Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия

Тучин, Святослав Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия"

На правах рукописи

РГБ ОД

1 / ЛИГ 2000

ТУЧИН Святослав Викторович

МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРЕССА ОБЕЗВОЖИВАНИЯ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ ПШЕНИЦЫ И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ

03.00. Г:3 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Лисссргацлк на соискание ученой степени

./¿.-/¡'.гор:; 6гк пошческ-чх "лук

Москва 2000

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук АвегисовВ.А.

доктор биологических наук КозловскаяВ.Ф. доктор биологических наук Шаин С.С.

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита состоится « и. // часов

на заседании диссертационного совета Д. 020.40.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу:

127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке: ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат разослан «¿£>>_Л_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Меликова С. А.

)

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Реализация клеточных технологий в селекции на засухоустойчивость растений связана с использованием факторов, моделирующих стресс обезвоживания при их воздействии на культивируемые ткани. Однако, теоретические обоснования такого способа повышения засухоустойчивости сельскохозяйственных культур и первые опыты, проделанные в этом направлении, совершенно не затрагивают вопрос других биологических последствиях обезгожичания клеток для вегетпру-ющих растений, происходящих от них, з ряду половых поколений.

Более того, до настоящего времени практически отсутствуют данные, демонстрирующие справедливость наиболее важного для обоснования теории селекции клеточных культур постулата - о существовании положительной корреляции между устойчивостью изолированных тканей к обезвоживанию и проявлением этого признака у растений в виде способности сохранять урожай в условиях засухи.

Попытки экспериментального решения данной проблемы были предприняты в основном для двудольных растении, в результате которых было показано наличие такой коррелятивной связи. В то же время исследования на злаковых культурах, и особенно на пшенице, носят фрагментарный характер, не дают ответа на главный вопрос и совершенно оставляют без внимания ряд проблем, тесно связанных с ним.

Прежде всего это касается выбора наиболее эффективно действующего агента, способного в изолированной культуре адекватно моделирова ть стресс обезвоживания, отбирая устойчивые клетки, способные регенерировать растения с генетической устойчивостью к данному фактору, а также доз и сроков его воздействия на клеточные культуры, оценки экспрессии приобретенной >стойчивости и ее трансмиссии в ряду половых поколений.

Кроме того, выяснение биологических закономерностей адаптации растений к обезвоживанию остается, по-прежнему, актуальной задачей для всех сельскохозяйственных видов-мезофитов, анатомически не приспособленных к сохранению воды, но особенно для пшеницы, ареал возделывания которой в Российской Федерации приходится в основном на зоны, периодически страдающие от недостатка влаги и высоких температур.

Изучению влияния на пшеницу зтах главных лимитирующих факторов среды в засушливых регионах посвящено громадное количество исследований, выполненных с использованием всего арсенала средств, имеющихся в современной науке. Тем не менее, до настоящего времени не удалось создать целостную физиолого-генетическую модель признака засухоустойчивости, основанную на понимании биологических реакций растений, адекватно отражающих процессы адаптации и формирования урожая в условиях длительного обезвоживания тканей.

Во многом это связано с недостаточной проработанностью вопросов, касающихся роли клеточных механизмов в подобного рода реакциях ппте-

ницы на данный фактор внешней среды, что объясняется, прежде всего, методическими трудностями, возникающими при работе на клеточном уровне. Однако, значительный прогресс, достигнутый в разработке методов культивирования изолированных тканей пшеницы, открывает широкие перспективы для выяснения истинного значения клеточного компонента в формировании адаптивных реакций пшеницы в ответ на обезвоживание.

Цель исследования: ш/чить влияние факторов, моделирующих обезвоживание in vitro, на поведение молекулярных маркерных систем, изолированных тканей и целостных растений пшеницы; изучить биологические последствия обезвоживания культивируемых тканей пшеницы; разработать научно обоснованные селективные схеиы дл:; отбора сомаклонов пшеницы с хозяйственно-ценными признаками и создать на этой основе исходный материал для селекции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ использования методов культуры тканей и клеточной селекции дня получения генотипов пшеницы, устойчивых к стрессорам;

2. Изучить влияние факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro - абсцизовой кислоты, Ь-азетидин-2-карбоновой кислоты и полиэти-ленгликоля, на интегральные характеристики процессов роста и развития тканевых культур и целостных проростков пшеницы. Установить дозовые зависимости биологического эффекта этих факторов и степень их соответствия для изолированных тканей и целостных растений.

3. С помощью молекулярных маркерных систем выяснить причины, синхронизирующие ответные реакции на обезвоживание, и показать последствие этого явления для культивируемых тканей пшеницы, затрагивающие молекулярный уровень. Привести доказательства трансмиссии молекулярных изменений от клеточных культур, подвергнутых обезвоживанию, в половые потомства растений-регенерантов.

4. На основе принципов молекулярно-экологической концепции разработать теоретический подход к отбору клеточных культур пшеницы, устойчивых к стрессу обезвоживания. Выяснить эффективность различных селективных схем для отбора засухоустойчивых сомаклонов пшеницы и получить формы, экспрессирующие этот признак в половых поколениях.

5. Изучить в лабораторных опытах и полевых испытаниях полученные сомаклоны пшеницы и установить биологические последствия обезвоживания изолированных тканей на вегетирующих растениях. Создать коллекцию сомаклонов с хозяйственно-ценными признаками, пригодную для использования в селекции.

6. Оценить перспективы и направления использования молекулярно-экологической концепции для создания методами клеточной селекции устойчивых к обезвоживанию форм пшеницы и возможность ее применения для оценки адаптивности селекционного материала.

Научная новизна. Впервые показано, что ингибирующее влияние низкого химического потенциала воды на процессы роста и развития клеточ-но-тканевых систем пшеницы подчиняется закономерностям функционирования биологического триггера. На основании этого предложен подход к установлению эффективной дозы селективного давления для получения засухоустойчивых форм пшеницы.

Доказана целесообразность одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с предельно низким химичес;.1:м потенциалом воды, который обеспе^.зае; оптимальное соотношение между частотой мутациа, возникающих в культивируемых клетках, и способностью каллусных кул- -тур к регенерации растений.

Э;рименталыго установлено, что культивирование изолир.ж, тг.мх тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды сопряжено с проявлением наследуемых изменений в структурно-функциональных свойствах полиморфных белковых систем. При этом частота мутаций по глиадикодирующим локусам в выборке сомаклонов коррелирует со степенью снижения химического потенциала воды в среде культивирования изолированиях тканей, а наиболее подвержены изменениям гли-адинкодирующие локусы генома D.

Показано, что адаптация к обезвоживанию изолированных клеток на уровне различных белковых систем осуществляется в направлении повышения структурной жесткости макромолекул.

Впервые обнаружено, что подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическому потенциалу воды, несет мутацию, редуцирующую длину главного побега растений, и в зависимости от генотипа пшеницы, служившего донором культивируемых тканей, - мутацию, повышающую устойчивость сомаклонов к бурой ржавчине.

Анализ большого числа сомаклонов, отобранных in vitro на устойчивость к обезвоживанию, выявил у них наличие изменений и по другим морфологически и физиологическим признакам, которые наследуются в ряду половых поколений.

Получены растения пшеницы с повышенной засухоустойчивостью, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении биосинтетической активности в условиях недостатка влаги, чтг рсализуется - более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с пи ходным сортом.

Впервые обнаружено влияние обезвоживания изолированных клеток пшеницы гибридного происхождения на частоту проявления качественных признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

Создана коллекция сомаклонов (около 1000 номеров), представляющая интерес как для включения в селекционные программы, так и для использования в научных целях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доказательства существования у пшеницы биологического триггера, контролирующего ответные реакции на воздействие факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro - абсцизовой кислоты, L-азете-дин-2-карбоновой кислоты и пониженного химического потенциала воды в среде.

2. Анализ селективных схем, используемых для отбора устойчивых к обезвоживанию сомаклонеи пшеницы, с и: лщий молекулярно-экологи-ческой концепции и триггерного механизма адаптации растений к стрессорам. Данные о преимуществах одноступенчатой схемы отбора каллус-ш.'х культур при использовании низкого химического потенциала воды в качестве селективного фактора и ауксина, как индуктора калл%сооб; азо-вания.

3. Потенцирующий эффект низкого химического потенциала воды в среде на частоту мутаций в культивируемых клетках пшеницы. Множественный характер молекулярно-генетических и фенотипических изменений, выявляемых у сомаклонов, отселектированных в стадии изолированных клеточных культур под воздействием данного фактора. Наследование мутаций, возникающих в культивируемых клетках, устойчивых к обезвоживанию.

4. Экспрессия засухоустойчивости в растениях - половых потомках регенерантов, полученных из каллусных культур, устойчивых к обезвоживанию, связана с повышением урожайности сомаклонов при засухе и изменениями термодинамических параметров воды в растениях.

Апробация полученных результатов и практическая значимость работы связана с реализацией способов получения наследственно измененных форм пшеницы, оформленных в виде двух изобретений (A.c. СССР № 1738171А1 и патент РФ № 2095971). На основе указанных изобретений создан исходный материал доя селекции, который используется в селекционных программах лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока и Ершовской опытной станции.

Коллекция сомаклонов, насчитывающая около 1000 образцов яровой мягкой пшеницы, содержит формы с новыми генетическими элементами, детерминирующими дойну стебля растения, окраску растения, устойчивость к бурой ржавчине, качество клейковины зерна, длину вегетационного периода и другие признаки. Указанные формы используются в генетических и физиологических исследованиях в НИИСХ Юго-Востока и ВИЗРе.

Методические исследования в области совершенствования способов культивирования изолированных пыльников пшеницы реализованы в виде создания дигаплоидного сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (патент РФ на селекционное достижение № 0344), районированного с 2000 года по Саратовской области.

Практической ценностью для биотехнологических исследований обладают полученные доказательства преимущества использования корот-

ких селективных схем для отбора in vitro стрессустойчивых сомаклонов. При этом предложен научно обоснованный подход к определению дозы воздействия селективного фактора.

Данные о превалирующем значении химического потенциала воды, выступающего в роли сигнала для переключения биологического триггера при адаптации растений к обезвоживанию, открывают широкие возможности для построения прогностических моделей, предназначенных для повышения эффективности отбора засухоустойчивых форм в процессе проработки гибридного селекционного материала.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные материалы, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. В изучении проростковых генов устойчивости к бурой ржавчине у сомаклонов пшеницы принимала участие научный сотрудник лаборатории микологии и фитопатолопш Всероссийского института защиты растений Е.И. Гультяева.

Связь работы с крупными научными программами. Данная работа выполнялась с 1986 г. в соответствии с международной программой КП НТП СЭВ по пятому приоритетному направлению «Ускоренное развитие биотехнологии», программой ВРО ВАСХНИЛ и Россельхозакадемии «Биотехнологнческие основы интенсификации селекционного процесса культурных растений и животных», гранта Министерства науки и технологий РФ по направлению 050, проект № 13 «Стрессы растений».

Опубликованность результатов. Основные положения работы представлялись на многих научных конференциях, совещаниях и симпозиумах, среди которых можно выделить: Международный симпозиум «Клеточные и генные биотехнологии дтя зерновых злаков» (Алма-Ата, 1989), I Всесоюзный симпозиум «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино, 1991), II Российский симпозиум «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино, 1993), I съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), V Международная конференция по пшенице (Анкара, 1996), Международная научная конференция «Развитие научного наследия академикаН. И. Вавилова» (Саратов, 1997). Пятая международная конференция «Регуляторы роста и развития растсний» (Москва, 1999), Международная конференция «Физиология растений - наука III тысячелетия (IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 1999).

Результаты, полученные при выполнении данной диссертации, в совокупности опубликованы в 51 научных работах, в том числе в 27 научных статьях в международных и центральных журналах и сборниках, 2 патентах и 1 авторском свидетельстве на изобретение и 21 тезисах в материалах конференций, съездов и симпозиумов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 281 страницах машинописного текста и состоит из 9 глав, разделенных на подгла-вы и содержащих 72 таблицы и 35 рисунков, введения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, состоящего из 329 источников, включая 142 иностранных.

Основная часть

Дозовые зависимости ингибирующего эффекта факторов, имитирующих стресс обезвоживания

Главным критерием, характеризующим устойчивость клеточных культур к моделируемым абиотическим стрессам, принято считать их способность к размножению в присутствии селективного фактора. При этом важным условием селективной эффективности такой искусственно созданной системы является установление дозы действующего агента, ингибирующей пролиферацию культивируемых клеток (Гонзалес, Уидхолм, 1989), которая, как правило, находится по дозовым кривым, отражающим взаимосвязь «доза - эффект» (Лакин, 1973).

Нами были изучены дозовые зависимости ингибирующего воздействия на растительные клетки трех факторов, используемых для моделирования in vitro стресса обезвоживания - Ь-азетидин-2-карбоновой кислоты (АЗТ), абс-цизовой кислоты (АБК) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве агента, изменяющего физико-химические параметры воды в среде культивирования.

Изучите дозовых характеристик селективных факторов на проростках пшеницы

Среди веществ общего воздействия, конкурирующих с растительными клетками за воду, наиболее часто используется ПЭГ 6000, молекулы которого не могут преодолеть барьеры клеточной проницаемости. Изменение активности воды при растворении ПЭГа может быть описано в термодинамических терминах, через понижение ее химического потенциала (ХПВ) по сравнению с таковым чистой воды. Снижение этого параметра в культуральной среде сопровождалось торможением ростовых процессов у проростков пшеницы при достижении ряда пороговых уровней химического потенциала воды (рис. I). Тот факт, что низкий ХПВ угнетает ростовые функции проростков сам по себе не вызывает удивления. Однако принципиальное отличие результатов, полученных нами, заключается в том, что они демонстрируют явно нелинейный характер ответных реакций проростков на градуальное возрастание концентрации ПЭГа в среде. На дозовой кривой четко выявляются участки как с пониженной чувствительностью к обезвоживанию, так и с гиперчувствительностью проростков при достижении соответствующих уровней химического потенциала воды в питательном растворе.

Химичеоайпотгашеяводы, ДяЛголь

Рис. 1 Влияние химического потенциала воды в среде на массу проростков пшеш1цы сорта Саратовская 29

Измерение ХПВ непосредственно в проростках показало, что угнетение процессов роста при обезвоживании в большей степени соответствует изменению величины именно этого параметра, нежели концентрации воды в тканях (табл. 1).

Токсический аналог пролина - АЗТ в концентрации до 100 мг/л и гормон "стрессустойчивости" - АБК в концентрации до 40 мг/л обладают выраженным угнетающим влиянием на 7-дневные проростки пшеницы. При этом дозовые кривые, отражающие зависимость сырой массы проростков от концентрации ингибиторов, также как и в случае использования ПЭГа, имеют нелинейный характер. Это означает, что, несмотря на разную природу угнетающего эффекта ингибиторов метаболических путей и низкого ХПВ, непропорциональность ответных реакций проростков на возрастающее напряжение использованных факторов должна предполагать существование какого-то общего механизма, обеспечивающего нелинейную кинетику физиологических реакций растений на внешнее воздействие.

Таблица 1

Величины параметров воды и ростовые характеристики 7-днсвных проростков пшеницы сорта Саратовская 29 при выращивашш на среде, содержащей полиэтиленгликоль в концентрации 20%.

Кон-ция К.ОН-ЦНЯ ХПВ, Длина Сырая масса Сухая масса

ПЭГа в воды в Дж/моль проростков, проростков, проростков,

среде, % тканях, % см мг мг

0 91,2± 1,1 -28,03± 1,64 18,04±0,78 144,1± 9,4 12,69±0,91

20 82,2±2,5 -64,42*3,15 8,94±0,25 45,4± 1,2 8,00±0,23

Особенности поведения дозовых кривых оказалось возможным проанализировать, используя динамическую модель адаптивности растений к меняющимся условиям среды (Веселова с соавт., 1993). Согласно этой модели, нелинейность реагирования живой системы при возрастании напряженности внешнего фактора означает, что она может находится в различных дискретных структурно-функциональных состояниях в зависимости от степени воздействия на нее. При э том переход между этими состояниями осуществляется кооперативно по принципу биологического триггера, функционирующего в режиме «все или ничего» (Конев с соавт., 1970). Данное свойство как раз и находит свое отражение в форме дозовых кривых, траектория которых может быть трех видов - ступенчатая, Б-образная и экспоненциальная. Анализ с этой точки зрения полученных нами результатов показывает, что ответные реакции проростков на градуально возрастающие дозы использованных факторов осуществляются по принципу биологического триггера, о чем свидетельствует нелинейный характер дозовых кривых. В основе кооперативных свойств живых систем лежит способность белковых макромолекул изменять свою конформацию под воздействием изменяющихся условий окружающей среды, в результате чего происходит синхронная перестройка биологических структур более высоких уровней организации. В связи с этим, обнаруженные нами кооперативные свойства целых проростков пшеницы предполагают существование аналогичного явления и на более низком уровне биологической организации, а именно - на уровне изолированных клеточных культур.

Изучение дозовых характеристик селективных факторов на каллусных культурах пшешщы

Культивирование эмбриогенного каллуса различных сортов пшеницы на средах, содержащих ПЭГ в концентрации 5, 10 и 20 % (снижение ХПВ до -13,2 - 20,5 и -36,6 Дж/моль соответственно) в значительной степени угнетало их способность к регенерации растений по сравнению с контролем (рис.2).

Дозовые кривые, отражающие способность каллусных культур к регенерации растений, имеют экспоненциальный характер, что означает повышенную чувствительность клеточных структур, отвечающих за процес-' сы морфо- и органогенеза. Сравнительное изучение параметров воды в каллусных культурах, выращенных на контрольной среде Линсмайра-Скуга (ЛС) и на среде, содержащей 20-й ПЭГ (ХПВ - 36,6 Дж/моль), показало, что за время 30-дневного культивирования каллусы контрольного варианта имели большее содержание воды и более высокие значения ее активности и химического потенциала. Таким образом, низкий химический потенциал воды в среде культивирования обусловливает низкий ХПВ в каллусных тканях пшеницы. В этих условиях обменные процессы в клетках смещаются в сторону распада, но не синтеза новых соединений (Зялалов, 1984). Все это приводит к замедлению как процессов деления каллусных

клеток, так и их растяжения, которое напрямую зависит от величины химического потенциала воды в клетке. В результате количество клеточных культур, регенерирующих растения резко падает по сравнению с контролем. С другой стороны, инициальные клетки, сохранившие способность к пролиферации в подобных условиях, должны обладать устойчивыми биосинтетическими процессами, вопреки низкой активности воды.

Ингибитор синтеза пролина - АЗТ с учетом дозовой кривой для проростков использовали для отбора каллусных культур пшеницы в концентрациях до 75 мг/л, что значительно выше, чем для двудольных растений. Анализ дозовых кривых для каллусных культур показал, что даже в случае использования максимальной дозы АЗТ, клеточные культуры не подвергаются достаточно сильному стрессовому воздействию. Траектории кривых имеют нелинейный характер, но они, скорее всего, отражают результат взаимодействия двух противоположно направленных процессов. С одной стороны, ингибирование процессов регенерации растений, с другой - их несомненную стимуляцию при возрастании концентрации АЗТ в среде культивирования.

Изучение ингибирующего воздействия АБК в широком диапазоне концентраций (до 75 мг/л) на регенерационную способность эмбриоген-ных каллусов показало, что траектории дозовых кривых в большей степени похожи на Б- образные, чем в случае применения АЗТ, и на них можно выделить зону летальности. Однако даже очень высокая доза этого фито-гормона в 20 мг/л не являлась селектирующей для каллусных культур сортов пшеницы поволжских экотипов.

Сравнительный анализ дозовых кривых трех изучаемых факторов, проведенный попарно для проростков и изолированных клеточных культур, показывает, что для ингибиторов метаболических путей зоны стресса не соответствуют друг другу. Токсический эффект АЗТ и АБК на проростках проявляется в гораздо меньших концентрациях, чем на каллусных культурах. Более того, дозы, стимулирующие в некоторых случаях развитие процессов органогенеза в каллусных культурах, для проростков оказывались явно угнетающими. Данный эффект, по-видимому, обусловлен различиями в соотношении эндогенных и экзогенных стимуляторов роста в двух различных клеточных системах, возникающими под воздействием внешних добавок. Концентрации АЗТ 50 - 75 мг/л практически не оказывают ингибирующего воздействия на регенерацию растений, а нелинейность кривых, скорее всего, отражает пребывание клеточных популяций в переходной области, когда возможно развитие парадоксальных реакций (Веселова с соавт., 1993). Достоверно выраженный угнетающий эффект был получен нами при использовании сверхвысокой дозы АЗТ - 250 мг/л, которая, примерно, в 50 раз превышает концентрации, обычно используемые в клеточной селекции растений.

100 г? 90

§ во

Ё 70 & 60

1 50

I «

? 30 § 20 Я 10 О

£0

* 70 «

е во

I 50

5 40

о. 30

О -1-1-1-1

О 5 10 15 20

С,%

Ершовская 32

Рнс. 2 Влияние полютилснгликоля на регенерационную способность (выход регсисрантов) каллусных культур пшеницы

Что касается причин низкой селектирующей способности АБК в отношении изолированных клеточных культур, то, возможно, они кроются в антагонизме механизма действия этого ингибитора и ауксинов. Наличие 2,4-Д в составе культуральной среды, очевидно, препятствует проявлению воздействия АБК. Известно, что при совместной обработке растительных органов и тканей экзогенными АБК и ауксином они снижают эффект друг друга (Полевой, 1982; Уоринг, Филлипс, 1984; Кефели с соавт., 1989).

В конечном итоге, полученные нами результаты свидетельствуют о неадекватности механизмов воздействия изучаемых ингибиторов роста (АЗТ и АБК), на биохимические реакции, принимающие участие в адаптации клеток к стрессу обезвоживания, находящихся в условиях изолированной культуры, и клеток интегрированных в состав целостного организма.

В противоположность этому, экспоненциальные кривые для процессов регенерации растений из каллусных культур, выращенных на средах с низким химическим потенциалом воды, свидетельствуют о быстром подавлении активности неустойчивых к обезвоживанию клеток. При этом зоны стресса и летальности для целостных проростков и клеточных куль-

Сириовская 46

тур в большей степени соответствуют друг другу, нежели это наблюдалось в случаях использования АЗТ или АБК.

Согласно концепции биологического триггера (Веселова с соавт., 1993), адаптация популяции растительных клеток, в качестве которой можно рассматривать совокупность клеток каллусных культур, к давлению среды осуществляется за счет изменения в генетической структуре особей, составляющих эту популяцию. Экспоненциальные кривые, полученные для процессов регенерации растений из каллусных культур, как раз и свидетельствуют о быстром подавлении неустойчивых к обезвоживанию клеток. Это означает, что в случае использования низкого ХПВ в качестве селектирующего фактора можно прогнозировать появление генотипов, экспрессирующих устойчивость к обезвоживанию не только на уровне каллусных культур, но и на уровне вегетирующих растений половых потомств регенерантов.

Влияние стресса обзвоживания на полиморфные белковые системы в культуре изолированных клеток пшеницы

Адаптация клеток пшеницы к низкому химическому потенциалу воды и конформациошгая лабильность макромолекул

Обнаруженный нами кооперативный характер адаптивного ответа проростков и клеточных культур пшеницы, проявляющийся в виде нелинейности дозовых кривых, описывающих стресс обезвоживания, предполагает индуцирование конформационных перестроек биополимеров под влияш1-ем снижения химического потенциала воды и возникновение изменений в полиморфных белковых системах клеток, подвергнутых обезвоживанию.

Дозовые зависимости фракционного состава белков от величины снижения химического потенциала воды в среде выращивания проростков были изучены нами на двух сортах пшеницы, различающихся по своей засухоустойчнвосш -Саратовская 29 (С 29) и Опал на примере полиморфного семейства фермента эстеразы. Анализ элжгрофореграмм показал, что фракции эстераз двух сортов по разному реапгруютна обезвоживание тканей. Так, снижение ХПВ сопровождалось у сорта С 29 колебаниями синтеза высокомолекулярных фракций вокруг среднего уровня, а дозовая кривая представляет собой ломанную линию с четко выраженными максимумами и минимумами (рис. 3). Данный факт свидетельствует о сохранении структуры высокомолекулярных изоформ эстеразы при достаточно выраженном стрессе обезвоживания Адаптивная реакция на продолжающееся снижение ХПВ средывозникаету этого сорта в ввде скачкообразного усиления сшггеза высокомолекулярных белков при достижении порога -30,2 Дж/ моль, уровень которого не изменяется и при более жесттсом стрессе.

В противоположность этому, адаптация у сорта Опал начинается уже при ХПВ -14,2 Дж/моль путем увеличения образования низкомолекуляр-

ных форм, что является закономерной реакцией на стресс обезвоживания (Блехман, 1978, 1983). Данный уровень синтеза изоферментов этого типа сохраняется до величины ХПВ -30,2 Дж/моль, а затем следует его резкое усиление, что, по-видимому, свидетельствует о деградации высокомолекулярных компонентов под воздействием стресса.

Таким образом, адаптивные реакции на молекулярном уровне разных по засухоустойчивых сортов начинают проявляться при различном напряжении стресса и протекают в противоположных направлениях. Однако общим в реакции ферментативных систем двух сортов на снижение ХПВ в среде выращивания проростков является ступенчатый характер дозовых кривых, отражающий нелинейность процессов синтеза различных фракций эстеразы в зависимости от степени обезвоживания тканей.

Саратовская 2 9

ч. (п

а , в

во..

70 •• 60 ■ • 1 60 ■ • 40 • • 30 . . 20.. ю 4-

----

I I

-н

£0 ■•40 • •30 . .20 ■И0

-3,5 -14,2-20,3-30,2-40,2-62,8

Химический потенциал воды, Дж/моль Опал

V? ч -я

*ч.

* ^ £ «»

8 а я

70 60 50 40 30 20 10 0

Н-1-

ч-

■4-

40 35 30 26 20 15 10 5 0

0 -14,2-20,3-30,2-40,2-52,8

Химический потенциал воды, Дж/моль

I®

Рис. 3 Влияние химического потенциала воды в среде выращивания проростков пшеницы на относительные количества фракций эстеразы листьев; 1-высокомолекулярные; 2-низкомолекулярные фракции

Влияние низкого химического потенциала воды в среде культивирования на состав изоформ эстеразы у каллусных культур было изучено нами

на трех сортах пшеницы, относящихся к различным агроэкологическим группам - Ершовской 32 (Е 32), Саратовской 46 (С 46) и Саратовской 55 (С 55). Каллусные культуры наименее засухоустойчивого сорта Е 32 характеризовались большей активностью низкомолекулярных фракций (НМФ) по сравнению с высокомолекулярными (ВМФ). В культурах более засухоустойчивого сорта С46 данный дисбаланс был выражен в меньшей степени, а у самого засухоустойчивого среди них сорта - С 55 наблюдалось обратное соотношение активностей высоко- и низкомолекулярных компонентов эстеразы. Изменения в составе изоэстераз, вызванные длительным обезвоживанием каллусных культур, коснулись всех областей электрофорети-ческого спектра. При этом оказалось, что приспособительные реакции клеток менее засухоустойчив! тх сортов (Е 32, С 46) сопровождаются увеличением активности ВМФ этого фермента. Однако абсолютная величина активности высокомолекулярных компонентов и соотношение ВМФ/НМФ эстеразы как в контрольном варианте, так и при обезвоживании, были выше у клеток засухоустойчивого сорта С 55. Электрофоретический профиль эстеразы адаптированных к обезвоживанию каллусных культур сорта Е 32 оказался менее подвержен модифицирующему влиянию температурного шока (45°С), по сравнению с клетками, выращенными на контрольной среде . Достаточно похожая картина наблюдалась и для клеточных культур более засухоустойчивых сортов С 46 и С 55. В этих случаях температура также не вызывала существенных изменений в общей картине белкового профиля эстераз, как это происходило при шоковом воздействии на клетки контрольного варианта.

На основании этих данных можно сделать вывод о том, что, несмотря на различия в составе белков каллусных культур трех сортов и реакциях на адаптацию к обезвоживанию, культивирование каллусов на среде с низким химическим потенциалом воды приводит к таким изменениям в белковых системах, которые снижают их чувствительность к температурному стрессу. Об этом же свидетельствуют электрофоретические профили общих белков адаптированных к обезвоживанию каллусных культур до и после температурного шока. В значительной степени их общин вид соответствует друг другу - в электрофореграммах не наблюдается таких резких изменений, вызванных температурной обработкой, как это имеет место в случае с неадаптированными каллуснымн культурами.

Очевидно, данное явление обусловлено изменением структуры белков, связанное с тем, что механизмы адаптации клеток пшеницы не способны стабилизировать химический потенциал внутриклеточной воды при культивировании каллусных культур на среде с ПЭГом и, по В.Я. Александрову (1975, 1985), для поддержания семилабильного состояния биополимеров в новых условиях белковые макромолекулы должны претерпеть соответствующие преобразования, которые сопровождаются изменениями их конфор-мационной подвижности. Определение информационной подвижности белковых макромолекул и их комплексов в грубом экстракте каллусных культур с помощью амфифильного зонда АНС показало, что при выращивании

тканей пшеницы на контрольной среде ЛС (ХПВ -8,6 Дж/моль) макромолекулы более лабильны, чем в опытном варианте, когда ХПВ среды составлял -36,6 Дж/моль. Таким образом, при снижении активности воды в окружающей среде макромолекулярные внутриклеточные структуры изолированных клеток подвергаются непосредственному давлению отбора, что приводит к изменению их структурно-функциональных свойств.

Сомаклспальная нзмшчшюсть полиморфных белковых систем, связанная с обезвоживанием изолированных клеток пшешщы

Культивирование каллусных культур Е 32, С 46 и С 55 на среде с низким ХПВ индуцировало возникновение в средней зоне спектра дополнительной изоформы фермента . Регенерация растений из таких культур, выращивание последовательно двух половых поколений сомаклонов не привели к элиминации дополнительных линий в спектрах изоэстераз зерновок для всех трех сортов пшеницы (рис. 4). Более того, при скрининге сомаклонов наиболее часто изменения в спектрах эстераз эндосперма зерновок пшеницы наблюдали у форм, отселектированных на среде с 20 % ПЭГом. Так, у некоторых сомаклонов сорта Е 32 (ИИ 141, 173, 176) на электрофореграммах отсутствовал в блоке Е$1-2 характерный для исходного сорта изозим. Этот блок контролируется генами, расположенными на длинном плече хромосомы ЗЭ. В тоже время у всех сомаклонов подобного происхождения отмечается усиление экспрессии генов блока ЕвМ, локализованных на коротком плече хромосомы ЗА. Массовый анализ сомаклонов второго-шестого семенных поколений по алкогольдегвдрогеназе АДГ показал наличие изменений в их составе у большинства семей. Отклонения в электрофореграммах были наиболее значительны при использовании осмотика в концентрации 15-20%. Так, у сомаклона N 39 (С 55) изменение соотношения изоформ характерно для мутаций, сопровождающихся увеличением продукции гена А<1Ь-А1, например, вследствие образования одной или двух изохромосом 4 А. Поскольку локус АсШ-А1 находится в одной группе сцепления с геном короткостебельности!Ш-1 (ОаучеБ е1 а1.,1986), то его дупликация при образовании изохромосомы 4 А должна приводить к усилению экспрессии этого гена, что и было обнаружено при морфологическом анализе сомаклонов.

Анализ электрофоретических спектров глиадинов исходных сортов ( С 46, С 55, Е32) и сомаклонов, полученных от них с использованием различных сред, показал, что изменения в глиадинкодирующих локусах по-томств регенерантов нередкое явление, а их частота может возрастать с увеличением селективного давления среды (табл. 2). Стабильность выявленных изменений и характер наследования измененных компонентов глиадинов исследовались на гибридах от скрещивания сомаклона N 184 (Я 6) с родительским сортом Е 32, которые различаются расположением глиадинов в блоках 1А, 1В и Ш.

При анализе 195 зерновок И 2 было обнаружено 27 фенотипических классов распределения компонетов глиадинов. Соотношение количества зерновок в фенотипических классах позволило подтвердить в этом скрещивании наличие трех пар аллельных генов. Обнаруженное расщепление (1:2:1 для каждой пары блоков) соответствовало предположению о независимом наследовании трех пар аллелей с кодоминантным выражением. Кроме того, анализ электрофогетических спектров глиадинов сомаклона N 184 в ряду самоопыленных поколений от КЗ до Ы8 показал, что возникшие изменения стабильно сохранялись в течение 6 генераций.

12 3 4

Е512

ЕбИ

Ершовская 32

ЕБ12

ЕвИ

Саратовская 46

Е$12

ЕзИ

Саратовская 55

Рис. 4 Электрофоретические спектры эстеразы зерновок исходных сортов (1), сомаклоиов, отселектироваиных на 20 %-ом ПЭГе (2), каллусиых культур неадаптированных (4) и адаптированных к 20%-му

ПЭГу(З)

Таблица 2

Влияние концентрации ПЭГа в среде культивирования на частоту изменений в глиадинкодирующих локусах в геномах пшеницы

Исходный Конц. ПЭГа в Кол-во семей, Частота семей с изменениями в геномах

сорт среде, шт. А В D

% шт. % шт. % шт. %

Ершов- 0 И 0 0 4 36,4 1 9,1

ская 32 10 12 4 33,3 9 75,0 1 8,3

20 16 7 43,8 1 6,3 13 81,3

F"=3,52* F-10,17* F =20,97*

НСР =33,7 нср- =31,4 НСР- =27,1

Сара- 0 10 4 40,0 2 20,0 0 0

товская 10 14 4 28,6 2 14,3 2 14,3

55 20 10 3 30,0 3 30,0 6 60,0

F-1.27 F=0,17 F=7,55*

НСР= ■ НСР= - НСР=30,7

Примечание:" - различия достоверны на уровне 0,95

Направление сдвигов биохимического статуса растений-потомств кал-лусных клеток, пролиферирующих при низком химическом потенциале воды, были изучены на сомаклонах, экспрессирующих засухоустойчивость в продвинутых поколениях и исходных сортах, взятых в качестве контроля.

Характерной особенностью изменений спектра изоэстераз, наблюдаемых у исходного сорта при выращивании проростков на среде с 20 % ПЭГом, является уменьшение относительного количества наиболее высокомолекулярной фракции, а также разделение ее на две составные части, в результате чего электрофоретический профиль в этой зоне приобретает вид двойного пика (рис.5). Одновременно с этим соответственно возрастает относительное количество белков с низкой молекулярной массой, что, собственно, и является закономерной адаптивной реакцией клетки на обезвоживание.

В противоположность этому (рис. 6), под влиянием ПЭГа у сомаклона N 65-84, отобранного in vitro на 20 % ПЭГе и показавшего повышенную засухоустойчивость в условиях экстремально высоких температур и засухи, наиболее высокомолекулярная фракция не только не разделилась на отдельные компоненты, но и профиль ферментов в этой части электрофоретического спектра стал более сглаженным. Кроме того, соотношение высоко- и низкомолекулярных фракций изоэстераз не претерпело существенных изменений, как это наблюдалось в случае исходного сорта Е 32.

Температурный стресс у проростков сорта Е 32 привел к снижению синтеза всех фракций эстеразы и относительному увеличению низкомоле-

кулярных пиков как в случае одиночного воздействия, так и в комбинации с обезвоживанием. Аналогичные обработки проростков сомаклона № 6584 существенных изменений во фракционном составе эстеразы листьев не произвели.

Электрофоретический анализ водорастворимых белков проростков сомаклона N 65-84 выявил существенные различия между сомаклоном и исходным сортом по составу высокомолекулярных компонентов при выращивании проростков в условиях стресса обезвоживания. Осмотический стресс, воздействующий на проростки засухоустойчивого сомаклона N 6584, не приводил к нарушению структуры высокомолекулярных компонентов, в отличие от исходного сорта Е 32, у которого электрофоретический профиль этих белков существенно изменялся по сравнению с нормальными условиями выращивания проростков.

Изменения спектров белков, наблюдаемые под влиянием обезвоживания и температурного стресса, означают, что растения исходного сорта Е 32 адаптируются к указанным стрессам прежде всего перестройкой белковых систем в направлении распада высокомолекулярных белков и образования низкомолекулярных соединений, прекращения синтеза некоторых белков и образования новых, не существовавших в нормальных условиях, тогда как высокомолекулярные белковые соединения проростков засухоустойчивого сомаклона N 65-84 обладают более высокой прочностью, сохраняя свою структуру под воздействием указанных факторов.

В общем, можно констатировать, что при культивировании изолированных клеток пшеницы на искусственных питательных средах в системах, контролирующих синтез различных белков, возникают разнообразные изменения. Количество подобных изменений и степень их выраженности зависят от величины снижения химического потенциала воды, вызванного добавлением в среду культивирования ПЭГа. Изменения в структурных генах, отвечающих за синтез полиморфных белков (глиадинов и изо-ферментов), наиболее часто возникают в условиях предельно низкого ХПВ среды, создаваемого 20 %-м ПЭГом. Эти изменения экспрессируются в дальнем потомстве растений-регенерантов и подчиняются менделевскому расщеплению при скрещивании сомаклона с исходным генотипом пшеницы.

Поскольку указанные мутации носят множественный характер затрагивая все три генома пшеницы (судя по маркерным системам), имеются основания предполагать, что у сомаклонов, отобранных in vitro в условиях обезвоживания, должны обнаруживаться изменения в генетических системах, контролирующих и другие признаки, в том числе связанные с адаптивностью растений к недостатку влаги.

«.55

«.И-Н

0.41

«.35

14' I

I I ) I I I

V ^ \

I ••

п.

(I ! I I I I I I I • 1 -! I \

V. «1

\ ) 1,

1? 1 \

Ч « 1

. , . . . ' ■ • J 1

1 п > / 1

\ 11 1 1.

т Л I \ и

VI •Ч л / \

........ ■ 1/ - . . -V п

_________ У.. . .......и.:

1.1 и и и и

55 50 15 «0 «5 511 1 1 55 1еч

0.37-1 (■• ■ I-

1 г 1 1 : г Ь.ЗИ 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 ( 1 1

».55+ 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1) 1 1,

о.м-ц

11 \ 5 М 1

1/. V 1 IV *

п г " 1

0.55Т ' ' ...... "1 ■ —II" ' V ' -)■•■•

1 3 II < и->

1 * 11 < »

1 П ( ' 1

"Г.......1 •

1 1 П( 1 ( -1

1 — 1Г 1 1

Ь Л. 1 V * J

!2 35 10 55 10« 10! 110 115 1Г и 12!

Рис. 5. Денситограммы элсктрофорстпческого профиля эстеразы проростков сорта Ершовская 32 при выращишшин на контрольной среде (ХПВ -3,5 Дж/моль) (а) и иа среде с низким химическим потенциалом

воды (-25 Дж/моль) (б)

1.51

«.5111

II II ' II '

М I I IV I I I I I I I I . I Л .

«.«+ ■ г1-

1)11 II 0/1

1 I

I I ■ I II-

12 I

М « / V

.....Г ■ ■ V

" \ II / V

па д ) ш жп—с"пт

1 \

■V

____

"птди V .

а б

Рис. 6. Депситограшпл электрофорстпчсского профиля эстеразы проростков сомаклг.на №65-84 при выращнвашш на кшггрольпой срсде (ХПВ -3,5 Дж/моль) (а) и па среде с шпки„ п.шчс'-ким потенциалом

воды (-25 Дж/моль) (б)

Изменчивость сомаклонов пшеницы« связанная с обезвоживанием изолированных клеточных культур

Окраска растеши

Среда сомаклонов сорта Е 32 выявилось достаточно большое количество светло-зеленых растений в отличие от темно-зеленых, покрытых выраженным белесым налетом, растений исходного сорт.".. Первые из них мы обозначили как изумрудные, вторые - как сизые. Частота появления изумрудных форм зависела от условий выращивания клеточных культур (табл. 3), которая была наивысшей при использовании селективной среды с 20 %-м ПЭГом. Этот признак характеризуется стабильным наследованием в ряду половых поколений - в течение 10 лет наблюдений нами не было обнаружено его инверсий к исходному генотипу. Более того, вторичные регенераты, полученные от сомаклона N 184 изумрудной окраски сохраняли ее, независимо оттого подвергались ли изолированные клеточные культуры стрессу обезвоживания или не подвергались в процессе культивирования.

