Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением

Домогатская, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.3

Домогатская Анна Сергеевна

МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕНОСА БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ ПРИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ МАТРИКСА ТКАНЕЙ С ПОДАВЛЕННЫМ КРОВООБРАЩЕНИЕМ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2003 г.

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Рууге Энно Куставич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

проф. Петрусевич Юрий Михайлович

доктор биологических наук

проф. Максименко Александр Васильевич

Ведущая организация Институт Теоретической и

Экспериментальной Биофизики РАН

Защита диссертации состоится « сентября 2003 года в а заседании

диссертационного совета К 501.001.08. в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские Горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Физический факультет, аудитория XW^ .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан Q-M7 2003 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 501.001.08. кандидат физико-математических наук

\QJ1J2-

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Проблема лечения некротического поражения тканей (в частности, некроза подкожных тканей при глубоких ожогах) очень актуальна в настоящее время. В пораженных тканях прекращается циркуляция крови и лимфы; вследствие чего массообмен (перенос молекул) в области некроза многократно замедляется. Некротические ткани представляют собой опасность как источник токсичных продуктов некроза и патогенных анаэробных бактерий, поэтому их удаление является необходимой стадией лечения ожога. Одним из методов очистки раны от некротических тканей является воздействие на нее протеолитическими ферментами, которые разрушают внеклеточный матрикс, обеспечивающий прочность ткани.

Необходимым условием жизнеспособности тканей является интенсивный массообмен: транспорт молекул-метаболитов должен происходить достаточно быстро для обеспечения жизнедеятельности клеток. Существует два механизма переноса молекул в тканях: диффузия и фильтрация (направленное перемещение, вызванное перепадом давления); причем скорость этих процессов зависит от среднего расстояния между кровеносными капиллярами и проницаемости межклеточного пространства ткани. В здоровых тканях с нормальной системой микроциркуляции крови скорость диффузии и фильтрации достаточно велика для жизнеобеспечения клеток. При глубоком некрозе происходит изоляция пораженной области, поэтому процесс перемещения молекул между областью поражения и нормальными тканями многократно замедляется. Чем больше глубина некротического поражения, тем медленнее будет происходить диффузионный и фильтрационный перенос молекул вглубь пораженной области.

Процесс проникновения фермента вглубь слоя некротической ткани ограничивается скоростью его диффузии в ткани и интенсивностью встречного потока экссудативной жидкости.

Понимание влияния процессов переноса на распределение молекул в тканях с подавленным кровообращением важно для эффективного решения таких проблем, как лечение глубоких ожогов путем деструкции матрикса некротических тканей протеолитическими ферментами.

Цель и задачи работы:

Целью данной работы было изучение влияния процессов переноса белковых макромолекул (протеолитических ферментов и ингибиторов) на процесс протеолитической деструкции тканей с подавленным кровообращением. Для этого необходимо было решить следующие практические задачи:

1. Исследовать экспериментально взаимодействие ферментов - сериновых протеиназ (трипсин, химотрипсин, брахиурины семейства А) - с ингибиторами плазмы крови человека;

2. Исследовать экспериментально роль коллагенолитической активности на процесс деструкции различный структур матрикса тканей гетерогенной структуры (мышечной, подкожной соединительной, дермы и эпидермиса);

3. Описать процесс деструкции ткани с подавленным кровообращением раствором протеолитического фермента, нанесенного на ее поверхность, с помощью математической модели, учитывающей влияние следующих факторов:

- процессов переноса (диффузии и фильтрации),

- инактивации фермента при взаимодейсгвии с ингибиторами,

- изменение глубины слоя пораженной ткани вследствие ее протеолитической деструкции;

4. Получить распределение активного фермента в слое пораженной ткани, оценить глубину его проникновения и скорость его инактивации (теоретически);

5. Установить зависимость скорости деструкции слоя пораженной ткани с подавленным кровообращением протеолитическими ферментами от их

распределения в ткани (теоретически).

Научная новизна:

Разработан новый экспериментальный качественный тест, позволяющий исследовать воздействие протеолитических ферментов на целостность тканей гетерогенной структуры (мышечной, кожной, подкожной соединительной).

Впервые для описания процессов протеолитической деструкции тканей с подавленным кровообращением раствором протеолитического фермента, нанесенного на поверхность тканей, предложена математическая модель, позволяющая оценить зависимость глубины проникновения активного фермента и кинетики деструкции от концентрации наносимого фермента.

Впервые был выделен, очищен и определен ингибитор, обеспечивающий более 90% ингибиторной активности плазмы крови человека по отношению к сериновым протеиназам - брахиуринам.

Практическая значимость:

Результаты работы могут быть применены для оценки перспективности различных направлений разработки лекарственных форм протеолитических ферментов, используемых для лечения глубоких некротических ран (в частности, ожоговых). Результаты исследования процессов массопереноса в гканях с подавленным кровообращением позволяют предложить способы увеличения скорости доставки протеолитических ферментных препаратов в область поражения и повышения эффективности терапии.

Разработанный качественный тест по воздействию протеолитических ферментов на структуры матрикса тканей гетерогенной структуры может бьггь использован для скрининга новых ферментных препаратов с комплексной протеолитической активностью с целью отбора препаратов, обеспечивающих максимально быструю деструкцию тканей. Данный тест может быть использован научно-исследовательскими институтами, занимающимися разработкой новых медицинских препаратов протеолитических ферментов.

Апробация работы:

Результаты были доложены на конференциях «Biocatalysis 2002» (Москва, 2002) и «III Съезд Российского Биохимического Общества» (Санкт-Петербург, 2002). Работа прошла апробацию на семинаре кафедры биофизики физического факультета МГУ. Публикации:

По теме диссертации опубликовано пять печатных работ: тезисы и три статьи.

Структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литерагуры, описания методов и результатов экспериментального исследования, описания математической модели и результатов теоретического исследования, их обсуждения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 18 рисунков. Список литературы содержит 165 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ дается общая характеристика работы, обосновывается актуальность исследуемой темы, формулируются основные задачи и цели исследования, излагается научная новизна результатов.

ГЛАВА 1 диссертации представляет собой обзор литерагуры, который состоит из пяти частей:

I. Внеклеточный матрикс: структура и функции

II. Процессы переноса макромолекул в тканях с подавленным кровообращением

III. Некроз ткани как следствие ожога

IV. Использование протеолитических ферментов для деструкции некротических тканей

V. Ингибиторы протеолитических ферментов

ГЛАВА 2 посвящена описанию материалов и методов экспериментального исследования и включает в себя следующие разделы:

Характеризация ферментных препаратов В работе использовались высокоочищенные (не менее 95% чистоты) препараты протеолитических ферментов - сериновых протеиназ: трипсин (Sigma), химотрипсин (Sigma) и брахиурины семейства SI A (Imtek).

Инактивация протеолитических ферментов при взаимодействии с плазмой крови человека

Измерение кинетики протеолитической деструкции тканей: количественный метод

Анализ действия протеолитических ферментов на ткани гетерогенной структуры: качественный метод

Для оценки действия ферментных препаратов на отдельные структурные компоненты матрикса гетерогенных тканей, обеспечивающие их механическую прочность, был разработан следующий метод качественного анализа:

Для эксперимента были использованы тонкие срезы кожных и подкожных тканей крысы. Толщина образца, с одной стороны, была достаточной, чтобы сохранить механическую прочность ткани, с другой стороны, достаточно малой, чтобы исключить влияние диффузионных ограничений на ход эксперимента. Наблюдение за состоянием ткани велось с методом фазово-контрастной микроскопии.

Образцы тканей подвергались воздействию ферментов - сериновых протеиназ; концентрация ферментов варьировалась в диапазоне 0.1 - 10.0 мг/мл, активность ферментов поддерживалась постоянной, эксперимент проходил при температуре 22°С. Целостность структур матрикса гетерогенной ткани оценивалось по следующим критериям:

1) Светорассеяние - характеризует целостность неколлагеновых белков

2) Целостность интерстициального внеклеточного матрикса, включающего фибриллы коллагенов I и III типа

3) Целостность базальных мембран (входящих в состав оболочки мышечных волокон), включающих полимер коллагена IV типа

4) Прочность (связность) образца ткани

Аналогичным образом был проведен качественный анализ действия прогеолитических ферментов на мышечную ткань.

ГЛАВА 3 содержит результаты экспериментального исследования

Инактивация ферментов - сериновых протсиназ при взаимодействии с плазмой крови человека

Было получено, что плазма крови человека при добавлении к раствору ферментов-брахиуринов, а также трипсина и химотрипсина, необратимо подавляет их ферментативную активность (трипсиноподобную, химотрипсиноподобную) менее, чем за 0.5 минут. Ингибиторная способность плазмы крови человека, в том числе и по отношению к коллагенолитической активноеш, равняется 40 мкМ, что соответствует полному ингибированию раствора трипсина, химотрипсина и брахиуринов концентрацией менее 0.9 мг/мл.

Анализ элюата, полученного пропусканием плазмы крови человека через аффинный сорбент, несущий в качестве лиганда один из ферментных препаратов, показал, что не менее 90% белков, связавшихся с ферментами, имеют молекулярную массу в 50-55 кДа. Полученые данные указывают, что ингибиторная активность плазмы крови человека на 90% обусловлена активностью «¡-антитрипсина (ар ингибитора протсиназ).

Измерение кинетики протеолитической деструкции тканей

Кинетика изменения массы образцов мышечной ткани при помещении в раствор протеолитических ферментов грипсина, химотрипсина и брахиуринов отображена на рисунке 1.

—•—Брахиурины, 10 мг/мл - Трипсин, 10 мг/мл

1—1—1

30 40 Время, ч

Рис. 1. Кинетика деструкции мышечной ткани под действием общей протеолитической активности (трипсин) и комплексной активности (брахиурины)

При этом:

1. Под действием ферментов трипсина и химотрипсина, не обладающих коялагенолишческой активностью, внеклеточный матрикс ткани сохраняется, поддерживает механическую прочность и сохраняет 30% первоначального объема ткани.

2. Под действием ферментов брахиуринов, обладающих коллагенолитической активностью происходит полная деструкция ткани.

3. Неразрушенный матрикс создает диффузионные ограничения для проникновения фермента внутрь ткани и для удаления продуктов деградации матрикса.

Анализ воздействия протеолитических ферментов на структуры матрикса гетерогенных тканей (качественный тест)

Тест, позволяющий произвести оценку воздействия протеолитических ферментов на структуры матрикса гетерогенных тканей, был разработан с целью:

1. оценки эффективности протеолитической деструкции тканей для ряда ферментных препаратов;

2. выявления структур матрикса, ответственных за поддержание целостности гетерогенных тканей

3. оценки роли коллагенолитической активное™ в протеолитической деструкции гетерогенных тканей

Действие протеолитических ферментов (трипсина / брахиуринов) на срезы кожной и подкожной соединительной ткани отражено на рисунке 2.

