Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация макромолекул и бактерицидное действие миелопероксидазы лейкоцитов крови человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модификация макромолекул и бактерицидное действие миелопероксидазы лейкоцитов крови человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РС4СР НГОРОЯ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи

ХАЙЛОВ Павел Михайлович

УДК [ 547. 964. 4-0.18.11-438: 691. 4301

иОЩЮЙКАЦИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ И БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЫИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03,00.04 - Биох'.'.ьшл

Автореферат дкссеритшщи на соискание ученоЛ степени кандидата Оиологичэсгага наук

¡Лэсква 1091

Работа выполнена на кафедре биохимии медико-биологического факультета 2-то Московского ордена Ленина Государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова.

Научный руководитель

академик АМН СССР, доктор биологических наук, -профессор Арчаков А. И.

Официальные оппоненты)

доктор медицинских наук Галпаров Ы. и. -Г. доктор биологических наук Бачманова Г. И.

Ведущая организация - Научно-исследовательский Институт Фив икс- Химической кадицины.

Защита диссертации ооотоится <<....>>........1091г. »

.... часов на заседании специализированного ученого совета К 084.14. Об 2-го МОЛГМИ им. Я И. Пирогова по адресу: 117437, Москва, ул. Оотровитянова, 1.

О диссертацией модно оанакоються в библиотеке 2-го МОЛГМИ им. Я И. Пирогова.

Автореферат разослан <<.....>> , . ......1801г.

Ученый секретарь специалиеированного ученого совета кандидат медицинских наук

доцент Г. а КЛУШКА

'■■■■■ ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

т

Актуальность проблемы.

Реакции окислительной модификации макромолекул широко распространены у аэробных организмов и играет значительную роль в физиологии и патологии клетки(Nathan С.F. et ah. 1986). Эти реакции лежат в основе процессов фагоцитоза, в которых сущгственную роль играет фермент - миелопероксидаза, обладающий бактерицидной активностью, обусловленной продукцией Н0С1 из ионов СГи перекиси водорода (Bakkenlst A.R.J. et al.. 1980).

Представляло интерес исследовать роль гипохлорита, генерируемого миелопероксидазой, в бактерицидном действии этого фермента, а также способность ыиелоперокеидаэы вызывать мутагенез бактерий и модификацию белков и ДНК. В качестве системы, генерирующей активные формы кислорода, с которой можно было бы сравнить работу миелопероксидазы была выбрана монооксигеназная система, содержащая цитохром Р-450. Однако, так как механизмы реакций, а также продукты реакций этих двух систем различны, то для оценки бактерицидного и мутагенного действия миелопероксидазы и цитохром Р-450 содержащих систем был предложен метод расчета, учитывающий количество участвующих в реакции электронов.

Согласно гипотезе Стедмана и др. (Stadtman E.R. et al. 1986) , инактивация белков под действием активных форм кислорода может являться начальной стадией их распада в клетке. Ранее было показано. что при метаболизме целого ряда субстратов под действием образующейся в гидрокснаааном цикле перекиси водорода, происходит необратимая инактивация цитохрош Р-450, вследствие модификации апофермента( Карузина И. И., Арчакоа А. IL . 1987). Инактивация сопровождается повытанием чувствительности цитохроиа Р-450 к протео-

- г -

лиэу. Миелопероксидаза также способна к самоинактивации под действием выработанного гипохлорита(Andrews P.C. et al., 1981). Представляло интерес исследовать протеолитическую атакуемость альбумина, модифицированного ыиелопероксидазой, а также способность миелопероксидазы к саыоинактивации.

Таким образом, учитывая важную роль, которую играют.активные формы кислорода в процессах фагоцитоза, а также при модификации макромолекул, в настоящей работе исследовались бактерицидное и мутагенное действие миелопероксидазы, а также ее способность вызывать модификацию. нуклеиновых кислот и белков, при генерации различных активных форм кислорода.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ : Выяснить роль активных форм кислорода и гипох-лорита в модификации макромолекул, бактерицидном и мутагенной действии миелопероксидазы лейкоцитов крови человека.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ : - исследовать роль гипохлорита и активных форм кислорода в бактерицидном действии миелопероксидазы м цитохром Р-450 содержащих систем, соответственно;

- сравнить мутагенное действие миелопероксидазы й растворимой монооксигеназной система

- исследовать модификацию ДНК гипохюритом, активными формами кислорода, генерируемыми миелопероксидазой и растворимой ыоиоок-скгеназной системой. •

- исследовать протеолитическую атакуемость альбумина, модифицированного миелопероксидазой.