Таблица 3

Влияние условий культивирования каллусных культур на изменчивость сомаклонов пшеницы сорта Ершовская 32 по цвету

растения

Вариант Кол-во Кол-во сомакл. с Доля сомаклонов с

сомаклонов изумрудным изумрудным

цветом растения цветом растения

ЛС 0 пас. 18 2 11,1

ЛС I пас. 25 12 48,0

ЛС I пас. (без 2,4-Д) 13 3 23,1

ЛС+ПЭГ 10 I пас. 27 9 33,3

ЛС+ПЭГ 20 I пас. 45 42 93,3

I ~=22,2* НСР=22,6

Примечание: * - различия достоверны на уровне 0,95

Длина стебля растения

Анализ длины стебля сомаклонов продвинутых поколений 112 - К1, сгруппированных по сортам и средам выращивания каллусных культур, показал, что стресс обезвоживания, создаваемый ПЭГом в концентрации 20 %, приводит к отбору преимущественно короткостебельных форм.

В связи с тем, что по фенотипическому проявлению количественного признака в одном поколении невозможно установить генетическую природу обнаруженных изменений нами была проанализирована высота ряда сомаклонов в течение нескольких генераций (табл.4).

Таблица 4

Наследование длины стебля у сомаклонов пшеницы, отселектированных на 20 %-мполиэтиленгллколе

Сорт, 1988 г. 1989 г. 1990 г.

сомаклон R2 R3 R4

Ерщовскал 32 43,7±1,9 58,2±2,0 106,9± 1,2

Ск 129 30,5±0,3* 52,3±3,0 67,0±3,4*

Ск 141 32,3± 1,0* 50,4± 1,5* 81,3± 1,4*

Ск 178 32,8±3,5* 53,3±2,1* 81,2± 1,1*

Ск 403 31,9±3,7* 49,8,±4,6* 61,5±4,8*

Саратовская 46 56,4±2,0 80,5±2,2 112,8±2,4

Ск 140 40,2±8,3* 72,9±6,7 100,3±4,2

Ск 168 46,4±2,3* 72,2±2,5* 113,8±2,0

Ск 169 42,5±2,0* 62,7±9,1* 105,4±2,3*

Примечание: * - различия достоверны на уровне 0,95

Гибридологический анализ показал, в результате отбора клеточных культур в условиях сильного обезвоживания, вызываемого 20 %-м ПЭГом, отбираются генетически детерминированные короткостебельные генотипы пшеницы. При этом мутагенный эффект может быть компенсирован влиянием цигоплазматического генома исходной формы. Данный факт означает, что уменьшение длины стебля у сомаклонов может быть следствием мутации как ядерных, так и цитоплазматических генов.

Устойчивость к бурой ржавчине

В последнее время была показана возможность получения сомаклонов пшеницы, устойчивых к некоторым фитопатогенам, в связи с чем нами был проведен скрининг сомаклональных вариантов с целью выявления форм устойчивых к бурой ржавчине. Исходные сорта пшеницы С 46, С 55 и сомаклоны, полученные на их основе, были восприимчивы к данному заболеванию. При этом интенсивность поражения листовой поверхности сомаклонов не зависела от способа их получеши.

Совершенно иная картина была обнаружена при изучении сомаклональных вариантов сорта Е 32. В среднем по устойчивости к бурой ржавчине сомаклоны, полученные со сред Блейдза (Бл), ЛС, ЛС без гормонов и ЛС + ПЭГ 10, не отличались от исходного сорта. В тоже время семьи, прошедшие отбор in vitro, на среде с низким химическим потенциалом воды, поражались патогеном значительно меньше (табл. 5). Обнаружено также, что коэффициент вариации этого признака у вариантов ЛС и ЛС + ПЭГ 20 значительно превышал таковой у исходного сорта. Высокий коэффициент вариации, свидетельствующий о большой изменчивости признака в популяции, в случае этих вариантов сомаклонов связан с налотием как полностью восприимчивых (поражение 100 %), так и абсолютно устойчивых семей, тогда как среди повтор-ностеи исходного сорта Е 32 не было обнаружено крайних значений проявле-

ния признака. Высокая степень сомаклональной изменчивости экспериментального материала открывает возможность для проведения отбора внутри полученных популяций на устойчивость к бурой ржавчине.

Таблица 5

Интенсивность поражения растешш сомаклонов пшеницы сорта Бршовская 32 бурой ржавчиной (%)

Сорт, вариант Кол-во повторностей, семей М±ш CV Р

Ершовская 32 16 32,4±3,7 45,8 --

Бл 6 33,3±3,7 24,5 >0,05

ЛС б/г 15 38,0±3,0 29,8 >0,05

ЛС 31 28,9±5,6 107,4 >0,05

ЛС + ПЭГ 10 5 29,8±6,4 43,2 >0,05

ЛС ПЭГ 20 22 15,1±5,73* 173,9 <0,05

Важной характеристикой в установлении генетической природы изменений, обнаруживаемых у сомаклонов, подвергавшихся селекции in vitro, является тест на стабильность признака устойчивости (Гогоалес, Уидхолм, 1989). Повторное культивирование соматических тканей сомаклонаК 184, проявившего полевую устойчивость к бурой ржавчине, на каллусогенной среде JIC и селективной JIC + ПЭГ 20 позволила получить ряд вторичных сомаклонов, которые также испытывали на устойчивость к этому патогену. Оказалось, что по степени поражения заболеванием вторичные сомак-лоны не отличалась от исходной формы Ск. 184, что свидетельствует о стабильной генетической природе устойчивости, индуцированной in vitro.

Влияние экзогенной гибберелловой кислоты на сомаклоны

Для изучения реакции сомаклонов на обработку экзогенной гибберелловой кислотой (ГК) было отобрано 24 образца, полученных на сорте Е 32, дайна стебля которых, как правило, была мслыпе, чем у исходного сорта. Оказалось, что из восьми сомаклонов, отобранных на селективной среде, содержащей 20 % ПЭГ, только один образец (N176) при достоверном уменьшении длины стебля реагировал на обработку ГК почти также, как исходный сорт Е 32. Остальные сомаклоны данного варишгга были абсолютно нечувствительны к экзогенной ГК. В тоже время среди сомаклонов, не подвергавшихся стрессу обезвоживания in vitro, более половины низкорослых образцов также были слабочувствительны к обработке ГК, однако пять сомаклонов суменыденнойдшшой стебля, наоборот, имели очень высокий эффект ГК. Более высокорослые сомаклоны, как и следовало ожидать, реагировали на внешнюю обработку ГК в большей степени, чем Е 32.

Эффект ГК у 70 % сомаклонов с уменьшенной длиной соломины, созданных на основе С 46 был ниже, чем у исходного сорта. Однако он был ниже и у двух образцов, несколько превышающих'по высоте исходный сорт.

Остальные сомаклоны, хотя и имели укороченный стебель, либо не отличались, либо превосходили по эффекту ГК родительский сорт.

В связи с тем, что низкорослые мутанты пшеницы, нечувствительные к экзогенной гибберелловон кислоте, ведут свое происхождение от клеток, способных к пролиферации в условиях экстремального обезвоживания (ХПВ в среде составлял всего -36,6 Дж/моль) было изучено влияние этого фито-гормона на термодинамические параметры воды в тканях у таких сомакло-нов и исходного сорта. Оказалось, что химический потенциал воды в тканях проростков исходного сорта, выращенных на среде как с добавлением ГК, так и без нее, совершенно не отличался. Соответственно, и эквивалентное осмотическое давление, рассчитанное по величине ХПВ, также было одинаковым. При этом, однако, линейные размеры колеоптилей достоверно увеличились (табл. 6).

Таблица б

Влияние гибберелловон кислоты на термодинамические параметры поды в тканях проростков пшеницы исходного сорта Ершовская 32 н короткостебельного сомаклопа № 184

Сорт, Содержание ХПВ воды в Р, МПа Длина

сомаклон ГК в среде, тканях, колеоптиля,

мг/л Дж/моль см

Ершовская 32 0 -40,4±3,8 2,24±0,21 5,5±0,21

10,0 -41,3±2,6 2,28±0,14 6,4±0,16*

Ск. 184 0 -24,3±2,4 1,34±0,13 4,0±0,12

10,0 -35,4±3,5* 1,96±0,19* 4,3±0,10

Примечание: * - различия достоверны на уровне 0,95 Совершенно иная картина обнаруживается в случае низкорослого самоклона № 184. Во-первых, при выращивании на контрольной среде проростки этого мутанта имели более высокий химический потенциал воды в тканях, чем исходный сорти более низкое эквивалентное осмотическое давление. Во-вторых, присутствие в среде выращивания ГК привело к достоверному снижению ХПВ в тканях проростков сомаклона практически до уровня исходного сорта и соответствующему возрастанию эквивалентного осмотического давления. В-третьих, средние размеры колеоптиля совершенно не изменились под влиянием ГК, из чего следует, что значительное повы-шешге эквивалентного осмотического давления в тканях низкорослого мутанта под влияние ГК, очевидно, связано с ограниченной способностью его клеток к росту растяжением.

Развитие растеши! сомаклонов

Как известно, скорость прохождения фенологических фаз определяется, наряду с генетическими особенностями того или иного сорта, конкретными агрометеорологическими условиями, складывающимися во время

вегетации. С наибольшей точностью можно установить фазы всходов, кущения и колошения, что широко используется как в практической работе агрономов, так и в исследованиях по физиологии развития пшеницы (Ку-маков, 1980).

Фенологические наблюдения, выполненные нами показали, что среди сомаклонов встречаются формы как с более коротким, так и с более продолжительным периодом «всходы - колошение», чем у исходных сортов. В ходе полелых испытаний сомаклонов, подвергавшихся стрессу обезвоживания in vitro, мы обратили внимание на увеличенную продолжительность периода «всходы-колошение» у форм, отобранных на 20 %-м ПЭГе (табл. 7). Более подробное изучение этого якления при параллельном выращивании образцов в открытом грунте и в засушшке позволило установить, что увеличение сроков развития растений примерно на 1,5 дня происходило только при выращивании сомаклонов в условиях естественных осадков и температур, что отразилось и на увеличении суммы эффективных температур. При дефиците влаги, сопровождавшемся увеличенными температурами, время от всходов до колошения у сомаклонов не отличалось от такового у исходных сортов, соответственно не бьио обнаружено и различий по сумме эффективных температур.

Таблица 7

Продолжительность периода «всходы-колошение» у сомаклонов пшеницы, подвергавшихся стрессу обезвоживания in vitro

Сорт, образец Селективная среда Период "всходы-колошение", ДНИ

Ершовская 32 -- 42

Ск. 192 ЛС+ПЭГ 10 42

Ск. 347 ЛС+ПЭГ 10 43

Ск. 162 ЛС+ПЭГ 20 44

Ск. 177 ЛС+ПЭГ 20 44

Ск. 184 ЛС+ПЭГ 20 43

Таким образом, воздействие стресса обезвоживания на культивируемые клетки пшеницы приводит к отбору сомаклонов, развитие которых тормозится в большей степени пониженными положительными температурами, чем высокими. Другими словами, температурный оптимум таыгх форм сдвинут в сторону более высоких температур по сравнению с исходными сортами. Поскольку границы зон влияния температур на растение детерминированы генетически (Дроздов с соавт., 1984), то изменение тер-морезистентносги, являющейся интегральным показателем обмена веществ, служит еще одним доказательством тотальной перестройки биохимических процессов, индуцированных в изолированных клетках пшеницы под влиянием стресса обезвоживания.

Качество клейковины зерна сомаклонов пшеницы

Поскольку качество клейковины гапенщы в основном определяется ее белковым комплексом (Конарев, 1980), обнаруженные изменения в элект-рофоретических спектрах глиадинов вполне вероятно могли отразиться на параметрах клейковшш, связанных с ее технологическими свойствами. Для экспресс - анализа качества клейковины сомаклонов нами бьи разработан высокопроизводительный метод, требующий минимального количества зерна (2-3 г) и обладающий высокой точностью. Указанный способ включает дезинтеграцию зерна до шрота или муки, суспендирование частиц в 0,1 Н растворе молочной кислоты, добавление флуоресцентного зонда АНС и наблюдение за динамикой его флуоресценции во времени. О качестве клейковины судили по рядупараметров, зависящих от стабильности суспензш! муки или шрота. Установлено, что сомахлоны сорта Б 32, полученные из каллус-ных культур, выращенных на среде ЛС, достоверно превышали исходный сорт по двум флуоресцентным параметрам, которые имеют отрицательную корреляционную связь с качеством клейковины. Оценка 14-ти сомаклонов сорта Е 32, отобранных на стадии каллусных культур на среде с низким химическим потенциалом воды (-36,6 Дж/моль; вариант ЛС+ПЭГ 20) не выявила каких-либо отличий от исходного сорта по всем изученным параметрам качества. В тоже время сомаклон № 184 из этой группы имел повышенное (хотя и недостоверное) значение параметра Р,. Повторное введение в культуру соматических тканей этой формы и получение вторичных сомаклонов сохранило эту тенденцию, а различия носили достоверный характер. Это означает, что повторное культивирование соматических тканей пшеницы на среде с низким химическим потенциалом воды привело к улучшению качества клейковины, т.к. параметр Р, имеет положительную коррелятив-н\ю связь с физическими свойствами клейковины (растяжимость, показатель ИД К).

Сомаклоны сорта С 46, полученные из каллусных культур, выращенных на стандартной среде ЛС, не изменили ни одного параметракачества клейковины по сравнешпо с исходным сортом. В тоже время 10 %-й ПЭГ (ХПВ -20,5 Дж/моль) индуцировал у сомаклонов увеличение показателя Рг Кроме того эти формы имели сниженную величину показателя Ф0/Р,, который положительно коррелирует со степенью разжижения теста по фаринографу. Следовательно, пониженный уровень данного показателя означаетулучшениерео-логических свойств клейковины сомаклонов.

Наибольшее количество параметров, претерпевших изменения, обнаружены у сомаклонов С 46, отобранных на среде с низким химическим потенциалом воды (вариант ЛС+ПЭГ 20). Два го этих параметров Ф0 и Ф,, связанные с содержанием клейковины, оказались несколько сниженными по сравнению с исходным сортом. Также сниженным был параметр Ф5, однако, поскольку его величина положительно коррелирует с расплываемостъю клейковины, это свидетельствует об улучшении ее ф изических свойств. В таком же соотношении у сомаклонов находится параметр Кс, связанный отр1щателыюй связью с валориметричес-

ким числом. В данном случае он имел пониженное значение, что обусловлено улучшением реологических свойств теста

Таким образом, использование для культивирования каллусных тканей пшеницы питательных сред с низким химическим потенциалом воды приводит к улучшению ряда параметров, характеризующих качество клейковины, которое, как правило, обусловлено прочностью ее белкового комплекса. Вполне вероятно, что в условиях длительного обезвоживания среди каллусных клеток отбираются генотипы впоследствии способные синтезировать запасные белки с более прочной структурой.

Влияние обезвоживания каллусных культур на частоту проявления признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов

Проявление разнообразных мутаций под воздействием стресса обезвоживания с учетом предполагаемого механизма влияния этого фактора на структурно-функциональные свойства биополимеров, навело нас на мысль о его возможном вмешательстве в процесс рекомбинации хромосом у сомаклонов гибридного происхождения.

С целью проверки этого предположения была создана модельная гибридная популяция от скрещивания яровых мягких пшениц Альбидум 28 и селекционной формы N 35/5. Альбидум 28 высокорослый засухоустойчивый сорт с безостым колосом и белым зерном; форма N 35/5 несет в себе черты пшеницы интенсивного типа: более требовательна к наличию влаги, имеет укороченный стебель, разновидность - эритроспермум (остистая с красным зерном).

Часть зерновок И 1, полученных от скрещивания, использовали доя вычленения незрелых зародышей и индукции у них каллусообразования, остальные доращивали до полной зрелости. Каллусные культуры в дальнейшем доращивали по принятой в наших исследованиях методике на двух средах - стандартной ЛС и содержащей полиэтиленгликоль в концентрации 20 % (ЛС + ПЭГ 20), а затем из них регенерировали растения.

Анализ гибридных растений первого поколения, а также регенеран-тов И 0, которые соответствовали генерации И 1, показал полную однородность материала по фенотипу: в обоих случаях растения были апикальными и краснозерными. Во втором (Б 2 и К 1) и третьем поколениях 0? 3 и И. 2) наблюдали расщепление по указанным признакам, комбинация которых укладывалась в шесть фенотипических классов растений: безостые белозерные, апикальные белозерные, остистые белозерные, безостые крас-нозерные, апикальные краснозерные, остистые краснозерные. Различия по частотам фенотипических признаков в популяциях оценивали с использованием критерия соответствия - (Рокицкий, 1974), а величину разнообразия при помощи меры информации Шеннона -1 (Жученко, Король, 1985). В таблице 8 приведены результаты обработки данных по частотам фенотипических классов в соответствии с указанными выше критериям. Высокий уровень значения х2, в случае варианта И. 2 ЛС+ПЭГ 20 означает, что

расщепление по качественным признакам в этой популяции не соответствует расщеплению в популяции F 3. Обнаруженные отклонения частот фенотипических классов в популяции R 2 JIC оказались статистически не достоверными. Однако сравнительный анализ двух экспериментальных вариантов (х\) показал, что между ними существуют не случайные различия. Что касается степени разнообразия, то она в обеих популяциях R 2 была выше (Д1 ф 0), чем в контрольной популяции F 3.

Таблица 8

Оценка соответствия и разнообразия по качественным признакам в гибридных популяциях пшеницы, прошедших отбор in vitro

Поколение Вариант отбора Кол-во раст. х2, < I Д1

F3 — 325 -- 1,701342 -

R2 ЛС+ПЭГ 20 766 16,53* — 1,718167 0,0168

R2 ЛС 881 9,77 19,50* 1,721055 0,0197

Примечание: * - различия достоверны на уровне 0,95

Получение сомаклонов пшеницы, экспрессирующих засухоустойчивость в половых поколениях

Выбор адекватной селективной схемы для отбора клеточных культур, устойчивых к стрессу обезвоживания

Доза действующего фактора и способ наложения давления отбора in vitro - два главных компонента, составляющие основу методик клеточной селекции, которые описываются как ряд последовательных шагов в виде некой схемы селекции. В настоящее время среди исследователей нет единого мнения относительно преимуществ той или иной схемы отбора на клеточном уровне. Одни авторы (Nabors, 1982) полагают, что необходима длительная ступенчатая селекция с постепенным усилением селективного давления, приводящая к обогащению культур клетками, устойчивыми к наложенному фактору. Другие (Conner, 1986), предлагают проводить отбор однократно, на сильном селективном фоне, считая при этом, что в данном случае выживут только мутировавшие клетки, устойчивые к стрессовому воздействию, в то время как неустойчивые погибнут, не успев адаптироваться. Поэтому ступенчатая селекция с постепенным увеличением селективного давления должна приводить к физиологическим адаптационным изменениям в клеточной культуре и не будет способствовать отбору клеток с генетической устойчивостью.

Отбор каллусных культур осуществляли по нескольким схемам ступенчатой селекции, которые отличались начальным уровнем селективного давления, соответствующим зонам толерантности,-стресса и летальности на дозо-вых кривых. Прямая селекция была представлена одной схемой, как частный случай ступенчатой селекции с высокой дозой наложенного в первом пассаже

фактора в зоне летальности. Оказалось, что, если летальная доза применяется уже в 1-ом пассаже (схема 3), ее ингибирующий эффект проявляется в большей степени, чем в случае постепенного нарастания мощности воздействия.

При этом полное угнетение морфогенетических функций, наблюдаемое при очень сильных дозах воздействия, не исключает возможности существования устойчивых к осмотическому стрессу клеток, «кооперативно» гибнущих в каллусной массе . В связи с этим была разработана схема селекции, предусматривающая возможность размножения устойчивых клеток в отсутствие селективного давления. Она состояла в том, что после каждого пассажа на среде с ПЭГом жизнеспособные культуры пересаживали на каллусоген-ную среду ЛС без осмотика (схема4). Оказалось, что дажев тех случаях, когда после осмотического стресса регенерация была полностью подавлена, подращивание каллусных культур на среде без ПЭГа несколько восстанавливало способность к развитию растений.

Однако технологичность той или иной схемы отбора не гарантирует сохранение селектируемого пргонака в последующих поколениях. В качестве теста на стабильность пргонака устойчивости (Гонзалес, Уидхолм, 1989) было использовано вторичное культивирование на селективной среде тканей, ранее отобранных in vitro сомаклонов, что можно представить как одну из модификаций ступенчатой клеточной селекции.

Эксперименты показали, что ПЭГ в концентрации 10% действовал на ткани сомаклонов, отсел ектнрованных ранее на этом же уровне стресса, в одних случаях как стимулятор процессов регенерации (Ск. NN 41,45), в других, по-прежнему, как ингибитор (Ск. N 56). Каллусные ткани сомаклонов, отобранных ранее на 20%-м ПЭГе, по вторичной схеме подвергали воздействию такой же мощности, доза которой соответствует зоне легальности для первичных культур. Как видно го таблицы 9, регенерационная способность этих образцов достоверно не отличалась оттаковойконтрольных вариантов, в качестве которых служили каллусные ткани, как самого сомаклона, так и исходного сорта, выращенные на стандартной среде ЛС.

Таблица 9

Регенерационная способность каллусных культур, прошедших вторичный отбор на 20 % полштнленгликоле

Образец Среда Кол-во каллусов Кол-во регенератов %

Ершовская 32 ЛС 40 17 45,5

Ск. № 184 ЛС 33 13 39,4

Ск. № 184 ЛС+ПЭГ 20% 103 26 25,2

F =2,54 НСР= --

Саратовская 46 ЛС 56 41 73,2

Ск. № 169 ЛС 32 19 59,4

Ск. № 169 ЛС+ПЭГ 20% 54 37 68,5

F =0,89 НСР= --

Эксперименты по реализации схемы вторичного отбора показали, что стабильность признака устойчивости у некоторых сомаклонов сохраняется через половое поколение, однако технологичность такого приема повышения устойчивости каллусных культур не очень высока, поскольку требует значительных затрат времени на осущестатенис всего цикла работ, включающего семенное размножение регенерангов.

Анализируя полученные результаты, можно видеть, что факторами ин-гибирования мор фсгенетической активности каллусных культур пшеницы являются стрессовая доза осмотика, конкурирующего с клетками за воду, и количество пересадок, которым подвергались эксплантаты. Синер-гическпй эффект, возникающий при этом, приводит почти к полной потере регенерационной способности каллусных культур уже во 2 - 3 пассаже. В первом пассаже подобное воздействие оказывает доза осмотика, находящаяся в зоне летальности. Поэтому с технологической точки зрения прямая схема отбора на жестком фоне представляется более предпочтительней, чем ступенчатая, поскольку позволяет осуществлять наиболее короткий культуральный цикл, значительно сокращая сроки получения сомаклонов. Еще одним преимуществом одноэтапного отбора устойчивых культур является существенная экономия расходуемых материалов, что связано уменьшением как числа пересадок, так и стартового количества каллусных культур в 1 пассаже. В основе указанных преимуществ лежит тот факт, что после первого пассажа каллусные культуры пшеницы имеют достаточно высокую регенерационную способность, которая объясняется наличием еще незначительных нарушений в геноме клеток на данном этапе культивирования. Однако, эта же причина может ограничить степень изменчивости сомаклонов, полученных по короткой схеме.

Другими словами, исследователь должен вызвать достаточно высокую степень изменчивости в культивируемых клетках при сохранении ими способности к регенерации фертальных растений. В связи с этим было изучено влияние нулевого и первого пассажей на степень сомаклональной изменчивости пшеницы на примере сорта Е 32, продуцирующего сомаклоны с измененным (изумрудным) цветом, тогда как растения исходного сорта имеют на поверхности сизый налет. Как видно из таблицы 10, среди сомаклонов, регенерированных из каллусных культур, выращенных на инициальной среде ЛС (0 пассаж), доля измененных семей составляет 11 %. Субкультавирование эмбриогешшх каллусных культур в I пассаже на среде ЛС без гормонов увеличило долю изумрудных сомаклонов в 2 раза. Использование в I пассаже среды ЛС, содержащей 2,4-Д в обычной концентрации, привело к возрастанию количества мутантных форм до 48 %. Подобная величина сомаклональной изменчивости является весьма приемлемой для целей клеточной селекщш. Определение степени сопряженности между условиями культивирования каллусных культур и изумрудным цветом сомаклонов показало достоверно высокую ассоциацию между этим признаком и культивированием эксплантатов в I пассаже именно на гор-монсодержащей среде ЛС , Полученные результаты позволяют сделать

вывод о том, что одноступенчатая схема селекции, кроме технологических преимуществ, в наибольшей степени сглаживает возникающее диалектическое противоречие между необходимостью индукции генетической изменчивости в культивируемых клетках и отбором мутантных, но полноценных генотипов, способных к регенерации растений и сохраняющих вероятность наличия высоких показателей хозяйственно-ценных признаков, чего невозможно добиться вследствие накопления кариологических нарушен».й при длительном перекультивировании клеток пшеницы (Юркова, Левенко, 1985).

Таблица 10

Влияние условий культивирования каллусных культур пшеницы на изменчивость сомаклонов Е 32 по цвету растения

Вариант Кол-во семей Кол-во семей с Доля семей с

изумрудным изумрудным

цветом растения цветом растения,

ЛС 0 пас. 18 2 11,1

Л С б/г 1пас. 13 3 23,1

ЛС 1 пас. 25 12 48,0

Б =3,89* НСЕ= 29,3

Примечание: * - результаты достоверны на уровне 0,95

Оценка засухоустойчивости сомаклонов пшеницы на вегетирующих

растениях

С целью выявления экспрессии засухоустойчивости у сомаклонов пшеницы образцы выращивали в засушнике, полностью изолированном от естественных осадков, на фоне экстремально высоких температур (до +47° С). В вегетационных опытах участвовали сомаклоны не ранее второго семенного поколения (И 2), чтобы снизить возможное влияние эпигенетических эффектов, возникающих под воздействием биологически активных веществ при культивировании изолированных клеток.

Отселектированные сомаклоны испытывали на засухоурожайность в сравнении с исходными сортах'ч, оценивая при этом еще ряд признаков, характеризующих способность растений к росту в экстремальных условиях - массу растения, количество продуктивных побегов и высоту растения. По результатам этих испытаний в ранних половых поколениях Я2 - КЗ для сомаклонов сортов Е 32 и С 46 удалось отобрать формы, достоверно отличающиеся по засухоурожайности от исходных сортов (табл. 11). В тоже время даже предварительно отобранные семьи сомаклонов сорта С 55, полученные по тем же одноступенчатым схемам отбора, не превосходили исходный сорт по засухоурожайности.

Таблица 11

Некоторые агрономические признаки сомаклоиов пшеницы рашшх поколений, отобранных по критерию засухоурожайности

Схема отбора Сорт, сомакл. Поколение Масса зерна, г Масса растения, г Кол-во прод. побегов, шт. Высота, см

2.П.1 Ершовская 32 Ск. 82-24 ИЗ 0,07± 0,006 0,13± 0,008* 0,41±0,02 0,67±0,11* 1,0±0,00 1,1±0,07 35,0±0,9 37,5±0,7

Саратовская 46 Ск. 5-16 ИЗ 0,10± 0,007 0,18±0,017* 0,62±0,04 0,80±0,03* 1,1±0,02 1,1±0,05 42,1±0,4 42,2±2,4

Саратовская 55 Ск. 21-38 яз 0,11±0,012 0,12± 0,009 0,58±0,04 0,60±0,03 1,1±0,03 1,2±0,06 43,2±0,7 41,7±0,8

З.п.1 Ершовская 32 Ск. 65-84 Я2 0,22± 0,028 0,30±0,014 0,74± 0,05 0,79±0,03 1,2±0,07 1,2±0,07 36,4± 1,5 32,4±1,2

Саратовская 46 Ск. 39-67 яз 0,18±0,012 0,23± 0,010* 0,74±0,06 0,78±0,04 1,4±0,25 1,4±0,13 40,7± 1,8 43,0±0,7

Саратовская 55 С к. 10-60 Я2 0,63± 0,049 0,62± 0,046 1,77±0,18 1,97±0,19 1,9±0,13 2,1±0,04 72,8±2,3 73,6±2,2

Примечание:" - различия достоверны на уровне 0,95 С целью проверки наследован™ экспрессии засухоустойчтшосш семьи со-маклонов, показавшие в 1*2-113 превышение урожайности над контролем, выращивали в течение нескольких поколений в условиях естественных осадков и температур на участке открытого грунта, а затем вновь испытывали при остром дефиците влага и экстремально высоки?: температурах (табл. 12).

Таблица 12

Некоторые агрономические прнзпаки продвинутых поколешш сомаклонов пшеницы, отобранных в К2*БЗ по критерию засухоурожайности, выращенных в условиях засухи

Схема отбора Сорт, сомакл. Поколение Масса зерна, г Масса растения, г Кол-во прод. побегов, шт. Высота, см

2.п.1 Ершовская 32 Ск. 82-24 Я7 0,51± 0,03 0,45± 0,08 1,29±0,09 1,21±0,22* 1,2±0,06 1,3±0,11 67.6±2,6 59,5±2,8*

Саратовская 46 Ск. 5-16 Я7 0,72± 0,06 0,84±0,15 2,29±0,16 2,56±0,37 2,4±0,14 2,9±0,07 74,7± 1,4 68,3±3,9

З.п.1 Ершовская 32 Ск. 65-84 Я7 0,51±0,03 0,67±0,06* 1,29±0,09 1,59±0,14 и±о,об 1,5±0,12 67,6±2,6 58,5±3,2*

Саратовская 46 Ск. 39-67 117 0,72± 0,06 0,93±0,06* 2,29±0,16 2,764:0,04* 2,4±0,14 3,0±0,11 74,7± 1,4 72,3±2,2

Примечание:" - различия достоверны на уровне 0,95

Выращивание сомаклонов, полученных на средах с 20 %-м ПЭ-Гом (схема 3, п.1), в течение нескольких поколений без давления отбора в виде острого дефицита влаги не приводит к потере засухоустойчивости отселектированных форм, как это наблюдается в случае семей, отобранных на 10 %-м ПЭГе (схема 2,п. 1). Эти результаты свидетельствуют в пользу генетической природы повышения засухоустойчивости у сомаклонов, прошедших отбор in vitro сразу на максимально жестком фоне, без постепенного наращивания от пассажа к пассажу давления отбора.

Вследствие малочисленности сомаклонов, полученных по схемам ступенчатой селекции, среди них невозможно было производить отбор «+» - вариантов, и по этой причине они все подвергались!!; питаниям на засухоурожайность. Как видно из таблицы 13, ни один из сомаклонов, прошедших отбор в несколько этапов, не превышал исходные сорта по уровню урожайности в условиях острого дефицита влаги. Установить истинные причины отсутствия экспрессии засухоустойчивости у вегетирующих растений, инициальные клетки которых были устойчивы к обезвоживанию в изолированном состоянии, представляется весьма проблематичным. Однако, можно предполагать, что в данном случае это явление, скорее всего, связано с ростом количества хромосомных аномалий, возникающих в результате увеличения количества пассажей, которым подвергались каллусные культуры, вследствие чего клеточная устойчивость к обезвоживанию не сопровождалась увеличением урожайности в засушливых условиях.

Таким образом, из всех изученных селективных схем наиболее эффективной для получения сомаклонов, экспрессирующих засухоустойчивость в ряду поколений, оказалась схема 3, п. 1, которая предусматривает отбор клеточных культур на жестком фоне обезвоживания, создаваемом ПЭГом в концентрации 20%.

Засухоустойчивость сомаклонов, сохраняющих в условиях экстремальной засухи достаточно высокую синтетическую активность, по-существу, является суммарным выражением всех биохимических реакций (как конститутивных, так и индуцибельных), претерпевших изменения в результате сомаклональной изменчивости при культивировании изолированных клеток в условиях стресса обезвоживания. Как известно, сдвиг и суммарного баланса биохимических процессов, определяющих адаптацию растений при обезвоживании, могут быть выражены через состояние термодинамических параметров воды в тканях, которые указывают на соотношение реакций анаболизма и катаболизма при снижении химического потенциала воды в клетках (Зялалов, 1984).

Таблица 13

Некоторые агрономические признаки сомаклонов пшепицы, отобранных по схемам ступенчатой селекции, выращенных в условиях

засухи

Схема отбора Сорт, сомакл. Поколение Масса зерна, г Масса растения, г Кол-во прод. побегов, шт. Высота, см

2.П.2 Ершовская 32 сомакл. И5 0,51± 0,03 0,62±0,06 1,29±0,09 1,41±0,17 1,2±0,05 1,4±0,14 67,6±2,6 57,8±1,0*

Саратовская 46 сомакл. И5 0,73±0,06 0,63±0,05 2,29±0,16 1,97±0,12 2,4±0,14 2,3±0,18 74,7±3,2 67,01:1,4*

4.П.2 Ершовская 32 сомакл. Я5 0,51±0,03 0,49± 0,01 1,291:0,09 1,27±0,03 1,2±0,05 1,1±0,07 67,6±2,6 65,8±1,4

Саратовская 46 сомакл. Я5 0,73±0,06 0,76±0,21 2,29±0,16 2,18±0,56 2,4±0,14 2,1±0,27 74,7±3,2 69,3±4,3

Саратовская 55 сомакл. Я5 0,63*0,05 0,64±0,13 1,77±0,18 2,09±0,36 2,0±0,13 2,2±0,34 72,8*2,3 73,0±0,2

4,п.З Е 32 сомакл. КЗ 0,07± 0,006 0,07± 0,025 0,41± 0,02 0,40±0,08 1,0±0,00 1,0±0,02 35,0±0,9 33,5±3,7

Саратовская 46 сомакл. ЯЗ 0,10± 0,007 0,09± 0,027 0,62±0,02 0,65±0,16 1,2±0,02 1,3±0,17 42,1±0,4 41,4±3,8

4.П.4 Саратовская 46 сомакл. Я5 0,73±0.06 0,75± 0,03 2,29±0,16 2,46±0,15 2,4±0,14 2,1 ±0,27 74,7± 1,4 69,3±4,3

Саратовская 55 сомакл. ЯЗ 0,11±0,012 0,12±0,016 0,5 8± 0,04 0,65±0,09 1,1±0,03 1,1±0,12 43,2±0,7 44,4±1,4

5.П.З Саратовская 46 сомакл. 115 0,73± 0,07 0,75± 0,05 2,29±0,16 2,32±0,28 2,4±0,14 2,5±0,44 74,7±1,4 69,0±1,6

Определение термодинамических характеристик воды в нет старую щих растениях сомаклона N 65-84 показало, что они содержат в тканях больше воды по сравнению с Б 32 как в условиях орошения, так и засухи (табл.14). Кроме того, обращает на себя внимание небольшая величина изменений термодинамических характеристик воды у засухоустойчивых сомаклонов при выращивании на контрастных по влагообеспеченности фонах. Так, химический потенциал воды в тканях сомаклонов в условиях засухи снижался всего на 35 % по сравнению с орошением, в то время как у исходного соргга Е 32 почтив два раза. Понижение химического потенциала воды в растениях под действием засухи является комплексной величиной, которая зависит от уменьшения концентрации воды и направления биохимических реакций. Происходящие при этом процессы могут быть направлены как на повышение, так и на понижение химического потенциала воды в растении, либо оставаться нейтральными в этом отношении (Зялалов, 1984). В наших экспериментах падение

химического потенциала воды на единицу количества потерянной воды при переходе от орошаемого к засушливому фону у Е 32 было в два раза выше, чем у сомаклонов (табл. 14). Следовательно, под действием засухи в клетках засухоустойчивых сомаклонов происходят такие изменения, которые повышают химический потенциал воды, частично компенсируя ее физическую потерю.

На основании полученных результатов можно предположить, что среди каллусных клеток пшеницы, способных после длительного обезвоживания регенерировать растения, образуются варианты, приспособление которых к низкому химическому потенциалу воды осуществляется на генетическом уровне. При этом адаптация к дефициту влаги у растений-по-томств таких клеток связана как с повышенным содержанием воды в тканях, так и с увеличением ее активности, что обусловлено изменениями в метаболических процессах.

Таблица 14

, Термодинамические характеристики воды в растениях сомаклонов (К. 8) на разных по влагообеспеченности фонах

Фон выращивания Сорт, сомаклон С, % в, ед. активности воды хпв, Дж/моль Р, МПа Отношение ДХПВ/ДС

Орошаемый Ершовская 32 Самаклои 86,0±0,76 89,2±0,44* 0,9739± 0,0044 0,9840±0,00197» -5б,4±8,41 -40,69+4,86 3,13±0,47 2,25±0,27 -

Засушливый Ершовская 32 Самок лон 81,5± 1,15 86,5±0,47* 0,9593± 0,0051 0,9782^0,0013* -109,86±10,78 -55,48±3,43» 6,08±0,60 3,07±0,19» -11,9 -5,5

Примечание: * - различия достоверны на уровне 0,95 Причины возникновения мутаций в генетическом аппарате культивируемых клеток пшеницы достаточно известны, однако механизм отбора устойчи- • вых генотипов под воздействием селективных факторов еще требует многих уточнений. Согласно обсуждаемой триггерной модели адаптации растений к внешним воздействиям, изменение генетической структуры популяции клеток возникает под давлением среды такой мощности, которая вызывает состояние глубокого стресса, граничащего с прекращением жизнедеятельности живой системы (В ее олова с соавт., 1993). В результате гибели неустойчивых генотипов в этих условиях популяция обогащается мутантными клетками, способными противостоять новым параметрам среды. Именно в условиях подобного стресса, вызванного низким химическим потенциалом воды в среде, были отобраны каллусные культуры, давшие начало сомаклонам с повышенной устойчивостью синтетических процессов в условиях острого дефицита влаги. Показателем этого может служить стабильность химического потенциала воды в тканях растений сомаклонов при выращивании в условиях контрастных по влагообеспеченности.

Использование сомаклонов в практической селекции

С практической точки зрения среди сомаклонов, полученных в процессе выполнения данной работы, наибольший интерес представляют формы с наследственно измененными характеристиками, которые могут служить донорами тех или иных хозяйственно-ценных признаков (например, устойчивости к бурой ржавчине, короткостебельности или качества зер-нл).

Однако селекция полевых культур ведется прежде всего на повышение продуктивности новых сортов. Дажев острозасушливых условиях Юго-Востока Российской Федерации основная стратегия селекции яровой пшеницы направлена на скрещивание между собой лучших по продуктивности форм и выделение трансгрессивных по этому признаку селекционных номеров (Ильина, 1989).

Тот факт, что сомаклоны, отселектированные на стадии каллус-ных культур на средах с низким химическим потенциалом воды, обладают повышенной урожайностью в условиях экспериментальной засухи еще не означает проявления данного свойства в условиях естественной вегетации. В связи с этим мы провели испытания лучшего по засухоурожайности сомаклона № 65-84, полученного на базе сорта Ер-шовская 32, в течение 4-х лет, изучая его семенное потомство в экспериментальном севообороте на участках с естественным увлажнением (оптимальный фон) и искусственным ограничением влагообеспечения (лнмитирванный фон). Оценивали следующие показатели: массу зерна с одного растения, продуктивную кустистость и высоту растения. Адаптивные свойства исходного сорта и сомаклона определяли по комплексу признаков: коэффициенту мультипликативности (КМ) (Драгав-цев с соавт., 1984), индексу стабильности (ИС), показателю уровня стабильности сорта (Пусс) (Неттевич с соавт., 1985), показателям гомеос-татичности (НОМ и НОМ opt-lim) и селекционной ценности (Sc) (Хан-гильдин, 1978).

Проведенные испытания показали, что в условиях оптимального фона сомаклоны не отличались от исходного сорта ни по массе зерна с одного растения, ни по продуктивной кустистости (табл.15). Однако они были достоверно ниже по высоте, чем растения сорта Ершовская 32. При выращивании этих же форм на лимитированном фоне продуктивность и высота растений сорта Ершовская 32 заметно снизились по сравнению с оптимальным фоном, тогда как у отсе-лектированных in vitro сомаклонов уменьшения данных показателей не происходило.

Таблица 15

Продуктивность сомаклоыа № 65-84, выращенного на разных фонах влагообеспеченности

Сорт, сомоклон Масса зерна с Продуктивная Высота растения,

растения, г кустист., шт. см

Оптимальный фон влагообеспеченности

Ершовская 32 1,73 2,26 69,2

Ск. 65-84 1,73 1,92 52,3

Б 0,001 1,09 103,7*

НСР - - 3,6

Лимитированный фон влагообеспеченности

Ершовская 32 1,30 1,80 62,6

Ск. 65-84 1,89 2,03 54,1

¥ 5,59* 0,50 4,4

НСР 0,58 -- -

Примечание:" - критерий И достоверен на уровне 0,95 Анализ адаптивных свойств по массе зерна с одного растения позволил установить, что сомаклоны проявили большую степень адаптивности, чем исходный сорт по всем изученным признакам (табл. 16).

