Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование железоникелевых гидрогеназ

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моделирование железоникелевых гидрогеназ"

На правах рукописи

Абдуллатыпов Азат Вадимович

МОДЕЛИРОВАНИЕ ЖЕЛЕЗОНИКЕЛЕВЫХ ГИДРОГЕНАЗ

03.01.04 - биохимия

Зп

Пл.

чгэъ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005562825

Пущино - 2015

005562825

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Научные руководители:

доктор биологических наук Цыганков Анатолий Анатольевич

кандидат биологических наук Бутанаев Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

Ризниченко Галина Юрьевна - доктор физико-математических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биофизики, заведующая сектором информатики и биофизики сложных систем

Кондратьев Максим Сергеевич - кандидат физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, заведующий лабораторией структуры и динамики биомолекулярных систем

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт математических проблем биологии Российской академии наук

Защита состоится «24» ноября 2015 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе ИФПБ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://www.ibbp.psn.ru/).

Автореферат разослан « » сентября 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Назарова Галина Николаевна

Актуальность проблемы

Гвдрогеназы - это ферменты, способные к активации молекулярного водорода. В зависимости от содержания металлов в активном центре гидрогеназ эти ферменты подразделяются на Hmd-гидрогеназы, у которых активный центр представлен в виде гуанилилпиридинольного кофактора, находящегося вне белковой глобулы [Thauer et al., 1996], Fe-Fe гидрогеназы, у которых активный центр находится внутри белка и содержит 2 атома железа [Peters et al., 1998], и Ni-Fe гидрогеназы, содержащие внутри белковой молекулы активный центр с железом и никелем [Хуснутдинова, 2012; Цыганков, Хуснутдинова, 2015].

HydSL-гидрогеназа из Thiocapsa roseopersicina, выделенная более 40 лет назад, была одной из первых применена в водородном топливном элементе [Ярополов и др., 1984]. Она является относительно устойчивой к инактивирующему действию кислорода [Зорин, Гоготов, 1982], а также к действию протеолитических ферментов [Kovacs et al., 1988]. Эти характеристики выдвигают HydSL гидрогеназу в первые ряды кандидатов на практическое применение в топливных элементах и системах получения водорода [Karyakin et al., 2007; Shastik et al., 2011]. Вместе с тем, несмотря на многолетние усилия, до сих пор не удалось получить трёхмерную структуру этой гидрогеназы с атомным разрешением. Недостаток этих данных сильно сдерживает дальнейшее развитие исследований механизма действия HydSL гидрогеназы, её возможных модификаций с целью повышения активности и дальнейшего улучшения стабильности.

HydSL-гидрогеназа из глубоководной бактерии Alteromonas macleodii Deep Ecotype была выделена сравнительно недавно [Maroti et al., 2009; Vargas et al., 2011]. Помимо сходных биохимических свойств, важных в прикладном отношении — термостабильности и устойчивости к кислороду [Vargas et al., 2011], они обладают также сходными механизмами сборки. Так, гидрогеназа из Alt. macleodii была успешно экспрессирована в Т. roseopersicina [Maroti et al., 2009]. Трёхмерная структура этого фермента также не известна.

В связи с вышеизложенным целью данной работы являлось построение моделей гидрогеназ HydSL Т. roseopersicina BBS и HydSL Alt. macleodii Deep Ecotype с их последующей верификацией и апробацией.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Построить модели гидрогеназ HydSL Т. roseopersicina BBS и HydSL Alt. macleodii Deep Ecotype и оценить их качество;

2) Проверить рабочую гипотезу о стабилизирующем влиянии ионных пар на гидрогеназы, сравнив полученные модели с известными структурами термолабильной и термостабильной гидрогеназ по количеству ионных пар между субъединицами.

3) Провести картирование внутримолекулярных туннелей для выявления возможных отличий в их структуре у исследованных гидрогеназ и гидрогеназ, чувствительных к кислороду.

4) Выявить возможный механизм связывания акцептора электронов -метилвиологена - гидрогеназой HydSL Т. roseopersicina; определить характер взаимодействия этой гидрогеназы с положительно заряженными полипептидами.

5) Предложить схему модификации гидрогеназы Т. roseopersicina для придания ей дополнительной устойчивости к кислороду.

Научная новизна

Впервые построены полноразмерные модели HydSL гидрогеназ Т. roseopersicina BBS и Alt. macleodii Deep Ecotype. С использованием этих моделей был проведён анализ внугрисубьединичных и межсубъединичных взаимодействий, а также исследована структура поверхности этих ферментов и туннелей внутри их молекул. Высказано предположение, что возможной причиной устойчивости этих ферментов к действию кислорода может быть особая структура внутримолекулярных туннелей. Показано, что детерминанты устойчивости к кислороду, описанные в литературе, отсутствуют у исследованных гидрогеназ.

Впервые картированы два возможных сайта связывания акцептора электронов (метилвиологена) в гидрогеназе HydSL Т. roseopersicina BBS.

Практическая значимость

Полученные полноразмерные модели двух HydSL-гидрогеназ, обладающих высокой термостабильностью и устойчивостью к воздействию кислорода, можно использовать для планирования экспериментов по направленной модификации гидрогеназ.

Результаты молекулярного докинга, показавшие наличие двух возможных сайтов связывания акцептора электронов (метилвиологена) и положительно заряженных полипептидов в гидрогеназе HydSL Т. roseopersicina BBS, а также результаты картирования распределения электростатического потенциала на поверхности гидрогеназ дают информацию о возможности подбора агентов для иммобилизации гидрогеназ на электрод в зависимости от задач функционирования ферментного электрода.

Предложена схема возможной модификации гидрогеназы HydSL Г. roseopersicina для повышения устойчивости к кислороду.

Апробация работы

Результаты работы были апробированы на следующих конференциях: XX международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» (2013, Пущино, Россия), Moscow conference on Computational Molecular Biology'2013 (2013, Moscow, Russia), Photosynthesis research for sustainability: in Honor of Vladimir A. Shuvalov. International Meeting (2014, Pushchino, Russia).

