Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ядов некоторых членистоногих и их компонентов на электро- и хемотвозбудимые структуры биомембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние ядов некоторых членистоногих и их компонентов на электро- и хемотвозбудимые структуры биомембран"

р Г 5

1 з cpfcB 13S5

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ©ЕЙОЛСГИИ и ШОВВИКИ

На правах рукописи УДК 577.353:591.145.3

ахмейоз шжшпдаа к&ураевгн

влияние ядов ггЕипшя чшшяловопос я ах довхшгяхаз на эшсгро - н ciwrhki £3s2b3£2z3

03.00.02 - Баофигиса

Автореферат диссертации на сснскгязе ученой стелена СгоготЕчесгаа эзаук

,v /^,-Ы'.- Таакент - 1994

" УГ ,

^ «Г

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор П.Б.Усманов кандидат биологических наук, Д.Калккулов

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, У.З.Мирходжаев кандидат биологических наук, А. Мшаткадкров

Ведусая организация

Институт биоорганической химии АН РУз

/а^в

Защита состоится " (О" ej/U^- 19S5 г. в f V часов на заседании специализированного совета (Д.015.01.21) по присуждении ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУв (700095. г. Ташкент, ул. А.Нияэова,1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз»

Автореферат разослан

года.

Ученый секретарь/специализированного совета, доктор биологических наук, профессор . . ' 'V

' Ж

З.С.Ыахыудаз

.'-.а г

- 3 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш. Ионные каналы и нейрорецепторы возбудимых мембран играют ключевую роль при генерации, распространении и передаче нервного импульса. Исследование особенностей функционирования и организации этих мембранных образований является актуальной проблемой современной биофизики и нейрофизиологии. При решении этик проблем достигнуты определенные успехи благодаря разработке новых методов, математическому моделированию и применению в качестве инструментов исследований различных нейротоксинов природного происхождения. В частности, благодаря таким токсинам как тетродотокеин, с'акситоксин, ве-ратридин, аконитин, батрахотоксин и полипептидним нейротокси-нам скорпионов, выяснена функциональная организация и структу-, ра потенциалзависиыых Ма+-каналов. С помощью пресинаптических нейротоксинов,таких как Сотулиновый и столбнячный токсины, латротоксина и некоторых токсинов вмей,прослежена цепь событий в процессе синтеза,накопления и секреции медиатора. Незаменимую услугу оказали постсинаптические кейротоксгаш змей, избирательно и необратимо взаимодействующие с никотиновым холино-рецептором. Использование этих токсинов в качестве аффинных дигандов позволило выделить холинорецептор и установить его химическую природу.

Однако несмотря на достигнутые успехи все еще остаются недостаточно изученными глутаматергические синапсы,играющие важную роль в центральной нервной системе позвоночных. Аналогичная ситуация и с кальциевыми каналами , обеспечивающими процессы секреции медиаторов, сокращение мышечных волокон и деятельность сердечно-сосудистой системы.В связи с этим поиск но-

вых нейротоксинов,специфически взаимодействующих с Са^-кана-лами и глутаматергическими синапсами,является одной из актуальнейших вадач нейрофизиологии и биофивики.

Безусловно,результаты этих исследований позволят более подробно охарактеризовать (фармакологические свойства Са2+-ка-налов и глутаыатергических синапсов и будут способствовать созданию перспективных фармакологических средств целенаправленного действия для профилактики и лечения патологий нервной и сердечно-сосудистой систем.

Еель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось изучение механизма действия новых нейротоксинов из ядов пауков Arglope lobata и Agelena lablrlntlca на кальциевые каналы и глутаматергическке синапсы.

В процессе исследования решались следующие задачи.

1. Изучить действие яда паута Argiope lobata и его компонентов на глутвыатчувствительные идентифицированные нейроны

виноградной улитки НеЦх pomatia.

¿.Изучить действие ядов пауков Argiope lobata и Agolena lablrlntlca и их компонентов на нервно-мышечные синапсы лягушки и саранчи.

3.Исследовать взаимодействие яда паука Agelona lablrlntlca и его компонентов с потенциалвависимыми Са2*-каналами преси-наптическнх мембран нервно-мышечных синапсов лягушки.

Научная новизна. В процессе исследований выявлены яды пауков и их компоненты,избирательно взаимодействующие с глута-матнши рецепторами нейронов виноградной улитки Helix pomatla и-нервно-мышечными синапсами саранчи Locusta migratoria,а также с Са2*"- каналами пресиналтических мембран.

Обнаружено, что яд паука Argiope lobata и его нивкомолеку-

« f

- 5 - '

лярные компоненты- аргиолобатин и A-V-2 дозазависимым образом подавляют глутаматактивируемые входящие и выходящие токи нейронов ППа4 и ППа1 виноградной улитки. Установлено, что действие низкомолекулярного компонента аргиолобатина имеет неконкурентный , а компонента - A-V-2 конкурентный характер. Конкурентный характер действия компонента A-V-2 свидетельствует о его взаимодействии с узнающим участком глутаматного рецептора нейронов виноградной улитки.

Установлено, что аргиолобатин, при периодической аппликации глутамата,существенно усиливает степень десенситизации глутаматного рецептора саранчи. Показано, что взаимодействие аргиолобатина с глутаматным рецептором синапсов саранчи влияет на функциональное состояние участка десенситизации данного рецептора.

Обнаружено , что яд паука Agelena labirlntica подавляет спонтанную секрецию медиатора и уменьшает квантовый состав потенциалов концевой пластинки лягушки. Показано,что эти эффекты яда паука Agelena labirlntica обусловлены его взаимодействием с Са2+ -каналами прееинаптических мембран. Установлено, что блокирование прееинаптических Са2+ - канатов вызывает компонент яда - Agi-1,имеющий молекулярную массу около 100О Да.

Теоретическое и практическое значение. Представленные экспериментальные данные вносят вклад в исследование особенностей функционирования и организации глутаматергических синапсов и Кальциевых каналов и определяют возможные . способы регуляции их функционального состояния. :

Выявленные новые компоненты ядов пауков Arglope lobata и Agelena labirlntica - аргиолобатин, A-V-2 и Agl-1 пополнят арсенал инструментов исследования глутаматергических синапсов и

потенциалзависимых кальциевых каналов и найдут широкое применение в медико-биологических исследованиях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IV съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1988); на Всесоюзной конференции, посвященной 90-летио со дня рождения академика АН Армянской ССР, члена-кореспонденга АН СССР Х.С.Коштоянца (Москва, октябрь 1990); на 1 съезде физиологов Ср. Азии и }а-аахстана (Душанбе, 1991), а также на объединенном семинаре лаборатории« Института физиологии и бисфизики АН РУз.

Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах.

Объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного ' текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методор исследования , изложения экспериментальных результатов и и: обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация содержит одну таблицу и ^рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ.И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовались цельные яды пауков, поставляемые зоокомбинатом РУз. В качестве обьекта ислледования служили кервно-мышечные препараты лягушки и саранчи, а также идентифицированные нгйроны ППа4 и ППа! подглоточного ганглия виноградной улитки ( Helix pomatla ).

Регистрацию мембранного потен; иала (МП) мышечных волокон и нейронов, синаптических пот энциа. ов ( миниатюрных возбуждающих постсинапгических потенциалов-МВПСП, возбуждающих постсинапгических потенциалов-ВПСП,миниатюрных потенциалов концевой плас-

тинки-МПКП и потенциалов концевой пластинки-ПКП ) и глутаматых потенциалов осуществляли стандартной микроэлектродной техникой. Аппликацию L-глутамата осуществляли методом ионофореза из стеклянной пипетки, заполненной 2М раствором L-глутамата толчками тока 1СГ8 - 1СГ5 Л.

Миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи (ШШСТ), возбудающие постсинаптические токи (ВПСТ) и глутаматактивируе-мые токи регистрировали в условиях фиксации потенциала с помощью двух микроэлектродов,' сводимых на расстоянии не более 100 мкм друг от друга в исследуемый нейрон или мышечное волокно. Один из микроэлектродов служил для регистрации МП, второй -для фиксации потенциала.Регистрацию токов производили с помощью усилителя "Dagan"8500 (США)(коэффициент усиления 26 ООО, полоса пропускания до 30 кГц).

Отведения вызванных сигналов от нервного окончания производили внеклеточно при помогу! микроэлектродов с оплавленными кончиками.согласно методу / Зефиров,Халилов и др., 1985 /. Ыикроэлектроды в зависимости от цели эксперимента заполняли нормальным раствором Рингера или 100 мМ СаСI2■ Сопротивление микроэлектродов составляло 1-2 мОм.

Все эксперименты проводили при комнатной температуре

22°С.

г. ДЕЙСТВИЕ ЭДА ПАУКА Arglope lobata IIA ГЛУТАМАТЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ НЕЙРОНЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ HELIX POMATIА Аппликация L- глутамата на сому нейронов приводила к деполяризации нейрона ПГ1а4 и гиперполяризации нейрона ППа1. Амплитуда этих ответов прямо зависела от концентрации апшнщируемо-го глутамата. Добавление яда паука Arglops lcbata (50 мет/мл)

приводило к снкженнию амплитуды ответов,вызываемых аппликацией глутаыата на сому нейронов ППа4 и ППаг. При атом яд паука не оказывал действие на МП и потенциалы действия (ПД) исследуемых нейронов.Б условиях фиксации потенциала аппликация глутамата индуцировала входящие токи на нейроне ППа4 и выходящие токи на нейроне Ш1а1. Наши данные,а также литературные данные /Герасимов и др.,1982/ свидетельствуют о том, что развитие входящего тока в' этих условиях связано с повышением Na+-проводимости,а выходящего тока-с повышением К^-проводи^ости мембран нейронов. Добавление яда паука Arglcpe lobata (50 мкг/мл) приводило к снижения годлйтуды-глутам£лштивируемых токов (рис.1). Анализ вольт-амперных характеристик (ВАХ) в контроле показал, что с увеличенной поддерживаемого потенциала происходит увеличение ешшпуды глутйнатактйвируеиых токоъ и эта зависимость имеет нелинейный характер.Экстраполяция линейного участка этой кривой к оси абцисс показала, что потенциал реверсии глутаматак-тивируемых токов находится в пределах 20i5 ыВ. В присутствии яда ВАХ также была нелинейной,а потенциал реверсии глутаматак-тивируемых токов находился в пределах 20*5 мВ. Следовательно, яд паука Arglope lobata сникает амплитуду глутаматактивиру-емых токов и не . оказывает существенного влияния на их потенцк-ал реверсии.

1

Б

8

Г

/

Г"

/

Г"

1&М*

. А

Г

2

Рис.1 Действие яда паука Аги1оре 1оЬага на глутаматактавк-руеше токи нейронов 1ша4 (I) и Ша1 (2) виноградной

улитки.

А - контроль: Б и В - через 10 и 20 мин после добавление яда ( 50 мкг/ю! ); Г - поело 30 т» оишвання.

1.2 ДЕЙСТВИЕ КОМПОНЕНТОВ ЯЛА ПАУКА Аг?Юре 1оЬаЬа НА ГЛУТАЫАТ-АКТИВИРУЕМЫЕ ТОКИ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

С помощью гельфильтрации и ионообменной хроматографии из яда паука Агг1орв 1оЬаЬа выделено два ниэкомолекулярных компонента- аргиодобатин (мод. масса 657 Да)' и компонент А-У-2 (мол.масса 637 Да)/ Насыров,1992/. При добавлении в раствор ,перфузирующий препарат, аргиолобатина(5*10"7 М),происходит снижение-амплитуды активируемых глутзматом входящих токов нейрона ППа4 и.выходящих токов нейрона ППа1.Степень и скорость •подавления токов прямо задисели от концентраций аргиолобатина. Однако даже высокие концентрации аргиолобатина(5*10~5 М ) не вызывали полного подавления глутаматактивируемых токов. Анализ! ВАХ в норме и в присутствии аргиолобатина.показал, что аргио-

- 1и -

лобатин изменяет величину потенциала реверсии глутаматактиви-руемых токов на 5-10 мВ. В присутствии аргиолобатина кривая доза-эффект глутаматактивируемых токов смещалась вправо относительно оси абцисс с некоторым уменьшением максимума тока (рис,2). Эти данные свидетельствуют о том, что действие аргиолобатина на глутаматактивируемые токи имеет неконкурентный характер.

Компонент А-У-2 (5*10~6 Ы) также вызывал снижение а*1ли-туды входящих токов нейрона Ша4 и выходящих токов нейрона ППа1, активируемых глутаматом. В присутствии этого компонента не наблюдалось изменения потенциала реверсии глутаматактивируемых токов. Как видно из рисунка 3 , компонент А-У-2 вызывает параллельное смещение вправо относительно оси абцисс кривой доза-эффект глутаматактивируемых токов. Вместе с тем при увеличении тока .ионофореза можно восстановить исходный уровень глутаматактивгруемых токов, сниженных компонентом А-У-2. Эти данные свидетельствуют о том, что действие компонента А-У-2 на глутаматактивируемые токи нейронов имеет конкурентый характер.

Таким образом, проведенные эксперименты показывают, что цельный яд паука АЛоЬаЬа и его низкомолекулярные компоненты-аргиолобатин и А-У-2 подавляют глутаматактивируемые токи на нейронах ППа4 и ППа1 виноградной улитки .Анализ полученных экспериментальных данных позволяет заключить, что участком, с которым впаимодействует аргиолобатин, - является канальная часть, а компонент А-у-2 1 залмодействует с узнающим участкок глутаматного рецептора.

OA

7

г/

Г

■ж

г/х

__I__I > Т ) LU-

j_1.1 t J-IJ

10-

10"

10-6 с

Рис.2 Елшшкв аргиолобатЕяа на зависга.?ость доза-э^Ьегсг глугамат-актнвнруешх токов uciipoua ППа4 виноградной улитки. А - контроль; Б - в присутствии аргпаяойагнна ( ).

По оси ординат-амплитуда глутакатактлвируемнх токов, по оои абдагсс-количество электричества (в кулонах) протекающего через микрозлектрод.

вЛ

L l

iO-7

Рпс.З Влияние "компонента A-V-2- на зависимость доза-эффект

глутаматактивируемых токов нейрона ППа4 виноградной улитки. ;

, А - контрЬль; Б г d присутствии компонента A-V-2 (б'КГ^Ц). По аои ординат-аиплигуда глутаматактиаирувмцх токов, по оси абцисс-когичзотво электричества (в купонах) протекша-tiisro черээ микроалектрод.

Z

- - 12 -

2. ДЕЙСТВИЕ АРГИОЛОБАТИНА НА НЕРВНО-ИШЕЧНЫЕ СИНАПСЫ

САРАНЧИ '

Ранее было показано,что аргиолобатин необратимо блокирует нервно-ыыэечные синапсы саранчи, изменяет характер зависимости ВДСТ от неубранного потенциала и увеличивает связывание 1-3Н-глутауата с снналтическиыи мембранами из мышц краба ( Ус-налов и др. ,1991,1992). На основании полученных данных предполагалось, что аргиолобатин одновременно может оказывать влияние и на. участок, связывающий медиатор, и на ионный канал глутаматного рецептора. В связи'с тем, что агенты, углубляющие десенситнэйщзо глутаматного рецептора параллельно усиливают его сродства к ыеднатору, наблюдаемое в этих экспериментах увеличение сьязывания печенного глутаиата синаптическими ueuO-вызываемое арпшой'аткнои, обгонялось его влиянием на Tcut nasuBaaifiiü участок десенситизации рецептора. Для проверки этого предположения наш! были проведены эксперименты с кенка-iiaBasHüC'á A (Con А), который оЗлцдаот способностью устранять йесенскуизация глугед.'атпых рецепторов /Us.Vjrwood, 1й79/.

В'коптрслъиих опытах.периодическая аппликация глутаната (5*10"4i) с частотой 2кмл/иин вызывала ответы,амплитуда которых постепенно уиеньсадась в результате десенситизации глута-ьгатных рецепторов (ркс.ДЛ). В этих условиях Con А ( 1*10~еМ ) предотвраядл снижение амплитуды последухпшх ответов на периодическую ытзнкацк» глутамата (рис.4£).

В другой сери;! опытов было изучено действие аргиолобатина па дссецснтигащэ при периодической аппликации глутамать . Спита показали,что при действи;: аргиолобатина, когда амплитуда глутаматного ответа подавляется на 50 X, степень десенсктиза-Ш® вшгетно-усиливается (р»с.4В). На препаратах,предварительно

а

<5

4 иА

s

г

к

У

I мш

Рис.. 4 Действие аргполобатина на глут&матактпвируемыо токи шещ саранчи: а-развитке. десенсктизации глутакатактивпруемцх токов при ритмической аппликации глутамата(5-10-3Ш; б-блокирозанло десенситкзащш глут&чатактишруемых токов конканавалином А (10"^М);в-подавлешкз глутаматактквируемш:. токов аргиолобатн -но:г( 10"" ¡¿¡¡^-подавление гл утащат акт кшруе '.«к г о коз аргаолобати-HOi.:( Ю~'м) на фоке блокирования десенситизацнц кошсанавали-ном А (Ю*6:.!).

обработанных Con А.аргиолобатин'также эффективно подавлял глу-таматактивируемые токи (рис. 4Г).

Таким образом, учитывая ранее показанное увеличение связывания 1,-3Н-глутамата синаптическиыи мембранами- в. присутствии ' аргполобатина и обнаруженное нами усиление степени десенсити- ' зации, вызываемое аргиолобатаном, свидетельствует о том, что взаимодействие аргполобатина с глут&чатныи рецептором каким-то образом оказйвает влияние на участок десенсмтмзаций глутамат-н'огс рецептора,. Однако, . как было показано ранее /Усманов и др. ,1991/, аргиолобатин "наряду со снижением амплитуды сннапти-ческих потенциалов также уменьшает и длительность их. полуспада,' что является характерным-признаком блокады канала глута-матного рецептора. .

В целом полученные экспериментальные данные свидетельст-

- 1-4 -

вуют о том, что взаимодействие аргиолобатина с глутаматным рецептором одновременно сказывается на функциональном состоянии различных участков рецептора, управляющие ионным каналом и его десенситизацей.

3. ДЕЙСТВИЕ ЯДА ПАУКА АдюГепа 1еЫг1гЛ1са НА НЕРВНО.' ЬШЕЧВДЕ СИНАПСЫ ИЯШКИ Яд паука А.1аЫг1писа при концентрации 1-Ю мкг/кд не вызывал достоверных изменений частоты ШКП яягупки. При I с-польвовании Высоких концентраций яда (50-150 мкг/мл) частота ЖЖП снижалась в 5-6 раз относительно исходного уровня (табл. 1). При этом. МП мышечных волокон и амплитуда ШЖП существенно не изменялись. При отмывании препарата этот эффект яда был частично обратим.

Яд паука.вызывал также заметное снижение амплитуды ПКП (табл.1). Как .показал анализ экспериментальных данных, подавление амплитуды ЩП при действии ?да происходит еа счет снижения их квантово-'о состава (рис.5). Эти данные , а именно, снижение частоты МПКП и.квантового состава ПКП однозначно свидетельствуют о том, что действие яда паука происходит на уровне пресинаптичзской мембраны.

Известно, что процесс секреции медиатора прямо зависит от концентрации ионов кальция в аксоплазме нервного окончания, которая в свою очередь определяется состоянием кальций-транспортирующих систем, -таких, как митохондрии и потенциалзависи-мые кальциевые каналы пресина ¡тидеской мембраны.Возможно, что наблюдаемые нами эффекты яда п*ука являются результатом его действия на «дну из этих систем В свяаи с ' этим нами было изучено действие яда паука на эффекты таких агентов, как тет-рахлортрифторметилбензимидазол и менадион , которые, как из-.

ТАБЛИЦА

Влияние, яда паука Аее1епа 1аЬ1г1Шса на параметры еийаптических потенциалов нервно-шпечног.о препарата лягушки .

Концентрация яда паука, мкг/мл Мембранный потенциал ■мышечного волокна, мВ Амплитуда ' ЫПКП,. МЗ Частота т ШКП, С"1 Амплитуда ПКП, кВ

Ю 89.5 ± 1.1 (Б) цц'.б-г 1\И 0,395 ± 0.061 . (4) О!У93 ± и:обо 0,95 4 0.21 (Б) и'Ы4 -± • 7.855 ± 0,514 (7) 7.1Ю4 ± и,4УЬ

50 86,0 ± 0,9 (4) 0,423 ± 0,092 (3) 0,415 ± 11-ОБЬ 1,21 ± 0,!31 (4) 9,056 ± 0,794 (6) ь;ив ± и.ьаа

100 90,6 4 0,8 (7) 0.415 ± 0.103 (5) 1,15 ± 0.18 (7) 8,450 ± 0,541 (7)

У0,2^ О.У и,Ж ± 0,1)0 5г;Ш8 £"4,122.-

150 88,7 ± 1,2 (7) 0,405 ± 0,046 (5) О'ЬУУ 1 и,изь 0,75 ± 0,14 (7) и!1в ± о|ш 8,738 ± 0,649 (7) и,6У8 ± и.ОУЬ

В скобках указано число опытов.

я>

16

10

во

100

и

- - <

190

Рис.5 Влияние яда паука А^е1епа 1аЫг1пг1оа на квантовое числа ВКЛ.

По оси ордкнат-квантовое число К-ОТ, по оси абцисс-концон-трацня яда, ынг/мл.

вестно, увеличивают уровень ионов кальция в аксоплазме нервного окончания . за счет его высвобождения из ыитохрондрий нервного окончания . и усиливают процесс секреции медиатора /Глаголева и др.,1970; Каликудов и др.,1991/. Эти эксперименты показали, что яд паука не влияет на усиление секреции медиатора, вызываемое этими агентами. Следовательно, подавление амплитуды ПКП в присутствии яда паука происходит в результате снижения потока, йонов* кальция чз внеклеточной среды в нервное окончание. Для проверки этогг поед/оложения .были проведены эксперименты в условиях калпеЕ ул де'псляриэацин, которая, как известно, вызывает активацию потеициалзавнсимых Са2+-капалов пресинаптической мембраны , "усиление входа Саг+- в аксоплазыу нервного окончания и увеличение частоты МПКП. Эти эксперименты•

о

проводили по следующей схеме: 1-после контрольной регистрации ЫПКП в течение 30 минут повышали концентрацию KCl в- среде и определяли максимальное {значение частоты ЫПКП для данной концентрации KCl в среде (концентрация KCl в среде изменялось от 2,5 до 15 мМ), 2-нервно-кишечные препараты предварительно инкубировали в течение 30 минут в растворе, содержащем яд паука (100мкг/мл), затем повышали концентрацию KCl от 2.5 до 15 мМ. Как видно из рис.6, повышение концентрации KCl в среде приво-• дит к значительному увеличению частоты МПКП, в то время как' на

Рко^б Влияние яда паука Agelena labirintlca ка завпсклость частоты МПКП лягуаки-о? концентрации KCl. I - контроль; 2 - в присутствии яда ( 100 мкг/мл ). По обн ордЕнат-частота МПКП, сек-*, по оси абцксс- концентрация KCl в сроде, iü.

препаратах, предварительно проинкубированных с ядом паука, эф-

- - 18 -

фект калиевой деполяризаций был менее выражен.

Эти данные косвенно свидетельствуют о том, что эффекты яда Паука Agelena lablrlntlca обусловлены снижением поступления ионов кальция ь аксоплазму нервного окончания. Б связи с тем, что поток ионов кальция в аксоплазму нервного окончания определяется числом и состоянием кальциевых каналов пресинаптичес-кой мембраш, которые в свою очередь зависят от параметров пресинаптического 1Щ / MUedl ,1973/ , нами было изучено влияние яда паука Agelena lablrlntlca на параметры пресинаптического ГШ и каяыиеъый ток пресинаптической мембраны.

3.1 ДЕЙСТВИЕ-Ш ПАУКА Agelena lablrlntlca -НА Са2*-КАНАЛЫ ПРЕСШШШГСЕСШ ШЩРАН НЕРВНО-ШЫЕЧНЫХ СИНАПСОВ ' "• ЛЯГУШКИ \

Эти эксперименты проводили на проксимальных участках нервного окончания лягушки путем внеклеточного отведения сигнала .который является суммой Na*- и К*- токов,участвующих в генерации пресинаптического ПД ¿Са2+-тока пресинаптической мембраны . , активируемого пресинаптическиы ГЩ и тока концевой пластинки (ТКП)(рис.?А). Как показали эксперименты, добавленкэ яда паука(100 ыхг/цд) нё вызывает изменений амплитуды и кинотики Мл+- и ¡Г-ксипоиантов регистрируемого -сигнала. Вместо с • тем в этих условиях наблюдалось значительное снижение амплитуды тока, состояцэго ив ТКЛ и и кальциевого тока (рис. 7Б).

С целью . кссдгдоваиия■ влияния яда паука непосредственно на Са2* -ток в среду добавляли тубокурариы Cl*lb-3lJ) и тетрадти-да^оинй (lislO'^l) , которыз' блокируют соответственно ТИП и К^-Коипояант пресинаптического ПД. в этих условиях регистрировался ток.» состоящий из Na*-тока пресинаптического ПД и

Рис.7 Влияние яда паука А^е1епа ааЫг!пг1са на токи нервного окончания лягушки.

А - контроль ; Б - через 30 мин. .. после добавления яда ( 100 мкг/кл ). Стрелками указаны: I - На*-' компонент, 2 - К+-ког.тонент, 3 - ток концевой пластинки.

Саг+-тока пресинаптической мембраны. Как показали эксперименты, добавление яда паука (50 мкт/мл ) приводит к заметному подавлению Саг*-тока. Степень подавления Саг+-тока прямо зависела от концентрации яда паука. Так, при концентрации 150 мкг/ мл яд паука снижал амплитуду Са2+ -тока на 95Х относительно" исходного уровня.

Эти экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о тем, что яд паука Аее1епа 1аЫг1пИса непосредственно взаимодействует с потенциалзависимымй Са2+-каналами пресинаптической мембраны.

' Путем гельфильтрации и ионообменной-хроматографии из яда

' " 20 - , паука Agelena lablriñtlea выделен низкомолекулярный компонент с мол.массой около 1000 да (Насыров и др., 1995). Этот компонент, как и цельный яд, вызывал существенное снижение амплитуды Са2+-токов пресинаптической.мембраны нервно-мышечых синапсов лягушки (рис. 8). А Б

РИС.8 Влияние компонентаAgl-l яда паука Agelena labirintica

на кальциевый ток пресинаптической момбраны нервно-мышечного синапса лягушки.

А - контроль ; Б - через 30 мин после добавления компонента Agl-1 (5«Х(П7М). Стрелкой указан кальциевый компонент гока. •' .

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, чгео эффекты', * вызываемые ядом паука A.labirintica обусловлены наличием в его составе компонента с мол. массой около 1000 Да, который, избирательна взаимодействует с потенциалзави-симыми Са2+- каналами пресинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов лягушки и блокии ¿тих-

- 21 -ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что цельный яд паука.Arglope lobata и его компоненты - аргиолобатин (мол.масса 657 Да) и компонент A-V-2 (мол. масса 637 Да) подавляют глутаматактивируемые токи идентифицированных нейронов ( Ша4. и ППа1) подглоточн.ого ганглия виноградной улитки Helix pomatla. " .

2. Показано, что аргиолобатин смещает потенциал реверсии глутаматактивируемых токов на 6-10 мВ и кривур' доза-эффект вправо относительно оси абцисс. Увеличение концентрации аппли-цируемого глутамата не приводило ' к восстановлению максимума токов, сниженных аргиолобатином, что•свидетельствует о неконкурентном характере действия аргйолобатииа. • Полученные данные указывают на взаимодействие аргиолобатина с канальной частью глутаматных рецепторов нейронов виноградной улитки.

3. Показано, .что компонент A-Y-2 не влияет на потенциал реверсии глутаматактивируемых токов. В присутствии компонента A-V-2 кривая доза-эффект глутаматактивируемых токов параллельно смещается вправо относительно оси абцисс. Увеличением концентрации апгшщируемого глутамата можно восстановить максимум глутаматактивируемых токов, сниженных компонентом A-V-2, что указывает на конкурентный характер действия компонента A-V-2. Представленные данные свидетельствуют о том,что компонент A-V-2 взаимодействует с узнающим участком глутаматного рецептора.

4. Обнаружено, что аргиолобатин усиливает степень десен-ситизации глутаматных рецепторов нервно-мьппечных синапсах саранчи. Аргиолобатин эффективно подавлял глутаматактивируемые токи на препаратах предварительно обработанных конканавалином А. В присутствии аргиолобатина зависимость ЕПСТ от мембранного

. - 22 -

потенциала приобретала нелинейный характер. Полученные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие аргиолобатина с глу-таматныы рецептором нервно-мышечных синапсов саранчи одновременно влияет на функциональное состояние участка десенситиза-цим и канальную часть рецептора.

5. Обнаружено, что яд паука Agelena lablrlntlca вызывает снижение частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки, квантового состава потенциалов концевой пластинки и подавляет Са2+-токи пресинаптической мембраш нервно-мышечных синапсов лягушки.

Установлено, что компонент Agl-1 (мол.массой 1000 Да), выделенный из яда паука Agelena lablrlntlca, блокирует потен-циалаависише Са2+-каналы пресинаптической мембраны нервно-мы-иечных синапсов лягушки..

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осипенко О.Н., Ахмедов К.Д.-Влиянне ядов пауков семейства Aranoldao на глутамат-вызванные токи в идентифицированных нейронах Helix pomatla. Теэ.докя-.V Всесоюзной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика АН Армянской ССР, члена-корреспондена АЛ СССР Х.С.Коштоянца.Москва,октябрь 1990,с.219.

2. Усманов П.Б., Каликулов Д., Ахмедов К.Д..Наснров К.Э., Нуртаев Х.С.- Влияние компонента A-V-2 яда паука Arglop© lobata на глутаматергические синапсы. Tea.докл.1 съезда физиологов Средней Азии и Казахстана,Душанбе,199i.с.147.

•.. 3. Ахмедов К.Д., Каликулов Д., Усманов П.Б. -Действие яда паука Arglopo lobata на глутаматние ответы идентифицированного нейрона (ППа4) виноградной улитки.ДАН ГУз, 1991,M U.c.

- 23 -

4. Усманов П.В., Каликулов Д., Насиров К.Э., Ахмедов К.Д. -Новые нейротоксические компоненты яда паука Arglope lobata. Биол.мембраны,1991,т.8,N 11,с.1135-113б.

5. Ахмедов К.Д., Каликулов Д.. Усманов П.Б.-Влияние яда паука Arglope lobata на глутаматные ответы идентифицированного нейрона (ППа1) виноградной улитки.Узб.биол.журн.,1992 N 1, с.77-78.

6. Усманов П.Б..Каликулов Д., Насиров К.Э., Ахмедов К.Д.-Действке аргиолобатина на L-глутаматактивнруемые токи мышц саранчи. Биол. мембраны,1992,N 10, с.1142-1143.

Киска мазмуни

Arglope lobata ва Agelena lablrlntlca Ургимчаклари вахар-лари ва компонентлари Урганидди.

Маълум б^лди-ки Arglopa lobata ургкмчаги аахари ва унинг компонентлари аргиопин ва A-V-2, уаум шилик куртидаги аниклан-ган нерв хужайралари (ППа4, ППа1) нинг глутаматга бергаи жаво-бини йуколишига олиб келади. Аргиопйн компонеити нерв xyiaflpa-ларидаги глутамат рецепторлари фаолиятига иоконкурент равишда т^скинлик килади ва рецепторнинг канал кисмига таъсир к^рсата-ди. A-V-2 компоненти эса глутамат билан талашиб глутамат ре-цепторига конкурент равишда тУскинлик к?*лади. Демак A-V-2 глутамат рецепторининг сезиш кисмига тагсир курсатади.

Яна маъдум б^лди-ки аргиопин компоненти чигирткашшг нерв ва мускул синапсларига таъсир кщшб, увдаги глутамат рецептор-ларининг десенситизация даратасини оширадй, зцамда конконавалин А ни таъсирини йук килади. Демак аргиолобатин бир вактда глутамат рецепторининг десенситизация кисмига, хам канал кис-

мига таъсир кррсатади.

Agelena lablrlntlca Ургимчаги захари ба^анинг нерв тола-сидаги Са2+ га хос каналларнинг фаолиятига тус^инлик ^шади.

Маълум б^лди-ки захар таркибидаги Agl-1 комлонети нерв ва мускул синапсининг нерв кисмидаги потенциалга боглик б^лган Са2+ - каналларни тусиб к?яди.

SUMMARY

The investigation of action of Arglopa lobata and Agelena lablrlntlca spider venoms and their low- molecular components.

The orude venom of Arglopa lobata spider venom and Its low molecular components - argiolobatin (m.m.657 Da) and A-V-2 (m.m.637 Da) inhibit glutamat-activated currents of Identified neurons (RPa4 ai)d RPal) of vine snail Helix pomatia.

The argio'obatin uncompletely Inhibits the glutamat-activated currents . but A-V-2 contains competitive action with glutamat and . acts at Jthe recognizing site of receptor.

It was discovered that argiolobatin Increases the desensitization and blooks the effect of Con A on glutamat receptors of locust's nerve-musoular synapses.

The Agelena .lablrlntlca spider venom decreases the MEPPs frequency and inhibits the presynaptic membrane's Ca2+-currents of frog ! <erv<»-muscular synapses. The lowmoleoular component. oJ thli venom Agl-1 (m.m. 1000 Da) blocks the presynaptic : meibrane's potential-dependent Ca2+-channels of frog nerve-muscular synapses.