Таблица 16

Адаптивные свойства сомаклова пшсшщы № 65-84 по массе зерна с

одного растения

Сорт, Признаки адаптивности и стабильности

свмаклон

ИС Пусс М НОМ НОМ орг-Ит вс

Ершовская 32 100,0 100,0 2,08 3,07 2,54 0,74

Ск. 65-84 120,8 125,0 1,92 3,71 3,46 0,86

Таким образом, приобретение сомаклоном способности экспрессиро-вать более высокую урожайность при экспериментальной засухе не снижает его адаптивных свойств по сравнению с исходным сортом в условиях открытого грунта.

Всего за годы селекционных испытаний (с 1989 по 1999) в селекционные лаборатории было передано свыше 2000 семей сомаклонов, полученных как из промышленных сортов, так и из перспективных гибрццныхком-бинаций. Несмотря на то, что некоторые формы включались селекционерами в скрещивания в качестве доноров хозяйственно-полезных признаков, в чистом виде ни один из сомаклонов не поднимался выше питомника контрольных испытаний.

Данное обстоятельство, очевидно, не связано с потенциальной ущербностью сомаклонов. В этом можно убедиться, проанализировав данные по урожайности сомаклона № 421 за 4 года, два из которых он испытывал-ся в лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы НИ-ИСХ Юго-Востока, а остальные два года на Ершовской опытной станции орошаемого земледелия (табл. 17). Как видно из таблицы, в среднем за 4 года изучения в двух географически удаленных точках сомаклон №421 превышал по урожайности исходный сорт С 55 на 1,2 ц/га. Однако, данная форма была снята с официальных испытаний, поскольку не превосходила по урожайности сорт-стандарт Саратовскую 58. В связи с этим объяснение затрудненного продвижения сомаклонов по селекционным питомникам, по-видимому, кроется в сохраняющейся высокой эффективности традиционной селекционной технологии, которая основана на массовой оценке разнообразных гибридных популяций, что позволяет выделять большое количество перспективных трансгрессивных форм. При этом окончательное решение о предпочтении того или иного селекционного номера может быть принято на основании изучения данных о десятках почти равноценных селекционных форм. Введение же в культуру тканей перспективной селекционной линии отодвигает испытания, полученных от нее сомаклонов, как минимум на два года, что объясняется как длительностью самого культурального цикла, так и необходимостью размножения семенных потомств регенерантов с целью получения достаточного количества семян для проведения полевых испытаний. За это время, как показывает наш опыт, происходит смена лидера, и в качестве нового сорта передается уже другая форма. Введение же в культуру тканей от нескольких сотен перспективных линий из более ранних поколений весьма сложно технически и экономически нецелесообразно.

Таким образом, методы культуры соматических тканей, повышающие частоту мутаций, необходимо использовать в качестве дополнительного источника генетического разнообразия пшеницы.

Для непосредственной проработки гибридного материала в процессе селекции в большей степени подходит метод стимуляции генеративных клеток к развитию гаплоидных растений при культивировании пыльников на средах с низким химическим потенциалом воды. В этом можно убедиться на примере создания дигаплоидного сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64.

Гибридная популяция Рритроспермум 1976 х Саратовская 60), на базе которой создан этот сорт, была получена в лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока. Пыльники, изолированные от гибридных растений, инокулировали на питательную среду РОТАТО-2 с низким химическим потенциалом воды за счет высокого содержания сахарозы. Всего на этой среде было прокультивировано 1462 пыльника, на которых сформировались гаплоидные эмбриоиды, давшие 39 зеленых гаплоидных растений.

Таблица 17

Полевые испытания сомаклоиа яровой мягкой пшеницы № 421 в двух географически удаленных пунктах

Год изучения Пункт изучения Урожайность, ц/га

Саратовская 55 Ск. 421

1991 НИИСХ Ю.-В. 15,2 15,6

г. Саратов

1992 -II- 33,0 35,1

1993 Ершовская ОСОЗ, 9,3 12,0

г. Ершов

1994 -II- 18,4 18,2

В среднем за

4 года 19,0 20,2

Дигапловдные линии (29 игг.), полученные в результате обработай регенератов колхицином, гоуч&тись по общепринятой схеме селекционного процесса. Одна из этих линий -С-2045 - стала родоначальной линией сортаСаратовская 64. За все годы в основном конкурсном испытании линия превышала по продуктивности лучший районированный стандарт - Саратовскую 58 (табл. 18).В острозасушливом 1995 году сорт Саратовская 64 превысил по продуктивности лучший стандарт Саратовскую 58 на 2,2ц/га. Повышенная продуктивность Саратовской 64 обеспечивается за счет большей продуктивной кустистости и густоты стеблестоя перед уборкой, а также за счет большей массы 1 ООО зерен. По данным экологического испытания в 1995-1997 г.г. в экспериментальном хозяйстве НИИСХ Юго-Востока новый сорт превысил Саратовскую 58 в среднем 3,6 ц/га, на Ер-шовской ОСОЗ - на 2,1 ц/га и на КраснокутскойСОС - на 1,7 ц/га. Многолетние полевые испытания сорта Саратовская 64 в экстремальных погодно-климатичес-ких условиях показали, что гомозиготность и гомогенность сорта не снизили его адаптивных свойств, которые обеспечиваются за счет способности к адаптации, заложенной в самом геноме.

Таблица 18

Продуктивность дигаплоидного сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (данные ОКИ НИИСХ Юго-Востока).

Сорт Урожайность по годам, ц/га Среднее,

1995 1996 1997 1998 1999 ц/га

Саратовская 58 10,5 23,5 23,9 12,3 27,1 19,5

Саратовская 64 12,7 25,2 24,4 10,7 27,8 20,2

Выводы

1. Угнетение ростовых процессов пшеницы, вызванное воздействием факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro, - абсцизовой кислотой, Ь-азетадин-2-карбоновой кислотой и пониженным химическим потенциалом воды, осуществляется по универсальному принципу, а именно - в соответствии с механизмом биологического триггера. Независимо от внутриклеточных мишеней эти факторы в большей степени воздействуют на рост клеток растяжением, чем на их биосинтетическую активность.

2. Динамика угнетения процессов морфогенеза клеточно-тканевых систем пшеницы, пролифелирующих in vitro, под воздействием низкого химического потенциала воды подчиняется закономерностям функционирования биологического триггера. Границы зоны летальности на дозовой кривой для каллусных культур соответствуют таковым для целостных проростков. Абсцизовая и Ь-азетидин-2-карбоновая кислоты даже в высоких дозах (до 50 мг/л) не вызывают выраженного ингибирования роста и развития каллусных культур пшеницы.

3. Механизм поддержания водного гомеостаза как проростков, так и каллусных культур пшеницы не в состоянии стабилизировать уровень химического потенциала воды в тканях при его снижении в культуральной среде до значений, вызывающих переход биологической системы в зону летальности.

4. На основании исследования поведения маркерной системы полиморфного семейства эстеразы проростков пшеницы при снижающейся величине химического потенциала воды в среде показано, что адаптивные реакции на молекулярном уровне осуществляются также по принципу биологического триггера, а траектории дозовых кривых находятся в противо-фазе для генотипов, контрастных по засухоустойчивости.

5. Культивирование каллусных тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды в течение длительного времени вызывает заметные изменения в составе суммарных водорастворимых белков и полиморфной системы фермента эстеразы. Несмотря на то, что характер этих изменений связан с генотипическнми особенностями сортов-доноров каллусных тканей, адаптация белковых систем при обезвоживании клеток осуществляется в едином ключе - в направлении повышения структурной жесткости белковых макромолекул.

6. Изменения в полиморфных белковых системах (глиадины, изофер-менты) обнаруживаются у значительной части половых потомств клеточных культур, устойчивых к низкому химическому потенциалу воды. Возникшие изменения наследуются в ряду самоопыленных поколений сомак-лонов и при гибридологическом анализе показывают менделевское расщепление признаков.

7. Величина снижения химического потенциала воды в среде культивирования тканей пшеницы определяет частоту появления сомаклональ-ных вариантов, несущих мутации по глиадинкодирующим локусам. Наи-

более низкий химический потенциал воды способствует отбору сомакло-нов с изменениями в глиадинкодирующих локусах, расположенных в геноме D.

8. Подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическому потенциалу воды, несет мутацию, редуцирующую длину главного побега растений. Данная мутация имеет промежуточное наследование с неполным доминированием и связана со снижением чувствительности сомаклонов к экзогенному гиббереллину.

9. Взависимосгаоггеноптапшеницы, служившего донором культивируемых тканей, отбор каллусных культур на среде с низким химическим потенциалом водыможет сопровождаться повышением у сомаклонов устойчивости к возбудителю бурой ржавчины, наследуемой в ряду поколений.

10. Показана целесообразность использования одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с очень низким химическим потенциалом воды, который обеспечивает оптимальное соотношение между частотой мутаций, возникающих в культивируемых клетках, и способностью каллусных культур к регенерации растений. Определен подход к установлению эффективной дозы селективного давления, заключающийся в определении зоны летальности на дозовой кривой для генотипа пшеницы -донора изолированных тканей.

11. Селекция на устойчивость к низкому химическому потенциалу воды в культуральной среде позволяет получать растения с повышенной устойчивостью к засухе, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении биосинтетической активности в условиях недостатка влаги, что реализуется в более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с исходным сортом.

12. Повышенная засухоустойчивость сомаклонов экспрессируется в ряду половых поколений и сохраняется при вторичном введении в культуру соматических тканей этих форм.

13. Культивирование соматических тканей пшеницы гибридного происхождения на среде с низким химическим потенциалом воды вызывает изменения в соотношении качественных признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

Создана коллекция, насчитывающая около 1000 сомаклонов, отобранных на устойчивость к различным факторам, имитирующим стресс обез-воживати in vitro, которая используется как в селекционных программах, так и в научных исследованиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. ДьячукПА., ДьячукТ.И., Прокофьева И.Г., Тучин C.B. Возможности и перспективы использования гаплоидии в селекции пшеницы и ячменя // Селекция и семеноводство зерновых культур. Саратов, 1986. - С. 46-50.

2. Тучин C.B., Носова H.H., Иванова Ю.Е. Влияние осмотического стресса на морфогенетическую активность каллусных культур яровых

пшениц II Тез. докл. Всесоюзн. конф. по биотехнологии злаковых культур. -Алма-Ата, 1988.-С. 71-72.

3. Тучин C.B., Носова H.H., Архипова JI.H. Разработка методических приемов селекции пшеницы на засухоустойчивость в культуре изолированных тканей И Результаты селекции полевых культур и новые методы создания исходного материала. Саратов, 1989. - С. 25-31.

4. Тучин C.B., Носова H.H., Архнпова JI.H., Дьячук П.А. Изучение сома:;, опальных вариантов пшеницы, отселектиронанных in vitro к.. ; тойчивость к осмотическому стрессу // Тез. докл. Всесоюзн. конф по генетике соматических клеток в культуре, посвященная памяти Н.И. Шапиро (Звенигород, 12-15 октября 1989 г.). - М., 1989. - С. 54

5. ДьячукП.А., Носова H.H., Тучин C.B., ИвановаЮ.Е. Особенности каллусообразован'.)я и регенарции растений в культуре соматических тканей яровых сортов мягкой м твердой пшениц // Сельхозбиология. - 1990. -№ 3. - С. 56-59.

6. Тучин C.B., Васильева JI.H,, Сахаджи Т.Н. Экспрессия засухоустойчивости у сомаклональных вариантов пшеницы, отселектированных in vitro //1 Всесоюз. симпоз. «Новые методы биотехнологии растений». - Пущино, 1991. - С. 92.

7. Тучин C.B., Архипова JI.H., Носова H.H., Сахаджи Т.Н. Оценка различных селективных схем для отбора на засухоустойчивость в культуре изолированных тканей пшеницы // Биологические основы селекции. - Саратов, 1991. - С. 41-48.

8. Тучин C.B., Итальянская Ю.В. Сомаклональная изменчивость пшеницы по цвету растения // Материалы VI съезда общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. Минск, 23-27ноября 1992г.-Минск, 1992. - С. 156.

9. Тучин C.B., Архнпова JI.H., Носова H.H., Сахаджи Т.Н., Дьячук П.А. Способ изменения высоты растений пшеницы //Авторское свидетельство СССР. № 1738171А1. Зарег. 08.02.92 г.

10. Сахаджи Т.Н., Тучин C.B. Скрининг сомаклональных вариантов пшеницы по высоте растения // Тез.докл. Международ, научно-практ. конф. молодых ученых и спец. по пробл. интенсификации с/х. Шортанды, 1993. 4.2. Шортанды, 1993. - С. 24-25.

11. Тучин C.B. Результаты клеточной селекции на засухоустойчивость зависят от геноти ла донорных растений // «Новые методы биотехнологии растений». II Рос. симпоз. (18-20 мая 1993 г., г.Пущино). - Пущино, 1993. -С. 214.

12. Тучин C.B., Дьячук П.А. Получение засухоустойчивых форм пшеницы одноступенчатым отбором каллусных культур // Сельхозбиология. -1994. -№ 5. - С. 21-23.

13. ТучинС.В., ДьячукПА., КозловаА.Ю. Изучение селектирующего действия азетединкарбоновой кислоты на каллусные культуры пшеницы II Фгои-ол. и биохимия культурных растений, 1994. - 26, № 6. - С. 576-580.

14. Тучин С.В. Экспрессия и наследование термодинамических параметров воды у засухоустойчивых сомаклонов пшеницы // Генетика. - 1994. - 30, прилож. - С. 160.

15. ДьячукП А, ТучинСВ., ДьячукТ.И., ДухаревН А., Васькин Д.В. Биогехно-логичеоше исследования //Селекция с/х культур. - Саратов, 1994, с. 256-266.

16. Tuchin S.V., Italianskaya Yu.V. The drought-resistant somaclones of spring bread wheat //Annual wheat newsletter. - 1994. - 40. - P. 181.

17. Тучин C.B. Клеточная селекция пшеницы и перспективы создания адекватной генетико-физиологической модели признака засухоустойчивости // Итоги и перспективы исследований в селекцли, семеноводстве и лавд-шафтно-экологическом земледелии. - Саратов, 1995. - С.30-31.

18. Тучин С.В., Юсупов Д.А., Козлова .'..10. Сомаклональная изменчивость пшеницы по устойчивости к бурой ржавчине // Всероссийски! съезд по защите растений. Тез.докл. (СПб, декабрь, 1995). - СПб, 1995. - С.257.

19. Tuchin S.V., Italianskaya Yu.V. Low chemical potential of water as a mutagen for callus-derived wheat somaclones // Annual wheat newsletter. - 1995. -41. - P. 162.

20. Tuchin S. V. Thermodynamic analysis of water in tissues of wheat drought-resistant somaclones //Annual wheat newsletter. -1995. - .41. - P. 162.

21. Дьячук Т.И., Тучин C.B., Столярова C.B., Итальянская Ю.В., Саф-ронова Н.Ф. Использование методов биотехнологии в селекции пшеницы и ячменя // Селекция, семеноводство и технология возделывания полевых культур. - Саратов, 1996. - С. 41-48.

22. Тучин С.В., Козлова А.Ю., Юсупов Д.А. Об устойчивости сомак-лональных вариантов яровой мягкой пшеницы к возбудителям бурой ржавчины II Сельхозбиология. - 1996. - № 5. - С. 112-114.

23. Tuchin S.V. Molecular-ecological approach to plant cell selection for drought resistance//5-th Inter. "Wheat Conf. June 10-14,1996, Ankara, Turkey. Abstr. - Ankara, 1996. - P. 404.

24. Tuchin S.V. Yusupov D.A., Kozlova A.Yu. The leaf rust resistance of wheat somaclones //Annual wheat newsletter, 1996. - 42. - P. 171.

25. Tuchin S.V. Use of molecular-ecological principles for plant cell selection for drought resistance//Annual wheat newsletter. - 1996. - 42. - P. 171.

26. Дьячук Т.И., Дьячук П.А., Тучин C.B. Биотехнологические проблемы в создании исходного материала для селекции пшеницы II Проблемы селекции яровой пшеницы. - Саратов, 1996. - С. 13-14.

27. Тучин С.В. Стресс обезвоживания как фактор формообразования у пшеницы. Моделирование в клеточной культуре // Тезисы междунар. научн. конф. «Развитие научного наследия академика Н.И.Вавилова».Са-ратов, ноябрь 1997. 4.1. - С. 47-49.

28. Кибкало И.А., Тучин С.В., Бебякин В.М. Сопряженность между характеристиками гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе клейковины и признаками ее качества // Тезисы междунар. Научн. конф. «Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова». Саратов, ноябрь 1997. 4.1. С.67-68.

29. Tuchin S. V. The interaction of 1 -aniImonaphtalme-8-sulfonic acid with membranes and protons of wheat callus //Annual wheat newsletter. -1997. - 43. -P. 199.

30. Italianskaya Y.V., Tuchin S.V. The leaf rust-resistatnt somaclone of spring bread wheat // Annual wheat newsletter. - 1997. - 43. - P. 200.

31. Тучин C.B., Итальянская Ю.В. «Способ получения наследственно измененных форм пшеницы» Патент на изобретение № 2095971. Зарег. в Государственном реестре изобретений 20.11.19°7 г.

32. Тучин С.В., Кибкало И.А. Взаимодействие флус/есцентного красителя 1-анилинонафталин-8-сульфоната с бачками пшеницы //Проблемы увеличение производства и: ювышения качества зерна в Российской Федерации. Тез.докл. научно-практ. Km ;. «Проблемы повышения качества зерна», 2-3 июля 1997 т. НИИСХ }Oro-F;<':oKa. - Саратов, 1997. -С.36-37.

33. Кибкало И.А., Тучин С.В., Бебякин В.М. Сопряженность между традиционными показателями качества клейковины и характеристиками гидрофобных взаимодействий в «группах качества» яровой мягкой пшеницы // Вопросы повышения устойчивости зернового хозяйства в условиях Поволжского региона (Тез. докл. научно-практ. Коиф., секции 2,3). -Кннель, 1997. - С. 17-19.

34. Kozlova A.Yu., Tuchin S.V., Kireeva V.V. The influence of combined stresses on morphogenesis of wheat tissue culture in vitro // Annual wheat newsletter. - 1998. - 44. - P. 184.

35. Tuchin S. V. The molecular characteristics of adaptivity of wheat callus cultures //Annual wheat newsletter. -1998. - 44. - P. 185.

36. Бебякин B.M., Еременко Л.В., Тучин C.B. Изменчивость стекло-вндности зерна у сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы // Вестник РАСХН. - 1998. - №5. - С. 31-34.

37. Бебякин В.М.Тучин С.В., Кибкало И.А. Тестирование качества клейковины: традиционные методы и новые разработки // Первая международная конференция «Качество зерна, муки и хлеба» (Качество, 98). Россия, Москава, 4-8 мая 1998 г. - М., 1998. - С. 95.

38. Гультяева Е.И., Тучин С.В. Устойчивость сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы к возбудителю бурой ржавчины // Бюллетень ВИЗР. -1998. -№78-79. - С. 71-76.

39. Тучин С.В. Теоретические аспекты клеточной селекции растений на устойчивость к обе; -«ожив&шпо // Вестник РАСХН - 1999. - №2. - С. 32-34

40. Тучин С.В. О термодинамическом состоянии воды в тканях отсе-лектированных in vitro на засухоустойчивость сомаклонов пшеницы II Сель-хозбиология. - 1999. - №1. С. 58-62.

41. Тучин С.В., Кибкало И.А. Изучение качества клейковины зерна сомаклонов пшеницы методом флуоресцентных зондов // Тезисы научно-практической конф. «Актуальные проблемы селекции и семеноводства зерновых культур юго-восточного региона Российской Федерации» (5-7 июля 1999 г., Саратов-Красный Кут). - Саратов, 1999. - С. 148-150.

42. КирееваВ.В., Тучин С.В. Цитологический анализ сомаклонов яровой мягкой пшеницы, отобранных на средах, содержащих полиэтиленгли-

коль 6000II Тез. научно-практической конф.»Актуальные проблемы селекции и семеноводства зерновых культур юго-восточного региона Российской Федерации» (5-7 июля 1999 г., Саратов-Красный Кут). - Саратов, 1999. - С. 75-76.

43. Тучин C.B. Влияние гибберелловой кислоты на термодинамические параметры воды в тканях низкорослых мутантов пшеницы // Пятая международная конференция «Регуляторы роста и развития растений» (29 июня - 1 июля 1999 г.) Тез. докл. 4.1. - М, 199?. - С. 69-70.

44. КозловаЛ.Ю., КирееваВ.В., ТучинС.В. Изучениедозовыхэффектов абсцпзовой кислоты на проростках и каллусных культурах пшеницы //Пятая международная конференция «Регуляторы роста и развития растений» (29 ию;-1 июля 1999 г.) Тез. докл. 4.1. - М„ 1999. - С. 41-42.

45. Итальянская Ю.В., Тучин C.B. Синергизм воздействия 2,4-Д и обезвоживания на частоту мутаций в культивируемых клетках пшеницы // Пятая международная конференция «Регуляторы роста и развития растеши!» (29 июня -1 июля 1999 г.). Тез.докл. 4.2. - М., 1999. - С. 291-292.

46. Тучин C.B., Галкин А.Н., Гурьянова К.Ф. и др. Пшеница мягкая яровая Triticum aestivum L. emend. Fiori et Paol. Саратовская 64. // Патент РФ на селекционное достижение № 0344. Приоритет от 05.11.1996 г. Зарег. 01.06.1999 г.

47. Тучин C.B. Концепция биологического триггера и отбор сомакло-нов пшеницы на устойчивость к обезвоживанию // Международная конференция «Физиология растений - наука III тысячелетия. IV съезд Общества физиологов растений России. Москва, 4-9 октября 1999 г. Тез. докл. Т.1. -М. 1999. - С. 479-480.

48. Тучин C.B. Сомаклональная изменчивость пшеницы по цвету растения // Вопросы семеноводства, селекции и генетики сельскохозяйственных культур в засушливом Поволжье. - Саратов: СГАУ, 1999. - С. 48-53.

49. Кибкало ИА., Бсбякш В.М, Тучин C.B. Корреляционный аналш новых крггериен качества клежовины // Зерновые культуры. -1999. -№6. -С.20-21.

50. Дьячук Т.И., Столярова C.B., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П., Тучин C.B. Гаплоидия в селекции пшеницы и ячменя в НИИСХ Юго-Востока И II съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (1-5 февраля 2000 г.). Тез. докл. Т. 1. Санкт-Петербург, 2000. - С. 145

51. Итальянская Ю.В., Тучин C.B. Пероксидазная активность сомак-лона мягкой тпеницы, устойчивого к бурой ржавчине // II съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (1-5 февраля 2000 г.). Тез. докл. Т. 1. Санкт-Петербург, 2000. - С. 314-315.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тучин, Святослав Викторович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ТОТИПОТЕНТНОСТЬ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ.

ГЛАВА 2. СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПШЕНИЦЫ.

ГЛАВА 3. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 5. ДОЗО'ВЫЕ ЗАВИСИМОСТИ ИНГИБИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА

ФАКТОРОВ, ИМИТИРУЮЩИХ СТРЕСС ОБЕЗВОЖИВАНИЯ.

5.1. Изучение дозовых характеристик селективных факторов на проростках пшеницы.

5.1.1. Полиэтиленгликоль.

5.1.2. Ь-азетедин-2-карбоновая кислота.

5.1.3. Абсцизовая кислота.

5.1.4. Анализ дозовых кривых селективных факторов, имитирующих стресс безвожи-вания.

5.2.' Изучение дозовых характеристик селективных факторов на каллусных культурах пшеницы.

5.2.1. Тотипонентность клеточных культур пшеницы поволжских э"котипов.

5.2.2. Влияние полиэтиленгликоля на клеточные культуры пшеницы.

5.2.3. Влияние Ь-азетедин-2-карбоновой кислоты на клеточные культуры пшеницы.

5.2.'4. Влияние абсцизовой кислоты на клеточные культуры пшеницы.

-35.2.5. Анализ дозовых кривых селективных факторов, моделирующих стресс обезвоживания в культуре изолированных клеток пшеницы.

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ СТРЕССА ОБЕЗВОЖИВАНИЯ НА ПОЛИМОРФНЫЕ БЕЛКОВЫЕ СИСТЕМЫ В КУЛЬТУРЕ И30ЛИР0ВАН-ННЫХ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ.

6.1. Адаптация клеток пшеницы к низкому химическому потенциалу воды и конформационная лабильность макромолекул.

6.2. Сомаклональная изменчивость полиморфных белковых систем, связанная с обезвоживанием изолированных клеточных культур.

ГЛАВА 7. ИЗМЕНЧИВОСТЬ СОМАКЛОНОВ ПШЕНИЦЫ, СВЯЗАННАЯ С

ОБЕЗВОЖИВАНИЕМ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

1.1. Морфологические признаки.

7.1.1. Окраска растения.

7.1.2. Длина стебля растения.

7.1.3. Элементы продуктивности растения.

7.2. Физиологические признаки.

7.2.1. Устойчивость к бурой ржавчине.

7.2.2. Чувствительность сомаклонов к экзогенной гибберелловой кислоте.

7.2.3 Развитие растений сомаклонов.

1.3: Качество клейковины зерна сомаклонов пшеницы

7.4. Влияние обезвоживания каллусных культур на частоту проявления признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

ГЛАВА 8. ПОЛУЧЕНИЕ СОМАКЛОНОВ ПШЕНИЦЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ

ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТЬ В ПОЛОВЫХ ПОКОЛЕНИЯХ.

8.1. Выбор адекватной селективной схемы для отбора клеточных культур, устойчивых к стресссу обезвоживания.

8.2. Оценка засухоустойчивости сомаклонов пшеницы на вегетирующих растениях.

8.3. Изучение термодинамических параметров воды у засухоустойчивых сомаклонов пшеницы

ГЛАВА 9. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОМАКЛОНОВ В СЕЛЕКЦИОННОМ

ПРОЦЕССЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия"

Попытки экспериментального решения данной проблемы были предприняты в основном для двудольных растений, в результате которых было показано наличие такой коррелятивной связи. В то же время исследования на злаковых культурах, и особенно на пшенице, носят фрагментарный характер, не дают ответа на главный вопрос и совершенно оставляют без внимания ряд проблем, тесно связанных с ним.

Прежде всего это касается выбора наиболее эффективно действующего агента, способного в изолированной культуре адекватно моделировать стресс обезвоживания, отбирая устойчивые клетки, способные регенерировать растения с генетической устойчивостью к данному фактору, а также доз и сроков его воздействия на клеточные культуры, оценки экспрессии приобретенной, устойчивости и ее трансмиссии в ряду половых поколений.

Изучению влияния на пшеницу этих главных лимитирующих факторов среды в засушливых регионах посвящено громадное количество исследований, выполненных с использованием всего арсенала средств, имеющихся в современной науке. Тем не менее, до настоящего времени не удалось создать целостную физиолого-генетическую модель признака засухоустойчивости, основанную на понимании биологических реакций растений, адекватно отражающих процессы адаптации и формирования урожая в условиях длительного обезвоживания тканей.

Во многом это связано с недостаточной проработанностью вопросов, касающихся роли клеточных механизмов в подобного рода реакциях пшеницы на данный фактор внешней среды, что объясняется, прежде всего, методическими трудностями, возникающими при работе на клеточном уровне. Однако, значительный прогресс, достигнутый в разработке методов культивирования изолированных тканей пшеницы, открывает широкие перспективы для выяснения истинного значения клеточного компонента в формировании адаптивных реакций пшеницы в ответ на обезвоживание.

Цель исследования: изучить влияние факторов, моделирующих обезвоживание in vitro, на поведение молекулярных маркерных систем, изолированных тканей и целостных растений пшеницы; изучить биологические последствия обезвоживания культивируемых тканей пшеницы; разработать научно обоснованные селективные схемы для отбора сомаклонов пшеницы с хозяйственно-ценными признаками и создать на этой основе исходный материал для селекции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ использования методов культуры тканей и клеточной селекции для получения генотипов пшеницы, устойчивых к стрессорам;

2. Изучить влияние факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro - абсцизовой кислоты, Ь-азетидин-2-карбо-новой кислоты и полиэтиленгликоля, на интегральные характеристики процессов роста и развития тканевых культур и целостных проростков пшеницы. Установить дозовые зависимости биологического эффекта этих факторов и степень их соответствия для изолированных тканей и целостных растений .

3. С помощью молекулярных маркерных систем выяснить причины, синхронизирующие ответные реакции на обезвоживание, и показать последствия этого явления для культивируемых тканей пшеницы, затрагивающие молекулярный уровень. Привести доказательства трансмиссии молекулярных изменений от клеточных культур, подвергнутых обезвоживанию, в половые потомства растений-регенерантов.

4. На основе принципов молекулярно-экологической концепции разработать теоретический подход к отбору клеточных культур пшеницы, устойчивых к стрессу обезвоживания. Выяснить эффективность различных селективных схем для отбора засухоустойчивых сомаклонов пшеницы и получить формы, экс-прессирующие этот признак в половых поколениях.

5. Изучить в лабораторных опытах и полевых испытаниях, полученные сомаклоны пшеницы, и установить биологические последствия обезвоживания изолированных тканей на вегети-рующих растения. Создать коллекцию сомаклонов с хозяйственно-ценными признаками, пригодную для использования в селекции.

6. Оценить перспективы и направления использования молеку-лярно-экологической концепции для создания методами клеточной селекции устойчивых к обезвоживанию форм пшеницы и возможность ее применения для оценки адаптивности селекционного материала. Научная новизна. Впервые показано, что ингибирующее влияние низкого химического потенциала воды на процессы роста и развития клеточно-тканевых систем пшеницы подчиняется закономерностям функционирования биологического триггера. На основании этого предложен подход к установлению эффективной дозы селективного давления для получения засухоустойчивых форм пшеницы.

Доказана целесообразность одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с предельно низким химическим потенциалом воды, который обеспечивает оптимальное соотношение между частотой мутаций, возникающих в культивируемых клетках, и способностью каллусных культур к регенерации растений.

Экспериментально установлено, что культивирование изолированных тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды сопряжено с проявлением наследуемых изменений в структурно-функциональных свойствах полиморфных белковых систем. При этом частота мутаций по глиадинкоди--рующим локусам в выборке сомаклонов коррелирует со степенью снижения химического потенциала воды в среде культивирования изолированных тканей, а наиболее подвержены изменениям глиадинкодирующие локусы генома Б.

Показано, что адаптация к обезвоживанию изолированных клеток пшеницы на уровне различных белковых систем осуществляется в направлении повышения структурной жесткости макромолекул.

Впервые обнаружено, что подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическое му потенциалу воды, несет мутацию, редуцирующую длину глав-^-ного побега растений, и в зависимости от генотипа пшеницы,; служившего донором культивируемых тканей, - мутацию, повышающую устойчивость сомаклонов к бурой ржавчине.

Анализ большого числа сомаклонов, отобранных in vitro на устойчивость к обезвоживанию, выявил у них наличие изменений и по другим морфологическим и физиологическим признакам, которые наследуются в ряду половых поколений.

Получены растения пшеницы с повышенной засухоустойчивостью, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении биосинтетической активности в условиях недостатка влаги, что реализуется в более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с исходным сортом.

Создана, коллекция сомаклонов (около 1000 номеров), представляющая интерес как для включения в селекционные программы, так и для использования в научных целях. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доказательства существования у пшеницы биологического триггера, контролирующего ответные реакции на воздействие факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro -абсцизовой кислоты, Ь-азетедин-2-карбоновой кислоты и пониженного химического потенциала воды в среде.

2. Анализ селективных схем, используемых для отбора устойчивых к обезвоживанию сомаклонов пшеницы, с позиций моле-кулярно-экологической концепции и триггерного механизма адаптации растений к стрессорам. Данные о преимуществах одноступенчатой схемы отбора каллусных культур при использовании низкого химического потенциала воды в качестве селективного фактора и ауксина, как индуктора каллусо-образования.

3. Потенцирующий эффект низкого химического потенциала воды в среде на частоту мутаций в культивируемых клетках пшеницы. Множественный характер молекулярно-генетических и фенотипических изменений, выявляемых у сомаклонов, от-селектированных в стадии изолированных клеточных культур под воздействием данного фактора. Наследование мутаций, возникающих в культивируемых клетках, устойчивых к обезвоживанию.

Практическая значимость определяется разработкой способов получения наследственно измененных форм пшеницы, оформленных в виде двух изобретений (A.c. СССР № 1738171А1 и патент РФ № 2095971). С использованием указанных изобретений создан исходный материал для селекции, который включен в селекционные программы лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока и Ершовской опытной станции.

Коллекция сомаклонов, насчитывающая около 1000 образцов яровой мягкой пшеницы, содержит формы с новыми генетическими элементами, детерминирующими длину стебля растения, окраску растения, устойчивость к бурой ржавчине, качество клейковины зерна, длину вегетационного периода и другие признаки. Указанные формы используются в генетических и физиологических исследованиях в НИИСХ Юго-Востока и ВИЗРе.

Методические исследования в области совершенствования способов культивирования изолированных пыльников пшеницы реализованы в виде создания дигаплоидного сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (патент РФ на селекционное достижение № 034 4) районированного с 2000 года по Саратовской области.

Практической ценностью для биотехнологических исследований обладают полученные доказательства преимущества использования коротких селективных схем для отбора in vitro стрессустойчивых сомаклонов. При этом предложен научно обоснованный подход к определению дозы воздействия селективного фактора.

Результаты, полученные в ходе выполнения данной диссертации, используются в подготовке лекций по общей биологии для студентов физического факультета Саратовского государственного университета со специализацией "биофизика".

Экспериментальные материалы, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. В изучении лроростковых генов устойчивости к бурой ржавчине у сомаклонов пшеницы принимала участие научный сотрудник лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского института защиты растений Е.И. Гультяева.

0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

В основе всех существующих ныне подходов и экспериментальных схем клеточной селекции растений на устойчивость к различным видам стрессоров лежат два фундаментальных положения сформулированных и экспериментально доказанных в последние десятилетия:

1. Свойство тотипотентности растительных клеток (Бутенко, 1975);

2. Феномен сомаклональной изменчивости растений (Ьагк:1п, 1987) .

Работы в этих направлениях на пшенице начались достаточно давно, однако технические трудности, связанные с регенерацией растений у этой и других злаковых культур, позволили получить достаточно обширный фактический материал по данным проблемам только к середине 80-х годов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Тучин, Святослав Викторович

-243-ВЫВОДЫ

1. Угнетение ростовых процессов пшеницы, вызванное воздей ствием факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro, - абсцизовой кислотой, Ь-азетидин-2-карбоновой кислотой и .пониженным химическим потенциалом воды, осу ществляется по универсальному принципу, а именно - в соответствии с механизмом биологического триггера. Независимо от внутриклеточных мишеней эти факторы в боль шей степени воздействуют на рост клеток растяжением, чем на их биосинтетическую активность.

2. Динамика угнетения процессов морфогенеза клеточно-тка-невых систем пшеницы, пролифелирующих in vitro, под воздействием низкого химического потенциала воды подчи няется закономерностям функционирования биологического триггера. Границы зоны летальности на дозовой кривой для каллусных культур соответствуют таковым для целост ных проростков. Абсцизовая и Ъ-азетидин-2-карбоновая кислоты даже в высоких дозах (до 50 мг/л) не вызывают выраженного ингибирования роста и развития каллусных культур пшеницы.

3. Механизм поддержания водного гомеостаза как проростков так и каллусных культур пшеницы не в состоянии стабили зировать уровень химического потенциала воды в тканях при его снижении в культуральной среде до значений, вы зывающих переход биологической системы в зону летально сти.

4 . На основании исследования поведения маркерной системы полиморфного семейства эстеразы проростков пшеницы при снижающейся величине химического потенциала воды в сре де показано, что адаптивные реакции на молекулярном уровне осуществляются также по принципу биологического триггера, а траектории дозовых кривых находятся в про-тивофазе для генотипов, контрастных по засухоустойчивости.

5. Культивирование каллусных тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды в течение длительного времени 'вызывает заметные изменения в составе суммарных водорастворимых белков и полиморфной системы фермента эстеразы. Несмотря на то, что характер этих изменений связан с генотипическими особенностями сортов-доноров каллусных тканей, адаптация белковых систем при обезвоживании клеток осуществляется в едином ключе

- в направлении повышения структурной жесткости белковых макромолекул.

6. Изменения в полиморфных белковых системах (глиадиньг, изоферменты) обнаруживаются у значительной части половых потомств клеточных культур, устойчивых к низкому химическому потенциалу воды. Возникшие изменения наследуются в ряду самоопыленных поколений сомаклонов и при гибридологическом анализе показывают менделевское рас- . щепление признаков.

7. Величина снижения химического потенциала воды в среде культивирования тканей пшеницы определяет частоту появления сомаклональных вариантов, несущих мутации по глиадинкодйрующим локусам. Наиболее низкий химический потенциал воды способствует отбору сомаклонов с изменениями в глиадинкодирующих локусах, расположенных преимущественно в геноме Б.

8. Подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическому потенциалу воды, неоет мутацию, редуцирующую длину главного побега растений. Данная мутация имеет промежуточное наследование с неполным доминированием и связана со снижением чувствительности сомаклонов к экзогенному гиббереллину.

9. В зависимости от генотипа пшеницы, служившего донором культивируемых тканей, отбор каллусных культур на среде с низким химическим потенциалом воды может сопровож- \ даться повышением у сомаклонов устойчивости к возбудителю бурой -ржавчины, наследуемой в ряду поколений.

10.Показана целесообразность использования одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с очень низким химическим потенциалом воды, который обеспечивает оптимальное соотношение между частотой мутаций, возникающих в культр!вируемых клетках, и способностью каллусных культур к регенерации растений. Определен подход к установлению эффективной дозы селективного давления, заключающийся в определении зоны летальности на дозовой кривой для -генотипа пшеницы -донора изолированных тканей.

11.Селекция на устойчивость к низкому химическому потенциалу воды в культуральной среде позволяет получать растения с повышенной устойчивостью к засухе, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении биосинтетической активности в условиях недостатка влаги, что реализуется в более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с исходным сортом.

12.Повышенная засухоустойчивость сомаклонов экспрессиру-ется в ряду половых поколений и сохраняется при вторичном введении в культуру соматических тканей этих форм.

-24 6

13.Культивирование соматических тканей пшеницы гибридного происхождения на среде с низким химическим потенциалом воды вызывает изменения в соотношении качественных признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

14.Создана коллекция, насчитывающая около 1000 сомаклонов, отобранных на устойчивость к различным факторам, имитирующим стресс обезвоживания in vitro, которая ис-. пользуется как в селекционных программах, так и в научных исследованиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие технологий, позволяющих манипулировать клетками, изолированными от коррегирующего влияния целого организма, открыло широкие возможности для получения измененных форм растений с генетической устойчивостью к тому или иному стрессору.

Исследованиям в этом направлении посвящено большое число работ (для обзора см. Сидоров, 1990), но в основном в них превалирует эмпирический подход. Теоретические обоснования тех или иных технологических приемов встречаются крайне редко, и могут быть в грубом приближении сведены к двум альтернативным концепциям:

1) обогащение популяции культивируемых клеток устойчивыми генотипами происходит в результате адаптации при постепенном увеличении селективного давления (ступенчатая селекция) (Nabors, 1982.);

2) отбор устойчивых мутантных форм осуществляется за достаточно короткий срок на фоне гибели в жестких условиях основной части популяции клеток, в результате чего изменяется ее генетическая структура (прямая селекция) (Conner, 1986).

Отсутствие соответствующей теоретической базы клеточной селекции порождает крайнюю пестроту в методиках, используемых для отбора клеточных культур, устойчивых к тому или иному фактору, и, очевидно, является одной из причин частого отсутствия экспрессии селектируемого признака в регенерированных растениях и их потомствах.

Принимая- во внимание это обстоятельство, мы попытались теоретически обосновать и получить экспериментальные доказательства приложимости триггерной концепции адаптивности растительных систем (Веселова с соавт., 1993) для построения наиболее органичного подхода к разработке технологий клеточной селекции растений на устойчивость к абиотическим стрессорам на примере обезвоживания.

Вышеуказанная концепция была сформулирована в результате изучения структурно-динамической модели реагирования растительной клетки на варьирующие условия среды, которая позволяет, по мнению авторов, объективно оценивать критерии смены функциональных состояний клеток в зависимости от величины внешнего воздействия. При этом для анализа экспериментальных данных предложено использовать изучение дозовых зависимостей общих физиологических реакций от степени воздействия факторов среды.

Показано (Веселова с соавт. , 1993), что дозовые кривые отражают нелинейность ответных реакций растительных клеток на увеличение давления среды, и в общем виде имеют следующие зоны, отражающие три устойчивых состояния организма, и переходные области между ними: 1) уровень нормального метаболизма (зона толерантности); 2) уровень повышенной устойчивости (зона стресса); 3) мертвое состояние (зона летальных воздействий).

Нелинейные свойства живых организмов, проявляемые у растительных .клеток в виде биологического триггера, т.е. их способности переходить в новое структурно-функциональное состояние только при достижении пороговых значений величин внешнего воздействия, связаны с фундаментальной особенностью биополимеров и мембран, которые образуют единый структурно-функциональный комплекс клетки, и могут находиться в различных конформациях, кооперативно переходя из одной в другую при изменении условий среды (Конев с соавт., 1970).

В литературе накоплен обширный материал по изучению температурных адаптаций организмов, который интерпретирован с точки зрения соответствия конформационной подвижности биополимеров экологии организмов того или вида (Александров, 1985). Авторы концепции биологического триггера для экспериментального подтверждения соответствия разработанной структурно-динамической модели поведению растительных клеток в условиях стресса также использовали экспериментальные данные по температурным воздействиям на растительные клетки. При этом было показано, что траектории кривых "доза фактора - биологический эффект" полностью укладываются в рамки предложенной модели. Аналогичное поведение дозовых кривых обнаружено в случае воздействия засоления, обезвоживания и фумигации озоном на фотосинтетический аппарат клеток листьев гороха (Веселовский с соавт., 1993).

Адаптивные реакции внутриклеточных компонентов, выраженные в изменении фракционного состава растворимых белков листьев пшеницы под влиянием обезвоживания, уже пытались интерпретировать с позиции конформационно-кооперативных свойств (Гусев, Каримова, 1982). Однако из публикаций можно почерпнуть не очень много сведений для анализа дозовых кривых, где в качестве независимой переменной выступает степень обезвоживания клеток. Наиболее старой работой, относящейся к теме данного исследования и обнаруженной в доступной нам литературе, оказалась монография Н.М. Сисакяна (1940), в которой изучалась активность ряда ферментов в листьях пшеницы в зависимости от содержания воды в тканях. Дозовые кривые ферментативной активности при обезвоживании листьев, приводимые в этой работе, нелинейны, и большинство из них имеют зоны толерантности и стресса. Нелинейность скорости ферментативных реакций от величины рН, ионной силы или температуры среды общеизвестна. Однако в данном случае характерная траектория дозовых кривых означает, что белковые макромолекулы (ферменты) отреагировали на обезвоживание клеток по принципу триггерного механизма, изменением своей активности при достижении пороговых значений содержания воды в листьях.

Факты, приведенные выше, получены разными авторами, на разных объектах с использованием различных методик и не касаются вопросов клеточной селекции растений. В связи с этим в данной работе впервые все эксперименты по изучению дозовых зависимостей эффекта обезвоживания были выполнены на одном объекте - яровой пшенице - в условиях, стандартизированных по величине химического потенциала воды в среде, причем на разных уровнях организации живой материи - молекулярном, клеточно-тканевом и организменном.

Оказалось, что общий физиологический отклик целостных проростков (организменный уровень) на снижение активности воды в среде выращивания, имеет четко выраженные зоны толерантности, стресса и переходные зоны между ними. При этом проростки различающихся по засухоустойчивости сортов пшеницы реагируют на дозу внешнего воздействия несколько различно - зоны толерантности и стресса у них смещены относительно друг друга. Более того, возрастающие дозы ингибиторов метаболических путей, принимающих участие в адаптации растительных клеток к обезвоживанию (абсцизовая кислота и Ь-азетедин~2-карбоновая кислота), также вызывают ответные реакции нелинейного вида. Это означает, что совершенно разная природа угнетающего эффекта трех факторов, включает общий механизм, обеспечивающий типичную кинетику физиологических реакций растений на внешние воздействия. Анализ дозовых кривых не оставляет сомнений, что таковым является механизм биологического триггера, функционирующий по принципу "все или ничего".

Дозовые зависимости влияния обезвоживания на поведение молекулярных систем в целостных растениях были изучены нами на примере полиморфного семейства эстеразы проростков пшеницы. Эксперименты показали, что снижение химического потенциала среды выращивания проростков вызывает смену структурно-функциональных свойств эстеразы ступенчатым образом, тем самым подтверждая существование биологического триггера на молекулярном уровне.

Таким образом, растения пшеницы на молекулярном и ор-ганизменном уровнях организации реагируют на стресс обезвоживания по принципу триггерного механизма. Это означает, что снижение химического потенциала воды в клетках растений до- определенной величины индуцирует конформационно-кооперативные перестройки во внутриклеточных биополимерах, которые затем генерализуются до организменного уровня.

Изолированные культуры высших растений, естественно, лишены влияния целого организма, состоят в основном из недифференцированных клеток и вследствие этого могут рассматриваться как клеточные популяции, независимо от вида эксплантата - отдельных клеток или тканевых культур. Поэтому, с точки зрения клеточной селекции, наибольший интерес представляет экстраполяция концепции биологического триггера на уровень поведения клеточных популяций растительных клеток.

Согласно теоретическим выкладкам (Веселова с соавт., 1993), состояние популяции клеток в условиях нормальной жизнедеятельности (зона толерантности) контролируется в основном скоростью их деления. В случае внешнего воздействия, в дозе, не превышающей летальную, адаптация осуществляется за счет механизмов физиолого-биохимического гомео-стаза каждой клетки (область перехода дозовой кривой в зону стресса). При этом размножаются в основном клетки исходного генотипа. Мутантные формы получат селективное преимущество при давлении среды, соответствующем переходу основной части популяции клеток в зону легальности. Чувствительные генотипы в данном случае элиминируют, а сама популяция продолжит существование за счет размножения клеток с генетически обусловленной устойчивостью к селективному фактору. При этом выделяют три типа дозовых кривых: 1) ступенчатые кривые -имеют плато, наличие которого связано с медленным нарастанием эффекта с увеличением дозы, и пороги, при которых ответная реакция изменяется очень резко. Траектория подобных кривых обусловлена как задержкой процесса деления клеток, так и их гибелью при больших нагрузках; 2) экспоненциальные кривые - вызваны быстрой гибелью клеток под влиянием большой мощности действующего фактора; 3) Б-образные кривые -являются производными от кривых ступенчатой формы, и могут быть получены при изменении сроков наблюдения отклика на внешние воздействия.

В результате предлагается рассматривать состояние стресса в популяциях растительных клеток, при котором резко возрастает относительное число мутантных форм, как начальную стадию эволюционного процесса, а пребывание популяции в зоне стресса определять по "хвосту" на дозовой кривой, обусловленному наличием небольших количеств (в абсолютных величинах) устойчивых к селективному давлению генотипов (Веселова с соавт., 1993).

Действительно, дозовые зависимости эффекта обезвоживания на уровне популяций изолированных клеток пшеницы оказались также нелинейными, а траектории кривых имеют либо ступенчатый, либо экспоненциальный характер, в зависимости от признака по которому проводилась оценка биологического эффекта. Подобная форма дозовой зависимости свидетельствует о высокой степени ингибирующего влияния стрессового фактора и должна сопровождаться, согласно концепции биологического триггера, увеличением относительной частоты мутаций в популяциях переживающих клеток.

Это объясняется тем, что при снижении активности воды в окружающей .среде макромолекулярные внутриклеточные структуры изолированных клеток подвергаются давлению отбора точно также как органы, ткани или целостные растения в естественных условиях (Александров, 1985). Действительно, нами было установлено, что у каллусных культур пшеницы отсутствуют механизмы, стабилизирующие химический потенциал внутриклеточной воды при его значительном снижении в кульуральной среде. Поэтому адаптация изолированных клеток к обезвоживанию начинается на молекулярном уровне с таких изменений в белковых системах, которые снижают их чувствительность к стрессорам за счет упрочения их структуры и уменьшения конформационной лабильности молекул.

Поскольку вся информация о жизнедеятельности организмов содержится в макромолекулах нуклеиновых кислот, а ее реализация осуществляется через разнообразные белковые макромолекулы, практически любой признак, заложенный в культивируемых клетках, может быть подвергнут воздействию обезвоживания на генетическом уровне. Это предполагает наличие генетических последствий для растений - потомков каллусных клеток пшеницы, ДНК которых вынуждена функционировать в условиях низкого химического потенциала воды.

Изучение сомаклонов пшеницы, ведущих свое происхождение от клеточных культур, отобранных в условиях сниженного до уровня летальности химического потенциала воды в среде культивирования, показало резкое возрастание количества мутаций по глиадинкодирующим локусам генома Б. Выли обнаружены наследственные изменения в составе полиморфных семейств ферментов эстеразы и алкогольдегидрогеназы, а также общих водорастворимых белков, среди которых встречаются белки стрессустойчивости.

Кроме того, мутагенный эффект обезвоживания проявился на уровне морфологических и физиологических признаков сомаклонов (цвет растений, длина побега, устойчивость к болезням и др.).

Повышенная устойчивость мутировавших клеток к обезвоживанию экспрессировалась в целых растениях не только в виде изменения -состояния воды в тканях и увеличения урожайности сомаклонов при засухе, но и в клетках изолированных от сомаклонов для повторного культивирования при различных уровнях обезвоживания. В последнем случае форма дозовой кривой существенно отличалась, демонстрируя снижение чувствительности мутантов к наложенному фактору. Это означает, что на популяции культивируемых клеток было оказано такое внешнее давление, которое отбраковало генотипы неадекватные условиям среды. Устойчивые формы, напротив, сохранили возможность регенерировать растения, состоящие из клеток, способных переносить обезвоживание, а генетическая структура популяции сомаклонов оказалась смещенной по отношению к таковой исходного генотипа.

Аналогичный эффект,, в принципе, может быть получен не только путем снижения химического потенциала воды в среде культивирования изолированных тканей, но и при помощи специфических ингибиторов метаболических реакций, принимающих участие в адаптации клеток к обезвоживанию.

Так, использованные в нашем исследовании вещества -АБК и АЗТ - ингибировали рост целостных проростков, также как полиэтиленгликоль, в соответствии с механизмом биологического триггера. Кроме того, положительные результаты были получены при селекции клеточных культур табака и люцерны на устойчивость к токсическим' аналогам пролина, когда удалось отобрать стрессустойчивые растения (Новожилов, 1987; Дридзе с соавт, 1992).

В этих экспериментах концентрации токсических аналогов, исчисляемые величинами 1-100 мкМ, существенно подавляли рост клеточных культур, т.е. фактически переводили популяцию изолированных клеток в состояние стресса. Однако, в отличие от двудольных растений, клеточные культуры пшеницы оказались гораздо более устойчивыми к ингибирующему влиянию АЗТ и АБК. При этом анализ дозовых кривых показал, что их траектории для проростков и каллусных культур значительно отличаются, а зоны стресса у этих биологических систем не адекватны друг другу. Более того в отдельных случаях развивалась парадоксальная реакция, когда с увеличением дозы эффект угнетения снижался.

В результате было установлено, что угнетающим влиянием на каллусные культуры пшеницы обладают только экстремально высокие концентрации АЗТ и АБК , оказывающие общетоксический эффект. Устойчивые культуры, отобранные в таких условиях, не обладали способностью стабильно экспрессиро-вать засухоустойчивость в половых поколениях регенерантов.

В определенной степени такое положение связано с тем, что в случае информационного воздействия на биологические системы существенным моментом является чувствительность к нему внутриклеточных мишеней, которая зависит от генетических особенностей растительных клеток.

Таким образом, на основании анализа приведенных материалов мы пришли к заключению о соответствии экспериментальных данных по клеточной селекции пшеницы на устойчивость к обезвоживанию основным положениям, постулированным в концепции биологического триггера.

Из этого следует, что прямая (одноступенчатая) селекция изолированных клеточных культур растений на устойчивость к обезвоживанию имеет явные преимущества перед многоступенчатой схемой, т.к. только летальные воздействия способны отселектировать устойчивые генотипы, вследствие чего первые пассажи культур на средах с низкими дозами стрессового фактора оказываются по крайней мере бесполезными.

Однако, для эффективного использования одноступенчатого отбора необходим предварительный анализ дозовой кривой каждого генотипа растений, подвергаемого селекции in vitro на устойчивость к обезвоживанию, с целью точного определения нижней границы зоны летальности.

Данное требование должно распространятся и на случай применения для отбора клеточных культур факторов информационного типа, действующих на специфические внутриклеточные мишени, когда анализ дозовых кривых особенно важен по причине возможного отсутствия подобных мишеней у некоторых видов растений или вследствие маскирующего эффекта экзогенных регуляторов роста.

Полученные нами на изолированных тканях и целостных проростках данные, раскрывающие молекулярный механизм формирования итегрированного ответа на воздействие стрессора, открывают широкие перспективы для выяснения истинного значения клеточного компонента в адаптивных реакциях вегети-рующих растений пшеницы в ответ на недостаток влаги в естественных условиях.

Прежде всего это касается вопроса о существовании и функционировании сигнальной системы, реагирующей на обезвоживание и запускающей адаптивные реакции на стресс. Считают (Альтергот, 1981), что у растений в ходе эволюционного процесса сформировалась такая сигнальная система, которая-, чутко реагирует даже на незначительное обезвоживание клеток, ингибируя рост растений. В подобном "анабиотическом" состоянии растение получает возможность направлять внутренние ресурсы на усиление признаков, обеспечивающих повышенную устойчивость к развивающемуся стрессу. При этом остается совершенно не выясненной природа внешнего сигнала и внутриклеточных мишеней, предназначенных для восприятия этого сигнала, а также механизм синхронизации всего комплекса разнообразных изменений, происходящих в растении в случае недостатка влаги.

На основании выполненных экспериментов с уверенностью можно предполагать, что адаптивные реакции при обезвоживании тканей растений до уровня, при котором гомеостатические механизмы не в состоянии поддерживать физиологически приемлемую величину активности воды, запускаются и синхронизируются самой водой, через изменение ее химического потенциала в клетке с последующим развитием цепи конформационных пере

-242строек биополимеров, кооперативно охватывающих все структурные уровни организации растений.

Данный вывод представляется весьма важным, так как, в \ принципе, позволяет подойти к созданию интегральной модели \ реагирования растения на обезвоживание, что является весьма ( I актуальной задачей на современном этапе разработки физиоло- / го-генетических аспектов засухоустойчивости пшеницы и дру- \ гих полевых культур.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тучин, Святослав Викторович, Саратов

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975. - 330 с.

2. Александров В.Я. Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 1985. 318 с.

3. Альдеров A.A.' Наследование короткостебельности при гибридизации твердых пшениц // Бюллетень ВИР. 1979. - Вып. 89. -С. 27-31.

4. Альтергот В.Ф. Действие повышенной температуры на растение в эксперименте и природе.- М.: Наука, 1981.-56 с. Аникеева Н.В. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к Helminthosporium sativum // Генетика. 1994. - 30, прилож. - С. 7.

5. Бебякин В.M., Пискунова Г.В., Романова O.A. Микрометодики определения твердости зерна, количества и качества клейковины мягкой пшеницы // Вестник с.-х. науки Казахстана. -1976. № 2. - С. 24-28.

6. Вебякин В.М., Тучин C.B., Кибкало И.А. Тестирование качества клейковины: традиционные методы и новые разработки // Первая международная конференция "Качество зерна, муки и хлеба" (Россия, Москва, 4-8 мая 1998 г.), М. 1998. - С.95.

7. Беккужина С.С. Экспериментальный андрогенез и клеточная селекция пшеницы на устойчивость к стрессам : Автореф. дис. .канд. биол. наук. М., 1993. - 23 с. Беркутова Н.С. Методы оценки и формирования качества зерна. М.: Росагропромиздат, 1991. - 134 с.

8. Бриггс Ф., Ноулз П. Научные основы селекции растений. М.: Колос, 1972. 399 с.

9. Бритиков Е.А. Биологическая роль пролина. М.: Наука, 1975. - 88 с.

10. Веденеева M.JI., Аникеева Н.В., Тихонова Т.В. Испытание селективных схем для отбора сомаклонов пшеницы на устойчивость к гельминтоспориозу // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., г.Пущино). Пущино, 1993. - С. 119.

11. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений (Биофизический подход). М.: Изд. Моск. Ун-та, 1993. 144 с.

12. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С. Стресс растения. Биофизический подход // Физиол. раст. 1993. -40, № 4. - С.' 553-557.

13. Викторова JI.В., Максютова H.H. Регуляция абсцизовой кислотой синтеза белков зерновок пшеницы // Пятая международ, конф. "Регуляторы роста и развития растений (29 июня-1 июля 1999 года). Тез. докл. М., 1999. С. 17.

14. Виленский Е.Р., Щербаков В.К. Роль фитогормонов в естественном и индуцированном мутационном процессе // Цитология и генетика. 1985. - 19, N 3. - С. 214-217.

15. Внучкова В.А., Аш O.A. Об использовании селективных сред для создания in vitro форм пшеницы, устойчивых к корневой гнили // Сельскохозяйственная биология. 1992. - № 3. - С. 2-55.

16. Гирко B.C. Нетрадиционные методы создания селекционного материала пшеницы. Автореф. дисс. доктора сельскохозяйственных наук. Киев, 1999. 34 с.

17. Глазко В.И. Биохимические особенности регенерантов издген-ной линии мягкой пшеницы Новосибирская 67 // Цитология,и генетика. 1993. -27, № 5. - С. 49-55.

18. Гонзалес P.A., Уидхолм Д.М. Отбор клеток растений по тре-буемьм признакам: устойчивость к ингибиторам // Биотехнология растений: культура клеток. М.: ВО Агропромиздат, 1989. - С. 83-96.

19. Гусев H.A. Некоторые закономерности водного режима растений. М.: Изд. АН СССР, 1959. - 158 с.

20. Гусев H.A., Каримова Ф.Г. Водообмен и засухоустойчивость растений // Развитие теоретических и экспериментальных исследований в борьбе с засухоустойчивостью. Ставрополь, 1982. - С.78-89.

21. Даргинавичене Ю.В., Меркис А.И., Улявичене P.P., Жяменас И.А., Максимов Г.Б. ИУК-связывающие свойства плазмалеммы колеоптилей пшеницы // Физиол. раст. 1992. -39, № 2. - С. 249-258.

22. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985.- 304 с.

23. Джозеф Е.Дж., Дмитриева А.К., Никифорова И.Д. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к засолению // II Российский симп. Новые методы биотехнологии раст. (18-20 мая 1993 г., г.Пущино): Тез.докл. Пущино, 1993. - С. 131.

24. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б. Селекция на осмо-устойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-регенерантов // Физиология растений. 1994. - 41, вып. 1. -С. 114-117.

25. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пус-товойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэти-ленгликоля клеточных линий // Физиология растений. 1994. - 41, вып. 6. С. 853-858. :

26. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Агропромиздат, 1985. 351 С.

27. Драгавцев В.А., Цильке P.A., Рейтер Б.Г. Генетика признаков продуктивности яровых пшениц в. Западной Сибири.'- Новосибирск: Наука, 1984. 230 с.

28. Дьячук Т.И,, Дьячук П.А. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников. М.: ВАСХНИЛ, 1989. 37 с.

29. Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Кудашкина C.B., Давыдов С.Д., Сафронова Н.Ф. Получение гаплоидных растений яровой мягкой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников // Доклады ВАСХНИЛ. 1986. - № 10. - С. 3-4.

30. Еаттатхоттам Д.Д. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к стрессам: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук. М., 1991. - 18 с.

31. Емельянов Л.Г., Анкуд С.А. Водообмен и стессустойчивость растений.- Минск: Наука и техника, 1992. 14 4 с. Жученко A.A., Король A.B. Рекомбинация в эволюции и селекции. М.: Наука, 1985. - 4 00 с.

