Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы нарушения обмена хрящевой ткани под влиянием свободных кислородных радикалов в условиях in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ярощук, Галина Васильевна

1. Введение.6

2. Глава I Литературный обзор. 12

1. Патогенез остеоартроза.12

2. Функциональная морфология, физиология и биохимия суставного хряща.17

3. Основная характеристика активных форм кислорода. Возникновение свободных кислородных радикалов, их влияние на ткани и клетки.23

4. Свободнорадикальная патология и система антиокси-дантной защиты. Процесс воспаления как основной фактор поражения тканей при остеоартрозе.30

5. Экспериментальные модели остеоартроза.34

6. Основы хондропротективной терапии при остеоартрозе.38

3. Глава II Материалы и методы.44

1. Материалы.

2. Методы исследования.44

2.1. Получение монослойных культур хондроцитов человека, кролика и крысы.44

2.2. Получение монослойных культур фибробластов кожи здоровых доноров.46

2.3. Определение пролиферативной активности хондроцитов и фибробластов (методы оценки синтеза ДНК и РНК).

2.4. Определение скорости биосинтеза коллагена и протеогликанов хондроцитами в монослойной культуре.47

2.5. Определение хондропротекторного действия артепарона и финоптина на экспериментальной модели остеоартроза у кроликов.50

-42.6. Статистические методы оценки результатов исследований.

4. Глава III Результаты собственных исследований.52

1. Изучение влияния свободных кислородных радикалов на пролиферацию хондроцитов кролика, крысы и человека в монослойной культуре клеток.52

2. Изучение влияния СКР на обмен компонентов хрящевого матрикса.60

3. Изучение влияния экзогенных протеаз и свободных кислородных радикалов на хондроциты и фибробласты человека в монослойной культуре. 66

4. Изучение влияния препарата, содержащего смеси сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) на пролиферацию хондроцитов, продукцию коллагена и протеогликанов.70

5. Изучение влияния различных хондропротекторов на биосинтез хондроцитов человека в присутствии свободных кислородных радикалов и экзогенных протеаз.75

6. Анализ хондропротекторного действия артепарона и финоптина на экспериментальной модели остеоартроза у кроликов.78

5. Глава IV Обсуждение.87

1. Механизмы нарушения обмена хрящевой ткани.

1.1. Хондроцит как структурный элемент соединительной ткани.87

1.2. Процесс воспаления как источник свободных кислородных радикалов.

1.3. Анализ влияния свободных кислородных радикалов на пролиферацию хондроцитов кролика, крысы и человека в монослойной культуре клеток.90

1.4. Анализ влияния свободных кислородных радикалов на процесс обмена компонентов хрящевого матрикса.93

1.5 Анализ влияния свободных кислородных радикалов и экзогенных протеаз на процесс разрушения хрящевого матрикса.94

2. Анализ влияния смеси сульфатированных гликозамино-гликанов (сГАГ) на показатели обмена хондроцитов и фибробластов (кожи и роговицы) человека. Синергическое воздействие свободных кислородных радикалов, протеаз и различных хондропротекторов на монослойную культуру хондроцитов человека.97

3. Анализ хондропротеьсгорного действия Артепарона и Финоптина на экспериментальной модели у кроликов.100

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы нарушения обмена хрящевой ткани под влиянием свободных кислородных радикалов в условиях in vitro"

Нарушение метаболизма суставного хряща, приводящее к его деструкции, может быть следствием практически любого заболевания суставов. Воспалительные заболевания суставов зачастую предшествуют остеоартрозу (ОА), являющемуся распространенным заболеванием, при котором происходит преимущественное поражение хрящевой ткани суставов (14, 25).

Патогенез остеоартроза изучен недостаточно, но, по мнению многих исследователей, ключевым моментом его патофизиологии является нарушение обмена структурных компонентов соединительной ткани хряща - матрикса и хондроцитов (27, 37). Характерным признаком деструкции хрящевой ткани является потеря матриксом гликозаминогликанов (ГАГ) во всех слоях хряща (199, 210). Хондроциты наиболее чувствительны к содержанию суль-фатированных гликозаминогликанов в окружающем их матриксе, поэтому возникновение качественных или количественных нарушений протеогликанового компонента приводит к изменениям в обмене хондроцитов (23, 123). Прогрессирующее уменьшение содержания ГАГ сопровождается разволокнением и расщеплением матрикса хряща, одновременно развиваются катаболические процессы и возрастает активность ферментов, разрушающих коллаген и протеогликаны (41, 200). Не менее важную роль в процессе деструкции хряща играют такие биогенные факторы, как интерлейкины, факторы роста, протеазы, компоненты межклеточного матрикса, свободные кислородные радикалы (СКР) и т.д. (29, 39, 230). При артритах и артрозах СКР в ассоциации с про-теолитическими энзимами способны, по мнению ряда авторов (6,

-7126, 133), играть важную роль в поражении хрящевой ткани суставов.

Известно, что при ревматических заболеваниях главным источником активных форм кислорода являются полиморфноядер-ные лейкоциты и макрофаги (22, 29, 46). Свободные кислородные радикалы вызывают окислительную модификацию многих типов макромолекул и в ряде случаев даже приводят к их полной деградации (2, 13, 167).

Учитывая тот факт, что во всех клетках присутствуют многочисленные оксидазные ферментные системы, способные генерировать СКР, то их гиперпродукция или снижение активности в антиоксидантной системе могут быть причиной развития многих патологических изменений (12, 135, 229).

Именно поэтому исследование механизмов патогенеза остео-артроза на клеточном уровне (в условиях in vitro), а также изучение процессов, связанных с восстановлением функций хрящевой ткани под действием различных хондропротективных препаратов, являются актуальными и перспективными.

Цель работы

Определить роль свободных кислородных радикалов при повреждении суставного хряща, сравнить хондропротективное действие различных препаратов в культурах клеток и в модельной системе остеоартроза на кроликах.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние свободных кислородных радикалов на пролиферацию хондроцитов крысы, кролика и человека в монослойной культуре этих клеток.

2. Исследовать эффект свободных кислородных радикалов на синтез коллагена и протеогликанов хондроцитами в культуре.

3. Определить степень разрушения монослоя хондроцитов и фиб-робластов человека протеиназами в присутствии свободных кислородных радикалов и различных хондропротективных препаратов.

4. Изучить влияние смеси сульфатированных гликозаминоклика-нов (сГАГ) на пролиферацию хондроцитов, на продукцию ими коллагена и протеогликанов.

5. Провести сравнительный анализ хондропротекторного действия артепарона и финоптина на экспериментальной модели ос-теоартроза у кроликов.

Научная новизна работы

Проведены исследования на монослойной культуре хондроцитов кролика, крысы и человека по оценке биосинтеза этими клетками коллагеновых белков и протеогликанов. Предложена модель свободнорадикальных процессов в монослойной культуре хондроцитов с использованием микрометодов.

Изучено воздействие различных доз биологически активных препаратов на монослойную культуру хондроцитов, как совместно с СКР, так и после их повреждающего воздействия.

Показано, что при одновременном воздействии СКР и проте-олитических ферментов резко усиливаются процессы деструкции соединительной ткани. Данный феномен имеет важное значение при любом типе воспаления.

Положения, выносимые на защиту:

1. Действие СКР на биосинтетическую активность хондроцитов имеет бифункциональный характер. При низких физиологических концентрациях свободные кислородные радикалы стимулируют функциональную активность данных клеток, а при высоких подавляют.

2. Деградация протеогликанов свободными кислородными радикалами происходит за счет разрушения коровых белков данной молекулы. При этом боковые цепи гликозаминогликанов остаются практически неизменными.

3. При одновременном воздействии свободных кислородных радикалов и протеолитических ферментов резко усиливаются процессы деструкции матрикса соединительной ткани.

Практическая ценность работы

Благодаря проведенным исследованиям было впервые продемонстрировано бифазное (разнонаправленное) действие СКР на синтез протеогликанов клетками хряща (стимуляция при низких концентрациях и подавление при высоких). Показан повреждающий эффект СКР не только на матрикс клеточного монослоя, но и на хондроциты. Этот факт является серьезным указанием на патогенетическую роль СКР при развитии ОА, заключающуюся в повреждении хондроцитов и деструкции матрикса хряща. Следовательно, изучение действия СКР на обмен клеток хряща и межклеточный матрикс хрящевой ткани, особенно в сочетании с про-теолитическими ферментами, важно и актуально. Одновременное исследование хондропротективного действия некоторых биологических препаратов, в том числе и в качестве антиоксидантных средств, имеет существенное значение для практической медицины.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Всесоюзном съезде ревматологов (Минск, 1991), V ревматологическом симпозиуме (Прага, 1993), XIII Европейском ревматологическом конгрессе (Амстердам, 1995), II Всероссийском съезде ревматологов (Тула, 1997).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения полученных материалов (всего 4 главы), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 41 отечественный и 189 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами, 11 рисунками и 2 графиками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ярощук, Галина Васильевна

выводы

1. Свободные кислородные радикалы способны непосредственно влиять на функциональную активность хондроцитов и структуру вновь синтезированных молекул соединительной ткани. Эти свойства свободных кислородных радикалов играют важную роль в нормальной и патологической физиологии хрящевой ткани. При остеоартрозе свободные кислородные радикалы способны изменять свойства матрикса хряща и его клеточных элементов, приводя к развитию патологии.

2. Действие свободных кислородных радикалов на биосинтетическую и пролиферативную активность хондроцитов имеет бифункциональный характер. При низких физиологических концентрациях (10"5 Ед/мл) свободные кислородные радикалы стимулируют биосинтез протеогликанов, а при высоких (от 10"4 до 10"2 Ед/мл) его подавляют.

3. Разрушение протеогликанов свободными кислородными радикалами происходит за счет деградации коровых белков данной молекулы. При этом боковые цепи протеогликанов - гли-козаминогликаны, практически не повреждаются свободными кислородными радикалами.

4. При одновременном воздействии свободных кислородных радикалов и протеолитических ферментов усиливаются процессы деструкции матрикса соединительной ткани. Этот феномен имеет важное значение для развития воспаления, потому что при всех его видах наблюдается увеличение кислородных радикалов и активности протеолитических ферментов.

5. Низкие концентрации коллагеназы (150-300 мкг/мл), которые в обычных условиях не влияют на целостность монослоя хондроцитов, в присутствии свободных кислородных радикалов оказывают выраженное действие на распад межклеточного матрикса в культуре.

6. В монослойной культуре хондроцитов Артепарон и Румалон в концентрациях от 100 до 200 мкг/мл на 30%-50% подавляют эффект разрушающего синергического действия свободных кислородных радикалов и коллагеназы на хрящевой матрикс. В аналогичных условиях препарат из смеси сульфатированных гликозаминогликанов в концентрации 100 мкг/мл оказывает лучший эффект на сохранность клеточного монослоя, чем Артепарон и Румалон.

7. Сравнительный анализ хондропротективного действия Артепа-рона и Финоптина на экспериментальной модели остеоартроза у кроликов показал, что они снижают частоту и выраженность воспалительного процесса в суставе, достоверно увеличивая пролиферативные показатели хондроцитов.

Практические рекомендации

В настоящее время биохимия процесса нормальной и патологической физиологии хряща исследована крайне недостаточно, поэтому развитие теоретических исследований в данной области является актуальным не только для ревматологии, но и для биологии в целом. Выводы и обобщения, полученные в настоящей работе, расширяют существующее представление о механизмах нарушения метаболизма соединительной ткани в норме и при воспалении. Предложенная модель по изучению влияния СКР на монослойную культуру хряща в условиях in vitro позволяет более широко изучать физиологическое состояние клеток при воспалении. Поэтому использование данной модели позволит не только более полно охарактеризовать механизмы деградации хрящевого матрикса, но и провести первичную оценку хондропротективного

-106и антиоксидантного эффектов веществ, являющихся базовой основой антиревматических лекарственных препаратов.

Необходимо отметить, что благодаря микрометодам, которые были применены в предложенной модели, стоимость исследований значительно снижается, а время, необходимое для первичного скрининга действующих нативных веществ существенно сокращается. Это, в конечном результате, может значительно ускорить разработку новых лекарственных препаратов исключая использование лабораторных животных при первичном скрининге лекарственных веществ.

Результаты, полученные в представленной работе являются теоретической базой для дальнейшего изучения роли СКР в патофизиологии как заболеваний соединительной ткани, так и организма в целом.

Таким образом, представленная работа имеет важное значение для теоретической биологии, медицины и практического здравоохранения, позволяя глубже понять патофизиологические механизмы, лежащие в основе процессов обмена хряща при воспалении, открывая новые подходы к аппробации антиоксидант-ных и противовоспалительных лекарственных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ярощук, Галина Васильевна, Москва

1. Агишева К.Н. Перекисное окисление липидов и антиокси-дантная система в патогенезе и клинике ревматоидного артрита и системной красной волчанки. Автореф. дис. канд. мед. наук., Ярославль, 1988.

2. Арчаков А.И., Мохосоев И.М. Модификация белков активным кислородом и их распад. Биохимия, 1989, т.54, вып.2, с.179-186.

3. Аскаров А.Ф. О роли регионарного кровообращения в патогенезе ДОА. Ревматология, 1985, №1, с.27-30.

4. Астапенко М.Г. Современное состояние проблемы ДОА. -Ревматология, 1984, №2, с.61-65.

5. Астапенко М.Г., Копьева Т.Н., Дуляпин В.А. и др. Клинико-лабораторная характеристика синовита при ДОА. Ревматология, 1984, №4, с.10-13.

6. Барнс К.Г. Ревматоидный артрит. Клиническая ревматология. - Под ред. Х.Л.Ф.Кэррея: пер. с англ. - М., 1990, с.53-85.

7. Беклимишев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция -М., 1986.

8. Бобырев В.Н. Биохимическая фармакодинамика и молекулярные механизмы действия антиоксидантов как средств профилактики и лечения свободнорадикальной патологии. -Дис. д-ра мед. наук, Полтава, 1990.

9. Бобырева Л.Е. Свободнорадикальное окисление, антиокси-данты и диабетические ангиопатии. Вопросы мед. химии, 1996, №6, с.14-20.

10. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма. Успехи современной биологии, 1989, том 108, вып.1(4), с.3-16.

11. Дуглас У. Целительные свойства перекиси водорода. -Санкт-Петербург, Питер, 1998, с.19-51, с.179-183.

12. Жаденов И.И., Пастель В.Б. Обменные процессы в суставном хряще в норме и при патологии (остеоартроз). Ортопед., травматол., 1982, №3, с.65-70.

13. Замараева Т.В., Лебедев Д.А. Поперечные ковалентные связи, стабилизирующие коллагеновые структуры в норме и патологии. Вопросы мед. химии, 1985, №1, с.10-23.

14. Ивлева В.В. Витамин С будущее становится настоящим. В кн.: ВитаЛайн: подробно о наших продуктах. М., 1999, с.55-65.

15. Иммунология. Под редакцией У.Пола в трех томах, М., Мир, 1987, т. 1, с.166-167.

16. Корязова Л.К., Гулевский А. К. Биохимия животных и человека, 1990, вып.14, с.70-79.

17. Лаврищева Г.И., Михайлова Л.Н. К вопросу о репаративной регенерации суставного хряща. Ревматология, 1985, №4, с.46-49.

18. Лебедев Д.А. Обмен коллагена при ССД. Вопросы мед. химии, 1978, №6, стр. 789-795.

19. Мазуров В.И., Лила А.М., Шелухин В.А. и соовт. Продукция интерлейкина-2 мононуклеарными клетками периферической крови у больных ревматоидным артритом. Клинич. медицина, 1991, №3, с.89-91.22