- исследовать возможность распада алофершнта при самоииак-

тивации миелопероксидазы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ : в результате проведенных исследований показано, что основной вклад в бактерицидное действие миелопероксидазы вносит, образующийся в ходе реакции с перекисью водорода и ионами хлора гипохлорит. Мутагенное действие миелопероксидазы и растворимой монооксигеназной сис-теш обеспечивается генерацией различных кислородных радикалов и не имеет выраженной специфичности. Пэказано таюяэ, что как активные Форш кислорода, так и гипохлорит, способны модифицировать ДНК, причем гипохлорит вызывает избирательное выдапление тимина из молекулы ДНК. Ыэдификация гипохлорлтом приводит к повышению протеолитической атакуемости альбумина, а тага® к фрагментации »миелопероксидазы при самаоинактивации. Материалы диссертации могут быть использованы специалистами, занимающимися исследованием процессов фагоцитоза, а тага» проблемами инактивации белков кислородными радикалами и процессами регуляции обмена белков в клетке.

Апробация работы состоялась 4 декабря 1990 года на еовмест-

* ■

пой научной конференции кафедры биохимии медико-биологического факультета 2-го ШЛГЫИ им. Н. И. Пирогова, ПНИЛ экологии, токсикологии и метаболизма лекарственных препаратов, лаборатории микро-сокального окисления Института Биологической и Шдицинской Химии АНН СССР. Натериалы диссертации докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Шггохром Р-450 и модификация макрошлекул"(Яята, 1989), на Ьздцународнои симпозиума "Применение хроматографии и электро-

- 4 -

фореза в биологии и медицине'Ч Таллинн. 1990).

Публикации: Do теме диссертации опубликовано 4 печатные работа

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в котором рассматриваются общие представления о роли миелопероксидазы в процессах фагоцитоза, строение и функция миелопероксидазы, вопросы окислительной модификации макромолекул, процессы самоинактивации ферментов, экспериментальной части, .в которой приводятся результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 170 источников. Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста, содержит 1Б рисунков и б таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И методы ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали миелопероксидаау лейкоцитов крови человека, которую выделяли по модифицированному.методу Andrews, Krlnsky(1981). Выделение миелопероксидазы включало в себя следующие этапы: солюбилизацию лейкоцитов, высаливание с помощью сульфата аммония, гель-проникавдую ВЭЖХ.

Активность, миелопероксидазы определяли по методу Andrews, Krlnsky (1982).

Микросомальную фракцию печени кроликов, индуцированных фено-

- б -

барбиталом выделяли по методу Карузиной И. И. и соавт. (1977).

Выделение цитохрома Р-450 ЛМ2 из печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом, проводили по методу Карузиной и соавт. (1983).

Выделение НАДФН - специфичного флавопротеина проводили по модифицированному методу Dignam J. D., et al(1977).

Содержание белка определяли по методу Lowry 0. Н., et al(1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Растворимая монооксигеназная система содержала 100 мМ Na-фосфатный буфер, рН-7.4, 0,025 7. эмульген 913, 2.5 мкЫ цитохром Р-450 и 2.5 мкЫ НАД®-специфичный фяавопротеин. Для диссоциации олигомеров цитохрома Р-450 и НАДФН-специфичного флавопротеина систему инкубировали в течение 2-х часов при 4* С (Bachnanova а I. ot al. 1986).

Количество образовавшейся в ходе миелопероксидазной реакции гипохлорной кислоты определяли с помощью о-толидинового реактива по методу Harrison J. Е., Schultz J. (1976), по образованию окрашенного продукта реакции. Спектрофотометрию проводили при длине

волны 455 нм и рассчитывали концентрацию гипохлорной кислоты, ис-

_ -i _i >.

пользуя' коэффициент молярной зкстинкции 1375 МЫ СМ. '

При исследовании бактерицидного действия ыиелопероксидазы и цитохром Р-450 содержащих систем использовали пггамм бактерий Esherlchla coll OA 120.Инкубационная смесь объемом 0,5 ил содержала 109бактерий/мл, 1 Uli перекиси водорода, 100 мМ NaCl, Na-фос-фатный буфер, рН-7.0 и определенное количество миелопероксидазы, микросом печени кролика или PLC. Инкубацию проводили при 37°С в

течение 5 кинут. Реакцию начинали добавлением в инкубационную смесь перекиси водорода для миедопероксидазы и добавлением NADPH в случае инкубации с растворимой ыонооксигеназной системой или микросомами. Чзреэ 2 и 5 минут отбирали 50 мкл инкубационной среды и высевали на L-arap в чашки Петри после соответствуюоэго разведения в 100 ыМ фосфатном буфере pH 7.4. Чашки с посевами инкубировали при 37 °С в течении суток, подсчитывали число выросших клонов и рассчитывали выживаемость.

При исследовании »мутагенного действия миедопероксидази н РУС использовали штаммы бактерий Salmonella thyphyimrlum ТА08.ТА1ОО к TAI02. Мутагенное действие миедопероксидазы и РШ оценивали в тесте Эймса (Ames В. N. et al, 1973). Инкубационная омось содержала 100мМ Na-фосфатный буфер, pH"?, 4. 1мМ Н^0Д, 100 МЫ HaCl И определенное количество миедопероксидазы или РШ. Инкубацию проводили при 37°С в течение б минут. Балерин высевали на L-arap и инкубировали в течение суток при 37°С. Затем подсчитывали количество образовавшихся мутантных колоний и рассчитывали мутагенный эффект.

Электрофорез ДНК проводили в 10Х агарозном геле по методу Birnboim Н. С. (1083). Ка дорохасу наносили 30 им образца, содержащего 1-2 ют модифицированной ДНК. Инкубационная среда для модификации ДНК содержала 1-2 мкг ДИК, 1 мМ НЛ0Д, 100 мУ HaCl и определенное количество мколопероксидазы или РШ. Инкубации проводила в течение 10 минут при 37°0. После окрашивания геля проводили денситометрированпе на денситометре фирмы "Но1епа"/£ранция/.

ВЗНХ нуклеотидов проводили на колонка с образиной фазой L lchrosorb RP 18 фирмы ииШ"/Швецня/.

Исследование протеолитического расцепления альбумина после действия на него гипохлорита, генерируемого миелопероксидазой прводилл с помощью протеаэы К. Появление фрагментов регистрировали с помощью гель-прониказдэй ВЭЯХ на колонке ТБК 6-2000 БУ фирмы "ЬКВ"/Швеция/,

Для исследования самоинактивации миелопероксидазы использовали гель-проникающую ВЗЯХ на колонке ТБК 6-3000 ЕМ и изоэлектро-фокуснрование в борат-полиолыюй системе(Допгий н др 1991).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерицидное действие миелопероксидазы, растворимой мо-иооксигенаоной ситемы и шкросом печени кроликов.

Активные формы кислорода, образуются при работе различных гем-содертапзис ферментов могут обладать модифицирующим действием на белга! и нуклеиновые гаслотыС Б1ас11шап Е. И. et а1, 1985). В рядэ работ было показано, что такие ферменты обладают и бактерицидным действием( АггНгге е1 а1, 1989, Апйгога Р.С. е1 а1, 1984.). Однако до сих пор дискутируется вопрос о конкретном повреждающем бактерии агенте. Таковым мотет являться, как супероксидный радикал, так и ОН" - радикал или гипохлорит. Предетарляло интерес сравнить бактерицидное действие милопероксидазы, вырабатывающей в присутствии и отсутствии ионов хлора различные активные формы кислорода, растворима (■онооксигеиазной системы и микросом печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом.

Бактерицидное действие циелопероксидазы лейкоцитов крови человека (МП), микросом из печени кролика (ВД и растворимой ре кон-

- а -

струированной ыонооксигенааной системы (РМЗ), содержащей цитохром Р-450, исследовали на бактериях E.coli QA120. Покааано. что выживаемость бактерий после инкубации с миелопероксидазой составила -я s

10 X и 10 X по отношению к контролю в присутствии О, IM NaCl и в его отсутствии, соответственно (рис.1). Мшгросомы и РМС также оказывают бактерицидное действие. Выживаемость бактерий составила 10 X и 1 X , после инкубации с MC и РМС. Цри инкубации бактерий с гипохлоритом натрия в концентрации 300 мкМ выживаемость бактерий падала на два порядка и составляла IX соответственно. В то же время перекись водорода в концентрации 10 Mil, не оказывает влияния на инкубировавшиеся с ней бактерии.

Реакции, катализируемые миелопероксидазой и цитохрои Р-450 содержащими системами» отличаются по своему механизму и по продуктам реакций. Поэтому нами Сил предложен метод расчета выживаемости бактерий, учитывающий различную активность ферментативных систем, генерирующих активные формы кислорода Суть этого метода расчета заключается в том, что при окислении одной молекулы NADPH цитохром Р-450 содержащими системами на кислород переносятся 2 электрона. Такое же количество электронов использует миелоперок-сидааа для окисле ния одной молекулы тетраметилбензидина и одного иона СГ. Исходя из этого, бактерицидное действие 1С, РМС и мие-лопероксидазы можно выразить, как количество погибших бактерий в расчете на моль окисленного NADPH в случае 1С! и РШ или па моль окисленного тетраметилбенэидина или моль образовавшегося NaDCl в случае с миелопероксидааой. Таким образом расчет гибели бактерий иа пару электронов, участвующих как в реакциях, катализируемых миелопероксидазой, так и в реакциях, катализируемых цитохром

1М2В0

с бактерии {%)

Вр8!Ш(кза.)

Рис.1 Выживаемость бактерий Е. coli GA- 12D после инкубации с миелопероксидаэой мгафосомами и РЖ.

1 - мнелопероксидаза(0. 6 нмоль/мл), 1мМ Н,02, 0,111 NaCl

2 - миелопероксидаза(1мкМ), 1мЫ Н.О,

3 - РМ:(2,5нмоль/мл цитохрома Р-4Б0, 215нмоль/мл

NADPH-эависимой редуктазы, 0,0257. эмульген), 1мМ NADPH.

4 - микросомы печени кролика(2,5 нмоль/мл цитохрома

Р-450). 1мМ NADPH.

5 - 200 мкм гкпохлорит Na

6 - 10 ММ Н^Ол „

В каждом эксйерименте количество бактерий было 5*10а кл/мл.

Инкубационная смесь крою указанных выше ингредиентов содержала 100 мм На-фосфатныЯ буфер рН=7.4. Инкубации проводили при 37°С.

Еыдиваемость бактерий оценивали по числу образованных колония и выражали в z по отношению к контролю; по оси абсцисс - время инкубации Е. coli с ферментативными системами.

Р-450 содержащими системами, позволяет учесть различие в активности этих ферментных систем и, следовательно, количественно оценить Оактерицидность образующихся в них продуктов реакций.

Таблица 1.

Количество погибших бактерий в расчете на перенесенные в ходе ферментативных рекций электрона

Время Шкросомы Р1Ю Ыиелоперок- Ыиелоперок-

реакции сидаза сидаза

-N301 +N301

2 минуты 14.0+0.5 35. 0+0. 4 100.0+0.6 570.0+1.3

5 минут 71.0+0.5 160.0+0. 5 2500. ОН. 9 39000.0+10.0

Активность микросом была равна 7ншль НАОРН/мин*ншль цитохрома Р-450, активность РИС была равна 40 нмоль ЫАЛРНЛин*нмоль цитохрома Р-450, активность миелопероксидазы была равна 2000 нмоль ТЫВ/иин*нмоль форманта в отсутствии МаС1 и 3500 нмоль ТМВ/мин*нжш> фермента в присутствии НаС1. (Р<0.01)

Из результатов представленых в таблице 1 видно, что наибольшим бактерицидиш действием обладает миелоперотеидаза в присутствии конов С1". В отсутствии ионов хлора миэдопероксидаза оказывает бактерицидное действие на несколько порядков шита, в то га время растворимая моиооксигеназная система и микросомы печеш1 кролика по сути дела не обладают баэтерицидным действием. Эффек-

тивность бактерицидного действия.РНС при таком рассчете составляет всего десятые доли процента от бактерицидного действия миело-пероксидазы.

По всей видимости бактерицидны,! эффект, наблюдаемый при действии добавленного гипохлорита и дающий два порядка гибели Сакте-рий(рис. 1), хорошо объясняет разницу мезду бактерицидным действием миелопероксидазы в присутствии и отсутствии 0,1 М ИаСКтабл. 1). Образующиеся в ходе оксидазных реакций в микросомах и растворимой монооксигеназной системе активные формы ютслорода такж могут обладать бактерицидным действием, однако их эффективность крайне низка.

Мутагенное действие мнелопроксидазы и растворимой моноок-сигенэной системы.

Мутагенный эффект миелопероксидазы и РШ исследовали в тесте Эйммса на 3-х шаммах Salircnella thyphymrlum (ТА98, ТА100, ТА102). Мутагенный эффект рассчитывали по количеству образованных мутантных колоний. В качестве.контроля наблюдали спонтанный мутагенез этих хг штаммов, без инкубации с ферментами. Показано, что миелопероксидаза в тесте Эймса обладает наибольшим модифицирующим действием на штамм ТА100, наиболее чувствительный к окислительной кодификации ДНК, в которой происходит мутация со сдвигом рамки считывания. Для этого кэ штамма наблюдается мутагенный эффект, но значительно более слабый, обусловленный действием P)iC. Количество мутантных колоний было равно 1000 при действии на штамм ТА100 ми-елопероксидазц, и 250 при исследовании мутагенного действия растворимой монооксигеназной системы. Миелопероксидаза и РМС оказыва-

от незначительный мутагенный эффект в тесте Эймса на штамм TAI02, также чувствительный к окислительной модификации ДНК. Число образовавшихся мутантных колоний в этом случае составляло 450 для ми-елопероксидазы и 370 для растворимой монооксигеназной системы. В то же время и ыиелопероксидаза и растворимая монооксигеназная система не оказывает влияния на иггамм ТА98, чувствительный к ад-килированию молекулы ДНК (рис. 2).

В таблице 2 представлены результаты количественного анализа мутагенного действия PLC и миелопероксидазы на штаммы ТА98, TAI00 и ТА102 Salmonella t-hyphymurium в расчете на каждую пару электронов перенесенных на кислород или участвующих в образовании гипох-лорита.

Таблица 2.

Количество образовавшихся мутантных колоний в расчете на 2 перенесенных электрона.

Штаммы Salmonella Ыиелопероксидаза thyphymurluBi

PW

ТА 98

О

О

ТА 100

1.0 +0.1 (Р<0.01) 0.26 +0.10 (Р<0.01) 0.4+0.1 (Р<0.01) 0,2+0.1 (Р<0.01)

ТА 102

Активность миелопероксидазы равна 3500 нмоль ТЫБ/ыин*нмоль фермента. Активность РШ равна 40 нмоль NADPH/ мин*ныоль цитохро-ыа Р-450.

Количество мутантных штаммов

ЮОО-г!

800-

000-

1 2 3 1 2 3 1 2 3

ТА 98 ТА100 ТА102

Рис.2. Нутагенниое действие миедопероксидазы и РМС в тесте Эймса

1 - контроль, 2 - миелопероксидаза, 3 - РМЗ

Используя данный метод расчета можно видеть, что мутагенное действие миелопероксидазы и РМС на штамм ТА100 составляет 1,90 и 0,26, а на штамм ТА102 - 0,40 и 0,20 колоний мутантов, соответственно. Полученный результат позволяет предположить, что в отличие от бактерицидного действия миелопероксидазы мутагенный эффект может быть обусловлен не только действием на молекулу ДНК гипохло-рита, вырабатываемого миедопероксидазой, но и другими кислородными радикалами, образованными при работе растворимой монооксигеназной системы. В то «е время необходимо отметить, что различные штаммы Salmonella thyphymrium обладают неодинаковой чувствительн остью к действию активных форм кислорода, образующихся при работе этих систем. Так штамм ТА100 оказался более чувствительным к действию на ДНК гипохлорита. Действие на этот штамм кислородных радикалов, генерирующихся при работе растворимой монооксигеназной системы, составляет лишь 14Х от воздействия на него миелопероксидазы. В то хе время штамм ТА102 более подвержен воздействию на ДНК активных форм кислорода, образующихся при работе растворимой монооксигеназной системы и этот эффект составляет 50Х от действия на данный стгамм миелоперксидазы.

Из результатов представленных в таблицах 1 и 2 видно, что при рассчете бактерицидного и мутагенного действия миелопероксидазы и растворимой монооксигеназной системы на пару перенесенных электронов, бактерицидное действие растворимой монооксигеназной системы ничтожно мало по сравнению с таковым миелопероксидазы. Однако мутагенное действие РШ довольно высоко, особенно в отношении штамма ТА102. Существующую разницу в действии миелопероюзи-дазы и растворимой монооксигеназной системы на бактерии можно об-

ъяснить тем, что основной зклад в баетерициднсе действие вносит гипохлорит, мутагенный же эффект может вызываться действием различных форм активного кислорода

Действие активных форм кислорода на ДНК.

После того, как был обнаружен мутагенный эффект миелоперок-сидазы и растворимой монооксигеназной системы, представляло интерес исследовать способность миелопероксидазы и РМС модифицировать молекулу ДНК. Эти исследования проводились на ДНК плазмиди pBR 322, существующей в двух формах: сунерспирализованной и в форме открытого кольца Плазмидную ДНК инкубировали с миелопероксидазой и растворимой тнооксигеназной системой в течение 10 минут при 37" С. , Гюсло инкубации на дорожу агарозного геля наносили 10-30 мел инкубационной смеси. На рисунке 3 приведены денситогракмы элект-рофоротичоского разделения модифицированной плазиидной ДНК. Из полученных результатов видно, что миелопероксидаза оказывает модифицирующее действие на плазмидную ДНК как в присутствии 0,1М NaCl, так и в его отсутствии. Модификация плазмидной ДНК вырата-ется в том, что возникают разрывы суперспирализованной формы, ведущие к образованию кольцевых молекул, а затем разрывы в кольцевых формах, ведущие к образованию линейных форм , которые впоследствии, превращаются в низкомолекулярные фрагменты. Причем, в присутствии 0.1Ы NaCl фрагментация ДНК протекает более выраяенно. Растворимая монооксигеназная система тагаз вызывает Фрагментацию дцпс

Тот факт, что киелопроксидаза и P1JC, вызывают модификацию плазмидной дик, приводящую к разрывам целой молекулы и образоаа-

Рис.3 Электрофореграммы ДНК после инкубации с миелоперокслдаэой и Piß.

Инкубационная смесь содержала 10 мкг/мл ДНК, 100 мМ На-фос-фатный буфер рН-7.4(1). и 1 мМ nADPH, 2,5 нмоль/мл цитохрома Р-450, 2,5 нмоль/мл NADPH-редуктазы, 0.025Х эмульген 913(4), или 1 мМ Н О , 1 нмоль/мл мнелопероксидагы(2) и 100 мН NaCl(3). Инкубацию проводили в течение 10 минут при 37 с.

а - суперспирализованная форма ДНК, б - кольцевая форм-а, в - линейная форма, г - низкомолекулярные фрагменты ДНК.

нию низкомолекулярных фрагментов, бев какой-либо специфичности, позволяет сделать вывод, что при кодификации плазмидной ДНК pBR322 различные по своей природе кислородные радикалы не оказывают специфического действия на нуклеиновую кислоту. Более интенсивное действие на плазмидную ДНК, оказываемое миелопероксидазой в присутствии О, 1 М NaCl по сравнению с действием растворимой цонооксигеназной системы и миелопероксидазы в отсутствии 0,1 11 NaCl, момэт быть объяснено тем, что эти ферментативные системы работают с различной скоростью и, соответственно, генерируют различное количество активных форм кислорода

С помощью ВЭ20С на колонке с обращенной фазой Llchrosorb RP18 была исследована модификация ДНК тимуса крупного рогатого скота при действии на нее миелопероксидазы, как в присутствии О.1 U NaCl, так и в его отсутствии. Инкубацию ДНК с миелопероксидазой проводили при 37°С в течение 20 минут. После окончания инкубации, ДНК осавдали о помощью сульфата бария центрифугированием. Надое а-дочную гзадкость в количестве 100 - 200 мкл наносили на колонку, уравновепенную рабочим буфером, содержащий в качестве ион-парного реагента 1 м51 ТВА. Содержание нуклеотидов регистрировали с по-моифю детектора с диодным полем при длинах волн 254 и 280 ни. На рисунке 4 представлена хроиатограмиа разделения надосадочной жидкости после инкубации ДНК с миелопероксидазой. ВЭЯХ показала, что при действии миелопероксидазы в присутствии 0,1 11 NaCl на ДНК тимуса крупного рогатого скота черев 20 минут после начала реакции появляется нштоиолекулярное соединение, соответствующее по времени выхода с колонки и по соотношению поглодения 280/264 нм ти-!£:ну. При отсутствии МаС1 а инкубационной среда не было обнаруже-

А?54

0.01 ч

0

0.05 -

0.05

0 J

1 7

Время элпции(мин.)

Рис.4. ВЭЖХ продуктов распада ДНК после ее инкубации с миелопероксидазой а - тимин, избирательно выяепленкый из ДНК после ее инкубации с миелопероксидазой.

б - смесь стандартных нуклеотидов после инкубации с миелопероксидазой.

в - смесь стандартных нуклеотидов без инкубации с миелопероксидазой.

1 - а;енин. 2 - цитидин, 3 - тимин, 4 - гуанин. 1 Инкубационная смесь содержала 1 имоль/мл миелоперокеидазы, 1 мМ ИгРе, 10Э мМ НаС1, 100 мМ Па-фосфатный буфер, и 10 мг/мл ДНК(а) или 10 мкг/мл каждого нуклеотида!. б. в).

- 10 -

но появления фрагментов этой фракции.

Протеолитическое расщепление альбумина, обработанного ыив-лопероксидазой.

Важным иоментом для пон!1!.*лш;л механизма бактерицидного действия ииолопероксидазы ■ является исследование ее модифицирующего действия на белки. С этой целью исследовалась протеолитическая атакуеиость альбумина протеазой К после его предварительной инкубации с шелоперогашдазой. Бычий сывороточный адьбушн с молекулярной «яссой 67 кДа шпсубировали с миелопероксидазой в присутствии 0,1 li l.'aCl при 37'0 а течение 10 минут. По окончании инкуСа-ци". добавляли в реакционную смесь протеазу К из рассчета протеаза К/альбушн 1:100 и ишсубировали в течение 30, 60, 90 и 120 кинут при 37°С. Затем 100 мхл ишсубационной сиеси наносили на гаэлонку TSK G-2000 SW для гель-проникающей ВЗДХ За появлением протеоли-ттэских фрагментов следили с помопаьп регистрации при 280 им на детекторе с диодным полем( рис. б). В таблице 3 приведены результаты протеодиза альбумина обработанного миелопероксидазой. Из полу-чонкых результатов видно,что со временен количество альбумина уг-эньсгется по сравнению с контролен.

3 то ítí cpoi/л появляются и со временем увеличивается количество низтонолекулярних Фрагментов с >,юлеку лярной массой 10 - 20 ;сДа. Инкубация альбумина с миелопероксидазой баз последующего протеолиза не приводит к расщеплению Сзлка(рис. 5, кривая 2).

А280 0.2

0.1

I 1

15 30

Время элюцииСмин.)

Рис. 5. Гель-проникающая БЭКХ продуктов частичного протеолиза

альбумина.

Инкубационная смесь содержала: 1 - 100 мкг/мл альбумина, 1 мкг/мл протеазы К, 100 мМ Na-фосфатныЯ буфер рН-7.4. 2 - 100 мкг/мл альбумина, 1 нмоль/мл миелопероксидагы. 1мМ НА0£, 100 мМ NaCl. 3 - в инкубационную смесь, описанную в пункте 2 добавляли протеазу К(1 мкг/мл) и инкубировали в течение 120 минут при о7°с.

1,2

Время элюции(мим.)

Рис.6. Гель-проникающая ВЭЯХ (а) и изоэлектрофокусирование в борат-полнольной системе (б) миелопероксидазы до (1) и после (2) каталитической реакции.

Инкубационная смесь содержала 1 нмоль/мл мтелопероксидазы, 1 ыЫ Н^, 100 мЫ N301 в 100 мМ На-фосфатном буфере, рН-7. 4.

- 22 -Таблица 3.

Протеолиз модифицированного и нативного альбумина под действием протеазы К.

Время протеолиза (мин) Содержание альбумина после инкубации с миелопероксидазой (в процентах) Содержание альбумина не инкубировавшегося с миелопероксидазой (в процентах)

0 100 100

30 92 100

60 83 100

90 71 95

120 60 95

Самоинактивация ыиелопероксидазы.

Для исследования образования фрагментов миелопероксидаэа при самоинактивации была использована гель* проникался ВЭЛК и изоэ-лектрофокусирование в борат-полиольной системе. На рис. 6а показана хроматограмма разделения ыиелопероксидазы после инкубации ее с перекисью водорода и нонами хлора в течение 10 минут. Обнаружено образование низкомолекулярного фрагмента с молекулярной массой около 10 кДа. Однако в этой фракции может содержаться не один пептид, а несколько. Метод изоэлектрофокусирования в борат-полиольной системе позволяет определить очень небольшие количества низкомолекулярных петидов и мы использовали его для обнаружения

таковых при самоинактивацин миелопероксидазы. Как видно из рис. 60 при изоэлектрофокусировании самоинактивированной миелопероксидазы наблюдается появление фрагмента миелопероксидазы с иаоэлектричес-кой точкой 6,3.

выводи

1. Бактерицидное действие миелопероксидазы объясняется генерацией гипохлорита, а не действием других активных форм кислорода Шнооксигеназные цитохром Р-450 содержащие системы на обладают бактерицидным действием.

2. Активные формы кислорода и гипохлорит, генер!фуе>зие миелопероксидазой и растворимой ионооксигеназной системой. обладают мутагенным действием.

3. Гипохлорит и активные формы кислорода, генерируемые миелопероксидазой и растворной монооксигеназной системой, модифицирую? молекулу ДНК пдаамиды рВЙ 322 с образованием разрывов ыоле-куяи и появлением низкомолекудярных фрагментов. Гипохлорит способен избирательно вьщэплять из молекулы ДНК тшш.

4. Генерируемый шюлопероксидазой гипохлорит увеличивает протеолитическую атакуемость альбушна

Б. Самоиншстквация миелопероксидазы в процессе катализа сопровождается образованием низкомол9!судярного фрагмента

- 24 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Khallov P.M., Slvov I. й , Adrlanov N. V. Bactericidal and mutagenic effect of hypochlorite and active oxygen forms generated by myeloperoxidase and soluble reconstituted monooxy-genase system.// In:Biochemistry В biophysics of cytochrome P-450; structure and function, biotechnologlcal arid ecological aspects. Abstracts of 7-th International conference, Moscow.-1991-p. 27.

2. Хайлов П. M, Сивов И. Г., Адрианов Н. & Бактерицидное действие микросом, растворимой реконструированной системы и миелопероксидазы лейкоцитов крови человека. //В кн. Цитохром Р-450 и модификация макромолекул. Тезисы докладов V Всесоюзной конференции. Ялта. -1989-с. 54.

а Хайлов П. U., Захаренко Е И., Воронин Б. М. Модификация ДНК в реконструированной монооксигеназной системе и под действием миелопероксидазы лейкоцитов крови человека. // В кн. Цитохром Р-450 и модификация макромолекул. Тезисы докладов V Всесоюзной конференции. Ялта. -1989-с. 63.

4. Адрианов Н. В*, Довгий А. И., Хайлев П. М. // Влияние фенобарбитала и амидопирина на скорость распада изоформ цитохроиа Р-450 в микросомах печени мытэй.// Биохимия-1989- Т. 64-вып. 7-с. 1120-112Б.

5. Khallov P.M., Slvov 1.й. Zakharenko V.N., Adrlanov N.V., Archakov A. I.// The role of aotivo oxygen forms in modification of macromolecules and baoterloldal action of the human leucocyte myeloperoxidase. // Biomedical Science - 1991 - in press.

8S3pr -,Q0