Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные механизмы регуляции секреторного процесса в молочной железе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы регуляции секреторного процесса в молочной железе"

'Б

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ПОПОВ Станислав Михайлович

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СЕКРЕТОРНОГО ПРОЦЕССА В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ

(ОЭ • 00« 13 ~ физиология человека я хюотввх)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации яа соискание ученой отепевв доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в научно-исследовательском институте физиологии им.А.А.Ухтоыского Санкт-Петербургского государственного университета

Научные консультанты! доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной прении РФ

|И.И.Грач8в1

доктор биологических наук, лауреат Государственной прешо РФ В.П.Гшшнцаа

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, акад. РАМН И.П.Ашыарин доктор медицинских наук, профессор, акад. РАЕН Р.С.Орлов доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, акад. РАЕН, лауреат Государственной премии РФ А.Д.Ноздрачеа

Ведущее учреждение - Институт физиологии им.И.П.Павлова РАН

Защита соотоится " • 1994 г. в /^¿Г час.

на заседании Специализированного совета Д.063-57-19 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Свнхт-Петербургсксм государственной университете по адресу: 199034. Санкт-Петербург, Университетская наб.. 7/9-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.А.И.Горького Санкт-Петербургского государственного университета Автореферат разослав ¿ИсГ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук Ещенко И.Д.

- 3 -1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Постановка проблемы и ее актуальность.

По мере решения фундаментальных проблем физиология лактации открываются новые перспективы управления лактационной функцией животных и человека. Кроме того, сана молочная железа в период лактопоэза является чрезвычайно удобным объектом для изучения наиболее общих закономерностей секреция вообще, а также механизмов ее регуляции. Поэтому исследования по данному разделу физиологии актуальны.

Согласно широко признанной в настоящее время теории рефлекторной регуляции лактации, которая была создана И.И.Грачевым и сотрудниками его лабораторий в НИИ ®иэиолологив им.А.А.Ухтомского, важную роль в иерархии регуляторвых механизмов лактопоээа играет процессы, реализующиеся на клеточном уровне и в надклеточных альвеолярных комплексах ткани молочной железы. Изучение этих механизмов предполагает дифференцированный подход к анализу функций различных клеток железистой ткани и учет того,' что только взаимодействие элементов всего сложного клеточного ансамбля способно обеспечить нормальное течение секреторного процесса.

Исследование многих цитофизиологичаских явлений в молочной железе только начинается. Возникли новые вопросы, особенно на стыках смежных дисциплин ( физиологии, биохимии, гисто- и цитологии ). Говоря о клеточных процессах секретообразоввния, следует отметить успехи, достигнутые оря изучении некоторых секреторных органов пищеварительной системы, которые позволили ввести понятие о клеточном секреторном цикле как о развивающейся во времени последовательности изменений в структуре и обменных процессах клетки, связанных с образованием и выведением секрета (Шубвикова, 1966; Шубиикова, Коротько, 1986). Складываются представления о ритмическом функционирования различных типов клеток ( в том числе и секреторных), основанном на гетерохрониэме протекания отдельных связанных в взаимообусловленных клеточных процессов (Бродский и др., 1973; Меерсон, 1967! Эйдус, 1977).

Функциональная клеточная рнтыалогия, по-видимому, является общефизиодогической проблемой, однако далеко не на всех клетках и органах получены данные, подтверждающие ритмичность их детальности. В частности, до недавнего времени сохранялось мнение, что альвеолярный эпителий в молочной железе секретярует казеин непрерывно (Финеан и др.,1977). Впервые околочасовые ритмические колебания уровня Ш секреторных клеток молочной железа яврэгистрарованы в

нашей лаборатории (Грачев и др.,1976). Решающее методологически значение в их выявлении сыграл прием частичной синхронизации деятельности клеток многих альвеол. Важно отметить.что вслед зи стимулированной окситоцином (ОТ) или ацетилхоляном (АХ) кратковременной гиперполяризацей мембран секреторных клеток последующие изменения МП возникали без дополнительных внешних воздействий -автоматически. Автономное поддержание ритма контролируется, вероятно, целью клеточных регуляторных механизмов, однако каких именно - не известно. Наин получена данные, позволяющие вновь оживить интерес к внутриклеточным офирам холява (АХ, ПХ и ВХ) и возможности их участия в механизмах саморегуляции секреторных клеток.

Наряду с понятием "клеточный секреторный цикл" в современной литературе по физиологии лактации используется понятие "цикла клеточной активности", или периода деятельности секреторных клеток, начиная с момента их активации при рефлекторном освобождении альвеол от молока и кончая их торможением при заполнении емкостной системы железы секретом (№>12п, 1к^(1апоУо, 1980). Вопрос о механизме инициации этого цикла при осуществлении рефлекса молоковыве-дения побудил нас к изучению влияния на секреторные клетка таких горыонально-медиаторных факторов, как ОТ, АХ и катехоламины (КА), которые сцособны одновременно воздействовать и на миоэпителий альвеол.

К числу причин, обусловливающих снижение интенсивности образования секрета, следует отнести изменения в соотношении и уровне поставки секреторным клеткам гормонов и медиаторов, а также необходимых метаболитов, изменения реценторного аппарата клеток. Вместе с атим высказывались предположения, что за торможение образования секрета в молочной жолезе могут быть ответственны и какие-то химические факторы, накапливающиеся в ткани органа и молоке (Тверской, 1972). Их природа, место образования и механизм действия долгое время оставались неизученными. В качестве рабочей гипотезы мы предположили, что такими веществами могут быть некоторые белки, выделяемые нейтрофильными лейкоцитами, которые усиленно мигрируют в ткани железы и молоко в периоды значительного снижения уровня секретообразования в органе ( при задержках молоковыведения, стрессах, маститах). Полученные нами данные свидетельствуют о важной роли 8тих высокогюдвижншс, секретируицнх клеточных элементов соединительной ткани в регуляции деятельности молочной железы не только в иориод торможения, но и при активации в ней секретообразования, что характерно, по-видимому, и для других желез.

- 5 -

Обнаружение прямих аналогий и клеточно-тканевых механизма* регуляции различных секреторных органов является дополнительным подтверждением современных паучннх воззрений. Их суть, по мнению Е.М.Крепса (1981), заключается в том, что Природа редко изобретает новые механизмы я чрезвычайно широко использует механизмы, однажды возникшие. Полой копкретво эти представления оформлены в концепции А.М.Уголева (19В5, 1987) о тем, что деятельность различных клеток и органов осуществляется, очевидно, с помощью ограниченного набора унифицированных молекулярных и надмолекулярных структур или блоков. выполняющих элементарные функция. Вместе с этим, успешное решение вопросов о тормозных факторах лейкоцитарного происхождения и механизмах их влияния на железистый эпителий открывает перспективы нового направления в поисках способов и средств управления лактационной функцией организма. В отличие от ставшего традиционным использования гормональных препаратов и их комплексов для стимуляции лактации это направление будет заключаться в попытках устранения тормозных факторов или предохранения секреторных клеток от их влияния.

1.2. Цель и задачи исследования.

Нестоящее исследование предпринято с целью решения отмеченных выше вопросов о регуляции в период лэктопоэза секреторного процесса в молочной железе на клеточно-тканевом уровне и экперимевталь-ной проверки выдвинутых предположений. Основными задачами работы явились:

1) изучение влияния ОТ и его химически измененных аналогов, КА и эфиров холина на секреторные клетки в качестве факторов -инициаторов цикла их активности, а также влияния этих веществ на тканевую холинэстеразу (ХЭ) и энергетический обмев;

2) изучение динамики поглощения аминокислот, синтеза секреторного белка и его экструзии в пределах цикла клеточной активности;

3) исследовапие взаимосвязи основных этапов клеточного секреторного цикла в связи с ролью ионов Саа*,цитоскелетвых структур и цАМФ?

4) изучение возможного участия внутриклеточных ацетилхолвноподоб-ных веществ в механизмах саморегуляции ритмической деятельности секреторных клеток;

5) исследование взаимодействия альвеолярных клеточных комплексов о лейкоцитами, динамики миграции последних из крови в молоко и хемо-таксических факторов, влияющих на этот процесс;

6) определение яейтрофяльпых факторов, способймх тормозить еокре-

торный процесс в железе;

7) изучение механизмов тормозного действия система миелоиероксида-зы (НПО) в железистой ткани.

Работа выполнена в период с 1970 по 1993 год по плановым темам лаборатории нейрозндокринологии и лаборатории клеточной физиологии и молекулярной иммунологии НИИ/физиологии им.А.А. Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета. 1.3. Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработаны физиологические модели с частично синхронизированными по стадии секреторного цикла железистыми клетками. Модели могут быть использованы для исследования клеточных процессов сек-ретообразовавия и их регуляции, е также для изучения аффектов биологически активных веществ и их химических производных.

В модельных експериментах показано, что ОТ, АХ и КА стимулируют экструзию белке из секреторных клеток. Общими свойствами этих веществ яляются их способность снижать активность тканевой ХЭ, а также то, что их действие блокируется атропином и анти-ХЭ препаратами. Влияние ОТ в значительной мере определяется освобождающимся тканевым "АХ". Экструзию белка стимулируют и химические производные ОТ, лишенные традиционно оцениваемой формы биологической активности и даже блокирующие сократительную реакцию миоэпители-альных клеток ильвевд на ОТ. но сохраняющие способность взаимодействовать с ХЭ. Нельзя исключить, что этот фермепт включен в состав более сложной мембранной системы с участием Иа, К-АТФазы, блокада которой уабаином также тормозит деятельность секреторных клеток.

Впервые установлено, что клеточному сакрвтообразованию в молочной Железе свойственен ритмический (с околочасовым периодом) характер изменения интенсивности процессов пс"лощения предшественников, синтеза и экструзии белка. Последующие поело стимуляции секреторных клеток пики повышения интенсивности отмеченных процессов возникают автоматически, без дополнительных внешних воздействий. Весьма существенно, что интенсификация синтеза новой порции секреторного белка происходит только после освобождения железистого ВЕшгелия от накопленного секрета. Необходимыми участниками в механизмах внутриклеточного транспорта и экструзии секреторного белка являются иащ! Са2*, цАМФ и система цитоскелета. Процесс стимулируемой и автоматической акотрузии подавляется при отсутствии в среде ионов Саг* шш при воздействии колхицина.

Показано, что ритмические изменения в содержании тканевого "АХ" и активности ХЭ совпадают о ритмом функционирования секретор-

пых клеток. Атропип и анти-ХЭ препараты, проникающие через клеточную мембрану, блокируют автоматическую и стимулируемую экструзию белка, тогда как нопронккающие лишены способности влиять имепно на автоматическую экструзии. Полученные данные обосновывают предположение, согласно которому элементы внутриклеточной холинергической системы включены в структуру пускового механизма, контролирующего завершающий этап секреторного цикла (экструзию) и определяющего таким образом ритмичность деятельности секреторных клеток.

Отмочено, что в период торможения секретообразоваяия в молочной железе, в частности, при задержке выведения молока значительно возрастает уровень миграции из крови в ткань лейкоцитов (главным образом, нейтрофилов), которые, быстро преодолевав барьер железистого эпителия, попадают в молоко. В то же время в оттекающей от органа крови снижается активность ХЭ плазмы, а в ткани возрастает содержание угнетающих активность фермента веществ и продуктов пе-рекисного окисления лшшдов (малонового диальдогида). Проникновение лейкоцитов в молоко происходит по межклеточным пространствам в основном на уровне однослойного эпителия альвеол в мелких протоков. Целостность мембран альвеолярных клеток при этом сохраняется, а у нейтрофилов обнаруживается частичная двгравуляция цитоплазмы, что,по-видимому, связано с явлением экэоцитоза содержимого гранул. Кратковременное усиление миграции в железистую ткань лейкоцитов обнаружено также при инъекции животным ОТ. Из числа изученных в опытах In vitro тканевых факторов (казаки, холнн, АХ, адреналин, гистамия) наиболее вфективным положительным хемотаксическим агентом для лейкоцитов оказался АХ.

Установлено,~ что высокоочшценный препарат НПО (при наличии в среде низких концентраций Нг0г, не оказывающих самостоятельного влияния) является сильнейшим тормозным фактором, блокирующим процессы поглощения клетками молочной железы аминокислот и синтез белка. Сходный эффект вызывает комплекс белковых факторов из грянул нейтрофилов. Система МПО (при концентрации фермента не более 150 нг/мл) подавляет экструзию белка, как стимулируемую, так и автоматическую, инактивирует тканевую ХЭ, окисляет адреналин (А) и ОТ. Одним аз наиболее чувствительных к повреждающему действию ТОО является процесс освобождения тканевого ИАХ", инициируемый ОТ.

Показано, что лактопероксидаэа (ЛПО) молока во может образовываться из МПО, а является белком железистого эпителия. В модельных условиях влияние ЛПО на секреторные клетки аналогично влвятао '"ПО, однако в реальных условиях доступ к специадчзиропчттим бчзо-

латеральным мембранам альвеолярных клеток, а, следовательно, и возможность действия на лих для ЛПО (в отличие от НПО нейтрофилов) ограничены структурой плотного межклеточного контакта.

Наиболое вероятным Механизмом тормозного и повреждающего действия НПО нейтрофшгов в молочной железе является усиление свободно-радикального процесса шзрекисного окисления лшщцов мембран и других субстратов. Поатоиу выводы настоящей работы позволяют в качестве наиболее перспективного в прикладном аспекте направления рекомендовать к испытанию на животных вещества со свойстпаыи анти-оксидантов, способных предотвратить развитие цепных процессов перо окисления , повысить резистентность секреторных клеток и тем самым стимулировать лактацию. Следует ожидать, что применение анти-оксвдантов в молочном животноводства существенно снизит негативные последствия'стрессов, маститов и задержек доения. Возможно, что в отдельных случаях практической медицины окажется целесообразным применение антиоксидантов в комплексе с факторами, угнетающими миграцию лейкоцитов (нейтрофилов).в ткани.

На защиту выносятся основные положения дисартационной4 работы

о ритмичности функционирования секреторных клеток молочной железы и о торможении секретообразования под влиянием факторов из нейтро-фильвых лейкоцитов. 1.4. Апробация работы.

Материалы диссертации обсуждались на заседаниях Ленинградского отделения общества физиологов, биохимиков и фармакологов им. И.М. Сеченова (1970-1991); на XI, Х11, Х111 и XV съездах Всесоюзного физиологического общества им.И.П.Павлова (Ленинград, 1971; Тбилиси, 1975; Алма-Ата, 1979; Кишинев, 1987); на 11НШ Всесоюзных симпозиумах по физиологии и биохимии ла-твции (Фрунзе, 1971; Баку,1974; Ленинград, 1976; Львов, 1982; Алма-Ата, 1986; Баку, 1990); на VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Сыктывкар, 1982); на пленуме Головнох'о Совета по биологии Минвуза РСФСР (Элиста, 1983); па Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет" (Ростов-на-Дону, 1989)! на 1 Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989); на конференции ФНИИ им.А.А.Ухтомского СПбГУ "Доминантные механизмы поведенческих адаптаций" (Ленинград, 1990); на 4-м Всесоюзном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1990); на V Всесоюзной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения Х.С.Коштоянца (Москва, 1990); на X Всесоюзном совещания по эволюционной физиологии, иоепяцаапом памяти акад.Л.А.Орбели (Ленинград, 1990); на ХХХ11 Конгрессе Международного Общества физиологических

Наук (Глазго, 1993).

На монографию (С.М.Попов - Клеточные механизмы регуляции секреторного процесса в молочной железе. Л.: Иэд-во Лонингр.уя-та, 1989--200 е.), в которой широко представлены материалы настоящей диссертации, опубликованы рецензии:

- Физиол.журя.СССР, 1990, т.76, N б, с.845-846;

- Биологические науки, 1990, К 9, с.157-158;

- Сельскохозяйственная биология, 1991, N 2, с.203-1.5. Структура и объем диссертация.

Диссертация имеет традиционную структуру и содержит следующие разделы: 1.Введение (8 е.), 2.Обзор литературы (49 е.), 3. Материалы и методы исследования (40 с.), 4. Результаты исследований и их обсуждение (162 е.), 5.Заключение (18 е.), б.Выводы (3 е.). Раздел 4' - включает 3 глава, каждая из которых содержит 3 подраздела. Работе документирована 62-мя рисунками и 23-мя таблицами. Список литературы включает 456 ссылок. Общий объем диссертации - 331 с.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на лактируюиих самках нелинейных белых мышей" Б1ГО зверопитомника РАМН (Рапполово), а также на козах и коровах, содержащихся в виварии нашей лаборатории. Молоко женииа-родвльпиц получали из послеродового отделения, клиники Института акушерства и гинекологии РАМН.

Краткая характеристика модельпых систем. Очевидно, что при работе на железистой ткани с неоднородным клеточным составом сделать заключение о развитии во времени специфической функции секреторной клетки возможно только при условии синхронного течения процессов в основной массе этих клеток. Данные, полученные нами и другими авторами (Hollmann, 1974; Грачев и др.,1976; Seelig, 1980) при электронномикроскопическом исследовании молочной железы, свидетельствуют о том, что по мере заполнения ее емкостной системы секретом возрастает число альвеол, клетки которых снижают секреторную активность и, накопив секрет, не выделяют его, В железе мышей такое состояние клеток выявляется в большинстве альвеол после 4-5-часовой задержки молоковыведения и достигает максимума через 8-10 ч. Увеличение числа обратимо заторможенных клеток создает предпосылки синхронизации их доследующей деятельности при условии единовременной активации. Последняя наблюдается in vivo при реализации рефлекса молоковыведения и воспроизводится при инъекции животным или при непосредственной аппликации пй келззпетуго ткапь ОТ идя ЛЯ в опытах in sltu п in vl1.ro. Этот прием

частичной синхронизации деятельности секреторных клеток Сил использован нами в модельных системах. При разработке модели in vitro на переживающей 2.5-3 ч тканевой культуре молочной железы -кусочках ткани объемом не более 1 мм3, инкубируемых и питательной среде 199 или растворе Хенкса па поддерживающих плотиках из фильтра Synpor-8, за основу была взята методика работы на тканевых препаратах слюнной железы (Нечаева. Фатеева, 1973). Препараты готовили из заполненной секретом молочной железы мышей (6-15 дней лактации), их инкубацию проводили при Э7"С без использования искусственной газовой смеси. Установлено, что исходное состояние удьтраструктуры секреторных клеток тканевых препаратов аналогично таковому в биопсийаом материале, взятом в период торможения секре-тообразовакия. Секреторные клетки уплощены, их ядра имеют овально-округлую форму, в цитоплазме содержатся крупные липидные капли и большое количество белковых гранул. Последние локализуются в зоне аппарата Гсьльджи (АГ) в небольших конденсирующих вакуолях и секреторных везикулах (СВ). При воздействии ОТ (2 мин, 1 нМ) или АХ (2 мин. 1.8 мкМ) на тканевые препараты с секреторными клетками происходят те же изменения, которые наблюдались нами и другими авторами (Грачев и др.,1976; Ollivier-Bousquet, 1976) при аппликация этих веществ на ткань интактной молочной железы. Заметно увеличивается высота клеток. СВ с гранулами белкового сокрета перемещаются к верхушкам клеток, где происходит их укрупнение, путем слияния друг с другом. Мембраны везикул взаимодействуют с апикальной плазмалем-мой, происходит екзоцктоз их содержимого в полость альвеол. Экструзия липцдных капель также воспроизводится в полной аналогии с биопсвйным материалом, на основе которого создана схема етого процеоса (Wooding, 1977). Четко воспроизводи.гея ультраструктурныо изменения, характеризующие активацию синтетических процессов, возрастает складчатость ядерной оболочки, ядра приобретают' неправильную форму. При последующей инкубации клетки стимулированных препаратов продолжают синтезировать я выделять белок (по крайней мере в течение 3 ч) в отличие от параллельно инкубированных нвети-мулировашшх препаратов, большинство клеток которых сохраняют исходные признаки заторможенности. С учетом сказанного был использован упрощенный вариант количественного определения секретируемо-го клеткнми белка по разнице между фоновым уровнем, выделяемым в среду равными навесками ткани контрольных нестимулированных препаратов (за 10 минутные интервалы времени), и уровнем выделения после стимулирующего воздействия. Фоновый уровень выделения белка

па протяжении 2-3 ч инкубации препаратов изменялся пезиачитвлыю. Результаты контрольных опытов с охлаждением ткани до 0°С, с добавлением в среду ЭГТА (3 мМ), NaT (10 мМ). атроиина (3.4 мкН), т.е. с воздействиями, приводящими к блокаде экструзии бедка из сокро-торных клеток, позволили заключить, что в фоновом уровпе только около 19Ï может приходиться на белок, секретируемый отдельными клетками, а также то, что весь прирост белка над фоновым уровнем определяется деятельностью активированное популяции железистых клеток.

В переживающей тканевой культуро паряду со специфическими морфо-функциопалышми параметрами деятельности секреторных клеток хорошо воспроизводятся основные особенности деятельности миовлитв-лиальных и гладкомышечвых клеток альвеол и мелких протоков. Регистрацию их сокращения проводили па полосках железистой ткани (1x1x7 мм) по модифицированной методике Ляс « др.(1972). Исследования In vitro проводили также на изолированных секреторных клетках, выделенных аз ткани с помощью панкреатопептидаэы-Е (Попов, Коваленко, 1970). Адекватность получаемых на моделях in vitro результатов контролировали там, где это было возможно, на интактной молочной железе с сохраненными системами кровоснабжения я иннервации, т.е. на модели in situ (Грачев и др.,1976).

Для электронной я световой микроскопии ткань молочной железы фиксировали в 3.5% глютвропом альдегиде (60 мин) и постфиксировали в 1.0* растворе 0в0( (60 мин) ва какодилатном . буфере с рН 7-2 (ЛоЯдэ и др.,1982), дегидратировали я заключали в Эпов-812 (Гайер, 1974). Ультратонкие' и полутонкие срезы (1-3 мкм) получали яа ультратоме 1KD-3. После контрастирования в уренилацетате я цитрате свинца срезы исследовали на- электронных ■микроскопах BS-613 (Testa), JEH-7A, HITACHI-300. Для световой микроскопии полутонкия срезы подкрашивали л-фвнвлевдиамивом.

В экспериментах на модальных системах регистрировали различные показатели клеточной жизнедеятельности. Изменение уровня белка определяли по to wry et al. (1951). ДНК Я РНК - по Цаяеву и Маркову (1960). Динамику изменения транспортных клеточных процессов, синтеза белков, яухлетгаовнх кислот и эфиров холила исследовали с использованием 2-1'с-глутймяновоа кислоты (37-185 кПк/мл), эН-лай-цина (370 кБк/мл), 14С-уридина (185 кБк/мл), 3Н-тимидина (370 кБв/ мл) и 2-,4С-ацетата (740 кБк/ил). Об изменения интенсивности синтеза белка и нуклеиновых кислот судили по величине относительной удельной активности (0УА), рассчитанной как отношение г.о.тчп -

ства радиоактивной мотки в них к общей радиоактивности ткани. Идентификацию меченых Фракций казеива проводили методом электрофореза в пояиакриламидном гело в щелочной буферной системе (Syvaoja, 1971). При определении обмена ионов Ca" тканевые препараты инкубировали в растворе Локка, содержащем 46СаС1а (370 кБк/ыл), по методика llayer et al.(1972). Нуклеозидфосфаты фракционировали по модифицированной нами методике ионообменной хроматографии на колонке со смолой Дауакс-lxß в формиагвой форме (Pechan, Uarko, 1963). Креатин и креатнафосфат определяли по методу Еппог (1957). Биотостированиа тканевых АХ-подобных веществ ("АХ") проводили на спинной мышце медицинской пиявки (Попов, Коваленко, 1970; Коваленко, Попов, 1931). Регистрацию натяжения тест-препарата в изометрическом режиме работы осуществляли на установка, сконструированной нами на основе механотронов 6UX1C и 6Их1Б. Активность ХЭ определяли по методике Ellman et al.(1961) в модифицированной методике Ele a trin (1949). Проницаемость мембран кнтактпых клеток железистой ткани дня ээерииа и других анти-ХЭ препаратов оценивали по величине их "защитного" аффекта от действия хорошо проникающего, сильного а необратимого ингибитора - армина (Михельсон, Зеймаль, 1970). Схема опыта в атом случае позволяла рассчитывать истинную величину иягибировация XD в интактаых клетках (Тонкопий и др.,1972). При оценке общей АТФазпой активности тканей по скорости гидролиза AT® образующийся неорганический фосфат определяли по методу Bible, Lauds (1969).

В работе на модельных системах испытывали влияние общего экстракта гранул, выделенных по методике Colin, Hlrach (1960) из нейтрофилов перитонеального экссудата коров, в также гомогенные препараты НПО, полученные по методика Янковоххго и др. (1978) на кафедре биохимии СПбГУ. ЛПО получаля из молока коров (Uultqulet, Morrleon, 1963). Пероксидазиую активность количественно определяли по реакции с о-дионизидином (Klebanoff, 1965) и с пирогаллолом (Polla, BhJDUkler, 1953). Аятисыворотка к НПО и ЛПО получали иммунизацией кроликов. Наличие антител к ферментам регистрировали о помощью реакции связывания комплемента (Зейфарт, 1979), а также методом иымуиодиффуэяи о игаровом голе (Allen, HorriDon, 1963). Локализацию №10 и ЛПО в тканях молочной железы и найтрофилах екссудата короэ определили методом непрямой иммунофлуоресцеяции (Эрнст, Тесман, 1979). Интенсивность свечения отдельных клеток измеряли количественно при помощи микроскопа МЛ-4, оснзщепяого ФЭУ-39А (Пуррова, Kypeiiujia, 1973). Для гистохимического и ультра-

гистохимического выявления пероксидаэной активности использовали методику с 3.З-дивмвяобенэидяпом (Graham, Karnovsky, 1966) в модификации Anderson et al. (1975). Содержание в тканях молочной железы малояового диальдегида (ЫДА) определяли по рвакцин с 2-тиобарбитуровой кислотой (Ланкин и др., 1975).

Исследование хемотаксиса лейкоцитов in vitro проводили с помощью модифицированной вами методики Boyflen (1962). Для выяснения некоторых особенностей миграции лейкоцитов из крови в ткянь молочной железы был разработан прием, суть которого заключается в том, что на поверхность органа in situ помещали кольцо с приклеенным к нему Фильтром Synpor-3. проницаемым для подвижных клеток. В вту камеру вносили раствор казеина, который обладает положительной хемотаксической активностью для лейкоцитов. Оценивали число кло-т'ок, внедрившихся за определенное время в структуру фяльтроп. Последние обрабатывали с учетом имеющихся рекомендаций ¡Boydon, 1962: Евгевьава, 1976).

Число клеток в молока женщин определяли с помощью автоматического цитометра ЦМК-1 по методике Архангельского и др. (1971), поправочные коэффициенты вводились после контрольного счета клеток в камере Горяева. В молоке коэ определяли количество жира стандартным кислотным методом (Кугенев, Барабанщиков, 1978), общей белок и казеин - по Лоури. Содержание фосфора в кэзеияе определяли по Ames, Dubin (1960), концентрацию К, Na, Ca в молоке - с помощью методики плазменной фотометрии на приборе ФПЛ-1М. Для получения ,2SI-OKCHTomraa использовали методику глюкозооксидазо - лактопе-роксидазного иодирования гормона (Хаббард, Ков, 1979). Весь Представленный в работе экспериментальный материал обработав с помощью соответствующих статистических методов (Плохивский, 1970; Ашмарин и др.,1975; Легаш, 1980).

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Совокупность полученных результатов позволяет представить общую картину процессов, происходящих в секреторных клетках и в тквви молочной железы при активации и торможении секретооСраэова-ния» детализировать' описание этих процессов и выделить наиболее перспективные в прикладном отношении пути дальнейших исследований.

3.1. Инициация цикла активности секреторных клеток молочвой железы в период лактопоэза. Роль нейро-гуморольвых факторов. Из результатов наших исследований следует, что к числу Факторов, стимулирующюг экструзию белке вэ альвеолярного железистого эпителия, могут быть отпесепы ОТ, АХ и катехолемлвя (К и НА).

Клетки впиталип, освобождаясь от накопленных секреторных продуктов (болка , жира), выводятся из заторможошюго состояния. Происходит краткое ре ионная (ira Comee 10 мин) интенсификация процессов поглощения аминокислот а белкового синтеза. В частности, поглощение 2-1,С-глутаминовой кислота возрастает примерло па 14SC. а ее включение в Солок - Canee чем в 3.8 раза (ОУА повышается в 3-4 раза). Установлено, что в этот период расходуется значительная часть фосфорсодержащих макроаргических соединений - резко (более чем в 2 раза) снижается содержание АТФ и АДФ, несколько меньше - уровни УТв, УМФ, ГНФ я AHÍ. Расходуется до 70-802 креатинфосфата. Снижение уровня ряда куклаозидфосфатов может быть связано с изменениями транспортных и синтетических процессов при функциональной активации секреторных клеток. Действительно, нами отмечено некоторое увеличение уровня тканевых РНК (на 7.7 - 1.8*, р<0.05) и ДНК (на 5.3 • 2.4%, р>0.05) при возрастании включения в них '"с-уридина аа 19.2* (р<0.05) и эН-тимидина на 43.136 (р<0.05). Одновременно регистрируется ограничение поступления в клетки этих предшественников на 14-356 и 25.256 соответственно (р<0.01).

В действии факторов-инициаторов секреции различных по своей химической природа выявлены некоторые общие моменты. Это способность вызывать гипзрполяриэацию мембран секреторных клеток (Грачев и др.,1970, 1974, 1975. 1976), а также то, что процесс стимулируемой ими экструзии блокируется в бескальцвевой среде и при воздействии колхицина. Наибольшее внимание привлекает способность ОТ, АХ и КА (в физиологических концентрациях) снижать активность тканевой ХЭ, и то, что процесс стимулируемой ими экструзия полностью или частично подавляется после обработки ткани атропином или ввти-ХЭ препаратами.

Пусковое действие АХ на экструзию белка связано о активацией м-ХР секреторных клеток. Такое заключение согласуется с данными, свидетельствующими, что м-жолинолитик атропин (34 пМ) блокирует влияние AXt кпрбохеиьн оказывается аффективным при концентрации более высокой, чем АХ: в бутирнлхолин, активирующий преимущественно я-ХР, не вызывает окструаии белка. 6 опытах на изолированных секреторных клетках намп показано, что не только АХ, во и ОТ стимулирует вкотрузию балка из них, т.е. может прямо влиять на эти клетки, хотя считается , что специфический рецепторы к ОТ локализуются только в мембранах мноздите.миальянх клеток альвеол (Солофф, 1979). После нормирования ОТ с помочью ЛПО, а также после его обработки системой МПО гормон лишается способности вызывать сокра-

щение миоэпителиалышх клеток альвеол и протоков. Однако модифицированный указанными способами ОТ, а также его антагонист (2-Д-пентафторфенил-алэнин)-ОТ стимулируют экструзию белка секреторными клетками и, так же как сам ОТ, влияют на активность ХЭ. В очень низких концентрациях (2 нМ) ОТ и примененные его аналоги могут снижать активность ХЭ более, чем на 205!. Влияние аналогов ОТ па секреторные клетки блокируется атропином и ээвряном.

В опытах in situ показано, что действие ОТ на альвеолярные клетки молочной железы дополняется однонаправленным с ним влиянием АХ. поскольку аффект сокращения альвеол усиливается анти-ХЭ препаратами и блокируется атропином (Грачов и др.,1976). В отличие от АХ, БХ не вызывает сокращения миоэпитолия, что свидетельствует о наличии и у отого типа клеток м-ХР. Появление свободной формы "ЛХ" в железистой ткани при развитии реакции молоковцведения может быть связано с активацией эфферентных холинергяческих нервов, наличие которых в органе было доказано нами ранее (Грачев и др., 197*1. 1976; Галанцев и др.,1972; Попов, 1972), а также с освобождением тканевого "АХ" при действии ОТ. Последний эффект четко зарегистрирован нами в опытах с аппликацией ОТ (1 нМ, 2 мии) на тканевые препараты (п«10). Так, исходный уровень "АХ" в ткани и окружающей среде составлял 32 - 5 и 6 - 2 яг/г соответственно. После воздействия ОТ содержание "АХ" в ткани снизилось до 16 - 3 нг/г, а в среде возросло до 19 * 5 нг/г. При аппликации ОТ яа поверхность интвктпой железы также было отмечено снижение содержания "АХ" в ткани, на 57SS- Допустимо предположение, что гормон инициирует освобождение "АХ", либо связанного с неспецифическими тканевыми акцепторами, в качестве которых могут служить ОТ-рецепторы миоэпитолия , либо из альвеолярных секреторных клеток.

Первичный аффект КА в железистой ткани также заключается в стимуляции экструзии секреторного белка, при этом А в концентрации Ю вг/мл так же эффективен, как НА в концентрации 1 ыкг/мл. Такое различие может, отчасти, объясняться тем, что А взаимодействует с 0- и а-АР, присутствующими в секреторных клетках, в то время, как НА - преимущественно с а-АР (Марков, 1981). Учитывая то обстоятельство, что при активации 0-АР в мембранах секреторных клеток растет активность вденилатциклазы (Ваг, 1973). а Также то. что дб-цАМФ усиливает экструзию белка, можно заключить, что стимуляция экструзии при действии КА сопряжена, в основном, с активацией р-АР, связанных с адепилатциклаэной системой. Последней подтверждается тем, что при илгибировании фосфодотстеряз эуфилляеом ми

1G -

отметили увеличение вффакта А (при и той у АХ аффект снижается). При совместном применении ОТ. АХ и IU установлено, что АХ онижмят действие А и увеличивает действие ПА; ОТ не оказывает такого влияния. Известное тормозное влияние КА на секреторный процесс в молочной железе может проявиться, вероятно, ара развитии последующих тканевых и клеточных процессов, а также при включении других, системных механизмов.

В целом, механизмы влияния КА, АХ и ОТ па секреторные клетки молочпой железы находят удоилетворительное объяснение с позиций существующих рецвцториых концепций. Вместе с этим, действие изученных вами стимуляторов секреторных клеток сопровождается снижением активности ХЭ при одновременном увеличении переноса в клетки аминокислот и повышением уровня №. Известно, что поглощение аминокислот сопряжено с переносом ионов Na* и зависит от градиента етих ионов, поддерживаемого №, К-АТФазой. Из этого следует, что при активации секреторных клеток активность транспортной АТФазы должна возрастать. Напротив, при блокаде ХЭ взерииом в опытах in situ мы отметили снижение поглощения клетками 2-''с-глутаминовой кислоты. Кроме того, било показано, что »зерен (10 мкг/мл) снижает АТФазвую активность ткани молочной железы на 26.3 - 10.336, такой же эффект вызывает атрошш. В аналогичных условиях in situ отмечается снижение уровня МП секреторных клеток при действии прозерина и убаина (Толкунов, 19Гб). Установлено также, что для заметного торможения стимулируемой экструзии балка антк-ХЭ препаратами достаточно ингибирования не более 3056 активности фермента, при этом аффективны и не проникающие в клетку препараты, что свидетельствует о важней роли ХЭ внешних, плазматических мембран. Таким образом, полученные нами данные свидетельст. уют о существенной роли взаимодействий ОТ и КА с холинергическими компонентами сложной системы трансмембранного переноса ряда веществ, в которой важную роль играет Na.K-АТФаза.

3- 2. Саморегуляция железистого эпителия в пределах цикла клеточной активности

Проследив динамику функциональных параметров активированных секреторных клеток в опытах in vitro и in situ, мы установили характерные ритмические колебания интенсивности процессов поглощения аминокислот, синтеза, экструзии белка и транспорта ионов Саг*, имеющих общий околочасовой период. Анализируя этот факт, необходимо отмотить, что интенсивность течения во времени определяемых нами процессов связана прямой зависимостью с количеством клеток.

обладающих повышенным (выше 30 мв) уровнем Ю (Грачев и др.,1976). Эти данные, в сочетании с данными о том, что длительность секреторного цикла от моменте поглощения клеткой аминокислот до выделения вновь синтезированного белка составляет для молочной железы мышей около 60 мин (Еааске, НеаХ<3, 1974), свидетельствует о ритмичности функционирования секреторпых клеток. Очевидно, что вслед за завершением стимулированного секреторного клеточного цикля процессы, связанные с развитием очередного цикла секретообразова-ния, интенсифицируются автоматически, т.е. без дополнительных внявших воздействий. Полученные результаты согласуются с представлениями об этапности, гетерохрояизмэ процессов секреторного цикла, которые могут быть применены и в отношении молочной железы.

Опыты с обработкой ткани молочной железы колхицином и ЭГТА

позволили выявить важную роль системы цитоскелета и ионов Саг* в

механизмах внутриклеточного транспорта и экструзии секреторного

белка. В электронномикроскопическом исследовании установлено, что

нарушение функционирования микротрубочек колхицином тормозит

перемещение секреторных везикул (СВ) в апикальную зову клетки,

~ 2 ♦

тогда как недостаток ионов Са препятствует укрупнению переместившихся в эту зону СВ и их взаимодействию с плазматической мембраной. В результате ве осуществляется экзоцитоз секреторного белка. Очевидно, для реализации механизма экструзии белка необходимо увеличение в цитоплазма уровня ионов Са1*, которые поступают из внешней среды через базелыше мембраны клеток и/или освобождаются из внутриклеточных депо, что псдтверадается результатами алектрофнзиологических исследований (Грачев и др., 1976; А1екпееу atal.,1992; Толкунов, 1993).

Вместе с этим, общое содержание Са а клетках определяется ве только его поступлением из внешней среды, во и выделением из клеток в составе секрета, причем а период стимуляции экструзии белка количество ввделившегося из клеток Са превышает вяовь поступившее из среда его количество. Именно этим можно объяснять наличие значительной, достоверной в обратной связи уровня поглощения 1®Са клетками с изменениями ввделеняя из шгх белка (г=-0.61 1 0.27, Р<0.05) и о МП секреторных клеток (г—0.65 * 0.19.р<0.01), а также существование корреляций между содержанием казеине (1), фосфора в казеине (2) и Са (з) в молока. Коэффициент корреляции в соре 1-3 выявил наличие положительной, но не сильной связи!

3"=0.45 - 0.27 (р>0.05). Используя метод ранжирования, вычисляем коэффициенты г)1/э-0.46 - 0.26 и которые формально вскрывп-

ют существование более сильной зависимости содержания Са от белка, чем наоборот. В паре же 2-3 выявляется достаточно сильная положительная связь: г .0.66 - 0.19 (р<0.01), ч показатели п .0.53 -

* > з 'г / з

0.24 и П3/г«1 вскрывают более выраженную зависимость содержания

Са от фосфора в казеина, чем наоборот. Оценивая далее взаимовлияние трех показателей по методу поочередного исключения влияния одного из mix, получаем соответствующие значения г 3=0.7, гг 3.,"0-54 и г( зг«-0.13, которые свидетельствуют о существовании сильной положительной взаимосвязи между казеином и фосфором при исключении влияния Са, менее сильной "«жду фосфором и Са при исключении влияния белка, при исключении же влияния фосфора связь между казеином и Са приобретает отрицательное значении. Оти данные говорят о том, что основная часть Са выделяется из клеток, будучи сшюшшой с фосфатными группами казеина.

В механизмах акотрузии секреторного белка принимает участие и система цикловуклеотидов. При добавлении в среду дб-цАМФ (0.1 мЫ) процесс екструзии белка аз секреторных клеток тканевых препаратов стимулируется. Эффект дб-цАЫФ усиливается на фоне ингибирования фосфодиастерэз оуфиллиноы (4.8 мг/мл). В бескальциевой среде (с 3 мЫ ЭГТА) или при нарушении функции микротрубочек колхицином стимулирующее действие цАЫ® не проявляется. Следовательно, одного только повышения уровня ЦАПФ в клетке недостаточно для реализации екструзии белка, механизм которой контролируется комплексом морфо-функциональных компонентов клетки.

Тот факт, что интенсификация синтеза секреторного болка происходит в клетках вследствие их освобождения от накопленного ранее секрета был также обоснован в опытах с предварительной обработкой тканевых препаратов колхицином (2.5 мкМ) и ЭГТА (3 мМ). Показано, что подавление синтеза белка колхиц. лом и ЭГТА (не 8356 и 't'i-2%) происходит за счет общего снижения синтеза водорастворимых тканевых белков и, главным образом, синтеза казеиновых фракций (на 81.2% и 7556 соответственно), в то время как синтез водонераствори-мых белков возрастает в 3.8-4 раза после стимуляции клеток АХ. Под действием АХ на фоне колхицина и ЭГТА, так же, как и в норме, возрастает поглощение клетками меченой аминокислоты, в то же время ОУА снижается в 6.6-8.3 раза. Таким образом, аффект торможения белкового синтеза под действием этих веществ не связан с ограничением поступления в клетки аминокислот или с неспецифическим повреждением механизма белкового синтеза, и свидетельствует о существовании регуляторной связи между процессами экструзии и синтеза

бедка.

При анализе механизмов, контролирующих ритмическую деятельность секреторного эпителия альвеол в период цикла клеточной активности, основное внимание было уделано изучению роли внутриклеточных эфиров холина и формантов их обмена. Основанном для этого послуаэиш данные о прерывании аатоматии секреторных глоток атропином и эзерииом. Ранее нами было установлено, что в железистой ткани содержатся АХ, ПХ и БХ, ферменты их синтеза и гидролиза (Грачев и др.,1970; Попов, Коваленко, 1970s Попов, 1972). Доказан факт локализации АХ, ПХ и ЕХ в секреторных метках, и изучены некоторые особенности их компартмеытализации. В частности, оказалось, что в ядрах секреторных клеток преобладает ПХ (Попов, 1972). В последующих исследованиях была выявлена активность ХЭ и холин-ацетилаэы в цитоплаоматических и ядерных структурах секреторных клеток (Валакина, 1983). По-видимому, не только характер внутриклеточной локализации, но и функции эфиров холина в секреторных клетках отличаются. Это следует, например, из данных о том, что БХ увеличивает степень фосфорилированности казеина, а АХ снижает (Попов и др.,1974).

Об участии внутриклеточного "АХ" и других компонентов внутриклеточного звена холинергичоской системы в поддержании ритмической деятельности секреторных клеток свидетельствуют данные о том, что в пределах 10-минутного интервала развития автоматического пика экструзии белка (на 50-60 мин после воздействия ОТ) регистрируется в течение первых 5 мин быстрое нарастание более, чем в 6 раз (п-11, р<0.001) содержания тканевых эфиров голина за счет увеличения их синтеза и снижения активности ХЭ почти в 2 раза (п=10, р<0.01). Одноврзмевпо увеличивается общая АТФазная активность с 750 - 81 до 1100 - 98 мкМ АТФ/г/ч (п=Э). После «того уровень "АХ" резко снижается почти до исходпого, а активность ХЭ возрастает иа 8856 (р<0.01) при снижении АТФазной активности до 853 - 75 мкМ АТФ/г/ч. Отсутствие в этот период освобождения "АХ" в среду щюд-полагает ого внутриклеточный гидролиз. На фоне действия ингибиторов белкового синтеза - цкклогексимида и пуромицина - отмеченные изменения активности ХЭ не проявляются. Важно отмотять, что специфическая блокада холи нергиче с кого механизма проникающими в клетку атропином и эзерииом приводит к подавлению автоматической экструзии белка, а также экструзии, стимулируемой дб-цАНФ, тогда как малопроникающие энти-ХЭ препараты менее аффективны или совеом не влияют (Попов, Коваленко, 1970) Попов, 1989).

РО

Можно заключить, что многокаскадный механизм саморегуляции, контролирующий конечный этап секреторного цикла (экструзию белка) и определяющий ритмичность деятельности секреторных клеток, включает в себя элементы клеточной холипергичоской системы. Эта система, с одной стороны, должна зависеть от мембранных и цитошшзмати -ческих процессов (в том числе, циклонуклеотид-зависимых), о с другой - ее можно рассматривать как самостоятельную и необходимую часть пускового механизма экструзии белка. Наиболее вероятную основу этого механизма, по нашему мнению, может составлять взаимодействие ТО с Ия, К-АТ?азой, а также влияние эндогенного "АХ" па уровень плазматических ионов Саг*. Поэтому, по принципу действия указанный механизм (носмотря на его внутриклеточную локализацию) сходен с механизмом, который используется клетками при инициации вкструзии внешними медааторпо-гормональншдо факторами. Предлагается гипотеза, что холинореактивные механизмы клеточной саморегуляции осуществляются при участии "клатриновых" везикул (Попов, 1939).

Э.з. Обнаружение тормозного действия химических факторов нейтрофилышх лейкоцитов и обоснование гипотезы об участии нейтрофилов в регуляции секреции молочной железы

Анализируя клеточные механизмы регуляции функциональной активности секреторного впителия молочной железы, необходимо учитывать систему сложных межклеточных взаимодействий в ткани. В этой связи ваше внимание привлек давно известный факт, что в молоко даже в норме содержится 'большое количество лейкоцитов, которые в процессе преодоления гемато-молочного барьера могут оказывать какое-то влияние на железистый эпителий. Известно, что в молоке основной клеточной популяцией являются наиболее подвижные из лейкоцитов - нейтрофилы. В олектронпомикроскопическом исследовании на молочной железе мышей мы установили, что лейкоциты, мигрировавшие из капилляров в соединительную ткань, преодолевают оставшиеся компоненты гемато-молочного барьера на уровне однослойного эпителия альвеол я мелких протоков. В стопку альвеол опй внедряются, как правило, под отростки миозпителиальных клеток. В месте внедрения лейкоцита можно наблюдать разрыхление базальной мембраны, покрывающей альвеолярный комплекс. Обращает на себя внимание, что нейтрофилы при внедрении в стенку альвеол теряют значительную часть грайул. Поскольку в их цитоплазме при этом пе обнаруживается фагосом, можно заключить, что дегрануляция нейтро-фялов связана с явлением экзоцитоза содержимого гранул. Далее,

внедрившийся и станку альвеол гроцулоцнти (и лимфоциты) перемещаются между сокроторними клетками и, разрушая структуру ц,потного коптпкта соседних секреторных клеток, попадают в полость альвеол, содержащую секрет.

Для изучения дипамлки миграции лейкоцитов из кровеносных сосудов в рыхлую соединительную ткань молочной железы мышей мы разработали экспресс-методику для модельных условий in situ. С ее помощью показано, что усиление миграции лейкоцитов происходит в периоды стимуляции и торможения секреторного процесса в органе. Так, после введения (в/б) мышам ОТ в дозе 1 мШ5/г было зарегистрировано непродолжительное (менее 1 ч) усиление миграции лейкоцитов в соединительную ткань молочной железы, при этом число клеток, внедряющихся в фильтр прикладываемой к поверхности органа камеры, увеличивалось в среднем на 35-5 - 8.5% (р<0.01). Эти даиные согласуются с результатами других авторов, отметивших, что при реализации рефлекса молоковыведеиия в венозной крови молочной железы снижается содержание нейтрофилов (Рааре, Ouidry, 1969) и, что при инъекции животным ОТ уровень нейтрофилов в молока существенно возрастает (Владимирова, Белова, 1982).

Используя модифицированную методику Бойдена in vitro, мы рценили хемотаксическую активность некоторых веществ (холима, АХ, А и гистамиаа) по отаошеяию к лейкоцитам крови. Установлено, что все эти вещества, за исключением гистамяна, в физиологических концентрациях усиливают миграцию лейкоцитов: холил (10 мкг/мл) -на 26.0 - 9.1Я (р<0.05), АХ (1 мкг/мл) - на 75.0 - 14.156 (р<0.01), А (1 мкг/мл) - на 29.6 í 9-0Ж (р<0.05). По-видимому, in vivo при активации секретообразоаания в молочной железе освобождающийся тканевой "АХ" может выполнять функцию хемовттрактвнта для лейкоцитов, действие гистамина может реализоваться косвенно, за счет увеличения проницаемости капилляров, а эффект А заключается в увеличении подвижности лейкоцитов, что может проявляться в виде усиления их направленной миграция под влиянием других хемотакси-ческах веществ. Последнее подтверадается результатом опытов с казеином. Сам казеин (50 мкг/мл) увеличивал число мигрирующих лейкоцитов на 15-7 - 7.IK, А (1 мкг/мл) увеличил аффект до 59.0 -12.2JE (р<0.05). тогда как АХ (1 мкг/мл) и ОТ ( 1 мМЕ/мл) не пызыва-ли достоверного изменения хемотаксиса лейкоцитов на казеин.

Наряду с отмоченными фактами известно, что ОТ и АХ, воспроизводя аффекты рефлекторной стимуляции секретооброэоввнвя в молочной железе, вызывают вазодияятацию (Скопичев, 1994). сопровождающуюся

??

увеличенном объемной скорости кровотока и томпературч ткачи (К.ис-лякова, 1900; Беззубцев и др.,1901). Проницаемость капилляров также ооэрастает, о чем можно судить по увеличению числа линоци-тозных вакуолей в эидотелиальных клетках и усилению лимфооттока (Хрустадева, 1902; Потов, Доржиев, 1902). По аналогии с другими сокроторными органами в развитии отмеченных реакций принимают участие тучлые клетки (тканевые базофилы), в которых, по нашим даоным, после воздействия ОТ усиливаются процессы догрануляции (Балакина, Попов, 1990). В частности, известно, что выделяемый этими клетками гястамин действует однонаправленно с АХ и может еще больше увеличивать проницаемость капилляров, обеспечивая доставку метаболитов, кислорода, гормонов, необходимых для процессов секре-тообраэования в альвеолярном эпителии. Важно подчеркнуть, что отмеченные аффекты кратковремениы и не превышают нескольких минут. В целом, в период активации секретообразования в молочной железе после реализации рофлекса молоковыведення или в эксперименте после воздействия ОТ и АХ происходящие в органе процессы, в том числе усиление деграпуляцяи тучных клеток и миграции лейкоцитов, сходны с картиной "физиологического воспаления", описанного для других секреторных оргавов (Успенский, 1986).

Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что содержание лейкоцитоп в молоке значительно возрастает за счет пойтрофплов при торможении секреторной деятельности железы. В частности, этот эффект четко проявляется, когда торможение секретообразования развивается при увеличении времени между дойками (Грачев, Смолина, 1978). В наших опытах на мышах отмечено увеличение на 61£ (р<0.01) числа лейкоцитов, мигрирующих в соединительную ткань железы в период торможении секреторного процессе через 0-10 ч поело выведения молока из органа, по сравнению с уровнем их миграции сразу после выведения молока.

Дополнительные данные получены нами при исследовании содержаний клеточных элементов в молоке у 10 жеящия-родильниц через 5-6 дней после родов. Сравнивали число клеток в порциях сцеживаемого молока, полученных через 7 и 10 ч от последнего кормления из одной и той же железы. Установлено, что при 7-часовом интервале число клеток составляет 69 4 13 тыс/мл, а при 10-часовом - 129 * 21 тыс/мл, то есть яа 87Ж больше (р<0.05). При этом известно, что за 7 ч в железе накапливается 64.5 г 5.8 мл молока, а за 10 ч - 68.6 1 7.6 мл (Иажбиц и др-,1977)- Сопоставление этих данных также поэполлот заключить, что возрастание числа мигрирующих в молоко

- 23 -

лейкоцитов наблюдается при заполнении молоком емкостный системы железы, когда происходит евижепие скорости секретообразоиания.

Г) целом, представленные данные свидетельствуют о том, что мигрирующие в молочную железу лейкоциты нейтрофилыгого ряда пииол-няют там какие-то весьма важные функции как в период активации, так и в период торможения деятельности секреторного эпителия. При этом нужна подчеркнуть, что в последнем случав миграция лейкоцитов в железистую ткань существенно вито, чем в первом. Чтобы оцепить значение этих явлений, потребовалось разностороннее изучение механизмов влияния выделяемых нейтрофилами факторов.

Исследуя характер влияния на секреторный процесс в молочной железе белковых факторов, выделяющихся из пейтрофилов при экзоци-тоза содержимого их гранул в непосредственной близости от секреторных клеток, мы наиболее полно исследовали эффекты системы МПО. Особый интерес именно к этой ферментативной системе не случаев. В наших опытах при . проведении ультрагистохимической реакции установлено, что пероксидазная активность выявляется в большинстве гранул нийтрофилоп мыши. По-видимому, за счет обилия этих гранул при флуоресцентной иммуногистохимкческой реакции на ИПО было зарегистрировано интенсивное свечение всей цитоплазмы нейтрофилов роровы (Попов и др.,19G1). Известно, что при экзоцитозе содержимого гранул активированные нэйтрофилы, наряду с ШО, выделяют Н202 в ионы С1~ и 1% которые являются кофакторами пероксидазнах реакций (Root, Hetcalf, 1977). В процессе пероксидазного катализа иродуци-руатся большой набор высокорвактявных антибиотических агентов: гкпохлорит. свободные радикалы, хлорамипы, альдегида, сияглетный кислород и др. (Владимиров, Шерстнев, 1989; Rttoden, Bumes, 1989; Cochrane, 1991); расходуются компоненты тканевой снстомы антиокси-дантов и активируются реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран (Ашев et al.,1993; Galanteev et al.,1993). Очевидно, что в зависимости от интенсивности и длительности отмеченных роакцяй клетки тканей могут либо необратимо повреждаться, либо в большей или меньшой мери изменить свою функциональную актвваость.

Опыты с прямой аппликацией экстракта из гранул пейтрофилои и раствора ШО мы проводили на тканевьтс препаратах tn vitro is mi-твктпой молочной железе in eltu. Высокоочмщьшзую ШО использовали в концентрации 0.07-0.14 мкг/мл с активностью 50-100 о.д.а./мл, которая бала па трп порядка ниже ойщей пероксидазной актияпости гомогоната железистой ткали. Экстракт гранул иеЯтрофилов с et-.тяв-

постью НПО 100 о.д.о./мл содержал го мкг/мл белт_о. Инкубацию П{юводали с добавлением в сроду (45 нИ/мл) или баз такового,

расчитывая на возможность образования хотя бы незначительных количеств эндогенной 11^0^ ври участии тканевых форментативпих систем (коачтипоксидвзы и др.). Известно, что при снижении концентрации П^О. ниже оптимального уровня (50-80 нН/мл) каталитическая активность ИГО существенно уменьшается (Янковский, 1979). Ото обстоятельство в опытах без добавления в среду Нг02 позволяет моделировать я в первом приближении определить эффекты, вызываемые НПО в период функциональной активации молочной желозн, когда усиление миграции пойтрофилоа в ткань кратковременно, а выделяемая лейкоцитами II.0^ но может, вероятно, достигнуть уровня, оптимального для пероксидазного катализа. Напротив, в спи пух с добавлением в среду Нг0г (в концентрации, не оказывающей повреждающего действия) можно повысить интенсивность пороксидазных реакций. Ото является одним из путей моделирования условий, которые, по-видимому, возникают при продолжительном и значительном усилении миграции иейтрофидоа в период торможения секретообразования в молочной железе.

В опытах in vitro без добавления в среду Н^О^ (п=17) получены данные о том, что 1Ш0 не влияет на фоновый уровень выделения белка я его экструзию из секреторных клеток, стимулируемую АХ, но зато угнетает почта на 6036 (р<0.01) экструзию, вызываемую ОТ- Можно заключить, что ИГО в ьтих условиях не повреждает секреторные клетки, так как они проявляют исходную функциональную активность при действии АХ. Анализируя влияние МП0 на эффект ОТ, мы установили. что модификация молекул гормона системой КПО не лишает его способности стимулировать экструзию белка а тормозить активность тканевой ХЭ. Вместе с этим установлено, что после инкубации с НПО исходный уровень "АХ" в железистой ткани сохраняется, однако "АХ" перестает выделяться в среду в ответ на воздействие ОТ (п*10, р<0.05). Показано также, что НТО без.добавления Н^О^ не влияет на активность ХЭ в гемогейлте железистой ткани. Из этих Данных следует, что основной причиной блокады влияния ОТ на секреторные клетки является нарушение при действии МПО (в условиях дефицита Н20г) процесса освобождения тканевого "АХ".

Полученные результаты позволяют предполагать, что система соединительной ткапи молочной железы в пориод "физиологического воспаления" выполняет не только функцию трофического обеспечения активированного секреторного эпителия, но и защитную функцию. В

частности, нойтрофилы и этот короткий период могут поглощать и инактивиронать часть поступающих в железистую ткань гормонов, таких как пролякттх и инсулин (Dron et al.,198Q), а выделяемая нейтрофилами МПО способна снизить уровень свободного "АХ", блокируя процесс ого освобождения ярд действии ОТ. Таким образом, в процессе "физиологического воспаления" высокий уровень секреции достигается, по-видимому, и за счет предохранения железистых клеток от воздействия избытка активирующих медиаторов и гормонов.

D дальнейших исслодовапиях, повышая интенсивность пероксидаз-ных раякций в опытах с добавлением в сроду Н^О^, ми установили, что воздействие системы МПО приводит, к полному торможению автоматической экструзии белка секреторными клетками и экструзии, стимулируемой не только ОТ, но и АХ (п-17, р<0.01). Отдельно пзятыо МПО или Нг0г не блокируют экструзию в ответ на АХ. Кроме этого эффекта в опытах In vitro (п-15) было устапонлепо, что окстрокт из гранул нейтрофилов и выделенная из него МПО в присутствии экзогенной оказывают сильное тормозное влияние на процесс поглощения клетками молочной железы аминокислот и на синтез белка. Эффект очищенной ШО был несколько вишэ, чем у суммарного экстракта гранул: поглощение 2-14С-глутаминовой кислоты и ее включение в белок снижались в случае МПО в 13.7 и 4.7 раза соответственно (р<0.001), а при воздействии экстракта - в 7.1 ив 3-2 раза (р<0.001). При воздействии МПО о Нг0г на интактную молочную железу в опытах in Bitu (п=10) включение меченой аминокислоты в белок снижалось пя 33.1)6 (р<0.001). Меньшая выраженность эффекта НПО в этом случае может объясняться тем, что циркулирующая кровь способна частично восстанавливать резервы антиоксидантов в железистой ткани и обоспочявать расщепление 11,0^ с участием каталазы. Вместе с этим, качественное совпадение результатов онытов In vitro и in Bitu свидетельствует, что для реализации тормозного влияния ЫПО на секреторные клетки достаточным является контакт фермента только с базально-латеральиой поверхностью клеток, поскольку в условиях in aitu ашглицируемый фермент не проникает в полость альвеол. Заключение о непроницаемости плотных контактен между секреторными клетками альвеол для НПО было подтверждено нами в гистохимическом исследовании распространения фермента, введенного в емкостнуп систему железы.

Представленные результаты, по нашему мнению, достаточно полно обосновывают гипотезу о возможности тормозного влияния иа секрото-образовпяие в молочной железе выделяемых неЯтрофяламя цитотокси-

ческих факторов, сроди которых основную роль вграот. система НПО. Биологический смысл существования регуляторно-тормоопой системы с участием иойтрофилов заключается, очевидно, в том, что при дополнения молочной железы секретом может происходить попрождепио оо тканей и поступление в кровь компонентов молока, в нормо не присущих организму и способных привести к серьозцым нарушениям гомоо-стаза. Поэтому организм отвечает ва такую ситуацию обычной защитной реакцией, характерной чертой которой является усилапио миграции нейтрофилов к источнику повреждения, то есть к молочной железе, где их общая защитная функция проявляется на начальных этапах как рогуляторяая, тормозная. При более длительной задержке молоко-вывёдэния происходят необратимые повреждения железистого эпителия и его инволюция.

Анализируя некоторые механизмы влияния НПО на железистый впителий, мы исходили из известных данных, согласно которым перок-евдозы, не проникая в клетки, изменяют прежде всего свойства их внешних плазматических мембран (Хаббард, Кон, 1979). В частности, опираясь на результаты представленные в разделе Э. 1, исследовали влияние системы ШО, па активность тканевой ХЭ. Установлено, что при добавлении к гомогенату железистой ткани ШО и Нг0г происходит быстро прогрессирующее и значительное угнетение активности ХЭ. Аналогичное воздействие па интвктныа клетки тканевых препаратов через 30 мил приводит к снижению скорости гидролиза ацетилтиохоли-на с участием ХЭ всего на 9.0 - 1.8Я (п=»10, р<0.05), тогда как скорость гидролиза бутирилтиохолинз вообще не изменяется. Эти результаты (в сочетании с данными о подавлении функциональной активности секреторных клеток селективным ингибитором ацетил-ХЭ оксазвлом) позволяют предполагать, что во внешней мембране клеток молочной железы локализуется ацетил-ХЭ и что продукты пероксидаз-пого катализа в условиях опыта повреждают, главным образом, внешнюю мембрану клеток. Очевидно, не все белковые компоненты клеточных мембран столь же чувствительны к. НПО, как ХЭ. В частности, не происходит повреждения специфических ОТ-роцепторов мийэпвтелия. Об этом свидетельствует сохранение сократительной активности полосок ткани молочной желазы в ответ иа ОТ. Важно подчеркнуть, что инактивация ХЭ в молочной железе мышей обнаруживается и в условиях in situ. Так, в период торможения сикретообрязопания мы зарегистрировали снижение активности ХЭ в оттекающей от органа венозной крови относительно артериальной но 4.8 1 1.Ъ% (п=10, р<0.05). Одновременно в гелозистой ткани возрастает содержание веществ, угнетающих

активность ХЭ. Извостно, что к числу факторов, иигибирующих ХЭ, а также N3, К-АТФазу, Са-АТФазу и адонидатциклазу мембран, относятся продукты, образующиеся в процессе ПОЛ (Шведова и др.,1902; СосЬга-пы, 1991! Аптипспко и др., 1992; 1993). Нами установлено, что при задержке молоковыведения и торможении секретообразовокия у мышей уровень ПОЛ в железистой ткани действительно возрастает, о. чем можно судить по увеличению содержания МДА на 40% (р<0.001) по сравпенШо с его содержанием в период интенсивной секреции.

Одной из причин активации ПОЛ является, очевидно, увеличение содержания в железистой ткапи КА, поскольку установлено, что задержка молоковыведения - стрессорный фактор для животных (Дюсем-бин, 1902). Прооксидантное влияние КА показано при изучении патогенеза стрессорного повреждения различных тканей.- Эти повреждения можно предотвратить предварительным введением животным антиокси-дантов (Ыеерсок и др.,1302; 5и>о1гу а1.,1993). Эффект активации ПОЛ вызывают свободнорадикалыше продукты, возникающие, вероятно, на только при автоокислении, но и при ферментативном окислении КА системой МПО нейтрофильных дойкоцитов, миграция которых в железистую ткаяь при стрессах резко возрастает (Великжааин, 1975). Таким образом, представленные данные позволяют прогнозировать, что одним из перспективных способов стимуляции молочной продуктивности может быть введение в рацион животных антиоксидантов.

• вывода

1* Показано, что дня изучения особенностей секреторного процесса на клеточном уровне могут использоваться в качества физиологических модельных сиотем тканевые препараты молочной железы и интакт-ный орган (без кожного покрова) наркотизированного животного. Необходимым условием их применения является синхронизация деятельности большей части клеток железистого эпителия по стадии секреторного цикла.

2. Экзогенные ОТ, АХ и КА инициируют цикл активности секреторных клеток молочной железы, стимулируя экструзию белка. Пусковое действие АХ связано с активацией м-ХР этих клеток, а КА - преимущественно с активацией (3-АГ. Стимулирующее влияние ОТ па секреторные клетки опосредуется, в основном, освобождающимся тканевым "АХ". Общность действия ОТ, КА и АХ на железистую ткань заключается в их способности снижать активность ХЭ; их стимулирующее влияние на секреторные клетки блокируется атропином и авти-ХЗ препаратами. , --3. При стимуляции освобождения железистых клеток от накопленного

F.O

белкового секрета кратковременно возрастают поглощение клетками аминокислот и интспоивность синтеза секреторного белка. В ткани резко снижаются содержание АТФ и суммарный пул адотгановых иуклпо-тидов, расходуется креатинфосфат. Снижение уровпя нуклеотидов связано с интенсификацией синтеза нуклеиновых кислот и с ограничением поглощения клетками их продаюствешшков.

4. В пределах инициированного цикла активности секреторные клетки Функционируют ритмически с около-часовым периодом, последовательно осуществляя несколько секреторных циклов. Возникновение максимумов поглощения аминокислот, синтеза белка и его экструзии чероз каждые 50-60 мин происходит без дополнительных внешних стимулов -автоматически.

5- В механизмах внутриклеточного транспорта и экструзии секреторного белка, а также в регуляции этих процессов важлую роль играют ионы Ca2*, цитосколетный комплекс и циклонуклеотиды.

- Ионы Саг* необходимы, в частности, для взаимодействия мембран СВ между собой и с апикальной мембраной клетки, о также для регуляции процессов сборки-разборки МТ.

- цАМФ оквзнвает стимулирующее влияние ва экструзию белка, эффект усиливается при ингибиропапии фосфодиэствраз.

- Комплексное функционирование элементов цитоскелета обеспечивает либо транспорт СВ в апикальную зопу клетки и вкструзию секрета, либо при увеличении плотности цитоскалетной сети создает барьер для этих процессов. Реорганизация цитоскелета и динамика поглощения ионов Саа* тесно связаны с фазами секреторного цикла и ритмичностью функционирования железистых клеток.

6. В среде с ЭГТА или колхицином блокируются процессы экструзии секреторного белка и его синтеза, что свидетельствует о системности пускового механизма экструзии и о наличии обратного положительного регуляторпого влияния экструзии белкового секрета ва «го синтез.

7. В процессах саморегуляции секреторных клеток участвуют также внутриклеточные эфиры холило (с ферментами пх спатозд в гидролиза), которые являются необходимой частью пускового механизма автоматической экструзии белка и, следовательно, способны определять ритм функционирования секреторных клоток. Предлагается гипотеза, что внутриклеточные холинореактивныа регуляторнно процесс« реализуются при участий окаймленных везикул.

О. Лойкоциты Преодолевают гемато-молочкцй Оорьар пз уроопо одло-t;.;ioü{£oro опитоляя r,.-j.!i«Oji и ¡„j.;:tji.. иротокса. ;:::гр.оцмя .;.сЛксг,:.г.го;':

(главным образом, нейтрофилоп) кратковрвмшшо увеличивается в момент актилации секреторного процесса в органе ири ноодейстпии ОТ. Более сильная и длительная миграция в ткань и молоко спязппа с периодами торможении секротообряноватая. При внедрении в структуру альвеол лейкоциты не нарушают целостности мембран секреторных клеток; в нейтрофилэх наблюдается эффект частичной дегрануляции. К числу хемотаксических факторов, усиливающих миграцию нейтрофилов в железистую ткань, следует отнести казеин, АХ и холив.

9. В развитии торможения секретообразования в молочной железе важную роль играет . система №0, выделяемая нейтрофилями. Эта система оказывает сильное тормозное влияние на процессы экструзии белка, поглощение клетками аминокислот и белковый синтез.

10. Механизмы тормозного влияния системы МПО связапы с активацией реакций ПОЛ, приводящей к изменению свойств плазматических мембран секреторных клеток (в частности, ингибированию ХЭ и систем мембранного транспорта веществ), к реорганизации цитоскелетных структур и нарушению процесса освобождения тканевого "АХ", инициируемого ОТ. Возможно также косвенное влияние этой системы на секреторные клетки путем модификации структура гормонально-медивторных факторов в межклеточной среде.

11. Выдвинуты и экспериментально обоснованы теоретические положения о ритмичности функционирования секреторных клеток молочпой железа и о регуляторной роли нейтрофилои, проявляющейся в тормозном влилпш системы МПО на секротообразовагше. Положение о рогуля -торной функции нейтрофвлов с учетом механизма действия их химических факторов дает научную основу для решения ряда медицинских проблем и практических задач повышения молочной продуктивности животных путем использования антиоксидантов, а также веществ, угнетающих миграцию пойтрофилов и ткани.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галанцов В.П., Попов С.М. Особенности состава молоки ондатры и морской свалки. - Вести. ЛГУ. 1969■ V 15, вып. 3. С.99-100.

2. Попов С.М., Коваленко С.Г. Исследование ацотилхолина и ацетил-холицонодобыых веществ о ткани молочпой железы. - Вести. ЛГУ. 1970. Я 21, С.104-111.

3. Грачев И.И., Коваленко С.Г.. Попов.С.й., Скопичев В.Г., Толкунов Ю.А. Исследование мембранного потенциала секреторных кле- ток и роли яцетилхолипя п функции молочной железы. - В кн.: XI съезд Всесоюзн.физиол.об-ва им.И.П.Павлова. Тез.неучн.сооСщ. т.2. Л..

Наука, 1970, С.450.

4- Галакцев В.П., Попов С.М., Скопичев В.Г. Об иннервации молочной жолозы белой мыши. -• Нервная система. Л., 1973- Вып.13. С.81-87.

5. Попов С.М., Коваленко С.Г., Слепеиков C.B. О влиянии окситоцино и эфиров холила на формирование секрета в молочной железе коз. - В кн.: Материалы 1Т Всесоюая. симпоз. по фпзисл. и биохим. лактации. Баку, Олм, 1974. С.191-192.

6. Грачев И.И., Попов С.М., Толкунов Ю.А. О влиянии окситоцинл по мембранный потенциал секреторных клеток молочпой железы. - Физиол. ж. СССР, 1975. Т.61, N 4, С.642-647.

7. Грачев И.И., Коваленко С.Г., Попов С.М., Толкунов Ю.А. О роли иоиоп Св в деятельности секреторных клеток молочной железы. -Физиол. ж. СССР. 1976, Т.62, N 11, С.1703-1707.

С. Грачев И.И., Попов С.М., Скопичев В.Г. Патофизиология секреции молока. Л., Паука, 1976. - 242 С. (монография)

9. Попов С.М., Слопепков C.B. Изучение влияния катехоламивов и окситоцино на активность холинзетеразы молочной железы. - Веств. ЛГУ. 1976. N 21, С.99-103.

10. Грачев И.И., Попов С.М., Слепевков C.B. Роль лейкоцитов в регуляции секреторного процесса в молочной железе. - Вести. ЛГУ. 1978. N 3, С.78-85.

11. Грачев И.И>< Попов С.II., Слепенков C.B. 0 природе веществ, тормозящих секретообразование в молочной железе. Влияние пероксв-дазы вейтрофилов, - В кн. i Материалы V Всосоюзп. симпоз. по физи-ол. и биохим. лактации. M., 1978."С.39-40.

12. Попов С.М., Коваленко С.Г. 0 клеточных механизмах регуляции секреторного процесса в молочной Железе. - Там же, С.102-103.

13. Попов С.И., Слепепков C.B.,'Кокряков В.Н. Сравнительное исследование перокевдазы вейтрофилов и молока коровы (к вопросу о происхождении лактопероксидазы). В кн. i Современные достижения физиологии и биохимии лактации. Л., Наука, 1901, С.205-211.

14. Коваленко С.Г., Попов С.М. 0 взаимосвязи клеточных процессов синтеза и выделения секреторного белка в молочной железе. - Там же, С.176-182.

15. Коваленко С,Г., Попов С.М. Способ определения ацетилхолипопо-добпых веществ в биологических тканях. - Авт.свид. N 850783. Бюллетень, 1981, N 32.

16. Попов С.М., Коваленко С.Г. 0 механизмах влияние окситоцила, пцвтилхолинл и катехоламипов па секроторныо клетки молочной жалами. - П кн.: Материалы V1 Всосоюзп.симпоз. по физиол. и биохим.

- 31

лактации. Ы., 1982, С.137-138.

17. Галапцсв В.П., Коваленкр с.Г., Попов C.U. Исследование'холиа-ергических механизмов приспособительных реакций сердца нырявдих млекопитающих. - Журн. эволюц. биохим. и физиол., 1933, Т.19, N 3, С.251-255.

10. Попов С.М., Гринюк Н.А. Клеточные механизмы действия окситоци-на в молонной железе. - В кн.! Вопросы нейровндокринологии (Нервная система. Вып. 24). Л., Изд-во ЛГУ, 1983. С.73-Я0. 19- Грачев И.И., Попов С.М. Клеточные механизмы регуляции секреции молока. В кн.: Биологи Вузов РСФСР - Продовольственной программе СССР: Сб.научн.тр.Калм.ун-та*. Элиста, 1985. С.13-27.

20. Попов С.М. Цитофизиологические аспекты регуляции лактопоээа. В кн.: Материалы V11 Всесоюзн.симпоз. по физиол. и био?сим. лактации. М., 1986, С.41-42.

21. Попов С.К., Толкунов D.A., Балякина Г.В. и др. Современное состояние проблемы клеточных механизмов регуляции секреции молока. В кн.: XV съезд Всесоюзн. физиол.об-ва им.И.П.Павлова. Кишияев-1907, Т.2, Л., Наука. 1987, С.580.

22. Попов С.М. Клеточпые механизмы регуляции секреторного процесса в молочной железе. Л., Изд-во ЛГУ, 1909. - 200 С. (монография).

23. Попов С.М., Павленко И.II.. Валакипа Г.Б. Реакция структур цитоскелета лейкоцитов при их взаимодействии с однослойным эпителием зкзокринных желез. - В кн.: 1 Всесоюзн. съезд иммунол. Сочи, Тез. докл. Т. 1., 1989. С.58.

24. Попов С.М., Павленко И.Н. Особенности перестроек системы структур цитоскелета и распределения клатриновых везикул в секре-торпых клетках молочной железы в процессе лактогепвза, - В кн.: Материалы У111 Всесоюзн.симпоз.-по физиол. и биохим. лактации.'М., 1990, С.55-56.

25. Валакина Г.В., Попов С.М., Скалецкий Б.К. Анализ реакций тучных клеток в условиях действия окситоцина на молочную железу. -Там же, ТС.28-29. ,

26. Павленко И.Н., Попов С.М. Цэптриолярный аппарат в клетках сокреторных тканей, его подвижность и функциональная активность в различные стадии секреторного процесса. - В кн.: Доминантные механизмы поведенческих адаптации. Л. Тез.докл.ковф.ФНИИ ЛГУ, Вып.2, 1990, С.31.

27. Попов С.М., Павленгсо И.Н. Реорганизация цитоскелета как показатель межклеточного взаимодействия секреторных- клеток молочной железы с внедряющимися лейкоцитами. - В кя.: 1V Всесоюзн. симпоз.

- 32 -

о международным участием по иммунол. репродукции. Киев. 1990, С.243.

28. Попов С.Н. Внутриклеточная холинергхческая система и функциональная автоматия секреторных клеток молочной железы. В кн.: Физиология ■ биохимия медиаторных процессов. Материалы V Всесоюзн. конф..посвящ.90-летию со дня рожд.Х.С.Коштоянца. И., 1990, С.98. 29- Попов С.Ы., Павленко И.Н. Сравнительное ультраструктурное исследование цитоскелета секреторных клеток слизистой оболочки желудка лягушки и молочной железы мыши. В кн.: X Всесоюзн.совещ. во эволюц.физиол..посвященное памяти Л.А.Орбели. Л. 1990, С.362-

30. Павленко И.Н., Попов С.II. Организация структур цитоскелета секреторных клеток молочной железы. - Цитология, 1991. Т.33. N 1, С.3-7.

31. Павленко И.Н.. Попов С.Н., Уголев A.M. Влияние желудочных ввдогенных факторов сытых и голодных крыс на ультраструктуру оксивтных клеток. - ДАН СССР, 1991, Т.319, N 5, С.1260-1262.

32. Зуева С.А., Павленко И.Н., Попов С.Н., Титова В.А. Изменение ультраструктуры аксовшшгковых синапсов в связи с функциональными перестройками на органном уровне. - Морфология, 1992, Т.104. N 9-10, С. 50-58.

33. Popov S.U., Pavlenko .Т.К., Balakina С.В., Kamardina Т. А. Possible local effects of calcium in the contact area of the mammary secretory eelle with loucocytes. - In: Abstr. XXXII Congress of the IOTS. Aug.1-at - 6-th. 1993, Glasgow. P.116.

34. Shereshkov V.I., Balakina C.B., Guljaeva Б.Р., Popov S.VI. Structure, motor activity and the role of the teat sphincter in milk ejection. - Troc. Soc. Nutr.'Phyaiol., 1994, Vol.3, P.262.