32. Ильина Л.Г. Селекция яровой мягкой пшеницы на Юго-Востоке. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1989. - 160 с. Калинин Ф.Ф., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наук, думка, 1980. -488 с.

33. Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин E.H. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота. - М.: Наука, 1989. -184 с.

34. Козьмина Н.П., Любарский JI.H. Зерно и его качество. М.: Сельхозиздат, 1962. 152 с.

35. Кулаева О.Н. Физиологическая роль абсцизовой кислоты. Введение в публикацию материалов международного симпозиума (Пущино, 1993 г.) // Физиол. раст. 1994. -41, № 5. С. 645-646.

36. Кумаков В.А. Физиология яровой пшеницы. М.: Колос, 1980. -207 с.

37. Кумаков В.А., Игошин А.П. Оценка засухоустойчивости сортов пшеницы по коэффициенту реализации потенциальной продуктивности колоса // Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям (Методическое руководство). JI.: ВИР, 1988. С.30-34.

38. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 4. Изменчивость в процессе дедифференцировки и каллу-сообразования in vitro // Биополимеры и клетка. 1998. -14, №4. - С. 298-319.

39. Кунах В.А., Губарь Е.К. Хромосомная изменчивость клеток растений in vitro : состояние и перспективы исследований // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., г.Пущино) Пущино, 1993. - С. 186.

40. Кушнаренко C.B., Рахимбаев И.Р. Морфогенез в культуре тканей яровой пшеницы // Вестн. АН Каз. ССР. 1988. - 3. - С. 63-68.

41. Кушнер В.П. Конформационная изменчивость и денатурация биополимеров. Д.: Наука, 1977. - 274 с.

42. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. - 343 с. Левенко Б.А. Применение культуры изолированных клеток, тканей и органов растений в генетике и селекции // Общая генетика. Т.5. Генетика и селекция с/х растений.- М.: ВИНИТИ, 1978. - С.

43. Левенко Б.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к стрессовым факторам: Автореф. дис. . докт.биол. наук. -Киев, 1991. 41 с.

44. Лукъянюк С.Ф., Ружицкий A.B., Игнатова С.А., Авсенин В.И. Изучение влияния генов Yrn на каллусообразование у мягкой пшеницы // Тез. докл. Всес. конф. по биотехнологии злаковых культур. Алма-Ата,198 8. - С.69-70.

45. Маркова И.А., Тонких А.К., Салихов Ш.И. Обнаружение ауксин-связывающих белков у проростков хлопчатника // 2 съезд Всес. о-ва физиологов раст., Минск, 24-29 сент. 1990: Тез. докл. 4.2. М., 1992. - С. 131.

46. Неттевич Э.Д., Моргунов А.И., Максименко М.И. Повышение эффективности отбора яровой пшеницы на стабильность урожайности и качество зерна // Вестник сельхознауки. 1985. -№ 1. - С. 66-74.

47. Нечипоренко Г.А., Рыбалова Б.А. Применимость осмотически действующих агентов для исследования водного обмена растительных тканей // Физиол. раст.- 1980.- 27, № 1. С. 203208.

48. Одинцова И.Г., Пеуша Х.О. О сложности локуса Lr 23, контролирующего устойчивость пшеницы к бурой ржавчине / Сб. на-учн. тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. Л., 1984. - 85. - С.13-19.

49. Писарева JI.A. Методы тестирования короткостебельности растений мягкой пшеницы // Бюл. ВИР. 1987. - № 174. - С. 4346.

50. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд. Ленингр. ун-та, 1982.248 с.

51. Прилюк Л.В. Генетический анализ короткостебельности в первом и втором поколении от скрещивания мексиканских и отечественных пшениц // Генетика. 1978. - 14, № 5. - С. 757762 .

52. Пустовойтова Т.Н. Рост растений в период засухи и его регуляция // Проблемы засухоустойчивости растений. М.: Наука, 1978. С. 129-165.

53. Пустовойтова Т.Н. Роль геномных мутаций в повышении засухоустойчивости и изменении регуляторов роста растений // Рост растений и его регуляция. Кишинев: Штиинца, 1985. - С. 176-182.

54. Пустовойтова Т.Н., Жолкевич В.Н. Основные направления в изучении влияния засухи на физиологические процессы у растений // Физиол. и биохимия культ, раст. 1992. - 24, №1.- С. 14-26.

55. Пустовойтова Т.Н., Меликсетян H.A. Торможение роста абсци-зовой кислотой и засухоустойчивость проростков пшеницы /./ Физиол. раст. 1985. -32, №1. - С. 169-175. Рабинович C.B. Современные сорта пшеницы и их родословные.- Киев: Урожай, 1972. 328 с.

56. Рекославская Н.И. Адаптационные изменения в белковом и аминокислотном обмене у растений в условиях водного стресса // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука, 1989. - С. 113-142.

57. Родин Е.А., Худякова Т.В. Новый метод массового получения растений-регенерантов озимой ржи при создании исходного материала для практической селекции // Доклады ВАСХНИЛ. -1990. № 10. - С.5-7.

58. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышейшая школа, 1973. - 320 с.

59. Сидоров В.А., Моргун В.В., Логвиненко В.Ф., Матвеева H.A. Выделение и характеристика мутантов пшеницы, устойчивых к

60. S-аминоэтилцистеину, лизину и треонину // Цитология и генетика. 1990. - 24, № 5. - С. 37-41.

61. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 1985. 272 с.

62. Созинова Л.Ф., Швидченко В.К., Бадаев Н.С. Использование клеточных и хромосомных технологий при создании сортов мягкой пшеницы // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., г. Пущино). Пущино, 1993. - С. 212.

63. Ооловьян В.Т., Захленюк О.В., Кунах В.А. Перестройки генома раувольфии в культуре in vitro // Всесоюз. конф. по генетике соматических клеток в культуре, посвященная памяти Н.И. Шапиро (Звенигород, 12-15 окт., 1989): Тез. докл. V М., 1989. - С. 100.

64. Сорта полевых культур Саратовской селекции // Ред. В.Ф. Ун-генфухт. Саратов: НИИСХ Юго-Востока, 1990. - 43 С. Старостенко Н.В. Некоторые особенности органогенеза в культуре тканей злаковых // М.: МГУ, 1986. - С. 244-246. Деп.

65. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // Биотехнология растений: культура клеток. М.: ВО Агро-промиздат. 1989. - С. 97-127.

66. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л.: Химия, 1974.352 с.

67. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М.: Мир, 1984.- 512 с.

68. Чекуров В.М., Сергеева С.И., Сычев И.П., Килев С.Н. Гиббе-реллины и степень выраженности морфологических признаков растений // Генетические методы в селекции растений. Новосибирск: Наука, 1990. - С. 140-179.

69. Черницкий Е.А. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. Минск: Наука и техника, 1972.278 с.

70. Шаяхметов И.Ф., Сурина О.В., Мулюкова Г.А. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к корневым гнилям // Генетика . 1994. - 30, прилож. - С. 181.

71. Шевелуха B.C., Рогинская В.А., Хижняк C.B. Перспективы использования токсинов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых в клеточной селекции // С.-х. биология. 1992. - № 3. - С. 4 5-51.

72. Шевякова Н.И.< Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе // Физиол. раст. -1983. 30, №. 4. - С. 768-783.

73. Шевякова Н.И., Дмитриева Г.А., Кузнецов В.В. // IV Съезд J ОФР. Международн. конф. "Физиология растений наука IIIтысячелетия". Москва, 4-9 октября 1999 г. Тез. докл. М., 1999. С. 496-497.

74. Шегебаев О.Ш., Кабаева З.Н., Жамбакин К.Ж. Сомаклональная вариабельность селекционных признаков в условиях Казахстана // Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-15 октября 1989 г.): Тез.докл. М., 1989. - С.55.

75. Швидченко В. К., Созинова Л.Ф., Бадаев Н.С. Применение метода со-маклональной вариабельности растений в селекции яровой мягкой пшеницы // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., Пущино). Пущино, 1993. - С. 216.

76. Шматько И.Г., Григорюк И.А. Реакция растений на водный и температурный стрессы // Физиол. и биохимия культ, раст. -1992. 24, № 1. - С. 3-14.

77. Шматько И.Г., Григорюк И.А., Шведова O.E. Устойчивость растений к водному и температурному стрессам. Киев: Наук, думка, 1989. - 224 с.

78. Шматько И.Г., Жук О.И. Деление и растяжение клеток в интер-калярной меристеме листа кукурузы при дефиците воды и повышенной температуре // Физиол. и биохим. культ, раст. -1998. 30, № 1. - С. 60-65.

79. Юркова Г.Н., Левенко Б. А. Влияние различных ауксинов и рН среды на образование и прирост каллюса пшеницы // Генетические методы ускорения селекционного процесса. Кишинев, 1986. - С. 46-52.

80. Юркова Г.Н., Прилюк Л.В., Новожилов О.В., Левенко Б.А. Ци-тогенетический анализ растений-регенерантов мягкой пшеницы в третьем и четвертом поколениях // Генетика. 1990. - 2 6, № 1. - С. 72-77.

81. Ahloowalia B.S., Sherington J. Transmission of somaclonal variation in wheat // Euphytica. 1985. - 34, N 2. - 525537.

82. Ahloowalia B.S. Somaclones of wheat regenerated from primordial leaf callus // Gen. Manipulat. Plant Breed. Proc. Int. Symp., Berlin (Sept. 8-13, 1985). Berlin, 1986. - P. 577-579.

83. Arora R., Pitchay D.S., Bearce B.C. Water-stress-induced heat tolerance in geranium leaf tissues: A possible linkage through stress proteins ? // Physiol. Plant. 1998. - 103, N 1. - P.24-34.

84. Azzi A. The application of fluorescent probes in membrane studies // Quart. Rev. Biophys. 1975. - 8, N 2. - P. 237316.

85. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in wheat breeding // Biotechnology in agricultural and forestry. V.13. Wheat. Berlin -Heidelberg, 1990. P. 3-23.

86. Barlow E.W.R., Munns R.E., Scott M.S., Reisner A.H. Water potential, growth and polyribosome content of stressed wheat apex-// J. Exp. Bot. 1977. - 28, N 105. - P. 909916.

87. Bhaskaran S., Smith R.H., Newton R.J. Physiological changes in cultured sorghum cells in response to induced water stress.- I. Free proline // Plant Physiol. 198-5, -79, N 1. - P. 266-269.

88. Bohnert H.J.,- Sheveleva E. Plant stress adaptation making metabolism move // Cur. Op. Plant Biol. 1998. - 1, N 3. -P.267-274.

89. Bressan R.A., Hasegawa P.M., Handa A.K. Resistance of cultured higher plant cells to polyethylene glycol-induced water stress // Plant Sci. Lett. 1981. - 21. - P. 23-30.

90. Brettell R.I.S., Brown A.G.P., Whan B. Selection of wheat resistant to glume bloth disease through tissue culture // Gen. Manipul. Crops: Abstr. Inter. Symp. (Beijing, October 22-26, 1984). Beijing, 1984. - P. 69.

91. Bright S.W.J. Selection in vitro // Cereal tissue and cell culture. Dordrecht etc.: Martinus Nijhoff/Dr. W.Junk Pablishers, - P. 231-260.

92. Chauhan R.S., Singh B.M. Variation for some morphological traits and leaf rust reaction among régénérants of bread wheat cultivar Sonalica // Cereal Res. Com. 1995. - 23, N1-2. - P.109-116.

93. Chen Z., Evans D.A., Vasconcelos A. Use of tissue culture to bypass wheat hybrid necrosis // Theor. and Appl. Genet. 1989, - 78, N 1. - P. 57-60.

94. Chi-Chang Chen, Ksin-Shang Tsay and Chien-Rong Huang. Rice (Oriza sativa L.): factors affecting androgenesis // Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin-Hedelberg: Springer-Verlag, 1986. P.123-138.

95. Close J. Dehydrins: testing the link between DHN genes and freezing tolerance in barley timothy // Plant physiol.-1996. -Ill, N 2, Suppl. P 28.

96. Conner A.J. Isolation and characterization of variants from plant cell culture // N.Z.J. Technol. 1986. - 2, N 2. - P.83-94.

97. Dunwell J.M. Embryogenesis from pollen in vitro // Biotechnology in plant science. N.-Y. London: Acad. Press, 1985. - P. 49-76.

98. Jonson B.B., Nguyen H. Somaclonal variation in spike characteristics of wheat // Gen. Manipul. Crops: Abstr. Inter. Symp. (Beijing, October 22-26, 1984).- Beijing, 1984. P. 61.

99. Fedak G., Armstrong K.C., Handyside R.J. Chromosome instability in wheat plants regenerated from suspension culture // Genome. 1987. - 29, N 4. - p. 627-629.

100. Fontdevil A. Genotipe temperature interaction in Droso-philla melanogaster. II. Body weight // Genetics. - 1973. -73, N 1. - P. 125-129.

101. Handa A.K., Bressan R.A., Handa S., Hasegawa P.M. Characteristics of cultured tomato cells after prolonged exposure to medium containig polyethylene glycol // Plant Physiol.,1982. 69. - P. 514-521.

102. Handa A.K., Bressan R.A., Handa S., Hasegawa P.M. Clonal variation for tolerance to polyethylene glycol-induced water stress in cultured tomato cells // Plant Physiol.1983. 72, N 3. -P. 645-653.

103. Handa S., Handa A.K.-, Hasegawa P.M., Bressan R.A. Proline accomulation and the adaptation of cultured plant cells to water stress // Plant Physiol. 1986. - 80, N 4. - P. 938945.

104. Hart G.E., Langston P.J. Chromosomal location and evolution of isozyme structural genes in hexaploid wheat // Heredity. 1977. - 39, N 2. - P. 269 - 277.

105. He D.G., Yang Y.M., Scott K.J. A comparision of scutellum callus and epiblast callus induction in wheat: the effect of genotype, embryo age and medium // Plant Sci. 1988. -57. P. 225-233.

106. Henry rX., Buyser J. Factors influencing the response of anther cultures If Biotechnology in agricultural and forestry. Wheat. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1990. -P. 289 - 299.

107. Higgins P., Mathias R.J. The effect of the 4B chromosomes of hexaploid wheat on the growth and regeneration of callus cultures // Theor. and Appl. Genet. 1987. - 74, N 4. - P. 439-444.

108. Galiba G., Kertesz Z., Sutka J., Sagi L. Differences in somaclonal variation in three winter wheat (Triticum aestivum L.) varieties // Cereal Res. Commun. 1985, - 13, N 4. - P.343-350.

109. Galiba G., Kovacs G., Sutka J. Substitution analysis of plant regeneration from callus culture in wheat // Plant Breeding. 1986. - 97, N 3. - P. 261-263.

110. Galiba G., Yamada Y. A novel method for increasing the frequency of somatic embryogenesis in wheat tissue culture by NaCl and KC1 supplementation // Plant Cell Reports. 1988. - 7. - P. 55-58.

111. Grandbastein M.A. Activation of plant retrotransposons under stress cjnditions // Trends in Plant Sci. 1998. - 3, N5. - P. 181-187.

112. Janes B. The effect of molecular size, concentration in nutrient solution and exposure time on the amount and distribution of polyethylene glycol in paper plants // Plant Physiol. 1974. - 54, N 3. - P. 226-230.

113. Henry Y., Beyser J. Factors influencing the response of anther cultures // Biotechnology in agricultural and forestry. Wheat. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1990, -P. 289-299.

114. Kinoshita T., Mikami T. Influence of alien cytoplasms on callus proliferation and streptomicin resistance in common wheat // Wheat Inf. Serv. 1985. - 60. - P. 34.

115. Mathias R.J., Boyd L.A. Cefotaxime stimulates callus growth, embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L. em. Tell) // Plant Sci. 1986. - 46, N 3. - P. 217-223.

116. Mathias R.J., Fukui K. The effect of specific chromosome and cytoplasmic substitutions on the tissue culture response of wheat (Triticum aestivum) callus // Theor. and Appl. Genet. 1986. - 71. - P. 797 - 800.

117. Nomura K., Komanie A. Polarized DNA synthesis and cell division in cell clusters during somatic embryogenesis from single carrot cells // New Physiol., 1986. 104, N 1. - P. 25-32.

118. Orlov P.A. Nuclear and cytoplasmic control of wheat plant development in vivo and in vitro // 5th Inter. Wheat Conf. June 10-14, 1996, Anhara, Turkey. Abstr. Anhara, 1996. -P. 383.

119. Oziaz-Akins P., Vasil I.K. Proliferation of and plant regeneration from the epiblast of Triticum aestivum (wheat, Gramineae) embrios // Amer.J.Bot. 1983. - 70, N 7. - P. 1092-1097.

120. Pareek A., Singla S.L., Grover A. Evidence for accumulation of a 55 kDa stress-related protein in rice and several other plant genera If Plant Sci. 1998. - 134, N 2. - P. 191-197.

121. Pauk J. Breeding with half the genes: "J.K. Delibab" released, patented new winter wheat varieties // Ann. Wheat Newslet. 19'96. - 42. - P. 159.

122. Penzer G.R. l-anilinonaphtalene-8-sulphonate. The dependence of emission spectra on molecular conformation studied by fluorescence and proton-magnetic resonance // Eur. J. Biochem. 1972. - 25. - P. 218-228.

123. Purnhauser L. Improving plant regeneration in callus cultures of wheat // Ann. Wheat Newsletter. 1993. - 39. - P. 159-160.

124. Purnhauser L., Medgyesy P., Czako M., Dix P.J., Marton L. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifola via tissue cultures using the ethylene inhibitor AgN03 // Plant Cell Repts. 1987. -6, N 1. - P. 1-4 .

125. Rebordinos L., Perez de la Vega M. Extent of genetic variability of endosperm esterases in Triticum aestivum L. 2n=6x=42 // Theor. and Appl. Genet. 1989. - 78, N 5. - P. 728-734.

126. Ryan S.A., Scowcroft W.R. A somaclonal variant of wheat with additional a- amilase isozymes // Theor. and Appl. Genet. 1987. - 73, N 3. - P. 495-464.

127. Ryschka U. Morphogenese bei Kalluskulture des Weizens // Tagunsgsber. Akad. Landwirt Schaftswiss DDR. -1983. N 207. - 15-22.

128. Sagi F., Beke B., Sagi L. Somaclonal variation in durumwheat (Triticum durum Desf.) // Biotechnology in Agriculture and Forestry 13. Wheat. Berlin etc.: Springer - Verlag, 1990. - P. 494-510.

129. Schuetze R., Leike H., Shlegel H. Selektion von resistenen mutanten in zellkulturen // Fortschrittsberichte fur die Landwirtschaft und Nahrungsguterwirterwirtsschaft.- 1984. 22, 1. - S. 1-48.

130. Sears R.G., Decard E.L. Tissue culture variability in wheat-callus induction and plant regeneration // Crop. Sci.- 1982. -22, N 3. P. 546-550.

131. Smith R., Bhaskaran S., Miller F. Screening for drought tolerance in sorghum using cell culture // In Vitro. -1985. 21, N- 10. - P. 541-545.

132. Swaaij A.C., 'Jcobsen E., Kiel J.A., Feenstra W.J. Selection, characterisation and regeneration of hydroxyprolineresistant cell lines of Solanum tuberosum: tolerance to NaCl and freezing stress // Physiol. Plant.- 1986. 68, N 3. - P. 359-366.

133. Thomas T.H. Some recent advances in plant hormone research in Europe // Annu. Bull. Brit. Soc. Plant Growth Regul. -1991. N 1. - P. 13-20.

134. Winfield M. 0., Schmitt M., Lorz H., Davey R., Karp A. Non-random chromosome variation and morphogenic potential in cell lines of bread wheat (Triticum aestivum L.) // Genome.- 1995. 38, N 5. - P. 869-878.

135. Wersuhn G. Obtaining mutants from cell cultures // Plant Breeding. 1989. - 102, N 1. - P. 1-9.

136. Yoshida S., Watanabe K,, Fujio M. Non-random gametoclonal variation in rice regenerants from callus subcultured for a prolonged period under high osmotic stress // Euphitica. -1998. 104, N 2. - 87-94.

137. Zhang L.J., Seilleur P. A simple and fast method to obtain high frequency of plant regeneration from mature and immature wheat embryos // Bull. Rech. Agron. Gembloux. 1987.- 22, N 3. P. 187-197.

Информация о работе

Тучин, Святослав Викторович
доктора биологических наук
Саратов, 2000
ВАК 03.00.23

Диссертация

Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы