Моделирование полисахарид-полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и адсорбции на корнях пшеницы

Арефьева, Оксана Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование полисахарид-полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и адсорбции на корнях пшеницы
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Моделирование полисахарид-полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и адсорбции на корнях пшеницы"

На правах рукописи

АРЕФЬЕВА ОКСАНА АНАТОЛЬЕВНА

МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОЛИСАХАРИД-ПОЛИСАХАРИДНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ПРОЦЕССАХ АГРЕГАЦИИ БАКТЕРИЙ АгОБРШЬЬиМВЯАБ1ЬЕМБЕ вр245 И АДСОРБЦИИ НА КОРНЯХ

ПШЕНИЦЫ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2006

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с.

С.М.Рогачёва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ковалева Тамара Андреевна

доктор химических наук, профессор Щеголев Сергей Юрьевич

Ведущая организация - Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится ноября 2006 г. в ч. на заседании

диссертационного совета Д 212.038.03 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологический наук Грабович М. Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.* Межклеточные взаимодействия составляют основу жизнедеятельности всех живых организмов.

Большой теоретический и практический интерес представляет исследование механизмов симбиотических взаимодействий высших растений и почвенных микроорганизмов. Это связано с перспективами использования ассоциативных азотфиксирующих бактерий в качестве продуцентов индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), стимулирующей рост и продуктивность сельскохозяйственных растений. Одним из наиболее изученных штаммов из числа ризосферных азотофиксирующих бактерий рода АгоэртИит является АгоэртПит ЬгавИете Бр245, который преимущественно ассоциирован с корнями пшеницы.

Способность бактерий к агрегации и сорбции на корнях растений зависит от структуры компонентов бактериальных и растительных клеточных поверхностей. В процессах взаимодействия азоспирилл между собой и с корневой поверхностью выявлено участие белков, липополисахаридов (ЛПС) внешней мембраны бактерий, капсульных полисахаридов, полисахарид - содержащих комплексов, экскретируемых в окружающую среду. Но макромолекулы, ответственные за специфичность этих процессов, а также механизмы взаимодействий окончательно не определены,

В системе азоспириллы-злаки, так же как и в других межклеточных контактах, наиболее изучены белок-углеводные взаимодействия. Возможность существования углевод-углеводных взаимодействий показана лишь в единичных работах на животных клетках (Накотоп, 2001) и клетках дрожжей (М1сЬа1сЫк, 2000). Не исключено, что подобный механизм может играть важную роль и в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций.

Для выяснения такой возможности целесообразно использовать методы моделирования, экспериментальные и компьютерные.

Поскольку наружная мембрана бактерий рода АгоэриШит состоит из липидного бислоя, адекватной моделью для экспериментального моделирования процесса полисахарид-полисахаридного взаимодействия могут служить липосомы, инкрустированные ЛПС бактериальной поверхности.

Способность модельных систем имитировать процессы агрегации и адсорбции бактерий можно использовать в прикладных целях, например для транспорта химических соединений с разнообразной биологической активностью к корням растений.

♦Научным консультантом работы являлся профессор, д.х.н. Кузнецов

П.Е.

Разработав подход для конструирования таких систем, можно создавать средства доставки, распознающие клетки-мишени целевых растений, по аналогии с системами транспорта лекарственных веществ в организме человека.

Все вышеизложенное определяет актуальность данной работы.

Цель диссертационной работы: разработка моделей бактериальной поверхности АгозртИит ЪгазИете Бр245 и их применение для изучения роли полисахарид - полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации микробных клеток и адсорбции на корнях пшеницы.

Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести компьютерное моделирование конформации О-специфического полисахарида (О-ПС) ЛПС наружной мембраны бактерий АгояртПит ЬгаяИете Бр245 и динамики полисахарид - полисахаридного взаимодействия.

2. Разработать экспериментальные модели поверхности клеток АгозртИит ЬгаэИеюе Бр245 для изучения полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

3. Исследовать процесс агрегации модельных систем.

4. Изучить процесс адсорбции экспериментальных моделей на поверхности корней пшеницы.

5. Оценить возможность доставки химических веществ к корням растений с помощью наносистем с углеводной детерминантой.

Научная новизна работы:

Методами молекулярной динамики установлены термодинамически равновесные конформации О-ПС в водной фазе. Показано, что при взаимодействии двух цепей полисахаридов с антипараллельной ориентацией наиболее энергетически выгодной является структура типа двойной спирали, образованная за счет межмолекулярных водородных связей. Установлено, что полисахариды, ориентированные параллельно друг другу, не образуют устойчивого комплекса.

Разработаны экспериментальные модели бактериальной поверхности, представляющие собой липосомы, инкрустированные липополисахаридами внешней мембраны клеток А. ЬгаьИете Бр245. Показано, что ЛПС встраиваются в липосому таким образом, что их О-ПС направлен в окружающую среду и расположен по нормали к поверхности липосом.

Впервые данные экспериментальные модели использованы для изучения полисахарид-полисахаридных взаимодействий в межклеточных контактах в системах бактерии-бактерии, бактерии-злаки. Установлено, что липосомы, инкрустированные ЛПС внешней бактериальной мембраны, подобно живым микробным клеткам, образуют агрегаты и способны сорбироваться на корневой поверхности пшеницы.

Научно-практическая значимость работы:

Впервые изучена возможность применения наносистем для направленного транспорта химических веществ к корням растений. В

модельных экспериментах показана высокая эффективность доставки химического соединения к корням пшеницы с помощью наночастиц диоксида кремния, обогащенных растительными полисахаридами, и липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны А. brasilense Sp245. Полученные результаты предлагается использовать при разработке систем доставки биологически активных веществ к корням растений с целью уменьшения антропогенной нагрузки на окружающую среду.

Модифицирован метод расчета энергии сольватации химического соединения в среде вода-липид и оценки его ориентации на границе раздела этих фаз и разработаны соответствующие алгоритм и программа.

Материалы диссертационной работы использовались при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета Саратовского государственного университета и Курского государственного технического университета, а также применялись в курсе лекций «Молекулярная биология» и в практикуме по молекулярной биологии на биологическом факультете Саратовского государственного университета.

Работа выполнена в рамках плановой госбюджетной темы НИР ИБФРМ РАН "Изучение биологически активных веществ и моделирование их действия на растения и микроорганизмы расчетно-теоретическими методами" (№ гос. регистрации 01.200.116077).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Взаимодействие двух цепей О-ПС внешней мембраны бактерий А. brasilense Sp245, ориентированных антипараллельно, приводит к образованию структуры типа двойной спирали, стабилизированной межмолекулярными водородными связями и снижению полной энергии системы.

2. Липосомы, содержащие на своей поверхности О-ПС азоспирилл, образуют агрегаты посредством полисахарид-полисахаридного взаимодействия и подобно живым бактериальным клеткам сорбируются на корневой поверхности пшеницы.

3. Разработанные наносистемы с углеводными детерминантами являются эффективными средствами для направленного транспорта химических веществ к корням растений.

Апробация работы Основные результаты диссертации обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях:

Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia, 2003, 2004.

1-ая и 2-ая Российские школы-конференции "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине", Саратов, 2002,2004.

Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants - International Symposium, Saratov, Russia, 2003.

Macromolecular Organization and Cell Function - Gordon Research Conference, Oxford, Great Britain, 2004.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале из списка ВАК и 2 статьи в зарубежных изданиях.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы исследования», четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 170 источников, из которых 119 на иностранных языках.

Работа поддержана Программой Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы», раздел 3.3 «Развитие научно-исследовательской работы молодых преподавателей и научных сотрудников, аспирантов и студентов», проект № 45436.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

Рассмотрены процессы агрегации почвенных бактерий рода Azospirillum и их адсорбции на корнях растений, обсуждено участие в них белковых и углеводных компонентов клеточной поверхности. Отмечено, что роль ЛПС внешней бактериальной мембраны в таких взаимодействиях не изучена. Описана структура ЛПС бактерий А. brasilense Sp245, состоящего из липида А, олигосахаридного «кора» и О-специфической посахаридной части (D-рамнана).

Проанализированы основные молекулярные механизмы межклеточных контактов. Показано, что в свете открытий последних лет (Hakomori, 2001), нельзя исключить возможность полисахарид-полисахаридных взаимодействий в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций.

Обсуждены принципы экспериментального моделирования межклеточных взаимодействий. Приведена классификация методов молекулярного моделирования, позволяющих исследовать конформации полисахаридов и прогнозировать образование комплексов такими структурами. Обоснована возможность применения компьютерной программы «HyperChem» для решения задач, поставленных в данной работе.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовались бактерии Azospirillum brasilense Sp245 из коллекции ИБФРМ РАН (Саратов). Культура выращивалась на жидкой синтетической малатной среде при 30°С (Dobereiner, Day, 1976), при встряхивании на качалке с частотой вращения 100 об/мин до логарифмической фазы роста.

Выделение ЛПС из внешней бактериальной мембраны проводилось по модифицированной методике (Бурыгин, 2003). При наличии белковых примесей, определяемых с помощью ПААГ-электрофореза, препарат ЛПС подвергался дополнительной очистке с использованием катионита КУ-2 в Н+ форме (Учебно-методич. пособие, 2005).

В экспериментах по агрегации и адсорбции модельных систем на корнях пшеницы использовался препарат ЛПС, выделенный и очищенный сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (г. Саратов) (Федоненко, 2001; Fedonenko, 2002).

Модельные системы - липосомы, инкрустированные ЛПС - получали введением 10 %-ного этанольного раствора яичного фосфатидилхолина до концентрации 1.4 г/л в водные растворы ЛПС с концентрацией 23 или 150 мг/л, при температуре 50°С, при перемешивании на магнитной мешалке. Полученную суспензию озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе UD-11 ("Elpan", Польша) 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Недиспергированные фосфолипиды удаляли с помощью центрифугирования (центрифуга К-24, Германия) взвеси в течение 10 мин при 8000 об/мин.