Отрицательный Брахиурины Э1А Трипсин контроль (буфер) коллагенолитическая общая протеопитическая

активность активность

Рис. 2. Действие протеолитических ферментов на структуры матрикса кожной и подкожной соединительной ткани.

А: буфер (без ферментативной активности); Б: брахиурины; В: трипсин (концентрация фермента: 10 мг/мл, время действия фермента: 2 часа).

Зависимость времени наступления определенных стадий деструкции мышечной ткани (деструкция полимеров (а) неколлагеновых белков, (Ь) интерстициальных коллагенов I и III типов, (с) коллагена базальных мембран IV

типа) от концентрации фермента (трипсина / брахиуринов) отражена на рисунке 3.

2.0

1Э& Светорассеяние ф Лизис коллагена 1,Ш и дестр)'кция ткани Деструкция банальных мембран

10 3-

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Концентрация фермента (брахиурины), мг/мл

0 2.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Концентрация фермента (трипсин), мг/мл

Рис. 3. Действие протеолитических ферментов ( А: брахиурины; Б: трипсин) на структуры матрикса мышечной ткани.

Из полученных результатов можно заключить, что;

1. Необходимым условием деструкции тканей гетерогенной структуры (мышечной, кожной и подкожной соединительной) является лизис интерстициальных коллагенов ! и III типа.

2. Ткани сохраняют целостность и механическую прочность под действием общей протеолитической (неколлагенолитической) активности.

3. Ткани подвергаются полной деструкции иод действием комплексной (коллагенолигической и протеолитической) активностей.

ГЛАВА 4 содержит описание и результаты теоретической модели,

описывающей процесс протеолитической деструкции тканей с подавленным

кровообращением.

Описание математической модели

Рассмотрен процесс деструкции слоя некротической ткани (с подавленным кровообращением) раствором протеолитического фермента, нанесенного на поверхность ожоговой раны Ша-Шб степени. Предложена математическая модель этого процесса, описывающая изменение толщины слоя некротической ткани, разрушающейся под действием фермента. Модель учитывает диффузионное распространение фермента навстречу потоку экссудативной жидкости, а также его необратимую инактивацию специфическими ингибиторами, содержащимися в экссудате.

Скорость очистки раны от некротической ткани определяется распределением активного фермента в слое необратимого некроза ожоговой раны. Проникновение активного фермента в глубину слоя некротической ткани ограничивается наличием там ингибиторов сериновых протеиназ, уменьшающих эффект протеолитической терапии. Перенос фермента и ингибитора в слое необратимого некроза осуществляется посредством диффузии и фильтрационными потоками интерстициальной жидкости. Взаимодействие ингибитора (а.|-антитрипсина) и протеолитическою фермента, рассматривается как необратимая бимолекулярная реакция Е + / —> Е1.

Некротическая ткань после ожога сохраняет механическую прочность за счет остатков внеклеточного матрикса ( в том числе желатина и коллагена) и фибрина. При расщеплении протеолитическими ферментами этих структурных белков, некротическая ткань теряет связность и легко удаляется.

Скорость изменения толщины слоя некротической ткани ДО зависит от распределения фермента в слое Е(х,1) (чем больше активного фермента и чем глубже он проникает, тем быстрей происходит деструкция ткани). Однако Е{х,г) в свою очередь зависит /.(/): толщина слоя определяет скорость диффузии фермента и, следовательно, его распределение в слое.

Постулаты модели

Рассматривается одномерная модель некротической раны, в которой выделены три слоя (см. рисунок 4):

Слой Слой Раствор

неповрежденной некротической дротеолитического ткани ткани фермента

\ Е = 0 Е(х, 0 Е = Е0 (

/ / = /0 1(х,0 1=0 >

ДО —►

Рис. 4. Одномерная модель некротической раны

1) Слой некротической ткани, в котором отсутствует циркуляция крови и лимфы.

2) Слой нормальной (жизнеспособной) ткани, где происходит циркуляция крови, являющийся источником ингибиторов сериновых протеиназ с концентрацией /0.

3) Раствор нротеолитического фермента концентрацией Е0.

Концентрации фермента Е0 и ингибитора /0 считаются постоянными вследствие бесконечной емкости соответствующих слоев-источников.

Система уравнений, описывающих процессы диффузии, фильтрационного переноса и инактивации фермента ингибитором в слое некротической ткани выглядит следующим образом: дЕ

(1)

а/ „ дч ы

.01 дх дх

к. • Е-1

с граничными условиями:

{Е(х = 0,О = 0 1(х = 0,1)^1о Е(Х = Ь,1) = Е0 1{Х = 1,0 = 0}

Процесс протеолитической деструкции компонентов матрикса в данной

модели описывается уравнением Михаэлиса-Ментен: dS -к-Е-----dt или

S + Кт

„ J 1 S + KK ,„ л.

Е ■ dt =----- • dS. Матрикс считается потерявшим целостность, если

k S

произошел протеолиз определенной доли его компонентов (¿\ молекул из S0). Отсюда можно получить интегральное уравнение, связывающее распределение фермента E(x,i) с толщиной слоя некротической ткани L(t)\

I i

¡—E(x = L(t),T,L(r)-dT = A (3)

где А = j—!— • S + К"' ■ dS = const (4)

s к-I0 S

Параметры модели даны в таблице 1. Таблица 1: Параметры математической модели.

п, , о,: коэффициент диффузии фермента (трипсин, химотрипсин), ингибитора (ai-антитрипсина) 5.8*! 0 "7 см 2/е

р1 L,pi /.: коэффициент фильтрации фермента, ингибитора 2.4*10 "7 см 2/с

/0: концентрация ингибитора в интерстиции 2*10 ° М (1 мг/мл)

г„: концентрация наносимого фермент До 20 мг/мл (8*10 -4М)

i,: константа скорости реакции ингибирования 1.7* 105 М"'с

к1: константа равновесия реакции ингибирования 1.4*10М

l : толщина слоя некротической ткани при ожоге III степени 1-3 мм

Vl s: средняя скорость изменения толщины слоя некротической гкани 10 мкм/ч

РЕЗУЛЬТАТЫ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ Временная иерархия процессов

Была определена временная иерархия процессов диффузии, фильтрации, иш ибирования и лизиса некротической, то есть, были выделены процессы,

доминирующие на определенных временах и расстояниях. Характерные времена

л2 X

диффузии и фильтрации 1МГ(х) =—, tm(x,L) = — отражаютскоростьпереноса

4 D р

фермента от источника на расстояние х. Характерное время подавления активности фермента ингибитором: f 4 = —-—. Характерное время продвижения

границы ths (х) = -:=— требуется для изменения толщины слоя коагуляционного некроза на х.

В физически значимом диапазоне значений х~10-1000 мкм иерархия времен выглядит следующим образом:

W « ldiff <1 fût « hys (5)

Самым быстрым процессом является взаимодействие фермента с ингибитором; этот процесс происходит за доли секунды. В течение этого времени процесс диффузии, а также прочие, более медленные процессы, не успевают повлиять на распределение фермента. За времена, на порядок превышающие tmh, но меньшие , устанавливается локальное равновесие

между ферментом и ингибитором.

Диффузия ферменга и ингибитора происходит на порядок быстрее процессов фильтрации и продвижения границы. Таким образом, распределение активного фермента в слое некротической ткани соответствует квазистационарному диффузионному распределению. Распределение фермента и ингибитора

Было показано, что в слое некротической ткани можно выделить две зоны -зону активности фермента и зону ингибитора; при этом взаимодействие фермента и ингибитора происходит только в очень узкой зоне на границе этих двух зон. Координата, определяющая положение слоя взаимодействия фермента

и ингибиторах0, дается соотношением Ха = ———L.

£о + /о

Так как в зоне активности фермента концентрация ингибитора пренебрежимо мала, для распределения фермента в этой зоне справедливо соотношение:

ДАЯхе[х0;!]: Е{х) = (Еа +10)~~1(): (6)

Для ле[0;хо]: Е(х) = О

Распределение фермента и ингибитора в слое некротической ткани изображено на рисунке 5.

Е0=1 мг/мл

с;

Рис. 5. Распределение фермента и ишибигора в слое некротической ткани (концентрация фермента: 1/2/4 мг/мл)

Глубина проникновения фермента, скорость его инактивации Для оценки эффективности ферментной терапии важны следующие параметры: глубина проникновения активного фермента, его количество и ->

скорость его инактивации.

Глубина проникновения фермента в слой некротической ткани определяется равенством (см. рис. 6):

При малых концентрациях фермента е0 « /0 глубина проникновения стремится к нулю -> 0.

Е мг/мл

Рис. 6. Относительная глубина проникновения фермента: зависимость от концентрации наносимого фермента

Количество активного фермента, диффундировавшего внутрь слоя

ме 1 а г 1

некрогическои ткани определяется выражением: —- = — е0аь[ =----—, где

2 2 е0+1„

М ь

—- = \е(х) ■ (1х (м, - количество фермента в слое некротической ткани

5 о

площадью Я). При малых концентрациях фермента в растворе М 8 к £„->().

Скорость инактивации фермента, равная количеству фермента, которое инактивируется в слое некротической ткани с единичной площадью поверхности

за единицу времени, определяется формулой: — = В - (£с + /0) --.

Характерно, что при еа —>■ 0 скорость инактивации фермента стремится не к

нулю, а к постоянной величине: —- -> ——.

Время установления квазистационарного равновесия

Зависимость количества активного фермента в зоне коагуляционного некроза от времени является решением уравнений (1-4) с учетом (5) и выглядит

М 'г

следующим образом: —£-(/) = \Р(х,1)с1х, где

& ,0Г< ,„,()- о

Получено, для Ь=1 мм Тм% (соответствует времени накопления в некротическом слое активного фермента в количестве 50% от стационарно1 о значения) составляет 0.35 часа, а - 1.3 часа, тогда как полное время деструкции - 100 часов. Так, для Ь менее 5 мм время установления стационарного распределения значительно меньше длительности деструкции слоя некротической ткани, поэтому можно считать, что во время терапии распределение фермента соответствует квазистационарному.

Скорость протеолитической деструкции слоя некротической ткани

В приближении, что распределение активного фермента с самого начала соответствует квазистационарному (см. (5)), было получено, что функция 1{1), описывающая толщину некротического слоя, экспоненциально убывает:

ДО = К -ехр['-~1 (8)

V -"о)

с характерным временем затухания Т0, в течение которого толщина слоя некротической ткани уменьшается в 2.7 раз:

Та=--А---(9)

'о *0

Кинетика деструкции слоя некротической ткани для значений Е0= 2 / 5 / 10 мг/мл представлена на рисунке 7:

{, сутки

Рис. 7. Зависимость толщины слоя некротической ткани от времени (для концентрации наносимого фермента: 2, 5, 10 мг/мл)

При малых концентрациях фермента Е0 « /0 (менее 0.25 мг/мл) характерное время Т0 « А- ] ос (поскольку А ос —). При больших

концентрациях Е0 » /„ (более 5 мг/мл) характерное время обратно пропорционально концентрации фермента и не зависит от концентрации

О 1

ингибитора: Т0 « А

\Е<

Слой некротической ткани можно считать полностью разрушенным, когда е1 о толщина составляет менее определенного значения <5£0 (порядка юлщины клеточного монослоя). Время, требующееся для полного разрушения некротических тканей Гм пропорционально характерному времени '/'„:

Га,=Г0.11.-^-»5-Г0 (10)

о1п

"1 ' I 1 I [ I 1 I ' I

О 2 4 6 8 10

Е0, мг/мл

Рис. 8. Зависимость времени полной деструкции слоя некротической ткани ог концентрации наносимого фермента.

Характерная кривая зависимости времени полного лизиса некротической ткани Ть, от концентрации фермента Е„ изображена на рисунке 8.

ГЛАВА 5 содержит обсуждение полученных результатов.

Роль ингибиторов, как регуляторов протеолитической активности

Полученные результаты указывают на возможную роль ингибиторов сериновых протеиназ, как регуляторов распределения активности протеолитических ферментов в некротической ткани. Наличие специфического ингибитора в тканях с нормальным кровообращением принципиально ограничивает распространение активного фермента вглубь слоя некротической ткани и в жизнеспособные ткани. При этом наличие потока специфического ингибитора играет двойную роль:

1. Уменьшение количества активного фермента в слое некротической ткани и глубины его проникновения (уменьшение эффективности терапии);

2. Полная инактивация фермента до его попадания в ткани с нормальным кровообращением (защита грануляционных тканей и кровеносного русла от протеолитической активности - снятие побочных эффектов). Механизм избирательной деструкции некротических тканей В рамках модели был продемонстрирован принцип работы естественно: о механизма, ограничивающего область протеолитической активности. Этот механизм обеспечивает избирательный протеолиз некрошческих тканей и полное подавление протеолитической активности в жизнеспособных тканях. Как было показано в модели, процесс лизиса замедляется по мере

сократцения толщины некротического слоя (скорость лизиса (величина )

уменьшается до нуля пропорционально толщине некротического слоя 1.(1)). Этот результат коррелирует с тем, что согласно клиническим наблюдениям раствор протеолитических ферментов эффективно разрушает некротическую ткань, не затрагивая подлежащие жизнеспособные ткани, в которых сохраняется микроциркуляция крови.

Выбор концентрации фермента для протеолитической терапии Оптимальный выбор концен фации наносимого фермента должен удовлетворять следующим критериям:

1) Быстрое удаление некротической ткани (во избежание токсического воспаления и бактериального заражения)

2) Отсутствие побочных эффектов (протеолиза жизнеспособных тканей, а также белков и клеток крови при попадании в кровоток)

3) По возможности, экономный расход ферментного препарата

Из результатов теоретической модели можно предположить, что при концентрации фермента (класса сериновых протеиназ, взаимодействующего с ингибиторами-серпинами) более 5 мг/мл:

1) Некротическая ткань будет быстро удалена (полное время лизиса обратно пропорционально наносимой концентрации фермента);

2) Несмотря на высокую протеолитическую активность в некротической ткани, активный фермент будет полностью инактивирован до попадания в кровоток и в жизнеспособные ткани; к тому же лизис замедляется по мере уменьшения толщины некротического слоя;

3) Расход ферментного препарата будет не больше, чем при нанесении фермента в малой концентрации: скорость инактивации фермента пропорциональна его концентрации, зато длительность процедуры обратно пропорциональна концентрации наносимого фермента.

В заключении подведены основные итоги диссертационной работы и сформулированы выводы.

выводы

1. Экспериментально показано на модели протеолитического разрушения образцов подкожной соединительной и мышечной ткани, что:

- сериновые протеиназы трипсин и химотрипсин разрушают основную массу белков, но оставляют неповрежденным каркас соединительной ткани

- напротив, ферменты брахиурины, обладающие колла! енолитической активностью, полностью разрушают кожную и подкожную соединительную и мышечную ткани.

2. Экспериментально обнаружено, что и трипсин, и химотрипсин, и брахиурины концентрацией менее 40 мкМ полностью инакгивируются при контакте с плазмой крови человека, причем более 90% ингибнторной активности обеспечивается альфа-1 антитрипсином.

3. Исследована теоретическая модель процесса проникновения фермента вглубь пораженной ткани, учитывающая диффузию, фильтрацию, а также инактивацию фермента находящимся в ткани ингибитором. Квазистационарное распределение фермента в слое пораженной ткани устанавливается в течение 2 часов и ¡атем сохраняется при поддержании постоянной концентрации фермента снаружи.

4. Теоретически показано, что активность фермента сохраняется лишь в поверхностной части слоя пораженной ткани, тогда как в глубинном слое она полностью подавляется ингибитором. Отношение толщины слоя, содержащего активный фермент, к толщине некротического слоя, недоступного для ферментативной активности, равно отношению концентрации наносимого фермента к концентрации иш ибитора, содержащегося в ткани.

5. Теоретически показано, что разрушение некротического слоя соединительной ткани происходит с экспоненциальным убыванием скорости по мере уменьшения толщины остающейся части пораженного слоя. Получена зависимость характерного времени экспоненциального затухания от концентрации наносимого фермента.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1) A.S. Khalili (Domogatskaya). A mathematical approach to enzyme treatment of burn wounds. // Тезисы международной конференции "Biocatalysis 2002" (Москва) - 2002

2) A.C. Халили (Домогатская). Ограничение активности протеолитического фермента, используемого для лечения ожоговых ран, потоком экссудата интерстициальной жидкости. // Тезисы конференции «III Съезд Российского Биохимического Общества» - 2002

3) A.C. Халили (Домогатская), С.П. Домогатский, О.П. Близнюков, Э.К. Руугс. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание распределения фермента. // Биофизика, т. 48, вып. 1, стр. 76-83.

4) A.C. Халили (Домогатская), С.П. Домогатский, Э.К. Pyyi е. Ограничение активности протеолитического фермента, используемого для лечения ожоговых ран, потоком специфического ингибитора, содержащегося в экссудате. // Вестник МГУ (Химия), т. 44, вып. 1, стр. 31-35.

5) A.C. Домогатская, С.П. Домогатский, Э.К. Рууге. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание кинетики лизиса. // Биофизика, т. 48 (в печати).

{ 2292

Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102 Тираж 100 экз. Заказ №46

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Домогатская, Анна Сергеевна

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ, КОМПОНЕНТЫ.

2.1.1.ВВЕДЕНИЕ: ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС.

2.1.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МА ТРИКС А И ИХ ФУНКЦИИ.

2.1.2.1.БЕЛКИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА.9 2.1.2.1.1 .Коллагены (классификация).9 2.1.2.1,2.Интерстициальные (фибриллярные) коллагены. 10 2.1.2.1.3.Коллаген базальных мембран (IV тип). 11 2.1.2.1.4.Эластин. И 2.1.2.1,5.Фибронсктин.

2.1.2.1,6.Ламинин компонент базальных мембран.13 2.1.2.1,7.Энтактин (нидоген).13 2.1.2.1,8.Хондронектин.14 2.1.2.2.ПРОТЕОГЛИКАНЫ.14 2.1.3.АРХИТЕКТУРА ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА. 15 2.1.3.1 .ИНТЕРСТИЦИЙ. 15 2.1.3.2.БАЗАЛЫ 1АЯ МЕМБРАНА.15 2.1.4.ЕСТЕСТВЕННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕСТРУКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА. ¡

2.1.4.1 .Необходимость деструкции внеклеточного матрикса.1 8 2.1,4.2.Матриксные металлопротеиназы и прочие протеазы.

2.1.4.2.1 .ММР - семейство, структура, классификация. Л 8 2.1.4.3.Регуляция активности матриксных металлопротеиназ.21 2.1.4.4.Биологические функции ММР.23 2.2.Процессы переноса макромолекул в некротических тканях.24 2.2.1 .Процессы массопереноса в нормальных и некротических тканях.24 2.2.1.1 .Механизм диффузии.24 2.2.1.2.Механизм фильтрации.

2.2.1.3.Массообмен в здоровых и некротических тканях.25 2.2.1.4.Механизмы массообмена в нормальных тканях.

2.2.1.5.Механизмы массопереноса в некротических (ишемизированных) тканях.

2.2.2.Методы измерения коэффициента диффузии.

2.2.2.1 .Метод восстановления флуоресценции после фотоотбеливания (РЯАР).

2.2.2.2.Метод ЯМР-томографии.27 2.2.2.3.Интегральный метод.27 2.2.2.4.Метод перфузии.27 2.2.3. Теория диффузии в тканях и гелях.

2.2.3.1.Диффузия и другие механизмы массопереноса.29 2.2.3.2.Факторы, определяющие коэффициент диффузии в ткани.29 2.2.3.3.Диффузия в вязких жидкостях.29 2.2.3.4.Влияние макрочастиц на диффузию в тканях.30 2.2.3.5.Диффузия в гелях.30 2.2.3.6.Характеристики тканей.32 2.2.4.Диффузия белков в растворах и тканях (экспериментальные данные).

2.2.4.1 .В белковых растворах.32 2.2.4.2.Фибриновый сгусток и тромб.

2.2.4.3.Рыхлая волокнистая неоформленная соединительная ткань (здоровая).

2.2.4.4.Рыхлая соединительная ткань (в раковой опухоли).34 2.2.4.5.В мышечных тканях.36 2.2.5.Влияние прочих факторов.36 2.2.5.1 .Температура.36 2.2.5.2.Зарядовые взаимодействия.

2.2.5.3.Хрящевая ткань - роль зарядовых взаимодействий.37 2.3.Некроз ткани вследствие ожога.38 2.3.1.Глубокое ожоговое поражение.38 2.3.2.Первичные изменения в тканях после ож-ога.

2.3.3.Реактивно-воспалительные процессы: естественная реакция организма на ожог.

2.3.4. Естественные механизмы регенерации пораженных тканей.40 2.3.4.1 .Ремоделирование матрикса некротических тканей.

2.3.4.2.Протеолитические ферменты и их ингибиторы.43 2.3.4.2.1. Матриксные металлопротеиназы. .43 2.3.4.2.2.Ингибиторы протеолитических ферментов.43 2.3.5.Осложнения при глубоких ожогах.44 2.4.Использование протеолитических ферментов для деструкции некротических тканей.

2.4.1 .Способы удаления слоя некротической ткани.

2.4.2.Протеолитические ферменты, используемые в лечении поверхностных ран.

2.4.2.1 .Параметры и критерии протеолитической терапии.46 2.4.2.2.Протеолитические ферменты, используемые в медицине для деструкции некротических тканей.

2.4.2.2.1 .Сериновые протеиназы, не обладающие коллагенолитической активностью (трипсин, химотрипсин).

2.4.2.2.2.Цистеиновые протеиназы, не обладающие коллагенолитической активностью (папайи, бромелаин).

2.4.2.2.3.Бактериальные коллагеназы класса металлопротеиназ (коллагеназы Clostridium histolyticum).

2.4.2.2.4.Нрахиурины - коллагенолитические сериновые протеиназы беспозвоночных.49 2.5.Регуляция протеолитической активности система кровообращения и ингибиторы 11ротеол ити 4 ес к и x ферментов.

2.5.1 .Система кровообращения как регулятор процесса деструкции некротической ткани протеолитическими ферментами.51 2.6.Заключение.

3.МАТЕРИ АЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАН ИЯ.

3.1 .Используемые препараты протеоли тических ферментов.57 3. /. 1 .SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.57 3.1.2.Определение ферментативной активности по цветным олигопептидным субстратам.

3.1.3. Измерение протеолитической активности по отношению к нашивным белком ~ естественным субстратам.

3.1.3.1 .Измерение фибринолитической активности.58 3.1.3.2.Измерение коллагенолитической активности по скорости деструкции фибрилл интерстициальных коллагенов.

3.1.3.3.Тест на характерную коллагенолитическую активность брахиуринов.

3.2.Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

3.2.].Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

3.2.2.Определение ингибиторов, ответственных за инактивацию протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.60 3.2.3.Ингибирование протеиназ плазмой крови человека.61 3.2.4.Ингибирование протеиназ сывороткой крови кролика.61 3.2.5.Ингибирование протеолитических ферментов жидкой фракцией гомогенизата мышечной ткани.

3.2.6.Получение плазмы крови человека, дефицитной по алъфа-2 антиплазмииу и альфа-2 макроглобулину.

3.2.7.Получение плазмы крови человека, обедненной по ингибиторам-серпипам, а также альфа-2 макроглобулину.62 3.3.Деструкция матрикса различных тканей протеолитическими ферментами.

3.3.1 .Количественное измерение кинетики протеолитической деструкции образцов мышечной ткани.

3.3.2.Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса мышечной ткани.

3.3.3.Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса подкожной соединительной и . кожной (дермы и эпидермиса) тканей.

4.РЕЗУЛБТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1 .Характеристика основных свойств выделенной фракции протеолитических ферментов - брахиуринов.

4.2.Инактивация ферментов - сериновых протеиназ при взаимодействии с плазмой крови человека.

4.3.г1рогеолитичес'кая деструкция образцов скани.

4.3.1 .Кинетика протеолитической деструкции мышечных тканей с учетом диффузионных ограничений.

4.3.2.Качественный анализ действия протеолитических ферментов на ткани гетерогенной структуры.

5.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ.

5.1.Введение.

5.2.математическая модель.

5.2.1.Качественное описание модели:. 73 5.2.2.Постулаты модели:. 74 5.2.3.Параметры модели.76 5.3.Результаты модели.

5.3.1 .Временная иерархия процессов.

5.3.2.С'тационарное диффузионное распределение фермента.80 5.3.3.С'тационарное диффузионно-фильтрационное распределение фермента и ингибитора.

5.3.4.Характерное время установления стационарного распределения.86 5.3.5.Кинетика протеолитической деструкции слоя пораженной ткани.88 5.4.Приложения.92 5.4.1. Приложен не I. 92 5.4.2.Приложение 2.

6.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6.1.Роль ингибиторов протеолитических ферментов.

6.2.Деструкция слоя некротической ткани неравномерной толщины с помощью протеолитических ферментовса.,.

7.ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением"

При обработке поверхности слоя некротической ткани (с подавленным кровообращением) раствором протеолитического фермента скорость деструкции матрикса пораженных тканей зависит от глубины проникновения фермента. Процесс проникновения фермента вглубь слоя некротической ткани ограничивается скоростью его диффузии в ткани и интенсивностью встречного потока экссудативной жидкости.

2 Обзор Литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Домогатская, Анна Сергеевна

7 Выводы

- напротив, ферменты брахиурины, обладающие коллагенолитической активностью, полностью разрушают кожную и подкожную соединительную и мышечную ткани.

2. Экспериментально обнаружено, что и трипсин, и химотрипсин, и брахиурины концентрацией менее 40 мкМ полностью инактивируются при контакте с плазмой крови человека, причем более 90% ингибиторной активности обеспечивается альфа-1 антитрипсином.

3. Исследована теоретическая модель процесса проникновения фермента вглубь пораженной ткани, учитывающая диффузию, фильтрацию, а также инактивацию фермента находящимся в ткани ингибитором. Квазистационарное распределение фермента в слое пораженной ткани устанавливается в течение 2 часов и затем сохраняется при поддержании постоянной концентрации фермента снаружи.

4. Теоретически показано, что активность фермента сохраняется лишь в поверхностной части слоя пораженной ткани, тогда как в глубинном слое она полностью подавляется ингибитором. Отношение толщины слоя, содержащего активный фермент, к толщине некротического слоя, недоступного для ферментативной активности, равно отношению концентрации наносимого фермента к концентрации ингибитора, содержащегося в ткани.

8 СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1) A.S. Khalili (Domogatskaya). A mathematical approach to enzyme treatment of burn wounds. // Тезисы международной конференции "Biocatalysis 2002" (Москва) - 2002

3) A.C. Халили (Домогатская). С.II. Домогатский, О.Г1. Близнюков, Э.К. Рууге. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание распределения фермента. // Биофизика, т. 48. вып. ], стр. 76-83.

4) A.C. Халили (Домогатская). С.П. Домогатский, Э.К. Рууге. Ограничение активнос ти протеолитического фермента, используемого для лечения ожоговых ран, потоком специфического ингибитора, содержащегося в экссудате. // Вестник МГУ (Химия), т. 44. вып. 1. стр. 3 1 -35.

5) A.C. Домогатская, С.П. Домогатский, Э.К. Рууге. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание кинетики лизиса. // Биофизика, 48 (в печати).

2.6 Заключение

Для этого необходимо было решить следующие практические задачи:

1. Исследовать экспериментально взаимодействие ферментов — сериновых протеиназ (трипсин, химотрипсин, брахиурины семейства 81 А) - с ингибиторами плазмы крови человека;

- процессов переноса (диффузии и фильтрации),

- инактивации фермента при взаимодействии с ингибиторами,

- изменение глубины слоя пораженной ткани вследствие ее протеолитической деструкции;

5. Установить зависимость скорости деструкции слоя пораженной ткани с подавленным кровообращением протеолитическими ферментами от их распределения в ткани (теоретически).

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Используемые препараты протеолитических ферментов

В работе использовались высокоочищенные (не менее 95% чистоты) препараты ферментов - сериновых протеиназ: трипсин (Sigma), химотрипсин (Sigma) и брахиурины семейства SI A (Imtek). Специфическая ферментативная активность препаратов составляла не менее 85% от максимально возможной и определялась следующим образом:

• трипсиноподобная, химотрипсиноподобная и плазминоген-активирующая активности определялись по скорости расщепления олигопептидных паранитроанилидных субстратов (Bz-Arg-pNA, Glp-Ala-Ala-Leu-pNA и Val-Leu-Lys-pNA, соответственно);

• фибринолитическая активность определялась методом лизиса фибриновых пленок;

• коллагенолитическая активность определялась количественно (по скорости лизиса нерастворимого фибриллярного коллагена 1,111 типов)

• качественный тест на специфическую коллагенолагенолитическую активность проводился путем анализа продуктов протеолитической деградации растворимого коллагена I типа методом SDS-электрофореза в 7% геле. Тест показал характерное для ферментов-брахиуринов расщепление нативной молекулы коллагена I в соотношении 1:3.

3.1.1 SDS-электрофорез в полиакриламидном геле

Белковый состав ферментных препаратов был характеризован методом SDS-электрофореза (методика Laemmly). Препарат концентрацией 3 мг/мл , прокипяченный в течении 5 минут в восстанавливающем и в невосстанавливающем Sample-буфере (по Laemmly), наносился в количестве 2 мкл в лунки концентрирующего полиакриламидного геля (6%, рН6.8). Электрофорез проводился в установке Biorad при значении тока 40 мА и значении напряжения 100 V. Передний фронт проходил концентрирующий и разделяющий (12%, рН8.8) гели за 40 минут. После электрофореза гели фиксировались в растворе спирт-перхлорная кислота 10 минут, прокрашивались раствором Coomasie Brilliant Blue в перхлорной кислоте 1 час и отмывались водой в течении 4 часов.

3.1.2 Определение Ферментативной активности по цветным олигопептидным субстратам

Специфическая субстратная активность ферментных препаратов измерялась следующим образом:

Трипсиноподобная активность ферментных препаратов измерялась по скорости расщепления цветного паранитроанилидного олигопептидного субстрата Bz-Arg-pNA(Serva). В пластиковой кювете приготовлялся 50 мкМ раствор субстрата в натрий-фосфатном буфере (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ натрий хлора, 3 мМ азида натрия, рН7.5). содержащий 2% диметилформамида. В кювету добавлялся раствор фермента: 50 мкл на 1 мл реакционной смеси, кювета помещалась в спектрофотометр (Spectronic 3000). где снималась кинетика расщепления субстрата на длине волны 405 нм в течение одной минуты. Скорость расщепления субстрата определялась по наклону линейной части кинетической кривой.

Химотрипсиноподобная активность ферментных препаратов измерялась по скорости расщепления цветного паранитроанилидного субстрата Glp-Ala-Ala-Leu-pNA (Serva) аналогичным образом.

Плазминоподобнан активность ферментных препаратов (способность активировать плазминоген профермент плазмина) измерялась по скорости расщепления цветного паранитроанилидного субстрата Val-Leu-Lys-pNA(Serva) аналогичным образом.

3.1.3 Измерение протеолитической активности по отношению к нативным белкам - естественным субстратам

3.1.3.1 Измерение фибринолитической активности

Измерение фибринолитической активности ферментных препаратов производилось по скорости лизиса фибриновых пленок (метод «fibrin plate», [11]). Для этого 12 мл раствора фибриногена концентрацией 7 мг/мл смешивали с 1 мл раствора тромбина концентрацией 1 мг/мл и полимеризовали пластиной размером 8см х 12см, толщиной около 1 мм. Раствор ферментов концентрацией 1 мг/мл наносили каплями по 20 мкл на поверхность застывшего полимера фибрина. Измеряли зависимость радиуса зон лизиса от времени.

3.1.3.2 Измерение коллагенолитической активности по скорости деструкции фибрилл интерстициальных коллагенов

Лиофилизованный фибриллярный коллаген I, III типа смешивали с Tris-буфером до получения равномерной взвеси с содержанием коллагена 5 мг/мл. К 1.5 мл взвеси добавляли препарат протеолитического фермента так, что его содержание составляло 5 мг/мл. Эксперимент проводился при комнатной температуре, при постоянном перемешивании. Через 5 часов пробирка подвергалась центрифугированию, жидкость удалялась. После повторного центрифугирования и удаления жидкости пробирка взвешивалась. Остаточный вес неразрушенных коллагеновых фибрилл (разница в весе пробирки после и до эксперимента) сравнивался с остаточным весом коллагеновых фибрилл в контрольной пробирке, в которую добавлялся буфер, не содержащий фермента.

3.1.3.3 Тест на характерную коллагенолитическую активность брахиуринов

Характерная особенность брахиуринов расщеплять молекулу нативного коллагена на две части соотношением размеров 1:3 контролировалась согласно методике [132]. Раствор нативного коллагена человека типа I концентрацией 3 мг/мл инкубировался с коллагенолитическим препаратом концентрацией 1 мг/мл в течении 1 часа (в буфере, содержащем 50 мМ TrisHCl, ЗЮО мМ NaCl, 20 мМ СаС12, 25 мМ ацетата, pH 7.5). Реакционная смесь кипятилась в течении 5 минут в восстанавливающем Sample-буфере (по Laemmly) - при этом останавливалась реакция. Состав реакционной смеси был характеризован методом SDS-электрофореза (согласно Laemmly). Смесь наносилась в количестве 7 мкл в лунки концентрирующего полиакриламидного геля (4%, рН6.8). Электрофорез проводился при значении тока 40 мА и значении напряжения 100 V. Передний фронт проходил концентрирующий и разделяющий (7%, рН8.8) гели за 30 минут. После электрофореза гели обрабатавались, как описано выше.

3.2 Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека

3.2.1 Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека

Для исследования взаимодействия ферментных препаратов с плазмой крови человека проводились на плазме, стабилизированной цитратом натрия (13 мМ), объединенной в пул и хранимой в аликвотах при -70° С. Ингибирующее действие плазмы определялось по остаточной активности ферментативной активности, которая измерялась по скорости расщепления олигопептидных субстратов.

3.2.2 Определение ингибиторов, ответственных за инактивацию протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека

Ингибиторы ферментов - сериновых протеиназ трипсина, химотрипсина и брахиуринов определялись путем аффинной хроматографии плазмы крови человека на сорбенте с иммобилизованным ферментным препаратом. Для изготовления сорбента носитель - бромциан-активированную сефарозу - после предварительного набухания в слабоконцентрированной соляной кислоте (концентрация 1 мМ, рН 3.0) инкубировали в течение 5 минут с раствором протеоли гичсского фермента концентрацией 2 мг/мл. Затем сорбент промывался и фиксировался в лечении 2 часов в одномолярном растворе глицина, после чего промывался буфером с содержанием 0.02% азида натрия. Процедура иммобилизации проводилась при комнатной температуре. Контроль за сохранением нативности ферментов после процедуры иммобилизации производился путем измерения их протеолитической активности добавлением олигопептидного паранитроанилидного субстрата к готовому сорбенту.

Для определения ингибиторов плазмы крови человека, ответственных за инактивацию протеолитической активности, плазма пропускалась через сорбент с иммобилизованным ферментным препаратом. Белки, связавшиеся с иммобилизованным ферментом, были элюированы раствором ацетата, рН 2.5. Их состав определялся методом 8138-электрофореза в 7% и 12% гелях. Отсутствие ингибиторов в плазме, пропущенной через сорбент, контролировалось измерением ее ингибирующей способности по методу, описанному выше.

3.2.3 Ингибирование протеиназ плазмой крови человека

Ингибирование производилось плазмой крови человека (содержала цитрат натрия для подавления коагуляционной активности, до эксперимента хранилась при температуре -80°С). Раствор брахиуринов концентрацией 10 мг/мл разбавлялась плазмой до требуемой концентрации (плазма разбавлялась не более, чем на 10%). Через определенные промежутки времени измерялась ферментативная активность смеси по цветным субстратам Вг-А^-рЫА и 01р-А1а-А1а-Ьеи-рЫА. Начальная активность, соответствующая 1=0, измерялась для смеси протеиназ соответствующей концентрации без добавления плазмы. Реакция производилась при температуре 25°С, рН7.4.

3.2.4 Ингибирование протеиназ сывороткой крови кролика

Работа проводилась на сыворотке, выделенной из крови кролика, которая после коагуляции подвергалась центрифугированию (10000об/мин, 1-14 (Весктап), 15 мин). Кинетика ингибирования снималась аналогично опытам по ингибированию, проведенным на плазме человека. Ферментативная активность измерялась по цветному субстрату Вг-А^-рКА. Реакция производилась при температуре 25°С, рН7.4-7.7.

3.2.5 Ингибирование протеолитических ферментов жидкой фракцией гомогенизата мышечной ткани.

Мышечная ткань человека (без консервантов, до эксперимента находилась в замороженном на -20°С состоянии) измельчалась до размера нескольких миллиметров, после чего в ручном гомогенизаторе был получен гомогенат ткани, который был отцентрифугирован в течении 10 мин при ускорении 10000§. В полученный супернатант добавлялся азид натрия до концентрации 0.02% для подавления бактериального роста, а на следующий день подвергался повторному центрифугированию при тех же условиях, в результате чего был получен прозрачный супернатант - жидкая фракция гомогената мышечной ткани человека. Измерение способности данной фракции ингибировать протеолитическую активность ферментов проводились аналогично опытам с плазмой человека. Ферментативную активность измеряли по цветному субстрату Вг-А^-рКА. Опыты проводились при температуре 25°С, рН7.5.

3.2.6 Получение плазмы крови человека, дефицитной по альфа-2 антиплазмину и альфа-2 макроглобулину

Предобработка плазмы крови урокиназой производилась следующим образом: к 1 мл плазмы крови человека добавлялось 10 мкл раствора урокиназы активностью 10 ООО ед/мл. Дополнительно добавлялся азид натрия до 0.02%. Смесь инкубировалась 2 часа при температуре 37°С (в термостате New Brunswick G-24). Это время является достаточным для активации всего плазминогена в реакционной смеси (2.5 мкМ). Плазмин должен был связать весь альфа2-антиплазмин (0.9 мкМ) за секунды (характерное время реакции: миллисекунды). Наличие активного плазмина в плазме контролировалось по цветному субстрату Val-Leu-Lys-pNA, активность равнялась 2/5 мкМ/мин (плазма, неактивированная урокиназой имеет нулевую активность по этому субстрату).

3.2.7 Получение плазмы крови человека, обедненной по ингибиторам-серпинам, а также альфа-2 макроглобулину

Предобработка плазмы крови трипсином производилась следующим образом: к 1 мл плазмы крови человека добавлялось 4 мг трипсина. Дополнительно добавлялся азид натрия до 0.02%. Смесь инкубировалась 3 часа при температуре 37°С (в термостате New Brunswick. G-24). Наличие активного трипсина в плазме контролировалось по цветному субстрату Bz-Arg-pNA. активность равнялась 3 мкМ/мин (плазма, не предобработанная трипсином, имеет нулевую активность по этому субстрату).

3.3 Деструкция матрикса различных тканей протеолитическими ферментами

3.3.1 Количественное измерение кинетики протеолитической деструкции образцов мышечной ткани

Эксперимент проводился на образцах мышечной ткани человека и быка, по методике аналогичной описанной в работе [105]. Кинетика лизиса ткани определялась по скорости изменения массы образца мышечной ткани (бычьей или человеческой) массой 150 мг и диаметром 5-6 мм, помещенного в герметично закрывающуюся пробирку, содержащую раствор фермента (трипсина, химотрипсина или брахиурипов) концентрацией 10 мг/мл. Образцы инкубировались в растворе фермента при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для измерения остаточной массы образцов ткани, излишняя жидкость экстрагировалась путем центрифугирования в течении 10 минут со скоростью 10000 об/мин. Ферментативная активность раствора в течение эксперимента поддерживалась постоянной.

3.3.2 Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса мышечной ткани

Для оценки действия ферментных препаратов на отдельные структурные компоненты гетерогенных тканей, обеспечивающие их механическую прочность, был разработан следующий метод качественного анализа:

Для эксперимента были использованы поперечные срезы мышечной ткани (скелетной мускулатуры) человека и быка толщиной 100 мкм, полученные с помощью криотомного ножа. Толщина образца, с одной стороны, была достаточной, чтобы сохранить механическую прочность ткани, с другой стороны, достаточно малой, чтобы исключить влияние диффузионных ограничений на ход эксперимента. Наблюдение за состоянием ткани велось с методом световой микроскопии при увеличении х 20 - 50.

Образцы тканей подвергались воздействию протеолитических ферментов

А) Трипсина, химотрипсина, обладающих общей протеолитической неколлагенолитической активностью

Б) Брахиуринов, обладающих комплексной активностью (коллагенолитической и протеолитической).

Срезы мышечной ткани помещались в лунки 24-луночного планшета ЬтЬго, содержащие раствор ферментов различной концентрации.

Концентрация ферментов варьировалась в диапазоне 0.1 - 10.0 мг/мл, активность ферментов поддерживалась постоянной, эксперимент проходил при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Состояние структур внеклеточного матрикса мышечной ткани оценивалось по следующим критериям:

1. Светорассеяние - характеризует целостность неколлагеновых белков;

2. Целостность интерстициального внеклеточного матрикса, включающего фибриллы коллагенов I и III типа (перимизий);

3. Целостность базальных мембран (входящих в состав оболочки мышечных волокон), включающих полимер коллагена IV типа (эндомизий);

4. Прочность (упругость) образца ткани.

3.3.3 Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса подкожной соединительной и кожной (дермы и эпидермиса) тканей

Для оценки действия ферментных препаратов на отдельные структурные компоненты кожной (дермы, эпидермиса) и подкожной соединительной тканей, обеспечивающие их механическую прочность, был разработан следующий метод качественного анализа:

Для эксперимента были использованы тонкие срезы кожной ткани крысы, (включающие в себя эпидермис, дерму, подкожную соединительную и мышечную гкани) толщиной 30 мкм, полученные с помощью криотомного ножа. Толщина образца, с одной стороны, была достаточной, чтобы сохранить механическую прочность ткани, с другой стороны, достаточно малой, чтобы исключить влияние диффузионных ограничений на ход эксперимента. Наблюдение за состоянием ткани велось с методом фазово-контрастной микроскопии (был использован микроскоп Zeiss со встроеной видеокамерой) при увеличении х 50-100.

Срезы мышечной ткани помещались в лунки 24-луночного планшета Linbro, содержащие раствор ферментов различной концентрации.

Целостность структур матрикса кожной и подкожной соединительной ткани оценивалось по аналогичным критериям, как в случае мышечной ткани.

4 Результаты экспериментального исследования

4.1 Характеристика основных свойств выделенной фракции протеолитических ферментов - брахиуринов

Были определены основные свойства комплекса ферментов брахиуринов (Imlek):

1) Из результатов SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 4) можно определить молекулярные массы ферментов, входящих в состав полученного комплекса протеиназ. Они равняются приблизительно 29 и 36 кДа.

2) Смесь протеиназ PC полностью сохраняла ферментативную активность в течение 3 дней при температуре 25°С и в течение двух недель при 4°С.

3) Из результатов SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 5) можно определить характерную особенность коллагенолитических ферментов PC расщеплять молекулу коллагена в соотношении 1:3. Полученные фрагменты молекулы коллагена после этого расщепляются прочими ферментами PC до состояния пептидов.

Рисунок 4. Анализ белкового состава Рисунок 5. Определение характерной комплексного препарата протеолитических для брахиуринов коллагенолитической ферментов брахиуринов методом SDS- активности по отношению к молекулярному электрофореза: коллагену человека I типа методом SDS

1) LMW (Референс молекулярных электрофореза. весов) 1) Нативный молекулярный коллаген

2) препарат брахиуринов - не человека (тип I, III) восстовленный. 2) Нативный молекулярный коллаген

3) препарат брахиуринов человека (тип I, III), расщепленный восстановленный меркаптоэтанолом ферментами брахиуринами на две составные части (25% и 75%)

Ref EZ EZ LMW ox red С-1 С-1 +ТР +EZ

9 43 kDa ¿Bp 100 kDa Collagen ф Alpha-chain

30 kDa fH A" 75 kDa

20 kDa ~ -

14 kDa «я» Low mol. Weight degradation ptOdUCtS

4.2 Инактивации ферментов - сериновых протеиназ при взаимодействии с плазмой крови человека

Было получено, что плазма крови человека при добавлении к раствору ферментовбрахиуринов, а также трипсина и химотрипсина, подавляет их ферментативную активность (трипсиноподобную, химотрипсиноподобную) менее, чем за 0.5 минут. Ингибиторная способность плазмы крови человека равняется 20 мкМ, что соответствует полному ингибированию раствора трипсина концентрацией 0.8 мг/мл.

Анализ элюата, полученного пропусканием плазмы крови человека через аффинный сорбент, несущий в качестве лиганда один из ферментных препаратов, показал, что 90% белков, связавшихся с ферментами, имеют молекулярную массу в 5055 кДа (см. рис.6). Полученые данные указывают, что ингибиторная активность плазмы крови человека на 90% обусловлена активностью альфа-1 антитрипсина (альфа-1 ингибитора протеиназ).

Рисунок 6. Анализ белков плазмы крови, связывающихся с ферментами-брахиуринами (ингибиторов протеолитических ферментов - серпиновых протеиназ) методом 81)8- шектрофореза.

1) Референс 55 кДа

2) Элюат ингибиторов из плазмы крови человека, связавшихся с иммобилизованными брахиуринами

3) Элюат инг ибиторов из плазмы крови человека, связавшихся с иммобилизованным бычьим трипсином

50 - 55 кДа а! -антитрипсин)

4.3 Протеолитическая деструкция образцов ткани

4.3.1 Кинетика протеолитической деструкции мышечных тканей с учетом диффузионных ограничений

Измерение кинетики протеолитической деструкции тканей с учетом диффузионных ограничений

При воздействии на образцы мышечной ткани растворами ферментов:

• общей протеолитической (неколлагенолитической активности -трипсина, химотрипсина,

• комплексной активности (коллагенолитической и протеолитической) -брахиуринов. были получены следующие результаты (см. рисунок 7 и таблицу 20):

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Домогатская, Анна Сергеевна, Москва

1. Адамян A.A., Глянцев С.П., Сахаров Ю.И., Саввина Т.В. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба paralithodes camtschatica на раневой процесс в эксперименте. Бюлл.эксп.биол.мед. 1992. 114(12), 660-663.

2. Акмаев И.Г., Быков B.JI., Волкова О.В. и др. Руководство по гистологии. 1,2. 2001. "СПб, "СпецЛит".

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, изд. 2. 2. 1994. "М., "Мир".

4. Белов A.A. и др. Взаимодействие ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным на диальдегидцеллюлозе протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба. Вестник МГУ (Химия). 2003. 44(1), в печати.

5. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика (Практический курс). . 1999. "М., "Фаир-Пресс".

6. Вихрев Б.С., Бурмистров В.М. под ред. Ожоги. . 1981. "Ленинград, "Медицина".

7. Глянцев С.П., Саввина Т.В., Заец Т.Л. Сравнительное изучение активности протеолитических ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран. Бюлл. Эксп. Мед. Биол. 1996. 121(6), 716-720.

8. Ентов В.М. Теория фильтрации. Соросовский Образовательный Журнал. ¡998. 2, 121-128.

9. Климова, Ведищева, Стронгин. Выделение и характеристика коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса краба-стригуна Chionoetes opilio. Докл. Акад. Наук СССР. 1991. 317(2), 482-484.

10. Кузнецова A.B., Руденская Г.Н., Богачева A.M., Воюшина Т.Л., Степанов В.М. Аффинные сорбенты для выделения протеиназ, содержащие в качестве лигандов морфолиды трипептидов. Биохимия. 1997. 23(11), 868-876.

11. Лютова Л.В., Карабасова М.А. и др. Действие протеолитического препарата морикразы на состояние рубцовой ткани в условиях in vitro. Вопр. Мед. Химии. 1998. 44(3).

12. Матвеев М.Ю. Распределение введенных в кровоток белковых препаратоув при артериальной тромботической окклюзии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1999.

13. Оглоблина О.Г., Арефьева Т.И. Роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в инвазии злокачественных опухолей. Биохимия. 1994. 59(3), 340-352.

14. Писаржевский С.А., Карелин A.A. Принципы биохимической диагностики раневого инфекционного процесса. 1998. 46-51.

15. Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. Том 1. 2002. "Ижевск: НИЦ "Регулярная и хаотическая динамика".

16. Рубин А.Б. Биофизика. 1,2. 1999. "М., "Книжный дом "Университет".

17. Руденская Г.Н., Купенко О.Г., Исаев В.А., Степанов В.М., Дунаевский Я.Е. Выделение и свойства карбоксипептидазы камчатского краба Paralithodes camchatica. Биоорг. Химия. 1995. 21(4), 249-255.

18. Руденская Г.Н., Исаев В.А., Степанов В.М. и др. Выделение трипсина PC камчатского краба Paralithodes camtschatica и его свойства. Биооргаиическая Химия. 1998. 24(2), 112-118.

19. Сандахчиев, Ставский и др. Экспериментальное изучение лечебных свойств и токсичности мази, содержащей коллагеназу камчатского краба. "Вестник РАМН". 1998. 4, 50-55.

20. Сахаров Д.В. Направленная доставка ферментов как способ локального воздействия на компоненты сосудистой стенки. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1987. .

21. Сахаров И.Ю., Глянцев С.П., Литвин Ф.Е., Гордеев В.Ф. Фармакокинетическое изучение коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica. Вопр. Мед. Химии. 1994. 40(3), 18-20.

22. Сахаров И.Ю., Шехонин Б.В., Глянцев С.П., Литвин Ф.Е. Иммуногистохимическое изучение гнойных ран у крыс после аппликации коллагеназы краба paralithodes camtschatica. Бюлл. экспер.биол.мед. 1993. 116 (9), 267-270.

23. Сахаров, Джунковская. Эластаза из гепатопанкреаса камчатского краба. Биохимия. 1993. 58(9), 1445-1452.

24. Сахаров, Матвеев, Домогатский. Связывание афинного лиганда с объемной мишенью. Роль диффузионных ограничений. Биофизика. 1991. 36(1), 49-54.

25. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции. Биоорганическая Химия. 1998. 24(4), 245-255.

26. Соловьева Н.И. Коллагеназы различного происхождения и их роль в деструкции коллагена в норме и патологии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.

27. Туркова Я. Аффинная хроматография. 1980. "М., "Мир".

28. Фрайфелдер Д, Физическая биохимия. . 1980. "М., "Мир".

29. Фукс Б.Б., Фукс Б.И. Очерки морфологии и гистохимии соединительной ткани. . 1968. "Л., "Медицина".

30. Хэм А., Кормак Д. Гистология. 1-5. 1982. "М., "Мир".

31. Шмидт Р., Тевс Г. (под. ред.). Физиология человека. 2. 1996. "М., "Мир".

32. Яровая Г. А. и др. Определение активности альфа-1 антитрипсина и альфа-2 макроглобулина в плазме крови человека унифицированным энзиматическим методом. Методы Клинической Биохимии. 1982. 22-26.

33. Adam С., Bieth J.G. Inhibition of neutrophil elastase by the alpha-1 proteinase inhibitor immunoglobulin A complex. FEBSLett. 1996. 385(3), 201-204.

34. Agren M. Matrix metallloproteinases (MMPs) are required for re-epitalization of cutaneous wounds. Arch. Dermatol. Res. 1999. 291, 583-590.

35. Agren M.S. et.al. Topical synthetic inhibitor of matrix metalloproteinases delays epidermal regeneration of human wounds. Exp. Dermatol. 2001. 10, 337-348.

36. Alitalo, Vaheri. Pericellular matrix in malignant transformation. Advances in cancer research. 1982. 37, 111-158.

37. Anand S., Diamond S.L. Computer simulation of systemic circulation and clot lysis dynamics during thrombolytic therapy that accounts for inner clot transport and reaction. Circulation. 1996. 94, 763-774.

38. Anderson J.L. et.al. Particle diffusion as a function of concentration and ionic strength. J. Phys. Chem. 1978. 82, 608-616.

39. Ashcroft G.S. et.al. Age-related differences in the temporal and spatial regulation of matrix metalloprotainases (MMPs) in normal skin and acute cutaneorus wounds of healthy humans. Cell Tissue Res. 1997. 290, 581-591.

40. Aumaillay M., Gayraud B. Structure and biological activity of the extracellular matrix. J. Mol. Med. 1998. 76, 253-265.

41. Barisoni D. et.al. Monitoring of elestase in plasma of burned patients in relation to other inflammation parameters. Sums. 1991. 17(2), 141-146.

42. Berndt A. et.al. Dreidimensionales in-vitro-Invasionsmodell fuer orale Plattenepithelkarzinome. Mund Kiefer GesichtsChir. 1998. 2, 256-260.

43. Blom A.M. et.al, Structural characterisation of inter-alpha-inhibitor. J. Biol. Chem. 1999. 274(1), 298-304.

44. Bode W. et.al. Structural properties of matrix metalloproteinases. Cell. Mol. Life Sci. 1999. 55, 639-652.

45. Boderke P. et.al. Modeling of diffusion and concurrent metabolism in cutaneous tissue./. Theor. Biol. 2000. 204, 393-407.

46. Borkakoti N. Structural studies of matrix metalloproteinases. J.Mol.Med. 2000. 78, 261-268.

47. Brinkman H.C. A calculation of the viscous force exerted by a flowing fluid on a dense swarm of particles. Appl. Sci. Res. Al. 1947. 27-34.

48. Castagnoli C. et.al. Role of T-lymphocytes and cytokines in post-burn hypertrophic scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 107-108.

49. Chary S.R., Jain R.K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. 86, 5385-5389.

50. Clubb B.H., Shivers R.R. Extracellular matrix regulates microfilament and vinculin organization in C6-glioma cells. Acta Neuropathol. 1996. 91, 31-40.

51. Coulomb B., Dubertret L. Skin cell culture and wound healing. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 109-112.

52. Crago A.M., Koronakis V. Binding of extracellular matrix laminin to Escherichia coli expressing the Salmonella outer membrane proteins Rck and PagC. FEMS Microbiology Lett. 1999. 176,495-501.

53. Cremer M.A., Rosloniec E.F. The cartilage collagens: a review of their structure, organization and role in the pathogenesis of experimental arthritis in animals and in human rheumatic disease. J. Mol. Med. 1998. 76, 275-288.

54. Cullen B. et.al. The role of oxidised regenerated cellulose/collagen in chronic wound repair and its potential mechanism of action. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. 34, 1544-1556.

55. Davidson J.M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 1998. 290 (Suppl), 1-11.

56. Dije M.Z., Stone S.R., Le Bonniec B.F. Intrinsic specificity of the reactive site loop of alpha-1 antitrypsin, alpha-1 antichymotripsin, antithrombin III and protease nexin I. J. Biol. Chan. 1997. 272(26), 16268-16273.

57. Edy, De Cock, Collen. Inhibition of plasmin by normal and antiplasmin-depleted human plasma. Thromb. Res. 1976. 8(4), 513-518.

58. Eldad A. et.al. Early nonsurgical removal of chemically injured tissue enhances wound healing in partial thickness burns. Burns. 1998. 24, 166-172.

59. Fasman F. ed. Handbook of biochemistry and molecular biology. Vol. 2. 1977. CRC Press, Cleveland, Ohio.

60. FDA Wound Healing Clinical Focus Group. Guidance for industry: chronic cutaneous ulcer and burn wounds developing products for treatment. Wound Rep. Regeneration. 2001. 9(4), 258-268.

61. Flessner M.F., Lofthouse J., Zakaria E.R. In vivo diffusion of immunoglobulin F in muscle: effects of binding, solute exclusion and lymphatic removal. Am. J. Physiol. 1997. 273, 2783-2793.

62. Folie B.J., Mclntire L.V. Mathematical analysis of mural thrombogenesis. Biophys. J. 1989. 56, 1121-1141.

63. Foy B.D., Blake J. Diffusion of paramagnetically labeled proteins in cartilage: enhancement of the 1 -D NMR technique. J. ofMagn. Res. 2001. 148, 126-134.

64. Friedrich R.E. et.al. Nachweis von extrazellulaerem Matrixprotein (Laminin) in experimentellen arteriellen Anastomosen. Mund Kiefer GesichtsChir. 1998. 2, 118-121.

65. Fu X., Wang Z., Sheng Z. Advances in wound healing research in China: from antiquity to the present. Wound Rep. Reg. 2001. 9, 2-10.

66. Giovannini U.M. Treatment of scars by steroin injections. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 116-117.

67. Godfrey E. W., Gradall K.S. Basal lamina molecules are concentrated in myogenic regions of the mouse limb bud. Anat. Embryol. 1998. 198, 481-486.

68. Gonzalez S. et.al. Non-invasive (real-time) imaging of histologic margin of a proliferative skin lesion in vivo. Int. Invest. Dermatol. 1998. 111(3), 538-539.

69. Goodwin A.E., Pauli B.U. A new adhesion assay using buoyancy to remove nonadherent cells. J. Immunol. Meth. 1995. 187, 213-219.

70. Grant A. Collagenolytic serine protease with trypsin-like specificity from the Fidller crab Uca pugilator. Biochemistry. 1983. 22, 354-358.

71. Gullberg D., Tiger C.F., Veiling T. Laminins during muscle development and in muscular dystrophies. Cell. Mol. Life Sci. 1999. 56, 442-460.

72. Harpel P.C. Alpha-2 plasmin inhibitor and alpha-2 macroglobulin plasmin complexes in plasma. J. Clin. Invest. 1981. 68, 46-55.

73. Hay. Extracellular matrix. J. Cell Biol. 1981. 91(3), 205-223.

74. Heiduschka P. et.al. Defined adhesion and growth on neurones on artificial structured substrates. FJectrochimica Acta. 2001. 47, 299-307.

75. Hynes R.O. Fibronectins. Sci. Am. 1986. 254(6), 42-51.

76. Irving J.A. et.al. Phylogeny of the Serpin superfamily: implications of patterns of amino acid conservation for structure and function. Gen. Res. 2000. 10, 1845-1864.

77. Jain R.K., Gerlowski L.E. Extravascular transport in normal and tumor tissues. Cril. Rev. Oncol. Hematol. 1986. 5(2), 115-170.

78. Johansson L., Lofroth J.E. Diffusion and interaction in gels and solutions. 4. Hard sphere Brownian dynamics simulations. J. Chem. Phys. 1993. 98, 7471-7478.

79. Jones J.J., Cohen R.L., Chambers D.A. Collagen modulates gene activation of plasminogen activator system molecules. Exp. Cell Res. 2002. 280, 244-254.

80. Jurgens K.D., Peters T., Gross G. Diffusivity of myoglobin in intact skeletal muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. 91, 3829-3833.

81. Kam L. et.al. Axonal outgrowth of hippocampal neurons on micro-scale networks of polylysine-conjugated laminin. Biomaterials. 2001. 22, 1049-1054.

82. Kim J.T., Andersom J.L. Diffusion and flow through polymer-lined micropores. Ind. Eng. Chem. Res. 1991. 29, 1008-1016.

83. Klasen H.J. A review on the nonoperative removal of necrotic tissue from burn wounds. Burns. 2002. 26, 207-222.

84. Kleinman, Klebe, Martin. Role of collagenous matrices in the adhesion and growth of cells (review). J. of Cell Biol. 1981. 88,473-485.

85. Klimova et.al. The isolation and properties of collagcnolytic proteases from crab hepatopancreas. Biochem. Biophys. Research Comm. 1990. 166(3), 1411-1420.

86. Kuznetsova et.al. Synthesis and application of sorbents for affinity chromatography of serine proteases. Chromatographici. 1997. 45, 44-48.

87. Ladwig G.P. et.al. Ration of activated matrix metalloproteinase-9 to tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in wound fluids are inversely correlated with healing of pressure ulcers. Wound Rep. Reg. 2002. 10, 26-37.

88. Laskowski M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases. Ann. Rev. Biochem. 1980. 49, 593-626.

89. Latijnhouwers M.A.H.E. et.al. Tenascin-C degradation in chronic wounds is dependent on serine proteinase activity. Arch. Dermatol. Res. 1998. 290, 490-496.

90. Liekens S., De Clercq E., Neyts J. Angiogenesis: regulators and clinical applications. Biochem. Pharmacol. 2001. 61, 253-270.

91. LorenaD. et.al. Normal scarring: importance of myofibroblasts. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 86-92.

92. Luckenbill-Edds L. Laminin and the mechanism of neuronal outgrowth. Brain Res. Rev. 1997. 23,1-27.

93. Ludeman J.P. et.al. Structure of a Serpin-enzyme complex probed by cysteine substitutions and fluorescense spectroscopy. Biophys. J. 2001. 80, 491-497.

94. Mackarel A.J. et.al. Migration of neutrophils across human pulmonary endothelial cells is not blocked by matrix metalloproteinase or serine protease inhibitors. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1999. 20,1209-1219.

95. Marchina E., Barlati S. Degradation of human plasma and extracellular matrix fibronectin by tissue type plasminogen activator and urokinase. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1996. 28(10), 1141-1150.

96. Martin G.M., Timpl R., Kuhn K. Basement Membrane Proteins: Molecular Structure and Function. Adv. in Prot. Chem. 1988. 39, 1-50.

97. Matveyev M.J., Domogatsky S.P. Penetration of macromolecules into contracted blood clot. Biophys.J. 1992. 63, 862-863.

98. Maurer H.R. Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use. Cell. Mol. Life Sci. 2001. 58, 1234-1245.

99. Mayne, Sanderson. The extracellular matrix of sceletal muscle. Collagen Rel.Res. 1985. 5, 449-468.

100. Mazar A.P., Henkin J., Goldfarb R.H. The urokinase plasminogen activator system in cancer: implications for tumor angiogenesis and metastasis. Angiogenesis. 1999. 3, 15-32.

101. Meaume S. Chronic wound scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 103-106.

102. Meek M.F. Evaluation of several techniques to modify denatured muscle tissue to obtain a scaffold for peripheral nerve regeneration. Biomaterials. 1999. 20, 401-408.

103. Mekkes J.R. et.al. In vitro tissue-digesting properties of krill enzymes compared with fibrolysin/DNAse, papain and placebo. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. 29(4), 703-706.

104. Mekkes J.R., Zeegelaar J.E., Westerhof W. Quantitative and objective evaluation of wound debriding properties of collagenase and fibrinolysin/desozyribonuclease. Arch. Dermatol. Res. 1998. 290, 152-157.

105. Michalsky J.P. et.al. A Modified Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Measurement of Alpha-1 Antitrypsin in Biologic Fluids. J. of Immunol. Meth. 1985. 83, 101-112.

106. Naili S-, Oddou C., Gciger D. A method for the determination of mechanical parameters in a porous elastically deformable medium: applications to biological soft tissues. Int. J. Solids Structures. 1998. 35, 4963-4979.

107. Naji L. et.al. C-13 relaxation studies on the cartilage and cartilage components. Carbohydrate Research. 2000. 327, 439-446.

108. Neame P.j., Tapp H., Azizan A. Noncollagenous, nonproteoglycan macromoleculas of cartilage (review). Cell.Mol.Life.Sci. 1999. 55, 1327-1340.

109. Nemes C., Ramsden J.J., Rozlosnik N. The unfolding of native laminin investigated by atomic force microscopy. Physica A. 2002. 313, 578-586.

110. Nieminen J.H. et.al. Real-time ultrasound analysis of articular cartilage degradation in vitro. Ultrasound in Med. & Biol. 2002. 28(4), 519-525.

111. Niimi T., Kitagawa Y. Distinct roles of mouse laminin beta-1 long arm domains for alphalbetalgammal trimer formation. FEBS Lett. ¡997. 400, 71-74.

112. Nomizu M. et.al. Active peptides from the carbozyl-terminal globular domain of laminin alpha-2 and Drosophila alpha chains. FEBS Lett. 1996. 396, 37-42.

113. Noyori K., Takagi T., Jasin H.E. Characterization of the macromolecular component of the articular cartilage surface. Rheumatol. Int. 1998. 1 8, 71 -77.

114. Olson S.T. et.al. Role of the catalytic serine in the interactions of serine proteinases with protein inhibitors of the Serpin family. / Biol. Chem. 1995. 270(50), 30007-30017.

115. O'Malley K.M. et.al. The kinetic mechanism of Serpin-proteinase complex formation./. Biol. Chem. 1997. 272(8), 5354-5359.

116. Ottonello L. et.al. Activation of neutrophil respiratory burst by cytokines and chemoattractants. Regulatory role of extracellular matrix glycoproteins. Inflamm. Res. 1998. 47, 345-350.

117. Ozcan C. et.al. Enzymatic debridement of burn wouns with collagenase in children with partial-thickness burns. Burns. 2002. 28, 791-794.

118. Ozer I. Kinetic analysis of enzyme inactivation under second-order conditions by use of substrate-to-product progress curves: application to the inhibition of trypsin by alpha-1 proteinase inhibitor. Anal Biochem. 1998. 264(2), 199-203.

119. Papadopoulos S. et.al. Radial and longitudal diffusion of myoglobin in single living heart and skeletal muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98(10), 5904-5909.

120. Papazian H.A., Mason L.W. Osmosis and microgravity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. 164(1), 351-354.

121. Petersen W., Tillmann B. Blood and lymph supply of the posterior cruciate ligament: a cadaver study. Knee Surg. 1999. 7, 42-50.

122. Petterson G. Effect of evolution on the kinetic properties of enzymes. Eur. J. Biochem. 1989. 184, 561-566.

123. Phillips R.G., Deen W.M., Brady J.F. Hindered transport of spherical macromolecules in fibrous membranes and gels. AIChE J. 1989. 35, 1761-1769.

124. Phillips R.G., Deen W.M., Brady J.F. Hindered transport of spherical macromolecules in fibrous membranes and gels: effect of solute size and fiber configuration. J. Colloid Interface Sci. 1990. 139, 363-373.

125. Pirot F. et.al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. 94, 1562-1567.

126. Pos O. et.al. Changes in the serum concentration and the glycosylation of human alpha-1 acid glycoprotein and alpha-1 protease inhibitor in severely burned persons: relation to interleukin-6 levels. Clin. Exp. Immunol. 1990. 82(3), 579-582.

127. Prager M.D., Herring M., Germany B., Baxter C.R. Elastase and alpha-1 proteinase inhibitor in burn wound exudates. J. Burn Care Rehabil. 1991. 12(4), 300-305.

128. Raabe E.H., Yoshida K., Schwarting G.A. Differential laminin isoform expression in the developing rat olfactory system. Dev. Brain Biol. 1997. 101, 187-196.

129. Reinert T. et.al. Visualization of collagen fibrils in joint cartilage using STIM. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2001. 181,511-515.

130. Rinehart A.R., Mallya S., Simon S.R. Human alpha 1 proteinase inhibitor binds to extracellular matrix in vitro. Am. J.Respir. Cell.Mol.Biol. 1993. 9(6), 666-679.

131. Rogues C. Massage applied to scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 126-128.

132. Roques C. Pressure therapy to treat burn scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 122125.

133. Rosenberg, Damus. The purification and mechanism of action of human thrombin-heparin cofactor. J. of Biol. Chem. 1973. 248, 6490.

134. Rudenskaya et. al. Isolation and properties of Trypsin PC from the king crab Paralithodes camchatica. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 1998. 24(2), 98-104.

135. Ruoslanti et.al. Extracellular matrices and cell adhesion. Arteriosclerosis. 1985. 5, 581-594.

136. Sakharov D.V. et.al. Two-step targeting of urokinase to plasma clot provides efficient fibrinolysis. Thromb. Res. 1988. 49, 481-488.

137. Sakharov D.V. et.al. Fibrin-specificity of a plasminogen activator affects the efficiency of fibrinolyaia and responsiveness to ultrasound: comparison of nine plasminogen activators in vitro. Thromb. Haemost. 1999. 81(4), 605-612.

138. Sakharov D.V., Lijnen H.R., Rijken D.C. Interactions between staphyllokinase, plasmin(ogen) and fibrin. J. Biol. Chem. 1996. 271(44), 27912-27918.

139. Sakharov D.V., Nagelkerke J.F., Rijken D.C. Rearrangenents of the fibrin network and spatial distribution of fibrinolytic components during plasma clot lysis. J. Biol. Chem. 1996. 271(4), 2133-3138.

140. Sakharov D.V., Plow E.F., Rijken D.C. On the mechanism of the antifibrinolytic activity of plasma carboxypeptidase B. J. Biol. Chem. 1997. 272(22), 14477-14482.

141. Sakharov D.V., Rijken D.C. Superficial accumulation of plasminogen during plasma clot lysis. Circulation. 1995. 92, 1883-1890.

142. Sakharov D.V., Rijken D.C. The effect of flow on lysis of plasma clots in a plasma environment. Thromb. Haemost. 2000. 83(3), 469-474.

143. Sakharov I.Ju., Shekhonin B.V., Glyantzev S.P., Litvin F.E. Immunohistochemical study of purulent wounds treated with King crab collagenasc. Exp. Dermatol. 1994. 3, 51-55.

144. Salmivirta K. et.al. Binding of mouse nidogen-2 to basement membrane components and cells and its expression in embryonic and adult tissues suggest complementary functions of the two nidogens. Exp. Cell Res. 2002. 279, 188-201.

145. Saylam C. et.al. Distribution of fibronectin, laminin and collagen type IV in the materno-fetal boundary zone of the developing mouse placenta. Arch. Gynecol. Obstet. 2002. 266,83-85.

146. Schaefer B.M. et.al. Alpha-2 antiplasmin and plasminogen activator inhibitors in healing human skin wounds. Arch. Dermatol. Res. 1996. 288, 122-128.

147. Schechter N.M. et.al. Diverse effect of pH on the inhibition of human chymase by Serpins. J. Biol. Chem. 1997. 272(39), 24499-24507.

148. Schiffmann Y. The second messenger system as the morphogenetic field. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989. 165(3), 1267-1271.

149. Schmehl K. et.al. Deficiency of epithelial basement membrane laminin in ulcerative colitis affected human colonic mucosa. Int. J. Colorectal Dis. 2000. 15, 39-48.

150. Schwindt D.A., Wilhelm K.P., Maibach H.I. Water diffusion characteristics of human stratum corneum at different anatomical sites in vivo. J. Invest. Dermatol. 1998. Ill, 385-389.

151. Shapiro S.D., Senior R.M. Matrix metalloproteinases: matrix degradation and more. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1999. 20, 1100-1102.

152. Sherman R. Maggot versus conservative debridement therapy for the treatment of pressure ulcers. Wound Rep. Reg. 2002. 10, 208-214.

153. Stanley J.R. et.al. Structure and Function of Basement Membrane. J. of Invest. Dermatol. 1982. 79(S1), 69-72.

154. Tanaka T. Gels. Sci. Am. 1981. 244, 124-138.

155. Teot L. Clinical evaluation of scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 93-97.

156. Terranova V.P., Hujanen E.S., Martin G.M. Basement Membrane and the Invasive Activity of Metastatic Tumor Cells. JNCI. 1986. 77(2), 311-316.

157. Tompkins R.G., Schnitzer J.J., Yarmush M.L. Macromolecular transport within heart valves. Ore. Res. 1989. 64, 1213-1223.

158. Tsonis A. A., Eisner J.B., Tsonis P.A. On the dynamics of a forced reaction -diffusion model for biological pattern formation. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. 86, 4938-4942.

159. Tsu C.A., Craik C.S. Substrate Recognition by Recombinant Serine Collagenase 1 from Uca pugilator J.Biol.Chem. 1996. 271(19), 11563-11570.

160. Tsu C.A., Perona J.J., Schellenberger V., Turck W„ Craik C. The Substrate Specificity of Uca pugilator Collagenolytic Serine Protease 1 Correlates with the Bovine Type I Collagen Cleavage Sites. J.Biol.Chem. 1994. 269(30), 19565-19572.

161. Tsu et.al. Structural basis for the broad substrate specificity of Fiddler crab collagenolytic serine protease 1. Biochem. 1997. 36, 5393-5401.

162. Wright J.B. et.al. Early healing events in a porcine model of contaminated wounds: effects of nanocrystalline silver on matrix metalloproteinases, cell apoptosis, and healing. Wound Rep. Reg. 2002. 10, 141-151.

163. Yurchenco, Schittny. Molecular architecture of basement membranes. FASEB Journal. 1990. 4, 1577-1590.

164. Zouboulis C.C. et.al. Current developments and uses of cryosurgery in the treatment of keloids and hypertrophic scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 98-102.

Информация о работе

Домогатская, Анна Сергеевна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.02

Диссертация

Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы