Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация микромолекул и бактерицидное действие миелопероксидазы лейкоцитов крови человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модификация микромолекул и бактерицидное действие миелопероксидазы лейкоцитов крови человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РС<КР ВТОРОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ а И. ПИРОГОВА

На правах рукописи

ХАЙЛОВ Павел Михайлович

УДК [647. 964. 4-0.18.11-436: 691. 4361

МОДИФИКАЦИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ И БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЫИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат днссеритации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1091

Работа выполнена на кафедре биохимии медико-биологического факультета 2-по Московского ордена Ленина Государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова.

Научный руководитель

академик АЫН СССР, доктор биологических наук,' профессор Арчаков А. И.

Официальные оппоненты»

доктор медицинских наук Галпаров Ы. Ы. -Г. доктор биологических наук Бачманова Г. И.

Ведущая организация - Научно-Исследовательский Институт Зм-вико-Химической Ыэдишиш.

Защита диссертации состоится ' в

.... часов на заседании специализированного ученого совета К 084.14.05 2-го ШЛГЫИ ни. И. И. Пирогова по адресу: 117437, Москва, ул. Оотровнтянова, 1.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотек» 2-го МОЛГМН им. Н. И. Пирогова.

Автореферат разослан «.....»....... . 1вв1г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета кандидат медицинских наук

доцент Т. Н. КДУШИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Реакции окислительной модификации макромолекул широко распространены у аэробных организмов и играют значительную роль в физиологии и патологии клетки( Nathan С.F. et al., 1986). Эти реакции лежат в основе процессов фагоцитоза, в которых существенную роль играет фермент - миелопероксидаза, обладающий бактерицидной активностью, обусловленной продукцией Н0С1 из ионов СГи перекиси водорода (Bakken 1st A. R.J. étal., 1980).

Представляло интерес исследовать роль гипохлорита, генерируемого миелойероксидазой, в бактерицидном действии этого фермента, а также способность шелопероксидавы вызывать мутагенез бактерий и модификацию белков и ДНК. В качестве системы, генерирующей активные формы кислорода, с которой можно было бы сравнить работу миелопероксидааы была выбрана монооксигенааная система, содержащая цитохром Р-450. Однако, так как механизмы реакций, а также продукты реакций этих двух систем различны, то для оценки бактерицидного и мутагенного действия миелопероксидааы и цитохром Р-450 содержащих систем был предложен метод расчета, учитывающий количество участвующих в реакции электронов.

Согласно гипотезе Стедмана и др. (Stadtnen E.R. et al, 1986), инактивация белков под действием активных форм кислорода может являться начальной стадией их распада в клетке. Ранее было показано, что при метаболизме целого ряда субстратов под действием образующейся в гидроксилааном цикл» перекиси водорода, происходит необратимая инактивация цитохрома Р-450, вследствие модификации апофермента(Карузина И.И.. Арчаков А.И., 1987). инактивация сопровождается повышением чувствительности цитохрома Р-450 к протео-

- г -

лиэу. Ыиелопероксидаза тага» способна к самоинактивации под действием выработанного гипохлорита( Andrews Р. С. et al., 1981). Представляло интерес исследовать протеолитическую атакуемость альбумина, модифицированного миелопероксидааой, а также способность миелопероксидазы к самоинактивации. -

Таким образом, учитывая важную роль, которую играют.активные формы кислорода в процессах фагоцитоза, а также при модификации макромолекул, в настоящей работе исследовались бактерицидное и мутагенное действие миелопероксидазы, а также ее способность вызывать модификацию. нуклеиновых кислот и белков* при генерации различных активных форм кислорода.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ : Выяснить роль активных форм кислорода и гипох-лорита в модификации макромолекул, бактерицидном и мутагенном действии му.едопероксидавы лейкоцитов крови человека.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ ¡-.исследовать роль гипохлорита и активных форм кислорода в бактерицидном действии миелопероксидазы и цитохроы Р-460 содержащих систем, соответственно;

- сравнить мутагенное действие миелопероксидазы и растворимой монооксигенааной системы.

- исследовать модификацию ДНК гипохлоритом, активными формами кислорода, генерируемыми миелопероксидааой и растворимой шноок-сигеназной системой. . > ,

- исследовать протеолитичоскую атакуемость альбумина, модифицированного шелопероксидавой.

- исследовать возможность распада апофермента при самоинак-

тивации миелоперокеидазы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ : в результате проведенных исследований показано, что основной вклад в бактерицидное действие миелоперокеидазы вносит» образующийся в ходе реакции с перекисью водорода и ионами хлора гипохлорит. Мутагенное действие миелоперокеидазы и растворимой монооксигеназной системы обеспечивается генерацией различных кислородных радикалов и не имеет выраженной специфичности. Показано таю®, что как активные формы кислорода, так и гипохлорит, способны модифицировать ДНК, причем гипохлорит вызывает избирательное выщепление тимина ив молекулы ДНК. Модификация гипохлоритом приводит к повышению протеолитической атакуености альбумина, а также к фрагментации миелоперокеидазы при самаоинактивации. Материалы диссертации могут быть использованы специалистами, занимающимися исследованием процессов фагоцитоза, а такжз проблемами инактивации белков кислородными радикалами и процессами регуляции обмена белков в клетке.

Апробация работы состоялась А декабря 1990 года на совместной научной конференции кафедры биохимии медико-биологического факультета 2-го ЫйЛГМИ им. Н. И. Пирогова, ПНИЛ экологии, токсикологии и метаболизма лекарственных препаратов, лаборатории микро-сомального окисления Института Биологической и Медицинской Химии АШ СССР. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул^ Ялта, 1989), на Мзлоународноы симпозиуме "Применение хроматографии и электро-

- 4 -

фореаа в биологии и медицине'Ч Таллинн. 1990).

Публикации; По теме диссертации опубликовано 4 печатные работа

Структура и объем работа Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в котором рассматриваются обдае представления о роли миелопероксидазы в процессах фагоцитоза, строение и функция шгалопероксидазы, вопросы окислительной модификации макромолекул, процессы самоинактивации ферментов, экспериментальной части, чв которой приводятся результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 170 источников. Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и Б таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали миелопероксидаау лейкоцитов крови человека, которую выделяли по модифицированному.методу Andrews, Krinsky(1981). Выделение миелопероксидазы включало в себя следующие этапы: солюбилизацкю лейкоцитов, высаливание с помощью сульфата аммония, гель-проникающую ВЭЖХ.

Активность, миелопероксидазы определяли по методу Andrews, Krinsky (1982).

Цикросомальную фракцию печени кроликов, индуцированных фено-

- Б -

барбиталом выделяли по методу Карузиной И. И. и соавт. (1977).

Выделение цитохрома Р-450 ЛМ2 из печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом, проводили по методу Карузиной и соавт. (1983).

Выделение НАДОН - специфичного фдавопротеина проводили по модифицированному методу Dignam J.D., et al(1977).

Содержание белка определяли по методу Lowry О. Н., et al(1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Растворимая монооксигеназная система содержала 100 мМ Na-фосфатный буфер, рН-7.4, 0,025 X эмульген 913, 2.5 мкМ цитохром Р-450 и 2.5 мкЫ НАДОЙ-специфичный фяавопротеин. Для диссоциации олигомеров цитохрома Р-450 и НАД®-специфично го флавопротеина систему инкубировали в течение 2-х часов при 4" С (Bachmanova G. I. et al. 1986).

Количество образовавшейся в ходе миелопероксидазной реакции гилохлорной кислоты определяли с помощью о-толидинового реактива по методу Harrison J.E.. Schultz J. (1976), по образованию окрашенного продукта реакции. Спектрофотометрию проводили при длине волны 455 нм и рассчитывали концентрацию гипохлорной кислоты, используя коэффициент молярной ЭКС^ИНКЦИН 1375 МЫ СМ. '

При исследовании бактерицидного действия миелопероксидазы и цитохром Р-450 содержащих систем использовали штамм бактерий Esherlchla coll OA 120.Инкубационная смесь объемом 0,5 мл содержала 109бактерий/мл, 1 Ш перекиси водорода, 100 Mil NaCl, Na-фос-фатный буфер, рН-7. о и определенное количество миелопероксидазы, микросоы печени кролика или РЫС. Инкубацию проводил! при 37 °С в

течение 5 минут. Реакцию начинали добавлением в инкубационную смесь перекиси водорода для миелопероксидазы и добавлением NADPH в случае инкубации с растворимой монооксигенааной системой или микросомами. Через 2 и 5 минут отбирали 50 мкл инкубационной среды и высевали на L-arap в чашки Пэтри после соответствувдэго разведения в 100 Ш фосфатном буфере рН 7.4. Чашки с посевами инкубировали при 37"С в течении суток, подсчитывали число выроста клонов и рассчитывали выживаемость.

При исследовании мутагенного действия миелопероксидазы и РДО использовали штаммы бактерий Salmonella thyphymurliun ТА98.ТА100 и ТА102. Мутагенное действкз мкедопероксидазы и РШ оценивали в тесте Эймса (Anes В.N. et al, 1S73). Инкубационная смесь содержала 100ыМ Na-фосфатшй буфер, ptt-7.4, 1мМ Нг0д, 100 мУ NaCl и определенное количество миелопероксидазы или РШ. Инкубацию проводили при 37°С в течение 5 минут1. Бактерии высевали на L-arap и инкубировали в течение суток при 37°С. Затем подсчитывали количество образовавшихся ыутантных колоний и рассчитывали мутагенный эффект.

Электрофорез ДНК проводили в 10Х агарозном геле по методу Blrnboim H. С. (1088). На дорожку наносили 30 мкл образца, содержащего 1-2 ыкг модифицированной ДНК. Инкубационная среда дм модификации ДНК содержала 1-2 мкг да, i Ш Н.0Д> 100 Ш NaCl и определенное количество миелопероксидазы иди РШ. Инкубацию проводили в течение 10 минут при 37°С. Пэсде окрашивания геля проводили денситомзтрирование на денситометре фирмы "Но1епа"/0раяция/.

ВЭЯХ нуклеотидов проводили на колоюса с обращенной фазой Lichrosorb RP 18 фирмы "ЬКВ'УШвеция/.

Исследование протеолитического расцепления альбумина после действия на пего гипохлорита, генерируемого миелопероксидазой прводщш с помощью протеазы К. Появление фрагментов регистрировали с помощью гель-проникающей ВЭЖХ на галош« TSK &-2000 SW фирмы 'гкВ'УШвеция/.

Для исследования самоинактивации миелопероксидазы использовали гель-проникающую ВЭЯХ на колонке TSK Q-3000 SW и изоэлектро-фокусирование в борат-полиольной системе(Довгий и др 1991).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОШШИЯ

Бактерицидное действие миелопероксидазы, растворимой мо-нооксигеназной ситемы и микросом печени кроликов.

Активные формы кислорода, образующееся при работе различных гем-содеркащих ферментов могут обладать модифицирующим действием на белки и нуклеиновые кислоты(Stadtman Е. R ét al, 1986). В ряде работ было показано, что такие ферменты обладают и бактерицидным действием( Aguirre j. et al, 1989. Andrews P.C. et al, 1984.). Однако до сих пор дискутируется вопрос о конкретном повреждающем бактерии агенте. Таковым мокет являться, ¡сак супероксидный радикал, так и ОН" - радикал или гипохлорит. Представляло интерес сравнить бактерицидное действие милопероксидазы, вырабатывающей в присутствии и отсутствии ионов хлора различные активные формы кислорода, растворимой моноокснгеназной системы и микросом печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом.

Бактерицидное действие миелопероксидавы лейкоцитов крови человека (МП), микросом из печени кролика (ИЗ) и растворимой рекон-

струированной монооксягенааной системы (РМС), содержащей цитохром Р-450, исследовали на бактериях Е.coli GA120. Показано, что выживаемость бактерий после инкубации с ыиелопероксидазой составила

-г -S-

10 X и 10 X по отношению к контролю в присутствии О, 1U NaCl и в его отсутствии, соответственно (рис. 1). Мшсросоыы и РШ так*» оказывают бактерицидное действие. Выживаемость бактерий составила 10 X и 1 X , после инкубации с MC и РМЗ. При инкубации бактерий с гипохлоритоы натрия в концентрации 300 ыкМ выживаемость бактерий падала на два порядка и составляла IX соответственно. В то же время перекись водорода в концентрации 10 мМ. не оказывает влияния на инкубировавшиеся с ней бактерии.

Реакции, катализируемые миелопероксидазой и цитохром Р-450 содержащими системами, отличаются по своему механизму и по продуктам реакций. Поэтому нами был предложен метод расчета выживаемости бактерий, учитывающий различную активность ферментативных систем, генерирующих активные формы кислорода Суть этого метода расчета заключается в том, что при окислении одной молекулы NADPH цитохром Р-450 содержащими системами на кислород переносятся 2 электрона Такое жэ количество электронов использует миелоперок-сидаза для окисле ния одной молекулы тетрамзтилбенвидина и одного иона СГ. Исходя из этого, бактерицидное действие МЗ, РМЗ и мие-лопероксидааы можно выразить, как количество погибших бактерий в расчете на моль окисленного NADPH в случае Ш и РЬС или на моль окисленного тетраметилбензидина иди моль образовавшегося NaOCl в случае с ыиелопероксидазой. Таким образом расчет гибели бактерий на пару электронов, участвующих как в реакциях, катализируемых миелопероксидазой, так и в реакциях, катализируемых цитохром

зчссзво

Рис.1 Выживаемость бактерий Е. coll GA* 120 после инкубации с миелопероксидазой микросомами и РАК.

1 - миелспероксидагаСО. 6 нмоль/мл), 1мМ Ht02, 0,1М NaCl

2- шелопероксидаза(1мкМ), 1мМ Н.0»

3 - РМС(2,5нмоль/мл цитохрома Р-450, 215нмоль/мл

NADFH-эависимой редуктазы, 0,0257. змульген), 1мМ MADPH.

4 - микросомы печени кролика(2,5 нмоль/мл цитохрома

Р-450), 1м!Л IJADPH.

5 - 200 мкм гипохлорит Na

6 - 10 Ш HÄ „

В каждом эксперименте количество бактерий было 5*103 кл/мл.

Инкубационная смесь кроме указанных выше ингредиентов содержала 100 мМ Ne-фосфатный буфер рН=7.4. Инкубацию проводили при 2?аС. .

Еыяиваемость бактерий оценивали по числу образованных колоний и выражали в X по отношению к контролю; по оси абсцисс - время инкубации Е.coli с ферментативными системами.

Р-450 содержащими системами, позволяет учесть различие в активности этих ферментных систем и, следовательно, количественно оценить бактерицидность образующихся в них продуктов реакций. •

Таблица 1.

Количество погибших бактерий в расчете на перенесенные в ходе ферментативных рекций электрона

Время Ыикросош рис Ыиелоперок- Миелоперок-

реавдии сидаза сидаза

-МаС1 +N301

2 минуты 14.0+0.5 35. 0+0. 4 100.0+0. 6 570.0+1.3

5 Ы1шут 71.0+0.5 150.0+0. 5 2500.0+1. 9 33000.0+10.0

Активность макросом была равна 7тюль НАБРН/минлнмодь цитохрома Р-450, активность РЫС была равна 40 анодь »АОРН/минлимона цитохрома Р-460, активность миелопероксидазы была равна 2000 нмоль ТЫБ/шн*кшль фермента в отсутствии МаС1 и 3500 нмоль ТМЕ/шш*нь«одь фермента в присутствии МаС1. (Р<0.01)

Из результатов представлении в таблице 1 видно, что наибольшим бактерицидным действием обладает шелопероюидаза в присутствии ионов СГ. В отсутствии ионов хлора миелопероксвдаза окааыва-ет бактерицидное действие на несколько порядков швга. В то лаз вреыя растЕоришп монооксигеназнаа система и мккросомы печени кролика по сути дела не обладают бактерицидным действием. Эффек-

- и -

тивность бактерицидного действия.РМС при таком рассчете составляет всего десятью доли процента от бактерицидного действия миело-пероксидазы.

По всей видимости бактерицидный эффект, наблюдаемый при действии добавленного гипохлорита и дакций два порядка гибели багае-рий(рис. 1), хороио объясняет разницу между бактерицидным действием миедопероксидазы в присутствии и отсутствии 0,1 М ЫаСКтабл. 1). Образующиеся в ходе оксидазных реакций в микросомах и растворю,юй монооксигеназной системе активные формы кислорода такте шгут обладать бактерицидным действием, однако их эффективность крайне низка.

Ыутагенное действие миелшрокеидазы и растворимой моноок-сигензной система Мутагенный эффект миелопероксидазы и РМС исследовали в тесте Эйшса на 3-х шаммах Ба1гтспе11а ЫгурИутИит (ТА98, ТА100, ГА102). Ь!утагенныЯ эффект рассчитывали по количеству образованных цутантных колоний. В гачестве контроля наблюдали спонтанный мутагенез этих же штаммов, без инкубации с ферментами. Показано, что ниедопероксидаза в тесте Эймса обладает наибольшим модифицирующим действием на штамм ТА100, наиболее чувствительный к окислительной модификации ДНК, в которой происходит мутация со сдвигом рамки считывания. Для этого г» штамма наблюдается мутагенный эффект, но значительно более слабый, обусловленный действием РИС. Количество мутант них колоний было равно 1000 при действии на штамм ТА100 т-елопероксидазы, и 250 при исследовании мутагенного действия растворимой моноокеигеназноЛ снстеш. Ниедопероксидаза и Р1Ю огсазыва-

ют незначительный мутагенный эффект в тесте Эймса на штамм TAI02, также чувствительный к окислительной модификации ДНК. Число образовавшихся мутантних колоний в этом случае составляло 450 для ми-елопероксидааы и 370 для растворимой ыонооксигеназной системы. В то же время и миелопероксидаза и растворимая монооксигеназная система не оказывали: влияния на штамм ТА98, чувствительный к ал-килированию молекулы ДНК (рис.2).

В таблице 2 представлены результаты количественного анализа мутагенного действия РМС и миелопероксидазы на штаммы ТА08, ТА100 и ТА102 Salmonella thyphywurlum в расчете на каждую пару электронов перенесенных на кислород шш участвующих в образовании гипох-лорита.

Таблица 2.

Количество образовавшихся мутантных колоний в расчете на 2 перенесенных электрона.

Штаммы Salmonella Миелопероксидаза thyphymurium

РИС

. ТА 98 ТА 100

1,0 +0.1 (Р<0.01) 0,26 +0. 10 (Р<0.01) 0,4 +0.1 (Р<0.01) 0,2 +0.1 (Р<0.01)

О

О

ТА 102

Активность миелопероксидазы равна 3500 ншль ТШ/мин*нмоль фермента Активность РМО равна 40 нмоль HADPH/ мин*нмоль цитохро-ма Р-450.

Количество мутантных штаммов

ТА98 ТА 100 ТА102

Рис.2. Мутагеннноа действие миелопероксидазы и РМС в тесте Зймса

1 - контроль, 2 - миелопероксидаза, 3 - РШ

Используя данный метод расчета мо;кно видеть, что мутагенное действие миелопероксидазы и РЮ на штамм TAI00 составляет 1,90 и 0,26, а на пгтамм ТА102 - 0,40 и 0,20 колоний кг/тактов, соответственно. Полученный результат позволяет предположить, что в отличие от бактерицидного действия миелопероксидазы мутагенный эффект мо-яет быть обусловлен не только действием на молекулу ДНК гипохло-рита, вырабатываемого миелопероксидазой, но и другими кислородными радикалами, образованными при работе растворимой монооксигеназной системы. В то же время необходимо отметить, что различные штаммы Salmonella tnyphytrurium обладают неодинаковой чувствительн остью к действию активных форм кислорода, образующихся при работе этих систем. Так штамм ТА100 оказался более чувствительным к действию на ДНК гипохлорита. Действие на этот штамм кислородных радикалов, генерирующихся при работе растворимой монооксигеказной системы, составляет лишь 14Z от воздействия на него миелопероксидазы. В то же время отамм ТА102 более подвержен воздействию на ДНК активных форм кислорода, образующихся при работе растворимой монооксигеназной системы и этот эффект составляет 502 от действия на данный штамм миелоперксидазы.

Из результатов представленных в таблицах 1 и 2 видно, что при рассчете бактерицидного и мутагенного действия миелопероксидазы и растворимой монооксигеназной системы на пару перенесенных электронов, бактерицидное действие растворимой монооксигеназной системы ничтожно (ало по сравнению с таковым миелопероксидазы. Однако мутагенное действие РШ довольно высоко, особенно в отношении штамма ТА102. Существующую разницу в действии миелопероксидазы и растворимой монооксигеназной системы на бактерии можно об-

ъяснить тем, что основной вклад в бактерицидное действие вносит гипохлорит. мутагенный же эффект мотет вызываться действием различных форм активного кислорода

Действие активных форм кислорода на ДИК.

После того, как был обнаружен мутагенный эффект миелоперокеидазы и растворимой монооксигеназной системы, представляло интерес исследовать способность миелоперокеидазы и РМС модифицировать молекулу ДНК. Эти исследования проводились на ДНК плаамиди рВГ? 322, существующей в двух формах: суперспирализованной и в форме открытого кольца Плазмидную ДНК инкубировали с миелопероксидааой и растворимой монооксигеназной системой в течение 10 минут при 37° С. . После инкубации на дорожку агарозного геля наносили 10-30 мел инкубационной смеси. На рисунке 3 приведены деиситограммы элект-рофоретичесгаго разделения модифицированной плазмидиой ДНК Из полученных результатов видно, что миелопероксидаза оказывает модифицирующее действие на плазмидную ДНК как в присутствии ОДЫ КаС1, так и в его отсутствии. Модификация плазмидной ДНК выражается в том, что возникают разрывы суперспирализованной формы, ведущие к образованию кольцевых молекул, а затем разрывы в кольцевых формах, ведущие к образованию линейных форм , которые впоследствии, превращаются в нивкомолекулярные фрагменты. Причем, в присутствии 0,111 НаС1 фрагментация ДНК протекает более выраиенно. Растворимая монссксигеназная система тага® вызывает фрагментацию ДНК. ■ •

Тот факт, что миелопроксидаза и РШ, вызызают модификацию плазмидной ДНК, приводящую к разрывам целой молекулы н образова-

Рис.3 Злектрофореграммы ДНК после инкубации с миелопероксддаэой и РМС.

Инкубационная смесь содержала 10 мкг/мл ДНК, 100 мМ Na-фос-фатный буфер рН-7. 4(1), и 1 мМ mADPH, 2,5 нмоль/мл цитохрома Р-450, 2.5 нмоль/мл NADPH-редуктазы, 0,0251 эмульген 913(4), или 1 мМ Н О , 1 нмоль/мл миелопероксидагы(2) и 100 мМ NaCl(3). Инкубацию проводили в течение 10 минут при 37 с.

а - суперспирализованнал Форма ДНК, б - кольцевая форма, в - линейная форма, г - низкомолекулярные фрагменты ДНК.

■ - 1? -

нию низкомолекулярных фрагментов, без какой-либо специфичности, позволяет сделать вывод, что при модификации плазмидной ДНК рВК322 различные по своей природе кислородные радикалы не оказывают специфического действия на нуклеиновую кислоту. Более интенсивное действие на плазмидную ДНК, оказываемое миелопероксидазой в присутствии О, 1 М N801 по сравнению с действием растворимой монооксигеназной системы и ыиелопероксидазы в отсутствии 0,1 и НаС1, может быть объяснено тем, что эти ферментативные системы работают с различной скоростью и, соответственно, генерируют различное количество активных форм кислорода.

О помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой 1лс11гозогЬ ИР18 была исследована модификация ДНК тимуса крупного рогатого скота при действии на нее ыиелопероксидазы, как в присутствии 0,1 Ы ИаС1, так и в его отсутствии. Инкубацию ДНК с миелопероксидазой проводили при 37°С в течение 20 минут. После окончания инкубации, ДНК осаждали с помощью сульфата бария центрифугированием. Надоса-дочную аидкость в количестве 100 - 20О мкл наносили на колонку, уравновешенную рабочим буфером, содержащим в качестве ион-парного реагента 1 мы ТВА. Содержание нуклеотидов регистрировал! с помощью детектора с диодным полей при длинах волн 254 и 280 км. На рисунка 4 представлена хроматограмма разделения надосадочной жидкости после инкубации ДНК с миелопероксидазой. ВЭЖХ показала, что при действии миелопероксидаэы в присутствии 0,1 и N801 на ДНК тимуса крупного рогатого скота через 20 минут после начала реакции появляется низкомолекулярное соединение, соответствующее по времени выхода с колонки и по соотношению поглощения 280/254 нм ти-мину. фи отсутствии НаС1 в инкубационной среде не было обнаруже-

Время алпшш(мин.)

Рис. 4. БЭЖХ продуктов распада ДНК после ее инкубации с миелопероксидазой а - тимнн, избирательно вылепленный из ДНК после ее инкубации с миелопероксидазой.

С - смесь стандартных нуклеотидов после инкубации с миелопероксидазой.

в - смесь стандартных нуклеотидов без инкубации с миелопероксвда-зой.

1 - а^енин, 2 - цитидин, 3 - тимин, 4 - гуанин. Инкубационная смесь содержала 1 нмодь/мл миелопероксидазы, 1 мМ НА, 100 мМ »аС1, 100 мМ На-фосфатный буфер, и 10 мг/мл ДНК(а) или 10 мкг/мл каадого нуклеотида(б.в).

- 19 -

но появления Фрагшнтов этой фракции.

Цротеолитическое расцепление альбумина, обработанного ыие-допероксидазой.

Важным моментом для понимания механизма бактерицидного действия миелопероксидазы является исследование ее модифицирующего действия на белки. С этой целью исследовалась протеолитическая атакуемость альбумина протеазой К после его предварительной инкубации с ьжелопероксидазой. ШчкЯ сывороточный альбумин с молекулярной кассой 67 кДа инкуб!фовали с миелоперокскдазой в присутствии 0,1 U NaCl при 37°С в течение 10 минут. По окончании инкубации добавляли п реакционную смесь протеазу К из рассчета протеаза К/алъбушш 1:100 к инкубировали в течение 30, 60, 90 и 120 минут при 37°С. Затем 100 ьпсл инкубационной смеси наносили на колонку TSK G-2000 SW для гель-проникающей В320С. За появлением протеолн-тических фрагментов следили с подавав регистрации при 280 нм на детекторе с диодным поле>Дрис. Б). В таблице 3 приведены результаты протеолиза альбумина обработанного ыиелопероксидазой. Из полу-чйнных результатов видно, что со временен количество альбумина уменьшается по сравнению с контролен

В то йэ время появляются и со временем увеличивается количество низ1юнолекуляр:шзс фрагментов с шлакулярной >.!ассой 10 - 20 иД& ИйкуОация альбумина с миелоперокеидазой без последующего протеолжза но приведет к расцеплению белка(рис. Б, кривая 2).

15 30

Время элюции(мин.)

Рис.5. Гель-проникающая ВЭЖХ продуктов частичного протеолиза

альбумина.

Инкубационная смесь содержала: 1 - 100 мкг/мл альбумина, 1 мкг/мл протеазы К, 100 мЫ Na-фосфатный буфер рН-7.4. 2-100 мкг/мл альбумина, 1 нмоль/мл миелопероксидагы. 1мМ Нt0t, 100 Ш NaCl. 3 - в инкубационную смесь, описанную в пункте 2 добавляли протеазу К(1 мкг/мл) и инкубировали в течение 120 минут при 37°С.

Время элюции(мин.)

Рис,6. Гель-проникающая ВЭЯХ (а) и изоэлектрофокускрование в Оорат-полиольной системе (б) миелопероксидазы до (1) и после (2) каталитической реакции.

Инкубационная смесь содержала 1 нмоль/мл мтелопероксидааы, 1. мУ НлОл, 100 мы МаС1 в 100 мМ ^-фосфатном буфере. рН-7.4.

- 22 -Таблица 3.

Протеолиз модифицированного и нагивного альбумина под действием протеаэы К

Время протеолиза Содержание альбумина Содержание альбумина

после инкубации с не инкубировавшегося

миелопероксидазой с миелопероксидазой

(мин) (в процентах) (в процентах)

0 100 100

30 92 100 .

60 83 100

во 71 95

120 60 95

Самоинактивация миелопероксидазы.

Для исследования образования фрагментов миелопероксидазы при самоинактивации была использована гель-проникаюшзя БЭЖХ и изоэ-лектрофокусирование в борат-полиольной системе. На рйс.ба показана хроматограмма разделения миелопероксидазы после инкубации ее с перекисью водорода и ионами хлора в течение 10 минут. Обнаружено образование низкомолекулярного фрагмента с молекулярной массой около 10 кДа. Однако в этой фракции иожзт содержаться не один пептид, а несколько. Метод изоэлектрофокусирования в борат-полиольной системе позволяет определить очень небольшие количества низкомолекулярных петидов и мы использовали его для обнаружения

таковых при самоинактивации миелопероксидазн. Как видно из рис. бб при изоэлектрофокусировании саыоинактивированной миедолероксидааы наблюдается появление фрагмента миелопероксидазы с иэоэлектричес-кой точкой 6,3.

ВЫВОДЫ

1. Бактерицидное действие миелопероксидазы объясняется генерацией гипохлорита, а не действием других активных форм кислорода. Монооксигеназные цитохром Р-450 содержащие системы не обладают бактерицидным действием.

2. Активные формы кислорода и гипохлорит, генерируеше ше-лопероксидазой и растворишй »гонооксигеиааиой системой, обладает мутагенным действием.

3. Гипохлорит и активные формы кислорода, генерируемые ыие-лспероксидазой и растворимой монооксигеназной системой, модифицируют молекулу ДНК плазмиды рВК 322 с образованием разрывов молекулы и появлением низкомолекулярных фрагментов. Гипохлорит способен избирательно вылеплять иа молекулы ДНК тииин.

4. Генерируемый миелопероксидазой гипохлорит увеличивает протеолитическуп атакуемость альбумина.

Б. Сашинактивация миелопероксидазы в процессе катализа сопровождается образованием низкоыолекудярного фрагмента.

- 24 -

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Khallov P.M., Sivov I. а , Adrianov N. V. Bactericidal and mutagenic effect of hypochlorite and active oxygen forms generated by myeloperoxidase and soluble reconstituted monooxy-genase system.// tru Biochemistry В biophysics of cytochrome P-450; structure and function, biotechnological and ecological aspects. Abstracts of 7-th international conference, Moscow.-1991-p. 27.

2. Хайлов П. II, Сивов И. Г.. Адрианов К Е Бактерицидное действие микросом, растворимой реконструированной системы и миелопе-роксидагы лейкоцитов крови человека. //В кн. Цитохром Р-450 и модификация макромолекул. Теаисы докладов V Всесоюзной конференции. Ялта. -1989-с. 64.

а Хайлов II ML. Захаревко Е И.. Воронин Е. И Кодификация ДНК в реконструированной моноокситенагной системе и под действием ми-елопероксидазы лейкоцитов крови человека. // В кн. Цитохром Р-450 и модификация макромолекул. Теаисы докладов V Всесоюеной конференции. Ялта. -1989-с. 63.

4.Адрианов Н.&, Довгмй А.И., Хайлов ИМ.// Влияние фенобарбитала и амидопирина на скорость распада иаоформ цнтохрома Р-450 в микросомах печени мышей. // Биохиыия-1989- Т. 54-ВЫП.7-С. 1120-1126.

Б. Khailov P. М.. Sivov I. G., Zakharenko V. N.. Adrianov N. V., Archakov A. I.// The role of active oxygen forms In modification of macromolecules and bactericidal action of the human leucocyte myeloperoxidase.// Biomedical Science - 1991 - in press.