Работа была поддержана грантами РФФИ (06-04-49658, 08-08-12196, 11-04-01383,

4

14-04-01676), Программой РАН «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов» в рамках подпрограммы «Нанобиотехнологии».

Публикации по теме работы

По материалам диссертации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликовано 3 статьи, из них 2 - в журналах, включённых в базу цитирования Web of Science.

Структура и объём диссертации

Диссертация содержит 7 глав и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 98 страницах, содержит 24 рисунка и 6 таблиц. Список литературы содержит 269 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Моделирование структуры гпдрогеназ по гомологии с известными структурами

Для моделирования структуры исследованных гпдрогеназ использовали последовательности, приведенные в базе данных Uniprot: о51820 - HydS Т. roseopersicina (малая субъединица), о51823 - HydL Т. roseopersicina (большая субъединица), f2g4p0 - HydS Alt. macleodii, f2g4pl - HydL Alt. macleodii. Поиск шаблона для моделирования проводили в BLAST по базе Protein Data Bank.

Наилучшим шаблоном для обеих исследованных гидрогеназ оказалась трёхмерная структура гидрогеназы HydSL Allochromatium vinosum (3MYR в базе Protein Data Bank). Для моделирования каждой субъединицы были использованы 4 соответствующих субъединицы из файла 3MYR.pdb. Моделирование проводилось в программе MODELLER9.10 [Sali, Blundell, 1993]

Моделирование фрагментов, не имеющих гомологов с известной структурой, проводилось ab initio на сервере QUARK для 48-аминокислотного С-концевого фрагмента малой субъединицы гидрогеназы Т. roseopersicina и на серверах QUARK [Xu, Zhang, 2012], i-TASSER [Zhang, 2008], RaptorX [Källberg et al., 2012], Phyre2 [Söding, 2005], LOMETS [Zhang, Wu, 2007], MUSTER [Wu, Zhang, 2008] для 49-аминокислотного фрагмента большой субъединицы гидрогеназы Alt. macleodii. Полученные модели с серверов использовали в качестве дополнительных шаблонов для моделирования в MODELLER. 18-аминокислотный С-концевой фрагмент гидрогеназы Alt. macleodii моделировали в MODELLER9.10. Малые и большие субъединицы объединяли в программе YASARA Model посредством наложения на шаблонную структуру. Применялись два разных метода совмещения субъединиц: суперпозиция [Theobald et al., 2006] и структурное выравнивание [Konagurthu et al., 2006].

Для каждой субъединицы было построено 1000 моделей, для которых проводилось определение Z-оценки дискретно оптимизированной энергии белка (Z-DOPE). Была введена формула для уровня достоверности модели (Р) как доли возможных конформаций белка, обладающих большим, чем данная модель, значением Z-DOPE:

Р = (1 - normsdist (Z) )*100%, где Z - Z-оценка DOPE,

normsdist - функция нормального распределения с ц = 0 и а2 = 1.

Например, при Z = -1 Р = 84%

Для сравнения полученных моделей было получено значение Z-оценки дискретно оптимизированной энергии уже существующих моделей, опубликованных в базе данных ModBase и в приложении к статье [Szilagyi et al., 2002], а также шаблонных структур.

Проверка качества моделей по геометрическим критериям

Проверка качества моделей по геометрическим критериям (количество напряжённых связей, углов и двугранных углов, количество перекрывающихся либо слишком близко находящихся атомов) проводилась на сервере MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) [Chen et al., 2010].

Минимизация энергии двусубъеднннчных моделей

Минимизация энергии двусубъединичных моделей проводилась на сервере YASARA energy minimization server (http://www.yasara.org/minimizationserver.htm) [Krieger etal., 2009].

Реконструкция лигандов в полученных моделях

Реконструкция связей между лигандами и белковыми молекулами была проведена на базе выравнивания последовательностей субъединиц в программе ClustalW2 и построения связей между остатками, гомологичными остаткам шаблона, заякоривающим лиганды, и соответствующими атомами лигандов модели в программе YASARA Model.

Подсчёт ионных пар

Подсчёт электростатических взаимодействий (ионных пар) между субъединицами гидрогеназ проводился на сервере Protein Interaction Calculator (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/). Для подсчёта ионных пар использовались критические расстояния в диапазоне от 3 до 8 А с шагом в 1 А.

Картирование внутримолекулярных туннелей

Для картирования внутримолекулярных туннелей был использован сервер MOLE2.0. При картировании туннелей были выбраны следующие параметры: минимальный радиус туннеля - 1.2 А. Зона поиска туннеля (пространство возможных стартовых точек) определялась по координатам трёх аминокислотных остатков, один из которых является лигандом для активного центра, в радиусе 5 А от центра масс.

Моделирование взаимодействия гидрогеназы с метилвиологеном и полипептидами

Для определения сайтов взаимодействия полипептидов и метилвиологена с гидрогеназой был проведен молекулярный докинг. В качестве рецептора была взята полноразмерная модель гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina, построенная и описанная нами.

Докинг молекул проводился в программе Autodock Vina [Trott, Olson, 2010]. Все молекулы при докинге были жёсткими. Лиганды (метилвиологен и полипептиды К2о, K(KLK)6K) были построены в программах YASARA Model и Autodock Tools.

Расчетные константы связывания молекул с гидрогеназой вычислялись по следующей формуле:

v MjíRT

л t■ = е ,

где AG - энергия Гиббса образования комплекса фермента и лиганда в Дж/моль (выходные данные докинга, переведённые из ккал/моль в Дж/моль),

R = 8.314 Дж моль '-К"1 - универсальная газовая постоянная,

Т — температура (303 К).

Выделение гидрогеназы Т. roseopersicina BBS

Данная часть работы выполнялась совместно с Н. А. Зориным (ИФПБ РАН). Клетки пурпурной серной бактерии Т. roseopersicina BBS выращивали в анаэробных фотогетеротрофных условиях на модифицированной среде Пфеннига [Богоров, 1974; Хуснутдинова, 2012] в течение 3 недель. Выделение гидрогеназы из клеточных экстрактов выполняли с использованием фракционирования сульфатом аммония и жидкостной хроматографии на колонках с фенилсефарозой CL-4B и ДЭАЭ-целлюлозой DE52 [Шерман и др., 1987]

Определение гидрогеназной активности

Активность гидрогеназы определяли по реакции восстановления окисленного метилвиологена спектрофотометрическим методом [Задворный и др., 2000]. Ферментативную активность выражали в мкмоль Н2/мин на 1 мг белка. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд [Bradford, 1976].

Определение константы ингибирования гидрогеназы положительно заряженными полипептидами

Графики зависимости обратной скорости реакции от концентрации полипептида аппроксимировались прямыми, и в точке пересечения этих прямых находилось значение константы ингибирования, взятое с противоположным знаком.

Построение схемы направленной модификации гидрогеназы Т. roseopersicina

Схема модификации гидрогеназы была спланирована на основе литературных данных о точечных детерминантах устойчивости к кислороду и поиска остатков в соответствующей позиции у гидрогеназы HydSL. Для этого проводилось множественное выравнивание аминокислотных последовательностей субъединиц гидрогеназы HydSL с устойчивыми к кислороду гидрогеназами с известной

7

структурой в программе ClustalW2 и структурное выравнивание в программе YASARA Structure.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Модели гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina

Оптимальной шаблонной структурой для гомологичного моделирования является трёхмерная структура гидрогеназы HydSL A. vinosum (PDB-код 3MYR). Достаточно протяжённый С-концевой фрагмент малой субъединицы (48 аминокислот) не был включён в модели (рисунок 1а), а последовательность большой субъединицы включалась в модель полностью.

Поскольку все лиганды рассматриваются программой MODELLER как абсолютно твёрдые тела, активный центр полученных моделей (рисунок 16) идентичен активному центру шаблона и находится в состоянии Ni-A state (окисленное неготовое состояние). Он состоит из атомов никеля и железа, связанных остатками цистеина большой субъединицы (Cys61, Cys64, Cys555, Cys558, согласно нумерации последовательности в базе данных Uniprot, ID: 051823) и соединённых между собой атомом кислорода; атом железа связывает два СО- и один CN-лиганд.

Атом магния, связанный боковой цепью остатка глутаминовой кислоты Glu42 и СО-группой аланина А1а506 (рисунок 1в), по-видимому, служит для координации отрицательно заряженных остатков, участвующих в отводе протонов, хотя для гидрогеназы Т. roseopersicina показан и альтернативный путь переноса протонов [Szori-Doroghazi et al., 2012].

а б в

Рисунок 1. Модель гидрогеназы НуёБЬ Т. гозеорегвшпа. а - общий вид модели. Малая субъединица выделена желтым, большая - серым; б - реконструированный активный центр. Атом никеля выделен оранжевым, железа -фиолетовым, углерода - голубым, кислорода -красным, азота - синим. Атомы координирующих остатков показаны в виде палочек: зелёный - сера, голубой - углерод, красный - кислород;

в - атом магния (жёлтый), координированный боковой цепью остатка глутамата и СО-группой остатка аланина.

Электрон-переносящие кофакторы представлены тремя железосерными кластерами малой субъединицы (рисунок 2), координированными остатками цистеина (проксимальный 4Ре-48-кластер и медиальный ЗРе-48-кластер), либо цистеина и шстидина (дистальный 4Ре-45-кластер).

а б в

Рисунок 2. Железосерные кластеры HydSL-гидрогеназы Т. roseopersicina. а - проксимальный железосерный кластер; б -медиальный железосерный кластер; в - дистальный железосерный кластер.

Атомы железа показаны фиолетовым, серы - зелёным, углерода - голубым, кислорода -красным, азота - синим.

Моделирование полиоразмерной малой субъединицы гидрогеназы HydSL

Т. roseopersicina

Результаты моделирования С-концевого фрагмента на сервере QUARK показали, что вторичная и третичная структуры полученных моделей сходны: этот фрагмент состоит из трёх альфа-спиралей, разделённых участками неупорядоченной структуры. Последующее моделирование полноразмерной малой субъединицы в программе MODELLER показало значения Z-оценки DOPE для лучших моделей в районе -1, а это означает, что данные модели с высокой вероятностью близки к нативной структуре. Полноразмерные модели HydSL были получены методом структурного выравнивания с шаблоном (рисунок 3). Значение RMSD для атомов малой субъединицы составило 0.92 А.

Рисунок 3. Полноразмерная модель гидрогеназы HydSL Т. ю5еореЫста. а - общий вид полноразмерного фермента; С-концевой фрагмент выделен фиолетовым; б - суперпозиция четырёх наилучших моделей полноразмерного фермента. Цепи отдельных моделей выделены жёлтым, зелёным, голубым и синим.

С-концевой фрагмент малой субъединицы находится вдали от малой субъединицы и состоит из трёх альфа-спиралей (рисунок За). Возможно, он участвует

в заякоривании на мембране (через цитохром-подобный белок Ispl) [Palagyi-Meszarosz et al., 2009] или олигомеризации гидрогеназы.

Суперпозиция четырёх лучших моделей малой субъединицы (рисунок 36) позволила предположить, что С-концевой фрагмент, обладающий довольно строгой трёхмерной структурой, расположен сравнительно свободно относительно основной белковой глобулы. Возможно, что подобное «качание» этого фрагмента прекращается при взаимодействии с редокс-партнёром или прикреплении к мембране. Причиной такого предположения является относительная гидрофобность этой последовательности (индекс GRAVY (grand average of hydropathicity) = +0.435 [Kyte, Doolittle, 1982]), поэтому этот фрагмент будет стремиться взаимодействовать с другими гидрофобными молекулами в водном окружении.

По результатам анализа в программе MODELLER, значения Z-оценок DOPE больших субъединиц и малых субъединиц без С-концевого фрагмента были сравнимы с таковыми шаблона и значительно превосходили по модулю Z-оценки DOPE ранее опубликованных моделей. Z-оценки полноразмерных малых субъединиц были в районе -1, что соответствовало уровням достоверности в районе 83,9 - 84,9% (таблица 1).

Таблица 1. Z-оценки дискретно-оптимизированной энергии (DOPE) и уровни достоверности моделей (в скобках)._

Ранг модели2 1 2 3 4

HydL (полученные в данной работе, большие) -1.925 (97,29%) -1.893 (97,08%) -1.892 (97,07%) -1.885 (97,03%)

НуёЬ (опубликованные, большие) -1.019 (84,59%) -0.931 (82,41%) - -

ЗМУИ (шаблон, большие) -2.008 (97,77%) -2.001 (97,73%) -1.970 (97,56%) -1.954 (97,46%)

НуёБ (полноразмерные, полученные в данной работе, малые) -1.033 (84,92%) -1.022 (84,66%) -1.022 (84,66%) -0.991 (83,91%)

HydSdelta48 (без С-концевого фрагмента, полученные в данной работе, малые) -1.406 (92,01%) -1.403 (91,94%) -1.400 (91,92%) -1.398 (91,89%)

Нуё5йека55 (опубликованные, малые) -0.831 (79,7%) -0.771 (77,96%) - -

ЗМУЯ (шаблон, малые) -1.430 (92,36%) -1.396 (91,86%) -1.373 (91,51%) -1.304(90,39%)

"Ранг модели показывает положение модели в списке, отсортированном по возрастанию Z-оценки DOPE. Модели, построенные в данной работе, обладают меньшими значениями Z-оценки DOPE и, следовательно, большими значениями уровня достоверности, чем опубликованные ранее.

Показано, что по уровням достоверности модели без С-концевого фрагмента, полученные в данной работе, значительно превосходят опубликованные и сравнимы с шаблоном.

Согласно результатам нашего анализа на сервере MolProbity, качество моделей было весьма высоким, что подтверждалось значениями индекса MolProbity и индекса перекрывания, соответствующими процентилям 72-94. Однако значения индекса перекрывания для димерных молекул были высокими, соответствуя 18-й процентили. После минимизации энергии на сервере YASARA Energy Minimization Server эта проблема была решена, и значения индекса перекрывания стали соответствовать 98й-100й процентилям.

Модели гидрогеназы HydSL Alt. macleodii

Степень идентичности последовательностей с шаблоном составляла 69% для больших субъединиц и 67% для малых; в выравниваниях присутствовали разрывы, что дало в результате более низкие значения уровней доверия, чем в случае гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina.

В середине большой субъединицы данной гидрогеназы присутствует 48-аминокислотный фрагмент неизвестной структуры, не имеющий гомологов. Вероятнее всего, данный фрагмент имеет неупорядоченную структуру (coil); во взаимодействии с малой субъединицей он не участвует.

18-аминокислотный фрагмент на С-конце малой субъединицы, который моделировали в программе MODELLER, по-видимому, также имеет неупорядоченную структуру (рисунок 4а).

а б в

Рисунок 4. Полноразмерная модель гидрогеназы Alt. macleodii.

а - общий вид: малая субъединица выделена жёлтым, большая - серым. Фрагмент большой субъединицы, не имеющий гомологов, выделен красным. Фрагмент малой субъединицы, не имеющий гомологов, выделен фиолетовым;

б - реконструированный активный центр. Атом никеля выделен оранжевым, железо -фиолетовым, углерод — голубым, кислород - красным, азот - синим. Атомы координирующих остатков показаны в виде палочек: зелёный - сера, голубой - углерод, красный - кислород;

в — атом магния (жёлтый), координированный боковой цепью остатка глутамата и СО-группой остатка цистеина.

Так же как и для гидрогеназы Т. roseopersicina, активный центр и электрон-переносящие кофакторы гидрогеназы All. macleodii (рисунки 4, 5) идентичны лигандам гидрогеназы A. vinosum. Реконструкция связей проводилась аналогично гидрогеназе Т. roseopersicina.

Интересно, что в отличие от гидрогеназ HydSL Т. roseopersicina и A. vinosum, у Alt. macleodii в заякоривании иона магния принимает участие цистеин, а не аланин (рисунок 46). Тем не менее, это не должно оказывать влияние на координацию протон-выводящего канала, поскольку в этом взаимодействии принимает участие не боковая цепь, а СО-группа.

Рисунок 5. Железосерные кластеры гидрогеназы HydSL Alt. macleodii. а - проксимальный железосерный кластер; б -медиальный железосерный кластер; в - дистальный железосерный кластер;

Атомы железа показаны фиолетовым, сера - зелёным, углерод - голубым, красным, азот - синим.

кислород -

Железосерные кластеры в данной гидрогеназе организованы аналогично HydSL Т. roseopersicina (рисунок 5), и реконструкция их связей с белковой глобулой была также аналогична.

Полученные результаты анализа моделей по z-оценкам DOPE (таблица 2) и на MolProbity свидетельствуют, что их качество выше, чем у опубликованных ранее, но ниже, чем у моделей HydSL Т. roseopersicina.

Таблица 2. Z-оценки и уровни достоверности (в скобках) моделей гидрогеназы HydSL Alt.

