 1) или в присутствии 2 мМ ¡-ВНР (кривые 2, 3) После окончания инкубации клетки отмывали изотоническим НЕРЕ8 буфером и определяли распределение по плотности фталатным методом Представлены результаты двух различных экспериментов А Время инкубации 20 мин В Время инкубации 60 мин. Кривая 4-клетки инкубировали в среде с 1.5мМСа в присутствии 10 цМклотримазола

180-1 В

li100

180

100

U, mOCW/KT

150

20Q

00 0,5 1,0 1,5 20 2,5 3,0 t-BHP, |1М

Рис. 5. Влияние кальция и ингибитора Гардос-каналов клотримазола на индуцированные t-BHP изменения распределения эритроцитов по осмотической резистентности

A. Клетки, ресуспендированные в Са-содержащем HEPES-буфере, (кривые 1, 3) или в HEPES-буфере без кальция с 1 мМ ЭГГА (кривые 2, 4), инкубировали без оксиданта (кривые 1, 2) или в присутствии 2 иМ t-BHP в течение 20 минут (кривые 3, 4) Представлены результаты типичного эксперимента.

B. Клетки инкубировали в Са-содержащем HEPES буфере (кривые 1,2) или в HEPES буфере с 1 мМ EGTA (кривые 3) с разными концентрациями t-BHP без клотримазола (кривые 1,3) или в присутствии 10 ¡Л1 клотримазола (кривая 2) в течение 20 мин После окончания инкубации отбирали аликвоты для определения осмотической резистентности, п — 6-20

Более длительная инкубация в присутствии 2 мМ t-BHP приводит к дальнейшему набуханию эритроцитов, и после двухчасовой инкубации начинается лизис клеток, достигающий через 3 часа 20-30%. В случае длительной инкубации при всех концентрациях перекиси степень гемолиза не зависит от присутствия в среде ионов кальция. При этом клотримазол достоверно увеличивает степень гемолиза (Рис. 6).

50-

SO-

DO OS 10 16 20 2b 30 t-BHP, »М

t, час

Рис. 6. Гемолиз эритроцитов при инкубации с t-BHP

A. Зависимость степени гемолиза от концентрации t-BHP в отсутствие (кривые 1, 2) или в присутствии (кривые 3. 4) 10 fiM клотримазола в Са-содержащей (кривые 1, 3) и бескальциевой (кривые 2, 4) среде Врем инкубации 3 часа.

B. Зависимость степени гемолиза от времени инкубации с 2 мМ-ВНР в отсутствие (кривые 1, 2) или в присутствии (кривые 3. 4) fiM клотримазола в Са-содержащей (кривые 1, 3) и бескальциевой (кривые 2, 4) среде

Если эффекты клотримазола в среде, содержащей кальций, можно связать с его ингибирующим действием на Гардос-каналы, то его действие на осмотическую хрупкость и на гемолиз эритроцитов в среде, не содержащей кальция, не может быть объяснено таким образом. Следовательно, в этих условиях клотримазол выступает в ином качестве, увеличивая индуцированное t-BHP набухание эритроцитов с помощью не зависящих от кальция механизмов. Мы исследовали действие клотримазола на параметры, непосредственно связанные с окислительными воздействиями на эритроцит (концентрация t-BHP от 0.5 до 3 мМ) Отсутствие заметного влияния клотримазола на скорость образования свободных радикалов, на кинетику изменения концентрации восстановленного глутатиона, на преципитацию денатурированного гемоглобина, на образование метгемоглобина и продуктов перекисного окисления липидов (ТБКАП) свидетельствует о том, что клотримазол в концентрации 10 цМ не вызывает дополнительных окислительных повреждений при инкубации эритроцитов с t-BHP.

Известно, что при различных окислительных воздействиях на эритроциты наблюдается окисление и денатурация гемоглобина (образование так называемых телец Гейяца), сопровождающиеся высвобождением гема/гемина (Ferriprotoporphyrin IX) (Chiu DT, Huang TY, 1997) Хорошо известно, что экзогенный гемин легко встраивается в мембрану, дестабилизируя ее и вызывая гемолиз (Fitch CD, Chevli R,

1983; Huy NT, Kamei K, 1997,2002)

Недавно было установлено, что клотримазол образует с экзогеппым гемом (гемином) комплекс, обладающий значительно большим литическим эффектом, чем свободный гем (Huy NT, Kamei К, 2002). В ходе пашей работы впервые было показано, что клотримазол в концентрации 10 цМ существенно усиливает как набухание, так и гемолиз эритроцитов под действием t-BHP, что свидетельствует о значительном усилении повреждения мембраны в присутствии этого соединения (Рис. 6) Вероятно, индуцированный перекисью гемолиз опосредован, хотя бы частично, литическим эффектом гемина, высвобождаемого из гемихрома, образующегося в клетке при окислении гемоглобина (Fitch C.D., Chevh R., 1983). Усиление индуцированного t-BHP гемолиза в присутствии клотримазола (Рис 6), по-видимому, вызвано образованием комплекса высвобождаемого гемина с клотримазолом (Huy N.T. et al, 2002,2004).

В наших условиях этот эффект проявлялся только при добавлении клотримазола в суспензию в течение первых 10-30 минут носле введения перекиси (Рис. 7), что, возможно, связано с происходящей за это время деградацией (Schmitt ТН, Frezzatti WA Jr, Schreier S., 1993; Atamna H, Ginsburg H., 1995; Kumar S, Bandyopadhyay U., 2005) или агрегацией (Wang F, Wang T, Lai J, Li M, Zou С , 2006; Schmitt TH, Frezzatti WA Jr, Schreier S., 1993) гемина, высвобождаемого из окисленного гемоглобина.

10-1-1---1-,-1-,-1 ' --1---1---1-,-г-

0 10 20 30 40 50 60 70

Л t, мин

Рис. 7. Зависимость иВНР-индуцированпого гемолиза от интервала времени между добавлением перекиси и клотримазола.

Суспензию эритроцитов инкубировали в присутствии клотримазола, который был добавлен через указанные промежутки ертени (А после внесения в суспензию 2 мМ ¡-ВНР. Кружком обозначен уровень гемолиза при инкубации клеток с 2 мМ ¡-ВНР в отсутствие клотримазола

Таким образом, можно рассматривать СЬТ как агент, усиливающий окислительный гемолиз эритроцитов под действием МЗНР. Гипотетическая схема происходящих при этом процессов представлена на Рис. 8

ÎÏ * Пят

ПОЛ * Повреждение

Снижение белков уровня G-SH, V АТФ j

Гемолиз

Встравванне в мембрану

Нарушен в е структуры мембраны

Рис. 8. Схема гемолиза эритроцитов, подвергнутых действию третбутиловой гидроперекиси.

Известно, что антиоксиданты снижают степень индуцированного гемином (Wang F., 2006; Li S.D., 2006) и t-BHP (Smith RC, 1986; Löpez-Revuelta A, 2006) повреждения мембраны и последующего гемолиза.

Мы исследовали действие нескольких известных антиоксидантов (тролокс, кверцетин, таксифолин), а также некоторых антибиотиков тетрациклинового ряда (хлор-тетрациклин, миноциклин, тетрациклин, доксициклин) на гемолиз, индуцированный t-BHP (2 мМ) в присутствии 10 цМ клотримазола (Рис. 9).

|с»

— ■- Хлор-(тетрациклин) ЗббцМ

— Кверцетин 13 0цМ

—А- Такси фол и к 15 8 цМ

Тролокс 198(1М

Миноциклин ЗббдМ

— Тетрациклин 75 4|1М

—О— Доксициклин 91 З^М

0 30 60 90 120 150 180 Концентрация антиоксиданта, |дМ

210

Рис. 9. Влияние антиоксидантов на гемолиз, индуцированный ¡-ВНР в присутствии клотримазола.

Суспензию эритроцитов преинкубировали в течение 10 мин. с разными концентрациями антиоксидантов, затем добавляли ¡-ВНР, 2 мМ + СЬТ, 10 рМ и инкубировали в течение 3 ч., п = 5 - 20.

Как видно из Рис. 9, значительное снижение окислительного гемолиза наблюдается уже при действующих концентрациях АО около 20 мкМ, что свидетельствует о высокой чувствительности использованного теста.

Итак, для оценки активности АО могут быть использованы два метода: (1) оценка влияния АО па изменение осмотической резистентности эритроцитов, подвергнутых окислению в присутствии системы ФМС+аскорбат и (2) оценка влияния АО на изменение степени гемолиза, индуцированного МЗНР+СЬТ.

Поскольку второй метод обладает значительно большей чувствительностью и технически более прост, именно этот метод предложен нами для оценки АОА различных соединений. Ниже приведены схема (Рис. 10) и описание разработанного нами метода оценки АОА, основанного на измерении гемолиза эритроцитов, индуцированного третбугиловой гидроперекисью в присутствии клотримазола.

Метод оценки активности антиоксидантов

цельная кровь

+ t-BHP, 2 mM + CLT, 10 дМ

5% суспензия эр-тов, 1 мл

исследуемых антаоксйдант

Инкубация Зч . „ ДО , пои! = 37гвм С=>7000об/шн„ с}

при! = 37 фад

5 мин

96-луночный планшет, 200 шл р-р Drebkin вкзкдой луш

100 ц) супер-натанта

планшетный СФ ридер, 31 = 490 нм

Рис. 10. Схема метода оценки АОА, основанного на чнгибировании гемолиза эритроцитов, индуцированного t-BHP в присутствии клотримазола.

Описание метода оценки антиоксидантнон активности по степени ипгибировапия гемолиза, индуцированного 2 mM t-BHP в присутствии 10 цМ

клотримазола.

1. Цельную кровь, взятую на цитрате или на гепарине, отмывают физиологическим раствором, и ресуспендируют отмытые эритроциты в HEPES-буфере при гематокрите 5%.

2. 70% водный раствор трет-бутилгидроперекиси (Sigma-Aldrich) разбавляют физиологическим раствором до концентрации 100 мМ и используют в день приготовления.

3. Спиртовой раствор клотримазола (Sigma) 100 мМ хранят в холодильнике 1 - 2 месяца. Непосредственно перед использованием разбавляют его физиологическим раствором до концентрации 1 мМ При этом получается мутная белая взвесь.

4. К 1 мл 5% суспезии эритроцитов в пробирках Eppendorf добавляют исследуемый антиоксидант в разных концентрациях, инкубируют около 20 минут, после чего вносят 10 цл взвеси клотримазола (предварительно встряхивать! Конечная концентрация 10 цМ, ) и практически сразу после этого 20 рл ЮОмМ раствора t-BHP (конечная концентрация 2 мМ)

5. Приготовленные образцы инкубируют 3 часа в термостате (37 град С) при непрерывном мягком покачивании.

6. После окончания инкубации образцы центрифугируют на центрифуге Eppendorf при 7000 об/мин в течение 5 минут.

7. По 100 мкл надосадка вносят в плоскодонные лунки 96-лупочного планшета, содержащие по 200 мкл раствора Драбкпна.

8. Измеряют степень гемолиза по оптической плотности образцов при 490 нм на планшетном СФ ридере. Строяг зависимость степени гемолиза от концентрации исследуемого антиоксиданта. Выражают АОЛ как концентрацию антиоксиданта, соответствующую 50% ингибированию гемолиза (IC50).

Выводы

1 При действии на эритроциты двух разных окислителей - ФМС-аскорбат (0 025 - 1 мМ) и третбутиловая гидроперекись (1-3 мМ) наблюдается активация Са-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект), что приводит к сжатию эритроцитов при действии ФМС-аскорбат и к частичной компенсации набухания при действии третбутиловой гидроперекиси.

2. Впервые показано, что индуцированный t-BHP гемолиз значительно усиливается в присутствии 10 цМ клотримазола.

3. Антиоксиданты уменьшают эффекты, наблюдаемые при действии обоих окислителей.

4. Предложен чувствительный метод оценки антиоксидантной активности, основанный на измерении степени гемолиза эритроцитов, подвергнутых окислению третбутиловой гидроперекисью в присутствии клотримазола.

Список работ, опубликованных по теме диссертации,

1) Щербаченко И.М*., Лисовская И.Л.. Полтанов Е.А., Владимиров Ю.А, Атауллаханов Ф.И.,Тихонов В.П Влияние дигидрокверцетина на изменение геометрических параметров эритроцитов при окислении Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека. Смоленск 2005

2) Scherbachenko I.M., Lisovskaya I L.,Poltanov E.A., Vladimirov Yu A., Ataullakhanov F I.,Tikhonov V P. Effects of dihydroquercetin on oxidation-induced changes of human red blood cells. Oxidants and antioxidants in biology, Abstracts. Oxygen Club of California, Turin. 2006 p 201.

3) Щербаченко И.М*., Лисовская И.Л. Тихонов В.П, Атауллаханов Ф.И. Модифицированные окислением эритроциты как тест-система для оценки активности антиоксидантов. VII Международная конференция «Биоаксидант» Москва 2006. стр 285.

4) Lisovskaya I.L., Shcherbachenko IM, Volkova RI, Vitvitsky VM, Tikhonov VP. Dehydration of normal human red blood cells due to oxidant-induced Gardos channel activation. 16-th Meeting of the European Association for Red Cell Research, Oxford 16-19 march 2007.

5) Shcherbachenko IM, Lisovskaya IL, Tikhonov VP. Oxidation-induced calcium-dependent dehydration of normal human red blood cells. Free Radic Res. 2007 May;41(5):536-545.

6) Щербаченко ИМ, Лисовская И.Л., Любицкий О.Б., Осипов АН-Определение осмотической резистентности эритроцитов, модифицированных окислением, как способ оценки активности антиоксидантов. "Вестник РГМУ\ №6 (59), 2007,с.70-75.

7) Shcherbachenko IM, Lisovskaya IL, Tikhonov VP,Ataullakhanov FI. T-BuOOH + CLT - induced erythrocyte hemolysis as a model of oxidative cell membrane damage. Oxidative stress in diseases, Bratislava, April, 23-25, 2008, p 28.

8) Lisovskaya IL, Shcherbachenko IM, Volkova RI, Tikhonov VP. Modulation of RBC volume distributions by oxidants (phenazine methosulfate and tert-butyl hydroperoxide): Role of Gardos channel activation. Bioelectrochemistry 2008 Jun;73(l):49-54.

Подписано в печать 29.10.2008 г.

Формат 60/84 1x16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. п. л. 1.5. Тираж 100 экз Заказ № П-524

Типография «Телер» 127299, Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Тел : (495) 937-8664,156-4084

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щербаченко, Ирина Михайловна

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эритроциты. Общие сведения

1.1.1. Структура эритроцитов

1.1.2. Метаболизм и ионный баланс

1.1.3. Структура и функции гемоглобина

1.2. Активные формы кислорода

1.3. Факторы, вызывающие окислительный стресс в эритроцитах

1.3.1. Аутоокисление гемоглобина

1.3.2. Фагоциты как источник активных форм кислорода

1.3.3. Реакции эритроцитов с ксенобиотиками

1.4. Биохимические основы защиты эритроцитов от окислительного стресса. Эндогенные антиоксиданты

1.5. Модификация эритроцитов под действием окислителей

1.5.1. Перекисное окисление липидов

1.5.2. Окисление тиоловых групп белков

1.5.3. Действие окислительного стресса на механизмы ионного транспорта

1.5.4. Образование гемихромов и высвобождение гемма. Повреждение мембран эритроцитов под действием свободного гемма

1.5.5. Изменение деформируемости

1.5.6. Экзогенные антиоксиданты и их применение в качестве лечебных препаратов 33 1.7. Методы,применяемые для оценки активности антиоксидантов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы исследования 38 2.2.1. Подготовка суспензии эритроцитов

2.2.2. Модификация эритроцитов с помощью окислительных воздействий

2.2.3. Определение распределения эритроцитов по плотности

2.2.4. Определение распределения эритроцитов по осмотической резистентности. Расчет изменения объема эритроцита

2.2.5. Измерение образования активных форм кислорода

2.2.6. Определение накопления метгемоглобина

2.2.7. Измерение преципитации гемоглобина

2.2.8. Определение содержания восстановленного глутатиона

2.2.9. Оценка перекисного окисления липидов

2.2.10. Измерение гемолиза

2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Влияние окислительной системы феназинметосульфат — аскорбат на эритроциты человека

3.1.1. Окисление гемоглобина

3.1.2. Внутриклеточное образование активных форм кислорода

3.1.3. Влияние окислительной системы феназинметосульфат—аскорбат на объемные параметры эритроцитов. Активация Гардос-каналов

3.1.4. Влияние антиоксидантов на продукцию активных форм кислорода и на изменение осмотической резистентности эритроцитов

3.2. Влияние третбутиловой гидроперекиси на эритроциты человека

3.2.1. Внутриклеточное образование активных форм кислорода

3.2.2. Влияние третбутиловой гидроперекиси на объемные параметры эритроцитов. Активация Гардос-каналов

3.2.3. Влияние третбутиловой гидроперекиси на осмотическую резистентность эритроцитов. Эффект клотримазола в бескальциевой среде

3.2.4. Действие кальция и клотримазола на индуцированный третбутиловой гидроперекисью гемолиз эритроцитов

3.2.5. Действие клотримазола на окислительно-восстановительный статус эритроцитов, подвергнутых окислению в присутствии третбутиловой гидроперекиси

3.2.6. Влияние антиоксидантов на внутриклеточную продукцию активных форм кислорода

3.2.7. Влияние антиоксидантов на гемолиз эритроцитов

3.3. Метод оценки антиоксидантной активности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов"

Актуальность проблелгы

Кислород, необходимый для энергообеспечения клеток и тканей млекопитающих, служит одновременно источником так называемых активных форм кислорода (АФК), являющихся промежуточными продуктами окислительного метаболизма. Механизмы действия АФК сложны, разнообразны и до настоящего времени не вполне изучены. Не вызывает сомнения определяющая биологические эффекты роль клеточных мембран и изменение их структуры и функций под действием АФК.

Эритроциты млекопитающих являются удобной моделью для изучения механизмов окислительных повреждений, поскольку они доступны в больших количествах, не содержат ядер и митохондрий и не способны к синтезу белков. Они циркулируют в крови 120 дней и более других клеток контактируют с кислородом и его активными формами. Постоянное взаимодействие с кислородом вызывает аутоокисление содержащегося в эритроцитах гемоглобина с образованием супероксид-радикалов (02' ), а также других АФК, главным образом, перекиси водорода (Н2О2) и гидроксил-радикалов (ОН.). В организме источниками экзогенных для эритроцитов АФК являются другие клетки крови (тромбоциты, моноциты, нейтрофилы и макрофаги), а также эндотелий сосудов. Кроме того, появлению избыточных количеств АФК в эритроцитах могут способствовать действие радиации и некоторых ксенобиотиков.

В норме окислительный стресс индуцирует старение эритроцитов, которое, как известно, сопровождается уменьшением клеточного объема, потерей клеточной поверхности, снижением деформируемости и нарушением асимметричного распределения фосфолипидов мембраны. Как известно, постаревшие эритроциты выводятся из кровотока ретикуло-эндотелиалыюй системой, в частности, поглощаются макрофагами.

Хорошо известно, что образование АФК в различных тканях усиливается при воспалении, иммунологических нарушениях, гипоксии и гипероксии, при старении, действии ионизирующего облучения, шоке, ишемии-реперфузии, дефиците витаминов и во многих других патофизиологических ситуациях. Свободнорадикальные формы кислорода принимают участие в патогенезе многих наследственных заболеваний, таких как серповидно-клеточная анемия, талассемия и дефицит глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. Спровоцированное окислительным стрессом повреждение мембран эритроцитов приводит к ухудшению их реологических свойств: снижению деформируемости и повышению адгезивности, спосбствуя развитию ишемии, анемии и гиперкоагуляции, усугубляющих первичную патологию.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было создание экспериментальной модели для оценки активности антиоксидантов с использованием эритроцитов, подвергнутых окислительным воздействиям.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить влияние окислительной системы феназин метосульфат+аскорбат на эритроциты человека.

2. Изучить влияние третбутиловой гидроперекиси на эритроциты человека

4. Разработать метод оценки антиоксидантной активности на основе выбранной окислительной системы.

Научная новнзиа

Показано, что действие на эритроциты окислителей (феназин-метосульфат, третбутиловая гидроперекись) приводит к активации кальций-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект). Активация Гардос-каналов при действии феназин-метосульфата вызывает сжатие (дегидратацию) эритроцитов, а при действии третбутиловой гидроперекиси частично компенсирует увеличение объема клеток. Высказано предположение, что активация Гардос-каналов является общим свойством клеточного ответа при окислительных воздействиях.

Впервые показано, что присутствие клотримазола приводит к существенному усилению гемолиза, индуцированного третбутиловой гидроперекисью. Преинкубация суспензии эритроцитов с антиоксидантами достоверно снижает степень гемолиза.

Предложен новый метод оценки активности антиоксидантных препаратов по степени ингибирования гемолиза, индуцированного третбутиловой гидроперекисью в присутствии клотримазола.

Практическая значимость

Предложенный нами метод внедрен в систему контроля качества на ОАО Завод экологической техники и экопитания «Диод» (г. Москва) как один из способов контроля биологической активности выпускаемой продукции. С помощью данного метода проводится оценка антиоксидантной активности веществ, используемых в производстве в настоящее время, а также скрининг потенциально обладающих антиоксидантной активностью соединений в процессе разработки новых препаратов.

Этот метод оценки антиоксидантной активности (АОА) может быть рекомендован для использования при разработке и производстве лекарственных препаратов. Для внедрения предложенного метода не требуется сложного и дорогостоящего оборудования. Для проведения анализа достаточно небольшого объема крови (~ 100 |лл). Метод является высоко чувствительным и хорошо воспроизводимым.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на: 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск), сентябрь 2005 г., объединенном симпозиуме «Oxidanis and antioxidants in biology» (Oxygen Club of California and University of Turin, Alba, Италия), сентябрь, 2006 г., 16-м конгрессе «European Association for Red Cell Research» (Oxford, Великобритания), март 2007 г., VII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2006 г., международной конференции «Oxidative stress in diseases», (Bratislava, Словакия), апрель 2008 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 219 источника. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 30 рисунками и 1 таблицей.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Щербаченко, Ирина Михайловна

Выводы

1. При действии на эритроциты двух разных окислителей - ФМС-аскорбат (0.025 - 1 мМ) и третбутиловая гидроперекись (1-3 тМ) наблюдается активация Са-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект), что приводит к сжатию эритроцитов в присутствии окислительной системы ФМС-аскорбат и к частичной компенсации набухания в присутствии третбутиловой гидроперекиси.

2. Впервые показано, что индуцированный 1:-ВНР гемолиз значительно усиливается в присутствии 10 цМ клотримазола.

3. Антиоксиданты уменьшают эффекты, наблюдаемые при действии обоих окислителей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щербаченко, Ирина Михайловна, Москва

1. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Кияткин А.Б., Пичугин A.B. Регуляция объема эритроцита человека. Роль активируемых кальцием калиевых каналов.// Биофизика 1993. - Т. 38, №5. - С. 809-821.

2. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Комарова C.B., Мошаров Е.В. Энергозависимые процессы и метаболизм аденилатов в эритроцитах человека.// Биохимия 1996. - Т. 61, № 2. - С. 266-274.

3. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И., Козлов A.B., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники. Биофизика. Т. 29. М.: ВИНИТИ, 1991. - 249с.

4. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252с.

5. Воробьев А.И. (ред.). Руководство по гематологии — 1985.

6. Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты.// Успехи физиол. Наука 2001, 32(3), 66-78.

7. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Комаров О.С., Владимиров Ю.А. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. Дело. 1988. - Т. 5. - С. 59 - 62.

8. Козинец Г.И, Быкова И.А., Ряполова И.В., Еременко Л.Л. Морфофункциональные особенности эритроцитов периферической крови больных железодефицитной анемией.// Гематология и трансфузиология 1984, 29(6), 19-20.

9. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия. Перевод с немецкого. 2000, стр 274-275.

10. Лисовская И.Л., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Кульман P.A., Гончаров И.Б., Аграненко В. А. Фильтрационное исследование деформируемости эритроцитов. Гематология и трансфузиология 1993, т.38, №2, стр. 12-15.

11. Плотников М.Б., Тюкавкина H.A., Плотникова Т.М. Лекарственные препараты на основе дигидрокверцетина.- Изд-во Томского ун-та. 2005. - 228 с.

12. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Методы исследования антиоксидантов // Химия растительного сырья. 2004. - № 3. - С. 63-75.

13. Чернух A.M., Александров П.Н., Алексеев О.В. Микроциркуляция. М. 1984.

14. Afanas'ev IB, Dorozhko AI, Brodskii AV, Kostyuk VA, Potapovitch AI. Chelating and free radical scavenging mechanisms of inhibitory action of rutin and quercetin in lipid peroxidation // Biochem Pharmacol. 1989. - V. 38, №11. - Pp. 1763-1769.

15. Alayash AI, Patel RP, Cashon RE. Redox reactions of hemoglobin and myoglobin: biological and toxicological implications // Antioxid Redox Signal. 2001. - V.3, №2.-Pp. 313-27.

16. Alvarez J, García-Sancho J, Herreros В. Effects of electron donors on Ca2+-dependent K+ transport in one-step inside-out vesicles from the human erythrocyte membrane // Biochim Biophys Acta. 1984. - V. 771, № 1. - Pp. 123-127.

17. Amer J, Goldfarb A, and Fibach E. Flow cytometric analysis of the oxidative status of normal and thalassemic red blood cells // Cytometry A. 2004. - V. 60, №1. -Pp.73-80.

18. Arner ES, Holmgren A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase. Minireview // Eur J Biochem. 2000. - V. 267, № 20. - Pp. 6102-6109.

19. Arora A, Byrem TM., Nair MG., Strasburg GM. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids // Arch. Biochem. Biophys. 2000. -V.373. - P. 102-109.

20. Ataga KI, Cappellini MD, Rachmilewitz EA. Beta-thalassaemia and sickle cell anaemia as paradigms of hypercoagulability // Br J Haematol. 2007. - V.139, №1. -Pp. 3-13.

21. Atamna H, Ginsburg H. Heme degradation in the presence of glutathione. A proposed mechanism to account for the high levels of non-heme iron found in the membranes ofhemoglobinopathic red blood cells // J Biol Chem. 1995 - V.270, №42. - Pp. 2487624883.

22. Ataullakhanov FI., Vitvitskii VM., Lisovskaya IL., Tuzhilova YeG. Analysis of the geometric parameters and mechanical properties of erythrocytes by the method of membrane nuclear filtration. Mathematical model // Biophizika. 1994. - V.39. -Pp. 672-680.

23. Baboir BM. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes // N. Engl. J. Med. -1978. V.298. - Pp. 721-725.

24. Balla J, Jacob HS, Balla G, Nath K, Eaton JW, Vercellotti GM.Endothelial-cell heme uptake from heme proteins: induction of sensitization and desensitization to oxidant damage //Proc Natl Acad Sci USA.- 1993. V.90, № 20. - Pp. 9285-9289.

25. Ballas SK and Krasnow SH. Structure of erythrocyte membrane and its transport functions 11 Annals of Clinical and Laboratory Science. 1980. - V.10, №3. - Pp. 209-219.

26. Bartolommei G, Tadini-Buoninsegni F, Hua S, Moncelli MR, Inesi G, Guidelli R. Clotrimazole inhibits the Ca2+-ATPase (SERCA) by interfering with Ca2+ binding and favoring the E2 conformation // J Biol Chem. 2006. - V.281, №14. - Pp. 9547-551.

27. Baskurt OK, Gelmont D, and Meiselman HJ. Red blood cell deformability in sepsis // Am J Respir Crit Care Med . 1998. - V. 157, №2 - Pp. 421 -427.

28. Beauge L and Lew VL. Passive fluxes of sodium and potassium across red cell membranes. In: Membrane Transport in Red Cells, edited by J. C. Ellory and VL. Lew// London: Academic, 1977. - Pp. 39-51.

29. Becker K, Gromer S, Schirmer R. and Muller S. Thioredoxin reductase as a pathophysiological factor and drug target // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267, № 20 -Pp. 6118-6125.

30. Bennett V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications for more complex cells // Annu. Rev. Biochem. 1985. - V. 54 - Pp. 273-304.

31. Bernhardt I., Ellory J.C (Eds.) Red Cell Membrane Transport in Heallth and Disease // Springer. 2003.

32. Beutler E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective // Blood.-2008.-V. Ill, № 1. Pp. 16-24.

33. Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical // Nature. -1958,-V. 26-Pp. 1198-1200.

34. Blumenfeld N., Zachowski A., Galacteros F. et al. Transmembrane mobility of phospholipids in sickle erythrocytes: effect of deoxygenation on diffusion and asymmetry // Blood. 1991. - V. 77 - Pp. 649-854.

35. Bookchin R.M., Ortiz O.E., Lew V.L. Activation of calcium-dependent potassium channels in deoxygenated sickled red cells // Prog. Clin. Biol. Res. 1987. - V. 240 -Pp. 193-200.

36. Bors W, Michel C, Saran M. Flavonoid antioxidants: rate constants for reactions with oxygen radicals // Methods Enzymol. 1994. - V.234. - Pp. 420-429.

37. Bratosin D., Mazurier J., Tissier J.P., Estaquier J., Huart J.J., Ameisen J., Aminoff D, Montreuil J. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review // Biochimie. 1998. - V. 80, Pp.173-195.

38. Brown M and Wittwer C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology // Clin. Chem. 2000. - V. 46, № 8. - Pp. 1221-1229.

39. Brugnara C, Gee B, Armsby CC, et al. Therapy with oral clotrimazole induces inhibition of the Gardos channel and reduction of erythrocyte dehydration in patients with sickle cell disease // J Clin Invest. 1996. - V. 97. - Pp. 1227-1234.

40. Cao G., Sanchez-Moreno C., Prior RL. Procyanidins, anthocyanins and antioxidant capacity in wines // Faseb Journal. 2000. — V. 14. — P. A564.

41. Caprari P, Bozzi A, Malorni W, Bottini A, Iosi F, Santini MT, Salvati AM Junctional sites of erythrocyte skeletal proteins are specific targets of tert-butylhydroperoxide oxidative damage // Chem Biol Interact. 1995. - V.94, №3. - Pp. 243-258.

42. Cesquini M, Tenor AC, Torsoni MA, Stoppa GR, Pereira AL, Ogo SH. Quercetin diminishes the binding of hemoglobin to the red blood cell membrane // Journal of Anti-Aging Medicine. 2001. - V 4, № 1,- Pp. 55-63.

43. Chan AC., Chow C and Chiu D. Interaction of antioxidants and their implication in genetic anemia // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1999. - V.222. - Pp. 274-282.

44. Chasis JA and Mohandas N. Erythrocyte membrane deformability and stability: two distinct membrane properties that are independently regulated by skeletal protein associations//J Cell Biol. 1986.-V. 103.-Pp. 343-350.

45. Chen IC., Chang HC., Yang HW., Chen GL. Evaluation of total antioxidant activity of several popular vegetables and Chinese herbs: a fast approach with ABTS/H202/HRP system in microplates // Journal of Food and Drug Analysis. -2004.-V. 12, №1.-P. 29-33.

46. Chiu D, Kuypers F, Lubin B: Lipid peroxidation in human red cells // Semin Hematol. 1989. - V.26, № 4. pp. 257-276.

47. Chiu D, Lubin B. Oxidative hemoglobin denaturation and RBC destruction: The effect of heme on red cell membranes // Semin Hematol. 1989. - V. 26. - P. 128.

48. Chiu D., Lubin B., Roelofsen B., VanDeenen LLM. Sickled erythrocytes accelerate clotting in vitro: An effect of abnormal membrane lipid asymmetry// Blood. 1981. -V. 58.-Pp. 398-401.

49. Chiu DT, Huang TY, Hung IJ, Wei JS, Liu TZ, Stern A. Hemin-induced membrane sulihydryl oxidation: possible involvement of thiyl radicals // Free Radic Res. -1997. V. 27, № 1. - Pp.55-62.

50. Chiu DT, Liu TZ Free radical and oxidative damage in human blood cells // J Biomed Sci. 1997. - V. 4 - Pp. 256-259.

51. Chiu DT, van den Berg J, Kuypers FA, Hung IJ, Wei JS, Liu TZ. Correlation of membrane lipid peroxidation with oxidation of hemoglobin variants: possibly related to the rates of hemin release // Free Radic Biol Med. 1996. - V. 21, № 1. - Pp. 89-95.

52. Chou AC, Fitch CD. Mechanism of hemolysis induced by ferriprotoporphyrin IX // J Clin Invest. 1981. - V. 68. - P.672.

53. Comporty M. Lipid peroxidation and cellular damage in toxic liver injury // Lab. Invest. 1985. - V.53, № 6. - Pp. 599-623.

54. Czapski G. Reaction of hydroxyl radical // Meth. Enzymol. 1984. - V.105. - Pp. 209-215.

55. Dai F, Miao Q, Zhou B, Yang L, Liu ZL. Protective effects of flavonols and their glycosides against free radical-induced oxidative hemolysis of red blood cells // Life Sci. 2006. -V. 78, № 21. - Pp. 2488-493.

56. Danon D., Marikovsky Y. Determination of density distribution of red cell population // J. Lab. Clin. Med. 1964. - V. 64. - Pp. 668-673.

57. Das KC, White CW. Redox systems of the cell: possible links and implications // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. V. 99, № 15. - Pp. 9617-618.

58. Davies KJA. and Goldberg AL. Oxygen radicals stimulate intracellular proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erythrocytes // J. Biol. Chem. -1987. V. 262. - Pp. 8220-8226.

59. Deuticke B, Klonk S, Haest CWM. Erythrocyte membrane barrier formation: role of bilayer polarity and skeletal proteins // Biochem Soc Trans. 1992. - V. 20. - Pp. 769-773.

60. Dise CA, Goodman DB. t-Butyl hydroperoxide alters fatty acid incorporation into erythrocyte membrane phospholipids // Biochim Biophys Acta. 1986. - V. 859, № l.-Pp. 69-78.

61. Dobbe J.G., Hardeman M.R., Streekstra G.J., Strackee J., Ince C., Grimbergen C.A. Analyzing red blood cell-deformability distributions // Blood Cells Mol Dis. 2002. -V. 28.-Pp. 373-384.

62. Domanski AV, Lapshina EA, Zavodnik IB. Oxidative processes induced by tert-Butyl Hydroperoxide in human red blood cells: Chemoluminescence studies // Biochemistry (Mosc.). 2005. - V. 70, № 7. - Pp. 922-932.

63. Dunn PM. The action of blocking agents applied to the inner face of of Ca-activated K+ channels from human erythrocytes // J Membr Biol. 1998. - V. 165. - Pp. 133143.

64. Duranton C, Huber SM, Lang F. Oxidation induces a Cl(-)-dependent cation conductance in human red blood cells // J Physiol. 2002. - V. 539, № 3. - Pp. 847855.

65. Dwight JF., Hendry BM. The effects of tert-butyl hydroperoxide on human erythrocyte membrane ion transport and the protective actions of antioxidants // Clinica Chimica Acta. 1996. - V. 249. - Pp. 167-181.

66. Edwards CJ and Fuller J. Oxidative Stress in Erythrocytes // Comp Haematol Int. -1996.-V. 6.-Pp. 24-31.

67. Ehlenfeldt MK, Prior RL. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2001. - V. 49. - Pp. 2222-2227.

68. Eldor A and. Rachmilewitz EA The hypercoagulable state in thalassemia // Blood. -2002. V. 99, № 1. - Pp. 36-43.

69. Elewa HF, Hilali H, Hess DC, Machado LS, Fagan SC. Minocycline for short-term neuroprotection // Pharmacotherapy. 2006. - V.26, №4. - Pp. 515-521.

70. Ellory JC, Robinson HC, Browning JA, Stewart GW, Gehl KA, Gibson JS. Abnormal permeability pathways in human red blood cells // Blood Cells Mol Dis. -2007. V.39, №1. - Pp. 1-6.

71. Fitch CD, Chevli R, Kanjananggulpan P, Dutta P, Chevli K, Chou AC. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent // Blood. 1983. - V. 62, № 6. - Pp.1165168.

72. Fitch CD, Dutta P, Kanjananggulpan P, Chevli R. Ferriprotoporphyrin IX: a mediator of the antimalarial action of oxidants and 4-aminoquinoline drugs // Prog Clin Biol Res. 1984. — V. 155.-Pp.119-130.

73. Flynn TP, Allen DW, Johnson GJ, White JG. Oxidant damage of the lipids and proteins of the erythrocyte membranes in unstable hemoglobin disease // J Clin Invest. 1983,-V. 71, № 5. - Pp.1215-223.

74. Forman HJ. and Torres M. Reactive Oxygen Species and Cell Signaling: Respiratory Burst in Macrophage Signaling // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002. - V. 166, (12, Pt 2).-S4-8.

75. Freedman J, Hoffman JH. Ionic and osmotic equilibria of human red cells treated with nystatin.// J. Gen. Physiol. 1979. - V. 74. - Pp. 157-185.

76. Fridovich, I. Quantitative aspects of the production of superoxide anion radical by xanthine oxidase // J. Biol. Chem. 1970. - V. 245. - Pp. 4053-4057.

77. Garcia-Sancho J & Herreros B. Effects of redox agents on the Ca2+-activated K+ channel // Cell Calcium. 1984. - V. 4. - Pp. 493-497.

78. Garcia-Sancho J., Sanchez A., Herreros B. Stimulation of monovalent cation fluxes by electron donors in the human red cell membrane // Biochim. Biophys. Acta. -1979.-V. 556.-Pp. 118-130.

79. Gardos G. The function of calcium in the potassium permeability of human erythrocytes // Biochim Biophys Acta. 1958. V. 30. - Pp. 653-654.

80. Gardos G., Szasz I., Sarkadi B. Effect of intracellular calcium on the cation transport processes in human red cells.// Acta Biol Med Ger. 1977. - V. 36. - Pp. 823-829.

81. Georgetti SR, Casagrande R., Di Mambro VM, Azzolini A, Forseka MJ. Evaluation of the antioxidant activity of different flavonoids by the chcmiluminescence method // AAPS Pharm Sci. 2003. - V. 5, № 2. - E. 2.

82. Gibson JS & Muzyamba MC. Modulation of Gardos channel activity by oxidants and oxygen tension: effects of l-chloro-2,4-dinitrobenzene and phenazine methosulphate // Bioelectrochemistry. 2004. - V. 62. - Pp. 147-152.

83. Gibson JS, Muzyamba MC, Ellory CJ. Effect of phenazine methosulphate on K+ transport in human red cells // Cell Physiol Biochem. 2003. - V. 13, № 6. -Pp.329-336.

84. Goldstein BD, Rozen MG, Kunis RL. Role of red cell membrane lipid peroxidation in hemolysis due to phenylhydrazine // Biochem Pharmacol. — 1980. V. 29, № 10. — Pp.1355-359.

85. Gutteridge JM. Iron promoters of the Fenton reaction and lipid peroxidation can be released from haemoglobin by peroxides // FEBS Lett. — 1986. — V. 201, № 2. — Pp. 291-295.

86. Halliwell B, and Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement,and significance //Am J ClinNutr. 1993. V. 57, № 5, Suppl:715S-724S.

87. Halliwell B, Cross CE. Oxygen-derived species: their relation to human disease and environmental stress //Environ Health Perspect. 1994. - V.102, Suppl 10. - Pp.512.

88. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine // 2nd ed. Oxford: Clarendon Press. 1989.

89. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine // Oxford University Press. Oxford. - 1999.

90. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence? // Lancet. 1994. - V. 344 (8924). - Pp. 721-724.

91. Halliwell B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life // Plant physiology. 2006. - V. 141, № 2. - Pp. 312-322.

92. Hebbel RP, Eaton JW. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane // Semin Hematol. 1989. - V. 26, №2. - Pp.136-149.

93. Hebbel RP, Morgan WT, Eaton JW, Hedlund BE. Accelerated autooxidation and heme loss due to instability of sickle hemoglobin // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. -V. 85, №1. - Pp. 237-241.

94. Hebbel RP. Beyond hemoglobin polymerization: the red blood cell membrane and sickle disease pathophysiology // Blood. 1991. - V. 77, №2. - Pp. 214-237.

95. Hebbel RP., Leung A., Mohandas N. Oxidation-induced changes in microrheologic properties of the red blood cell membrane// Blood. 1990. - V. 76. - Pp. 1015-1020.

96. Hollman PC, Katan MB. Absorption, metabolism and health effects of dietaiy flavonoids in man// Biomed Pharmacother. 1997. - V.51, №8. -Pp.305-310.

97. Huang CC, Hall AC, Lim PH. Induction of calcium-activated potassium channel activity by hemin in human erythroleukemia cells // Life Sci. 2004. - V.75, № 3. — Pp.329-338.

98. Huy NT, Kamei K, Yamamoto T, Kondo Y, Kanaori K, Takano R, Tajima K, Hara S. Clotrimazole binds to heme and enhances heme-dependent hemolysis: proposed antimalarial mechanism of clotrimazole // J Biol Chem. 2002. — V. 277, № 6. — Pp.41524158.

99. Huy NT, Takano R, Hara S, Kamei K.Enhancement of heme-induced membrane damage by the anti-malarial clotrimazole:the role of colloid-osmotic forces // Biol Pharm Bull. — 2004. V. 27, № 3. - Pp.361-365.

100. Jacob HS, Brain MC, Dacie JV. Altered sulfhydryl reactivity of hemoglobins and red blood cell membranes in congenital Heinz body hemolytic anemia // J Clin Invest. -1968.-V. 47, № 12. — Pp.2664-2677.

101. Jacob HS, Winterhalter KH. The role of hemoglobin heme loss in Heinz body formation: Studies with a partially heme-deficient hemoglobin and with genetically unstable hemoglobins // J Clin Invest. 1970. - V. 49, № 11. - Pp.2008-2011.

102. Jacobs MH and Stewart DR. The role of carbonic anhydrase in certain ionic exchanges involving the erythrocyte //J Gen Physiol. 1942. - V. 25. - Pp. 539-552.

103. Jain SK, Hochstein P. Generation of superoxide radicals by hydrazine: its role in phenylhydrazine induced hemolytic anemia // Biochim. Biophys. Acta . 1979. - V. 586.-Pp. 128-134.

104. Jensen F. B. Comparative analysis of autoxidation of haemoglobin // The Journal of Experimental Biology. 2001. - V. 204. - Pp. 2029-2033.

105. Johnson R, Goyette JG, Ravindranath Y, Ho Y-S. Red cells from glutathione peroxidase-deficient mice have nearly normal defenses against exogenous peroxides // Blood. 2000. - V.96. - Pp. 1985-1988.

106. Kannan R, Labotka R, Low PS. Isolation and characterization of the hemichrome-stabilized membrane protein aggregates from sickle erythrocytes. Major site of autologous antibody binding // J Biol Chem. 1988. - V. 263, № 27. - Pp. 1376613773.

107. Kellogg E.W. and Fridovich I. Liposome oxidation and erythrocyte lysis by enzymically generated superoxide and hydrogen peroxide // J. Biol. Chem. 1977. -V. 252.-Pp. 6721-6728.

108. Kitagawa S, Sakamoto H, Tano H. Inhibitory effects of flavonoids on free radical-induced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobin // Chem Pharm Bull (Tokyo). 2004. - V. 52, № 8. - Pp. 999-1001.

109. Klebanoff S.J. Oxygen metabolism and the toxic properties of phagocytes // Ann. Intern. Med. 1980. - V. 93. - Pp. 480-490.

110. Knauf PA, Fulirmann GF., Rothstein S., Rothstein A. The relationship between anion exchange and net anion flow across the human red blood cell membrane// J Gen Physiol. 1977. - V. 69, № 3. - Pp. 363-386.

111. Koppenol WH, Butler J., and van Leeuwen JW. 1978. The Haber-Weiss cycle // Photochem. Photobiol. 1978. - V. 28. - Pp.655-660.

112. Kourie M, Joseph I. Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms // Am. J. Physiol. 1998. - V.275. - C1-C24.

113. Krasovska A., Rosiak D., Czkapiak K., Lukaszewicz M. Chemiluminescence detection of peroxyl radicals and comparison of antioxydant activity of phenolic compounds // Current topics in Biophysics. 2000. - V. 24. - Pp. 89-95.

114. Kraus RL, Pasieczny R, Lariosa-Willingham K, Turner MS, Jiang A, Trauger JW.Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity // J Neurochem. 2005. - V. 94, №3. - Pp.819-827.

115. Kumar S, Bandyopadhyay U. Free heme toxicity and its detoxification systems in human // Toxicol Lett. 2005. - V.157, № 3. - Pp.175-188.

116. Kuross SA, Rank BH, Hebbel RP Excess heme in sickle erythrocyte inside-out membranes: possible role in thiol oxidation // Blood. 1988. - Y. 71, № 4. - Pp.876882.

117. Lang PA, Kaiser S, Myssina S, Wieder T, Lang F, Huber SM. Role of Ca2 activated K+ channels in human erythrocyte apoptosis //Am J Physiol Cell Physiol. 2003. -V. 285, № 6. P.1553-560.

118. LeBel CP., Ischiropoulos TH, Bondys SC. Evaluation of the probe 2',7'-dihidrofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress // Chem. Res. Toxicol. 1992. - V. 5, № 2. - Pp. 227-231.

119. Lenfant F, Bureau A, Lahet JJ, Bouyer F, Chaillot B, Freysz M. Effects of an oxidative stress on human hemoglobin: a multiwavelength visible spectrometry study.// Biomed Pharmacother.- 2005.- V.59, №5. Pp.230-232.

120. Lew VL & Bookchin RM. Ion transport pathology in the mechanism of sickle cell dehydration // Physiol Rev. 2005. - V. 85. - Pp. 179-200.

121. Lew VL, Etzion Z & Bookchin RM. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++)permeabilization // Blood. 2002. - V. 99.- Pp.2578-2585.

122. Lew VL, Tiffert T, Etzion Z, Perdomo D, Daw N, Macdonald L & Bookchin RM. Distribution of dehydration rates generated by maximal Gardos-channel activation in normal and sickle red blood cells // Blood . 2005. - V. 105. - Pp. 361-367.

123. Lew VL., Bookchin RM. Ion transport pathology in the mechanism of sickle cell dehydration. // Physiol. Rev. 2005. - V. 85. - Pp. 179-200.

124. LewVL and Beaugé LA. Passive cation fluxes in red cell membranes. In: transport across biological membranes, edited by G. Giebisch, DC. Tosteson, and H. H. Ussing. Berlin: Springer-Verlag, 1979, vol. II, p. 85-115.

125. Li SD, Su YD, Li M, Zou CG. Hem in-mediated hemolysis in erythrocytes: effects of ascorbic acid and glutathione // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2006. -V.38, № 1. - Pp.63-69.

126. Linderkamp J., Meiselman H. Geometric, osmotic and membrane mechanical properties of density-separated human red cells // Blood. 1982. - V. 59. - Pp. 1121-1127.

127. Lisovskaya IL, Rozenberg JM, Nesterenko VM & Samokhina AA Factors raising intracellular calcium increase red blood cell heterogeneity in density and critical osmolality // Med Sci Monit. 2004. - V. 10. - BR67- BR76.

128. Liu S-C, Derick LH. Molecular anatomy of the red blood cell membrane skeleton: structure-function relationships // Semin Hematol. 1992. - V. 29. - Pp. 231-243.

129. Liu SC, Palek J. Hemoglobin enhances the self-association of spectrin heterodimers in human erythrocytes // J Biol Chem. 1984. - V. 259, № 18. - Pp. 11556-562.

130. Liu SC, Zhai S, Lawler J, Palek J. Hemin-mediated dissociation of erythrocyte membrane skeletal proteins //J Biol Chem. 1985. - V. 260, № 22. - Pp. 1223412239.

131. Lussignoli S, Fraccaroli M, Andrioli G, Broceo G, Bellavite P. A microplate-based colorimetric assay of the total peroxyl radical trapping capability of human plasma //Anal Biochem. 1999. - V.269, № 1. - Pp. 38-44.

132. Lux SE. Spectrin-actin membrane skeleton of normal and abnormal red blood cells // Semin Hematol. 1979.-V. 16. - Pp. 21-51.

133. Ma A, Qi S, Chen H. Antioxidant therapy for prevention of inflammation, ischemic reperfusion injuries and allograft rejection // Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. 2008. - V.6, № 1. - Pp. 20-43.

134. Maher A.D., Kuchel P.W. The Gardos channel: a review of the Ca2+-activated K+ channel in human erythrocytes // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2003. - V.35. - Pp. 1182-1197.

135. Maridonneau I, Braquet P, Garay P. Na and K ^ transport damage induced by oxygen free radicals in human red cell membranes // J Biochem Chem. 1983. - V. 258.-Pp.3107-3113.

136. Martinov M.V., Vitvitsky V.M., Ataullakhanov F.I. Volume stabilization in human erythrocytes: combined effects of Ca2+dependent potassium channels and adenylate metabolism // Biophys Chem. 1999. - V. 80, № 3. - Pp. 199-215.

137. Matés JM, Sánchez-Jiménez F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes // Front Biosci. 1999. - V. 4:D339-45.

138. Mawatari S, Murakami K.Different types of glutathionylation of hemoglobin can exist in intact erythrocytes // Arch Biochem Biophis. 2004. - V. 421, № 1. - Pp. 108-114.

139. McKenney J., Valeri CR., Mohandas N., Fortier N., Giorgio A. and Snyder LM. Decreased in vivo survival of hydrogen peroxide-damaged baboon red blood cells // Blood. 1990. - V. 76. - Pp. 206-211.

140. McMillan DC, Powell CL, Bowman ZS., Morrow JD., and. Jollow DJ Lipids versus proteins as major targets of pro-oxidant, direct-acting hemolytic agents // Toxicol. Scie.-2005.-V.88,№ l.-Pp. 274-283.

141. Minetti M and Malorni W. Redox control of red blood cell biology: The red blood cell as a target and source of prooxidant species // Antioxidants & Redox signaling. -2006.-V. 8, №7, 8.-Pp. 1165-1169.

142. Misra H. P. and Fridovich I. The generation of superoxide radical during the awtoxidation of hemoglobin // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247, №21. - Pp. 6960962.

143. Mohandas N., Chasis J.A. Red blood cell deformability, membrane material properties and shape: regulation by transmembrane, skeletal and cytosolic proteins and lipids// Seminars in Hematology. 1993. — V. 30.-Pp. 171-192.

144. Moore R.B., Mankad M.V., Shriver S., Mankad V.N., Plishker G.A. Reconstitution of Ca -dependent K transport in erythrocyte membrane vesicles requires a cytoplasmic protein.// J Biol. Chem. 1991. - V. 266. Pp. 18964-18968.

145. Murakami K and Mawatari S. Oxidation of hemoglobin to methemoglobin in intact erythrocyte by a hydroperoxide induces formation of glutathionyl hemoglobin and binding of a-hemoglobin to membrane // Arch Biochem Biophys. 2003. - V. 417. — Pp. 244-250. ^

146. Mursu J, Voutilainen S, Nurmi T, Tuomainen TP, Kurl S, Salonen JT. Flavonoid intake and the risk of ischaemic stroke and CVD mortality in middle-aged Finnish men: the Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study // Br J Nutr. — 2008. — V.l-6.

147. Muzyamba MC, Gibson JS. Effect of l-chloro-2,4-dinitrobenzene on K+ transport in normal and sickle human red blood cells // J Physiol. 2003. - V. 547(Pt 3). - Pp. 903911.

148. Nagababu E and. Rifkind JM. Heme degradation by reactive oxygen species // Antioxidants and redox signaling. 2004. - V. 6, № 6. - Pp. 967-978.

149. Nash G.B., Boghossian S., Parmar J. Alteration of the mechanical properties of sickle cells by repetitive deoxygenation: role of calcium and the effects of calcium blockers. //Br J Haematol 1989. - V. 72. - Pp. 260-264.

150. Niki E, Komuro E, Takahashi M, Urano S, Ito E, Terao K.Oxidative hemolysis of erythrocytes and its inhibition by free radical scavengers // J Biol Chem. 1988. -V.263, № 36. - Pp.19809-19814.

151. Niki E, Yamamoto Y, Komuro E, Sato K. Membrane damage due to lipid oxidation // Am J Clin Nutr. 1991. - V.53(l Suppl). - 201S-205S.

152. Nishikimi M, Appaji N & Yagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen // Biochem Biophys Res Commun. 1972. - V. 46. - Pp.849-854.

153. Nordberg J and Arn'er ESJ. Reactive oxygen species, antioxidants and the mammalian thioredoxin system // Free Radical Biology & Medicine. 2001. - V. 31, №. 11.-Pp. 1287-1312.

154. Okamoto K, Maruyama T, Kaji Y, Harada M, Mawatari S, Fujino T, Uyesaka N. Verapamil prevents impairment in filterability of human erythrocytes exposed to oxidative stress // Jap. J. Physiol. 2004. -V. 54. - Pp. 39-46.

155. Omodeo-Sale F, Motti A, Dondorp A,. White NJ, Taramelli D. Déstabilisation and subsequent lysis of human erythrocytes induced by Plasmodium falciparum haem products // Eur J Haematol. 2005. - V. 74. - PP. 324-332.

156. Pauling L, Itano H, Singer S J, Wells IC. Sickle cell anemia: a molecular disease // Science. 1949. - V. 110. - Pp. 543-548.

157. Piatt OS, Falcone JF, Lux SE. Molecular defect in the sickle erythrocyte skeleton. Abnormal spectrin binding to sickle inside-our vesicles // J Clin Invest. 1985. - V.75, №1. -Pp.266-271.

158. Plishker GA, Chevalier D, Seinsoth L, Moore RB. Calcium-activated potassium transport and high molecular weight forms of calpromotin // J Biol Chem. 1992. -V. 267, № 30. - Pp. 21839-21843.

159. Puppo A., Halliwell B. Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is haemoglobin a biological Fenton reagent? // Biochem. J. -1988.-V. 249.-Pp. 185-190.

160. Reglinski J, Hoey S, Smith WE, Sturrock RD.Cellular response to oxidative stress at sulfhydryl group receptor sites on the erythrocyte membrane // J Biol Chem. — 1988. — V.263, № 25. Pp. 12360-12366.

161. Rice-Evans C. Flavonoid antioxidants //Curr. Med. Chem. 2001. - V. 8, № 7. -Pp.797-807.

162. Rice-Evans CA., Miller NJ. Paganga G, Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids // Free Radic.Biol. Med. 1996. V.20. - Pp.933956.

163. Rohn TT, Hinds TR., Vincenzi FF. Inhibition of the Ca pump of intact red blood cells by t-butyl hydroperoxide: importance of of glutathione peroxydase.// Biochim. Biophys. Acta. 1993. - V. 1153, № 1. - Pp. 67-76.

164. Romeo AA, Capobianco JA & English AM (2002). Heme nitrosylation of deoxyhemoglobin by s-nitrosoglutathione requires copper // J Biol Chem. 2002. -V. 277.-Pp. 24135-24141.

165. Ross JA., Kasum CM. Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety // Annu. Rev. Nutr. 2002. - V. 22. - Pp. 19-34.

166. Sadrzadeh SM, Graf E, Panter SS, Hallaway PE, Eaton JW. Hemoglobin. A biologic Fenton reagent // J Biol Chem. 1984. - V. 259. - Pp. 14354-14356.

167. Saija A, Scalese M, Lanza M, Marzullo D, Bonina F, Castelli F. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes // Free Radic Biol Med. 1995. - V. 19, № 4. - Pp.481 -486.

168. Sanchez-Moreno C. Review: Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and biological systems // Food Sci. Technol. Int. 2002. - V.8, № 3.-Pp. 121-137.

169. Sawyer PR, Brogden RN, Pinder RM, Speight TM, Avery GS. Clotrimazole: a review of its antifungal activity and therapeutic efficacy // Drugs. 1975. - V.9, № 6. - Pp.424-447.

170. Schlegel RA., Prendergast TW., Williamson P. Membrane phospholipid asymmetry as a factor in erythrocyte-endothelial cell interactions// J. Cell Physiol. 1985. - V. 123.-Pp. 215-218.

171. Schluter K, Drenckhahn D. Co-clustering of denatured hemoglobin with band 3: Its role in binding of autoantobodies against band 3 to abnormal and aged erythrocytes // ProcNatl Acad Sci USA. 1986.-V. 83.-P. 6137.

172. Schmitt TH, Frezzatti WA Jr, Schreier S. Hemin-induced lipid membrane disorder and increased permeability: a molecular model for the mechanism of cell lysis // Arch Biochem Biophys. 1993. -V. 307, № 1. - Pp.96-103.

173. Schrier S.L. Red cell membrane biology.// Clin. Haematol. 1985. -V14. - Pp. 1-12.

174. Schroder E, Jonsson T, Poole L, and. Johnson RM. The role of erythrocyte peroxiredoxin in detoxifying peroxides and in stimulating potassium efflux via the Gardos channels // Blood. 2003. - V. 101, № 7. - Pp. 2897 - 2897.

175. Schroit A J, Zwaal RFA. Transbilayer movement of phospholipids in red cell and platelet membranes // Biochim Biophys Acta 1991. - V. 1071, № 3. - Pp. 313-329.

176. Shalev S, Mogilner E, Shinar EA, Rachmilewitz SL Schrier Impaired erythrocyte calcium homeostasis in beta-thalassemia Blood 1984 64: 564-566

177. Shea TB, Rogers E, Ashline D, Ortiz D, Sheu MS. Quantification of antioxidant activity in brain tissue homogenates using the "total equivalent antioxidant capacity" // J Neurosci Methods. 2003. - V. 125, № 1-2. - Pp.55-58.

178. Sheerin HE., Snyder LM, Fairbanks G. Cation transport in oxidant-stressed human erythrocytes:heightened N-ethylmaleimide activation of passive K + influx after mild peroxidation// Biochim Biophys Acta. 1989. - V. 983, № 1. - Pp. 65-76.

179. Sies H Strategies of antioxidant defense // Eur. J. Biochem. 1993. - V. 215. - Pp. 213-219.

180. Sies H, ed. Oxidative stress, oxidants and antioxidants // New York:Academic Press. -1991.

181. Smith RC, Nunn V. Prevention by antioxidants of hemolysis of erythrocytes of cattle, pigs and humans treated with t-butil hydroperoxide // Camp. Biochem. Physiol. 1986. - V. 84, № 1. - Pp. 79-82.

182. Snyder LM, Fortier NL, Leb L, McKenney J,Trainor J„ Sheerin H, Mohandas N. The role of membrane protein sulfhydryl groups in hydrogen peroxide-mediated membrane damage in human erythrocytes // Biochim. Biophvs.Acta. 1988. - V. 937, № 2. - Pp. 229-240.

183. Song JH, Simons C, Cao L, Shin SH, Hong M & Chung IM. (2003). Rapid uptake of oxidized ascorbate induces loss of cellular glutathione and oxidative stress in liver slices // Exp Mol Med. V. 35. - Pp. 67-75.

184. Sugawara Y, Matsuoka A., Kaino A. and Shikama K. (1995). Role of globin moiety in the autoxidation reaction of oxymyoglobin: effect of 8M urea // Biophys. J. -1995.-V.69.-Pp. 583-592.

185. Tavazzi B, Di Pierro D, Amorini AM, Fazzina G, Tuttobene M, Giardina B and Lazzarino G. Energy metabolism and lipid peroxidation of human erythrocytes as a function of increased oxidative stres // Eur. J. Biochem. 2000. - V.267. - Pp. 684689.

186. Tiffert T, Ginsburg H, Krugliak M, Elford BC, Lew VL. Potent antimalarial activity of clotrimazole in in vitro cultures of Plasmodium falciparum // Proc Natl Acad Sei U S A. -2000. — V.97, № 1.-Pp.331-336.

187. Tubaro F, Ghiselli A, Rapuzzi P, Maiorino M, Ursini F. Analysis of plasma antioxidant capacity by competition kinetics //Free Radic Biol Med. 1998. - V. 24, №7-8.-Pp. 1228-1234.

188. Van Acker FA, Schouten O, Haenen GR, van der Vijgh WJ, Bast A. Flavonoids can replace alpha-tocopherol as an antioxidant // FEBS Lett. 2000. - V. 473, № 2. -Pp.145-148.

189. Van Den Berg JJM., Op Den Kamp JAF, Lubin BH, Relofsen B and Kuypers FA. Kinetics and site specificity of hydroperoxide induced oxidative damage in red blood cells //Free Rad. Biol. Med. 1992. - V.12. - Pp. 487-498.

190. Van der Zee J, Dubbelman TN and van Steveninck J. Peroxide-induced membrane damage in human erythrocytes // Biochimica et Biophysica Acta. 1998. - V.818, № 1.-Pp. 38-44.

191. Vasiljeva OV, Lyubitsky OB, Klebanov GI, Vladimirov YuA. Effect of antioxidants on the kinetics of chain lipid peroxidation in liposomes // Membr Cell Biol. 1998. -V.12,№2.-Pp. 223-231.

192. Vincent SH. Oxidative effects of heme and porphyrins on proteins and lipids // Semin Hematol. 1989. - V.26, № 2. - Pp.105-113.

193. Wang F, Wang T, Lai J, Li M, Zou C. Vitamin E inhibits hemolysis induced by hemin as a membrane stabilizer. Biochem Pharmacol. 2006 Mar 14;71(6):799-805.

194. Wang X, Wu Z, Song G, Wang H, Long M, Cai S. Effects of oxidative damage of membrane protein thiol groups on erythrocyte membrane viscoelasticities // Clin Hemorheol Microcirc. 1999. - V. 21, № 2. - Pp.137-146.

195. Waugh SM, Willardson BM, Kannan R, Labotka R, Low PS. Heinz bodies induce clustering of band 3, glycophorin, and ankyrin in sickle cell erythrocytes // J Clin Invest.-1986.-V. 78, №5.-Pp. 1155-1160.

196. Weatherall D.J. and Clegg J.B. Thalassemia revisited // Cell. 1982. - V. 29, № 1. -Pp.7-9.

197. Weiss SJ. The role of superoxide in the destruction of erythrocyte targets by human neutrophils //J Biol Chem. 1980. - V. 255, № 20. - Pp.9912-9917.

198. Winterbourn CC. Oxidative reactions of hemoglobin // Methods Enzymol. 1990. -V. 186. -Pp.265-272.

199. Zancan P, Rosas AO, Marcondes MC, Marinho-Carvalho MM, Sola-Penna M. Clotrimazole inhibits and modulates heterologous association of the key glycolytic enzyme 6-phosphofructo-l-kinase // Biochem Pharmacol. 2007. - V. 73, № 10. -Pp.1520-1527.

Информация о работе

Щербаченко, Ирина Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы