Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модельное и экспериментальное исследование процесса генерации миниатюрных токов концевой пластинки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Модельное и экспериментальное исследование процесса генерации миниатюрных токов концевой пластинки"

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

#

/

На правах рукописи

КОВЯЗИНА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

МОДЕЛЬНОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГЕНЕРАЦИИ МИНИАТЮРНЫХ ТОКОВ КОНЦЕВОЙ ПЛАСТИНКИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казакь-1998

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КОВЯЗИНА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

МОДЕЛЬНОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГЕНЕРАЦИИ МИНИАТЮРНЫХ ТОКОВ КОНЦЕВОЙ ПЛАСТИНКИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-1998

Работа выполнена в Казанском институте биологии КНЦ РАН, на кафедре медицинской и биологической физики Казанского Государственного Медицинского университета и на факультете нейробиологии и поведения Корнэллского укиверситетета (Итака, США).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Е.Е. Никольский доктор медицинских наук, профессор Р.А. Гиниатуллин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Полетаев Г.И. доктор биологических наух, профессор Гайнутдинов Х.Л.

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им М.В. Ломоносова

Защита состоится «о » 1993 г_ в /{ часов на

заседании диссертационного Совета К ИЗ. 19. 02 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 13 - физиология человека и животных при Казанском Государственном педагогическом университете (420021. Казань, ул. Межлаук, д.1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского Государственного педагогического университета по адресу, г. Казань, ул. Межлаук, д. 1.

Автореферат разослан « У » 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

канд. биол. наук, профессор И.Ш. Макалеев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследо*ания. Исследование миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП) - постсинагггических ответов на спонтанно освобождаемые из нервной терминали кванты медиатора, давно и плодотворно используется в нейрофизиологии как один из способов изучения процессов активации ацетилхолиновых рецепторов (АХР) никотинового типа в нервно-мышечном синапсе как в нормальных физиологических условиях, так и при разного рода воздействиях (Katz, Miledi, 1973; Gage, McBurney, 1975;Dwyer, 1981; Land et.al„ 1980, 1981, 1984; Van der Kloot, 1994, 1995, 1996; Stiles et.al., 1996). Интерес исследователей к одноквантовым составляющим нормального синаятического ответа и попытки их моделирования математическими методами (Wathey et.al., 1979; Rosenberry, 1979; Madsen et.al., 1984; Магазаник и др., 1986; Bartol étal., 1991) обусловлены тем, что многокванговый синаптический сигнал отражает в своем временном ходе не только кинетику активации АХР, но и асинхронность освобождения отдельных квантов медиатора (Katz, Miledi, 1965; Soucek, 1971; Barett, Stevens, 1972; Baldo et.al., 1986, Giniatullin etal., 1995). Кроме того, на фазе спада многоквалтовых синоптических ответов сказывается постсинаптическая потенциация, возникающая в результате увеличения вероятности повторных связываний ацетилхолина (АХ) с рецепторно-канальными комплексами при "перекрывании" областей действия отдельных квантов (Hartzel etal., 1975; Magazanik etal., 1984). Численный эксперимент дает возможность рассматривать такие этапы генерации МТКП, которые не поддаются прямым экспериментальным измерениям, проверять гипотезы о механизме взаимодействия медиатора и различных фармакологических агентов с рецепторно-канальными комплексами постсинаптической мембраны, оценивать возможные значения неизвестных констант и предсказывать изменение синаптических ответов при новьвс экспериментальных воздействиях. Хотя за последние десятилетия были разработаны различные методы регистрации МТКП и разные подходы к математическому моделированию процессов, лежащих в их основе, до сих пор имеют место разногласия относительно значений амплитудно-временных параметров МТКП, степени их чувствительности к экспериментальным воздействиям и относительно факторов, их определяющих (Gage, McBurney, 1975; Dwyer, 1981; Khanin et al., 1994,1997; Van der Kloot, 1995; Cherky-Vakil etal., 1995). Причина этих разногласий кроется как в разных экспериментальных условиях, так и в неизбежной ограниченности существующих математических моделей. В связи с этим на передний план выходит задача выбора оптимальной математической модели, адекватно воспроизводящей временной ход МТКП в синапсах с различным функциональным состоянием.

Цели и задачи исследования. Цепью работы являлось экспериментальное к

модельное исследования процессов активации АХР постсинаптической мембраны

нервно-мышечного синапса. В соответствии с этой целью были поставлены

следующие задачи:

1. Получить амплитудно-временные характеристики МТКП скелетной мышцы ящерицы путем экстраклеточной регистрации и методом фиксации мембранного потенциала мышечного волокна и определшъ диапазон их вариирования в нормальных физиологических условиях, при инактивировашой ацетилхолиюсгеразе (АХЭ) и сниженной плотности АХР для использования этих значений в качестве критериев корректности математических моделей.

2. Определить числовые значения исходных параметров для математических моделей (система дифференциальных уравнений, метод Монте-Карло) с целые получения модельных сигналов, соответствующих по амплитудно-временным параметрам сигналам, полученным экспериментально и очертить границы применимости моделей.

3. Воспроизвести в модельных экспериментах временной ход МТКП при функциональной недостаточности АХЭ, изменении размера кванта, сниженной плотности АХР и исследовать причины различной эффективности ингибиторов АХЭ в синапсах с разным функциональным состоянием.

4. Путем математического моделирования исследовать зависимость амплитудно-временных характеристик МТКП от значений кинетических констант активации АХР и кинетики непроводящих состояний АХР.

5. С помощью математической модели исследовать механизмы, лежащие в основе временной постсинаптической потенциации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Формирование переднего фронта МТКП определяется совокупностью диффузионных процессов и процессов, имеющих в своей основе химические реакции. Роль скорости диффузии АХ в синаптической щели в определении температурной зависимости амплитуды МТКП и длительности их передней: фронта возрастает при снижении плотности АХР на фоне инактивированной АХЭ.

2. Модели процессов генерации МТКП, реализованные разными математическими методами (система дифференциальных уравнений, метод Монте-Карло), адекватно воспроизводят временной ход МТКП в нормальных физиологических условиях. Модель, основанная на методе Монте-Карло, более точно воспроизводит зависимость параметров МТКП от морфологических и функциональных особенностей синапсов при ингибированной АХЭ.

Научная новизна Научная новизна работы заключается в том, что впервые в широком диапазоне исследовалась температурная зависимость амплитудно-временных характеристик МТКП в нервно-мышечном соединении ящерицы в интактном синапсе, при ингибированной АХЭ и сниженной плотности АХР. Впервые установлено наличие различной температурной чувствительности временного хода МТКП для разных функциональных состояний синапса и в зависимости от сезона. Получено свидетельство возрастания роли диффузионных процессов в определении температурной зависимости переднего фронта МТКП при сниженной плотности АХР на фоне ингибированной АХЭ. С помощью математической модели установили зависимости параметров МТКП от значений кинетических констант активации АХР (к+, к., о, ß), путем вариирования последних в широком диапазоне. Установлено, что уменьшение значений к* увеличивает, а значений а - снижает эффект ингибирования АХЭ на постоянную времени спада МТКП. Впервые на основании сопоставительного анализа установлены границы применимости различных математических моделей постсинаптического электрогенеза.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию механизмов, лежащих в основе постсинаптического электрогенеза в нормальных физиологичеких условиях и при различных воздействиях на синапс. Разработаны пакеты прикладных программ, реализующие математические модели постсинаптического электрогенеза («дифференциальная» модель, модель по методу Монте-Карло). Получено теоретическое обоснование правомочности использования для дифференциальной диагностики различных нервно-мышечных заболеваний с синацгическим дефектом теста с икгибированием АХЭ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на IX международном симпозиуме по холинергическим механизмам (Майнц, Германия, 1995), симпозиуме -«Растущий организм: адаптация к физическим и умственным нагрузках®) (Казань, 1996), на Конференции молодых ученых по холинергическим и пуринергичесхим механизмам (Казань, 1996), на 26 и 27 ежегодных симпозиумах общества нейронаук (Вашингтон, США, 1996 и Новый Орлеан, США, 1997), ежегодной отчетной конференции КНЦ РАН (1998), заседании Татарского отделения Всероссийского Физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 1998). Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 140 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой гопературы включает 181 источник, из них 166 иностранных авторов. Диссертация содержит 17 рисунков и 7 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Электрофизиологическая регистрация. Эксперименты проводили на иннервированных межреберных мышечных волокнах взрослых разнополых ящериц Anolis carolinensis. Использовали стандартный физиологический раствор для рептилий (в ммоль/л): NaCl -158,0; КС1 - 2,0; CaClj - 1,0; MgCl2 -1,0; NaHP04-7H20 -

0,8; NaHjPOHjO- 0,2; глюкоза - 2,8; pH 7,2-7,4. Ингибирование АХЭ проводили 10 мкмоль/л диизопрогашфлюорофосфатом (ДФП) в течении 90 мин. В ряде экспериментов осуществляли оценку активности АХЭ методами G. ElLman (1961) и M.J. Kamovsky (1964). Снижете плотности доступных для АХ мест связывания с АХР на поетеинаптичсской мембране осуществляли 40 мин обработкой мышечного препарата а-бунгаротоксином (25 нмоль/л) с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА). МТКП регистрировали при экстраклеточном отведении и двухэлектродной фиксации мембранного потенциала мышечного волокна при визуальном контроле подведения микроэлектрода к концевой пластинке. Для внеклеточного отведения использовали михроэлектроды с сопротивлением 0,3-0,5 мОм (коэффициент затухания -3 дБ на частоте 9-12 кГц), а для фиксации потенциала - 0,8- 1Д мОм (коэффициент затухания -3 дБ на частоте 15 кГц). Для внутриклеточной регистрации МТКП микроэлектроды под визуальным наблюдением при помощи микроманипулятора вводили в мышечное волокно в фокусе концевой пластинки. Расстояние между двумя внутриклеточными электродами было порядка 10-15 мкм. При внеклеточном отведении микроэлектрод прижимали к концевой пластинке до первого появления синаптических сигналов, избегая сильного давления на нервную терминаль. Время изменения потенциала фиксации от 20 до 80% («скорость фиксации потенциала») было не больше 15-20 мкс. МТКП квантовали (50 кГц) с использованием 16-битового аналого-цифрового преобразователя и записывали на жесткий диск (100-200 сигналов m каждого мышечного волокна; 5-10 мышечных волокон в контроле и после экспериментального воздействия). Значения исследуемых амплтудно-временных характеристик МТКП представлены как средние значения и среднеквадратичное отклонение. Для проверки статистических гипотез использовали t-критерий Стьюденга.