Ранг модели" 1 2 3 4

НуёЕ (построенные в данной работе, большие) -1.649 (95.04%) -1.640 (94.93%) -1.632 (94,86%) -1.602 (94.54%)

Ну(1Е (опубликованные, большие) -1.002 (84,18%) - - -

ЗМУЯ (шаблон, большие) -2.008 (97.77%) -2.001 (97,73%) -1.970 (97,56%) -1.954 (97,46%)

HydS (полноразмерные, построенные в данной работе, малые) -0.930 (82. 38%) -0.926 (82,27%) -0.922 (82,17%) -0.903 (81,67%)

Нус^еИа18 (без С-концевого мотива, построенные в данной работе, малые) -1.229 (89,04%) -1.220 (88.87%) -1.219 (88.86%) -1.218 (88.83%)

Нус^еИа18 (без С-концевого мотива, опубликованные, малые) -0.791 (78,55%) - - -

ЗМУЯ (шаблон, малые) -1.430 (92,36%) -1.396 (91,86%) -1.373 (91,51%) -1.304 (90,39%)

Ранг модели показывает положение модели в списке, отсортированном по возрастанию Z-оценки DOPE. Модели, построенные в данной работе, обладают меньшими значениями Z-оценки DOPE и, следовательно, большими значениями уровня достоверности, чем опубликованные ранее.

Результаты анализа моделей на сервере MolProbity показали, что индекс MolProbity и индекс перекрывания для отдельных субъединиц соответствовали процентилям 72-94. Однако значения индекса перекрывания для димерных молекул были высокими и соответствовали 14-й процентили для полноразмерного фермента и 24-й процентили для фермента без 18 аминокислотных остатков с С-конца. После минимизации энергии на сервере YASARA Energy Minimization Server значения индекса перекрывания стали соответствовать 98Й-100Й процентилям.

Анализ взаимодействий внутри субъеднниц и между субъединицами Поскольку малые субъединицы обеих гидрогеназ без С-концевого фрагмента обладали значительно более высоким уровнем доверия, а также принимая во внимание, что С-концевые фрагменты практически не взаимодействуют с большой субъединицей, все взаимодействия считались для молекул без С-концевой последовательности.

Таблица 3. Зависимость количества ионных пар в гидрогеназах от выбранного порогового расстояния - максимального расстояния между центрами заряженных групп.

Фермент ЗА 4 A 5 A 6A 7 A 8 A

Т. roseopersicina, суперпозиция 2+0 3,75+1,258 6,75+1,258 9,5±0,577 13,25+1,258 20,25+1,258

Т. roseopersicina выравнивание 2+0,816 4,5+1,915 6,25+2,062 10,25+1,5 14,5 +2,082 20,5+1,291

Alt. macleodii, суперпозиция 1 ±0 1,5 +0,577 4,25±0,5 6,25+0,5 8,75+0,5 13,5+2,38

Alt. macleodii, выравнивание 1,25 + 0,5 2,75 +0,5 5+0,816 8+0,816 9,75+1,5 15,25±1,258

HydSL A. vinosum 4±0 5,5 +0,577 10±0,816 13,25±0,957 17±0,155 24,25+0,5

HydAB D. vulgaris Miyazaki F 2+0 5+0,816 7,25+0,5 8,25+0,5 11+1,414 18,5+0,577

Данные приведены как среднее по выборке из 4 разных моделей/структур ± стандартное отклонение.

В таблице 3 приводится количество межсубъединичных ионных пар в гидрогеназах. Отдельно считались ионные пары в моделях, совмещённых методом структурного выравнивания и суперпозиции. Представленные данные показывают, что количество меж- и внутрисубъединичных водородных связей не коррелирует с термостабильностью ферментов. В то же время количество межсубъединичных ионных пар в HydSL-гидрогеназах из Т. roseopersicina и A. vinosum превышает их количество в HydAB-гидрогеназе D. vulgaris Miyazaki F. Однако количество ионных пар в HydSL из Alt. macleodii меньше. Принимая во внимание то, что у двух HydSL-гидрогеназ разное количество ионных пар между субъединицами, а также то, что у

термостабильной гидрогеназы Alt. macleodii примерно то же количество ионных пар, что и у термолабильной гидрогеназы D. vulgaris, наши результаты не подтверждают гипотезу о том, что межсубъединичные ионные пары являются возможными детерминантами термостабильности.

Картирование внутримолекулярных туннелей

В литературе описаны туннели, по которым происходит поступление различных газов (водорода, кислорода, монооксида углерода) в молекулы гидрогеназы [Leroux et al., 2008; Abou Hamdan et al., 2012]. Возможно, что активность гидрогеназ сильно зависит от ширины внутримолекулярных туннелей. Например, гидрогеназы-сенсоры водорода обладают узкими туннелями и низкой активностью. Туннели также играют роль в устойчивости гидрогеназ к кислороду: сенсорные гидрогеназы практически нечувствительны к кислороду, а расширение туннелей придавало им чувствительность к кислороду [Duche et al., 2005; Buhrke et al., 2005]. Поэтому нам представлялось важным исследовать структуру туннелей в гидрогеназах T. roseopersicina и Alt. macleodii.

После получения моделей больших и малых субъединиц они совмещались с шаблоном двумя разными методами - методом суперпозиции и методом структурного выравнивания. Различие этих алгоритмов приводит к тому, что взаимное расположение субъединиц в полученных двусубъединичных моделях немного отличается, поэтому туннели мы картировали как в моделях, полученных методом структурного выравнивания, так и в моделях, полученных методом суперпозиции.

Картирование туннелей в четырёх гидрогеназах (рисунок 6) показало, что модели гидрогеназ Т. roseopersicina и Alt. macleodii, построенные методом структурного выравнивания, обладают двумя туннелями, сливающимися в один, модели фермента Alt. macleodii - одним туннелем, сходным с двумя туннелями в Т. roseopersicina, в то время как гидрогеназы A. vinosum (шаблон для моделей, построенных нами) и Ü. vulgaris Miyazaki F обладают пятью туннелями (два туннеля, обладавших большим сходством и идущих через большую субъединицу, рассматривались нами как один) (рисунок 6). Однако в гидрогеназах T. roseopersicina и Alt. macleodii, полученных методом суперпозиции, картина туннелей была сходной с картиной туннелей в гидрогеназах A. vinosum и D. vulgaris.

где

Рисунок 6. Структура внутримолекулярных туннелей в гидрогеназах. а - гидрогеназа HydAB D. vulgaris Miyazaki F; б - гидрогеназа HydSL A. vinosum;

в - гидрогеназа HydSL T. roseopersicina, совмещение методом структурного выравнивания; г - гидрогеназа HydSL Alt. macleodii, совмещение методом структурного выравнивания; д - гидрогеназа HydSL Т. roseopersicina. совмещение методом суперпозиции; е - гидрогеназа HydSL Alt. macleodii, совмещение методом суперпозиции.

Начальные позиции туннелей в гидрогеназе T. roseoperscicina были фланкированы остатками большой субъединицы: 14 Glu L, 487 Arg L, 554 Pro L, 111 Leu L, а в гидрогеназе Alt. macleodii - гомологичными остатками 19 Glu L, 536 Arg L, 603 Pro L, 163 Leu L. Точки выхода туннелей также были фланкированы сходными остатками: туннель 1, представленный в моделях, полученных обоими методами -120 Val L, 159 Val L, 172 Trp L, 164 Leu L для гидрогеназы T. roseopersicina и 172 Val L, 211 Val L, 224 Trp L, 216 Leu L для гидрогеназы Alt. macleodii', туннель 2, проходящий между большой и малой субъединицами

и чувствительный к сдвигу субъединиц относительно друг друга - 56 Pro S, 57 Ser S, 119 Glu S для гидрогеназы T. roseopersicina и 51 Pro S, 52 Ser S, 114 Gin S для гидрогеназы Alt. macleodii; туннель 3 - Ala 183 L, Phe 267 L, , Leu 133 L для гидрогеназы T. roseopersicina и Val 235 L, Туг 319 L, Leu 185 L для гидрогеназы Alt. macleodii; туннель 4 - Val 258 L, Leu 262 L, Leu 435 L для гидрогеназы Т. roseopersicina и Туг 310 L, Val 314 L, Val 487 L A. macleodii; туннель 5 - Arg 308 L, Val 420 L, Tyr 424 L для гидрогеназы T. roseopersicina и Arg 360 L, Leu 472 L, Phe 473 L для гидрогеназы Alt. macleodii.

Влияние положительно заряженных полипептидов на активность гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina

Акцепторы электронов в реакции окисления молекулярного водорода, катализируемой гидрогеназой, имеют положительный заряд. Роль акцептора электронов в реакции in vitro, могут выполнять различные виологены, имеющие заряд +2 в окисленном состоянии, а также катионы никеля и кадмия, которые гидрогеназа восстанавливает в атмосфере водорода до металлического состояния. Мы сделали предположение, что и другие вещества с положительным зарядом могут иметь высокое сродство к гидрогеназе и быть конкурентными ингибиторами по отношению к акцептору электронов. Для проверки этого предположения в качестве модельных полиионов были использованы полипептиды с различным зарядом. Наиболее сильный ингибирующий эффект проявлял полилизин (К20), имеющий значительный положительный заряд (рисунок 7а). Ингибирующее действие полилизина было обратимым и конкурентным по отношению к

[р-Ьув]. мкМ [р-1.у5-1.еи]. мкМ

а б

Рисунок 7. Зависимость обратной величины скорости окисления Н2 (1/у) в присутствии гидрогеназы Нуё5Ь Т. го$еорегх1ста от концентрации ингибиторов.

а - от концентрации полилизина К20 ([р-Ьуэ], мкМ) при фиксированных концентрациях окисленного метилвиологена 1мМ (1) и 4 мМ (2) при рН 9.0 (й = 2.1 мкМ); б - от концентрации поли-лизин-лейцина К(КХК)6К([р-Ьу8-Ьеи], мкМ) при фиксированных концентрациях окисленного метилвиологена 1мМ (1) и 4 мМ (2) при рН= 9.0 (Ю = 8.0 мкМ). Измерения проводились Зориным Н.А.

акцептору электронов - окисленному метилвиологену в реакции окисления водорода, катализируемой гидрогеназой. Константа ингибирования, отражающая сродство этого пептида к гидрогеназе, составляла К; = 2.1 мкМ. Эта константа на два порядка ниже величины Кт = 182 мкМ для метилвиологена [Zadvorny е1 а1., 2006]. Полипептиды с меньшим положительным зарядом производили меньший ингибиторный эффект. Так, полилизин-лейцин (К(КЬК)6К), имеющий в своем составе 14 остатков лизина и 6 остатков лейцина, которые не имеют заряда, проявлял значительно меньший ингибирующий эффект, конкурентный по отношению к окисленному метилвиологену, с К; = 8.0 мкМ (рисунок 76). Незаряженные и отрицательно заряженные полипептиды, например, полилейцин (Ь20) и полиглугамат (Е20), не проявляли ингибирующего эффекта на гидрогеназу. Таким образом,

экспериментально показано, что полипептиды с положительным зарядом являются эффективными и конкурентными по отношению к метилвиологену ингибиторами гидрогеназы Т. го5еореп1с1па.

Докинг метилвиологена и полипептидов с гидрогеназой Т. гояеорепкта

Результаты докинга метилвиологена показали, что энергия Гиббса связывания метилвиологена составляет от -5,6 до -4,7 ккал/моль. Константа связывания, рассчитанная по этим энергиям, равна 91,3-407,2 мкМ, что достаточно близко к экспериментально определенной константе связывания, равной 182 мкМ. В двух комплексах, полученных в результате докинга, метилвиологен связывался с участками малой субъединицы вблизи дистального железосерного кластера (расстояния 8.5 и 15 А, константы связывания 127 и 292 мкМ, соответственно). Это теоретически подтверждает экспериментально известную возможность переноса электрона с гидрогеназы на метилвиологен (рисунок 86). Для сравнения, расстояния между железосерными кластерами равны 9 А, а расстояние от активного центра до проксимального железосерного кластера равно 13 А.

Рисунок 8. Метилвиологен и его взаимодействие с гидрогеназой.

а - молекула метилвиологена. Цветовые обозначения атомов: серый - водород, голубой -углерод, синий - азот. Цветовые обозначения связей: серый - одинарные связи, красный -«полуторные» связи (резонансные связи порядка 1,5);

б - взаимодействие метилвиологена с гидрогеназой. Цветовые обозначения молекул: красный - малая субъединица гидрогеназы (показаны атомы аминокислот, взаимодействующих с метилвиологеном), жёлтый - большая субъединица гидрогеназы, синий - молекула метилвиологена. Цветовые обозначения атомов (показаны в виде шариков): фиолетовый - железо, зелёный - сера, голубой - углерод, синий - азот, красный -кислород (в активном центре).

Связывание метилвиологена в сайте, ближнем к дистальному железосерному кластеру (расстояние от кластера до молекулы метилвиологена 8,5 А), предположительно обусловлено электростатическими взаимодействиями: молекула метилвиологена взаимодействует с остатками отрицательно заряженных аминокислот: Б247, Е363, Е366 - расстояния до заряженных групп 3,7 А, 4,8 А и 3,8 А, соответственно. Связывание метилвилогена с более удаленным от железосерных кластеров участком гидрогеназы происходит как за счёт электростатического взаимодействия (с остатком 0223, расстояние до заряженной группы 3,8 А), так и за

счёт стэкинг-взаимодействия с остатками тирозина (У225, У277, расстояния до ароматических групп 3,8 и 4,6 А).

а б

Рисунок 9. Результаты докинга полилизина и Ну(15Ь-гидрогеназы Т. юяеорегзкта. а - взаимодействие гидрогеназы с полилизином К2о- Цветовые обозначения молекул: красный - малая субъединица гидрогеназы, жёлтый - большая субъединица гидрогеназы, синий -молекулы метилвиологена, зелёный - молекулы полилизина. Цветовые обозначения атомов: зелёный - сера, фиолетовый - железо;

б - перекрывание атомов полилизина и метилвиологена в двух акцептор-связывающих сайтах. Поверхность гидрогеназы выделена красным, поверхность метилвиологена — синим, поверхность полилизина — зелёным. Рисунок получен путем совмещения комплексов гидрогеназа-метилвиологен и гидрогеназа-полилизин.

Результаты докинга полипептидов показали, что энергия Гиббса связывания К20 составляет от -9,2 до -8,1 ккал/моль, что соответствует константам связывания в диапазоне от 0,131 до 1,44 мкМ; для К(КЬК)6К диапазон констант связывания составил от 0,072 до 1,44 мкМ. При этом положительно заряженные полипептиды связывались с теми же сайтами, что и метилвиологен (рисунок 9).

Согласно экспериментальным данным, константа связывания полилизина (К2о) составляла 2,1 мкМ, что соответствует энергии Гиббса связывания, равной -7,9 ккал/моль, а константа связывания поли-лизин-лейцина (К(КЬК)6К) составляла 8 мкМ, что соответствует энергии Гиббса связывания, равной -7,1 ккал/моль.

Таким образом, результаты докинга показали, что:

1) Вблизи дистального железосерного кластера присутствуют два возможных сайта связывания метилвиологена; наиболее вероятен перенос электрона от гидрогеназы к акцептору, находящемуся в сайте, расположенном ближе к дистальному Ре-Б-кластеру.

2) С этими же сайтами связываются пептиды К20 и К(КЬК)6К, что подтверждает конкурентный механизм ингибирования этими поликатионами реакции восстановления виологена (рисунок 9).

3) Константы связывания для метилвиологена, К20 и К(КЬК)6К близки к экспериментально показанным значениям, однако различий между связыванием двух положительно заряженных пептидов выявить не удалось.

У некоторых гидрогеназ установлена пространственная структура как самого фермента, так и водород-активирующего центра. В меньшей степени описана структура и механизм действия акцептор/донор-связывающего центра. В

18

соответствии с пространственной структурой этот центр находится вблизи дистального железосерного кластера. В гидрогеназе из Desulfovibrio desulfurícans этот кластер окружен несколькими аминокислотными остатками, несущими отрицательный заряд, что увеличивает эффективность взаимодействия с редокс-партнёром гидрогеназы — положительно заряженным цитохромом сЗ [Matias et al., 2001].

По аналогии с этим, для гидрогеназы T. roseopersicina также могут быть важны электростатические взаимодействия с акцептором электронов, что мы показали в своей работе.

Показан также сайт, в котором может иметь место стэкинг-взаимодействие метилвиологена с ароматическими остатками.

Схема направленной модификации гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina с целью придания ей повышенной устойчивости к кислороду

Железоникелевые гидрогеназы могут иметь три возможных детерминанты устойчивости к кислороду: а) атом селена в активном центре, наличие которого приводит к тому, что переход никеля из Ni-A в Ni-B-состояние происходит значительно быстрее, как в Ni-Fe-Se-гидрогеназах; б) наличие крупных аминокислотных остатков в большой субъединице, закрывающих газовые туннели, как в сенсорных гидрогеназах -HupUV Rhodobacter capsulatus и НохВС R. eutropha; в) наличие Fe-S-кластера 4Fe-3S-типа, координированного шестью остатками цистеина, как в гидрогеназах HoxKG R. eutropha, НуаАВ Е. coli, HoxKG H. marinus. В построенных нами моделях гидрогеназы Т. roseopersicina нет ни одной из вышеперечисленных детерминант устойчивости к кислороду. Возможно, что она обладает иными детерминантами устойчивости к кислороду. Можно провести серию одноаминокислотных замен в гидрогеназе HydSL для повышения устойчивости к кислороду. Для выявления необходимых замен было проведено структурное выравнивание субъединиц гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina с гомологами, обладающими описанными в литературе детерминантами устойчивости к кислороду - гидрогеназой HoxKG R. eutropha, HydSL D. baculatum, a также мутантной формой гидрогеназы D. fructosovorans (рисунок 10).

Мы видим, что остаток цистеина Cys555 в большой субъединице гидрогеназы HydSL T. roseopersicina и остаток селеноцистеина Sec492 в большой субъединице гидрогеназы HydSL D. baculatum соответствуют друг другу по положению в пространстве, а значит, замена остатка цистеина на селеноцистеин должна привести к желаемому результату (повышению активности, повышению устойчивости к кислороду). Другим возможным способом придания дополнительной устойчивости к кислороду будет замена в HydSL T. roseopersicina двух аминокислотных остатков (Val63 и Leu 111) на более массивные остатки. Было показано, что замена гомологичных остатков приводит к повышению устойчивости к кислороду и СО. Замена остатков V74-I L122-F в гидрогеназе D. fructosovorans [Leroux et al., 2008] приводила к значительному повышению устойчивости ее к СО, а замена этих

остатков на метионин приводила к росту устойчивости к кислороду [ОетепПп й а1., 2009].

а б в

Рисунок 10. Структурное выравнивание модели гидрогеназы Ну<15Ь Т. гозеорегзтпа с гомологами, устойчивыми к кислороду.

а - структурное выравнивание модели гидрогеназы НуёЭЬ Т. юзеорегзшпа и селен-содержащей гидрогеназы НусйЬ О. ЬасиШит (РОВ-Ю 1СС1). Отмечены гомологичные остатки цистеина (жёлтый) и селеноцистеина (зелёный), заякоривающие атомы никеля в гидрогеназах Т. го8еорегз\сЬга и О. ЬасиШит, соответственно;

б - структурное выравнивание модели гидрогеназы Нус15Ь Т. гоэеорегзхста и мутантной гидрогеназы Нус1АВ £>. /гиаояоуогат (У74-1, Ы22-Р. РОВ-ГО ЗСШ) - отмечены остатки валина и лейцина (жёлтый) и соответствующие им остатки изолейцина и фенилаланина (зелёный);

в - структурное выравнивание модели малой субъединицы гидрогеназы Нус15Ь Т. гозеореыста и гидрогеназы НохКО Л. еШгорИа (РБВ-ГО ЗКО\¥). Отмечены остатки глицина (жёлтый) и соответствующие им остатки цистеина (зелёный). Показаны железосерные кластеры обеих гидрогеназ, наложенные друг на друга. Нумерация остатков соответствует их нумерации в базе данных ишргоГ

Придать устойчивость к кислороду можно также за счёт замены проксимального железосерного кластера с 4Ре-48 на 4Ре-38-кластер, способный восстанавливать кислород до воды [УоШеёа е! а]., 2012]. Для координации такого кластера необходимо два дополнительных остатка цистеина; у гидрогеназы НусКЬ Т. гояеореЫста в соответствующих позициях находятся остатки глицина. Возможно, замена этих остатков на остатки цистеина (С68-С, С170-С) приведет к образованию кластера 4Ре-Зв-типа.

Резюмируя все вышеизложенное, можно предложить серию замен в гидрогеназе Т. гоэеорегзтпа, которые могут привести к повышению устойчивости к кислороду.

В малой субъединице - С68-С, 0170-С.

В большой субъединице - У63-М, Ы11-М, С552~и либо У63-С, Ы11-М, С552-11, где и - остаток селеноцистеина.

ВЫВОДЫ

1) Построены модели гидрогеназ Нус18Ь ТЫосаряа гозеорегькиха и АЬеготопаз

тас1еос1и, превосходящие по своему качеству ранее опубликованные;

полноразмерные модели данных гидрогеназ получены впервые.

2) Сравнительное изучение ряда гидрогеназ выявило, что их термостабильность не коррелирует с расчетным количеством ионных пар между субъединицами.

3) В гидрогеназах Thiocapsa roseopersicina и Alteromonas macleodii показано наличие внутримолекулярных туннелей, которые могут служить путями доступа газов в активный центр.

4) Для гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina показано конкурентное ингибирование положительно заряженными полипептидами и впервые картированы два сайта связывания метилвиологена.

5) Предложена схема возможной модификации гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina для повышения устойчивости к кислороду, основанная на известных по литературным данным детерминантах устойчивости других гидрогеназ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных журналах:

1. Абдуллатыпов А. В.. Цыганков А. А. Моделирование пространственной структуры гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina BBS // Компьютерные исследования и моделирование. 2013. Т. 5. С. 737-747.

2. Абдуллатыпов А. В.. Зорин Н. А., Цыганков А. А. Взаимодействие гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina BBS с метилвиологеном и положительно заряженными полипептидами // Биохимия. 2014. Т. 79. С. 1009-1014.

3. Abdullatvpov А. V.. Tsygankov A. A. Modeling three-dimensional structure of two closely related hydrogenases // Photosynthesis Research. 2015. V. 125. P. 341-353.

Тезисы в сборниках конференций:

1. Абдуллатыпов А. В.. Бутанаев А. М., Цыганков А. А. Гомологичное моделирование пространственной структуры гидрогеназы HydSL Thiocapsa roseopersicina BBS. XX международная конференция «Математика. Компьютер. Образование», 28 января - 2 февраля, 2013, Пущино. URL: http://mce.su/archive/docl77476/rus.pdf

2. Abdullatvpov А. У.. Tsygankov A. A. Mapping the molecular tunnels in three nickel-iron hydrogenases. Moscow conference for computational molecular biology, 2013, July 25-28, Moscow. URL: http://mccmb.belozersky.msu.ru/2013/ abstracts/abstracts/24.pdf

3. Abdullatvpov A. V.. Tsygankov A. A. Modeling the HydSL-hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. International conference "Photosynthesis research for sustainability" in honour of Vladimir A. Shuvalov, June 2-7, 2014, Puschino, Russia. P. 140-141.

Подписано в печать 11.09.2015 Печать цифровая Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 4.0 Заказ № 29 Тираж 100 экз.

Отпечатано с оригинал-макета в типографии «Р1хРгтЪ>, 142290, Пущино Московской обл.,

м-н «АБ», 18а +7(926)712-06-04; www.fix-print.ru printpsn@gmail.com