Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционные и экологические аспекты секреторной активности защитных желез членистоногих животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эволюционные и экологические аспекты секреторной активности защитных желез членистоногих животных"

П V С) -и о О

российская академия наук

институт эволюционной физиологии и биохимии им. и. и. сеченова

На правах рукописи удк 595:591.141

ЛИСТОВ

Михаил Владимирович

ЭВОЛЮЦИОННЫЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЗАЩИТНЫХ ЖЕЛЕЗ ЧЛЕНИСТОНОГИХ ЖИВОТНЫХ

03.00.13 — физиология человека и животных

автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

санкт-петербург 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском технологическом институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. ВАСХНИЛ

БОНДАРЕНКО Н. В. доктор биологических наук, профессор ЛАПИЦКИИ В. П. доктор биологических наук, ст. н. с. НОВИКОВ С. Н.

Ведущая организация — Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова.

Защита диссертации состоится « » 1992 года

в .(О часов на заседании специализированного совета Д 002.89.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).

С монографией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

професссор МАСЛОВА М. Н.

f . . . ; (¡"ЯД {

ОНЦАЯ ХАРШЕРИСТИКА. .^^Актуальность темы. Защитные железы членистоногих в последние годы интенсивно изучаются.Причиной тому является не только общий интерес исследователей к структурам кожного происхождения.выработанным у Arthropode для защиты от врагов,но и возможность использования их наличия или отсутствия ( Doyen, 1972), морфологических особенностей (Kendall, 1974; Kanehiaa, Murase, 1977), а также химического состава выделяемых ими секретов (Moore, tfail-bank, 1968: Schildknecht et al.,1968;Doyen,1973; Kanehisa,Murase 1977; Dettner, 1979) для решения вопросов систематики.

Инструментом формирования новых пород домашних животных,сортов культурных растений и штаммов промышленных микроорганизмов является искусственный отбор, а исходным материалом для него служат дикие и культурные формы, в том числе полученные в результате химического мутагенеза.

Диссертация посвящена защитным железам членистоногих животных и влиянию секретируемых ими токсичных веществ на изменчивость организмов,попадающих в зону влияния этих соединений in vivo или in vitro. Проблема изменчивости организмов в эволюционном процессе всегда будет привлекать к себе внимание биологов разных специальностей.Что касается актуальности прикладной части диссертации, то в настоящее время во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии ведутся исследования по созданию энтомоцидного биопрепарата на основе Bacillus thuringiensis var.tenebrioidea (?) (серотип уточняется)против жесткокрылых вредителей.Способ селекции энтомопатогенных бактерий (Листов и др.,1981) с помощью хи-ноидного секрета малого чёрного хрущака Tribolium destructor Uytt. (Tenebrionidae;, ранее использованный нами при работе

I

со штаммами продуцента энтобактерина Bacillus thuringiensis var. gaiieriae, может быть вполне обоснованно цривлечён к аналогичным изысканиям цри селекции штаммов Bacillus thuringiensis других вариантов, в частности, var. tenebrioides.

Прослеживается связь развиваемых диссертантом представлений о природной мутабильности организмов с проблемами защити окружающей среды от антропогенных загрязнений мутагенами и канцерогенами - это особенно актуально в век охраны природы и экологизации общественного сознания.

Цель и задачи исследований. Цель работы состоит в том.чтобы показать возыоеность осуществления химического мутагенеза в природных условиях при участии веществ, секретируемых защитными железами отдельных ввдов членистоногих животных.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности строения и секреторной активности защитных желез различных видов членистоногих.

2. Изучить химический состав токсичных секретов наиболее распространенных ввдов Arthropoda, в том числе насекомых, повреждающих продовольственные запасы.

3. Выявить генетическую активность соединений, входящих в состав защитных экссудатов членистоногих.

4. Показать способность хиноидного секрета малого чёрного хрущака Tribolium destructor влиять на изменчивость признаков отдельных ввдов микроорганизмов.

5. Изучить взаимодействие ДНК Escherichia coli с 1,4-бензохино-ном и гвдрохиноном, входящими в состав защитных секретов многих видов насекомых.

6. Разработать и сформулировать положения экологической теории

2

природной мутационной изменчивости организмов.

Место проведения исследований. Работа выполнялась в 19751989 гг. в Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова »Всесоюзном НИИ прикладной микробиологии и ВНИИ защити растений. Завершение работы осуществлено во Всесоюзном научно-исследовательском технологическом институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения.

Материалы и методы исследований. В опытах по изучению действия защитного секрета Tribolium destructor на микроорганизмы использовали нативный секрет желез, а также водный раствор секрета, извлеченный из жуков с помощью вымораживания. Энтомопа-тогенные простейшие (Листов, 1976), бактерии и патогенные для человека шигеллы (Листов, 1982) были выбраны нами в качестве объектов, на которых испытывалось действие хиновдного секрета Т. destructor, в связи с тем, что в местах своего обитания хрущаки могут контактировать с этими микроорганизмами.

Научная новизна результатов исследований. Мутагенам окружающей среды посвящен целый ряд работ обзорного характера (Дубинин, Пашин, 1977; Nagao,Sugimura , 1978), в том числе статей,касающихся генетически активных соединений, продуцируемых живыми организмами,- в основном плесневыми грибами и высшими растениями (Tazima, 1974; Ong, 1975). Вопрос об экологическом значении природных мутагенов неоднократно поднимался многими, в том числе только что названными генетиками, но впервые наиболее полно изложен диссертантом на страницах журнала "Энтомологическое обозрение" (Листов, 1982,1983), где по-новому ставится вопрос о роли химических взаимодействий в экологии членистоногих животных.

В соответствии с разработанной автором концепцией в природе имеются отдельные виды членистоногих, вырабатывающие и выде-

лявдие в окружающую срнду мутагены - мутагенофоры. Ыутагенофоры соадают в экологических системах мощше очаги изменчивости, приуроченные к специфическим биотопам. Благодаря сложным и разветвленным биоценотическим связям действие природных мутагенов захватывает организмы самых разных систематических груш - от вирусов до позвоночных тавотных. Следует подчеркнуть, что генетическая активность обсувдаемых диссертантом химических соединений изучалась до недавнего времени в полном отрыве от их природных источников - членистоногих животных, издавна использующих альдегиды, хиноны, кетоны, пирролизидиновые алкалоиды и некоторые другие токсичные вещества в целях защиты от врагов.

Наличие в природе очагов изменчивости является постоянным фактором, воэдейстнущим на эволюционный процесс. Автором дается научное обоснование тому, что в качестве активных очагов изменчивости организмов могут выступать норы и гнезда грызунов и птиц, естественный богатый биоценоз которых включает в себя виды мута-генофоров.

Выявление неизвестной ранее роли членистоногих в качестве мутатенофоров, а также возможной структурированности окружающей среды, заключавшей в себе очаги природной мутационной изменчивости, позволяет диссертанту рассмотреть специфику секреторной активности защитных желез членистоногих в экологическом и эволюционном аспектах.

Реализация результатов исследований. Диссертантом опубликована монография "Химическая защита у членистоногих и изменчивость организмов" - Л., Наука, 1989.- 157 е.- Библиогр. 413 назв. Ил. 41. Табл.15.

Практическая ценность работы. Опубликованная книга является первой монографией, обобщающей большой фактический материал по

теме диссертации и может служить справочником для энтомологов,а также исследователей, изучающих генетически активные вещества биогенного происхождения.

Разработан оригинальный способ селекции энтомопатогенных бактерий с помощью хиноидного секрета Tribolium destructor, на который видано авторское свидетельство СССР JS 871526.

На защиту выносится доказательство роли хиноидных и некоторых других защитных экссудатов членистоногих животных в качестве биогенного фактора изменчивости организмов - как основное положение оригинальной экологической теории природного химического мутагенеза.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований доложены и обсуждены на заседании:

- секции общей генетики и цитогенетики Ленинградского отделения общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (1990);

- Ленинградского паразитологического общества (1990);

- Ленинградского городского научного семинара "Химия и биология физиологически активных веществ" (1991);

- конференции лаборатории химических канцерогенных агентов института онкологии им. профессора Н.Н.Петрова (1988).

ДОКЛАД

Движущей силой эволюции, как показал Ч.Дарвин, является естественный отбор, основанный на выживании форм растений и животных, оказавшихся наиболее приспособленными к конкретным условиям окружающей их среды. Причиной изменчивости организмов, поставляющей материал для отбора, являются мутации. Современная генетика различает индуцированные и спонтанные мутации, причем чёткое их разграничение невозможно, поскольку агенты, с помощью которых получает мутации искусственно (например, ионизирующая радиация), присутствуют и в окружающей среде.

Среди токсичных веществ, встречающихся в природных условиях а также производимых промышленностью (пищевой, фармацевтической и др.), при специальных исследованиях находят соединения с генетической активностью.

Вещества с генетической активностью продуцируют и некоторые членистоногие животные. Так, например, известно,что самцы бабочек-данаид, Питающихся на растениях Не11оггор1иш, Сгс^а1аг1а и др.,содержащих пирролизидиновые алкалоида, используют продукты метаболизма этих соединений в качестве половых феромонов ( 01агк, 1976). Следует однако сказать, что феромоны используются насекомыми в очень малых дозах и едва ли могут оказывать существенное генетическое влияние на контактирующие с ними жиые организмы и клетки.

В то же время среди наземных и водных членистоногих известно много видов и форы, представители которых при раздражении выделяют токсичные вещества в целях самозащиты. Чаще всего эти вещества ( в частности, альдегиды, хиноны и фенолы) представляют

собой секрета специальных лселез, расположенных у разных насекомых (перепончатокрылых, жуков, клопов, уховерток, тараканов и др.) в голове, передне- и задне-груДи, сегментах брюшка, а у многоножек - в большинстве сегментов.

Отдельные вещества, продуцируемые членистоногими, обладают генетической ( в том числе мутагенной) активностью. Это альдегиды цитраль и цитронеллаль, фенолы и хиноны, пирролизидиновые алкалоиды и другие соединения, о генетической активности которых давно известно генетикам, но изучение многих из которых шло в отрыве от их природных источников - членистоногих животных.

У некоторых насекомых защитные вещества, например, пирролизидиновые алкалоиды у бабочек кровавой медведицы, входят в состав гемолимфы и выделяются с нею через специальные поры тела или разрывы межсегментных мембран.

Мутагенная активность ( в скобках указана ее относительная сила) монокроталина (1,6), ласиокарпина (1,0=14,0$ рецессивных леталей, связанных с полом), гелиотрина (0,9), сенеционина (0,4) и некоторых других пирролизидиновых алкалоидов показана на дрозофиле (Clark, I960;Brink , 1966), гелиотрина и ласиокарпина -на Aspergillus nidulana (Alderson, Clark, 1966).

Токсичность веществ, входящих в состав защитных экссудатов членистоногих животных, тесно контактирующих с цветковыми растениями, с семенами сельскохозяйственных культур при их хранении, а также с микроорганизмами я водными животными, обусловливает их функционирование как одного из факторов естественного отбора. Поскольку многие защитные вещества членистоногих обладают генетической активностью, экссудаты таких животных могут не только убивать, но и вызывать изменчивость контактирующих с ними организмов.

Химическая защита у членистоногих животных

Впервые защитные железы были открыты Дюфуром в 1826 г. у жуков рода maps (по: Павловский, 1967) и описаны Гисслером ( Gissler, 1879) и Гильсоном ( Gilson, 1889) у чернотелок родов Eieodes и Blaps под названием "отпугивающие" и "пахучие" железы. Виллистон ( wiiiiston, 1884).описывая характерное при раздражении поведение жуков рода Elecdes - принятие вертикального положения и выбрызгивание зловонното секрета, называет его защитным. Е.Н.Павловский, изучив морфологию желез чернотелки Gnaptor spinlman.ua Pail, в 1915 г. (Павловский, 1915) при опубликовании работы на русском языке называет их "пахучими" (Павловский, 1967).Следует заметить,что перечисленные термины применялись авторами для обозначения брюшной пары пахучих желез имаго чернотелок, многие из которых, в том числе роды Tribolium,Blaps, Eleodes и Gnaptor имеют дополнительную пару аналогичных желез в переднегруди ( Roth, 1943; Palm, 1946; Kendall, 1974). Такая же картина наблгдается у представителей яуков-пыльцеедов семейства Alleculidae (Kendall, 1968), в ТО время,как у всех изученных видов Nilionidae найдены как брюшные, так и грудные, а у Lagriidae только брюшные пахучие (защитные) железы ( Kendall, 1974).

В настоящее время специализированные защитные железы известны у двупарноногих многоножек, сенокосцев ( Araclaiida, Opilio-nes), тараканов, уховерток, палочников, клопов, разнообразных жуков (жужелиц, чернотелок, плавунцов, стафилинов и др.), гусениц некоторых чешуекрылых и перепончатокрылых насекомых.Защитные железы имеются не только у представителей типа членистоногих ( Arthropoda), они такке есть у перипатов и перипатопсид ( Опу-chophora).

Южноамериканские сенокосцы ceM.Gonileptidae имеют две го-ловогрудные железы, продуцируицие бензохиноны (Estable et ai., 1955). Когда сенокосец потревожен, он выделяет секрет,разбавляет его извергающейся водянистой жидкостью и наносит смесь на нападающего кончиками своих передних ног. Такие хищники,как муравьи, эффективно этим отпугиваются (Eisner et al., 1971).

Многоддная, в т.ч. питающаяся пыльцой растений обыкновенная уховертка Forfícula auricularia L. имеет две пары маленьких мешкообразных желез ( Yosseier, 1890), расположенных на спинной стороне брюшка и открывающихся каждая самостоятельно на задних кромках 3 и 4 бршных тергитов. При раздражении уховертка, вращая брюшком и стараясь схватить нападающего клещами, разбрызгивает хиноидный секрет ( Eisner, I960) на расстояние, в несколько раз превышающее её собственные размеры.

Защитные железы имеются как у самцов, так и самок членистоногих, причем у насекомых с неполным превращением и многоножек они есть также у неполовозрелых личинок, правда, более простого устройства по сравнению о железами имаго. У насекомых с полным превращением защитными железами обладают только взрослые особи и единственным исключением в данном случае являются гусеницы чешуекрылых.

По своей морфологии, числу и расположению защитные железы членистоногих очень разнообразны и, по общему мнению исследователей, произошли у разных животных независимо друг от друга, являясь гомологичными только в пределах определённых групп - например, в надсемействе^еготега ( Kendall, 1968, 1974), у жужелиц Carabidae (íbrsyth., 1972; Kanehisa, Shiraga, 1978), a также в пределах отдельных подсемейств Staphylinidae (Brand et ai., 1973), железы которых развивались, повидимому, полифилети-

ческям путем (Araujo, 1978),что'в сущности можно сказать обо всех членистоногих.

В целом защитные железы имаго членистоногих представляют собой, как правило, парше органы и состоят из двух резервуаров ( у клопов и некоторых видов тараканов имеется один объемистый резервуар) и железистой ткани. Секреторная ткань может являться структурной частью стенки резервуара, может покрывать её отдельные участки снаружи или лежать совершенно отдельно в виде долей соединяясь между собой и резервуаром с помощью кутикулярных трубчатых каналов. Внутренняя поверхность резервуаров выстлана кутикулярными слоями и шесте с дренажными трубками и парными выводящими каналами цредставляет собой как бы одно целое о наружной кутикулой членистоногого, переходя в нею через устье, часто обрамленное скульптурным утолщением.

Основу секреторной ткани составляют одно- или двуклеточные элементарные железы, снабженные соответственно одним или двумя внутриклеточными пузырьками, специфическими органеллами секреции,

которые дренируются кутикулярной трубочкой (Balm, 1946). Такое строение элементарной железы наблвдается практически у всех изученных членистоногих, за исключением гусениц чешуекрылых (Cross-ley, Waterhouae, 1969; Percy, MacDonald, 1979).

Нерастворимая хитиновая выстилка органов химической защиты, в том числе дренажных трубочек элементарных желёз,несомненно,помогает ортанизму членистоногого избежать отравления токсичными веществами продуцируемых секретов. Кутикулярное строение станок мешкообразных резервуаров желёз является веским доказательством того, что эти органы произошли в результате впячивания стенки тела предков современных Arthropode (Forsyth, 1972; Kendall , 1974 и др.)

Еще одним доказательством служат выворачивающиеся пахучие

10

железы некоторых членистоногих. Это наиболее примитивно устроенные железы членистоногих. Секрет таких желёз у чернотелок родов Tenebrio, Idiobates, Alphitobius, Palorus, Zophobaa ( Roth, 1945; Tschlnkel, 1969; Tseng at al., 1971; Kendall, 1974) И некоторых других насекомых поступает в окружающую среду,испаряясь о поверхности резервуаров,котда членистоногое раздражено, и выворачивает их наружу.

Выворачивание желез у гусениц рода Ра pillo происходит под давлением гемолимфы (Blauer, Meinwald, 1966),что .вероятно, свойственно и перечисленным выше чернотелкам,во всяком случае у Tenebrio molitor L. выделению секрета соответствует резкое повышение давления гемолимфы в теле жука (Kendall , 1974).

У большинства видов членистоногих, в частности, у хинон-продуцирующих многоножек, у многих чернотелок и жужалиц защитные секреты при раздражении животного просто вытекают из устьев желёз в виде небольших капелек. Так, например, происходит выделение секрета у повсеместно распространенных мелких хрущаков рода Tribolium, у крупных чернотелок рода Coelocnenia, обитающих в лесах на западе Северной Америки ( Doyen, 1973), а также у жуков - пыльцеедов Gonodera murina L. и Cteniopus aulphureus L. , что обусловлено строением их брюшных желез,„сходных с железами чернотелок ( Kendall, 1968).

Поскольку резервуар железы лишен какой-либо сжимающей мускулатуры, выделение секрета в виде выступающих капель или выбрызгиваемой струйки должно происходить под давлением гемолимфы или вследствие непрямого действия мускулатуры стенок тела членистоногого ( Kendall, 1974).Выделению секрета способствует также эластичность стенок резервуара, который у многих чернотелок после опорожнения спадает.

Выбрасывание секретов отдельными видами членистоногих осуществляется подчас на значительное расстояние. Так, например, крупные Клопы-ЩИТНИКИ Teasaratoma papillosa Dr. способны выбрызгивать защитный секрет на 10-15 см. Эти насекомые распространены в Юго-Восточной Азии и повреадают цитрусовые культуры.Ядовитый секрет т.papulosa может вызвать сильное раздражение кожи и особенно опасен, когда попадает на слизистые оболочки глаз.

При механическом раздражении секрет Oimex lectulariua L., Еытекает из устьев железы и быстро испаряется. Таким же образом выделяет секрет клоп Oebaius pugnax Р.- щитник, повреждающий посевы риса в Ейсной Америке. Его большая округлая железа занимает низ полости тела в заднегруди и двух первых сегментов брюшка и открывается на боковых сторонах метаторакса двумя маленькими устьями,из которых при раздражении насекомого изливается оранжево-красный секрет, содержащий 2-гептеналь ( Blum et ai., I960). При нападении муравьев рода Solenopsis клоп выпускает капельки секрета с той или другой стороны тела - в зависимости от направления атаки хищника.

Клоп Acanthocephala femorata Р.- больших размеров щитник, встречающийся в США. на цитрусовых, может выбрызгивать гексе-наль-содержащий секрет на 20 см ( Blum et ai., 1961), а африканский клоп Petascelis remipes, когда его настигает птица,выбрасывает секрет на расстояние до 30 см ( Prestwich, 1976).

Водяной клоп-гладыш Plea leachi McGr et Kirk. Продуцирует перекись водорода (Maschwitz , 1971). У членистоногих перекись водорода образуется, невидимому, из гидрохинона,- который легко окисляется без разрыва бензольного крльца ( Wailing, 1963) с образованием п-хинона и перекиси.

У куков-шгавунцов подсем. Colymbetinae и Dytiscinae

12

гидрохинон найден вместе с бензойной кислотой ( Dettner, 1979)и у многих видов составляет основу секрета их пигидиальных желёз.

Еуки-вертячки сем. Gyrinidae такке хорошо известны среди насекомых, населяющих пруды и речные заводи» Эти небольших размеров (5-7 мм) жуки стайками кружатся на поверхности водоёмов в погожие дни, а при опасности выпускают защитный секрет и прячутся. Секрет пигидиальных желёз вертячек, содержащий альдегида и кетоны, токсичен для живущих в воде бактерий, жгутиковнх, амёб и водорослей (. Schildknecht, 1977). Некоторые из них погибают при контакте с раствором секрета в течение нескольких минут.

Резервуар у хинонсекретирущих многоножек однокамерный и их железы отличаются от подавляющего больишнотва других членистоногих, пожалуй, только своим числом и наличием запирающих выходные отверстия клапанов. Их желтого или оранжевого двзФа маслянистый секрет вытекает из резервуаров сегментов, подвергшихся раздражению, в виде небольших капелек. Однако у многоножки Rhinoorichus latersperger L. ( Splrobollda) с о.Гаити секрет выбрызгивается на расстояние до 75 см ( Casnati et ai.,I963), что небезопасно и для человека, поскольку попадание хинона в глаза вызывает болезненные ощущения и весьма опасно для зрения.

Многоножки могут приводить своя железы в действие поодиночке или группами в зависимости от силы раздражения ( Sisner, Meinwaid , 1966). Подобная картина наблкдается у тараканов Diploptera punctata Each., распыляющих хиноидный секрет латерально открывающихся брюшных желёз слева или справа в зависимости от того,какая сторона тела подвергалась раздражению ( Eisner et ai., 1959).

Токсичные вещества тропических тараканов, изучению которых посвящена большая часть работ по защитной секреции этих древней-

13

тих насекомых,представлены в основном гексеналем ( Roth et ai., 1956; Blum , 1964; Beim et al., 1977), а также хинонами ( Roth,Stay , 1958) и крезолом ( Maschwitz, Tho, 1978) .которые присутствуют в резервуарах желёз практически без сопутствующих соединений.

Защитная функция секретов пахучих желёз тараканов Dipiopte-ra punctata, Eurycotls floridana W., Neostylopyga rhombifolia St. показана Эйснером (Eianer et ai.,1959) с соавторами в опытах с хищными членистоногими (муравьи, жужелицы и пауки), а также позвоночными животными (лягушки, ящерицы).Отпугивающее действие оекретов тараканов было различным, что, очевидно, связано с их химическим составом, а также со способом разбрызгивания.

Пуэрториканский таракан Pelmatosilpha coriacea R. выбрасывает из большого мешкообразного резервуара гексеналь ( Blum , 1964), а у новозеландского вида Piatyzostera novaeseelandiae Br. секрет состоит из смеси гексеналя и октеналя (Beim et ai.,1977) - альдегидов, характерных для пахучйх секретов клопов-щитников.

В зависимости от силы раздражения жужелица chiaeniue cordi-collis к. выбрызгивает м-крезол, направляя его струйку в цель поворотом брюшка, из одной или обеих пигидиальных желёз ( Eisner et al., 1963).

Основная камера резервуара жужелиц-бомбардиров рода Brachi-nus содержит бесцветные гидрохинон и 25$ перекинь водорода ( Schildknecht,Holoubek , 1961). Поступая в момент выстрела в реакционную камеру, эта смесь соединяется с секретируемдаи там каталазой и пероксидазой, в.результате чего перекись водорода быстро разлагается на воду и кислород согласно реакции: 2Н202 = 2 HgO + 02 + 46 ккал, а гидрохинон окисляется в хинон и с характерным звуком (хлопком) выбрасывается наружу в мелкодис-

14

персном состоянии с температурой около I00°C (Aneshansley et al^969).

Бомбардиры обладают весьма надёжной защитной системой,которая,как показали опыты Эйснера (Eisner, 1958) эффективна даже против таких хищников, как богомолы.

Перепончатокрылые насекомые - одиночные и колониальные пчелы, муравьи, использующие секрет мандибулярных желёз при обороне выделяют его во время укуса.

Особый для нас интерес представляет железа Насонова,которая имеется у распространённой по всему свету медоносной пчелы A.pie meliifera L. Эта железа представляет собой неглубокий желобок (резервуар), который идёт по переднему краю верхнего полукольца последнего (седьмого) членика брюшка рабочей особи и прикрыт задним краем шестого членика (Насонов, 1885). В дно этого желобка-резервуара открывается множество одноклеточных желез,кавдая из которых дренируется кутикулярной трубочкой.

Секрет железы Насонова содержит около цитраля ( Butler, Caiam, 1969). Токсичность цитраля, а также некоторых других феромонов тревоги, продуцируемых перепончатокрылыми показана в опытах на грибных патогенах растений, насекомых и человека ( Cole, Blum, 1975). В работе (Рапопорт, 1948) представлены результаты изучения мутагенной активности цитраля и других альдегидов в опытах на дрозофиле; генетическому анализу подвергались половые клетки мух из культур, в которых воздействие альдегида вызывало гибель по крайней мере 75% личинок и яиц.

У медоносной пчелы цитраль используется не только как феромон тревоги, но и для метки обильного корма,лишенного сильного запаха (Киршенблат, 1968). Когда рабочая пчела находит такой корм,она выворачивает келезу и запах цитраля сообщается окружающим предметам и воздуху на месте кормления.

15

Защитные железы чернотелок

Защитные железы чернотелок (Tenebrionidae ) давно привлекали внимание энтомологов и, помимо работ, выполненных в XIX в., известны и другие исследования ( Roth, I943;I945; Palm, 1946; Tseng et al., 1971; Kendall, 1974) пахучих желёз этих широко распространенных насекомых - особенно тех из них, которые вредят продовольственным запасам.

Секреторные клетки питидиальных желёз чернотелок представлены двумя типами и у рода Tribolium одноклеточные элементарные железы располагаются поверх эпителия стенки резервуара, а двукле-точные образуют секреторную дольчатую ткань, прикрывающую стенки резервуара и слой одноклеточных желез сверху. Железы интенсивно снабжаются кислородом с помощью трахей. Опорожнение резервуаров происходит благодаря сокращению мышцы, открывающей выводной канал, и, по-видимому, других мышц, приводящих в движение стенки брюшных сегментов, в результате чего может происходить сжатие желез.

Мейнвальд С соавторами ( Meinwald et al., 1966),исследуя процессы биосинтеза бензохинонов у чернотелки Eleodes longicollis пришли к выводу,что хиноны образуются у членистоногих двумя независимыми способами. Основной путь образования 1,4-бензохинона заключается,по-видимому, в использовании ароматического кольца тирозина и фенилаланина (через гидрохинон, являющийся непосредственным предшественником 1,4-бензохинона), а алкилированные бензохиноны (толухинон и 2-этил-1,4-бензохинон) образуются из ацетатных и малонатных остатков.

Ресурсы химической защиты чернотелок не столь малы,как кажется на первый взгляд, и подтверждением тому являются размеры резервуаров их желез. Резервуары питидиальных желез тпьоНии

16

destructor (дайна тела хука 4,5-5,5 мм) имеют, например, длину от 0,5 до 1,2 мм ( Pain, I94S), а размеры резервуаров крупных жуков рода Blape, Gnaptor, Sleodes Coeloenemie достигает в длину 4-4,5 ММ при ширина 1-1,5 ММ ( Kendall, 1974; Doyen, 1973).

Общее количество защитного секрета у 50-75 дневных жуков Tri-bolium madens Oharp. (длина тела 3,6-5,2 мм) 2II-24I MKT, у T.brevicornia bee<-333-375 МКГ на особь ( Wirtz et al, 1978), причем расчётное количество бензохинонов на одного жука было соответственно 152-178 и 228-255 мкг, а остальную часть секрета составлял i-пентадецен. Принимая за основу расчётов,что в одном жуке T.caatameun (длина тела 2,3-4,4 мм) содержится в среднем 55 мкг хинона, Ладит с сотрудниками (ladiscb. et ai., 1967) произвели расчёты количества этого токсина в сельскохозяйственной продукции, заселенной булавоусыми хрущаками. Так, было подсчитано, что в одной из партий семян (95390 т) подсолнечника из Югославии находилось 40000 млн. насекомых, в том числе 18000 млн. т.са-staneum . Расчёт показывает,что общее количество хинонов в данной партии семян около 900 кг.

Общее содержание хинонов в секретеT.destructor составляет 61,4$, T.confusum Duv.- 73$, T.brevicornis - 50,5$, T.madens-54,I$, T.audax Hal.- 57,5$, T.castaneura - 58,3$. Толухинон И ЭТИЛ-ХИНОН в секрете жуков T.destructor находятся в соотношении 1:2,6 ( Haig et al., 1978).

Токсичные вещества в секретах желез членистоногих

Изучению защитных секретов членистоногих животных посвящено довольно много работ, в том числе обзоры Рота (Koth, Eisner, 1962), Шильдкнехта (Schildknecht et al., 1964), Эйснвра (Eisner, . Meinwald, 1966) И Вэтерстоуна (Weatherston., Percy, 1970) с со-

17

авторами, а также обзор Елша ( Blum,1969) "Феромоны тревоги".

Выделяемые членистоногими защитные секреты обладают, как правило, едким раздражающим запахом. "Хиноидным" - у видов,продуцирующих хиноны и их производные; "запахом карболки" - у фенол-и крезол-секретирующих ввдов; "клопиным" - обусловленным наличием в секретах клопов и некоторых тараканов алифатических альдегидов , в первую очередь - гексеналя; "горького миццаля" - у многоножек Polydesnida, выделяющих синильную кислоту и бензальдегид "лимонным" - у перепончатокрылых и отдельных ввдов жуков, в том числе мирмекофилов, продуцирующих алифатические терпены цитраль и (или) цитронеллаль, а также соответствующие этим непредельным альдегидам спирты (линалол и др.). Многие виды членистоногих продуцируют жирные кислоты, в том числе муравьиную и уксусную.

Как правило, защитные секреты членистоногих состоят из нескольких главных и второстепенных компонентов. В этом кроется определенный смысл. Так, например, сенокосец Vononee sayi секре-тирует в своих железах 2,3-диметил-1,-4-бензохинон и 2,3,5-триметил-1,4-бензохинон. При комнатной температуре эти два хинона в отдельности являются кристаллическими веществами, а в смеси их точка плавления снижена, что обеспечивает нахождение секрета членистоногого в жидком состоянии (Eisner et ai., 1971). Изменение физических характеристик секрета, по сравнению с отдельными его компонентами, несомненно, имеет место у постельного клопа Cimex lectularius L., продуцирующего 2-гексеналь, 2-октеналь, 2-бута-нон и ацетальдегвд (Collins, 1968). Чистый уксусный альдегид имеет точку кипения 20,8°С и хотя секрет .с.lectularius очень летуч, его закипания в резервуаре железы не происходят.

Хиноны входят в состав защитных секретов шесте с альдегидами не только у чернотелок Eleodes beameri В. 2-мэтил-1,4-бензо-

18

хинон наряду с непредельными альдегидами является главным компонентом пахучих секретов многоножек Hhinocrichua inaulatue (Wheeler et al, 1964), стафилинов Bruailla canaliculate (Aleoeharinae) (Brand et al., 1973), Blediua mandibularia ' и B.spectabilis (Qxytelinae), причем у последних двух видов хинон (соответственно 6 и 1%) находится в смеси с цитралем (18 и 8$) (Wheeler et al, 1972).

Хиноидные секреты членистоногих обладают высокой токсичностью. Интересные данные по изучению летального действия сечете головогрудных желез сенокосцев сем. Gonyleptidae приводит Эстейбл с соавторами (Eatable et ai., 1955). Они сообщают,что смесь бен-зохинонов секрета эффективна против представителей 18 родов бактерий и простейших: в концентрации от 2,6 до 64 мкг/мл - против различных штаммов Bacillus cereus, B.subtilis.B.anthracis; в концентрации от 3 до 10 мкг/мл - против Staphylococcus aureus ; 3-II2 мкг/мл - E.coli; 100 мкг/мл -B.tuberculosis и Trypanoeoma cruzi. Токсичное действие хиноцдного секрета сенокосцев сопровождается нарушениями при делении бактериальных клеток.

Хиноидные секреты жуков рода Tribolium токсичны для плесневых грибов (Энгельгардт и др., 1965) и убивают энтомопатогенные микроспоридии (Листов, 1976). Как показали наши более поздние исследования, пары секрета Tribolium destructor токсичны для дизентерийных бактерий, кишечной палочки и сальмонелл.

Структура молекул большинства обсуждаемых нами биотоксинов имеет одну общую особенность - в нее входит кислород в составе карбонильной группы. Это относится к альдегидам, кетонам, хино-нам, а также пиррозидиновым и хиназолиновым алкалоидам, кантари-дину и педерину. Фенолы и кислоты составляют отдельную группу токсичных веществ членистоногих,но могут рассматриваться как

предшественники карбонильных секретов защитных желез Arthropode.

Изучение химической структуры биотоксинов наводит на мысль, что первоначально эти вещества функционировали в организме предков современных видов членистоногих животных и растений в составе защитного механизма, охранявдето клетку от перегрузки продуктами радиационно-химического окисления в условиях повышенного радиационного фона Земли в далёком прошлом.

Генетическая активность соединений,входящих в состав защитных секретов членистоногих

Альдегиды и кетоны. Об индуцированном химическом мутагенезе стало известно в начале 30-х тодов,когда работами советских генетиков В.В.Сахарова (1932,1935), М.Е.Лобашова и Ф.А.Смирнова (1934) было установлено,что наследственные изменения могут возникать в результате воздействия на организм определённых веществ. И.А.Рапопорт (1946) опубликовал работу, в которой впервые сообщалось,что формальдегид (СЕ^О) при определённой концентрации в питательной среде вызывает у дрозофилы появление связанных с полом деталей (5,92^), что говорит о мутагенной активности этото карбонильного соединения. Помимо формальдегида мутагенная активность на дрозофиле была определена у ацетальдегида (СН^НО) и гептана-ля CHgiCI^^CHO, а также у целого ряда непредельных альдегидов (акролеина, цитронеллаля, цитраля, пропаргилового, кротонового и некоторых других) (Рапопорт, 1946, 1947, 1948).

Мутагенная активность формальдегида показана на вирусах (Засухина, 1963; Засухина,Рапопорт, 1965), бактериях и грибах ( Sasaki, Endo, 1978; Chanet,Borstel, 1979).

Ацетальдегид интересен для нас тем, что является составной частью пахучего секрета Cimex lectularius ( Collins, 1968) И,

20

возможно, других члениотонотих, в частности, тех, в секретах которых найдена уксусная кислота, способная,как известно (Лобашев, Смирнов, 1934) вызывать нерасходцение хромосом.

Большая энергия реакции непредельных карбонильных соединений ( в частности, цитраля и цитронеллаля) должна откладывать свой отпечаток на количественные особенности взаимодействия этих соединений с химическими группировками ДНК. Под этим углом зрения Рапопорт (1948) проводит очень наглядное сравнение между пропио-новым альдегидом ( СИд-С^-С^ ) и акролеином (СЕ^СН-С^ ).В опытах на дрозофиле первое соединение не показало выраженной мута- -генной активности, в то время как акролеин, благодаря этиленовой связи , вызывал 2,23$ мутаций, то есть в 10 раз больше, чем сро-пионобый альдегид. Логично предположить, что мутагенная активность 2-гептеналя и 4-гептенахя будет значительно выше, чем у гептаналя, под влиянием которого у мух возникало Около 0,7$ сцепленных с полом леталей ( в контроле 0,19$). Частота летальных мутаций в половых хромосомах дрозофилы под влиянием цитраля и цитронеллаля составила соответственно 0,47 и 1,8.

2-Гептеналь найден в пахучих секретах рисового клопа-щитни-ка ОеЬа1ив риалах ( В1цш et а1., 1960) и нимф молочайного клопа ОпсореЗЛив £авс1аЪи8 ( <1ашев, Staddon, 1973), а гептаналь (0,9$) входит в состав сложного секрета пигидиалышх желез жука-чернотелки Е1еос1ез Ьеашег!, содержащего кроме того гексаналь (15,6$), транс-гекс-2-ен-1-аль (2,0$), октаналь (4,5$),ноненон (10,8$) и 2~метял-1,4-бензохинон (22$) ( ТасШпке1, 1975).

Фенолы,, х1тнош и перекись водорода. Хадорн и Нигли ( Набогп, , *94:6) впервые сообщили об очень специфическом мутагенном действии фенола на дрозофилу,что нашго подтверждение в дальнейших

21

опытах Хацорна и его коллег.

Изучение фенолов было предпринято цитогенетикаыи Леваном и Тью ( Levan, 5^3.с£948), которые опубликовали работу по изучению влияния моно- и поли-фанолов, а также их производных на хромосомы клеток корешков лука. Под воздействием водных растворов п-бен-зохинона (0,0005-0,00002 ыоль/л) и фенолов, в том числе гидрохинона (0,005-0,00002 моль/л) и ирезолов, в клетках меристем корешков лука происходит фрагментация хромосом. Наибольший выход клеток с такими повреждениями наблюдался при обработке корешков 0,0005 М раствором гидрохинона (47$) и 0,00005 М - бензохинона [12%). Число фрагментов в одной клетке составляло иногда более пяти.

Смесь бензохинонов жуков Tribolium при добавлении в корм

индуцировала злокачественный рост слюнных желез у мышей (Ladisch, »

Suter ,1968), а нанесение кристаллов секрета на насекомых в преиматинальных фазах вызывало у имаго удвоение,утроение и ветвление конечностей, а также некоторые другие уродства (ßoth, Howland, 1941).

Важный и весьма обширный материал по изучению биологического (токсического тератогенного, мутатенното, канцерогенногоДействия водорастворимых хинонов (окисленная хлорогеновая кислота, окисленный тирозин) мы находим в работах советского радиобиолога А.М.Кузина и его сотрудников (Кузин, Копылов,i960; Ктзин,Крюкова, 1961; Кузин и др., 1961; Кузин, 1966,1968; Лебедева и др.,1966; Неустроев и др., 1966; Юров и др., 1969). Изучая молекулярный механизм биологического действия радиации высоких энергий на живые организмы (в основном на растения), эти исследователи приходят к выводу,что причиной наблвдаемых эффектов могут быть не только непосредственное взаимодействие ионизирующих частиц с молекулами

22

ДНК, но и реакции о ДНК появляющихся в клетках в результате ра-диационно-химических процессов веществ, так называемых радиотоксинов - в первую очередь о-хинонов и их семихинонных радикалов (Кузин, 1966,1968,1970,1971). Важную роль в развитии радиационно- ; го поражения организмов играют образующиеся в облученных клетках перекиси ненасыщенных жирных киолот, так называемые "липидные радиотоксины" (Кудряшов, 1966; Кузин и др.,1972). Хиноны, как отмечает В.А.Копылов (1966) одни из самых реакционно-способных соединений. о-Хиноны имеют более высокие окислительно-восстановительные потенциалы, чем соответствующие п-хиноны, и являются наиболее сильными окислителями из всех природных органических веществ.

Мутагенное действие окислителей было показано в опытах Вис-са, Стоуна и Кларка ( %ss, Stone, Clark, 1947,1950). Этими исследователями было, в частности, установлено,что перекись водорода и нафтохинон вызывают у микроорганизмов появление мутантов, устойчивых к пенициллину и стрептомицину (прямые мутации).

Изучение генетического действия перекиси водорода и УФ-о<5-лучения на бактерии ( %ss et al., 1947,1948) привело к выводу, что активным мутагеном в этих экспериментах служили органические перекиси аминокислот ( Wyse et al., 1963), образующиеся в питательной среде тест-культуры.

Непосредственное мутагенное действие органических перекисей показано на líeurospora, бактериях и дрозофиле. У дрозофилы,например, мутации и кроссинговер вызывало одновременное введение фор-мальдетвда и перекиси водорода (диоксидиметилпероксида) ( Sobéis, 1956).

Первоначальное изучение биологического действия хиноидного секрета Т.destructor

Исследуя дротозойвдв заболевания малых хрущаков,вызываемые кокцидиями Adelina tribolii и микроспоридиями Повета whitei, мы решили выяснить, не является ли хиноидный секрет жуков защитой от этих паразитов. Для решения этого вощ)оса были поставлены два варианта опытов. Первый из них заключался в том,что в пробирку с инвазионным кормом, содержащим 9x10^ спор/г A. tribolii и 9,8х хЮ® спор/г И.whitei,поместили 15 жуков Т.destructor. В опыте использовались стнрые жуки, поскольку они обладают более сильным запахом, чем молодые. Через 5 сут. жуков удалили, а в пробирки подсадили по 20 личинок Sribolium confusum II возраста.Второй вариант опыта заключался в том,что в 2 пробирки ёмкостью по 7 мл поместили по 4 капли взвеси спор ir.whiteJ, а в 2 другие - такое же количество взвеси цист A.tribolii. Затем в одну из каждой пары пробирок (вторая контрольная) на рыхлые ватные тампоны положили по 7 раздавленных жуков. Через 4 сут. пробирки вскрыли и трупы жуков удалили. После испарения воды во все 4 пробирки на осадок из спор и цист паразитов были подсажены личинки хрущаков,которые находились там в течение 50 ч. после чего их перенесли в индивидуальные пробирки на стерильный корм.

В первом варианте опыта все личинки, питавшиеся кормом,содержащим оба вида паразитов, погибли от кокцидиоза, а в контроле гибель происходила в результате смешанной инвазии кокцидиями и микроспоридиями (трупы микроскопировали).Во втором варианте опыта результаты были ещё очевиднее: все 20 личинок,питавшихся на спорах N. whitei обработанных парами секрета Т.destructor не заболели и благополучно закончили развитие. В контрольном вари-

анте гибель от микроспоридиоза была полной, так же как во всех вариантах с А. 1;г1Ъо111-от кокцидиоза.

Таким образом, бьио установлено,что пары хиноидного секрета М.Ьо11шп способны инактивировать споры н.тяЫ^еА. Это позволило по-новому оценить рефлекс окучивания в популяции малых хрущаков, благодаря которому концентрация хинонов в местах скопления жуков повышается и происходит химическая стерилизация пищевого субстрата, содержащего микроспоридии. В комплексе с высокой устойчивостью личинок старших возрастов к заражению микроспоридиями, являющимися, по-видимому, более древними паразитами хрущаков, чем кокцвдии, это создает возможность к некоторому самоочищению популяции от n.иьз^е!.Напротив, перечисленные барьеры не существуют в хозяино-паразитарных отношениях между малыми хрущаками и кокцидиями А. ^д-ЬоШ.

Способ извлечения хиноидного секрета ИЗ жуков Тгд.ЬоИит

Хиноидный секрет извлекали из жуков с помощью вымораживания ( шпь.НошаапсЗ, 1941) в специально сконструированной установке состоящей из и -образной стеклянной трубки-контейнера для жуков, погружаемой в водяную баню (80°С), горизонтально установленной на штативе трубки с водопоглотителем и ловушки, помещенной в сосуд Дыоара с сухим льдом и ацетоном ( t около -78°С).Установка работала при атмосферном давлении, в качестве носителя газообразных хинонов секрета использовали химически чистый азот, по-

о

ступающий из баллона со скоростью 200 см /мин.

Для ускорения процесса выделения хинонов жуков перемешивали с раскрошенным-сухим льдом (1:1) и растирали в ступке. Для обезвоживания паров хиноидного секрета, к которым в процессе

25

возгонки примешивается большое количество водяного пара из тканей размельченных хуков, использовали прокаленный кристаллический хлористый кальций (СаС^). Соль в специальной трубке помещали на пути следования паров перед ловушкой, а также нримешивали к растертой массе замороженных сухим льдом жуков, из которых шло непосредственное выделение секрета. Растертую замороженную массу жуков ссыпали через воронку в и -образный контейнер, один конец которого был оснащен притертой пробкой с впаянным в нее капилляром - входом для газообразного азота.

Возгоняемые вещества собираются в ловушке в виде желтых игольчатых кристаллов (бензохиноны секрета) и коричневого цвета смолоподобного продукта, незначительное количество которого откладывалось несколько выше кристаллов. Собранные в ловушке вещества расплавляли и помещали в бюкс с притертой крышкой. Бокс хранили в холодильнике. Перед употреблением секрета его расплавляли на водяной бане,после чего смолоподобный продукт возгонки всплывал на поверхность основной массы желтой маслянистой жидкости в виде коричневого пятна, которое можно было легко декантировать.

Желтая маслянистая жидкость очищенного продукта по своим органолептическим свойствам (цвет, вкус, запах), а также по действию на тест-обьекты ничем не отличалась от секрета,выделенного из отпрепарированных желез йМЬоНиш <3ев1;гис1;ог.0на оказалась хорошо растворимой в воде и очень летучей.

Действие паров защитного секрета жуков на возбудителей дизентерии

Многочисленные находки малого черного хрущака в местах,связанных с жильем человека (например, в корзинах с грязным бельем) ■ его производственной деятельностью (хлебозаводах, элеваторах

26

и т.п.), позволяют считать этот вид насекомого синантропным в значительно большей степени, чем другие виды рода iriboliun. Синантропный образ жизни Т. destructor несомненно увеличивает вероятность контакта его хиноддного секрета с возбудителями таких заболеваний человека, как дизентерия, туберкулез, микозы и некоторые другие. Б связи с этим нами были проведены опыты по изучению действия паров очищенного секрета Т. destructor на возбудителей дизентерии Shigella flexneri 2а.

Бумажные фильтры, смоченные определенным количеством свежеприготовленного 10^-ного водного раствора секрета,вносили в чашки Петри с 5-часовой культурой шителл (среда Плоскирева). Фильтры находились в чашках в течение 20 ч. Первые сутки опыта чашки содержали при температуре 37°С,после чего их переносили в термостат с более низкой температурой (30°С) для подращивания.

При обработке бактерий парами 10%-ного хиноидного секрета Т.destructor дозами в 20 и 40 мкл на чашку колонии выросших ши-гелл были такими же,как в контроле (нежные, круглоочерченные,выпуклые, с влажным блеском и гладкой поверхностью); при дозе 80 мкл на поверхности среды вокруг зоны угнетения роста вырастали фестончатые колонии,поверхность которых была покрыта мелкими бугоркам я, а по периферии чашки вырастали обычные гладкие колонии с ровными краями. Обработка нигелл дозами 120,160 и 200 мкл на чашку вызывала появление только фестончатых, бородавчатых коло-ний.Проверка антигенных свойств отобранных пооле обработки парами секрета шигелл показала их полную идентичность с контролем.

Общее число выросших колоний уменьшалось с возрастанием дозы секрета Т. destructor на чашку (табл.1) и при дозе 200 мкл во второй чашке составило 15, а в третьей - 3 колонии (т.е. почти 100%-тй летальный эффект). В контрольных чашках число выросших

27

колоний составило 1965 и 1937 соответственно (первая чашка -оплошной газон; посев шителл на первую чащку осуществляли маточной суспензией,на вторую и третью- переходным шпателем с первой чашки).

В опытах по изучению чувствительности Sh.flexneri 2а к антибиотикам о помощью дисков (содержание антибиотика в диске 30 мкг) по ставдартной методике были исследованы 20 контрольных и 60 опытных клонов шигелл. При отборе опытных вариантов учитывалась форма поверхности колоний (гладкая и бородавчатая). Результаты опытов представлены в табл.2.

Как видно из таблицы, чувствительность шигелл к мономицину и стрептомицину,содержащимся в дисках, в результате обработки парами секрета значительно уменьшилась. Результаты обработки 80 и 160 мкл секрета были практически одинаковыми,но между ними и результатами контроля (р <0.001), а также результатами обработки 40> мкл (р = 0.01) имеется существенное различие. Результаты обработки 40 мкл секрета отличаются от контроля (р^0.001). Заметим,что у Micrococcus pyogenes 2-ыетил-1,4-нафтохинон вызывал мутации к стрептомицин-резистентности ( Wyss et al., 1950).

Появление бородавчатых колоний шигелл, образующихся под влиянием определенных доз секрета ,отмечено и в опытах с Shigella sonnei 1а. Появления бородавчатых колоний после обработки секретом Escherichia coli 0-124 нами не наблюдалось.

Подводя итоги исследований влияния хиноидного секрета Т.destructor на культуру шигелл Флекснера, можно утверждать, что пары секрета жуков,поступая в окружающую среду, образуют вокруг себя две зоны: I/ бактерицидную и 2/ зону изменчивости возбудителя, в связи с чем контакт дизентерийных микробов с малым черным хрущаком может приводить к появлению новых форм патогена, в час-

28

Таблица I

Летальное действие паров секрета Tribolium destructor на Shigella flexneri 2а

Варианты опыта

Число выросших колоний_

П чашка Ш чашка

Морфология колоний

Контроль

Обработка парами секрета: нативный секрет,единиц на чашку 6

10$-й раствор сек-

рета.доза на чашку

(мкл) 20

40

80

160

200

1965 (100$) 1937 (100$) Гладкие,с ровными

краями

711 (36$) 537 (28$)

871 (44$) 585 (30$)

9S8 (48$) 857 (44$)

577 (29$) 393 (20$)

245 15

(12,5$) (0,8$)

168(8.7$) 3(0,15$)

То же

То же

Фестончатые,боро-давчатые+гладкие, с ровными краями Фестончатые,бородавчатые

Таблица 2

Чувствительность Shigella flexneri 2а к антибиотикам в результате обработки 5-часовой культуры бактерий парами 10$-ного ХИНОИДНОТО секрета Iribolium destructor

Доза секрета на чашку (мкл)(морфология отобранных колоний)

Диаметр зоны задержки роста вокруг

_дисков (мм)_

мономицин стрептомицин

+ш

Контроль (гладкие) 16 0.2 15 0.1

40 (гладкие) 13 0.4 13 0.2

80 (бородавчатые) 12 0.07 П 0.09

160 (бородавчатые) 12 0.1 II 0.1

тности с более высокой устойчивостью к действию мономицина и стрептомицина.

Действие секрета на энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis var. galleriae

Малые хрущаки Tribolium постоянно контактируют в местах своего обитания с чешуекрылыми вредителями продовольственных запасов, В частности, с мельничной огневкой .Anagasta kuehniella Zell. Инфекционные заболевания различных видов чешуекрылых часто бывают вызваны крггсталлообразующэй споровой бактерией Bacillus thuringiensis . В связи с этим было интересно выяснить действие хиноидного секрета хрущаков на изменчивость В. thuringienais.

Действие секрета на изменчивость бактерий оценивалось по частоте выхода плюс- и минус-вариантов, с измененными количественными признаками 24-часовой культуры: протеолитической и каталитической активностью (определение комплекса протеаз осуществляли ксантопротеиновым методом), а также продуктивностью (через 48 ч культивирования) (определение денситометрическим способом).

Частоту плюс- или минус-вариантов по каждому из исследованных признаков определяли по формуле

р = | юо (.%) ,

где п - число вариантов, имеющих показатели изучаемого признака больше х + (плюс-варианты) или меньше i - 36* (минус-варианты) ( X - среднее арифметическое значение показателя признака в контроле, - ошибка X ); N - общее число наблюдений.

Изменчивость некоторых количественных признаков энтомо-патогенных бактерий в результате обработка секретом

Размах изменчивости исследованных нами количественных признаков Bacillus thuringienais var. galleriae в результате £0330

действия хиноидного секрета на споры патогена показан на рис.1, 2. Цифры,полученные в опытах по изучению изменчивости бактерий, представляют собой средние величины,вычисленные по результатам двух аналогичных обработок.

Обработка парами секрета спор бактерий увеличивает выход плюс-вариантов по признаку продуцирования комплекса протеаз в 2 раза после воздействия нативным секретом (8 единиц) и в 3 раза -10^-ным раствором се1фета (60-120 мкл на чашку) (рис.1). В последнем случае значение активности комплекса протеаз'превышало * среднее значение этого признака в контроле на величину утроенной ошибки ( С>£ ) у 95% обработанных клонов (в контроле у 32,5$). Обработка спор в водной среде 2$-ным раствором секрета не приводила к существенному различию в выходе вариантов по данному признаку, и результаты этих опытов на рисунке не показаны.

По признаку продуктивности обработка парами нативного секрета 5-часовой культуры бактерий вызывала увнличение выхода положительных вариантов приблизительно в 2 раза (в контроле - 22$), а обработка 10^-ным секретом в дозах 20-80 мкл на чашку приводила к уменьшению количества плюс-вариантов до 10 и даже 2$ с одновременным значительным увеличением выхода минус-вариантов (45-80$ против 30% в контроле). При обработке спор парами секрета (рис. 2) достоверное увеличение (95$ против 32.в контроле) выхода плюс-вариантов получено в чашках, обработанных 10$-ным секретом при дозах 60-120 мкл на чашку; нативннй секрет в аналогичных опытах действия на изменчивость продуктивности в положительную сторону практически не показал.

Характер воздействия паров нативного секрета,вносимого в чашки вместе с раздавленными насекомыми, отличается от характера

10% pactaop сакоата, НанаямЯ деза иа чашу сажоат, (au) ------

Лоза ia а мху Г jcaoBUa «ximiaO

Рис.1.Изменчивость признака активности комплекса протеаз Bacillus thuringienais var.galleriae в результате воздействия паров секрета Tribolium destructor на споры бактерий (ориг,). Штриховой показана ошибка (+ ш)вычислеиного процента размаха изменчивости признака. I условная единица нативного секрета представляет собой его количество из желез I жука Т. destructor 2-3 месячного возраста.

воздействия ларов секрета,когда последний применяли в ввде Южного водного раствора.Внесенный в чашки в виде раствора секрет быстро испарялся и,таким образом,его воздействие на бактериальную культуру было кратковременным.Нативный секрет,внесенный в чашки вместе с фрагментами тканей насекомых и частично содержащийся в них испарялся,по-видимому,более равномерно в течение времени экспозиции.Вероятно,именно это и отложило свой отпечаток на определенные различия в результатах опытов с обработкой культур бактерий парами нативного я IOfé-ного секрета.Не исключена,конечно,и возможность некоторого влияния процесса извлечения секрета из жуков на его качество.

90 4 00..

:

í 60 : so ; i.e..

JO 20 Ю

1С» pecrucp cexpm, дсэв aa чеяку (мня)

He томна cerpíf, лозе яа чввку (условии« единицы)

Ряс.2. Изменчивость признака продуктивности Bacillus thu-ringiensis var.galleriae в результате воздействия паров секрета Tribolium destructor на споры бактерий (фит.). Обозначения как на рис.1.

Обработка спор бактерий 2$-ным секретом в водной среде вызывала достоверное увеличение выхода плюс-вариантов по признаку продуктивности только при экспозиции 2 ч (56.6$ против 35$ в контроле).При увеличении экспозиции до 4 и 6 ч размах изменчивости по данному признаку был приблизительно такой же,как в контроле.

Каталаза (КФ I.II.I.6) осуществляет разложение перекиси водорода на кислород и воду,что и лежит в основе перманганатомет-рического метода определения её активности,которым да пользовались.

Обработка спор Bacillus thuringiensis var.galleriae парами 10$-то водного раствора секрета Т. destructor в дозе 20-40

шел на чашку не приводила к изменению выхода плюс-вариантов по признаку каталитической активности 24-часовой бактериальной культуры по сравнению с контролем (25±6#),но увеличение дозы секрета до 60-80 мюг вызвало значительное повышение вывода плюс-вариантов,который при этом составил 65+10$.

Обработка 5-часовой культуры бактерий парами нативного (46 единиц) и 10%-ното раствора секрета (20-40 мкл) увеличивала выход плюс-вариантов по данному признаку до 75.0+7,9 и 65.0+10.6$ соответственно (в контроле 27,5+6.0$). Дальнейшее увеличение доз секрета (8-10 единиц и 60-80 мкл на чашку) приводило к резкому снижению каталитической активности культуры отобранных клонов. Выход плюс-вариантов сократился до 5-15$ после обработки парами нативного секрета и до 5-6? - после обработки парами 10^-ного раствора. Выход минус-вариантов при испытанных режимах обработки 5-часовой культуры бактерий колебался от 2 до 40$ (в контроле 35.0±6.7*).

При оценке летальното действия паров секрета на 5-часовую культуру энтомопагогенных бактерий Bacillus thuringiensia, а так_ же на их споры растворов 1,4-бензохинона в концентрации 50-500 мкг/мл установлено,что выживаемость бактерий уменьшается с увеличением дозы токсина (в опытах на спорах от ЮО/ь до 0). Такая же закономерность была зафиксирована ранее в опытах с .5-часовой культурой Shigella flexneri.-

Взаимодействия ДНК Escherichia coli С 1,4-бензохиноном и гидрохиноном

Механизм тенетического действия бензохинона и гидрохинона связан, вероятно,, с их. окислительно-восстановительными свойствами. Промежуточным продуктом окисления гидрохинона является, как известно, семихинонный радикал. Сложность изучения свободно-ра-

дикальных процессов заклинается в том,что концентрация радикалов в исследуемых объектах чрезвычайно мала; это связано с их высокой реакционной способностью и, следовательно, малым временем жизни. В настоящее время наиболее чувствительным методом изучения свободных радикалов является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), с помощью которого нами были исследованы взаимодействия ДНК Е. coli с 1,4-бензохиноном и гидрохиноном в водной среде.

В спектре водных растворов 1,4-бензохинона и гидрохинона сигналов ЭПР не наблвдали. При комнатной температуре сигналы появлялись только при длительном хранении растворов.Однако, когда к ним добавляли ДНК - картина резко менялась.

При добавлении ДНК к раствору гидрохинона ( в весовом соотношении 1:1) наблюдается спектр, представленный на рис.За. Регистрация квинтетного сигнала с расщеплением а=2,4 Э и соотношением интенсивности компонент 1:3:5:3:1 позволяет однозначно отнести его к семихинонному радикалу. Акцептором электрона (ё) в данном случае являются, по-ввдимому, пиримидиновые основания ДНК, характеризующиеся более сильными акцепторными свойствами, чем пурины (Кузин и др., 1966; Корчевая и др., 1969). Образование анион-радикальных состояний азотистых оснований является начальной стадией повреждения ДНК и наблюдается также под действием ^"-облучения.

При добавлении ДНК к раствору 1,4-бензохинона (1:1) наблюдается слаборазрешенный синглетный сигнал с дН=Г,3 3 (рис.36). Адекватный по параметрам сигнал зарегистрирован и при взаимодействии гидрохинона с бензохиноном при условии избытка в растворе последнего. Можно предполагать,что за него ответственен комплекс с переносом заряда меаду гидрохиноном и бензохиноном.При взаимо-

35

действии 1,4-бензохинона с ДНК нам не удалось зарегистрировать промежуточный семихинонный радикал.Однако возникновение син-глетного сигнала ЭПР свидетельствует о том,что в присутствии ДНК идёт восстановление бензохинона до гидрохинона. Донором электрона при этом являются скорее всего пуриновые основания ДНК.

Рис.3. Спектры ЭПР водных растворов ДНК Escherichia coli с гидрохиноном (а) и бензохиноном (б) при комнатной температуре (ориг).

Мутагенофоры как фактор внешней среды Широкое распространение в природных условиях различных растений и животных, продуцирующих в своем организме вещества с генетической, в том числе мутагенной активностью, делает целесообразным введение специального термина для их обозначения. Виды таких растений и животных мы предлагаем называть мутаген о-форами (mutagenophora), а те из них,которые производят вещества, требующие для своето генетического действия той или иной активации - условными мутагенофорами.

Термин образован из трёх слов: мутация (от jaT.mutatio -изменение); ген (от лат.generare - производить); фор (от грач, phoros - несущий).

У членистоногих мутагенофоров вещества с генетической активностью образуются двумя путями: I) в защитных железах, а также 2) в результате питания на растениях-мутагенофорах,Последние из этих членистоногих целесообразно называть трофическими мутагено-форами.Главным общим качеством членистоногих мутагенофоров является то,что их экскреты поступают в окружающую среду и,следовательно,должны оказывать влияние на генетический аппарат контактирующих с ними клеток растений и животных.Особенное значение при этом имеет контакт мутагенофоров с половыми клетками,а также с клетками существ,размножающихся бесполым путем,поскольку возникшие в генотипе этих клеток изменения могут передаваться по наследству.

Вицы мутагенофоров различаются не только химическим составом экскретов,Отдельные виды членистоногих мутагенофоров имеют биоэкологические особенности,позволяющие называть их активными мутагено-форамя.К последним мы относим насекомых-опылителей,а также виды, способные давать вспышки массового размножения,или имеющие склонность к окучиванию в местах,где может происходить тесный контакт продуцируемых этими членистоногими веществ с генофондом окружающего растительного и животного мира. .

Эволюцию цветковых растений тесно связывают с деятельностью насекомых-опылителей,среди которых пчелы повсеместно играют ведущую роль.Функции медоносной пчелы хорошо известны,однако в связи с изложенным материалом, становится понятной ещё одна её очень существенная,на наш взгляд, функция мутагенофора. Контакт перепончатокрылых мутагенофоров и,следовательно, продуцируемых в

их железах генетически активных веществ с пыльцой энтомофильных растений должен увеличивать частоту мутаций среди этой группы растений и,как следствие - ускорять их эволюцию. Растения,не нуждающиеся в насекомых-опылителях, контактируют с перепончатокрылыми мутагенофорами значительно реже и влияние на них природных мутагенов, продуцируемых этими членистоногими, ничтожно.

В сущности, мутагенофоры представляют собой один из биотических факторов внешней среды, действующий на генотип и фенотип живых клеток посредством химических веществ с генетической активностью. Если на фоне абиотических условий внешней среды генотип,как принято говорить, реализуется в фенотип, то при воздействии активных веществ ыутагенофоров (альдегидов, хинонов, пир-ролизидиновых алкалоидов, перекиси водорода, микотоксинов и пр.) в генотипе контактирующих с этими веществами клеток могут возникать мутации, подобно тому,как это может иметь место при попадании в клетку космической ионизирующей частицы или при облучении её коротковолновыми УФчяучами.Таким образом, членистоногие мута-генофоры, выделяя в окружающую среду вещества с генетической активностью, выступают в качестве природного фактора мутационной изменчивости современных форм ортанического мира.

Группировка членистоногих на ограниченной площади влечет за собой увеличение концентрации продуцируемых ими летучих веществ в прилегающем пространстве. При сношении членистоногих мутагено-форов (на цветах, под камнями и т.п.), в клетках микроорганизмов, растений и некоторых других организмов, находящихся в зоне действия эффективной концентрации паров карбонильных соединений членистоногих или при непосредственном контакте с ними могут осуществляться тенетически значимые процессы,в том числе и мутации.

Среди мест возможных контактов различных организмов (в том числе микроорганизмов) с мутагенофорами особый интерес представляют,на наш взгляд, норы и гнезда млекопитающих и птиц,являющиеся средой обитания не только своих хозяев, но и большого числа членистоногих,находящихся в топических, трофических и форических связях как с хозяином, так и между собой.

Как показывает изучение источников литературы (Траут,1929; Власов, Шестоперов, 1937; Киршенблат, 1937; Дубинин, 1946,1954; Нельзина,Медведев, 1962; Яблоков-Хнзорян, 1964; Косолапова,Новикова, 1965; Высоцкая, 1967; Дяйстер, 1967; Нельзина и др.,1967; Медведев,'Чикилевская, 1968,1977; Медведев, Высоцкая, 1969;Медве-дев.Соснина, 1973), в которых приводятся списки членистоногих, найденных авторами в норах млекопитающих,отдельные виды мутаге-нофоров являются постоянными обитателями нор и гнезд.

Чернотелки рода Biaps, поведение которых мы обсуждали при рассмотрении вопросов, касающихся функционирования их защитных желез, находят в норах мелких млекопитающих убежище от неблагоприятных условий окружающей среды, а некоторые .например, В. holco-nata F.-w» и пищу (Дубинин, 1946,1954) и скапливаются там подчас в большом количестве (Медведев, 1947; Косолапова,1965).

Вместе с грибами Aspergillus и Chaetomium жуки-стафили-ны, чернотелки и некоторые другие BiytHHeteroptera представляют собой группу активных мутагенофоров в норах и гнездах мелких млекопитающих и птиц, где в условиях благоприятного микроклимата в ограниченном объёме этих биотопов может происходить контакт карбонильных веществ, входящих в состав секретов насекомых, и мико-токсинов с возбудителями болезней человека и животных (сибирская язва, чума, туляремия и др.), энтомо- и фитопатогенными микроорганизмами, пыльцой и семенами растений, яйцами членистоногих -

иными словами, с генофондом растительных и животных организмов, населяющих этот биотоп.

В связи с вышеизложенным, можно предполагать,что изменчивость определённых ортанизмов в природе должна носить -очаговый характер.

Очаг изменчивости - место резервации одного или более видов мутагенофоров, где в ограниченном пространстве имеется реальная возможность контакта тенофоида данното биотопа с генетически активными веществами мутагенофоров - природными мутагенами и модификаторами, в результате чего появляются ноше измененные форма растительных и животных организмов.

Активный очаг изменчивости - это очаг,функционирующий за счёт нескольких видов мутагенофоров, среди которых имеется по крайней мере один активный, жизнедеятельность которого в очаге обеспечена условиями, близкими к оптимальным и способствующими тесному контакту производимых им.веществ с генофондом очага.

Функционирование нор и гнезд животных, в особенности грызунов и некоторых птиц, в качестве активных очагов изменчивости связано,по-видимому, в первую очередь с их заселенностью теплокровными хозяевами.Норы и гнезда грызунов,не впадающих в спячку и поддерживающих в гнезде постоянно высокую температуру, могут функционировать в качестве таких очатов круглый год, норы и тне-зда птиц и зимоспящих грызунов - только в летний период.Следовательно,деятельность активных очагов изменчивости в высоких и умеренных широтах должна носить сезонный, прерывистый характер.

Схематично функционирование очага изменчивости монет быть показано следующим образом (рис.4). Кроме уже названных очагов, таковыми,по-видимому,могут являться замкнутые временные и постоянные водоемы,обитатели которых - клопы и жуки,секретируют вещвст-

40

ва с мутагенной активностью. Наиболее интенсивное функционирование таких очагов должно наблюдаться в годы массового размножения водных мутагенофоров,увеличение численности отдельных видов которых (например,гладышей) регулярно регистрируется в связи с их вредной деятельностью для рыбного хозяйства.

Рис.4. Схема функционирования очага изменчивости (ориг.).

Помимо очагов изменчивости ареной природного химического мутагенеза могут служить почва и растительность,на которых концентрируются определённые виды мутагенофоров.Роль отдельных видов членистоногих мутагенофоров (исключение составляют космополитические виды)неравноценна в разных географических точках Земли и, по-видимому, наиболее заметна в центре ареала,представляющего собой диффузный очаг изменчивости.

Заключение

В настоящей работе мы стремились показать,что отдельные виды из большого числа мутагенофоров, вступая в тесный контакт с окружающими растениями и животными, при определённых условиях могут воздействовать на их генотип и фенотип собственными продуктами,в том числе хиноидными секретами защитных желез. Биологические особенности членистоногих животных делают юс наиболее пригодными для выполнения функций активных мутагенофоров.

Спонтанные мутации, сущность которых, как отмечают многие генетики, более правильно отражает слово "неконтролируемые"»происходят не беспричинно. Часта таких мутаций в природе несомненно происходит в результате деятельности членистоногих мутагенофоров.Их частота у определённых видов организмов зависит, вероятно, от степени связи с мутагенофорами, численности последних, а также от количества активных очагов изменчивости в конкретной местности.

Наличие в природе мугатенофоров со сходными спектрами действия является,по-видимому, одной из причин аналогичной изменчивости контактирующих с ними организмов. Эволюционно перспективными становились,по всей вероятности, те виды и формы растений и животных, которые чаще других контактировали с различными мутагенофорами, мутировали и поэтому давали более обширный материал для естественного отбора.

Изучение механизмов действия природных мутагенов и модификаторов на молекуле ДНК позволит в какой-то степени понять ход эволюции отдельных групп организмов, связанных в своем развитии с определенными мутагенофорами. Необходимо отметить,что значение природных веществ с генетической активностью определяется не столько их силой, сколько временем влияния на органический мир в процессе эволюции, а также степенью контакта с его генофондом.

42

Исследования генетической активности и специфичности действия защитных секретов и других экскретов членистоногих,а также изучение биологии и экологии самих мутагенофоров представляют собой большой практический и теоретический интерес. Мы надеемся,что комплексное изучение проблемы изменчивости органического мира в современных условиях позволит углубить многие из положений выдвигаемой нами экологической теории природной мутационной изменчивости организмов и внесет свой вклад в развитие эволюционного учения и защиту окружающей среды.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Многие вида членистоногих животных обладают специальными железами, в которых секретируют защитные вещества с генетической, в том числе мутагенной, активностью. Для обозначения этих животных, а также растений, в тканях ноторых происходит образование аналогичных соединений, нами предложен новый термин "мутаге-нофор".

2. Мутагенофоры представляют собой один из биотических факторов окружающей среды, действующий на генотип и фенотип живых клеток посредством химических веществ с генетической активностью.

3. Окружающая среда структурирована, в ней могут существовать очаги мутационной изменчивости организмов - специфические биотопы, естественный биоценоз которых содержит в себе виды мутагенофоров.

4. Хиноидный секрет защитных желез жуков Tribolium destructor при контакте с возбудителями дизентерии Shigella £lexneri 2а и эн-томопатогвнннми бактериями Bacillus thuringiensis var. galleriae показывает сильное бактерицидное действие и вызывает изменчивость этих микроорганизмов.

5. Контакт дизентерийных микробов с парами хиноидного секре-

43

та малого черного хрущака Т. destructor приводит к появлению новых форм патогена o более высокой устойчивостью к действию мономи-цина и стрептомицина,по сравнению с контролем.

6. Секрет Т. destructor обладает выраженным действием на изменчивость изученных признаков (протеолитическая активность,продуктивность и некоторые др.) Bacillus tfauringiensis var. galleriae, причем наиболее эффективным было применение секрета в виде паров, действующих на споры.

7. Гидрохинон и 1,4-бензохинон, составляющие основу защитных секретов многих видов наземных и водных членистоногих мутагено-форов,вступают в окислительно-восстановительные реакции с ДНК кишечной палочки в водном растворе. Эти взаимодействия, первым этапом которых являются реакции одноэлектронного переноса, сопровождаются возникновением ион-радикалов ДНК.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации: Микроспоридиоз и кокцидиоз-протозойные заболевания малых хрущаков (Coleóptera, Tenebriortidae ).- Паразитология. 1976. Т. 10, № З.С. 268-273.

Способ селекции энтомопатогенных бактерий. Авторское свидетельство СССР № 871526. 1981г(в соавторстве). Химическая защита у членистоногих и её вероятная роль в эволюции Часть 1.Строение и функции защитных желез членистоногих.-Эн-томол.обозр.,1982, T.6I, вып.4. С. 845-856. Химическая защита у членистоногих и её вероятная роль в эволюции Часть 2. Генетическая активность соединений,входящих в состав защитных экссудатов членистоногих.-Энтомол.обозр.,1983. Т.62, вып.4. С. 859-877. Химическая защита у членистоногих и изменчивость организмов.Л., 1989.157с.