Математическое моделирование: Моделирование МТКП осуществляли с использованием полной (1) и упрощенной (2) кинетических схем активации АХР ацетилхолином:

k*i к+2 Р

2А + R о А + AR <=> AjR » A2R", (1)

к.» к.} а

k+i kti

A + R»A + AR» AiR*, (2)

k-i X

где A - молекула AX, R - рецептор, AR - комплекс одной молекулы AX с R, AjR -комплекс двух молекул АХ с R, AjR* - рецепторно-канальный комплекс в открытом проводящем состоянии, k+i, k+2 - константы скоростей ассоциации первой и второй молекул АХ с АХР, k.i, k-j -константы скоростей диссоциации первой и второй молекул АХ соответственно, р - константа скорости открывания ионного канала, а -константа скорости закрывания ионного канала, % = 2к.г[и]ф + а)] - константа скорости закрывания ионного канала в случае упрощенной кинетической схемы.

При воспроизведении МТКП с использованием «дифференциальной» модели за основу была взята математическая модель, предложенная J.C.Wathey et.al. (1979) и Л.Г. Магазаником и др. (1986), усовершенствованная полной кинетической схемой активации АХР. Модель представляет собой систему нелинейных дифференциальных уравнений в частных производных с начальными и граничными условиями в плоской осесимметричной системе координат, описывающих изменения концентрации свободного АХ в щели, плотности рецепторно-канальных комплексов АХР с одной и двумя молекулами АХ в непроводящем и проводящем состояниях, плотность комплексов АХ-АХЭ. Граничные условия позволяли рассматривать описанные выше процессы только в пределах окружности радиуса R. Система нелинейных дифференциальных уравнений решалась с использованием конечно-разностного метода по чисто неявной численной схеме.

Моделирование МТКП по методу Монте-Карло осуществляли по алгоритму, предложенному Т. Baitol eL al. (1991). В основной модели область действия одного кванта АХ рассматривали как две параллельные плоскости; ацетилхолин к началу вычислительного эксперимента сосредоточен в точечном источнике на плоскости, соответствующей пресинапгической мембране; на постсинапгической мембране моделировалась складка глубиной 2000 нм, расстояние между стенками складки 50 нм; на постсинапгической мембране выделялось 3 зоны -с плотностью холинорецегггоров 10000, 5000 и 2000 мхм'3. В ряде вычислений АХ был сосредоточен в везикуле (кубе, примыхающем к пресинаптической мембране, объем которого сравним с объемом синаптического пузырька), соприкасающейся с пресинаптической терминалью. В ходе вычислительного эксперимента АХ поступал в синаптическую щель путем свободной диффузии через отверстие фиксированного диаметра (20 и 6 нм). Шаг по времени т выбирался достаточно малым («1 мкс на переднем фронте МТКП и порядка 1 мхе на фазе спада). Амплитуда модельных сигналов выражена в количестве ионных каналов, открытых на пике МТКП. Для

пересчета амплитуды в нА использовали значение проводимости одиночного канала: 25 пСм, потенциала реверсии: -15 мВ и потенциала покоя мышечного волокна: -100 мВ.

Таблица 1. Стандартный набор параметров «дифференциальной» модели МТКП и модели по методу Монте-Карло._

«Монте-Карло» «дифф. модель»

Количество АХ в кванте 10000 12200*

Плотность АХР 10000,5000,2000 мкм2 10000 мкм'2*

Плотность АХЭ (Ео) 2400 мкм'1 * 2400 мкм"1*

к, 2108 моль'л с'1 * 210® моль 'л с'1 ♦

к} 16 мс"1* 16 мс"1*

Скорость диффузии АХ (Э) 3-Ю-* см2с' 610"* см1 с'*

к+| (неполная кин. схема) - 2-107 моль''л с' *

к+2 (неполная кин. схема) - 3,3-107 моль 'л с '*

к» |=к+2=к+ (полная кин. схема) 2-Ю7 моль"'л с'1 1,510" моль'л с'

к.| (неполная кин. схема) - 1,3 мс"'*

X. (неполная кин. схема) - 0,82 мс '*

к.|=к.|=к-1 (полная кин. схема) 20 мс'1 60 мс'

Ь 40 мс"1 19 мс"'

а 1,8 мс"1 1 мс"'

*- приводится по Нигматуллину и др., 1988

** - в разных участках поетеинаптической мембраны

РЕЗУЛЬТАТЫ Электрофизиологическис эксперименты

Амплитудно-временные характеристики МТКП в интактном синапсе

Регистрацию МТКП в нормальных физиологических условиях (20-22°С) осуществляли методами экстраклеточного отведения и фиксации мембранного потенциала мышечного волокна на уровне -100 мВ. В таблице 1 представлены средние значения амплитуды, времени роста от 20 до 80% амплитуды, постоянной времени спада МТКП, зарегистрированных в штгактных синапсах, после ингибирования АХЭ и последующего снижения (на - 70%) плотности АХР в результате действия а-БТХ.

Таблица 1. Амплитудно-временные характеристики МТКП в интактном синапсе, при ингибированиой АХЭ и сниженной плотности АХР

Фиксация мембранного потенциала Экстраклеточное отведение

Амшпгтуда Время роста Постоянная времени спада Время роста Постоянная времени спада

контроль 3,9 ±0,8 П|=33 Пг=183 84,6 ±10,3 1.4 ±0,2 87,9 ±9,2 П(=40 1ц=180 1,3 ±0,2

ингибнрованная АХЭ 5,9 ±0.5 нА (151%) П|=24 ni=I13 118,8 ±20,4 (140%) 3,5 ±0,8 (2SQ%) 113.5 ±13,1 (129%) п,=21 щ=127 3.1 ±0.5 (238%)

ингибнрованная АХЭ, сниженная плотность АХР 1,2 ±0,3 (31%) П|-15 П2=68 269,2 ±74,2 (318%) 2,7 ±0,8 (193%) — -

Цифры в скобках соответствуют относительному изменению амплитудно-временных характеристик МТКП по сравнению с контролем. П| - количество животных, пг -количество мышечных волокон

Зависимость амплитудно-временных характеристик МТКП от температуры

Наиболее зависимым от температуры параметром МТКП в синапсах яцериц была их постоянная времени спада (СЬо =2,4 в диапазоне температур 0-10°С и 1,6 в диапазоне 20-30'С; метод фиксации мембранного потенциала). Для времени роста в экспериментах с экстраклеточным отведением (Зю составлял 1,8 в диапазоне температур 0-10"С и 1,3 в диапазоне температур 20-30°С, что говорит в пользу того, что температурозависимость фазы роста МТКП при температурах ниже 10-12вС определяется не только диффузионными процессами. МТКП, зарегистрированные в весенне-летний период, были достоверно короче «осенне-зимних» (Р<0,001) в диапазоне высоких температур. Сезонные изменения в чувствительности параметров МТКП к температуре могут иметь физиологическое значение, обеспечивая надежность синапгической передачи в периода повышенной активности животных. Для времени роста МТКП график Арреннуса был нелинейным, а для постоянной времени спада проявлял лишь слабую нелинейность (в экспериментах в «зимний» период).

Температурные коэффициенты для амплитудно-временных параметров МТКП в синапсах с ингибированиой АХЭ и сниженной плотностью АХР вычислялись при приближении зависимостей амплитудно-временных параметров МТКП квадратичными полиномами по методу наименьших квадратов (таблица 2). Зависимость амплитуды МТКП и времени роста от температуры в условиях ингибированиой АХЭ была практически тахой же, как и в контрольных экспериментах. Для постоянной времени спада была получена более слабая

зависимость от температуры, чем в контроле. При снижении плотности АХР на фоне ингибированной АХЭ была выявлена слабая температурная зависимость амплитуды МТКП, в то время, как для времени роста она была более выраженной, чем в контроле и при ингибированной АХЭ. Возможным объяснением этому может служить возрастание роли диффузии АХ в темперагурозависимости переднего фронта сигналов при сниженной плотности АХР.

Таблица 2 Температурная зависимость амплитудно-временных параметров МТКП в синапсах с ингибированной АХЭ и сниженной плотностью АХР_

Он

12-22 °С 22-32 °С 32-42 °С

ДФП

Амплитуда 1,4 1,3 -

Время роста 1,4 1,4 -

Постоянная времени 1,4 1,3 -

спада

а-БТХ*

Амплитуда 1,1 1.1 1,2

Время роста 1,8 1,9 1Д

Постоянная времени 1,7 1,9 1,5

спада

* - на фоне ингибированной АХЭ

Математическое моделирование МТКП Моделирование МТКП в интактном синапсе и при неактивной АХЭ

Тест (01а ингибирование АХЭ» является одним их основных критериев адекватности математической модели МТКП (\Vathcy еЫ., 1979; ЯовепЬепу, 1979; Магазакик и др., 1986). Поэтому при выборе параметров для воспроизведения МТКП в норме проверяли изменение амплитудно-временных характеристик сигналов после инактивирования АХЭ. На рис. 1 представлены модельные МТКП (полная кинетическая схема, «дифференциальная» модель) для стандартного набора параметров модели и для ситуации ингибированной АХЭ (Ео=0). Амплитуда модельного сигнала в контроле составляла 5,6 нА, постоянная времени спада - 1,4 мс, время роста сигнала от 20 до 80% - 150 мхе. При моделировании ситуации ингибированной АХЭ амплитуда составила 8,5 нА, постоянная времени спада - 3,3 мс, время от 20 до 80% - 230 мкс. При воспроизведении МТКП с использованием кинетических параметров активации АХР для модели по методу Монте-Карло амплитуда составляла 3,2 и 5,1 нА, постоянная времени спада - 1,6 мс и 3,4 мс, время роста - 100 мкс и 200 мкс соответственно при активной АХЭ и неактивной АХЭ. Время роста МТКП, полученное в модели для стандартного набора

10

параметров, превышает экспериментальные значения, полученные в данной работе. Однако относительные изменения временного хода после ингибирования АХЭ более соответствуют эксперименту, чем для набора параметров модели Монте-Карло. Это может объясняться несовершенством «дифференциальной» плоскостной модели, не учитывающей распределение АХ в пространстве синахтгической щели.

Рис.1 Временной ход модельных МТКП при активной (сплошная линия) и инакгивированной (пунктирная линия) АХЭ.

При моделировании МТКП по методу Монте-Карло (основная модель) были получены сигналы со следующими амплитудно-временными характеристиками при активной АХЭ: амплитуда - 2,5 нА, время роста от 20 до 80% - 87 мхе, постоянная времетш спада - 1Д мс. При инакгивированной АХЭ: амплитуда - 3,8 нА, время роста от 20 до 80% - 163 мке, постоянная времени спада - 3,9 мс. Таким образом, при моделировании МТКП по методу Монге-Карло был получен сигнал с меньшим временем роста, чем при моделировании с использованием «дифференциальной» модели, что более соответствует экспериментальным данным.

Результаты моделирования по методу Монте-Карло показывают, что при активной АХЭ параметры МТКП мало зависят от геометрии области действия одного кванта медиатора на постсинашической мембране. Моделировались следующие ситуации: модель без постсинашической складки; модель с постсинашической складкой и равномерным распределением АХР; основная модель (см. МЕТОДЫ) с низкой плотностью АХР в периферических участках зоны действия кванта АХ. «Добавление» в модель постсинаптической складки лишь на 8%

уменьшило амплитуду модельного сигнала и практически не изменило его постоянной времени спада. Однако время роста сигнала уменьшилось на 20%. При иигибированной АХЭ наиболее чувствительным к вариациям в геометрии синаптической щели параметром МТКП является постоянная времени спада. В модели без постеинаптической складки постоянная времени спада составляла 6,4 мс. Снижение плотности АХР в периферических участках активной зоны привело к дальнейшему (на 20%) укорочению постоянной времени спада - до 3,9 мс, что более соответствует полученным экспериментально значениям этого параметра. Для времени роста МТКП добавление в модель постсинаптической складки выразилось в 30% его укорочении, однако изменение распределения АХР практически не затронуло передний фронт сигналов. Таким образом, при иигибированной АХЭ временной ход МТКП сильно зависит от геометрии синаптической щели.

< х

20-,

и-

1.0-

си

00-1

т

мс

Рис 2 Временной ход модельных МТКП. Пунктирная линия - точечный источник освобождения АХ, сплошная линия - диаметр поры 20 им, штрих-пунктирная линия - диаметр поры 6 нм.

Согласно широко распространенной гипотезе (СесагеНу е(.а!., 1973; Тогп-Тоге11у, 1985) АХ попадает в синаптическую щель через пору в месте слияния пресинаптической мембраны и мембраны синаптического пузырька. Однако остается открытым вопрос о скорости расширения поры и характере диффузии АХ из везикулы в синаптическую щель. Для исследования зависимости временного хода МТКП от скорости освобождения АХ из везикулы по методу Монте-Карло моделировали диффузию АХ через пору фиксированного диаметра. Было показано, что при активной АХЭ уменьшение скорости экзоцитоза оказывает влияние в

первую очередь на передний фронт МТКП, удлиняя время роста и уменьшая апмшпуду сигналов. Существенные изменения во временном ходе модельных сигналов наблюдались только при значительном уменьшении диаметра поры. На рис. 2 представлены модельные МТКП для точечного источника АХ и его освобождения из поры диаметром 6 и 20 км.

Известно, что факторы, определяющие временной ход МТКП (плотность АХР, количество АХ в кванте, активность АХЭ, константы скоростей активации АХР) вариируют в интактном синапсе и могут быть «мишенью» экспериментальных воздействий (Tremblay et.al., 1985; Mora et.al., 1987; Smith et.al., 1990; Van der Kloot, 1991;). Поэтому особый интерес представляло моделирование МТКП в синапсах с различным функциональным состоянием.

Моделирование зависимости параметров МТКП от степени ингибирования АХЭ

Наиболее выраженная зависимость от плотности активных центров АХЭ была получена для постоянной времени спада МТКП (Рис. 3).

- модель по методу Мжго>Кврло

- "дафффогдалыяя" модель

А(яА)

ЯТ(шс)

Ii

13 _

гз

1.9

и

ХСО 4X0

В.СмпЛ

г*> хо 1(0 120 Я)

\\

^...................

2Ш 4Ю Е|,(ммГ2)

t(m)3J IB 2J 10 U-IJ>>

3X0 4W

Рис. 3 Зависимость амплитуды (А), времени роста (ИТ) и постоянной времени спада (т) модельных сигналов от плотности активных центров АХЭ (Ео).

При этом для одного и того же набора исходных параметров модель по методу Монте-Карло предсказывала более сильную зависимость в диапазоне низкой (<10%) активности АХЭ. Полученные с помощью обеих моделей зависимости

амплитудно-временных характеристик модельных МТКП от плотности активных центров АХЭ могут объясняться быстротой "кругооборота" АХЭ (порядка 100 мкс), которая обеспечивает эффективный гидролиз молекул АХ на фазе спада МТКП, когда концентрация АХ уже не так велика.

Нелинейная зависимость постоянной времени спада МТКП от плотности активных центров АХЭ предполагает, что в основе незначительного увеличения фазы спада сигнала (как, например, у МТКП, зарегистрированных в осенне-зимний период) может лежать существенное снижение активности АХЭ. Моделирование зависимости параметров МТКП от количества АХ в кванте.

Концентрация АХ, освобождающегося в результате нервной стимуляции, определяет эффективность синаптической передачи. В то же время количество АХ в кванте может изменяться под воздействием некоторых фармакологических агентов (везамикол, гемихолиний-3, катехоламины) (Van der Kloot, 1991). Снижение содержания АХ в кванте в результате нарушений работы системы захвата холина является причиной наследственного заболевания патологической мышечной слабости (Мота eLal., 1987; Vincent etal., 1997). В обеих математических моделях вариирование количества АХ вызывало изменение амплитуды синагтгических токов и не оказывало существенного влияния на их временной ход. Постоянная времени спада и время роста МТКП практически не менялись в случае активной АХЭ и нелинейно возрастали в случае ингибированной АХЭ при увеличении количества АХ в кванте с 500 до 20000 молекул. С использованием моделей проверялась гипотеза относительно природы "гигантских" МТКП. Согласно одной из гипотез (Кондашевская, 1981; Снетков, 1984) "гигантский" МТКП (ГМТКП), превосходящий нормальный сигнал по амплитудно-временным характеристикам, является следствием либо одновременного освобождения содержимого нескольких синаптических везикул, либо освобождения одного кванта с увеличенным содержанием в нем АХ. Попытка моделирования ГМТКП в условиях нативной АХЭ осуществлялась путем двукратного увеличении параметра, соответствующего количеству АХ в кванте. Модельный сигнал в этих условиях имел амплитуду в 2,3 раз превышающую амплитуду контрольного сигнала. Однако временные его характеристики практически не изменились. Моделирование освобождения 2 квантов медиатора одновременно или с небольшим интервалом в области одной активной зоны («дифференциальная» модель) также не дало значительного увеличения временных параметров сигналов. Таким образом, феномен ГМТКП связан с более сложными процессами, происходящими в синапсе, нежели простое увеличение числа молекул, участвующих в генерации миниатюрного сигнала, -

например, экзоцитоз АХ из шванновских клеток или аномальных везикул (Zefirov, Cheranov, 1995; Sellin etal., 1996), либо с комбинацией нескольких факторов. Модетроеание зашисимости амплитудно-временных характеристик МТКП от плотности АХР.

Плотность АХР на поетеинаптической мембране в области активной зоны различна в синапсах разных объектов, а у холоднокровных - в проксимальных и дистальных участках одного синапса или в зависимости от сезона (Magazanik etal., 1979; Tremblay etal., 1985; Безгина и др., 1987). Кроме того, инактивация части АХР специфическими антителами является основным патогенетическим звеном механизма миастении гравис (Fambrough etal., 1973).

Моделирование ситуации полного ингибирования АХЭ показало, что при пониженной плотности АХР инактивирование АХЭ приводило к большему приросту амплитуды МТКП - на 170% по сравнению с 50% в контроле («дифференциальная» модель; неполная кинетическая схема). Феномен большего прироста амплитуды в результате ингибирования АХЭ на фоне сниженной плотности АХР, полученный для упрощенной кинетической схемы, воспроизводился при использовании полной кинетической схемы и при моделировании по методу Монте-Карло, однако в меньшей степени (109% и 72%), что более соответствует экспериментальным данным (Pennefather, Quastel., 1980, 1981). Можно думать, что больший прирост амплитуды МТКП в результате ингибирования АХЭ базируется на вариациях числа возможных продуктивных связываний, которые молекула АХ претерпевает до того, как она будет удалена из синаптической щели. Полученные данные позволяют установить одну из важных, причин значительной вариации эффектов ингибиторов АХЭ в отношении амплитудных и временных характеристик МТКП и разную эффективность ингибиторов АХЭ при разных формах синдромов патологической мышечной утомляемости (Fambrough etal., 1973; Гест, 1974).

Модетроеание зависимости параметра МТКП от кинетика активации АХР («дифференциальная» модель)

Действие фармакологических агентов (местные экзегетики, этанол, ингибиторы АХЭ) и физические факторы (температура, уровень мембранного потенциала, вязкость клеточной мембраны) существенно определяют кинетику активации АХР, и как следствие - временной ход МТКП (Kuba et.al., 1974; Fong, McNamee, 1986; Zanello etal., 1996). Кроме того, изменение кинетики АХР может лежать в основе сезонных и возрастных особенностей функционирования синапсов (Lewis, 1984; Smith et.al., 1990).

С использованием «дифференциальной» модели детально исследовали зависимость амплитудно-временных характеристик МТКП от значений параметров,

определяющих кинетику активации АХР - lu, к., а, ß. Согласно результата« моделирования вариирование кинетических констант не существенно изменяет время роста МТКП, однако в значительной мере определяет их амплитуду и постоянной времени спада. Так, постоянная времени спада модельных МТКП практически не зависела от значений к» при активной АХЭ, однако при инактивированной АХЭ нелинейно возрастала с увеличением к». Было полученс большее увеличение времени роста сигналов после ингибнрования АХЭ при низких значениях к* (<110* моль'л с"1) (200% для к+=0,05108 моль'л с"1 по сравнению с 150% при к+=310* моль 'л с"'). Таким образом, относительно высокие значения к» (51 108 моль'л с'1) более соответствуют экспериментальным данным по изменению времени роста МТКП в результате ингибирования АХЭ.

Уменьшение значений к. и а привело к увеличению постоянной времени спада и амплитуды сигналов благодаря увеличению «времени жизни» АХР в открытом проводящем состоянии. При активной АХЭ 3-кратное уменьшение а привело к возрастанию постоянной времени спада на 211%, а при ингибированной -только на 102%. Аналогичное уменьшение значения к. при интактной АХЭ увеличило постоянную времени спада на 66%, а при инактивированной АХЭ - на 132%. Полученное в модели меньшее изменение постоянной времени спада МТКП при неактивной АХЭ может объясняться снижением вероятности повторных активаций АХР в условиях, когда при малых значениях а молекулы АХ дольше остаются связанными с рецепторами, и эффективная концентрация АХ в синоптической щели падает. Этот результат может объяснить более слабую тсмпературозав исимость постоянной времени спада МТКП при неактивной АХЭ, полученную в данной работе.

Известно (Anderson, Stevens 1973), что гиперполяризация мышечного волокна приводит к уменьшению a (a=a«n*eB*4V, где значение В вариирует от 0,004 до 0,01). Двукратное увеличение а в математической модели (изменение мембранного потенциала на - 110 мВ) привело к уменьшению амплитуды модельного сигнала на 12% и укорочению постоянной времени спада на 48%. Таким образом, изменение амгоппуды МТКП в эксперименте при вариировании мембранного потенциала мышечного волокна (Enomoto, Edwards, 1985; Гиниатуллин и др., 1987) обусловлено, в основном, изменением проводимости одиночных каналов, а не количества открытых каналов.

Для моделирования температурозависимости МТКП были выбраны две упрощенные ситуации: в первом случае предполагалось, что только а является температурозависимой (Е«=13,3 юсал моль"'; Qio-2,2). Во втором случае предполагалось, что а и ß изменяются одновременно и характеризуются одинаковой

энергией ахтивации. Для последнего случая кривая температурной зависимости для постоянной времени спада была неэкспоненциальной во всем температурном диапазоне. Qm для постоянной времени спада был близок к 2 для обоих моделей температурозависимосш. Для времени роста МТКП зависимость от температуры была более слабой, особенно в случае, когда только а была температурозависимой (Qio=l,1-1,2) в диапазоне 22±10вС. Модель предсказывает, что когда только а являлась температурозависимой, то амплитуда сигналов увеличивалась при снижении температуры. Когда температурозависимыми являлись и а, и (5, амплитуда снижалась при понижении температуры.

Таким образом, ситуация, когда и а, и р одновременно реагировали на изменение температуры, наиболее соответствует проведенным экспериментальным исследованиям температурной зависимости МТКП.

Моделирование феномена временной постсинаптической потенциации ТКП («дифференциальная» модель)

Для исследования феномена временной потенциации (Magazanik et.al., 1984) - увеличения постоянной времени спада второго ТКП при стимуляции нервного окончания парными импульсами - моделировалось последовательное освобождение двух квантов медиатора в одной области с временным интервалом 10, 30 и 100 мс. При активной АХЭ заметное увеличение постоянной времени спада было получено лишь при интервале 10 мс между освобождением первого и второго квантов. При ингибированной АХЭ т спада второго сигнала была больше на 49% при интервале 10 мс, на 22% при интервале 30, а при интервале 100 мс оба сигнала были одинаковы. Однахо согласно экспериментальным данным, при стимулировании нервно-мышечного препарата парными импульсами на фоне ингибированной АХЭ даже дня межимпульсного интервала 40 с наблюдается достоверное увеличение постоянной времени спада второго сигнала (Magazanik etal., 1984), что может объясняться остаточными комплексами- АХР с АХ. Полученное разногласие между экспериментальными и модельными дашшми может объясняться тем, что при неактивней АХЭ молекулы АХ из везикул, освободившихся на первый импульс, покинув зону действия одного ' кванта, диффундируют в другую, в результате чего общий фон свободного АХ и их комплексов с АХР сохраняется довольно высоким, чего не происходит в модели, где молекулы АХ, "вышедшие" за пределы зоны действия од ного кванта, не принимают дальнейшего участия в активации АХР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа посвящена математическому моделированию процесса генерации МТКП с использованием двух принципиально различных моделей -

«дифференциальной» и по методу Монте-Карло. Моделированию предшествовала экспериментальная часть, посвященная электрофизиологической регистрации МТКП в ингактных синапсах, в синапсах с инахтивированной АХЭ и сниженной плотностью постсинаптических АХР. Для трех исследуемых ситуаций изучалась температуре зависимость временного хода МТКП в широком температурном диапазоне. Было показано, что временные параметры МТКП вариируют в зависимости от сезона. При исследовании температурозависимости амплитудно-временных параметров МТКП в условиях ингибированной АХЭ нами была получена меньшая температурозависимость постоянной времени спада МТКП. В условиях сниженной плотности АХР (на фоне ингибированной АХЭ) была получена слабая зависимость амплитуды сигналов от температуры, что может указывать на возрастающую роль диффузии АХ в температурной чувствительности параметров синаптических токов при низкой плотности АХР и неактивной АХЭ. Полученные экспериментальные данные использовались в качестве критериев адекватности математических моделей.

Проведенные исследования показывают, что две принципиально различные математические модели МТКП - «дифференциальная» и по методу Монте-Карло • с достаточной точностью воспроизводят временной ход МТКП в нормальных физиологических условиях. Было показано, что существует ряд наборов исходных параметров моделей для адекватного воспроизведения временного хода МТКП. Однако моделирование МТКП в синапсах с различным функциональным состоянием (различная степень активности АХЭ, разная плотность АХР, модификация кинетики активации АХР) позволяет определить количественное соотношение между факторами, вовлеченными в синалтический электрогенез, и диапазон их вариирования. «Дифференциальная» модель адекватно воспроизводит те изменения во временном ходе МТКП, которые имеют место при модификации кинетики рецепторно-канального комплекса. Было показано, что температурозависимость переднего фронта МТКП обусловлена совокупностью диффузионных процессов и процессов, в основе которых лежат химические реакции, в то время, как связанные с температурой изменения в продолжительности фазы спада сигналов могут обуславливаться скоростью закрывания ионного канала (а). При этом в случае инахтивированной АХЭ зависимость постоянной времени спада МТКП от значений а слабее, чем в контроле, что согласуется с экспериментальными данными по температурной чувствительности т МТКП после ингибирования АХЭ. Было показано, что наиболее вероятным диапазоном значений константы скорости связывания АХ с АХР (к») является ИО'-З-Ю8 моль"'л с"1 и, что вариирование к+ при интакгной АХЭ сказывается главным образом на переднем фронте МТКП и

практически не затрагивает фазу спада. ((Дифференциальная» модель и модель, основанная на методе Монте-Карло воспроизводят наблюдаемое экспериментально изменение временного хода МТКП при снижении плотности АХР на фоне ингибированной АХЭ. Обе модели воспроизведет наблюдаемый экспериментально феномен большего прироста амплитуды МТКП после ингибирования АХЭ на фоне "прореженных" АХР (Pennefather 1980, 1981).Однако, относительный прирост ампшпуды МТКП, полученный по методу Монте-Карло представляется более реалистичным. Воспроизведение трехмерной структуры синаптической щели (методу Монте-Карло) показало, что в условиях активной АХЭ вторичная структура синапса не оказывает существенного влияния на временной ход МТКП. Однахо в условиях неактивной АХЭ фаза спада модельных сигналов была значительно короче при наличии постсинаптических складок и с учетом меньшей плотности АХР в периферических участках активной зоны. Таким образом, метод Монте-Карло является более предпочтительным при моделировании особенностей функционирования синапса на фоне сниженной активности АХЭ и позволяет исследовать различные аспекты синаптической передачи в более широком диапазоне.

ВЫВОДЫ:

1. Время роста и постоянная времени спада МТКП, зарегистрированных при экстраклеточном отведении и методом двухэлекгродной фиксации потенциала, в нервно-мышечном синапсе ящериц Anolis Carolinensis меньше в весенне-летний период, что может свидетельствовать о большей степени функциональной недостаточности АХЭ в зимний период.

2. В условиях ингибированной АХЭ передний фронт МТКП более чувствителен к снижению платности АХР на постсинаптической мембране, чем задний фрокг.

3. Математические модели воспроизводят и позволяют объяснить наблюдающийся в эксперименте феномен большего прироста амплитуды МТКП после ингибирования АХЭ в синапсах со сниженной платностью АХР.

4. Дня амплитуды, времени роста и постоянной времени спада МТКП наибольшая температурная зависимость наблюдается в области низких температур (<12 «С). Qio для времени роста составляет 1,8 (экстраклеточное отведение), что свидетельствует о том, что формирование переднего фронта МТКП в икгактном синапсе определяют не только диффузионные процессы.

5. При ингибированной АХЭ происходит снижение температурной зависимости скорости спада МТКП, что согласуется с результатами моделирования зависимости фазы спада от значений а при неактивной АХЭ.

6. При снижении плотности АХР на фоне инакгивированной АХЭ происходи! снижение температурной зависимости амплитуды МТКП, что свидетельствует о возрастании роли диффузионных процессов в формировании переднего фронта сигналов.

7. Моделирование зависимости амплитудно-временных параметров МТКП от значений постоянной скорости связывания АХ с АХР (к*) показало, что наиболее вероятный диапазон значений этого параметра в нормальных физиологических условиях от 0,5- (О8 моль'1 л с'1 до 3- 10s моль'л с'1.

8. Согласно результатам моделирования временная посгсиналтическая потенциация обусловлена перераспределением молекул АХ между смежными зонами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Bukharaeva Е.А., Gainulov R.Kh., Nikolsky E.E., Kovyazina I.V. The synchronity of the postsynaptic membrane activation by mediator quanta at the frog synapses is disrupted by carbacholine // Abstr. 9th Int. Symp. of Cholinergic Mechanisms, Mainz, Germany, 1995, P.24.

2. Kovyazina I.V., Nikolsky E.E., Giniatullin R.A., Vyskocil F. Amplitude and duration dependence of miniature end-plate currents on the acetylcholinesterase activity // Abstr. 9th Int. Symp. of Cholinergic Mechanisms, Mainz, Germany, 1995, P.30.

3. Гайнулов P.X., Никольский E.E., Бухараева Э.А., Ковязина И.В. Вклад асинхронности освобождения медиатора в изменение амплитуды токов концевой пластинки в присутствии карбахолина // Тез. Симп. «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке», Казань, 1996, С. 25.

4. Ковязина И.В., Никольский Е.Е., Гиниатуллин Р.А., Выскочил Ф. Эффекты ингибирования ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечных синапсах с разным исходным функциональным состоянием И Нейрофизиология, 1996, - т. 28, N 4/5, С. 263-267.

5. Stiles J.R., Kovyazina I.V., Salpeter Е.Е., Salpeter M.M. Experimental and modeling analysis of miniature endplate current variability: effects of temperature and cholinesterase inhibition // Thes. of 26е1 Annual Meeting of Society for Neuroscience, 1996, Washington, USA, V. 22, P. 788.

6. Kovyazina I.V., Stiles J.R., Salpeter E.E., Salpeter M.M. Temperature dependence of miniature endplate current time-course // Thes. of 27th Annual Meeting of Society for Neuroscience, 1996, New Orleans, USA, V. 23, P. 652.