Размеры агрегатов липосом определялись методом динамического рассеяния света в режиме «записи аналогового сигнала» (Khlebtsov et al., 2003).

Моделирование взаимодействия между полисахаридными фрагментами О-ПС бактериального ЛПС, а также определение геометрического пространственного строения О-ПС бактериального ЛПС и его расположения относительно плоскости липосомальной везикулы проводилось в коммерческой программе HyperChem 7.0е методом молекулярной динамики с молекулярно-механическим силовым полем Amber S.

Для определения положения О-ПС относительно билипидного слоя использовали метод лежачей капли. Каплю растворителя 1-бромбутана, содержащего 10"3 % лецитина, помещали на дно стеклянной кюветы с дистиллированной водой. Через определенные промежутки времени вносили в воду растворы ЛПС, увеличивая, таким образом, его концентрацию. Фотографически фиксировали изменение во времени контура капли. Определяли поверхностное натяжение капли в зависимости от концентрации ЛПС в водной фазе, используя формулы и таблицы Кошевника (Кошевник и др., 1953). Площадь монослоя липида, приходящуюся на 1 молекулу ЛПС рассчитывали по формуле Гиббса.

Для изучения адсорбции модельных систем на корнях пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29, проводилось инкубирование (45 мин и 24 ч) корней проростков в следующих растворах и суспензиях: 1) раствор метиленового синего (МС), 1,0 мг/л; 2) раствор ЛПС (150 мг/л) + раствор МС (0,9 мг/л); 3) липосомы, загруженные МС (0,7 мг/л); 4) липосомы с низким содержанием ЛПС (23 мг/л) и загруженные МС (0,7 мг/л); 5) липосомы с высоким содержанием ЛПС (150 мг/л) и загруженные МС (0,7 мг/л). Краситель МС использовался в качестве маркера. Для его введения в липосомы спиртовой раствор яичного фосфатидилхолина инжектировали в

водный раствор красителя с концентрацией 0.1 г/л. Не включившийся в липосомы краситель удаляли диализом против воды в течение суток. После инкубации в суспензиях и растворах корни тщательно промывали дистиллированной водой, растирали в ступке и экстрагировали 96 %-ным этанолом в течение 1 ч. В спиртовом экстракте корней содержание красителя определяли на спектрофотометре «Бресогс! М40», X = 632 нм.

Для оценки влияния ТМ-ацетилглюкозамина на адсорбцию экспериментальных моделей корни пшеницы предварительно выдерживались в 15 и 30 мМ растворах аминосахара в течение 1 часа. Затем отрезанные корешки инкубировались в течение 45 мин и 24 ч в суспензиях липосом, содержащих МС и ЛПС (110 мг/л). Срезы корней фиксировались над поверхностью суспензии. Количество адсорбированного маркера определялось спектрофотометрически.

В экспериментах по изучению возможности доставки химических веществ к корням растений использовались наночастицы, обогащенные растительными полисахаридами, и липосомы, инкрустированные ЛПС и загруженные индолил-3-уксусной кислотой.

Полисахариды выделяли из биомассы корней пшеницы методом концентрирования этанольного экстракта с последующей гель-фильтрацией (Коннова и др., 2005).

Гидрозоль наночастиц получали трехкратным ультразвуковым дезинтегрированием водной суспензии диоксида кремния ('ТШка", диаметр 0,7 нм) 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Гидрозоль наночастиц с флуоресцеином-Ыа (ФН), получали разбавлением исходного гидрозоля 10"5М раствором красителя до конечной концентрации частиц 10"2, 10 , 10"4 г/л при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 ч.

Для получения наночастиц, инкрустированных полисахаридами, к их суспензии приливали растворы высокомолекулярных или низкомолекулярных фракций растительных полисахаридов до конечной концентрации 10"1, 10", 10'3 г/л при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 ч.

Для регистрации адсорбции наночастиц на корнях пшеницы от проростков пшеницы отделяли целые корни, помещали их в бкжсы с 10"5М раствором ФН или суспензией наночастиц с красителем. Корни погружали в среды таким образом, чтобы места их срезов оставались над поверхностью, и выдерживали 1 ч. По окончании инкубации корни экстрагировали водой в течение 1 ч, ценрифугировали 10 мин при 10000 об/мин, отбирали 1 мл супернатанта, смешивали с 5 мл фосфатного буфера рН 8.25 (1:5). Измеряли интенсивность флуоресценции на спекгрофлюориметре "Флюорат-панорама-02В" при Хвозб. 491 нм, Книс. 512 нм. Концентрацию ФН определяли по калибровочной кривой. Растворами сравнения для экстрактов служил водный экстракт корней пшеницы с содержанием фосфатного буфера рН 8.25 в соотношении 1:5.

Липосомы с (ИУК) готовили инжекцией 10 %-ного спиртового раствора фосфатидилхолина в цитрат-фосфатный буфер (рН=6.0),

содержащий ЛПС в концентрации 150 мг/л и ИУК в концентрациях 0.1; 1 и 10 мг/л. Включенный в липосомы гетероауксин определяли спектрофотометрически по реакции Сальковского после разрушения липосом детергентом додецилсульфатом натрия (ДСН) (100 мкл 10 мМ раствора ДСН на 1 мл эмульсии липосом), визуально до исчезновения опалесценции. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «Specord М40» при 490 нм, / = 1 см.

Глава 3. Молекулярное моделирование поверхности грамотрицательных бактерий Azospirillum brasilense Sp 245

Целью молекулярного моделирования было определить конформацию О-специфичекой части ЛПС и расположение О-ПС в водной среде относительно билипидного слоя.

Теоретические расчеты. Для выяснение ориентации полисахарида на границе раздела фаз вода-липид был выбран метод Хопфингера, позволяющий рассчитывать энергию сольватации молекулы вещества. Но поскольку оценка энергии сольватации по Хопфингеру является неточной, метод был модифицирован.

Свободная энергия растворителя оценивается по формуле Хопфингера (Hopflnger, 1976):

где,/ - энергия переноса атома i из вакуума в среду (мембрану или воду),

Vi -объем сольватной сферы за вычетом объема, занимаемого ван-дер-ваальсовой сферой атома i и соседних с ним ван-дер-ваальсовых сфер, Voi - объем сольватной сферы без ван-дер-ваальсова объема атома /.

Уравнение Хопфингера не учитывает, что при движении атомов молекулы из одного растворителя в другой уменьшается объем сольватной сферы, составленный молекулами первого растворителя, и формируется сольватная сфера, составленная из молекул второго растворителя. Таким образом, вблизи границы раздела фаз атом имеет сложную сольватную оболочку, в которую входят молекулы обоих растворителей.

Поскольку гидратные оболочки имеют радиусы в диапазоне 4 - 8 А (Буркерт,1986), их размеры сопоставимы с размерами молекулы. Следовательно, необходимо хотя бы приближенно учитывать структуру сольватных оболочек.

Примем для простоты, что вне зависимости от типа атома и растворителя сольватная оболочка имеет радиус R = 6 А. Если атом имеет координату Zt такую, что

где - координата слоя, ближайшего к ядру атома ¡, то вклад атома 1 в свободную энергию растворителя рассчитывается в соответствии с формулой (1) и равен

(1)

\zt-zs\>R

(2)

д = гу*/у*

"VI ¥к 'г ы

Если неравенство (2) не выполняется, то часть сольватной сферы окажется в мембранной среде, а часть - в воде. Очевидно, что вклад в

{»у* ¡у™ гтут ¡ут энергию Р атома 1 будет между ' ы и ' ы .

Если часть сольватной сферы, относящейся к растворителю, есть то этот вклад равен

(4)

Таким образом, для расчета свободной энергии растворителя следует уметь рассчитывать в = \у,т . Полный объем сольватной сферы есть

° ~ 1

3 (5)

Если мы построим алгоритм расчета объема части сольватной сферы, находящейся, например, в воде, то

= У л» ~ ^~ ^^

и задача расчета свободной энергии будет решена.

Для нахождения V,-», сольватная сфера атома 1 была разбита на 2п сферических сегментов плоскостями, перпендикулярными оси Z так, чтобы первая плоскость проходила через точку а 2п+1-я плоскость - через

точку + Я.

Тогда объем каждого у -го сегмента V/ равен:

яЛ(Згу.а+Згу+Аа) У'--б-'

п=л*-(я-г,У; (7)

г,=0; г2=Ь/2; г2п+2=2Я;

3=1,... ,2п+1;Ь=К/п

Искомая величина v,w есть

(8)

Знак ' означает, что суммирование ведется только по тем сегментам, центры которых находятся в воде.

Таким образом, для расчета свободной энергии растворителя F следует вычислить vI по формуле (7), V0- по формуле (5), viw - по (8), затем т; и г,т -по (6), ф1 - по (3), если выполняется условие (2), либо (4) - если не выполняется (2), и, наконец, F по следующей формуле:

f-E.A W

Описанный алгоритм реализован в программе на языке С++ для ЮМ-

Экспериментальная часть. Компьютерный эксперимент осуществлен в коммерческой программе НурегСЬеш 7.0е. Проведена оптимизация конформации одного звена О-ПС в водном микроокружении. В расчетной модели съимитирована малая подвижность конца полисахарида, связанного с «кором» (примембранной частью молекулы ЛПС), что соответствует его состоянию в бактериальной мембране. В результате получены энергетически устойчивые структуры, имеющие форму псевдоспирали и стабилизированные внутримолекулярными водородными связями (рис.1).

Рис. 1. Молекулярно-динамическое моделирование конформации одного звена О-ПС ЛПС бактерий А. ЬгаяИете Бр245. Показаны конформации, полученные через указанные промежутки времени после погружения полисахарида в воду

Моделирование пространственного расположения молекулы О-ПС, состоящего из пяти звеньев Б-рамнана, относительно границы раздела фаз вода-липофильная среда (бактериальная мембрана), проведено в рамках модифицированной нами континуальной модели Хопфингера-Шераги.

Показано, что для молекулы липополисахарида энергетически выгодным является положение, при котором полисахаридная часть экспонирована в водную фазу, а липид А - в бислой (рис. 2). При чем, О-ПС расположен по нормали к поверхности, имитирующей внешнюю бактериальную мембрану.

