Модифицированные ДНК в исследовании надмолекулярных комплексов репарации и репликации ДНК

Ходырева, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модифицированные ДНК в исследовании надмолекулярных комплексов репарации и репликации ДНК
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модифицированные ДНК в исследовании надмолекулярных комплексов репарации и репликации ДНК"

Н£. г

11-1

1304 ГИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт химической биологии и фундаментальной медицины

На правах рукописи

ХОДЫРЕВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДНК В ИССЛЕДОВАНИИ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ РЕПАРАЦИИ И РЕПЛИКАЦИИ ДНК

03.01.04 - биохимия

Диссертация в виде научного доклада на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2010

Научный консультант:

д.х.н., профессор, член-корреспондент РАН Лаврик Ольга Ивановна

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Зенкова Марина Аркадьевна

д.х.н., профессор, член-корреспондент РАН Кочетков Сергей Николаевич

д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М. В. Ломоносова, химический факультет

Защита состоится «29» октября 2010 г. в 15:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск 630090, пр-кт акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана » сентября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Точность воспроизведения и сохранения генетической информации в клетках определяется функционированием двух ключевых систем -репликации и репарации ДНК. ДНК каждой клетки подвергается действию разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Повреждение ДНК может провоцировать гибель клеток, их злокачественную трансформацию или вызывать мутации. Чтобы предотвращать такие последствия, клетки располагают несколькими специализированными системами репарации ДНК с частично перекрывающимися функциями. Системы репарации ДНК различаются используемыми субстратами, механизмами и ансамблями белков, участвующих в процессе. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) является одной из основных и наиболее важных систем репарации ДНК, поскольку ее действия направлены на исправление наиболее многочисленных повреждений, вызываемых эндогенными и экзогенными факторами, которые включают ионизирующее излучение, активные формы кислорода и некоторые противоопухолевые препараты [Schärer, 2003]. Согласно господствующему в настоящее время представлению, ЭРО осуществляется двумя путями, так называемые «коротко-» и «длиннозаплаточная» ЭРО, которые отличаются используемыми субстратами, размером ресинтезируемого участка ДНК и вовлеченными в процесс белками. У высших эукариот в классическом короткозаплаточном пути с замещением одного нуклеотида (dN) используются специфичные для этого процесса белки: ДНК-гликозилазы, апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ1), ДНК-полимераза ß (Pol ß) и ДНК-лигаза III. В длинозаплаточном пути заменяются несколько dN, и в процессе дополнительно участвуют «репликативные» белки: ДНК-полимеразы 5 и/или е, флэпэндонуклеаза 1 (FEN1) и ДНК-лигаза I. Для каждого из путей ЭРО известно несколько минорных вариантов (запасных путей), в том числе, с вовлечением в процесс дополнительных белков. Представление о механизме функционирования ЭРО в живых клетках постоянно расширяется. К настоящему времени обнаружено, что помимо ферментов, катализирующих основные этапы репарации, в этом процессе задействованы белковые факторы, которые могут способствовать сборке комплекса ферментов на сайте повреждения, модулировать активность ферментов и обеспечивать сопряжение ЭРО с другими клеточными процессами, индуцируемыми в ответ на повреждение генома. К числу дополнительных факторов ЭРО относятся, например, поли(АБР-рибозо)полимераза 1 (PARP1), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), белок из группы комплементации, обусловливающей чувствительность клеток к рентгеновскому излучению (XRCC1).

В целом, для процесса ЭРО нехарактерно существование стабильного белкового комплекса, который бы полностью проводил устранения повреждения в ДНК. ЭРО функционирует, скорее, по принципу конвейера, где последовательные стадии репарации осуществляются временными относительно неустойчивыми комплексами белков без освобождения ДНК. В этих комплексах по мере протекания репарации один из ферментов (факторов) заменяется белком, необходимым для следующей стадии процесса. Такой принцип организации процесса вносит ограничения в исследование структурной организации репарационного ансамбля рентгеноструктурным анализом и другими биофизическими методами.

Использование модифицированных ДНК, в том числе химически активных, то есть способных образовывать ковалентные сшивки с белками, представляется перспективным в исследовании структурно-функциональной организации надмолекулярных ансамблей эксцизионной репарации оснований. При изучении реконструированных из очищенных

белков систем, аффинная модификация, основанная на применении химически активных аналогов ДНК-интермедиатов, позволяет детализировать структурно-функциональную организацию комплексов репарации/репликации ДНК и определять взаимное влияние белковых компонентов при взаимодействии с ДНК. Аффинная модификация в сочетании с иммунохимическими методами и современной масс-спектрометрией в применении к клеточным экстрактам обеспечивает возможность идентификации белков-участников того или иного комплекса репарации/репликации ДНК, в том числе ранее неизвестных. Кроме того, этот подход может быть применен для идентификации белковых компонентов систем репарации/репликации ДНК у мало изученных организмов. Цель и задачи работы. Цель работы - изучение молекулярных механизмов взаимодействия белковых компонентов ансамблей репарации/репликации ДНК с ДНК и между собой с использованием аффинной модификации, функциональных тестов и других методов, основанных на применении модифицированных ДНК, имитирующих интермедиаты определенных стадий этих процессов. В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

• разработка способов получения аффинных ДНК-реагентов, которые содержат структурные элементы, характерные для ДНК-интермедиатов определенной стадии репарации/репликации ДНК, и химически активные группы в заданных точках ДНК; изучение факторов, определяющих эффективность модификации белков фотоактивными ДНК; создание новых фотоаффинных реагентов;

• изучение функциональных взаимодействий белков репарации/репликации ДНК в реконструированных из очищенных белков системах и клеточных экстрактах, основанное на применении модифицированных ДНК;

• изучение структурно-функциональной организации комплексов белок-ДНК с использованием модифицированных ДНК;

• отработка подходов к идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с модифицированными ДНК-интермедиатами репликации/репарации ДНК;

• поиск белков (в том числе ранее неизвестных), взаимодействующих со специфическими ДНК в экстрактах эукариотических клеток и установление их функций в репарации ДНК.

Научная новизна и практическая значимость работы. Выполнено первое комплексное исследование по созданию, оптимизации и применению модифицированных ДНК-интермедиатов в изучении белковых ансамблей репарации и репликации. Проведенное исследование позволило выявить ряд новых деталей структурной организации некоторых комплексов белок-ДНК и уточнить механизмы функциональных взаимодействий белков с ДНК, а также обнаружить новые белки-факторы эксцизионной репарации оснований и неизвестные ранее взаимодействия белков другой системы репарации ДНК - негомологичного соединения концов ДНК - с ДНК-интермедиатами ЭРО.

Полученные данные свидетельствуют о результативности применения модифицированных ДНК в исследовании указанных систем и открывают перспективы в исследовании других систем репарации ДНК путем создания специфичных для исследуемого процесса ДНК-интермедиатов.

Область практического применения - создание химически активных ДНК-зондов для определения статуса некоторых систем репарации ДНК в клетках человека. Основной мишенью при использовании ионизирующего излучения и лекарств-радиомиметиков в противораковой терапии является ДНК. Системы репарации ДНК, исправляя повреждения, могут снижать эффективность терапии, поэтому определение статуса

систем репарации ДНК и механизмов регуляции этих процессов в опухолевых клетках может быть использовано в качестве прогностического фактора при определении целесообразности использования радиотерапии и повышения эффективности такого воздействия.

Публикации и апробация работы. Основные результаты работы отражены в 65 статьях (из них 7 обзоров), 1 патенте и более 60 тезисах докладов. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances (Новосибирск, 1998); International conference «Trends in Nucleic Acid Chemistry» (Москва, 2000); IVth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on Basic Science in ISTC Activities (Новосибирск,

2001); RNA as Therapeutic and Genomics Target (Новосибирск, 2001); The third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure (Новосибирск,

2002); Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference (Новосибирск, 2003); Chemical and Biological Problems of Proteomics (Новосибирск, 2004); Responses to DNA Damage: Insights from Chemical, Biochemical, Structural Biology and Cellular Studies (Brighton, 2005); International Conference on Chemical Biology (Novosibirsk, 2005); 2nd EU-US DNA Repair Meeting (Erice, 2005); Международная конференция «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д. Г. Кнорре (Новосибирск, 2006); The first meeting of international workgroup on «Early events in human pathologies» (Москва, 2007); Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability (Санкт-Петербург, 2008); ARCUS workshop: Development of new tools for fundamental research in health and disease (Strasbourg, 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Vlh International Symposium «Supramolecular Systems in Chemistry and Biology» (Kyiv, 2009); First symposium «Supramolecular Chemistry for Materials and Life Sciences» (Новосибирск, 2010).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение модификаций в структуру ДНК при разработке ДНК-интермедиатов для исследования белково-нуклеиновых взаимодействий может использоваться для разных целей: создание аналогов ДНК-субстратов, устойчивых к действию исследуемых ферментов; стабилизация/дестабилизация ДНК-дуплексов; изменение сродства ДНК к связывающим ее белкам; введение структурных элементов для имитации ДНК-интермедиатов определенных процессов или для обеспечения селективного связывания ДНК на определенных сорбентах; получение флуоресцентных ДНК-зондов; создание реакционноспособных аффинных реагентов, обеспечивающих образование ковалентных продуктов с исследуемыми белками. В зависимости от цели исследования модификации в ДНК можно вводить в состав любого из структурных элементов ДНК: гетероциклическое основание, углевод, межнуклеотидные или концевые фосфатные группы. В настоящей работе введение модификаций в ДНК использовано для конструирования аффинных реагентов и создания аналогов субстратов с измененными субстратными характеристиками. Работа состоит из 4 разделов и содержит типичные примеры исследований по созданию, характеризации и совершенствованию фотоактивируемых ДНК-интермедиатов; изучению белково-нуклеиновых взаимодействий в модельных системах репарации/репликации ДНК, реконструированных из очищенных белков, и в клеточных экстрактах с применением модифицированных ДНК; применению специфических модифицированных ДНК в поиске белков репарации/репликации ДНК в клеточных экстрактах и в идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с этими ДНК.

1. СОЗДАНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ АФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ДНК

Метод аффинной модификации, широко используемый для изучения специфических взаимодействий между биополимерами или биополимеров с низкомолекулярными лигандами, базируется на формировании специфического нековалентного комплекса между мишенью (белок или нуклеиновая кислота) и реагентом (реакционноспособным аналогом биополимера или низкомолекулярного лиганда) с последующим образованием ковалентной связи между реагентом и связывающим ее центром мишени.

В арсенале химически активных аффинных реагентов для исследования белково-нуклеиновых взаимодействий значительное место принадлежит аналогам ДНК, содержащим ароматические азиды. При активации УФ-светом арилазидных групп генерируются высокореакционноспособные частицы, которые могут атаковать ближайшие атомы с образованием ковалентной связи между контактирующими частями биополимеров. Последующий анализ образовавшихся продуктов «фотосшивки» белок-ДНК позволяет получать информацию о структурной организации белково-нуклеиновых комплексов.

Химическая нейтральность в условиях рутинных биохимических процедур и способность к активации в заданное время обусловливают несомненные преимущества арилазидных фотореагентов по сравнению с другими типами «сшивающих» группировок. В частности, это позволяет, наряду с химическими способами, использовать ферментативные подходы при создании ДНК с фотоактивируемыми группами в требуемом положении. В некоторых случаях получение фотореакционноспособных ДНК можно осуществлять in situ за счет ферментативной активности исследуемых систем. Для систем репликации/репарации ДНК наиболее удобно введение модифицированных dNMP с использованием ДНК-полимераз, поэтому основные усилия были направлены на создание dNTP с арилазидными группами, присоединенными к основанию, исследование их фотохимических характеристик и субстратных свойств в модельных системах. При создании аналогов dNTP варьировали тип фотореакционноспособной группы, длину и структуру ликера, присоединяющего ее к основанию.

1.1. Арнлазидные производные дезоксинуклеозид-5'-трнфосфатов в синтезе фотоактивных ДНК, катализируемом ДНК-полимеразами. Сравнительный анализ субстратных свойств и фотохимических характеристик

Первые эксперименты по аффинной модификации ДНК-полимераз фотоактивируемыми ДНК, синтезированными in situ за счет включения аналогов dNMP, с одной стороны, продемонстрировали перспективность используемого подхода [Doronin et al„ 1992, Doronin et at., 1994, Lavrik et al„ 1996], и, с другой стороны, выдвинули ряд новых требований в отношении субстратных и фотохимических характеристик аналогов dNTP. Для всех вновь синтезируемых фотоактивируемых аналогов dCTP и dTTP проводили детальный анализ спектральных, фотохимических и субстратных свойств в синтезе ДНК, катализируемом обратной транскриптазой вируса иммунодефицита человека (ОТ ВИЧ-1), ДНК-полимеразой Р крысы (Pol Р) и ДНК-полимеразой Thermus thermophilus (Tte pol) в сравнении с ранее использованными аналогами.

Для минимизации неспецифической фотоинактивации биополимеров под действием УФ-света актуально получение аналогов dNTP, в том числе dCTP, активируемых более длинноволновым УФ-светом (Х>300 нм). Кроме того, было синтезировано производное dCTP, содержащее нитроазидобензамидную группу, генерирующую преимущественно триплетный нитрен [Leiva et al, 1989, Keana&Cai, 1990], что должно повышать избирательность действия фотореагента на белки по сравнению с ДНК.

таутомерного равновесия гетероциклического основания от амино- к имино-форме, вызывает изменение субстратных свойств от характерных для dCTP к соответствующим для dTTP. Дальнейшая характеризация экзо-М-замещенных аналогов dCTP как базовых соединений в ферментативном синтезе фотоактивируемых ДНК для их применения в аффинной модификации белков и ДНК, проводилась с использованием Pol ß, которая относится к ферментам репарации (Табл. 2).

Все аналоги не терминируют синтез ДНК после включения в З'-конец праймера, но могут снижать эффективность его последующего удлинения. Pol ß, в отличие от ОТ ВИЧ-1, не использует FAB-dCTP, NAB-dCTP и FABC-dCTP как dTTP и идентифицирует все 5 аналогов как dCTP. Таким образом, специфику узнавания аналогов dCTP ДНК-полимеразами из разных источников необходимо учитывать при синтезе фотоактивных ДНК in situ.

Поскольку введение в арилазид атомов фтора (особенно в орто- и пара-положения к азидогруппе) способствует образованию электрофильного синглетного нитрена [Schuster&Platz, 1992, Schapp et а!., 1993], играющего ключевую роль в фотохимической модификации нуклеиновых кислот и белков [Blackwell&Borowiec, 1996, Добриков с соавт., 1996], в качестве альтернативы ранее использованным производным 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензальдегида можно применять полифторированные гетероциклические соединения. Были синтезированы производные ТТР, содержащие М-(3-хлор-4-азидо-2,5-дифторпиридин-6-ил)-Р-аланин и Ы-(3-хлор-4-азидо-2,5-дифторпиридин-6-ил)-глицин, присоединенные к 5-ому положению основания (FAP-8-dUTP и FAP-7-dUTP соответственно). Для характеризации аналогов определены их фотохимические параметры, субстратные свойства в реакции Tte ро1-зависимого синтеза ДНК и эффективность модификации фермента синтезированными in situ ДНК. При облучении УФ-светом (334-365 нм) ДНК, содержащие эти аналоги dUMP, обеспечивали сопоставимые уровни модификации Tte pol (9.3 и 8.6 % присоединенной ДНК), которые превышали соответствующий параметр для КАВ-4чИМР-содержащих ДНК (3.9%). Дальнейшая характеризация нескольких фотоактивируемых аналогов dUTP с использованием двух ДНК-полимераз (рис. 2) при облучении УФ-светом с длиной волны 313-365 нм, показала, что FAP-8-dUMP (в составе ДНК) обеспечивает более высокие уровни модификации обеих полимераз, указывая на перспективность использования такой фотоактивируемой группы в создании аналогов ДНК для аффинной модификации белков.

■ Mbcu ittepd нитрат Рис. 2. Эффективность модификации ДНК-полимераз и ДНК-матрицы праймерами,

\ ю ___синтезированными in situ с использованием

I 30

IJJ

аналогов dUTP

J _ м Щ_Я Условия облучения: при 25°С в течение 1 xti,2

_ ■ светом лампы ДРШ-120 при длинах волн - ю 1 ■ ш И _ I _ ■ II падающего света 313-365 нм или >280 нм.

Заместители: NAB-4 - 5-[Л^-(2-нигро-5-азидо-имлпр ш-митр илп> ишмитг к«4лт» uu^fuTP' бензоил)-3-аминопропенил-1]; NAB-12 - 5-[N-»u С я U9 IM» « « и (Л''-(2-нитро-5-азидобснзоил)-7-аминогептано-

,.,„, ..„. ил)-3-аминопропснил-1]; FAB-4 - 5-[/V-(2,3,5,6-

I-iii-лйим-1 |>гюнм| ХСфафТОр_4.азИдобснзоил)-3-аминопропенил-1 ]

и 4-S- 4-тио- соответственно.

ti/2=lg(2)/k, где k-константа скорости модификации Pol ß, определенная для каждого фоторсагснта.

Учитывая накопленную к этому времени информацию о том, что производные dCTP, в целом, проявили себя как более эффективные фотореагенты в составе ДНК, а также свойства FAP-группы, был синтезирован аналог dCTP - экзо-Лг-{2-[Лг-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]аминоэтил}-2'-дезоксицитидин-5'-три-фосфат (FAP-dCTP) (структура заместителя приведена на рис. 1). Кинетические характеристики в реакции синтеза ДНК, катализируемой Pol ß, для этого аналога практически не отличаются от соответствующих параметров для dCTP, а ДНК, полученные с его применением, обеспечивают наибольший выход продуктов сшивки с Pol ß. Данные сравнительного анализа модификации Pol ß ДНК, синтезированной in situ с использованием нескольких аналогов dCTP, представлены на рис. 3.

Рис.3. Эффективность модификации Pol ß и ДНК-матрицы фотоактиннруемыми праймерамн, синтезированными in situ с использованием аналогов dCTP

Условия облучения: 25°С в течение 1хТу2 светом лампы ДРШ-120 при длинах волн падающего света 313-365 нм. Т[/2—время полуфотолиза фотоактивной группы в использованных условиях облучения.

Таким образом, в результате синтеза новых аналогов dNTP и планомерного исследования их свойств удалось создать соединения, которые сочетают хорошие субстратные и фотохимические характеристики. ДНК, получаемые на их основе, обеспечивают увеличение выхода продуктов сшивки с модельным белком - Pol ß не менее чем на порядок для производных dCTP, и в 2-3 раза для производных dUTP.

Поскольку концентрации эндогенных ДНК-полимераз в экстрактах лимитированы, при введении фотоактивных dNMP в состав ДНК непосредственно ДНК-полимеразами экстрактов, субстратные свойства используемых аналогов dNTP могут оказаться критическим параметром, определяющим впоследствии выход сшивок ДНК-белок. Сравнительный анализ эффективности включения разных аналогов dCTP в ДНК-дуплекс с выступающей матричной цепью и последующая количественная оценка выхода продуктов пришивки ДНК к белкам экстракта клеток HeLa полностью подтвердил это предположение (рис. 4).

а -г

111

///

ЭМ количество радиоактивно!! ДНК (в относительных единицах), присоединенной к белкам экстракта (значение нормировано на общее количество радиоактивности в образце). Структура ДНК схематично представлена над гистограммой.

Действительно, FABO-dCTP, обеспечивавший максимальный уровень сшивок с Pol ß в реконструированной системе, в которой благодаря условиям проведения эксперимента

Рис.4. Сравнение эффективности встраивании в ДНК фотоактнвиру-смых аналогов dCTP эндогенными ДНК-полимеразами экстракта клеток HeLa и модификации белков экстракта полученными ДНК а - Эффективность удлинения праймера эндогенными ДНК-полимеразами

экстракта клеток HeLa. Эффективность определяли как долю (в %) праймера, удлиненного аналогом dCMP; б Эффективность модификации (ЭМ) белков экстракта клеток HeLa фотоактивируемыми ДНК, синтезированными in situ.

(4-кратный избыток фермента по отношению к ДНК) происходило эффективное включение аналога в ДНК, несмотря на неудовлетворительные субстратные свойства (Табл. 2), оказался абсолютно неэффективным в экстракте. Напротив, FABC-dCTP, обладающий худшими фотохимическими характеристики (более низкий выход сшивок Pol ß с FABC-dCMP-содержащей ДНК), но лучшими субстратными характеристиками (Табл. 2), при синтезе фотоактивируемых ДНК ДНК-полимеразами экстракта обеспечивал значительно более высокий уровень сшивок с белками (рис. 46). Максимальную эффективность модификации белков экстрактов продемонстрировал аналог FAP-dCTP, сочетающий хорошие фотохимические характеристики и хорошие субстратные свойства в реакции Pol ß-зависимого синтеза ДНК.

1.2. Ферментативный синтез ДНК, содержащих фогоактивируемые нуклеотиды во внутренних позициях цепи ДНК. Аффинная модификация белков этими ДНК

При детальном исследовании систем репарации/репликации ДНК часто возникает проблема создания широко спектра ДНК-интермедиатов различных стадий этих процессов со структурными элементами, которые характерны для какой-то конкретной стадии. Зачастую, одна из цепей ДНК может не отличаться для достаточно большого набора ДНК-интермедиатов, поэтому именно в эту цепь целесообразно вводить химически активную функцию, обеспечивающую сшивку с белком. При изучении взаимной ориентации отдельных полипептидов в мультибелковых комплексах, взаимодействующих с ДНК, изменение положения химически активной группы относительно элементов структуры, узнаваемых комплексом, может дать дополнительную информацию о его топографии. Достаточно универсальным подходом в создании требуемых химически активных ДНК представляется ферментативное введение фотоактивируемых нуклеотидов во внутренние положения цепи ДНК, схематично представленное на (рис. 5а).

В З'-конец инициирующего праймера в составе ДНК-дуплекса с однонуклеотидной брешью за счет активности Pol ß вводят фотоактивируемый dNMP комплементарно

Рис. 5. Синтез, характерызации и применение ДНК с фотоактинируемыми нуклеотидами по внутренних положенных цепи для аффинной модификации белков ЭРО

а - Схема синтеза ДНК с фогоактивируемыми нуклеотидами во внутренних положениях цепи, б -Расщсплснис фотоактивируемых флэп-ДНК флэпэндонуклеазой 1. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% ПААГ (7 М мочевина). Дор. 1 и 2 соответствуют флэп-21-А2-ДНК с 21-нт одноцепочечным участком, дор. 3 и 4 аналогичной ДНК с 8-нт флэпом, где AZ обозначает FABG-dCMP; и Фотоаффинная модификация белков ЭРО флэп-8-А7-ДНК. Дор. 1-4 - FEN1, Pol ß, АРЕ1 и PARP1 соответственно.

основанию матрицы и затем лигируют разрыв Т4 ДНК-лигазой. Наличие большого спектра фотоактивируемых аналогов dNTP, обладающих хорошими субстратными свойствами в реакции синтеза ДНК, позволяет получать реакционноспособные праймеры с высокими выходами. Для формирования необходимой структуры ДНК-дуплексов целевой фотоактивируемый олигонуклеотид выделяют и отжигают с дополнительными олигонуклеотидами.

Эффективность такого подхода продемонстрирована на примере 5'-флэп-ДНК, в которых одна из цепей непрерывна, а противоположная цепь представлена двумя фрагментами, один из которых полностью спарен, а второй олигонуклеотид имеет неспаренный одноцепочечный участок и содержит фотоактивируемый нуклеотид в районе узнавания ДНК флэпэндонуклеазой 1 (FEN1) - специфической эндонуклеазой длиннозаплаточного пути ЭРО. Полученные флэп-структуры с различной длиной одноцепочечной части, содержащие реакционноспособный нуклеотид в точке перехода одноцепочечной части в дуплекс, эффективно связываются и расщепляются FEN1 (рис. 56), что позволяет рассматривать такие ДНК как аналоги интермедиатов этого пути репарации и использовать в исследовании системы ЭРО. Пример аффинной модификации белков ЭРО, демонстрирующий их способность взаимодействовать с ДНК-интермедиатом длиннозаплаточного пути, для флэп-ДНК с 8-звснным одноцспочечным участком и FABG-dCMP представлен на (рис. 5в).

1.3. Ферментативное введение фогоактивных групп в 5'-конец олигонуклеотидов и использование полученных фотоактивных ДНК в модификации белков

Для расширения возможностей создания фотоактивируемых ДНК-интермедиатов репарации и репликации ДНК, которые бы содержали олигонуклеотиды, модифицированные по 5'-концу, был предложен универсальный ферментативный подход, основанный на использовании Т4 полинуклеотидкиназы (Т4 ПНК) и замещенных у-амидов АТР в качестве доноров модифицированной фосфорильной группы. Структурные формулы использованных у-амидов АТР представлены на рис. 6а.

FAB-ATP

F HN —^ N "pppribA

1 2 3 4 5 б 78

VT^F

• -rONW »-.(frONM

FABO-ATP

j-FAB-ATP ATP -NTP ^FABOATP

Рис. 6. Введение фотоактивируемых групп в 5'-конец олигонуклеотидов Т4 полинуклеогндкиназон и использование полученных ДНК для модификации белков

а - Структурные формулы у-амидов АТР. NAB-ATP у-Ы-[2-(5-азидо-2-нитробсн-зоил)аминоэтил]амид АТР, FAB-ATP - у-Ы-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тстрафторбснзоил)-аминоэтил]амид АТР, FABO-ATP - y-N-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тстрафтобснзилиденами-нооксимстилкарбамил)этил]амид АТР; б - Субстратные свойства у-амидов АТР в реакции фосфорилирования 14-звснного рибоолигонуклеотида, катализируемой Т4 ПНК. Дор. 1-3 - 90, 180 и 900 мкМ y-FAB-АТР, дор. 4-75 мкМ АТР, дор. 5 -контроль без NTP, дор. 6-8 - 33,166 и 332 мкМ y-FABO-ATP соответственно; в Фотоаффинпая модификация рспликативного белка A (RPA) и FEN1 синтезированными ДНК. Структура ДНК схематично изображена над радиоавтографом. Положение фотоактивнрусмой группы (FAB) в 18-звенном радиоактивномеченом олигодезоксирибонуклеотидс обозначено символом Az,

Mf'Y*4? NAI

nA^A

NAB-ATP

NO,

ppprlbA

0.3 0.5 1.2 мкМ (FCNl)

радиоактивной метки - 32P. Концентрация ДНК - 1.3 мкМ.

при их взаимодействии с ДНК в ходе репарации позволяет получать детальную информацию о факторах, определяющих эффективность процесса в целом.

2.1. Модифицированные ДНК как аналоги субстратов в исследовании некоторых стадий ЭРО

К числу наименее изученных аспектов функционирования ЭРО относятся способы обеспечения точности синтеза ДНК и факторы, регулирующие протекание ЭРО по КЗ- и ДЗ-пути. В классическом КЗ-пути синтез ДНК осуществляется ДНК-полимеразой ß, в ДЗ - Pol Р или ДНК-полимеразы 8/е [Frosina et al., 1996\. Однако Pol ß с низкой эффективностью катализирует синтез на протяженных участках ДНК и не обладает собственной 3'—>5' экзонуклеазной активностью, уступая репликативным ДНК-полимеразам 5/е в точности синтеза ДНК. Предполагается, что в комплексе с Pol ß может функционировать 3'—>5' экзонуклеаза, обеспечивающая удаление ошибочно включенных при синтезе ДНК нуклеотидных остатков. Часть этих ключевых вопросов можно исследовать, используя функциональные тесты, базирующиеся на модифицированных ДНК-интермедитах ЭРО, в том числе фотоактивируемых.

2.1,1. Исследование 3'—*5' экзонуклеазной активности апуриновой/апиримидиновой эндонуклеаэы 1 с использованием модифицированных ДНК

Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ1) высших эукариот -полифункциональный белок; она способна выщеплять З'-концевой нуклеотидный остаток в одноцепочечном разрыве, причем эта активность выше при неправильно спаренных нуклеотидах [Chou et al., 2002], что позволяет рассматривать этот фермент в качестве 3'—»5' экзонуклеазы, осуществляющей коррекцию ошибок в процессе Pol ß-зависимого синтеза ДНК. Проведено систематическое исследование зависимости катализируемого АРЕ1 3'—>5'-экзонуклеазного гидролиза природных дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (dNMP) в составе канонической или неканонической пары от ионной силы и pH для нескольких типов ДНК-дуплексов, структура которых имитирует интермедиаты репарации ДНК. В частности, ДНК-дуплексы с разрывом цепи содержали на 5'-конце олигонуклеотида, экспонированном в сторону разрыва, фосфатную, гидроксильную или тетрагидрофуранофосфатную группы, что позволяет рассматривать эти ДНК как аналоги различных путей ЭРО. Изучены все возможные сочетания пар на З'-конце олигонуклеотида, обращенном в сторону разрыва. Анализ выявил следующие закономерности: а) З'-концевые dCMP, dGMP и dTMP менее эффективно выщепляются из канонических пар C/G, Т/А и G/C (в обозначении X/Y первый нуклеотид относится к праймеру а второй - к расположенному напротив нуклеотиду матричной цепи), независимо от типа ДНК-дуплекса; б) эффективность гидролиза возрастает в ряду C/G<C/A<C/C<C/T, T/A<T/G<T/C~T/T, G/C<G/G~G/A~G/T для разных типов ДНК; в) эффективность выщепления З'-концевого dAMP не зависит от каноничности пары и варьирует для разных типов ДНК; г) в целом, 3'—>5'-экзонуклеазная активность АРЕ1 зависит от типа ДНК-дуплекса, а для ДНК с одноцепочечным разрывом - и от природы 5'-концевой группы, экспонированной в разрыв. Предпочтительными субстратами являются частичный ДНК-дуплекс, ДНК с 5'-свисающим одноцепочечным участком (флэпом) или 5'-гидроксильной группой, по сравнению с ДНК с 5'-фосфатной или 5'-тетрагидрофуранофосфатной группой в одноцепочечном разрыве.

Для различных реакционных условий проанализирована зависимость 3'-»5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 от «каноничности» пары, формируемой расположенным на З'-конце фотоактивируемым аналогом dCMP (FABG-dCMP, FABC-

dCMP, FAP-dCMP и FABO-dCMP) и основанием матрицы (А или G) напротив аналога. Дополнительный анализ включал оценку эффективности встраивания Pol ß природного dNMP после фотоактивируемого аналога и лигирования разрыва цепи Т4 ДНК-лигазой. Согласно литературным данным Pol ß неэффективно удлиняет цепь после неправильно спаренных З'-концевых остатков dNMP [Beard et al., 2004], а неправильное спаривание нуклеотидов на З'-конце разрывов в ДНК снижает эффективность лигирования разрыва Т4 ДНК-лигазой [Wu&Wallace, 1989]. По совокупности данных FABG-dCMP, FABC-dCMP и FAP-dCMP являются в большей степени аналогами dCMP, чем dTMP, a FABO-dCMP в равной степени имитирует dCMP и dTMP, что хорошо согласуется с данными о субстратной специфичности аналогов в реакции синтеза ДНК, катализируемого ОТ ВИЧ-1 и Pol ß.

В работе [Chou&Cheng, 2003] было выдвинуто предположение, что различия в оптимуме условий экзонуклеазной и эндонуклеазной активностей АРЕ1 могут быть обусловлены влиянием ионной силы на конформацию белка. Однако такие различия могут быть связаны еще и с влиянием ионной силы на стабильность ДНК-дуплекса. Термическая денатурации ДНК-дуплексов является информативным методом для выявления влияний структурных особенностей ДНК на ее стабильность. Для нескольких ДНК-структур в одних и тех же реакционных условиях было проведено систематическое сопоставление данных термической денатурации ДНК и 3'—>5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 в зависимости от «каноничности» пары, в которую входит выщепляемый dNMP. Из сопоставления термической стабильности ДНК-дуплексов, особенностей их структуры и активности APEI следует, что специфичность экзонуклеазного гидролиза определяется природой группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5'-стороны, а эффективность в значительной мере зависит от способности ДНК-дуплекса «подплавляться» с З'-конца.

2.1.2. Создание и характеризация модифицированных субстратов флэпзндонукпеазы 1

Взаимодействия между компонентами ансамблей репарации ДНК исследуют как в системах, реконструированных из очищенных белков, так и в клеточных экстрактах. Белки клеточного экстракта могут процессировать ДНК с образованием структур другого типа. В частности, использование фотоактивируемых флэп-структур для аффинной модификации белков в экстрактах затруднено из-за их расщепления флэпэндонуклеазой 1 экстрактов в присутствии Mg2+, поэтому была предпринята попытка создать ДНК, которые были бы устойчивы к действию FEN 1, что позволило бы с большей уверенностью выявлять белки клеточного экстракта, способные взаимодействовать с такими структурами. FEN1 - ключевой фермент длиннозаплаточного пути ЭРО - отщепляет свисающий 5'-конец ДНК вблизи точки перехода оцДНК в нормальный ДНК дуплекс (точка ветвления). Для исследования влияния изменений структуры ДНК в точке потенциального расщепления флэпэндонуклеазой 1 в состав флэп-формирующего олигонуклеотида вводили модифицирующие остатки и определяли скорости расщепления этих ДНК (рис. 8а и 86).

Для ДНК Fd с остатком декан-1,10-диола, находящимся в свисающей части непосредственно рядом с первым спаренным с матрицей нуклеотидом, скорость гидролиза снижена не менее, чем в три раза по сравнению с немодифицированной ДНК Fn. Для ДНК Fde с дополнительной модифицирующей группой (остаток диэтиленгликоля), расположенной после второго спаренного с матрицей основания, скорость снижена практически на порядок (рис. 86). Аналогичные результаты получены и для ДНК с двумя остатками декандиола в тех же положениях. Согласно данным метода

одноцепочечных интермедиатов. Считают, что RPA стабилизирует одноцепочную ДНК, препятствуя формированию вторичных структур. Для RPA характерно образование двух типов комплексов с одноцепочечной ДНК, в которых белок взаимодействует с 8 и 30 нуклеотидными остатками (нт), причем 8 нт - это минимальная длина ДНК, для которой были зафиксированы комплексы с RPA [Iftode et ai, 1999]. Литературные данные о роли RPA в процессе ЭРО противоречивы, поэтому представляло интерес оценить его влияние на активность FEN1 ключевого фермента длиннозаплаточного пути ЭРО.

rpa (мкМ) -

21 8 4 21 8 4

WWtt ««

I 2 3 rpa---

4 5 8

Комплекс — ДНК-RPA —Свободный субстрат

а 9 ID 11 12 13 M 15

Рис. 9. Взаимодействие RPA и FEN1 с флэн-субс гратами с разной длиной одноцепочечной части

а Влияние RPA на активность FEN1. Концентрация RPA в реакционных смесях варьировала от 0 до 0.4 мкМ; б - Количественная оценка эффективности расщепления флэп-субстратов; в -Связывание RPA с ДНК, содержащей флэпы различной длины (по данным метода задержки в геле). [RPA]=0.4 мкМ. Положения комплексов ДНК-RPA и ДНК обозначены стрелками.

Учитывая влияние длины ОЦ участка на эффективность связывания RPA, для изучения его влияния на активность FEN1 были сконструированы ДНК с длиной ОЦ участков (флэпов) равной 4, 8 и 21 нт. Длины одноцепочечных свисающих участков во флэп-структурах были выбраны так, чтобы RPA либо не мог связываться с ОЦ-частью (флэп-4-ДНК), либо связывался непрочно (флэп-8-ДНК), либо формировал стабильный комплекс (флэп-21-ДНК).

Для этих флэп-субстратов определены способность формировать комплексы с RPA и FEN1, а также влияние RPA на расщепление ДНК FEN1. RPA ингибирует расщепление субстрата флэп-21-ДНК, но не влияет на гидролиз ДНК с флэпами длиной 4 и 8 нуклеотидов (рис. 9а и 96), что, скорее всего, обусловлено неэффективным связыванием RPA с короткими флэпами, как следует из данных, полученных методом задержки в геле, которым обнаруживается комплекс RPA только с флэп-21 -ДНК (рис. 9в, дор.4). С учетом данных по связыванию RPA с флэп-ДНК и его влиянию на активность FEN1 синтезированы две фотоактивируемые ДНК с остатками FABG-dCMP в точке ветвления и флэпами длиной 8 и 21 нт, флэп-8-А7-ДНК и флэп-21-AZ-ДНК соответственно, и использованы для модификации белков. RPA образует сшивки только с флэп-21-AZ-ДНК (рис. 10, дор. 1) в отличие от FEN1, которая модифицируется обеими флэп-ДНК (рис. 10, дор. 2 и 5).

_у_ Рис. 10. Влияние длины флэна в фоюактивируемой флэн-1 2 3 ,4 » ДНК на модификацию FEN1 и RPA

Стрелками обозначены положения полос, соответствующих продуктам модификации FEN1 и субъсдиниц RPA 70 кДа р70 или 32 кДа р32. Положение фотоактивирусмого нуклеотида обозначено звездочкой. Дор. 1-3 - флэп-2 l-AZ-ДНК, дор. 4,5 -флэп-8-Аг-ДНК.

р70 _ FEN1 -

р32 -

Продукты

модификации« ДНК — Свободный субстрат rpa FEN1

¡н

+ _ ♦ ♦ _ _ + ♦ _ ♦

Этот факт позволяет предположить, что взаимодействие RPA с флэп-структурами осуществляется за счет связывания этого белка с одноцепочечным участком ДНК. При совместной модификации RPA и FEN1 субстратом флэп-21 -AZ-ДНК уровни модификации обоих белков уменьшаются по сравнению с контролями (модификацией белков по отдельности), что свидетельствует о конкуренции RPA и FEN1 за субстрат с длинным одноцепочечным участком. При использовании флэп-8-А2-ДНК уровень модификации FEN1 при добавлении RPA не изменяется (данные не проиллюстрированы). Уровень модификации р32 значительно выше, чем р70 (рис. 10, дор. 1 ), что согласуется с данными о полярности взаимодействия RPA с ДНК (см. раздел З.1.). При "посадке" RPA на одноцепочную часть флэп-структуры субъединица р70 располагается ближе к 5'-концу оцДНК, а р32 контактирует с участком перехода двух/одноцепочечная ДНК, где расположен реакционноспособный нуклеотид.

При репарации оснований по длиннозаплаточному пути, размер ресинтезируемого участка ДНК варьирует от 2 до 10 нуклеотидов [Frosina et al., 1996]. Поскольку FEN1 с одинаковой эффективностью отщепляет флэпы длиной до 20 нуклеотидов, она едва ли является фактором, ограничивающим размер ресинтезируемого участка [.Harrington&Lieber, 1994]. Флэп-структуры с короткими флэпами (до 10 нуклеотидов) недостаточно эффективно взаимодействуют с RPA, чтобы происходило ингибирование активности FEN1. При длине флэпа, достаточной для эффективного связывания RPA, может происходить блокирование синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО, и RPA, возможно, является одним из факторов, определяющих размер ресинтезируемого участка ДНК.

2.3. Влияние поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 и ее автомодификации на некоторые стадии ЭРО (по данным, полученным в реконструированных из очищенных белков системах)

К числу белков-регуляторов ЭРО относится поли(АОР-рибозо)полимераза 1 (PARP1), которая активируется при взаимодействии с разрывами ДНК, возникающими под действием генотоксических соединений или ферментов репарации ДНК. PARP1 катализирует синтез поли(АЭР-рибозы) из NAD+, осуществляя ковалентную модификацию ряда ядерных белков, участвующих в метаболизме ДНК, в том числе собственную [D'Amours et al., 1999]. Автополи(АОР-рибозил)ирование PARP1 приводит к уменьшению ДНК-связывающей активности этого фермента и рассматривается как механизм, обеспечивающий регуляцию взаимодействия PARP1 с разрывами ДНК [Lindahl et al., 1995]. Для PARP1 характерно взаимодействие не только с ДНК-интермедиатами репарации, но и формирование прямых либо опосредованных ДНК белок-белковых контактов с другими ферментами и факторами ЭРО [Dantzer et al., 1999]. Несмотря на большой интерес к исследованию PARP1, многие детали, касающиеся ее роли в координации функциональной активности ферментов, катализирующих основные этапы ЭРО, еще не выяснены, поэтому изучение взаимодействия PARP1 с ДНК-интермедиатами и белками, участвующими в репарации ДНК, необходимо для понимания механизма регуляции ЭРО на молекулярном уровне. Данные о взаимодействии PARP1 с ДНК-интермедиатами, формирующимися на различных этапах ЭРО, в литературе практически отсутствуют, поэтому представляло интерес исследовать взаимодействие PARP1 с такими ДНК. Для этих целей использовали ДНК-дуплексы, содержащие фотоактивируемый остаток FABG-dCMP, который вводили в З'-конец 5'-[ Р]-меченого праймера за счет активности Pol р. Схематическое изображение ДНК с фотоактивируемым нуклеотидом на З'-конце и тетрагидрофуранофосфатной (рР)/фосфатной группой (р) на б'-конце олигонуклеотидов,

ограничивающих брешь/разрыв и количественная оценка эффективности модификации PARPI приведены на рис. 11.

ДНК-дуплексы, содержащие остаток pF, невыщепляемый dRP-лиазной активностью Pol Р, могут рассматриваться как ДНК-интермедиаты ДЗ-пути ЭРО. Az-DNA-gap-pF и Az-DNA-nick-pF моделируют интермедиа™ ДЗ-пути, а Az-DNA-gap-p и Az-DNA-nick-p - интермедиа™ КЗ-пути ЭРО.

Az-DNA-gap-pF Az-DNA-gap-p Az-DNA-nlck-pF Az-DNA-nlck-p

Концентрация PARP1. мкМ

фотоактнвируемыми ДНК-интермедиа гами

Рис. 11. Аффинная модификация PARP1 коротко- и длиннозаплаэочного путей ЭРО

а - Схематичное изображение фотоактивируемых ДНК. AzC=FABG-dCMP. pf - З-гидрокси-2-гидроксимстилтетрагидрофуранофосфат, р - фосфат; б - Зависимость эффективности модификации PARPI от ее концентрации. Эффективность .модификации PARP1 фотоактивирусмыми ДНК-дуплексами определяли как долю (%) ['"Р]-мсчсного праймера, присоединенную к белку.

В целом, эффективность мечения PARP1 выше для ДНК с однонуклеотидной брешью, чем для ДНК с разрывом, и мало зависит от типа группы (фосфат или pF) на 5'-конце олигонуклеотида, запирающего брешь.

Учитывая различия в эффективности модификации PARP1 фотоактнвируемыми ДНК с брешью/разрывом можно ожидать более значительного влияния PARP1 на заполнение бреши, чем последующую элонгацию праймера, сопровождающуюся вытеснением цепи ДНК, фланкирующей разрыв. Однако данные количественной оценки влияния PARP1 на элонгацию праймера, катализируемую Pol Р, в составе ДНК-дуплексов с однонуклеотидной брешью, фланкированной pF- или р-группами, которые могут рассматриваться как интермедиа™ ДЗ- и КЗ-путей ЭРО соответственно, продемонстрировали, что для обеих ДНК PARP1 в концентрациях 50 нМ и 100 нМ вызывает уменьшение средневзвешенной длины продуктов элонгации праймера (синтез с вытеснением цепи) без заметного влияния на застраивание бреши (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние РАК PI на средневзвешенную длину продуктов и эффективность синтеза ДНК,

катализи эусмого Pol р

Концентрация PARPI (нМ)

0 | 50 | 100 | 500

Средне Ы взвешенная длина продукта )фсктивность синтеза*)

ДНК-pF 17.3 (93) 17.4 (92) 16.8 (92) 15.6 (60)

ДНК-Р 16.3 (96) 16.2 (96) 16.0 (96) 15.8 (78)

Pol р-

♦Эффективность синтеза определяли как долю (%) 15-мерного праймера, удлиненного в ходе реакции. Представлены данные трех независимых определений. Ошибка не превышала 1.5%.

Pt>l ßll ык\|| - ++ + ++ + ++ -PARPI <МКМ> 1.0 - 0.1 0.5 1.0 - 0.1 0.5 1.0 1.0

Рис. 12. Влияние PARP1 на

взаимодействие Pol Р с ДНК (по данным фотоаффинной модификации)

Структура ДНК обозначена вверху, С*-FABG-dCMP.

Однако при *500 нМ концентрации PARP1 ингибирует и застраивание бреши, и синтез ДНК с вытеснением цепи. В целом, PARP1 в большей степени ингибирует активность Pol ß на стадии синтеза ДНК с вытеснением цепи, чем на стадии заполнения бреши (Табл. 3).

Ингибирование Pol ß-зависимого синтеза ДНК с вытеснением цепи, вызываемое PARP1, может быть обусловлено конкуренцией этих белков за взаимодействие с ДНК-интермедиатами, формирующимися после застраивания бреши. Данные фотоаффинной модификации белков (рис. 12) с использованием Az-DNA-nick-p и Az-DNA-nick-pF (см. структуру на рис. 11а) демонстрируют, что увеличение концентрации PARP1 вызывает снижение уровня мечения Pol ß. PARP1, по-видимому, вытесняет Pol ß с З'-конца инициирующего праймера, что приводит к ингибированию синтеза с вытеснением цепи.

Как уже отмечалось выше, регуляция взаимодействия PARP1 с ДНК осуществляется путем ее поли(АОР-рибозил)ирования, поэтому представляло интерес изучить влияние поли(АОР-рибозил)ирования PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol ß.

ДНК-дэр-р

Рис. 13. Влияние PARP1 и ее нолн(АОР-рибозил)нрова11ной формы на элонгацию нраймеров Pol ß в составе ДНК-дуплексов с однонуклеотидной брешыо

б ДНК-flap-pF > --Синтез ДНК, катализируемый Pol ß, проводили в

смесях, содержащих ДНК-gap-p (а) или ДНК-gap-pF (б), в присутствии PARP1 (дор. 1-3), в присутствии PARP1 и NAD* (дор. 4-6), и в отсутствие PARP1 и ________NAD" (дор. 7-9).

PARP1 |5иОнМ) * + "

NADHIMM) +

Для этого анализировали продукты элонгации праймера в составе ДНК, содержащей однонуклеотидную брешь и фуранофосфатную или фосфатную группы на 5'-краю бреши, в присутствии PARP1, или PARP1 и NAD+ (рис. 13). В условиях поли(АОР-рибозил)ирования эффективность застраивания бреши восстанавливается до уровня, наблюдаемого в отсутствие PARP1 (рис. 13а и 136, дор. 4 и 7). Эффективность же синтеза ДНК с вытеснением цепи восстанавливается частично, но не достигает уровня, наблюдаемого в отсутствие PARP1 (рис. 13а и 136, дор. 6 и 9). В целом, PARP1 снижает активность Pol ß и на стадии застраивания однонуклеотидной бреши, но в значительно большей степени ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи. Восстановление активности Pol ß в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи при поли(АОР-рибозил)ировании PARP 1 свидетельствует о возможности регуляции Pol ß-зависимого синтеза ДНК в ДЗ-пути репарации с помощью PARP1 и ее автомодификации.

Как уже отмечалось, АРЕ1 способна выщеплять З'-концевой dNMP в одноцепочечном разрыве, что предполагает ее участие в комплексе с Pol ß в качестве 3'—>5' экзонуклеазы, обеспечивающей удаление нуклеотидных остатков, ошибочно включенных полимеразой при синтезе ДНК. С другой стороны АРЕ1, расщепляя апуриновый/апиримидиновый сайт в ДНК, генерирует одноцепочечный разрыв, который эффективно опознается PARP1. Детальное исследование взаимного влияния APEl, Pol ß и PARP1 (попарно и при совместном присутствии трех белков), проведенное с использованием ДНК-интермедиатов ЭРО, в том числе с ошибочно спаренными нуклеотидами на З'-конце элонгируемого праймера, позволило установить ряд закономерностей взаимодействия этих белков в репаративном синтезе и роль поли(А0Р-рибозил)ирования в этом процессе. В качестве примера на рис. 14 приведены

зависимость степени экзонуклеазного гидролиза от концентрации АРЕ1 (б) и влияние Pol ß (в) и PARP1 (г) на экзонуклеазную активность АРЕ1.

В целом, установлено, что: а) АРЕ 1 стимулирует активность Pol ß в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи. При некомплементарности оснований на З'-конце разрыва АРЕ1 выщепляет З'-концевой нуклеотидный остаток, обеспечивая точность репарационного синтеза ДНК, катализируемого Pol ß; б) PARP1 умеренно снижает эффективность застраивании однонуклеотидной бреши и значительно ингибирует синтез с вытеснением цепи, катализируемый Pol ß. PARP1 подавляет стимулирующее влияние АРЕ 1 на синтез ДНК и ингибирует 3'—>5' экзонуклеазную активность этого белка.

Поли(АОР-рибозил)ированис PARP1 ослабляет се ингибирующее действие, указывая на определяющую роль этого белка в регуляции репаративного синтеза в длиннозаплаточном пути. Автомодификация PARP1, по-видимому, является необходимым условием для реализации Pol ß-зависимого синтеза ДНК с участием АРЕ 1 в качестве 3'—>5' корректирующей экзонуклеазы.

DNA-F(C«G) dna-p(G.G) DNA-F(T.G) dna-p(t.G)

pF - 3-гндро«си-2-гадроксммст*птвтрагидро-фураиофосфат, p - фосфат

Рис.14. Зависимость 3'—^'-экзонуклеазной активности АР-эндонуклеазы 1 от структуры ДНК и присутствия Pol (1 и PARP1

а - Схематическое изображение структур ДНК;

б Зависимость степени гидролиза от концентрации АРЕ1; в Ингибированис экзонуклеазной активности АР-эндонуклсазы 1 в присутствии Pol ß;

г Ингибированис экзонуклеазной активности АР-эндонуклеазы 1 в присутствии PARP1.

2.4. Влияние поли(АОР-рибозо)полнмеразы 1 и ее 24 кДа-фрагмента на репарацию ДНК но КЗ- и ДЗ-пути ЭРО (по данным, полученным в экстрактах)

Поскольку в реконструированной системе обнаружено различие во влиянии PARP1 на синтез ДНК в КЗ- и ДЗ-путях ЭРО, представляет интерес исследовать влияние этого белка на эффективность процесса в целом и выявить все стадии репарации, находящиеся под контролем PARP1. При переходе клеток к апоптозу PARP1 подвергается протеолизу каспазой 3 с образованием фрагментов р89 и р24 (Kaufmann et al., 1993). р24 содержит ДНК-связывающий мотив "цинковые пальцы", обеспечивающий функциональное узнавание интактным ферментом ДНК-разрывов. р24 сохраняет способность связывать ДНК, но его взаимодействие с ДНК уже не регулируется через поли(АОР-рибозил)ирование. Предполагается, что р24 может ингибировать репарационный процесс, создавая стеричсское препятствие взаимодействию ферментов с повреждением в ДНК [D'Amours et al., 2001]. Удобной модельной системой для оценки влияния определенных белков на общую эффективность процесса могут быть клеточные экстракты. Добавление экзогенного исследуемого белка позволяет вычленить его влияние на фоне полного набора белков системы репарации.

2, 3 и 4, 5; 8, 10 и 9, 11). При совместном добавлении PARP1 и NAD+ активность FEN1 экстракта восстанавливается лишь частично (рис. 16а, дор. 3 и 6). Аналогичные тенденции наблюдаются и в реконструированной системе (рис. 166). Анализ полученных данных указывает, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в ДЗ-пути может эффективно осуществляться по механизму «трансляции однонуклеотидной бреши» за счет согласованного действия Pol ß и FEN1. PARP1 и р24 практически не оказывают влияния на репарацию ДНК по КЗ-пути ЭРО, но, подавляя синтез ДНК и активность FEN1, ингибируют ДЗ-путь.

32 р^

Рис. 16. Влияние PARP1 и р24 на расщепление олигонуклеотида, запирающего брешь с 5'-конца, за счет активности белков экстракта (а) и рекомбинантной FEN1 (б).

Положения исходного олигонуклеотида (pF-lN|8) и продуктов его расщепления обозначены стрелками.

Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, приводящее к снижению ДНК-связывающей активности этого белка, по-видимому, необходимо для эффективного протекания ДЗ-пути, когда синтез ДНК осуществляется по механизму «трансляции однонуклеотидной бреши». Детальное исследование влияния экзогенных PARP1 и р24 на модификацию белков экстракта с использованием фотоактивируемых аналогов ДНК-интермедиатов ДЗ- и КЗ-путей ЭРО позволило установить, что эти белки снижают уровни модификации белков экстракта (данные не проиллюстрированы). С учетом результатов функциональных тестов можно заключить, что ингибирующее влияние РАЯР1 и р24 на репарацию ДНК обусловлено функциональной конкуренцией этих белков с ферментами репарации экстракта за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО. Такая конкуренция, вероятно, играет важную роль в процессе координации репарации, т.е. в обеспечении передачи ДНК-субстрата от одного белка к другому в ходе ЭРО и регуляции состава белков, входящих в репаративный комплекс.

2.5. Взаимодействие ХЯСС1 с ДНК, содержащими АР-сайты

ХЯСС1 - белок, входящий в группу комплементации, которая обусловливает чувствительность клеток к рентгеновскому излучению - является одним из кофакторов процесса ЭРО. Он не обладает собственной ферментативной активностью, но способен взаимодействовать с несколькими ферментами ЭРО, модулируя их активность, и рассматривается как белок, координирующий короткозаплаточный путь ЭРО \Caldecolt, 2003, \1arsin е/ а!., 2003]. При исследовании взаимодействия XRCC1 с ДНК-интермедиатом начального этапа ЭРО - ДНК, содержащей 8-охоО - в присутствии 8-охов-гликозилазы (0001) обнаружены два типа основных продуктов пришивки белков к ДНК, формирование которых опосредовано присутствием боргидрида. Остатки дезоксирибозы в АР-сайтах находятся в равновесии циклической фуранозной и ациклической альдегидной форм. Альдегидная форма может реагировать с первичными аминогруппами белков, образуя основание Шиффа. Образование основания Шиффа -обратимый процесс, однако связь белка с ДНК можно стабилизировать за счет восстановления боргидридом [Левина с соавт., 1980]. С учетом кажущейся

ДНК-gap-pF

1-ЛКР1 n at>' <intp ♦ ■*■ -fr -- - -fr -fr -fr -fr о pen l Pol u l'akpi Jntp : t

рГ-N—~ r- w.

pF-Nj—- pF-Nj—

pF-Nj — pF.N,—- pF-Nj—— pF-N,—-

- — —. « *

1 23456 789 10 11 123466789

молекулярной массы продуктов, оцененной по электрофоретической подвижности, можно предположить, что их образуют OGG1 и XRCC1. Поскольку без OGG1 или в присутствии ее каталитически неактивной формы (K249Q) такие продукты отсутствовали, было выдвинуто предположение, что сшивки с XRCC1 формирует ДНК-структура, возникшая в результате катализируемой OGG1 реакции. При взаимодействии с 8-oxoG-flHK бифункциональная ДНК-гликозилаза OGG1 образует два типа продуктов, которые способны формировать основание Шиффа - ДНК с интактным AP-сайтом и ДНК с одноцепочечным разрывом, фланкированным 3'-а,р-4-гидроксипентен-2-алем (3'-dRP) [Fromme et al., 2004]. С использованием АР-ДНК обнаружено формирование ковалентных аддуктов с XRCC1, а также экспериментами по пришивке АР-ДНК к XRCC1 в присутствии конкурентных ДНК (рис. 17) продемонстрирована специфичность взаимодействия XRCC1 с AP-сайтами. ДНК-дуплекс с синтетическим аналогом АР-сайта - остатком остаток 2-гидроксиметил-З-гидрокситетрагидрофурана (THF) - значительно снижает уровень пришивки, а обычный ДНК-дуплекс практически не влияет на образование ковалентных продуктов.

thf

конкурентная ДНК (нМ) XRCCI-ДНК

10 50 100

Рис. 17. Специфичность XRCC1 с АР-ДНК

взаимодействия

1 2 3 4 5 6 7

XRCC1 инкубировали с 32Р-мсченой АР-ДНК в отсутствие (дор. 4) или в присутствии немеченых конкурентных ДНК, в качестве которых использовали THF-содсржащий (дор. 1-3) или обычный (дор. 5-7) ДНК-дуплексы. Реакционные смеси содержали 20 нМ АР-ДНК и 250 нМ XRCC1. Концентрации конкурентных ДНК приведены на рисунке.

При анализе влияния активной (WT) и каталитически неактивной (K249Q) форм OGG1 на взаимодействие XRCC1 с АР-ДНК установлено, что при низких концентрациях WT OGG1 увеличивает количество сшивок XRCCI-ДНК в 3-4 раза, а мутантная OGG1 не влияет на этот параметр (рис. 18а). Таким образом, увеличение уровня пришивки XRCC1 к АР-ДНК в присутствии OGG1 обусловлено ее каталитической активностью, по-видимому, за счет создания структуры ДНК, обладающей большим сродством к XRCC1, ДНК-дуплекса с разрывом [Mani et al., 2004], который является продуктом АР-лиазной активности OGG1. При гидролизе АР-сайта АРЕ1 образуется ДНК-дуплекс с разрывом, содержащий З'-ОН и 5'-дезоксирибозофосфатную (5'-dRP) группы. 5'-dRP остаток также может образовывать основание Шиффа с первичными аминогруппами белков. Для регистрации продуктов пришивки к белку в этом случае необходимо переместить радиоактивную метку в соответствующее положение, например, на З'-конец исходного АР-сайт-содержащего олигонуклеотида. С использованием такой ДНК также были обнаружены ее сшивки с полноразмерной XRCC1 и формой, лишенной С-концевого домена (12) (рис. 186).

OOG1

K249Q (нМ) WT(HM)

XRCC1-DNA*

OGG1-DNA*

- - - 0 20 50 200 -

20 50 200

XRCCI-ДНК— 12-ДНК—

1 2

Рис. 18. Взаимодействие ХКСС1 с ДНК, содержащими АР-сайты

(а) - 5'-[32Р]-АР-ДНК и ХЯСС! инкубировали в присутствии активной (\УТ) или мутаптной (К249<3) форм ООС1; (б) - ДНК-ду плекс с АР-саитом, гидролизованным АРЕ1, инкубировали с ХКСС1 или 12. Исходная АР-ДНК содержала радиоактивную метку на 3'-конце (обозначено звездочкой).

Таким образом, ХЯСС1 может взаимодействовать с несколькими ДНК-интермедиатами, содержащими как интактный АР-сайт, так и расщепленный АРЕ 1 с 5'-ёЯР группой или 3,-dRP, который формируется при действии на АР-сайт некоторых бифункциональных ДНК-гликозилаз. Такие взаимодействия ХЯСС1 могут быть вовлечены в ее известную регуляторную функцию в КЗ-пути ЭРО [СаШесоИ, 2003, Магэ1п е1 а!., 2003], однако это предположение требует дальнейших исследований.

3. ХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДНК В ИССЛЕДОВАНИИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КОМПЛЕКСОВ ДНК-БЕЛОК

Ковалентное присоединение химически активных ДНК к белкам позволяет «маркировать» поверхность белка, контактирующую с ДНК. В случае многосубъединичных белков с использованием таких ДНК, в особенности, при изменении положения химически активной группы в структуре ДНК, можно получать информацию об ориентации полипептидных цепей в комплексе с ДНК и в некоторых случаях регистрировать изменение конформации белков. «Разрешающая способность» будет зависеть от нескольких факторов, включающих расположение аминокислот-акцепторов, длину и гибкость линкера, через который присоединена химически активная группа. Для реагентов с «нулевой» длиной линкера, по-видимому, можно ориентироваться на идентификацию доменов белка, непосредственно контактирующих с ДНК. Продуктивность применения химически активных ДНК в комбинации с другими подходами в изучении структурной организации комплексов ДНК-белок иллюстрируется на примере двух белков, один из которых - ЯРА - является многосубъединичным и состоит из трех полипептидных цепей - р70, р32 и р14.

3.1. Исследование структурной организации комплексов ИРА с ДНК

Для решения задач такого рода фотоаффинная модификация была впервые применена нами в изучении репликативного белка А. Согласно литературным данным, в составе ЯРА присутствуют высокогомологичные ДНК-связывающие домены (ЭВО-А, ОВБ-В и ЭОВ-С в р70, а ОВО-Э - в р32) \Iftode е/ а!., 1999]. Малая субъединица р14 представляет собой отдельный домен с высоким уровнем структурной гомологии с ДНК-связывающими доменами 0В0-А-Т)В0-0. Наличие нескольких ДНК-связывающих доменов предопределяет возможность существования различных по архитектуре комплексов ЯРА-ДНК (типов связывания ДНК) [¡УоШ, 1997; 1/Ые е! а!., 1999], что, в свою очередь, обеспечивает возможность динамического изменения характеристик взаимодействия белка с ДНК и является основой многофункциональности ЯРА. К началу исследования нами ЯРА было известно, что он образует непрочные комплексы, взаимодействуя с 8 нт, и стабильные - с 30 нт, и, что изменение типа комплекса сопряжено со значительными конформационными перестройками белка \lftode е( а!., 1999]. Однако вклад субъединиц и отдельных доменов во взаимодействие с ДНК не был точно установлен. С использованием частичного ДНК-дуплекса (5'-выступающая одноцепочечная цепь длиной 19 нт) (см. рис. 19) было показано, что р32-субъединица является основной мишенью присоединения 3'-концевого фотоактивного нуклеотида \Lavrik е! а!., 1998]. Для детального исследования был сконструирован набор частичных ДНК-дуплексов с одноцепочечной (ОЦ) выступающей 3'- или 5'-концевой частями и соответственно расположенными фотоактивируемыми группами, а также набор одноцепочечных ДНК с вариабельным положением 4-тиоурацила (схематическое изображение использованных ДНК представлено на рис. 19).

-p Az Фоголтвиля груплана 3 «они«.

5 -выступающа*одноц«1оч*чна1| ■ цепьдлнноиф. 13. 14.19»пи ЗОнт

д2 ^¿Р Фоюакпвнм группам« 5 -«онце.

3-| I II - I э- -маступаищая одноцспочечная

■ цспьдпнноиО. 13.14. Юнли ЗОнт

Олкакпочсчнаи JJ1K. 30 нт. 5< _ остатки тиоурдцила в

32р'"" ..........ml....... III 3' положениях S. 10.22 с S*-конца

s* д з'

Рис. 19. Схематичное изображение фотоактивируеммх ДНК, использованных для исследования структурной

организации комплексов КРЛ с ДНК

Положения фотоактивирусмой группы, радиоактивной метки и вариабельной одноцепочечной части ДНК-дуплекса обозначены символами Аг или яи, 32Р и фигурной скобкой соответственно.

С использованием ДНК с З'-концевым фотоактивным нуклеотидом в праймерной цепи и переменной длиной 5'-выступающей одноцепочечной части показано, что при уменьшении длины ОЦ-части (14—>13—>9—>4 нт) интенсивность мечения р70 увеличивается, и она становится основной мишенью пришивки. Увеличение длины одноцепочечного участка до 30 нт уже практически не изменяет соотношение сшивок субъединиц р70 и р32 с ДНК. В параллельном исследовании, выполненном с использованием ДНК с аналогичной структурой, в которых фотоактивная 2-нитро-5-азидобензоильная группа была присоединена к 5-ому положению урацила линкерами длиной 2, 4 и 7-12 атомов, либо представляла собой фотореагент с «нулевой» длиной линкера - 4-тио-ТМР, было установлено, что изменение соотношения мечения р70/р32 в основном определяется длиной одноцепочечной части ДНК, а не размером линкера [Lavrik et al., 1998, Kolplashchikov et al., 2000]. Это дает основания относить наблюдаемый характер мечения субъединиц к конформационным изменениям RPA при связывании с ДНК.

Для 5'-концевого фотореагента (фотоактивируемая группа присоединена к 5'-концевому фосфату олигонуклеотида) основной мишенью сшивок на З'-выступающей одноцепочечной части является р70, а соотношение мечения р70/р32 практически не зависит от длины одноцепочечной части дуплекса.

Наблюдаемое перераспределение интенсивностей мечения субъединиц р70/р32 при варьировании длины одноцепочечной части ДНК-дуплексов и изменении соотношения RPА/ДНК, в целом, хорошо согласуются с предположением о полярности расположения субъединиц RPA на одноцепочечной ДНК и с изменением конформации белка, обусловленной последовательным вовлечением в связывание отдельных ДНК-связывающих доменов р70 и р32 субъединиц при изменении типа связывания от 8-нт к 30-нт.

Для частичных ДНК-дуплексов мечение р14-субъединицы не обнаружено ни в одном случае. Аффинная модификация отдельных субъединиц RPA (в составе химерных полипептидов с мальтозосвязывающим белком) с использованием частичного ДНК-дуплекса с 5'-выступающей одноцепочечной частью и З'-концевым фотоактивируемым нуклеотидом в праймерной цепи также не выявила сшивок р!4, хотя две другие субъединицы подвергались модификации. Субъединица р14 в составе RPA при взаимодействии с частичными ДНК-дуплексами, по-видимому, экранирована от фотоактивируемой группы двумя другими субъединицами.

Хотя при использовании частичных ДНК-дуплексов различных типов не удалось обнаружить сшивок с р14, наличие в р 14 ДНК-связывающего домена и абсолютная необходимость этой субъединицы, как и двух других, для жизнедеятельности клеток [Wold, 1997, Iftode et al., 1999], предполагают, наряду с известными типами связывания, в которых задействованы домены р32 и р70 субъединиц, возможность взаимодействия RPA с одноцепочечной ДНК, опосредованного р14 субъединицей.

Использование одноцепочечных олигонуклеотидов длиной 30 нт с остатками 4-тиоурацила фотореагента с «нулевой длиной спейсера» в различных положениях (8,

16, и 22 положения с 5'-конца) дает возможность варьирования типов связывания при изменении молярного соотношения RPA-.ДНК для выявления субъединиц RPA, непосредственно контактирующих с соответствующими участками ДНК. При анализе результатов фотоаффинной модификации субъединиц RPA такими ДНК (рис. 20а) с учетом типов образующихся комплексов (по данным метода задержки в геле) получены прямые свидетельства полярной укладки белка на одноцепочечную ДНК и данные о существовании непосредственных контактов с ДНК малой субъединицы белка - р14. Наличие прямых контактов р14 с одноцепочечной ДНК было позднее подтверждено с использованием аналогичного подхода. ДНК содержала 4-тиотимидин в качестве химически активной функции [Salas et al., 2009].

а 6 j|hk-8 днк-ie ahkj;

днкя дик 16 - лики ^^^^^^^^

V t * V * 100

ш Z р щ л

ТЧ^НШ - тип» i i 2 — ---;-з 4 0

IBHHI^IH РИИИИИИИЩ I^^HHI комплексов 2 |------

.. US 02» I 0.35 I - f +2

(вм| м.м o l,5 tl, 2 o 0.5 2 0125 0.5 2 2

Рис. 20. Взаимодействие RPA с одноцепочечной ДНК

а - Анализ продуктов аффинной модификации RPA одноцспочсчными ДНК, содержащими S4-dUMP в различных положениях цепи. Положения ковалентных аддуктов ДНК с различными субъединицами RPA обозначены слева; б Зависимость мечения отдельных субъсдиниц RPA (процентной доли ДНК, присоединенной к определенной субъединице, по отношению к суммарному количеству ДНК, присоединенной к белку в целом) от типа комплекса RPA-ДНК и положения S^-dUMP в цепи ДНК.

Ограниченный протеолиз часто используется для структурных исследований белково-нуклеиновых комплексов. Для картирования доменов RPA, взаимодействующих с З'-концом в составе ДНК с 5'-выступающей цепью (32 нт), был использован ограниченный протеолиз в комбинации с фотоаффинной модификацией (рис. 21).

Рис. 21. Ограниченный протеолиз RPA, ковалентно присоединенного к З'-к-онцу праймера в составе частичного ДНК-дуплекса (радиоавтограф геля и схематическое обозначение фрагментов)

Анализ данных о наборе пептидов, образующихся в условиях ограниченного протеолиза RPA, о принадлежности пептидов к определенному участку (или субъединице) белка, полученных с использованием антител, специфичных к определенным эпитопам, и данных о пептидах, сшитых с ДНК, позволил однозначно идентифицировать участки белка, взаимодействующие с ДНК в точке перехода одно/двухцепочечная ДНК в частичных ДНК-дуплексах с 5'-выступающей одноцепочечной частью. Во взаимодействие вовлечены центральная часть р32 (аминокислоты 39-180) и С-концевая часть р70 (аминокислоты 432-616).

-V"»

Им»

Вр«МИ ИНМувДЦИИ С iptWCHWM. мин ЯРЛ70- -

итого рво-а оао* рым:

Í1I» И !"»">

фотоактивируемыми группами, поэтому АР-ДНК более перспективны при поиске белков, специфически взаимодействующих с такими ДНК-структурами.

Возможность сочетания с иммунологическими, и, в особенности, с развитыми в последнее время масс-спектрометрическими методами идентификации белков, делают аффинную модификацию незаменимой в поиске белков, взаимодействующих с ДНК-интермедиатами репарации/репликации в недостаточно охарактеризованных организмах, и обнаружении ранее неизвестных белков-участников процессов репарации/репликации ДНК. Этот подход довольно универсален и может применяться в исследовании разных систем процессинга ДНК благодаря возможности создания ДНК, содержащих структурные элементы, которые характерны для определенного пути/стадии. Кроме того, варьируя структуру ДНК, можно создавать высокоселективные ДНК-зонды для сравнительного анализа содержания определенных белков в клеточных экстрактах.

4.1. Фоюактивные ДНК в характеризации компонентов репликативной системы

Плазмодий миксомицета Ркузагит ро!усерка1ит представляет собой синцитий с практически синхронно делящимися ядрами. Его репликативный аппарат, а именно набор существующих в организме ДНК-полимераз и репликативных факторов не был полностью охарактеризован. Базируясь на методе фотоаффинной модификации, удалось впервые выделить и охарактеризовать ДНК-полимеразу ь. В качестве матрично-затравочной системы для синтеза фотоактивируемой ДНК использовали ДНК из молок лосося (частично гидролизованную ДНК-азой I) или олигонуклеотиды. При синтезе ДНК, осуществляемом эндогенными ДНК-полимеразами, в ее состав вводили радиоактивные сП^МР и остатки РАВ-с1СМР. После индуцированного УФ-светом присоединения ДНК к белкам, часть ДНК, выступающую за пределы белковых глобул, удаляли нуклеазой, продукты разделяли электрофорезом в ЗОЗ-ПААГ и осуществляли электроперенос белков на мембрану, которую экспонировали с рентгеновской пленкой. Результаты фотоаффинной модификации частично очищенного препарата ДНК-полимераз и выделенного индивидуального препарата ДНК-полимераза б представлены на рис. 23. Данные ингибиторного анализа активности очищенного препарата ДНК-полимеразы е А^-этилмалеимидом, афидиколином, бутифенил-сЮТР и гепарином, а также предпочтительное использование выделенным ферментом определенных типов матрично-затравочных комплексов, свидетельствуют, что ДНК-полимераза е Р. ро!усерИа1ит проявляет характеристики, хорошо согласующиеся с опубликованными данными для этого фермента высших эукариот.

Рис. 23. Фоюаффнниая модификация частично очищенного препарата ДНК-полимераз из Р. ро!усерИа1ит (а) и очищенного препарата ДНК-полимеразы £ (б)

Для синтеза фотоактивируемой ДНК использованы ДНК из молок лосося, частично гидролизованная ДНК-азой I (а), или синтетические олигодезоксирибонуклеотиды (б).

Кроме того, с использованием этого же подхода, дополненного иммуноферментным окрашиванием, идентифицировано несколько белков, модифицированных фотоактивируемыми ДНК в экстракте. Отнесение продуктов модификации к определенным белкам основано на совпадении положения радиоактивной метки, входящей в состав ковалентно присоединенной ДНК, и сигнала, полученного при иммуноферментном окрашивании. Среди белков экстракта плазмодия, образовавших

сшивки с ДНК, с использованием антител к известным компонентам системы репликации ДНК идентифицированы полипептиды ДНК-полимеразы а-праймазы и ДНК-полимеразы 8.

4.2. Поиск клеточных белков человека, взаимодействующих с АР-сайтами. Идентификация Ки-антигена

Апуриновые/апиримидиновые сайты - один из наиболее часто встречающихся типов нарушений в структуре ДНК; они возникают в клетках млекопитающих с частотой 104 в сутки за счет спонтанного или катализируемого в процессе ЭРО ДНК-гликозилазами гидролиза jV-гликозидной связи между дезоксирибозой и основанием [Lindahl, 1972]. Нерепарированные АР-сайты цитотоксичны и мутагенны [Loeb, 1985], поэтому представляет интерес идентификация белков, взаимодействующих с ними и, возможно, участвующих в регуляции их репарации.

Большинство белков, которые способны формировать основания Шиффа с дезоксирибозой АР-сайта (в том числе и с его расщепленными формами), связано с процессом ЭРО, но, в тоже время, такой тип взаимодействий обнаружен у некоторых белков, формально не относимых к этому процессу [Hegde et al., 2004, Postel et ai, 2000]. Для поиска белков в клетках человека, способных к формированию ковалентных аддуктов с АР-сайтами (с последующим восстановлением NaBH4), был использован радиоактивно меченый ДНК-дуплекс (32 н.п.), содержащий АР-сайт в средине одной из цепей. В цельноклеточных экстрактах HcLa, легочных фибробластов человека, К-562 и MCF-7 преобладающие продукты сшивки АР-ДНК с белками обладают одинаковой электрофоретической подвижностью. Кажущаяся молекулярная масса такого продукта, оцененная по электрофоретической подвижности, соответствует приблизительно 95 кДа (рис. 24а, дор. 1).

- »

■нти-КивО I 2

ВНЙ'МКМ I MUI Í ДНК

B*K«NI(OpewtlCO CIIMfltMHAMOUM

доло|ммт«|ъим очистка ifwKf рофороом ■ ПААГ

Т|жл< ммоли! ■ г«1М бет л. с «ИТ Of о с дик. MALDt-TOr-MS WUM) логтуч#ииы1 пешндов

4tU

Пожкоапкааоа» дмикм иаммом

|M]VIMIINUK(. са*к1ром|||»и|

Рис. 24. Идентификация Ки-антигена как белка, взаимодействующею с АР-сайтами

а Модификация белков экстракта клеток HcLa: дор. 1 продукты сшивки АР-ДНК с белками экстракта клеток HcLa, дор. 2 - контроль - замена АР-сайта в ДНК на его аналог - остаток THF, и дор. 3 контроль без обработки NaBH4; б - Сравнение продуктов сшивки полипептидов в экстракте клеток HcLa ц препарате ДНК-ПК с АР- (дор. 1 и 2) и фотоактивирусмой ДНК (дор. 3 и 4) ; в Идентификация белка по «супсрсдвигу» комплексов Ku-антигсна с АР-ДНК в присутствии моноклональных антител против Ки80 в условиях нативного элекгрофореза в ПААГ; г Идснтифкация белка методом иммунопрсципитации с использованием моноклональных антител против Ки80 (дор 1. - апиквота реакционной смеси, дор. 2 и 3 продукты нссвязавишс и связавшиеся с Protein А-ссфарозой соответственно ; д - Схема идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с АР-ДНК с использованием масс-спсктромстрии.

Следует отметить, что кажущаяся молекулярная масса продуктов сшивки приблизительно соответствует сумме масс белка и ДНК. При замене в структуре ДНК АР-сайта на его аналог - остаток THF - (рис. 24а, дор. 2) или без обработки NaBH4 (рис. 24а, дор. 3) продукты сшивки ДНК белок не регистрируются.

Ни один из белков, для которых достоверно установлено взаимодействие с АР-сайтами через образование основания Шиффа, не обладает подходящей молекулярной массой, чтобы формировать продукты с наблюдаемой электрофоретической подвижностью. Для идентификации белка использовали несколько подходов. Аффинная модификация белков экстракта клеток HeLa фотоактивируемыми ДНК, имитирующими ДНК-интермедиаты более поздних стадий ЭРО, выявила продукты сшивки с белками с кажущимися молекулярными массами около 92 и 80 кДа (рис. 246, дор. 3). Учитывая набор, молекулярные массы продуктов сшивки белков с АР-ДНК и фотоактивируемыми ДНК, а также длину присоединяемого к белку олигонукпеотида (16 и 32 н.о. для фотоактивируемой и АР-ДНК соответственно), мы предположили, что возможным кандидатом является Ки-антиген.

Ки-антиген° эукариотический гетеродимерный ДНК-связывающий комплекс, состоящий из субъединиц с молекулярными массами около 70 кДа (Ки70) и 83 кДа (Ки80). Его основная функция связана с репарацией двухцепоченых разрывов ДНК путем негомологичного соединения концов. Ku-антиген, наряду с каталитической субъединицей, входит в состав ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК). Каталитическая субъединица (ДНК-ПКкс) способна связываться с концами ДНК, но Ки-антиген примерно в 100 раз увеличивает сродство ДНК-ПКкс к ДНК [Downs&Jacbon, 2004].

Природа модифицированного белка подтверждена: 1) сопоставлением электрофоретической подвижности продуктов сшивки полипептидов в экстракте и коммерческом препарате ДНК-ПК (в состав которой входит Ku-антиген) с АР-ДНК и фотоактивируемой ДНК (рис. 246); 2) уменьшением электрофоретической подвижности в условиях нативного электрофореза в ПААГ комплекса белок-АР-ДНК, образованного в экстракте из клеток HeLa, которое наблюдается в присутствии анти-Ки80 иммуноглобулинов (рис. 24в); 3) данными иммунопреципитации продуктов сшивки белков экстрактов с АР-ДНК с использованием Protein А-сефарозы и моноклональных анти-Ки80 иммуноглобулинов (рис. 24г). И в завершение, идентичность белка подтверждена методом пептидного картирования на основе данных MALDI-TOF-MS. Идентификации подвергался белок в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК в соответствии со схемой, представленной на рис. 24д. Ки80-полипептид идентифицирован как наиболее достоверный кандидат (Mowse score 115, coverage 15%).

В дальнейшем с использованием клеточных экстрактов и ДНК-ПК, в состав которой входит Ku-антиген, были установлены некоторые характеристики взаимодействия Ки-антнгена с АР-ДНК. Специфичность взаимодействия Ku-антигена экстракта с АР-ДНК была подтверждена с использованием конкурентных ДНК (рис. 25а). ДНК, содержащая остаток THF, снижает пришивку АР-ДНК к Ки80 в значительно большей степени, чем обычный ДНК-дуплекс, что указывает на более эффективное взаимодействие этого белка с АР-ДНК. Инкубация АР-ДНК в присутствии ДНК-ПК не приводит к расщеплению АР-сайтов (данные не проиллюстрированы).

Поскольку АР-эндонуклеаза 1 - это основной фермент ЭРО в клетках высших эукариот, гидролизующий АР-сайты [WHson&Barsky, 2001], было оценено влияние Ku-антигена (составе ДНК-ПК) на активность АРЕ 1 (рис. 256). ДНК-ПК при эквимолярной концентрации по отношению к ДНК значительно ингибирует гидролиз АР-сайтов, что указывает на возможную функциональную значимость взаимодействия Ku-антигена с

ЛР-сайтами. Формирование оснований Шиффа с АР-сайтами потенциально может быть вовлечено в их временную защиту или регуляцию репарации, как было предположено для монофункциональной ДНК-гликозилазы МЩУ, формирующей с АР-сайтами значительно более стабильные комплексы, чем бифункциональные ДНК-гликозилазы [1Иагко\&СгоЧтап, 1998]. Проведенная оценка стабильности комплексов Ки-антигена с АР-ДНК не обнаружила значимого их распада в течение 4 часов (рис. 25в).

я р; ■омтрол*. АРС1 АРС1 • ДМК-ЛК П

3 ° I-N-II-1 В

I ] ) 1 ) 1 1 И Н1М1 •»НК>Р«П11Ш1 _...._

I 2 .1 4 3 « 7

• «Л I } и I 1

I 2 Л 4 * ^

• I» М И I» ж

Рис. 25. Взаимодействие Ки-антигена с АР-сайтами

а Влияние конкурентных ДНК на пришивку АР-ДНК к Ки80. Белки экстракта клеток НсЬа инкубировали с АР-ДНК (дор. 1), АР-ДНК в присутствии обычного ДНК-дуплекса (дор. 2-4) или ДНК с аналогом АР-сайта - остатком ТНР (дор. 5-7); б Ингибированис активности АРЕ1 Ки-антигеном (в составе ДНК-ПК). АР-ДНК инкубировали в отсутствие белков (дор. 1-4), в присутствии АРЕ1 (дор. 5-8) или в присутствии АРЕ1 и ДНК-ПК (дор. 9-12); в Оценка стабильности комплексов АР-ДНК с Ки-антигсном. Белки экстракта клеток НсЬа инкубировали с АР-ДНК в течение 15 мин (дор. 1). Затем, чтобы предотвратить повторное связывание АР-ДНК с Ки-антигсном, освобождаемым при диссоциации его комплексов с АР-ДНК, добавляли конкурентную ДНК, содержащую остаток ТНИ (дор. 2-7), отбирали аликвоты реакционной смеси в указанные промежутки времени, обрабатывали их ЫаВН4 и анализировали.

Поскольку пришивка АР-ДНК к Ки80 (см. рис. 24а) в экстрактах происходит с высокой селективностью и эффективностью, этот подход потенциально может быть использован для оценки содержания активных в связывании ДНК форм Ки-антигена в экстрактах клеток в присутствии других клеточных белков (рис. 26).

5 8 7«» 10 11

•5«Д>—1

дот-эли!

? 4 "

[.I и ыы 12 14 5 6 8 9 10 11

А., Ки§0 ФФ Ф -

»«¡Л* ^

. АР ДНК 1 Дот-Эляса

АР-ДНК Ки-КивОАТ _ ГГ АР-ДНК-Ки _, — АР-ДНК-Ки(у) — - _ "

— *"

Рис. 26. Оценка относительного количества активной формы Ки80 в экстрактах клеток человека. Идентификации укороченной формы Ки80

а - Сравнительный анализ содержания Ки-антигена в экстрактах клеток с использованием АР-ДНК и дот-ЭЛИСА; б - Идентификация укороченной формы по изменению элсктрофорстичсской подвижности комплекса Ки-антигсн-АР-ДНК в присутствии антител, специфичных к С- или Оконцу Ки80.

Сравнительный анализ содержания Ки80 в экстрактах клеток нескольких культивируемых линий меланом и НеЬа, проведенный с использованием дот-БУБА и

АР-ДНК, показал, что количество ковалентных аддуктов Ки80 с АР-ДНК варьирует в значительных пределах и, в целом, положительно коррелирует с содержанием этого белка, оцененным иммуноферментным окрашиванием (рис. 26а). В некоторых образцах обнаружен интенсивный продукт сшивки с меньшей кажущейся молекулярной массой (рис. 26а, дор. 6 и 7, выделено синим овалом). Согласно литературным данным в некоторых культивируемых клетках человека представлена укороченная с С-конца форма Ku80 (Ku80v), возникающая под действием трипсиноподобной протеиназы, существующей в этих клетках и активирующейся в определенных условиях [Sallmyr et al., 2002, Jeng et al, 1999]. Соответствующая Ku80v мРНК не была обнаружена [Han et al, 1996, Muller et al., 1998]. Ku80v образует гетеродимеры с Ku70, сохраняющие активность в связывании ДНК, но не взаимодействующие с каталитической субъединицей ДНК-ПК, что уменьшает негомологичное соединение концов [Нап et al, 1996, Muller et al., 1998]. Образцы 5-7 (выделено малиновым прямоугольником) относятся к одной клеточной линии Mel 051102k, но отличаются по условиям приготовления экстрактов. Экстракт в образце 7 готовили по стандартной методике, а в случае образцов 5 и 6 предпринимали специальные меры для уменьшения вероятности протеолиза Ки80. Дальнейший анализ с использованием антител, специфичных к С- и N-концам Ки80 (рис. 266), позволил отнести указанные продукты к укороченному с С-конца полипептиду Ки80. Для этой клеточной линии, по-видимому, также характерна экспрессия такой специфической протеиназы. Таким образом, с использованием АР-ДНК в экстрактах клеток возможна детекция активных в связывании ДНК форм Ки-антигена, в том числе укороченных. В таких сложных случаях адекватность оценки количеств белка с использованием антител будет зависеть от правильности их выбора, а часто применяемая оценка, основанная на определении количества мРНК, может давать искаженные данные.

4.3. Поиск белков клеток человека, взаимодействующих с АР-сайтами. Идентификация PARP1

Учитывая конкуренцию Ku-антигена с белками при связывании с линейной АР-ДНК, при дальнейшем поиске в клеточных экстрактах белков, взаимодействующих с АР-сайтами, были использованы кольцевые ДНК, синтезированные на основе одноцепочечной ДНК фага М13, которые содержат случайно распределенные АР-сайты в одной цепи. Для М13 АР-ДНК во всех экстрактах основные продукты сшивки с одной и той же электрофоретической подвижностью соответствуют белку с кажущейся молекулярной массой около 120 кДа (рис. 27). Было выдвинуто предположение, что эти продукты относятся к PARP1. В экспериментах с индивидуальной рекомбинантной PARP1 установлена способность белка образовывать сшивки с линейной и кольцевой АР-ДНК, опосредованные образованием основания Шиффа (данные не проиллюстрированы).

Рис. 27. Анализ продуктов сшивки АР-ДНК с белками различных экстрактов

Дор. 1-4 - продукты пришивки кольцевой АР-ДНК к белкам цельноклеточных экстрактов НсЬа, фибробластов человека (ФЧ), МСР-7 и ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота (СКРС) соответственно. Перед анализом ДНК, выступающую за

___пределы белковых глобул, гидролизовали нуклеазой. Дор. 5 -

^^^ контрольный образец сшивки белков экстракта клеток НеЬа с 32-

мерной линейнои АР-ДНК (без обработки нуклеазой).

Ранее [¿дуп'Л е1 а!., 2001] было показано, что PAR.P1, ковалентно присоединенная к фотоактивируемой ДНК, способна подвергаться поли(АОР-рибозил)ированию, что приводит к уменьшению электрофоретической подвижности продуктов сшивки ДНК-PARP1. Это позволяет идентифицировать продукты, относящиеся к PARP1, среди других сшивок белок-ДНК. С использованием кольцевой и линейной АР-ДНК и очищенной рекомбинантной PARP1 установлена способность белка повергаться поли(АОР-рибозил)ированию в составе ковалентного адцукта с ДНК (данные не проиллюстрированы). Обнаруженное при использовании экстрактов изменение электрофоретической подвижности продуктов сшивки АР-ДНК-белок в присутствии NAD+ дает основания для отнесения продукта сшивки к PARP1 (рис. 28, дор. 3, 6, 12).

Рис. 28. Автополи(АОР-рибозил)ирование РАКР1 экстрактов клеток НеЬа и СКРС, ковалентно присоединенной к АР-ДНК

Дор. 1-6- сшивка белков экстрактов с кольцевой АР-ДНК, дор. 7-12- с линейной АР-ДНК. Положение продуктов поли(АОР-рибозил)ирования РАЯР1, ковалентно

присоединенной к АР-ДНК (дор. 3, 6, 12), обозначено

кЛл 120-

Hrl a СКК ll'l * СКРС

I 2.1 t . f. ~т К 4IIIIHJ

— РЛКРМЛ|)Р>п

— РЛКР1

— kuKII

м«ст, символом PARP1-(ADP)„.

ГЧЛ1)

Идентичность белка в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК подтверждена методом пептидного картирования, проведенного в соответствии с процедурой, представленной на рис. 24д. Для идентификации был использован экстракт из семенников крупного рогатого скота, поскольку в нем не образуются продукты, соответствующие Ku80, а продукты, относимые к PARP1, преобладают (рис. 28, дор. 10). PARP1 идентифицирована как наиболее достоверный кандидат (Mowse score 248, coverage 38%).

Представляло интерес оценить возможные каталитические функции PARP1 в отношении AP-сайтов. PARP1 не обладает значимой АР-лиазной активностью (данные не проиллюстрированы).

Возможно, это взаимодействие связано с регуляцией процессинга AP-сайтов, которая особенно важна при репарации AP-сайтов, входящих в состав кластерных повреждений, поскольку установлено образование двухцепочечных разрывов при репарации таких АР-сайтов [Yang et al., 2004]. АРЕ1 - основная АР-эндонуклеаза клеток млекопитающих [WUson&Barsky, 2001], поэтому было определено влияние PARP1 на гидролиз этим ферментом AP-сайтов в составе ДНК-дуплексов, содержащих напротив AP-сайта либо dAMP (АР-ДНК-А) либо синтетический аналог AP-сайта (остаток THF) (АР-ДНК-THF). В использованных условиях для АР-ДНК-А и АР-ДНК-THF глубина гидролиза АР-сайтов (в %) составляла 94±5 и 93±8 соответственно, а в присутствии PARP1 соответствующие параметры равны для АР-ДНК-А 93±5, и АР-ДНК-THF 62±10. Таким образом, PARP1 ингибирует гидролиз AP-сайта АР-эндонуклеазой I, если напротив него находится аналог AP-сайта, то есть, если AP-сайт находится в составе кластерного повреждения.

4.4. Поиск новых участников процесса ЭРО. Идентификация HMGB1 как кофактора этого процесса

Согласно господствующему в настоящее время представлению выбор пути ЭРО короткозаплаточный или длиннозаплаточный зависит от эффективности удаления 5'-dRP остатка за счет лиазной активности Pol ß, которая является основным известным белком высших эукариот, осуществляющим эту функцию [Horton et ai, 2000; Srivastava et ai, 1998].

Для поиска других белков с 5'-dRP лиазной активностью использовали ДНК-интермедиат ЭРО, содержащий остаток 5'-dRP, и экстракт эмбриональных фибробластов

мыши (МЭФ), нокаутных по гену Pol р и экспрессирующих Pol р с флаг-эпитопом (FE). В МЭФ-экетрактах обнаружен белок, формирующий ковалентные адцукты с ДНК-дуплексом с разрывом, фланкированным 5'-dRP остатком (Рис. 29а, дор. 1 и 2). Эта ДНК для своей репарации требует активности S'-dRP-лиаз. С использованием подхода, схематично представленного на рис. 24д, проведена идентификация белка в составе ковалентного аддукта, образованного белком экстракта клеток HeLa с ДНК, содержащей остатки 5'-dRP и биотина. В качестве наиболее достоверного кандидата (Mowse score 102, sequence coverage 32%) идентифицирован HMGB1 (High Mobility Group Box 1).

HMGB1 - высококопийный негистоновый архитектурный белок хроматина -обладает способностью изгибать ДНК и влиять на процессы эксцизионной репарации нуклеотидов и ошибочно спаренных оснований [Yuan et а!., 2004, Zhang et а!.. 2005]. Обнаруженная способность HMGB1 взаимодействовать с ДНК-интермедиатом ЭРО ставит вопрос о его роли в этом процессе. Для выделенного из клеток HeLa HMGB1 установлено, что он проявляет слабую S'-dRP-лиазную активность и стимулирует активность ферментов ЭРО: АРЕ1 (рис. 296) и FEN1 (рис. 29в).

а в Г

Рис. 29. НМСВ1 как кофактор ЭРО

а Поиск белков, взаимодействующих с 5'-dRP остатком в ДНК-дуплсксс: дор. 1 и 2 - продукты пришивки 5'-ёКР-ДНК к белкам в экстрактах МЭФ, экспрессирующих Pol р с флаг-эпитопом (FE) и нокаутных по этому белку соответственно, дор. 3 - то же для индивидуальной Pol р. Положение [12P]-5'-dRP остатка в ДНК обозначено овалом; б Влияние HMGB1 на активность АРЕ1; в -Влияние НМОВ1 на активность FEN1. Для обеих нуклеаз представлены радиоавтографы гелей с анализом продуктов гидролиза субстратов и количественная обработка данных. На оси ординат приведена кратность усиления активности ферментов в присутствии HMGB1. г - Взаимодействие GFP-HMGBI с сайтами повреждений ДНК в клетках HeLa, вызванных микрооблучением лазером (А. 405 нм) без сенсибилизатора и в присутствии 8-мстоксипсоралсна (100 мкМ); д - Влияние HMGB1 на повреждение ДНК мстилмстансульфонатом (MMS) в присутствии метоксиамина (MX) по данным метода «ДНК-комет». Индекс повреждения ДНК определен как «момент хвоста».

С использованием клеток HeLa, экспрессирующих HMGB1 в виде химерного белка с зеленым флуоресцентным белком (GFP-HMGBI), обнаружена способность HMGB1 локализоваться в местах повреждений ДНК, вызванных микрооблучением лазером (рис. 29г). В использованных условиях облучения, наряду с одноцепочечными разрывами и другими повреждениями, в значительном количестве образуются окисленные основания [Lan et al., 2005, Orimo et al., 2006]. Действительно, ДНК-

гликозилазы (GFP-OGG1 и GFP-NTH1), узнающие окисленные основания, эффективно аккумулируются в сайтах облучения в отличие от белков (GFP-Ku70 и GFP-RAD52), узнающих двухцепочечные разрывы ДНК (рис. 29г). Эмбриональные фибробласты мыши HMGB1+/+-типа проявляют большую чувствительность, чем HMGB1 "-клетки, к совместному действию метилметансульфоната и метоксиамина (данные не проиллюстрированы), и в ДНК HMGB 1+/+-клеток присутствует значительно большее количество одноцепочечных разрывов (рис. 29д). Обработка АР-ДНК метоксиамином повышает ее устойчивость к действию АРЕ1 [Horton et а!., 2000]. HMGB1 стимулирует расщепление таких модифицированных AP-сайтов АР-эндонуклеазой 1 (данные не проиллюстрированы). По-видимому, накопление в клеточной ДНК одноцепочечных разрывов обусловлено стимуляцией активности АР-эндонуклеазы 1 под действием HMGB I.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование модифицированных ДНК в изучении систем репарации/репликации ДНК продемонстрировано на типичных примерах, но из-за ограниченного объема, не охватывает всех исследований, выполненных с их применением.

Среди модифицированных ДНК особое место занимают фотоактивируемые ДНК. Благодаря разработанным подходам появилась возможность создания ДНК-структур с заданным положением фотоактивируемой группы, и с их использованием удалось получить информацию о структурной организации комплексов RPA с ДНК, которую не могут дать другие методы и подходы.

В результате целенаправленной работы по созданию новых фотореакционноспособных производных dNTP получены соединения, обеспечивающие эффективный синтез фотоактивируемых ДНК в экстрактах, и увеличение выхода сшивок с белками в 5-10 раз, что значительно расширяет возможности метода фотоаффинной модификации.

В настоящей работе с использованием АР-ДНК впервые установлена способность двух регуляторных белков ЭРО PARP1 и XRCC1 взаимодействовать с ранними интермедиадами этого процесса AP-сайтами посредством образования основания Шиффа. Кроме того, для двух белков, ранее не относимых к системе эксцизионной репарации оснований - Ки80 субъединица Ku-антигена и HMGB1, установлена способность взаимодействия с ДНК-интермедиатами ЭРО с использованием такого же механизма.

Интересно отметить, что обнаруженное взаимодействие регуляторных белков репарации - PARP1, Ku80, HMGB1 и XRCC1 - с AP-сайтами, не сопровождающееся эффективным расщеплением цепи ДНК по положению AP-сайтов, выдвигает вопрос о функциональной значимости таких взаимодействий. С одной стороны, вероятно, что ковалентное, но обратимое присоединение белков к АР-ДНК через основание Шиффа, может служить для временной защиты AP-сайтов. Временная защита АР-сайтов особенно важна, когда они входят в состав кластерных повреждений, например, близко расположенных в комплементарной цепи разрывов или AP-сайтов, поскольку в результате «попытки» репарации могут образовываться двухцепочечные разрывы, которые более токсичны для клеток [Gulston et al., 2004, Yang el at., 2004]. Действительно, в работе обнаружено, что PARP1 ингибирует гидролиз AP-сайта, если он расположен напротив аналога AP-сайта. С другой стороны, не исключено, что проявление АР-лиазной активности белками, образующими основания Шиффа, зависит от структурных особенностей ДНК. Так, например, в недавно опубликованной работе [Roberts et al., 2010] показано, что Ku-антиген проявляет слабую АР-лиазную активность, когда AP-сайт расположен непосредственно вблизи двухцепоченых концов (второе

положение с 5'-конца в свисающей одноцепочечной части ДНК-дуплекса). Однако если АР-сайт расположен на расстоянии более одного витка спирали от конца АР-лиазная активность Ки-антигена не проявляется, как и в случае использованных нами АР-ДНК. Кроме того, такая ковалентная фиксация белков на ДНК сама может вносить вклад в известную токсичность АР-сайтов.

Еще одним перспективным направлением развития аффинной модификации белков оказалось использование модифицированных ДНК в сочетании с методами масс-спектрометрии для поиска и идентификации ранее неизвестных белков-участников определенных процессов/стадий репарации ДНК. В данной работе этим подходом в составе конъюгатов, образованных белками экстрактов с ДНК, содержащими интактный или расщепленный АР-сайты, были идентифицированы PAR.P1, К.и80 субъединица Ки-антигена и НМвВ1. Этот подход довольно универсален и может применяться для идентификации различных ДНК-связывающих белков с использованием ДНК, содержащих структурные элементы, специфически узнаваемыми белками, и химически активные группы, обеспечивающие образование ковалентных связей с белками.

ВЫВОДЫ

Данная работа представляет собой систематическое исследование, в результате которого разработана новая стратегия в изучении механизмов репарации/репликации ДНК, основанная на использовании модифицированных, в том числе химически активных, ДНК-интермедиатов этих процессов. Их использование в сочетании с функциональным анализом и другими подходами позволило изучить важные аспекты организации и функционирования систем репарации/репликации ДНК, а также идентифицировать новые белковые факторы - компоненты этих систем.

1. Разработаны универсальные подходы к получению и характеризации модифицированных ДНК-интермедиатов репарации/репликации ДНК, которые содержат фотоактивируемые или другие модифицирующие группы в определенных положениях цепи ДНК:

• чтобы создать более эффективные фотореагенты на основе ДНК, проведен детальный анализ субстратных свойств в синтезе ДНК, катализируемом ДНК-полимеразами вирусного, бактериального и эукариотического происхождения, для широкого ряда аналогов пиримидиновых сП^ТР, содержащих фотоактивируемые группы различной реакционной способности, которые присоединены линкерами разной длины и структуры к экзоциклической аминогруппе цитозина и в 5-ом положении тимина;

• определены факторы, влияющие на эффективность образования сшивок фотоактивируемых ДНК с белками; к ним относятся: тип фотоактивируемой группы, структура линкера, присоединяющего ее к основанию, а при введении фотоактивируемых нуклеотидов в ДНК эндогенными ДНК-полимеразами экстрактов -субстратные характеристики аналогов (МТР;

• предложены универсальные ферментативные способы введения фотоактивируемых групп в 5'-конец ДНК и фотоактивируемых нуклеотидов во внутренние положения цепи ДНК;

2. На примере системы эксцизионной репарации оснований (ЭРО) продемонстрирована продуктивность использования модифицированных ДНК, включая химически активные, в сочетании с другими методами, для установления закономерностей взаимодействия белков с ДНК и функционального взаимовлияния белков в ходе репарации:

• показано, что апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ1) стимулирует активность ДНК-полимеразы р (Ро1 Р) в синтезе ДНК с вытеснением цепи. При некомплементарности оснований на З'-конце разрыва, АРЕ! выщепляет З'-концевой нуклеотид, обеспечивая последующее эффективное удлинение праймера. Установлены закономерности влияния комплементарное™ и типа пары, в которую входит З'-концевой нуклеотид, условий реакции (ионная сила и рН) и структурных особенностей ДНК на 3'—>5' экзонуклеазную активность АРЕ1;

• впервые детально исследована регуляторная роль поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 (РАЯР1) и ее автополи(АОР-рибозил)ирования в длиннозаплаточном (ДЗ) и короткозаплаточном (КЗ) пути ЭРО. Как регулятор ЭРО РАЯР1 умеренно снижает эффективность КЗ-пути и значительно влияет на ДЗ-путь, ингибируя синтез с вытеснением цепи, стимулирующее влияние АРЕ1, 3'—>5' экзонуклеазную активность АРЕ1 и активность флэпэндонуклеазы 1 (РЕЫ1). Автомодификация РА ЯР 1 ослабляет ее ингибирующее действие и, по-видимому, является необходимым условием для реализации Ро1 Р-зависимого варианта ДЗ-пути с участием АРЕ1 в качестве корректирующей экзонуклеазы.

• обнаружено, что репликативный белок А (ЯРА) - эукариотический белок, связывающий одноцепочечную ДНК, ингибирует отщепление РЕ>Л одноцепочечного участка ДНК, возникающего в результате синтеза ДНК с вытеснением цепи, если длина этого участка достаточна для эффективного связывания ЯРА, что может регулировать длину ресинтезируемого участка ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО;

3. Показано, что аффинная модификация в сочетании с другими методами может эффективно применяться в исследовании структурной организации комплексов белок-ДНК.

• для ЯРА - гетеротримерного белка, содержащего субъединицы р70, р32 и р14 - с использованием частичных ДНК-дуплексов с 3'- или 5'-выступающими одноцепочечными участками и фотоактивируемыми группами на 5'- или З'-концах комплементарной цепи соответственно, установлено, что связывание ЯРА с одноцепочечной частью ДНК происходит полярно. р70 преимущественно взаимодействует с 5'-концевой частью одноцепочечной ДНК независимо от структуры ДНК-дуплекса и конформации белка. Ориентация р70 и р32 относительно З'-конца цепи определяется длиной 5'-выступающей одноцепочечной части и конформацией ЯРА; в непосредственное взаимодействие с З'-концом цепи такой ДНК вовлечены центральная часть р32 и С-концевая часть р70. Субъединица р14 не контактирует с точками перехода одно/двухцепочечная ДНК. При связывании с одноцепочечной ДНК также реализуется полярная укладка белка на ДНК, и обнаруживаются прямые контакты р 14 с ДНК.

• с использованием ДНК, содержащей АР-сайты, обнаружено, что ЫТО- и ВЯСТ1-домены ХЯСС1 (белка, входящего в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению) непосредственно контактируют с сахарофосфатным остовом ДНК. Для ВЯСТ1 -домена такие контакты обнаружены впервые.

4. На ряде примеров продемонстрирована результативность использования химически активных ДНК в сочетании с иммунологическими и масс-спектромстрическими методами в поиске и идентификации новых белков репликации/репарации ДНК, а также поиске новых функций и типов взаимодействий белков:

• на примере плазмодия РИуяагит ро!усерНа1ит показано, что в случае мало изученных организмов фотоактивируемые ДНК могут использоваться для характсризации белков репликативного аппарата. С применением фотоактивируемой ДНК впервые выделена ДНК-полимераза е. С использованием специфических антител среди белков экстракта

плазмодия, модифицированных фотоактивируемой ДНК, идентифицированы полипептиды ДНК-полимеразы а-праймазы и ДНК-полимераз 6 и е;

• отработана и апробирована универсальная процедура идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с химически активными ДНК, основанная на данных масс-спектрометрического анализа пептидов. В экстрактах клеток млекопитающих Ки80 субъединица Ku-антигена и PARP1 впервые идентифицированы как белки, взаимодействующие с интактными АР-сайтами, а белок HMGB1 (High Mobility Group Box 1) - с 5'-дезоксирибозофосфатным остатком, возникающим при гидролизе АР-сайта;

• установлена новая функция белка HMGB1 как кофактора процесса ЭРО: он образует комплексы с Pol Р, АРЕ1 и FEN1, стимулируя активность обеих нуклеаз, проявляет слабую 5'-дезоксирибозофосфатлиазную активность и накапливается в сайтах повреждения ДНК в живых клетках;

• впервые показано, что XRCC1 - регуляторный белок ЭРО - взаимодействует с образованием основания Шиффа с ДНК-интермедиатами этого процесса: интактными АР-сайтами и продуктами расщепления АР-сайтов ферментами ЭРО: 5'-дезоксирибозофосфатом и 3'-а,Р-4-гидроксипентен-2-алем.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Обзоры

1. Лаврик О.И., Хлиманков Д.Ю., Ходырева С.Н. (2003) Репликативный комплекс эукариот и его исследование с помощью аффинной модификации. Молекуляр. биология, 37, 563-572.

2. Lavrik O.I., Khodyreva S.N. (2003) Photoaffinity probes in molecular biology of DNA replication and DNA repair, in: Chemical probes in Biology, Ed. Schneider M., Kluwer Academic Publishers, 193-205.

3. Lavrik O.I., Pestryakov P.E., Nazarkina J.K., Khodyreva S.N. (2003) Study of human replication protein A by photoaffinity labeling technique, in: Chemical probes in Biology, Ed. Schneider M., Kluwer Academic Publishers, 181-192.

4. Суханова M.B., Лаврик О. И., Ходырева С.Н. (2004) Поли(АОР-рибозо)полимераза 1 — регулятор белково-нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии. Молекуляр. биология, 38, 834-847.

5. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. (2005) Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair. Curr. Med. Chem., 12, 641-655.

6. Дырхеева H.C., Ходырева C.H., Лаврик О.И. (2007) Полифункциональная апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 человека: роль дополнительных функций. Молекуляр. биология, 41, 450-466.

7. Назаркина Ж.К., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2008) Флэпэндонуклеаза-1 и ее роль в процессах метаболизма ДНК в клетках эукариот. Молекуляр. биология, 42, 405-421.

Статьи в рецензируемых изданиях

8. Khodyreva S.N., Podust V.N., Sergeev D.S., Ivanova E.M., Frolova E.I., Koshkin A.A., Godovikova T.S., Zarytova V.F., Ricchetti M„ Lavrik O.I. (1993) Comparison of interactions of 5'-derivatives of deoxyoctathymidylate with human DNA polymerase and a HIV reverse transcriptase. Mol. Biol. Reports, 12, 43-47.

9. Щербик H.B., Ходырева C.H., Власов В.А., Добриков М.И., Дымшиц Г.М., Лаврик О.И. (1997) Фотоаффинная модификация обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека аналогом дезоксиуридин-5'-трифосфата, содержащим арилазидную группу. Молекуляр. биология, 31, 344-352.

10. Сафронов И.В., Щербик Н.В., Ходырева С.Н., Власов В.А., Добриков М.И., Шишкин Г.В., Лаврик О.И. (1997) Новые фотоактивные экзо-М4-замещенные аналоги dCTP: получение, фотохимические и субстратные свойства при синтезе ДНК, катализируемом обратной транскриптазой ВИЧ-1. Биоорган, химия, 7, 576-585.

11. Doerhoefer S., Khodyreva S., Safronov I., Wlassoff W.A., Anarbaev R., Lavrik O.I., Holler E. (1998) Molecular constituents of the replication apparatus in the Plasmodium of Physarum polycephalum: identification by photoaffinity labeling. Microbiology, 144, 31813193.

12. Захаренко A.Jl., Ходырева C.H., Речкунова Н.И., Сафронов, И.В,. Пышный Д.В,. Дегтярев С. X., Лаврик О.И. (1998) Аффинная модификация ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus и ДНК-матрицы с помощью фотореакционноспособных производных dCTP. Биохимия, 63, 1090-1096.

13. Kolpashchikov D.M., Rechkunova N.I., Dobrikov M.I., Khodyreva S.N., Lebedeva N.A., Lavrik O.I. (1999) Sensitized photomodification of mammalian DNA polymerase beta. A new approach for highly selective affinity labeling of polymerases. FEBS Lett., 448, 141-144.

14. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.-P., Khodyreva S.N., Fanning E., Favre A., Lavrik O.I. (1999) Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs p32 to the З'-end of nascent DNA. FEBS Lett., 450, 131-134.

15. Lavrik O.I., Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H-P., Khodyreva S.N., Favre A.

(1999) RPA subunit arrangement near the З'-end of the primer is modulated by the length of the template-strand and cooperative protein interactions. Nucleic Acids Res., 27, 4235-4240.

16. Колпащиков Д.М., Захаренко А.Л., Дежуров С.В., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. (1999) Новые реагенты для аффинной модификации биополимеров. Фотоаффинная модификация 7>е-ДНК-полимеразы. Биоорган, химия, 25, 129-136.

17. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2000) Исследование взаимодействия репликативного фактора А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dTTP. Биохимия, 65, 194-198.

18. Колпащиков Д.М., Александрова Л.А., Закирова Н.Ф., Ходырева С.Н., Лаврик О.И.

(2000) Фотореакционноспособный аналог 2',3'-дидезоксиуридин-5'-трифосфата: получение и использование для фотоаффинной модификации фактора репликации А человека. Биоорган, химия, 26, 151-155.

19. Колпащиков Д.М, Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2000) Репликативный фактор А связывает одноцепочечную ДНК полярно. Докл. Акад. Наук, 372, 824-826.

20. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Yu., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. (2001) Polarity of human replication protein A binding to DNA. Nucleic Acids Res., 29, 373-379.

21. Драчкова И.А., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Захаренко А.Л., Шишкин Г.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2001) Реагенты для модификации белково-нуклеиновых комплексов. II. Сайт-специфическая фотомодификация комплексов ДНК-полимеразы Р праймерами, элонгированными экзо-К-замещенными арилазидными производными dCTP. Биоорган, химия, 27, 197-204.

22. Хлиманков Д.Ю., Петрусева И.О., Речкунова Н.И., Белоусова Е.А., Колпащиков Д.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2001) Получение фотореакционноспособных олигонуклеотидных дуплексов и их применение для фотоаффинной модификации ДНК-связывающих белков. Биоорган, химия, 27, 205-209.

23. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И.

(2001) Аффинная модификация флэпэндонуклеазы FEN-1 фотореакционноспособными ДНК. Биохимия, 66, 905-912.

24. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Фавр А., Лаврик О.И. (2001) Исследование взаимодействия репликативного белка А человека с ДНК-дуплексами, содержащими бреши различного размера. Молекуляр. биология, 35, 827-835.

25. Сафронов И.В., Драчкова И.А., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Добриков М.И., Иванова Т.М., Шишкин Г.В., Лаврик О.И. (2001) Реагенты для модификации белково-

нуклеиновых комплексов. III. Сайт-специфическая фотомодификация элонгирующего комплекса ДНК-полимераэы (3 арилазидными производными праймеров, сенсибилизированная флуоресцентными у-амидами АТР. Биоорган, химия, 27, 372-382.

26. Захаренко А.Л., Колпащиков Д.М, Ходырева С.Н., Лаврик О.И., Менендес-Ариас Л. (2001) Исследование dNTP-связывающего участка обратной транскриптазы ВИЧ-1 с помощью фотореакционноспособных аналогов dNTP. Биохимия, 66, 1227-1237.

27. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Петрусеза И.О., Назаркина Ж.К., Белоусова Е.А., Лаврик О.И. (2002) Исследование взаимодействия RPA и FEN-1 с ДНК-дуплексами, содержащими одноцепочечные разрывы и флэп-структуры. Молекуляр. биология, 36, 1044-1053.

28. Lebedeva N., Rechkunova N., Khodyreva S., Favre A., Lavrik O. (2002) Photoaffinity labeling of proteins in bovine testis nuclear extract. Biochem. Biophys. Res. Commun., 297, 714-721.

29. Petrousseva I.O., Safronov I.V., Komarova N.I., Kamynina T.P., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. (2002) An enzymatic synthesis of 5'-end substituted oligonucleotides using T4 polynucleotide kinase and gamma-amides of ATP, bearing photoreactive groups. Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20, Novosibirsk, IC&G: 4, 16-18.

30. Khodyreva S.N., Nazarkina J.K., Petruseva I.O., Safronov I.V., Lavrik O.I. (2002) Interaction between flap endonuclease-1 and replication protein A. Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20, Novosibirsk: IC&G. 4, 13-15.

31. Sukhanova M.V., Lavrik O.I., Safronov I.V., Khodyreva S.N. (2002) Site-specific photomodification of mammalian poly(ADP-ribose)polymerase-1 with photoreactive DNA base excision repair intermediate, Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20, Novosibirsk: IC&G. 4, 22-24.

32. Lebedeva N.A., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. (2003) AP endonuclease 1 has no biologically significant 3'-5'-exonuclease activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 300, 182187.

33. Pestryakov P.E., Weisshart K., Schlott В., Khodyreva S.N., Kremmer E., Grosse F., Lavrik O.I., Nasheuer H.P. (2003) Human replication protein A: The C-terminal RPA70 and the central RPA32 domains are involved in the interactions with the З'-end of a primer-template DNA. J. Biol. Chem., 278, 17515-17524.

34. Дежуров С.В., Ходырева С.Н., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Лаврик О.И. (2003) Сравнительное изучение эффективности модификации ДНК-полимераз и ДНК-матрицы различными фотоактивными группами на З'-конце ДНК-праймера. Биоорган, химия, 29, 74-81.

35. Петрусева И.О., Сафронов И.В., Комарова Н.И., Камынина Т.П., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2003) Новый способ синтеза фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов, замещенных по 5'-концевому фосфату, с использованием Т4 полинуклеотидкиназы и гамма-амидов АТР. Докл. Акад. Наук, 389, 701-704.

36. Назаркина Ж.К., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2003) Исследование взаимодействия флэпэндонуклеазы-1 с репликативным белком А с использованием фотоактивных интермедиатов репарации ДНК. Биохимия, 68, 1 138-1148.

37. Суханова М.В., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2004) Поли(АОР-рибоза)-полимераза-1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой р. Биохимия, 69, 558-568.

38. Лебедева Н.А., Середина Т.А., Сильников В.Н, Левина А.С., Ходырева С.Н., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. (2005) Сравнительный анализ взаимодействия ДНК-полимераэы Р и обратных транскриптаз вируса иммунодефицита человека и лейкемии мышей с аналогами dNTP, модифицированными по рибозе. Биохимия, 70, 5-13.

39. Dezhurov S.V., Khodyreva S.N., Plekhanova E.S., Lavrik O.I. (2005) A new highly efficient photoreactive analogue of dCTP. Synthesis, characterization, and application in photoaffinity modification of DNA binding proteins. Bioconjug. Chem., 16, 215-222.

40. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Lebedeva N.A., Prasad R., Wilson S.H, Lavrik O.I. (2005) Human base excision repair enzymes apurinic/apyrimidinic endonucleasel (APE1). DNA polymerase beta and poly(ADP-ribose) polymerase 1: interplay between strand-displacement DNA synthesis and proofreading exonuclease activity. Nucleic Acids Res., 33, 1222-1229.

41. Anarbaev R.O., Khodyreva S.N., Zakharenko A.L., Rechkunova N.I., Lavrik O.I. (2005) DNA polymerase activity in water-structured and confined environment of reverse micelles. J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 33, 29-34.

42. Назаркина Ж.К., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2005) Использование модифицированных флэп-структур для исследования белков системы эксцизионной репарации оснований. Биохимия, 70, 1613-1622.

43. Дежуров С.В., Грин И.Р., Сафронов И.В., Шишкин Г.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2005) Высокоэффективная модификация ДНК-полимеразы бета в условиях прямой и сенсибилизированной активации фотоактивных ДНК. Модификация белков клеточного экстракта. Известия Акад. Наук. Серия химическая, 54, 1273-1283.

44. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Суханова М.В., Сафронов И.В., Дежуров С.В., Лаврик О.И. (2006) 3'-5'-экзонуклеазная активность апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека по отношению к ДНК, содержащим dNMP и их модифицированные аналоги. Биохимия, 71, 254-265.

45. Dyrkheeva N.S., Lomzov А.А., Pyshnyi D.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. (2006) Efficiency of exonucleolytic action of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 towards matched and mismatched dNMP at the 3' terminus of different oligomeric DNA structures correlates with thermal stability of DNA duplexes. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 699-706.

46. Grin I.R., Khodyreva S.N., Nevinsky G.A., Zharkov D.O. (2006) Deoxyribophosphate lyase activity of mammalian endonuclease VHI-like proteins. FEBS Lett., 580, 4916-4922.

47. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О.И. (2006) Влияние экзогенной поли(АОР-рибозо)-полимеразы-1 и ее апоптотического фрагмента 24 кДа на репарацию ДНК-дуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота. Биохимия, 71, 909-923.

48. Nazarkina Z.K., Khodyreva S.N., Marsin S., Lavrik O.I., Radicella J.P. (2006) XRCC1 interactions with base excision repair DNA intermediates. Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 53-54.

49. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Influence of 24 kDa apoptotic fragment of poly(ADP-ribose) polymerase-1 on repair of DNA duplexes in bovine testis nuclear extract. Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 63-64.

50. Khodyreva S.N., Nazarkina Z.K., Plekhanova E.S., Sukhanova M.V., Lavrik O.I. Chemically reactive DNA intermediates as a tool in study of DNA replication and DNA repair. Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 71-72.

51. Dyrkheeva N., Khodyreva S., Lavrik О. Interaction of Apel towards DNA-duplexes containing dNMP or modified dCMP analog at the 3' end. Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 110-111.

52. Пестряков П.Е., Красикова Ю.С., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Роль субъединицы р 14 репликативного белка А в процессе связывания с одноцепочечной

ДНК. Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 153-154.

53. Плеханова Е.С., Солодова Е.И., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Взаимодействие белков клеточных экстрактов с химически активными ДНК. Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 157-158.

54. Prasad R., Liu Y., Deterding L.J., Poltoratsky V.P., Kedar P.S., Horton J.K., Kanno S., Asagoshi K., Hou E.W., Khodyreva S.N., Lavrik O.I., Tomer К В., Yasui A., Wilson S.H. (2007) HMGB1 is a cofactor in mammalian base excision repair. Mol. Cell, 27, 829-841.

55. Nazarkina Z.K., Khodyreva S.N., Marsin S„ Lavrik O.I., Radicella J.P. (2007) XRCC1 interactions with base excision repair DNA intermediates. DNA Repair, 6, 254-264.

56. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. (2007) Suppression of base excision repair reactions by apoptotic 24kDa-fragment of poly(ADP-ribose) polymerase 1 in bovine testis nuclear extract. DNA Repair, 6, 615-625.

57. Назаркина Ж.К., Ходырева C.H., Марсан С., Радичелла П., Лаврик О.И. (2007) Исследование взаимодействия XRCC1 с ДНК и белками эксцизионной репарации оснований методом фотоаффинной модификации. Биохимия, 72, 1078-1089.

58. Пестряков П.Е., Красикова Ю.С., Петрусева И.О, Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2007) Роль субъединицы р 14 репликативного белка А в процессе связывания с одноцепочечной ДНК. Докл. Акад. Наук, 412, 118-122.

59. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2008) Взаимодействие АРЕ1 и других репарационных белков с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репарации и репликации ДНК. Биохимия, 73, 322-335.

60. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2008) Количественный анализ 3'-5' экзонуклеазной реакции АРЕ1 с ДНК, содержащими природные dNMP или их модифицированные аналоги в одноцепочечном разрыве. Биоорган, химия, 34, 210-219.

61. Ilina E.S., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. (2008) Ku antigen interacts with abasic sites. Biochim. Biophys. Acta, 1784, 1777-1785.

62. Ильина E.C., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2009) Идентификация Ku80-субъединицы Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами. Докл. Акад. Наук, 42, 411-414.

63. Ilina E.S., Khodyreva S.N., Berezhnoy А.Е., Larin S.S., Lavrik O.I. (2010) Tracking Ku antigen levels in cell extracts with DNA containing abasic sites. Mutat. Res., 685, 90-96.

64. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. (2010) Poly(ADP-ribose) polymerase 1 regulates activity of DNA polymerase p in long patch base excision repair. Mutat. Res., 685, 80-89.

65. Ходырева C.H., Ильина E.C., Кутузов M.M., Суханова М.В., Лаврик О.И. (2010) Взаимодействие поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами. Докл. Акад. Наук, 431, 132-135.

Патент

66. Ильина Е.С., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Способ детекции Ku-антигена в экстрактах клеток человека. Патент на изобретение № 2384623, приоритет от 07.10.2008.

Подписано к печати 10 сентября 2010г.

Тираж 140 экз. Заказ № 039. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

2010

83681

2010183681

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Ходырева, Светлана Николаевна, Новосибирск

Информация о работе

Ходырева, Светлана Николаевна
доктора биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Модифицированные ДНК в исследовании надмолекулярных комплексов репарации и репликации ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы