Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация белков для транспорта биологически-активных веществ в клетку

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модификация белков для транспорта биологически-активных веществ в клетку"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ЙАУЧНШ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи УДК 577.15:541.182:541.128

СЛЕПНЕВ Владимир Иванович

МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКСЗ ДЛЯ ТРАНСПОРТА ЕИОЛОП1ЧЕСКИ-АКТКВНЫХ ВЕШЕСТВ В КЛЕТКУ

Специальность: 03.СО.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соясканиз ученой степени кандидата хпмическгс нау;:

Носкза - 1532

с?

Работа выполнена в отделе химической инженерии Всесоюзного научного центра молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ).

Научный руководитель: д.х.н., зав.отделом

химической инженерии ВНШШ1 А.В.Кабанов

Официальные оппоненты: д.х.н. Породенко Н.В.

д.м.н. Чехонин В.П.

Ведущая организация: Институт молекулярной

биологии РАН

Защита диссертации состоится "2" апреля 1992 года в часов на заседании специализированного Ссвета Д 074.51.01. при Всесоюзном научном центре молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР по адресу: Москва, Симферопольский бульвар, 8. ВН1ШДЛ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (ВНЦМДЛ). Автореферат разослан "¿В" февраля 1992 года.

.Ученый секретарь специализированного Совета,

кандидат биологических наук В. В. Отраднова

•

-дел ртацкЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Развитее современной медицины требует разработки методов направленного транспорта лекарственных веществ. Один кз ключевых аспектов этой проблемы - целевая доставка биологически-активных вещестз з клетку. Поскольку, большинство макромолекул и гидрофильных низкомолекулярных веществ поглощенных клеткой в процессе зндоцитоза не способно преодолевать меибраяный барьер и проникать в цитоплазму, где обычно реализуется их биологически!! эффект, эти методы должна обеспечивать эффективный транскембранный перенос везеств. Применение большинства нетодоз введения белкоз в клетку ограничено узкими областями исследований и, эти методы не могут быть адаптнрозаны для транспорта веществ в организме.

3 качестве одного из подходоз для решения этой проблемы кедазно был предло.-еп метод искусственное гидрофобизации белкоз путем их ацилкрования остатками хирных кислот. Подобная модификация ведет к усилению мембранной активности белка, и, з частности, обеспечивает его транслокацию через модельные лп-пидкые y.eiíCpaau. Введение в молекулу белка нескольких жирно-кислотных остатков значительно увеличивает антапролиферативный эффект токсинов; и усиливает подавление репродукции вирусов в клетках специфическими антителами. Кроме того, з экспериментах in vivo гидрофобизация придает гаЬ-фраплентам антител способность проникать через гематоэнцефалический барьер в мозг. В то же время механизмы усиления биологической активности и транспорта гидрофобизованных белков з клетку до настоящего времени остаются неизученными.

Помимо этого представляется целесообразным, изучение транспорта белков, модифицированных амфифильными молекулами полимерных ПАВ, в частности блоксополимераки псли(оксиэти-лена)-поли(оксипропилена) - плюроникамк. Подобные ПАВ, благодаря своей низкой токсичности и часто низсой иммуногенности находят широкое применение в рецептурах искусственной крови. Благодаря своей амфнфнльной природе, плюр о кики растворяются, как з органической, так и з водной средах. Кроме того, известно, что' полиоксизтилены способны индуцировать процесс слияния мембран. Поэтому, есть основания предполагать, что конъюгация с плароникои существенно изменит мембранную актизнссть модифицируемого белка.

ОСНОВНАЯ ЦЕЛЬ РАБОТУ • заключалась з . исследовании ¿:е- ' хакизмоз транспорта в клетку белков модифицированных остатками жирных кислот п полимерными ПАВ (пляроникаш:).

НАУЧНАЯ НОЕПЗйА РАБОТЫ. В работе изучены закономерности транспорта белков кодифицированных остатками жирных кислот и молекулами плюрониха Р85. Установлено, что транспорт в клетку белков, модифицированных остатками жирных - кислот протекает ьо зндоцитозкоыу механизму и не сопровождается транолокацией е цитоплазму. Показано, что гидрофобизация белка усиливает его связывание и эндоцитоз клеткой. На примере а2-1штерферона продемонстрировано усиление биологической активности г результате введения остатка стеариновой кислоты за счет усиления специфического связывания с рецептором.

На примере пероксидазы, модифицированной ялкроником Р85 показана возможность придаю:я белку способности проникать з цитоплазму клетки. Продемонстрирована возможность транспорта в цитозоль кизкомолекулярных веществ путем - встраивания их в мицеллы полимерного ПАВ. Показана возможность усиления транспорта в клетку вещестБ, солюбилизированных в мицеллах плюроника за счет встраивания лиганда, способного взаимодействовать с клеточным рецептором.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Предложенный в работе метод транспорта в клетку веществ, ассоциированных ' с мицеллой полимерного ПАВ позволяет использовать данный подход для создания систем направленного транспорта физиологически-активных веществ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты были далсжены и о5-сувдекы на международных конференции:: 1-ом Совместно.'.; ссвэт-ско-япоиско-китайском симпозиуме. "Успехи химии полимеров", Москва (1991), 2-ой Советско-итальянской конференции по полимерам, Ленинград (1991), 2-ой конференции Института "Биомедицинская стратегия против СПИД?.", Кране Монтана, Швейцария (1991), 2-оЯ конференции ЮНЕСКО "Км.г/нология, вирусология и общество", Киев (1991).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа

изложена на _страницах машинописного текста к 2кл:счазт А

таблицы и 16 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3 этом разделе рассмотрены основные закономерности транспорта белков в клетку путем рецептор-опосредованного и хид-кофазкого / зндоцитоза» Проведен анализ существующих методов введения белков з цитоплазму клеток. Рассмотрены процессы природной и искусственной модификации белков остатками мирных кислот. Проведен анализ связи такой модификации с изменением биологической активности белков. Рассмотрены примеры использования блок-сополимеров полиоксизтилена и полиок-сипропилена для транспорта веществ в клетку и в условиях in vivo.

РАЗДЕЛ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

В этом разделе описаны методики получения белков модифицированных остатками гкрных кислот в системе обращенных мицелл ЛОТ з октане (в частности, перокскдази, антител, ^-интерферона). Приведены методики изучения зндоцитоза пероксидазы, основанные на измерении ее ферментативной активности; изучения локализации пероксидазы в клетке методами гистохимии; модификации белков молекулами плюроника Р85, включения веществ з мицеллы плюроника и изучения транспорта в клетки методом флуоресцентной микроскопии.

РАЗДЕЛ 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Глаза 3.1. Влияние искусственной гидрофобизации на

связывание и транспорт пероксидазы в клетку.

В качестве одного из объектов исследования выфана перок-сидаза - белок, часто используемый в качестве маркера зид-ксфазного рецептор-независимого зндоцитоза. Количественное определение белка з этом случав построено на спектро-фотометрическом определении его активности.

Лри использовании з качестве реакционной среды системы обращенных мицелл аэрозоля ОТ (натриевая соль ди-(2-этил)гек-

силового эфира сульфояной кислоты) (А.В.Кабанов, 1984) проведена модификация пероксидазы хлорангидридами жирных кислот (стеариновой, пальмитиновой, лауриновой). Модификация в этих условиях протекает с высоким выходом. Число введенных в молекулу белка жирнокислотных остатков (определяемая титрованием свободных аминогрупп и по радиоактивности белка) при использовании радиоактивно меченных жирных кислот задается соотношением [хлорангидрид]/[белок] в реакционной системе. Модифицированная пероксидаза сохраняет около 50% каталитической активности.

Изучено влияние модификации жирными кислотами на связывание и эндоцитоз пероксидазы с клетками МБСК (эпителиальные клетки почек собаки), ОНО (клетки яичника китайского хомячка) и Х-63 (мышиная ыиелома). С этой целью клетки инкубировали с пероксидазой,' отмывали, . лизировали и определяли по ферментативной активности количество связавшейся с клетками пероксидазы. Полученные результаты иллюстрируются в автореферате примерами нативной и стеароилир'ованной (содержащей 1.0 жирнокислотный остаток на белковую глобулу) пероксидазы.

3

перокси-

даза, : нг

4

МОСК

стеарои-лирован-кая

нативная

Рис.1. Связывание нативной и стеароилированной пероксидазы с

клетками при 4°С и 37°С. Концентрация пероксидазы 20 ыкг/мл (5-Ю"'' М), время инкубации пероксидазы с клетками (1'105) в бессыворотечноЕ среде - 3,5 ч. Здесь и далее средняя ошибка измерения количества ассоци-

ированной с клеткой пероксидазы по результатам 3-5 независимых экспериментов не превышает 20%.

Известно, что при низких температурах (4°С) эндоцитозный транспорт з клетку не происходит. 3 этих условиях вся связавшаяся с клеткой пероксидаза (Рис.1) локализована на поверхности клетки. Обработка клеток протеиназой К приводит к удалению пероксидазы с клеточной поверхности (данные не приведены на рисунках). При 3?°С общее количество пероксидазы, связанной с клетками, равно сугае количеств адсорбированного на поверхности поглощенного з ходе эндоцктоза белка. В этом случае посла обработки клеток протеиназой К происходит уда-ленке адсорбированной пероксидаза, а ккгеряадазованный белок (недоступный действии прстеиназы) остается. Это обстоятельство лежит з оснозе использованного нами метода определения коли-чзств адсорбкрозакной и интернализованной пероксидазы.

Как зидно из рис.1 введение остатка стеариновой кислоты приводит к существенному повышению общего количества связанной с клеткой пероксидазы. При 4°С с поверхностью одной клетки связывается от 1.65-10^ до 4.5*10^ молекул стеароилированного белка. Кемодифшзгрозанная пероксидаза з этих условиях с клеткой практически не связывается.

Как зидно из рис.2 при 37°С значительная часть (-25-30%) связавшиегося с ::леткоЯ гндрофобизованного белка адсорбирована на плазматической мембране. В случае немодифицирозанной пероксидазы такой адсорбции не происходит. Наряду с усилением связывания с неточной поверхностью введение жирнокислотного остатка приводит к усилению эндоцитозного захвата пероксидазы в клетку при 37°С. Кинетика связывания и эндоцитоза нативной и стеароилированной пероксидазы иллюстрируется рис.3. Взаимодействие стеароилированного белка с клеткой существенно блокируется в присутствии сыворотки, по-видимому, из-за наличия в ней белков, способных' к связыванию жирных кислот (альбумина, овальбуминов, а^-макроглобулинов).

перокси-даза, нг

4 т 1 ■

)

3.5 -3 -■ 2.5 •• 2 -1.5 •• 1 -■ 0.5 •• О

О 1 □ 2'

4°С

37°С

интерн.

Рис.2. Связывание и эндоцитоз нативной (1) и стеароилиро-вакой {2)пероксидазы с клетками СНО. Условия эксперимента см. в подписи к рис.1. Бремя инкубации пе-роксидазы с клетками - 3,0 ч. Количество ингерали-зованной пероксидазы (поглощенной клеткой б процессе эндоцитоза) определялось после удаления адсорбированного на клеточной поверхности белка проте-иназой К (0°С).

Внутриклеточную локализацию нативной и стеароилированной пероксидазы изучали гистохимически с псмощыо реакции пероксидазного окисления 5,5'-дааминобензидина. Нерастворимый продукт этой реакции (оранжево-бурого цвета) обнаруживается при микроскопическом исследовании фиксированных клеток в местах локализации фермента. Как нативная так и стегроилиро-ванная пероксидаза локализованы в везикулах (размер от 0.2 до 3 мкм). Это свидетельствует о том, что интернализованный фермент находится в эндоцитозных компартментах клетки. Проникновения нативной и стеароилированной перксидазы в цитозоль (характерное диффузное распределение продукта окисления 5,5'-диаминобензизина) не наблюдается.

перок-сндаза, нг

Рнс.З.. Ккнгтика связывания с клеткой (2,3) п эндонптоза (1,4) :"":гнноГ? (1,2) л стегронлнргз&кноз (2,3) пгрс::-схдгзы клеткам;: КВС1 л?:? 3~°С. Услсгкя эксперимента

С. 2. / .•*•=::* г;дрзфсбп?а1Т1:: на

¿за-г^слепо-'гьие с клегк;^.::^.

.'.СД-:^ГУ.ЗЦГ:Я 7-СТЕГХаМй кзрных кислот юшщаых ыснокяональ--чых атлтал к пероксвдазе (1=С) также, как и в рассмотренном выше случае персксидазы, приводит к существенному увеличению связывания белка с клетками (рис.4). Зффект усиления связывания зависит от типа используемых клеток. Так, в частности, усиление связывания антител в результате их модификации остатками пальшгтиновой кислоты составляет в случае клеток Х-63 -50 раз, а в случае клеток МВСК только -30 раз. В отличие от эпителиальных клеток ШХЖ клетки мшиной мисломы X-63 содержат, • по-видимому, Рс-рецепторы, обеспечивающие специфическое взаимодействие антител с клеточной поверхностью. За счет этого, вероятно, связывание немодкфицированных антител

Эксперименты проведены в лаборатории соматической генетики Института Пастера (Париж) соэкстно с Д-м

Г'/ДОМ Л П:;г:.,. .З'-.'Т'-ЭНСМ.

с клетками Х-63 существенно более вырахеио, чем в случае клеток ШХЖ (рис.4). Не исклпчено, что связывание гидрофобизованных антител с клетками Х-63 обусловлено их двухцентровым взаимодействием с липидной частью мембраны и Рс-рецептороыи. (Возмохность такого взаимодействия рассмотрена ниже на примере «з-интерферона). В случае, клеток ЮХЖ двухцентрового взаимодействия гидрофобизованных антител с клеточной поверхностью не происходит. ~

Количество связанных антител, 1000 мол./кл.

нат. стеар.пальм.

олеин.

Рис.4. Связывание с клетками и ШХЖ и Х63 нативных и модифицированных 1гС при'37°С. Условия эксперимента: время инкубации с клетками в бессывороточной среде 3.5 ч, концентрация - 20 мкг/мл. Степень модификации 1еС: 5.0±1.0 (стеариновая кислота), 6.0±1.0 (пальмитиновая кислота), 10.0±2.0 (олеиновая кислота).

Эффективность связывания гидрофобизованных антител зависит от природы гидрофобного якоря. В частности, при почти одинаковой степени модификации пальмитоилированный белок связывается с клетками лучше, чем стеароилированный.

Мы исследовали возмохность транспорта монсклональных антител Р04.05 (Европейская лаборатория молекулярной биологии (ЕМВЬ)) в цитоплазму клеток ВНК (клетки почек китайского хомячка), зараженных вирусом везикулярного стоматита (УБУ). Антитела Р04.05 специфичны к цитоплазматическому домену С-

белка вируса VSV, который присуствует в G-белке при его транспорте из эндоплазматического ретикулума (ЭР) в Гольдхи, однако, исчезает в ходе дальнейшего пршессинга белка при его транспорте в плазматическую мембрану. Известно (T.Kreis, 1984), что введение антител Р04.05 в цитоплазму зараженных клеток методом микроиньекции блокирует транспорт бежа в Голь-джи и сборку вирусных частиц.

Для изучения транспорта G-белка из ЭР к плазматической мембране использует температурочувствительный мутант VSV-ts 045 (ЕШЬ). Температурная чувствительность этого штамма VSV проявляется в том, что при температуре 39.5РС происходит заражение клеток ВНК," синтез вирусных белков, но блокирован транспорт белков из ЭР. При уменьшении температуры до 32°С начинается экзоцитоз вирусных белков, который макет быть зарегистрирован методом иммунофлуоресценцин с использованием поликлокальных антител к G-белку (K.Simons et al., 1982). При использовании этой системы мы убедились что добавление к клеткам, как натизных, так и модифицированных 3-4 остатками гхнрной кислоты (стеариновая, пальмитиновая) антител Р04.05 не приводит к нарушению транспорта G-белка. и уменшению титра вируса з среде. Полученные данные свидетельствуют о том, что модифицированные антитела не транслоцируются в цитоплазму зараженных клеток.

Глава 3.3. Усиление биологической активности a2~!iHTeP®sP0Ha в результате его модификации остатками жирных кислот.

Как видно из данных, представленных на рис.5, интерферон обладает способностью ингибировать пролиферацию клеток линии Jurkat (Т-лЕмфома человека). Мы обнаружили, что модификация аминогрупп в. колехуле интерферона одним остатком стеариновой кислоты прзводчт к почти 1000-кратному усилению ан-типролк^аретявной, активности этого белка (рис.5). Одноцземенно с усилением биологической активности, моявфякацня интерферона сопровождается значительным (в ~15 раз) увеличением его специфического связывания с клетками Jurkat (Рис.6, Таблица 2), при этом не происходит существенного изменения числа мест связывания.

^ концентрации интерферона {ч/л)

Рис.5. ' Влияние нативногс(1)и модифицированногс{2)( 1 остаток стеариновой кислоты на молекулу белка) «^-интерферона человека на пролиферацию клеток линии «1игка1;. Условия эксперимента: 5-10^ клеток/мл; 24 часа инкубация б среде ЕРШ-1640+10% фетальной сыворотки плода коровы, 2 мМ гдутамина, 37°С. Число клеток определялось с помощью гемоцитометра. Каждая точка представляет собой среднее значение Б измерений в 2-х независимых экспериментах.

Поскольку проявление биологической активности интерферона коррелирует со степенью заполнения рецепторов, усиление специфического связывания для модифицированного белка, по-видимому, усиливает его антипролиферативное действие при низких концентрациях.

2003 т

Связывание ИКТер^еГЗ-

Кс., мох./к'..

1300 т

150? i

КОС -'-^ ^ i 1200 -

1300 -i

8S3

общее

спештф.

неспзцп:?.

Рис.5. Связывание нативного (1) и стеароилированного (2) (1 остаток стеариновой кислоты на молекулу белка) (^-интерферона человека с клетками линии Лигка1. Условия эксперимента: 5-10"Ю М интерферона, 100- (клеток/мл), 19°С; время инкубации 1 час. Для определения специфического связывания использовался ЮС-кратнк" молярный избыток немеченного интерферона.

Таблица 2. Характеристики сзязызания нативного и стеароилированного интерферона с клетками Лпгкаг.

_Касс (Уг'П_п

нативный 2.8(±0.4)-103 44SG±64G

стеароилированный 4.3(±0.6)-10s 631Q+55C

Мы полагаем, что явление усиления специфического связывания интерферона в результате его модификации остатками жирных кислот обусловлено следующим. Введении остатка жирной кислоты усиливает связывание интерферона с мембраной. При этом модифицированный интерферон, по-видимому, способен к быстрой латеральной диффузии, характерной для белков, связанную с мембраной с помощь» липидного якоря (M.C-.Lov? and A.R.Saltiel, 1988). 3 этих условия:: за счет концентрирования

модифицированного интерферона на плазматической мембране происходит увеличение его кажущейся константы связывания с рецептором. Иными' словами, введение гидрофобного якоря приводит к двухцентровому связыванию интерферона с липидной частью мембраны и рецептором.

По-видимому, именно такой механизм лежит в основе обнаруженного ранее (В.Ю.Алахов, А.В.Кабанов, 1989) эффекта усиления антипролиферативной активности i стафилококкового эн-теротоксина А в результате его модификации остатками стеариновой кислоты. Не исключено также, что этим объясняется и широко известное влияние природной модификации жирными кислотами на биологическую активность белков (например, на трансформирующею активность Ras-белка).

Глава 3.4. Мицеллы плюроника Р85 как микроконтейнеры

для транспорта з. клетку солюбилизованных в них низкомолекулярных Ееществ.

В работе исследована возможность усиления- транспорта в клетку низкомолекулярных веществ (адекозинтрифосфат (АТФ), флуорзсцеин) в результате их солвбилизации в мицеллах плвронк-ка Р-85 (блоксополимер поли(55)(оксипропилен)-диполи(15)(окси-этилен)). В водных растворах при концентрациях больших 0.01% плюроник Р85 образует мицеллы. Размер мицелл плюроника, определенный методом квазиупругого светорассеяния при 25-37°С составляет 12-15 нм. Молекулы низкомолекулярных зедеств (например, флуоресцеина) способны встраиваться в мицеллы плюроника, при этом размер мицелл практически не изменяется.

Как показали эксперименты на клеточных линиях MDCK, Jurkat, ЗТЗ, плюроник Р85 не влияет на выживаемость клеток при концентрациях вплоть до 1% в течение нескольких часов в бессывороточных средах, и в течение нескольких суток в присутствии 10% сыворотки. Эти отличает его от большинства известных ПАВ, поскольку, обычно при концентрациях вьше ККМ происходит быстрый лизис клеток., Низкая токсичность плкроника, таким образом, позволяет использовать его для создания транспортных систем in vitro.

В качестве модельного соединения был использован АТФ. Хорошо известно, что отрицательно заряженные молекулы АТФ не способны проникать через клеточную мембрану и выступать в ка-

честве субстрата для внутриклеточных протедааз. Поэтому, при инкуб алия меток с низкими концентрациями ?[32р]-АТФ наблюдается включение метки в белки локализованные на внешен стороне плазматической мембраны клетки (экто-фосфорилирование).

5000 г

Включение [32р] в. клеточные белки, ерш

4000

3000

2000

1000

-I 120

I

I

100

80

60

40

20

Выживаемость

клеток, %

Рис.7. Включение [32р] в клеточные белки (п) и выживаемость клеток линии Jurkat в водном растворе (1), в присутствии 1 % плюроника Р85 (2), и смешанных мицелл (3) плюроник . Р85/ДА (17. Р85, 0.002 мг/мл ДА). Условия эксперимента: концентрация клеток - клеток/мл,

время инкубации 30 мин., концентрация [7-32Р]АТФ = 2 нМ (2мкКи).

Мы исследовали влияние плюроника Р85 и смешанных мицелл плюроника Р85 додециламин {ДА) --на фосфорилирование клеточных белков т[32р]-АТФ. Данные, приведенные на рис.?, показывают, что сам плюроник не влияет на фосфорилирование в то время, как в присутствии смешанных мицелл наблюдается почти 5-кратное увеличение включения 7[^2р] в клеточные белки.

О

Обработка клеток целочной фосфатазол после добавления меченного А7Р приводит к дефосфорилированию белков на клеточной поверхности (Рис.8). Б тоже время, з случае смешанных мицелл плкроника Р35/5А, дефосфорилирование значительно менее выражено. Таким образом з этих условиях происходит фос-форнлироЕанне зкутриклеточных белков. Исследование спектра фссфорплнрозаниых белков показывает, что з присутствии мицелл плароника Р85/ЛА 2 дополнение к полосе наблюдаемой для клеток инкубированных с АТС1 z водном растворе появляются нсзые полосы, наблюдаемые з случае фосфорилирования клеточного ли-зата и предположительно относящиеся к внутриклеточным белкам.

2000 ,-;-,-,-,-,-, Я000

С 1-----:----' О

0.0 0.1 0.2 О.г 0.4 0.5 0.6 Концентрация щелочной фосфгтазы (м2/мл)

Рис.8. Дефосфорилирование поверхностных белков при обработке клеток линии Лигка1 сщелочной фосфгтазой (0.5 часа при 0°С). Клетки инкубировались с [т-32р]АТФ 2пМ) в водном растворе (1) или в 1% растворе плсрони-ка Р85, содергащего 2 мкг/мл. додешиакина (2) при

• 37°С в течение 15 минут.

>

Следует отметить, что з присутствии мицелл плюроника Р85/ДА скорость гидролиза АТФ не меняется, и факт увеличения включения метки в клеточные белки не мокет быть отнесен за

счет транспорта меченного фосфата.

Усиление транспорта 7[32Р]-АТФ в' клетку мохет объясняться нарушением клеточной мембраны (пермеасилизацией) ;г облегченно:-диффузией меченного ATO э клетку. Мы изучили влияние мицелл пг секреция внутриклеточного АТФ (Рис.9). Как видно приведенных данных, ни плюроник. ни его смеаанкз мицеллы с ДА, не ускоряет выброс внутриклеточного АТФ во знспнкэ среду за используемое для изучения фосфорилирования время. Напротив, при более длительны;: временах инкубации с мицелла;.::; наблюдается шггибирование выброса АТФ. Эти данные свидетельствуют о том, что з -присутствие мицелл плюроника не происходит пермеабилизации клеток.

Время (мин.) Время (мин.)

Рис.9. Кинетика секреции клеточного АТФ (А) и изменения внутриклеточного уровня (АТФ в клеточном лизате) (В) при инкубации клеток .1игка1 в водном растворе (о). 1% растворе плюроника Р85 (о), или 1% растворе плюроника содержащего 2 мкг/мл додециламина (V). Условия эксперимента: 1 млн. клеток/200 мкл, 37°С.

Мы полагаем, что наблюдаемое язление транспорта меченного АТФ в клетку связано с включением АТФ в смешанные мицеллы, которые в своя очередь, захватываются в клетку в результате эндоцитоза.

Взаимодействие мицелл с клетками может быть усилено в результате включения в состав мицеллы лигандов, способных к связыванию с клеточными рецепторами. В качестве такого лиганда мы

15

использовали стафилококковый энтеротоксин В (SEB). Для встраивания в мицеллы SEB коньюгировали с плюроником Р85 (с этой целью концевые гидроксильные группы плюроника окисляли до альдегидных. Окисленный плюроник пришивали к аминогруппам белка, используя реакцию восстновительного алкилирования). Полученный коньюгат встраивали з мицеллы простым смешением компонент мкцеллярной системы. В работе изучено влияние SEB на транспорт солюбилизоЕакного в мицеллах флуоресценна в клетки Jurkat к MDCK. Методом флуоресцентной микроскопии показано, что включение SEB в мицеллы значительно усиливает захват солюбилизозанного красителя е эти :слеткк при 37°С. Захваченный таким образом краситель локализуется в ' эндоцитозных компартмектах клеток, четко проявляющихся на флуоресцентных микрофотографиях. При нкзких температурах (4°С) в условиях, когда зкдоцитоз не происходит, усиления захвата сша-билизованного флуоресцеина не наблюдается.

Известно, что клетки Jurkat содержат рецептор к стафилококковым знтеротоксинам, отвечающий за их зндоцитоз и проявление токсического эффекта (В.О.Алахоз, 1989). Рецепторы стафилококковых энтеротокскнов описаны также к для эпителиальных клеток. Не исключено, что включение SEB з состав мицзлл направляет мицеллы по эндоцитозному пути токсина.

Глаза 3.5. Влияние модификации плюроником Р85 на транспорт перокскдазы в клетку.

Влияние включения белка в мицеллы плюроника Р85 на его транспорт в клетку было изучено. на примере пероксидазы. Коньюгирование пероксидазы с молекулами плюроника проводили так, как это описано выше для SEB. Включение полученного коньюгата в мицеллярные агрегаты регистрировали методом электронной микроскопии. . По данным квазиупругого светорассеяния солюбилизация коньюгата не приводит к существенному изменению размера мицелл плюроника.

Изучение взаимодействия модифицированной перокскдазы с клетками Jurkat и MDCK проводили так, как это описано в главе 3.1. Модификация пероксидазы плюроником не приводит к изменению уровня ее связывания с клетками и эндоцитоза. Вместе с тем по данным гистохимического исследования после инкубирования клеток о мицеллами плюроника, содержащими коньюгат пероксидазы

и плюроника, продукт пероксидазной реакции обнаруживается как в эндосомальных везикулах, так и в цитоплазме (диффузное цитоплазматическое окрашивание). Это свидетельствует о выходе части коныэгата в цитозоль, по-видимому благодаря частичному лизису эндоцитозных везикул. Подобного явления не наблюдается в случае нативной пероксидазы как в'водном растЕоре, так и в растворах плюроника. Включение в состав мицелл, содержащих пероксидазу, SEB или ДА приводит к усилению цнтоплазматического окрашивания. Таким образом включение белков в мицеллы плюроника может быть использовано для доставки этих белков в цитоплазму интактных клеток.

ВЫВОДЫ

1. На примерах пероксидазы, рекомбинантного аз-интерферона и IgG показано, что искусственная гидрофобизация белков остатками жирных кислот приводит к значительному усилению их связывания с клеточной мембраной и эндоцитоза в клетки (Х63, MDCK, СНО, Jurkat).'

2. На примерах пероксидазы и антител к G-белку VSV показано, что искусственно гидрофобизованные белки (не способные к рецептор-опосредованному транспорту в -клетку) в ходе эндоцитоза захватываются в эндоцитозные компартменты, но не проникают в цитоплазму.

3. Обнаружено явление значительного усиления ангипроли-феративной активности и специфического связывания рекомбинантного о<2-интерферона в результате его искусственной гидрофобизация остатками жирных кислот. Это явление объяснено в рамках модели двухцентрового связывания модифицированного белка с липидной частью мембраны и специфическим рецептором.

4. Для повышения эффективности транспорта белков в клетку предложено проводить их химическую модификацию амфифильными блоксополимерами окисей этилена и пропилена (плюрониками). На примере пероксидазы впервые показано, что такая модификация приводит к значительному -усилению проникновения белка из эндоцитозных кояпартментов клетки в цитоплазму.

5. Показана возможность использования мицелл плсроника в качестве мшсроконтейУеров для транспорта в клетку солюбили-зованных в мицелле низкомолекулярных веществ (АТФ, флу-оресцеин). Показано, что усиление транспорта этих веществ не

сопряжено с пермеабилизацией клеточной мембраны в присутствии плэроника. Для усиления захвата в клетку мицелл и соли-

молекулы способные к рецептор-опосредованному эндоцитозу (например, стафилококковый энгеротоксин В).

1. Kabanov Y.A., Kabanov A.Y., Batrakova E.V., Slepnev V. I., Nazarcva I.R. New macrcmolecular system for targeting of bioactive corapaunds. Abstr. of Ist China-Japan-USSR joint symp. on advanced polymers, Moscow, Sept. 1991, p.A.28a-

2. Kabanov V.A., Kabanov A.V., Batrakova E. V., Slepnev V. I., Nazarova I.R. New polymer system for transport of bioactive compounds. Abstr. of Second Soviet-Italy polymer meeting, Leningrad, Sept. 1391, p.3f.

3. Kabanov A.V., Melik-Kubarov N.S., Slepnev V.I., Batrakova E.V., Vinogradov S. Drug transport through cell membrane and hematoencepualic barrier, Institutia la Vie, Inter, national conference "Biomedical strategy against AIDS".

Crans Mountana (Switzerland), 1991, p. 131-132.

4. Slepnev V. ¡., Mel ik-llubarov K.S., Kabanov A.V., Protein ra-diolabeling with Bolton-Hunter reagent in the system of Surfactant Reversed micelles in organic solvent. Bioconjug. Chemistry, 1992, in press.

5. V.I. Slepnev, L.E. Kusnetsova, A,K. Gubin, E.V. Batrakova, V.Yu. Alakhov, A.V. Kabanov. Micelles of poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene) block copolymer (pluronic) as a tool for low-molecular compound delivery into a cell: proshorylation of intracellular proteins with micelle incorporated [t-32 P] ATP.Biochemistry International, 1992 in press.

6. A.V. Kabanov, V.I.Slepnev, L.E.Kuznetsova, E.V.Batrakova, V.Yu.Alakhov, P.G.Sveshinov, 'V.A.Kabanov. Pluronic micelles as a tool for low-nolecular compound vector delivery into a cell: Effect of Staphylococcus aureus enterotoxin B on cell loading rath fluorescent dye. Biochemistry International, 1S92, in oress.

билизозанных в них веществ предложено встраивать в мицеллы

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях.

А.23Ь.