ПЭВМ.

30 рз

Вода

Для подтверждения данных молекулярного моделирования проведены исследования межфазного натяжения на границе вода-липид (яичный лецитин) в зависимости от концентрации в водной среде ЛПС. В экспериментах использовали метод лежачей капли. Характер зависимости на рис. 3. свидетельствует об увеличении гидрофильности капли с ростом концентрации ЛПС. Это доказывает, что ЛПС встраивается липидной частью в монослой лецитина на поверхности растворителя, а полисахаридный фрагмент остается в водной фазе.

. А

Рис. 3. Зависимость межфазного натяжения (о) от молярной концентрации (С|) ЛПС. Кривая - аппроксимация по формуле Шишковского.

Из полученных экспериментальных данных по формуле Гиббса рассчитана площадь, которую занимает одна молекула ЛПС в монослое -92±4 А, следовательно ориентация О-ПС относительно липидного бислоя может быть только по нормали к поверхности.

Знание пространственного расположения О-ПС относительно плоскости бактериальной мембраны позволило провести моделирование полисахарид-полисахаридное взаимодействия.

Глава 4. Экспериментальное и компьютерное моделирование процесса агрегации бактерий Л. ЬгазИепхе Бр 245

Для определения роли О-ПС ЛПС бактерий А. ЬгазИепяе Бр245 в процессе агрегации клеток, методом динамического рассеяния света проанализирован размер частиц в суспензиях липосом без ЛПС и липосом со встроенным ЛПС (рис.4). Размер частиц вычисляли по параметру а автокорреляционной функции, рассчитанному из приведенных на графике данных по методу наименьших квадратов с использованием аппроксимации §(т)~ехр(-а т).

В начальный момент времени средние размеры частиц составили около 210 нм как в суспензии липосом с ЛПС, так и в суспензии пустых липосом. С течением времени средний размер частиц во взвеси липосом с ЛПС увеличился до 430 нм, в суспензии пустых липосом не изменился.

Автокорреляционная функция

е(х)

§(т)-ехр(-аг)

а=0.68

• БЁе=430 пт

1 - Д

а=1.4

аке-210пт

. 1. 1 . ! 1

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

мс

Рис. 4. График зависимости нормированной автокорреляционной функции флуктуаций фототока рассеянного света при температуре 298 К от времени 1 для пустых липосом (1) и липосом со встроенным ЛПС (2).

Полученные результаты свидетельствуют о заметном увеличении среднего размера агрегатов липосом, инкрустированных ЛПС, и доказывают наличие взаимодействий между полисахаридными фрагментами, встроенными в искусственные мембраны.

В программе HyperChem проведено компьютерное моделирование динамики полисахарид-полисахаридного взаимодействия при условии: 1) антипараллельного расположения двух полисахаридов, состоящих из одного звена О-ПС; 2) направленного по нормали к поверхности липосомы и параллельного расположения двух полисахаридов, состоящих из одного звена О-ПС; 3) начальной параллельной ориентации двух полисахаридов, состоящих их 5 звеньев О-ПС.

В первом случае наблюдалось образование структуры, подобной двойной спирали, которая образовывалась за счет межмолекулярных водородных связей. Выигрыш в потенциальной энергии между исходным и конечным состояниями составил около 190 ккал/моль, т.е. полисахарид-полисахаридное взаимодействие является энергетически выгодным.

Во втором случае было показано, что в течение всего времени расчетов полисахариды не приближаются друг к другу и не образуют никакого устойчивого комплекса (рис.5).

Рис.5. Расположение двух цепей, состоящих из одного звена О-ПС бактериального ЛПС, направленных параллельно друг другу и по нормали к поверхности сферы, имитирующей липосому

В третьем случае показано, что О-ПС стремятся расположиться антипараллельно друг другу и образовать структуру типа двойной спирали , (рис. 6).

• - фиктивные атомы с молекулярной массой 1000 Да, имитирующие малоподвижные связанные с «кором» концы О-ПС

* - направление, которое принимают относительно друг друга полисахаридные цепи через 100 рс моделирования

Рис.6. Комплекс, полученный в результате молекулярно-динамического моделирования взаимодействия двух цепей, состоящих из пяти звеньев О-ПС бактериального ЛПС, при исходной параллельной ориентации.

Таким образом, данные компьютерного и экспериментального моделирования указывают на участие полисахарид-полисахаридных взаимодействий в процессе агрегации бактерий рода Аго$рт11ит.

Глава 5. Исследование процесса адсорбции экспериментальных моделей на поверхности корней пшеницы

Для изучения роли О-ПС в процессе адсорбции бактериальных клеток на корнях пшеницы использовались следующие модельные системы: липосомы, инкустированные ЛПС и загруженные красителем МС.

Проведена инкубация корней проростков пшеницы ТгШсит аевИуит Ь. сорта Саратовская 29 в растворах и суспензиях модельных систем в течение 45 мин и 24 ч. Показано, что липосомы без ЛПС не обладают сродством к поверхности корней растений. Отмечено значительное увеличение степени сорбции МС корнями пшеницы в эмульсиях липосом с ЛПС (рис. 7А,Б). С увеличением концентрации ЛПС в липосомах наблюдался рост степени адсорбции более чем в 2,5 раза.

Наличие ЛПС (150 мг/л) в липосомах увеличивало не только степень, но и скорость сорбции красителя (рис. 7А,Б): за 45 мин на корнях сорбировалось 85 ± 9 % красителя от максимально возможного количества. В суспензии липосом без ЛПС этот показатель составил 53 ± 20 %. Следует отметить, что количество сорбированных на корнях липосом с ЛПС не увеличивалось после 24 ч инкубации. Подобная динамика наблюдалась и в процессе адсорбции живых бактериальных клеток A. brasilense Sp 245, что объясняли ограниченным количеством сайтов связывания на корнях пшеницы (Zamudio, 1994).

А Б

млн.доли

60 1

40 - £ м Ч

20 - JL !

0 - й ii Н ЯШ

а б в г

млн.доли

100 л

а б в г

а - контроль, б - липосомы без ЛПС, в - липосомы с, ЛПС (23 мг/л), г -липосомы с ЛПС (150 мг/л)

Рис. 7. Количество красителя (млн. доли от веса сухого корня), адсорбированного корнями пшеницы из растворов и суспензий после полного погружения корней в среды и инкубации в течение 45 мин (А); после фиксации мест среза корней над поверхностью сред и инкубации в течение 24 ч (Б)

В случае предварительной инкубации корней в растворе М-ацетил-D-глюкозамина — специфического гаптена белка агглютинина - не происходило подавления сорбции красителя из суспензии липосом, инкрустированных ЛПС. Это свидетельствует об отсутствии специфического взаимодействия бактериальных ЛПС с белками корней пшеницы.

Таким образом, показано, что модельные системы, подобно живым бактериальным клеткам, адсорбируются на корневой поверхности пшеницы. Экспериментальные данные подтверждают результаты компьютерного моделирования и позволяют предположить, что участие ЛПС в указанных ассоциативных процессах носит специфический характер, вероятно обусловленный углевод-углеводными взаимодействиями.

На наш взгляд, подобные упрощенные модели можно успешно использовать для уточнения механизмов таких сложных, комплексных

процессов как взаимодействия между бактериальной клеткой и растительной поверхностью.

Глава б. Моделирование целевой доставки химических веществ к корням растений

Изучена возможность применения наночастиц диоксида кремния, обогащенных полисахаридами корневой поверхности растений, и липосом, инкрустированных ЛПС, для целевой доставки химических соединений к корням пшеницы.

В результате экспериментов по доставке маркера ФН наночастицами, обогащенными растительными полисахаридами, показано, что степень сорбции красителя на корнях пшеницы зависит как от концентрации полисахаридов, так и от содержания наночастиц в гидрозоле (рис. 8 А,Б).

Относительная интенсивность флуоресценции, %

Относительная интенсивность флуоресценции,%

2100 1800 1500 1200 900 600 300 0

-6 -5

-2 -1

1200 -] 1000 ■ 800 600 Н 400 200 0

-1

1«С

—♦--10-1 г/л ВПС; —♦--10-' г/л НПС;

—■— - 10"2 г/л ВПС; —•— - 10'2 г/л НПС;

—А--без ВПС —А--. 10"3 г/л НПС;

—■--без НПС

Рис. 8. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции экстракта корней после их инкубации в гидрозолях наночастиц, инкрустированных ВПС (А), НПС (Б), от концентрации наночастиц (1^0) и концентрации полисахаридов

Наибольшая степень сорбции наблюдалась для наночастиц, инкрустированных полисахаридами высокой молекулярной пассы (ВПС) и низкой молекулярной массы (НПС) в концентрации 10*' г/л, при их содержании в гидрозоле 10"4 г/л. По сравнению с частицами без полисахаридного покрытия она возрастала в 22.2 раза для ВПС (рис.8А) и в

11.3 для НПС (рис.8Б). Уменьшение степени сорбции частиц при их концентрации в гидрозолях больше 10"4 г/л, видимо, связано с процессом агрегации наночастиц.

Таким образом, наиболее эффективная сорбция обнаружена для наночастиц, инкрустированных ВПС в концентрации 10"' г/л. Вероятно, это обусловлено специфическим взаимодействием растительных полисахаридов на поверхности наночастиц с компонентами корневой поверхности.

Исследована эффективность применения липосом, обогащенных ЛПС, для транспорта химических веществ, в частности ИУК, к корням растений. Эксперименты проведены на колеоптилях пшеницы, прирост которых под действием экзогенной ИУК может служить критерием эффективности доставки данного химического соединения. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Прирост отрезков колеоптилей пшеницы ТгШсит аевИхит сорта _Саратовская 29 на растворах и суспензиях_

Суспензия/ раствор Прирост, (% к исходной длине)

Вода 14±2

Раствор ЛПС, 150 мг/л 12±2

Раствор ИУК, 1 мг/л 48±1

10мг/л 49±1

100 мг/л 47±2

Липосомы без ЛПС, загруженные

ИУК, концентрация внутри

липосом: 1 мг/л 14±1

10 мг/л 14±1

100 мг/л 13±2

Липосомы с ЛПС (150 мг/л),

загруженные ИУК, концентрация

внутри липосом: 1 мг/л 50±1

10 мг/л 53±2

100 мг/л 50±1

Отмечен практически одинаковый прирост колеоптилей в воде и растворе ЛПС, что свидетельствует об отсутствии биологической активности у ЛПС. Показано, что ИУК оказывает максимальный биологический эффект в концентрации 1 мг/л, что подтверждают и литературные данные.

Установлено, что липосомы без ЛПС, загруженные ИУК, не проявляют биологической активности. С другой стороны, применение липосом, инкрустированных ЛПС и загруженных ИУК, приводит к тому же результату, что и использование растворов ИУК. Необходимо отметить, что

количество вещества во внутреннем объеме липосом в суспензиях на несколько порядков меньше, чем в соответствующих растворах ИУК. Т.е. для получения высокого биологического эффекта в случае применения систем доставки (липосом) достаточно использовать значительно меньшее количество биологически активного вещества.

Таким образом, результаты исследований показали, что наносистемы, несущие углеводные детерминанты, могут быть использованы для создания эффективных систем транспорта химических веществ к корням растений. Это будет способствовать экономии препаратов и уменьшению антропогенной нагрузки на окружающую среду.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны экспериментальные модели поверхности грамотрицательных бактерий А. ЪгазИгте Бр245 на основе липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны.

2. Методами молекулярной динамики установлены термодинамически равновесные конформации О-ПС А. ЬгаяИете Бр245 в водной фазе. Показано, что при взаимодействии двух цепей полисахаридов с антипараллельной ориентацией наиболее энергетически выгодной является структура типа двойной спирали, образованная за счет межмолекулярных водородных связей. Установлено, что полисахариды, ориентированные параллельно друг относительно друга не образуют устойчивого комплекса.

3. Модифицирован метод расчета энергии сольватации химического соединения в среде вода-липид и оценки его ориентации на границе раздела этих фаз, и разработаны соответствующие алгоритм и программа.

4. Показано, что ЛПС встраиваются в липосому таким образом, что их О-специфическая полисахаридная часть направлена в окружающую среду и расположена по нормали к поверхности липосом.

5. Установлено, что липосомы, содержащие на своей поверхности О-ПС азоспирилл, образуют агрегаты посредством полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

6. Показано, что разработанные нами экспериментальные модели, подобно живым бактериальным клеткам, адсорбируются иа корневой поверхности пшеницы, при чем степень сорбции растет с увеличением содержания в них ЛПС.

7. Впервые рассмотрена возможность целевой доставки химических веществ к корням растений. В качестве систем транспорта предложены наночастицы диоксида кремния, обогащенные растительными полисахаридам и.

8. Отмечена высокая эффективность доставки к растениям биологически активных веществ, в частности ИУК, липосомами, инкрустированными ЛПС внешней бактериальной мембраны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Arefeva О.A., Kuznetsov Р.Е., Tolmachev S.A., Kupadze M.S., Khlebtsov B.N., Rogacheva S.M. Computer Simulation and Experimental Study of the Polysaccharide Ineraction in the Bacteria Azospirillum brasilense Sp245 // Proceedings of SPIE. - USA, Washington, 2003. - V.5067. -P.288-294.

2. Kuznetsov P.E., Rogacheva S.M., Arefeva O.A., Tolmachev S.A., Kupadze M.S. Computer Simulation of the Sorption Process of the Risosphere Bacteria on the Plant Roots // Abstr. of Int. Symposium "Biomedical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants." - Russia, Saratov, 28-30 July, 2003. - P.21-22.

3. Kuznetsov P.E., Rogacheva S.M., Arefeva O.A., Tolmachev S.A., Kupadze M.S., Minin D.V. Target delivery of chemical compounds to roots of plants. // Abstracts of Int.Symposium "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with technogenic Environmental Pollutants"-Russia, Saratov, 28-30 July, 2003. - P.22-23.

4. Арефьева O.A., Толмачев C.A., Купадзе M.C., Хлебцов Б.Н. Молекулярная динамика и экспериментальные модели липополисахарида бактрий Azospirillum brazilense SP245 и полисахарид-полисахаридного взаимодействия И Сб. тезисов Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование" -Москва, 2003. - С. 32-33.

5. Kuznetsov Р.Е., Rogacheva О.A., Arefeva О.A., Minin D.V., Tolmachev S.A., Kupadze M.S. Optical methods for creating delivery systems of chemical compounds to plant roots // Proceedings of SPIE. - USA, Washington, 2004. -V. 5474. - P. 369-376.

6. Толмачев C.A., Купадзе M.C., Арефьева O.A., Хлебцов Б.Н., Кузнецов П.Е. Моделирование динамики липополисахарида бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и полисахарид-полисахаридное взаимодействие // Сб. тезисов 1-й Российской школы-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» -Саратов, 2002. - С.29-31.

7. Шульгин С.В., Арефьева О.А., Кулибякина О.В., Кузнецов П.Е. Моделирование пространственной структуры полисахарида внешней мембраны Azospirillum brasilense Sp245 и динамики полисахарид-полисахаридного взаимодействия // Сб. тезисов 2-й Российской школы-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» - Саратов, 2004. - С.21 -22.

8. Арефьева О.А., Рогачева С.М., Кузнецов П.Е., Хлебцов Б.Н., Толмачев С.А., Купадзе М.С.. Липосомы в изучении механизма агрегации бактерий и их адсорбции на корнях растений // Биологические мембраны. - 2006. Т. 23, №3 - С. 195-202.

Благодарности

Благодарю профессора, д.б.н. Коннову С.А. за предоставленные препараты ЛПС и плодотворное обсуждение результатов работы; к.ф.-м.н. Хлебцова Б.Н. за помощь в определении размеров агрегатов липосом; к.б.н. Бурыгина Г.Л. за проведение электрофоретического определения белковых примесей в препаратах ЛПС.

Подписано в печать 18.10.2006 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 065.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Арефьева, Оксана Анатольевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Процессы агрегации бактерий рода Azospirillum и адсорбции на корнях растений

1.2. Структура липополисахарида бактерий рода Azospirillum

1.3. Межклеточные взаимодействия и участие в них липополисахаридов

1.4. Экспериментальное моделирование межклеточных взаимодействий

1.5. Молекулярное моделирование

1.5.1. Молекулярная механика и метод минимизации потенциальной энергии

1.5.2. Молекулярная динамика

1.5.3. Реализация расчетных методов в компьютерной программе HyperChem

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Бактериальная культура

2.2. Растительная культура

2.3. Выделение липополисахаридов

2.4. Методика очистки препарата липополисахарида от белка

2.5. Методика приготовления липосом

2.6. Определение размеров ассоциатов липосом

2.7. Определение размеров липосом

2.8. Регистрация адсорбции липосом на корнях пшеницы

2.9. Определение концентрации метиленового синего в липосомах и экстрактах корней пшеницы

2.10. Оценка влияния Ы-ацетил-В-глюкозамина на адсорбцию экспериментальных моделей на корнях пшеницы

2.11. Методика выделения растительных полисахаридов

2.12. Приготовление гидрозоля наночастиц диоксида кремния

2.13. Регистрация адсорбции наночастиц на корнях пшеницы

2.14. Определение концентрации флуоресцеин-натрия в липосомах

2.15. Определение концентрации индолил-3-уксусной кислоты в липосомах

2.16. Методика определения длины колеоптилей

2.17. Измерение поверхностного натяжения

2.18. Статистический анализ

2.19. Принципы работы программного комплекса

HyperChem с учетом применения модифицированных методов

2.19.1. Алгоритм графического изображения молекулярных структур в коммерческой программе HyperChem

2.19.2. Алгоритм оптимизации геометрии молекулы и выбора наиболее энергетически выгодной конформации

2.19.3. Краткое описание программы поиска стабильной конформации молекулы в гетерогенной среде

2.20. Компьютерное моделирование динамики полисахарид-полисахаридного взаимодействия

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ A ZOSPIRILL UM BRASILENSE SP

3.1. Модификация метода расчета энергии сольватации химического соединения на границе раздела фаз вода-липид

3.2. Экспресс-метод расчета дипольиого момента произвольной молекулы 72 3.3 Результаты моделирования поверхности грамотрицательных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и их обсуждение

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА АГРЕГАЦИИ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА АДСОРБЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ НА ПОВЕРХНОСТИ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ДОСТАВКИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ К КОРНЯМ РАСТЕНИЙ выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование полисахарид-полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и адсорбции на корнях пшеницы"

Межклеточные взаимодействия составляют основу жизнедеятельности всех живых организмов. У бактерий они определяют комплекс иммуногенных реакций, позволяют обмениваться метаболитами с симбионтами, приводят к агрегации клеток - эволюционно значимому процессу, необходимому для формирования многоклеточного организма. Молекулярные механизмы межклеточных взаимодействий являются предметом изучения, биохимии, молекулярной биофизики и биофизики клетки.

Большой теоретический и практический интерес представляет исследование механизмов симбиотических взаимодействий высших растений и почвенных микроорганизмов. Это связано с перспективами использования ассоциативных азотфиксирующих бактерий в качестве продуцентов ИУК, стимулирующей рост и продуктивность сельскохозяйственных растений. Из числа хорошо изученных азотфиксаторов выделяют ризосферные грамотрицательные бактерии рода Azospirillum, которые образуют колонии на корнях широкого круга растений (Dobereiner, 1976; Окоп, 1986; Bashan, 1997). Один из наиболее исследованных штаммов Azospirillum brasilense Sp 245 преимущественно ассоциирован с корнями пшеницы.

Способность бактерий к агрегации и сорбции на корнях растений зависит от структуры компонентов бактериальных и растительных клеточных поверхностей. В процессах взаимодействия азоспирилл между собой и с корневой поверхностью выявлено участие белков, ЛПС внешней мембраны бактерий, капсульных полисахаридов, полисахарид-содержащих комплексов, экскретируемых в окружающую среду. Но макромолекулы, определяющие специфичность этих процессов, а также механизмы взаимодействий окончательно не определены.

Исторически, в системе азоспириллы-злаки большее внимание уделялось белок-углеводным взаимодействиям, поскольку этот механизм лежит в основе реакции антиген-антитело.

В последние годы благодаря пионерским работам Hakomori, открыт новый тип молекулярного распознавания - углевод-углеводное взаимодействие, которое, по утверждению автора, происходит за счет образования межмолекулярных водородных связей (Hakomori, 2001). Hakomori доказал, что на первой стадии адгезии животных клеток гликосфинголипиды, образуя кластерные структуры на поверхности мембран, взаимодействуют с комплементарными гликосфинголипидами других клеток (Hakomori, 1999, 2000, 2001). Этот процесс активирует сигнальные системы клетки, вызывая ее фенотипические изменения.

Наличие углевод-углеводных взаимодействий у дрожжей подтверждают работы российских исследователей (Michalchik ,2000).

Следовательно, нельзя исключить возможность полисахарид-полисахаридных взаимодействий в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций.

Для исследования сложных многокомпонентных процессов, как правило, применяют методы моделирования, экспериментального и компьютерного.

В качестве моделей клеточных мембран обычно используют искусственные бислойные мембраны, в частности липосомы, которые способны включать в себя амфифильные соединения и ориентировать их на поверхности (Марголис, 1982). В последние годы липосомы, инкрустированные липополисахаридами, применяются для изучения межклеточных взаимодействий (Водовозова, 2004; Арефьева, 2006).

Поскольку наружная мембрана бактерий рода Azospirillum состоит из липидного бислоя, адекватной моделью для экспериментального моделирования процесса полисахарид - полисахаридного взаимодействия могут служить липосомы, инкрустированные ЛПС бактериальной поверхности.

Способность модельных систем имитировать процессы агрегации и адсорбции бактерий можно использовать в прикладных целях, например для доставки химических соединений с разнообразной биологической активностью к корням растений. Разработав подход для конструирования таких систем, можно создавать средства доставки, распознающие клетки-мишени целевых растений, по аналогии с системами транспорта лекарственных веществ в организме человека.

Использование математических методов, реализованных в настоящее время в компьютерных программах, является необходимым дополнением при проведении любых модельных экспериментов.

Все вышеизложенное определяет актуальность данной работы.

Цель диссертационной работы: разработка моделей бактериальной поверхности Azospirillum brasilense Sp245 и их применение для изучения роли полисахарид - полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации микробных клеток и адсорбции на корнях пшеницы.

Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести компьютерное моделирование конформации О-специфического полисахарида (О-ПС) ЛПС наружной мембраны бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и динамики полисахарид - полисахаридного взаимодействия.

2. Разработать экспериментальные модели поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp245 для изучения полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

3. Исследовать процесс агрегации модельных систем.

4. Изучить процесс адсорбции экспериментальных моделей на поверхности корней пшеницы.

Научная новизна работы:

Разработаны экспериментальные модели бактериальной поверхности, представляющие собой липосомы, инкрустированные липополисахаридами внешней мембраны клеток A. brasilense Sp245. Показано, что ЛПС встраиваются в липосому таким образом, что их О-ПС направлен в окружающую среду и расположен по нормали к поверхности липосом.

Научно-практическая значимость работы:

Впервые изучена возможность применения наносистем для направленного транспорта химических веществ к корням растений. В модельных экспериментах показана высокая эффективность доставки химического соединения к корням пшеницы с помощью наночастиц диоксида кремния, обогащенных растительными полисахаридами, и липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны А. brasilense Sp245. Полученные результаты предлагается использовать при разработке систем доставки биологически активных веществ к корням растений с целью уменьшения антропогенной нагрузки на окружающую среду.

Основные положения, выносимые на защиту:

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Личный вклад соискателя состоит в разработке экспериментальных моделей бактериальной поверхности и теоретических методов и алгоритмов, а также в проведении экспериментов, расчетов и интерпретации полученных данных. В экспериментах использовали препарат ЛПС, полученный из лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Эксперименты по определению среднего размера агрегатов липосом выполнены совместно с к.ф.-м.н. Хлебцовым Б.Н. Электрофорез препаратов ЛПС, полученных по модифицированной методике, проводился к.б.н. Бурыгиным Г.Л. и д.б.н. Маторой Л.Ю.

Апробация работы Основные результаты диссертации обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях:

Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants - International Symposium, Saratov, Russia, 2003.

Macromolecular Organization and Cell Function - Gordon Research Conference, Oxford, Great Britain, 2004.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Арефьева, Оксана Анатольевна

выводы

1. Разработаны экспериментальные модели поверхности грамотрицательных бактерий A. brasilense Sp245 на основе липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны.

2. Методами молекулярной динамики установлены термодинамически равновесные конформации О-ПС A. brasilense Sp245 в водной фазе. Показано, что при взаимодействии двух цепей полисахаридов с антипараллельной ориентацией наиболее энергетически выгодной является структура типа двойной спирали, образованная за счет межмолекулярных водородных связей. Установлено, что полисахариды, ориентированные параллельно друг относительно друга не образуют устойчивого комплекса.

5. Установлено, что липосомы, содержащие на своей поверхности О-ПС азоспирилл, образуют агрегаты посредством полисахарид-пол исахаридного взаимодействия.

6. Показано, что разработанные нами экспериментальные модели, подобно живым бактериальным клеткам, адсорбируются на корневой поверхности пшеницы, при чем степень сорбции растет с увеличением содержания в них ЛПС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование молекулярных механизмов симбиотических взаимодействий высших растений и почвенных микроорганизмов представляет как теоретический, так и практический интерес. Это связано с перспективами использования ассоциативных азотфиксирующих бактерий, в частности рода Azospirillum, в качестве продуцентов фитогормонов, стимулирующих рост и продуктивность сельскохозяйственных растений. Высокую активность в процессах азотфиксации, стимуляции роста растений проявляет штамм A. brasilense Sp 245, преимущественно ассоциированный с корнями пшеницы. Азоспириллы способны формировать агрегаты, что обеспечивает их выживание в почве при неблагоприятных условиях. Агрегаты также являются предпочтительной формой при инокуляции растений.

Способность бактерий к агрегации и сорбции на корнях растений зависит от структуры компонентов бактериальных и растительных клеточных поверхностей. Известно, что наружная мембрана грамотрицательных бактерий, в том числе и азоспирилл, состоит из билипидного слоя и имеет асимметричную мозаичную структуру, представленную фосфолипидами, липополисахаридами (ЛПС), сложными белками и липополисахарид-белковыми комплексами.

Сложный состав клеточной поверхности азоспирилл не позволяет уверенно определить структуры, ответственные за специфические взаимодействия бактериальных клеток между собой и с корневой поверхностью, а также механизмы этих взаимодействий.

В системе азоспириллы-злаки, также как и для других межклеточных контактов, наиболее изучены белок-углеводные взаимодействия. Возможность существования углевод-углеводных взаимодействий показана лишь в единичных работах на животных и дрожжевых клетках. Не исключено, что подобный механизм может играть важную роль и в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций. Наиболее вероятным его участником является О-специфическая часть ЛПС бактериальной поверхности, поскольку именно О-ПС является антигенной детерминантой клеток. Известна структура повторяющегося звена О-ПС липополисахарида поверхности бактерий A. brasilense Sp 245, состоящего из пяти остатков D-рамнозы: —>2)~p-D-Rha/?-(l—>3)-a-D-Rha/?-(1 —e)-a-D-Rha/?-( 1 ->2)-a-D-Rhap-( 1 ->2)-a-D-Rhap-( 1 Нами проведено компьютерное и экспериментальное моделирование бактериальной поверхности A. brasilense Sp245 для исследования участия О-ПС и роли полисахарид-полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации этих бактерий и их адсорбции на корнях пшеницы.

Экспериментальные модели клеточной поверхности были разработаны на основе липосом, инкрустированных бактериальными ЛПС.

Компьютерное моделирование использовалось для определения конформации О-специфической части ЛПС, ее расположения в водной среде относительно билипидного слоя, для оценки возможности полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

Эксперимент проводился в коммерческой программе HyperChem 7.0е., методом молекулярной динамики с молекулярно-механическим силовым полем Amber S, который обычно применяется для определения энергетически выгодной конформации макромолекул, в частности полисахаридов. При оптимизации конформации одного звена О-ПС были получены энергетически устойчивые структуры, имеющие форму псевдоспирали и стабилизированные внутримолекулярными водородными связями.

При определении ориентации О-ПС на границе раздела фаз вода-липид был использован метод Хопфингера, позволяющий рассчитывать энергию сольватации молекулы вещества, с предварительной его модификацией. В частности, было учтено, что при движении атомов молекулы из одного растворителя в другой уменьшается объем сольватной сферы, составленный молекулами первого растворителя, и формируется сольватная сфера, составленная из молекул второго растворителя. То есть, вблизи границы раздела фаз атом имеет сложную сольватную оболочку, в которую входят молекулы обоих растворителей. Для реализации модифицированного метода был разработан соответствующий алгоритм и написана программа на языке С++ для 1ВМ-ПЭВМ.

Моделирование пространственного расположения молекулы липополисахарида, содержащего пять звеньев D-рамнана, относительно границы раздела фаз вода-липофильная среда (бактериальная мембрана) показало, что энергетически выгодным является положение ЛПС, при котором полисахаридная часть экспонирована в водную фазу, а липид А - в бислой. Причем, О-специфическая полисахаридная часть расположена по нормали к поверхности, имитирующей внешнюю бактериальную мембрану.

Для подтверждения результатов молекулярного моделирования были проведены исследования межфазного натяжения на границе вода-липид (яичный фосфатидилхолин) в зависимости от концентрации в водной среде ЛПС. В экспериментах был использован метод лежачей капли. Характер зависимости межфазного натяжения от молярной концентрации ЛПС свидетельствовал об увеличении гидрофильности капли с ростом концентрации ЛПС. Это доказывало, что ЛПС встраивается липидной частью в монослой лецитина на поверхности растворителя, а полисахаридный фрагмент остается в водной фазе.

Из полученных экспериментальных данных по формуле Гиббса была рассчитана площадь, которую занимает одна молекула ЛПС в монослое -92±4 А. В программе HyperChem 7.0е. был создан визуальный образ этой молекулы на поверхности мембраны, и показано, что ориентация О-ПС относительно липидного бислоя может быть только по нормали к поверхности. Такое расположение О-ПС на поверхности бактериальной мембраны благоприятно для осуществления полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

Полученные результаты позволили провести компьютерное моделирование процесса полисахарид-полисахаридного взаимодействия. Варьировались условия моделирования. В том случае, когда два полисахарида, состоящие из одного звена О-ПС, были расположены антипараллельно друг другу, наблюдалось образование структуры, подобной двойной спирали, которая была стабилизирована за счет межмолекулярных водородных связей. Выигрыш в потенциальной энергии между исходным и конечным состояниями (около 190 ккал/моль) свидетельствовал о том, что полисахарид-полисахаридное взаимодействие является энергетически выгодным.

В случае, когда два полисахарида, состоящие из одного звена О-ПС, были расположены параллельно друг другу и направлены по нормали к поверхности липосомы, было установлено, что в течение всего времени расчетов молекулы не приближались друг к другу и не образовывали никакого устойчивого комплекса.

При исходном положении двух полисахаридов, состоящих из 5 звеньев О-ПС, параллельно друг другу, было показано, что О-ПС стремятся расположиться антипараллельно друг другу и образовать структуру типа двойной спирали.

Наряду с молекулярным моделированием были проведены эксперименты с липосомами. Методом динамического рассеяния света была проанализирована динамика изменения размера частиц в суспензиях липосом без ЛПС и липосом со встроенными ЛПС. В начале эксперимента средний размер частиц был около 210 нм как во взвеси липосом с ЛПС, так и пустых липосом. С течением времени средний размер частиц в суспензии липосом с ЛПС увеличился до 430 нм, а в суспензии липосом без ЛПС остался прежним. Это доказало наличие взаимодействий между полисахаридными фрагментами, встроенными в искусственные мембраны.

Для изучения роли О-ПС в процессе адсорбции бактериальных клеток на корнях пшеницы были использованы липосомы, инкустированные ЛПС и загруженные красителем метиленовым синим.

Была проведена инкубация корней проростков пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29 в растворах и суспензиях модельных систем в течение 45 мин и 24 ч. Было установлено, что липосомы без ЛПС не обладают сродством к поверхности корней растений. Значительное увеличение степени сорбции красителя корнями пшеницы было отмечено в эмульсиях липосом с ЛПС, причем с увеличением концентрации ЛПС наблюдался рост степени адсорбции более чем в 2,5 раза.

Наличие ЛПС (150 мг/л) в липосомах увеличивало не только степень, но и скорость сорбции красителя: за 45 мин на корнях сорбировалось 85 ± 9 % метиленового синего от максимально возможного количества. В суспензии липосом без ЛПС этот показатель составил 53 ± 20 %. Следует отметить, что количество сорбированных на корнях липосом с ЛПС не увеличивалось после 24 ч инкубации. Подобная динамика наблюдалась и в процессе адсорбции живых бактериальных клеток A. brasilense Sp 245, что объясняли ограниченным количеством сайтов связывания на корнях пшеницы.

Чтобы исключить возможность углевод-белковых взаимодействий в процессе адсорбции модельных систем на корневой поверхности, был проведен эксперимент с И-ацетил-О-глюкозамином (GlcNAc). Известно, что GlcNAc является специфическим гаптеном белка агглютинина зародышей пшеницы, т.е. по влиянию GlcNAc на сорбцию липосом, загруженных красителем и инкрустированных ЛПС, можно судить об участии белков в изучаемом процессе.

Было установлено, что в случае предварительной инкубации корней в GlcNAc, не происходит подавления сорбции красителя из суспензии липосом, инкрустированных ЛПС. Это свидетельствует об отсутствии специфического взаимодействия бактериальных ЛПС с белками корней пшеницы.

Таким образом, было показано, что модельные системы, подобно живым бактериальным клеткам, адсорбируются на корневой поверхности пшеницы. Результаты экспериментального и компьютерного моделирования позволили предположить, что участие ЛПС в данном процессе носит специфический характер, вероятно обусловленный углевод-углеводными взаимодействиями.

На следующем этапе была изучена возможность применения наносистем для целевой доставки химических соединений к корням пшеницы.

В экспериментах были использованы наночастицы диоксида кремния, инкрустированные растительными полисахаридами с высокой молекулярной массой (ВПС) и низкой молекулярной массой (НПС), маркером служил флуресцеин-Na. Выбор растительных полисахаридов в качестве компонентов систем доставки был обусловлен их большей привлекательностью по сравнению с бактериальными ЛПС. Процесс их выделения из растительного сырья намного проще и дешевле, кроме того, среди большого количества растительных полисахаридов вероятность найти углевод, способный специфически связаться с полисахаридами корневой поверхности, гораздо больше.

Было установлено, что степень сорбции красителя на корнях пшеницы зависит как от концентрации полисахаридов, так и от содержания наночастиц в гидрозоле. Наибольшая степень сорбции наблюдалась для наночастиц, инкрустированных полисахаридами ВПС и НПС в концентрации 10"1 г/л, при их содержании в гидрозоле 10"4 г/л. По сравнению с частицами без полисахаридного покрытия она возрастала в 22.2 раза для ВПС ив 11.3 для НПС. Уменьшение степени сорбции частиц при их концентрации в гидрозолях больше 10"4 г/л, видимо, было связано с процессом агрегации наночастиц. Более эффективная сорбция наночастиц, инкрустированных ВПС в концентрации 10"1 г/л, вероятно, обусловлена специфическим взаимодействием растительных полисахаридов на поверхности наночастиц с компонентами корневой поверхности.

Далее была исследована эффективность применения липосом, обогащенных ЛПС, для транспорта химических веществ, в частности ИУК, к корням растений. Эксперименты проводились на колеоптилях пшеницы, прирост которых под действием экзогенной ИУК может служить критерием эффективности доставки данного химического соединения. Был отмечен практически одинаковый прирост колеоптилей в воде и растворе ЛПС, что свидетельствует об отсутствии биологической активности у ЛПС. Показано, что ИУК оказывает максимальный биологический эффект в концентрации 1 мг/л, что подтверждают и литературные данные.

Было установлено, что липосомы без ЛПС, загруженные ИУК, не проявляют биологической активности. С другой стороны, применение липосом, инкрустированных ЛПС и загруженных ИУК, приводило к тому же результату, что и использование растворов этого вещества. Необходимо отметить, что количество ИУК во внутреннем объеме липосом в суспензиях было на несколько порядков меньше, чем в соответствующих растворах. Т.е. для получения высокого биологического эффекта в случае применения систем доставки (липосом) достаточно использовать значительно меньшее количество биологически активного вещества.

Таким образом, с помощью экспериментального и компьютерного моделирования нами была продемонстрирована возможность полисахарид-полисахаридных взаимодействий в межклеточных контактах в системах бактерии-бактерии, бактерии-злаки. В модельных экспериментах была показана высокая эффективность доставки химического соединения к корням пшеницы с помощью наносистем с углеводными детерминантами. Результаты исследований могут быть предложены для создания эффективных систем транспорта химических веществ к корням растений, что будет способствовать экономии препаратов и уменьшению антропогенной нагрузки на окружающую среду.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арефьева, Оксана Анатольевна, Саратов

1. Арефьева О.А. Липосомы в изучении механизма агрегации бактерий и их адсорбции на корнях растений / О. Арефьева, С. Рогачева, П. Кузнецов, Б. Хлебцов, С. Толмачев, М. Купадзе // Биологические мембраны. 2006. -№1. - Т.23. - С. 14-21.

2. Баскин И.И. Компьютерное моделирование в молекулярной нанотехнологии // Компьютерра. 1997. - №.41.

3. Бахвалов Н.С. Численные методы. / Н.С. Бахвалов, Н.П. Жидков, Г.М. Кобельков. М: Наука, 1987. - 152 с.

4. Безрукова А.Г. / О.А. Розенберг // Бюл. эксп. биол. мед. 1981. - № 4. - С. 506-507.

5. Бергельсон Л. Д. Мембраны, молекулы, клетки. / Л.Д. Бергельсон М: Наука, 1982.- 159 с.

6. Буркерт У. Молекулярная механика. / У. Буркерт, Н. Эллинджер М.: Мир,1986.-364 с.

7. Бурштейн К.Я. Псевдоконтинуальная модель точечных диполей для учета сольватации в квантово-химических расчетах. / К.Я. Бурштейн // Журн.структ.хим. 1987. - Т.28. - N 2. - С. 3-9.

8. Бурыгин Г. Л. Сравнительное исследование О- и Н- антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum: Дис. .к-та биол. наук. / Г.Л. Бурыгин -Саратов, 2003. С. 19.

9. Васильев Ф.П. Численные методы решения экстремальных задач. / Ф.П. Васильев М.: Наука, 1988.

10. Волькенштейн М.В. Биофизика. / М.В. Волькенштейн М: Наука, 1981 -гл.4,6.

11. Выделение и анализ гликополимеров растительного и бактериального происхождения: учеб. пособ. для студ. биол. фак-та / под. ред. В.В Игнатова. изд-во Саратов, гос. ун-та, 2005. - 15 с.

12. Григориадис Г. Липосомы в биологических системах. / Г. Григориадис, А. Аллисон М.: Медицина, 1983. - 36-93 с.

13. Громов Б.В. Строение бактерий. / Б.В. Громов Л.: изд-во Ленингр. Унта, 1985.-35 с.

14. Дашевский В.Г. Конформационный анализ макромолекул. / В.Г. Дашевский М: Наука, 1987 - 288с.

15. Дэннис Дж. Численные методы безусловной оптимизации и решения нелинейных уравнений. / Дж. Дэннис, П.М Шнабель. Мир, 1988.

16. Евграфова Е.Н. Руководство к лабораторным работам по физике. / Е.Н. Евграфова, В.Л. Каган М.: Высш. школа, 1970. - 383 с.

17. Жемеричкин Д.А. Выделение, фракционирование и моносахаридный состав О-специфических полисахаридов S-формы Azospirillum brasilense. / Д.А. Жемеричкин, О.Е. Макаров, В.В. Игнатов // Микробиология. 1989. -Т. 58. - № 2 - С. 236-239.

18. Забежайло М.И. Новые информационные технологии в научных исследованиях и технологических разработках / М.И. Забежайло //

19. Научно-техническая информация. Сер. 2. 1992. - N 6. - С. 1-11.

20. Заградник Р. Основы квантовой химии. / Р. Заградник, Р. Полак М.: Мир, 1979.-504 с.

21. Здоровенко Г.М. Характеристика макромолекулы и исследова-ние структуры О-цепи ЛПС. / Г.М. Здоровенко, Ю.А. Книрель // Мм. 1986 -Т. 3.-С. 318.

22. Итальянская Ю.В. Серологическая активность полисахаридных комонентов клеточной поверхности A. brasilense. / Ю.В. Итальянская, В.Е. Никитина, А.К. Мышкина // Микробиология. 1987. - Т. 56. - № 1. - С. 124-127.

23. Карплус М. Динамика белковой структуры. / М. Карплус, Дж.Э. Мак-Каммон //В мире науки 1986 - №6 - С. 4-15.

24. Коннова С.А. Полисахаридные комплексы, выделяемые Azospirillum brasilense, и их возможная роль во взаимодействии бактерий с корнями пшеницы. / С.А. Коннова, И.М. Скворцов, О.Е. Макаров и др. // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 6. - С. 762-768.

25. Конформации и функции биологических молекул. Теоретические аспекты. / под ред. Г.И.Чипенса. Рига: Зинатне, 1984. - 204 с.

26. Кротов В.В. К реологии свободных жидких пленок с растворимыми поверхностно-активными веществами. / В.В. Кротов, В.В. Малев // Коллоид.ж.-1979. Т. - 41. - вып.1. - с.49-53.

27. Кузнецов П.Е. Программа расчета зарядов Политзера по методу выравнивания электроотрицательностей. / П.Е. Кузнецов, П.Е. Щербаков, Т.В. Тимофеева //Ж.структ.химии 1989. - Т. 30. - N 2. - С.182-183.

28. Кузнецов П.Е. Введение в молекулярное моделирование: учеб. пособие / П.Е. Кузнецов, Л.А. Грибов Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 52 с.

29. Липосомы в медицине / под ред. Г. Грегориадис, А. Аллисон. // Вестн. Акад. мед. наук. 1983. - № 6. - 8. ред.

30. Лукин С.Ф. Азоспириллы и ассоциативная азотфиксация у небобовых культур в практике сельского хозяйства. / С.Ф. Лукин, П.А. Кожевин, Д.Г. Звягинцев//Сельхоз. биол. 1987.-N1. - С. 51-58.

31. Марголис. Л.Б. Липид-клеточные взаимодействия модель взаимодействия клеточных мембран. / Л.Б. Марголис. - Ташкент: Изд-во «Фан», 1982. - 105 с.

32. Марголис Л.Б. Липосомы и их взаимодействие с клетками. / Л.Б. Марголис, Л.Д. Бергельсон. М.: Наука, 1986. - 240 с.

33. Марчук Г.И. Методы вычислительной математики. / Г.И. Марчук М.: Наук, 1989.-46 с.

34. Матора Л.Ю. Антигенная идентичность липолисахаридов, капсулы и экзополисхаридов A. brasilense. / Л.Ю. Матора, С.Ю. Щеголев // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 2. - С. 211-214.

35. Методические рекомендации по выделению гомогенных препаратов липополисахаридов из наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов: пособие для студ. и аспир. / В.И. Кирпичев, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2000 - 16с.

36. Методическое пособие по компьютерным методам в молекулярной биологии и биоорганической химии / под ред. В.И. Игнатова. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2002. - 37 с.

37. Паламарчук И.А. Учебное пособие по ботанической гистохимии / И.А.

38. Паламарчук, Т.Д. Веселова. Москва: Изд-во Моск. ун-та, 1965. - 93 с.

39. Никитина В. Е. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл. / В.Е. Никитина, С.А. Аленькина, Ю.В. Итальянская, Е.Г. Пономарева // Биохимия. 1994. - Т. 59. - Вып. 5. - С. 656.

40. Никитина В.Е. Участие бактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл. / В.Е. Никитина, Е.Г Пономарева, С.А Аленькина, С.А Коннова // Микробиология. 2001. - Т. 70. - №. 4. - С. 471-476.

41. Попов Е.М. Структурная организация белков. / Е.М. Попов. М.: Наука,1989.-67с.

42. Радциг А.А. Справочник по атомной и молекулярной физике. / А.А. Радциг, Б.М. Смирнов. -М.: Атомиздат, 1980. 240 с.

43. Скопинская С. Н., Ярков С.П. // Иммунология. 1996. - №. 2. - С. 6-12.

44. Скопинская С. Н. Создание и свойства бифункционального реагента на основе липосом, сенсибилизированных бактериальными антигенами. / С.Н. Скопинская, С.П. Ярков, Е.Н Храмов // Иммунология. 2001. - №. 3. -С. 54-59.

45. Скопинская С. Н. Использование липосом для обнаружения поверхностного липополисахаридного антигена, клеток холерного вибриона и антител к ним. / С.Н. Скопинская, С.П. Ярков, Е.Н Храмов // Прикл. биохим. и микроб. 2005. - Т. 41. - №. 2. - С. 228-234.

46. Томшич С.В. Структура О-специфических полисахаридов липополисахаридов рода Yersinia: Успехи в изучении природных соединений / под ред. В.А. Стоник. Владивосток: Дальнаука, 1999. -222с.

47. Федоненко Ю.П. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы. / Ю.П. Федоненко, И.В. Егорова, С.А. Коннова и др. // Микробиология. 2001. - Том 70. - №3. - С. 384-390.

48. Кацы, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Микробиология. 2005. - Т. 74. - №. 5. - С. 626-632.

49. Чернавский Д.С., Белок-машина. Биологические макромолекулярные конструкции. / Д.С. Чернавский, Н.М. Чернавская М.: Наука, 1999, 47 с.

50. Balabaev N.K. Molecular dynamics simulation of ferredoxin in different electronic states. In: Laser Spectroscopy of Biomolecules / N.K. Balabaev, A.S. Lemak, E.I. Korppi-Tommola // Proc. SPIE. 1993 -V. 1921 - P. 375-385.

51. Baldani V. L. D. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat. / V. L. D Baldani, J. I. Baldani, J. Dobereiner // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - № 8. - P. 924-929.

52. Barton P.G. Hydrocarbon chain packing and molecular modification in phospholipids bilayers formed from unsaturated lecithins. / P.G. Barton, F.D. Gunstone // J. Biol. Chem. 1975. - V. 250. - P. 4470-4476.

53. Bashan Y. Enhancement of wheat root colonization and plant development by Azospirillum brasilense Cd. Following temporary depression of rhizosphere microflora. / Y. Bashan // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51. - P. 10671071.

54. Bashan Y. The fate of fieldinoculated Azospirillum brasilense Cd in wheat rhizosphere during the growing season. / Y. Bashan, H. Levanony, O. Ziv-Vecht// Can. J. Microbiol. 1987. - V. 33. - P. 1074-1079.

55. Bashan Y., Levanony H. // Canad. J. Microbiol. 1990. - V. 36. - P. 591.

56. Bashan Y. Anchoring of Azospirillum brasilense to hydrophobic polystyrene and wheath roots. / Y. Bashan, G. Holguin // J. Con. Microbiol. 1993. - V. -139.-№. 2.-P. 379-385.

57. Bashan Y. Azospirillum- plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996). / Y. Bashan, G. Holguin // Can. J. Microbiol. 1997. -V. 43. - P.103-121.

58. Berclaz T. Phase equilibria in binary mixtures of dimytilristoylphosphatidylcholine and csrdiolipin. / T. Berclaz, H.M. McConnel //Biochemistry. 1981. - V. 30. - P. 6635-6640.

59. Bergelson L.D. Paramagnetic hydrophilic probes in NMR investigations of membrane system. / L. D. Bergelson // Methods in membrane biology: N. Y. -1978 V.9. - P. 275-336.

60. Bertole E. Electron paramagnetic resonance studies on the fluidity and surface dynamics of egg phosphatidylcholine sides containing gangliosides. / E. Bertole, M. Masserini, S. Sonino et. al. // Biochim. et. biophys. acta. 1981. -V. 647. - P. 196-202.

61. Birell G.B., Cytochrome с induced lateral phase separation in diphosphatidilglycerol-steroid spin-labelled model membrane. / G.B. Birell, O.H. Griffith//Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 2925-2929.

62. Boggs J.M. Papahadjiopoulos D. Phase separation of .die and neutral phospholipids inducted by human myelin basic pro. / J.M. Boggs, M.A. Moscarello//Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 5420-5426.

63. Boggs J. M. Intermolecular hydrogen bounding between lipids: Influence organization and function of lipids in membranes. / J.M. Boggs // Canad. J. Biochim. 1980. - V. 58. - P. 755-770.

64. Bovin N.V. New type of carbohydrate-carbohydrate interaction. / N.V. Bovin, S.D. Shiyan, E.V. Michalchik // Glycoconjugate Journal. 1995. - V. 12. -P.427.

65. Braun W. Local deformation studies of chain molecules: differential conditions for changes of dihedral angles. / W. Braun // Biopolymers 1987. - V. 26. - P. 1691-1704.

66. Brockerhoff H. Model of interaction of polar lipids, cholesterol and .in biological membranes. / H. Brockerhoff// Lipids. 1974. - V. 9. - P. 645-650.

67. Brooks B.R. CHARMM: A program for macromolecular energy minimization, and dynamics calculations. / B.R. Brooks, R.E. Bruccoleri, B.D. Olafson, D.J. States, S. Swaminathan, M. Karplus // J.Comput. Chemistry. 1983. - V.4. -№.2.-P. 187-217.

68. Brown L.R. NMR and ESR studes of the interactions of citochrome с with mixed cardiolipin phosphatidylcholine vesicles. / L.R. Brown, K. Wuthrich // Biochim. at biophys. acta. - 1977. - V. 468. - P. 389-410.

69. Burdman S. Aggregation in Azospirillum brasilense: effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components. / S. Burdman, E. Jurkevitch, B. Schwartsburd, M. Hampel, Y. Okon // Microbiology. 1998. - V. 144.-P. 1989-1999.

70. Burdman S. Involvement of outermembrane proteins in the aggregation of Azospirillum brasilense / S. Burdman , E.Jurkevitch , B. Schwartsburd, Y. Okon // Microbiology. 1999. - V. 145 - P. 1145.

71. Cantor C.R — Biophysical chemistry. / C.R.Cantor, P.R. Schimmel. / W.H. Freeman . — San Francisco, 1980. part 1. - ch. 2, 5; part 3. - ch. 17, 20, 21.

72. Castellanos Th. Cell-surface hydrophobicity and cell- surface charge of Azospirillum 5pp. / Th. Castellanos, F. Ascencio, Y. Bashan // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. - V. 24.-P. 159-172.

73. Chikako Mitsuoka / Chikako Mitsuoka et al. // Proceeding National Academy Sciences USA 1999. - V. 96. - P. 1597-1602.

74. Choma A. Chemical composition of lipopolisaccharide from Azospirillum lipoferum Russa / A. Choma, Z. Lorciewicz // FEMS Microbiol. Lett. 1984. -V. 22. - P. 245-248.

75. Choma A. Analysis of Azospirillum lipopolisaccharides Russa. / A. Choma, Z.th1.rciewicz I 19 International Congress of Nitrogen Fixatuion. Cancur: Mexico. 1992.-P. 125.

76. Clejan S. Permeability properties of sterol-containing liposomes from analogues of phosphatidilcholine lacking acyl groups. / S. Clejan, R. Bittman, P. Derov et. al. // Biochemistry. 1979. - V. 18. - P. 2118-2125.

77. Clementi E. Supercomputing and supercomputers for science and engineering in general and for chemistry and biosciences in particular. / E.Clementi, S. Chin, G. Corongiu et al. // Int.J.Quantum Chem. 1989. - V.35. - №. 1. - P.73-89.

78. Clowes A.W. Chapman D. Physical properties of lecithin-cerebroside bilayers. / A.W. Clowes, R.J. Cherry // Biochim. et. biophys. acta. 1971. - V. 249. - P. 301.

79. De Grip W.J. A possibl roles of rhodopsin in maintaining bilayer structure in the photoreceptor membrane. / W.J. De Grip, E.M.S. Drenthe, G.J.A. van Echtteld et. al. // Biochim. Et biophys. Acta. 1979. - V. 558. - P. 330-337.1 Л | л

80. De Kruijff B. C-NMR studies on 4- С cholesterol incorporated in sonionted phosphatidilcholine vesicles. / B. De Kruijff // Biochim. Et biophys. Acta. -1978.-V. 300.-P. 173-182.

81. Dobereiner J. Associative symbioses in tropical grasres: Characterization of microorganisms nitrogen-fixing sites / J. Dobereiner, J.M. Day // Proc. 11th Symp. Nitrogen Fixat./ Eds. Newton W.E. and Nyman C.J. USA, Washington, 1976. - P. 518-538.

82. Dobereiner J. Nitrogen-fixing rhizocoenosis. The soil/root system in relation to Brazilian agriculture. / J. Dobereiner, De-Polli N: Parana. 1981. - P.175-198.

83. Estep T.N. Thermal behavior of synthetic sphingomyelin cholesterol dispersions. / T.N. Estep, D.B. Mountcastle, Y. Barenholz et. al. // Biochemistry. - 1979. - V. 18. - P. 2112-2117.

84. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology / Barenholz Y. et. al. New York, 1994.-V. 9.-P. 1-12.

85. Evans R.W. Monolayers of sterols and phosphatidylcholines containing a 20-carbon chain. / R.W. Evans, J.Tinoco // Chem. And Phys. Lipids. 1978. - V. 22. - P. 207-220.

86. Fedonenko Y.P. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp 245. / Y.P. Fedonenko, G.V.

87. Zatonsky, S.A. Konnova, E.L. Zdorovenko, V.V. Ignatov // Carbohydrate Research. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

88. Gaber B.P. On the quantitative interpretation of biomembrane structure by Raman spectroscopy. / B.P. Gaber, W.l. Peticolas // Biochim. et. biophys. acta. 1977. - V. 465. - P. 260-274.

89. Gaffney B.J. The paramagnetic resonance spectra of spin labels in phospholipid membranes. / B.J. Gaffney, H.M. McConnell // J. Magn. Reson. -1974.-V. 16.-P. 1-28.

90. Galanos C. Biological activities of lipid A complexed with bovine-serum albumin. / С Galanos, E.T. Rierschel, O. Luderitz // Europ. J. Biochem. 1972. -V.31.-P. 230-233.

91. Goldshtein Involvement of outermembrane proteins in the aggregation of Azospirillum brasilense / S. Goldshtein // Microbiology. 1980. - V. 145 - P. 1145.

92. Haegi A. Azospirillum-plant interaction: a biochemical apporoat. / A. Haegi, M. Del Gallo // Kluweer Academic Publichers. Jut. In Nitrogen Fixation with nonlegums. Firente: Italy. September, 1991 P. 1990. - C. 10-14.

93. Hakomori S. Soluble Fibronectin interaction with cell surface and extracellular matrix is mediated by carbohydrate-to- carbohydrate interaction / S. Hakomori, M. Zheng // Biochim. Et biophys. acta. 1999. - V. 374. - № 1. -P. 93-99.

94. Hakomori S. Traveling for the glycosphingolipid path / S. Hakomori // Glycoconjugate Journal. 2000. - V. 17. - P. 627-647.

95. Hakomori S. Cell adhesion/recognition and signal transduction through glycosphingolipid microdomain / S. Hakomori // Glycoconjugate Journal. -2001.-V. 17.-P. 143-151.

96. Helfand E. Flexible vs rigid constraints in statistical mechanics. / E. Helfand // J. Chem. Phys. 1979. - V. 71. - P. 5000-5007.

97. Hopfinger A.J. Application of SCAP to drug design. 1.Prediction of octanol-water partioniong coefficients using solvent-depended conformational analyses

98. A.J. Hopfinger, R.D. Battershell //J.Med.Chem. 1976. - V. 19. - № 5. - P. 569-573.

99. Jahn K. Microbial polysaccharides / K. Jahn, O. Westphal // The antigens / Ed. Sela M. New York: Academic press. 1975. - P. 1-125.

100. Janiak M.J., Aggregation in Azospirillum brasilense: effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components / M.J. Janiak // Microbiology 1998-V. 144.-P. 1989-1999.

101. Jorgensen W.L. The OPLS potential functions for proteins. Energy minimization for crystals of cyclic peptides and crambin / W.L. Jorgensen, J. Tirado-Rievs // J.Am.Chem.Soc. 1988. - V. 110. - № 6. - P.1657-1666.

102. Keith A.D. Spin-label studies on the aqueous regions of phospholipids multilayers. / A.D. Keith, W. Snips, D. Chapman // Biochemistry. 1977. - V. 16.-P. 634-644.

103. Keough K.M.W. Gel to liquid-crystalline phase transitions water dispersions of saturated mixed-acid phosphatidilcholine / K.M.W. Keough, P.J. Davies // Biochemistry. 1979. - V. 18. - P. 1453-1459.

104. Kitagawa T. Properties of liposomal membranes.taining lysolecithin. / T Kitagawa, K. Inoue, S. Wojima // J. Biochem. 1976. - V. 79. - P. 1123-1133.

105. Konnova S.A. Isolation, fractionation and some properties of polysaccharides produced in a bound form by Azospirillum brasilense and their possible involvement in Azospirillum-wheat root interactions. / S.A. Konnova, O.E.

106. Makarov, I. M. Skvortsov et.al. // FEMS Microbiol. Lett. 1994 - V. 118. - P. 93-99.

107. Kuharski R.A. Stochastic molecular dynamics study of cyclohexane isomerisation. / R.A. Kuharski, D. Candler, J.A. Montgomery, F. Rabii, S.J. Singer // J. Phys. Chem. 1988. - V 92. P 3261-3267.

108. Kuo A.L. Lipid lateral diffusion by pulsed nuclear resonance. / A.L. Kuo, C. G. Wade // Biochemistry. 1979. - V. 17. P. - 2300-230.

109. Lee A.G. Lipid phase transitions and phase diagrams. 11. Mixstures .lipids. / A.G. Lee // Biochem. Et biophys. Acta. 1977. - V. 472. - P. 285-344.

110. Lee A.G. Properties of liposomal membranes taining lysolecithin / A.G. Lee // Biochem. Et biophys. Acta. 1990. - V. 803. - P. 1100-1107.

111. Lentz B.R. Acyl chain order and lateral formation in mixed phosphatidylcholine-sphingomyelin multilans unilammelar vesicles. / B.R. Lentz, M. Hoechli, Y. Barenholz // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 68036809.

112. Levine Y.K. Strukture of oriented lipid bilayers. / Y.K. Levine, M.H.F. Wilkins //New Biol. -1971. V. 230. - P. 69-72.

113. Levitt M. A simplified representation of protein conformations for rapid simulation of protein folding. / M. Levitt // J. Mol. Biol. 1976. - V.104. -P.59-107.

114. Madi L. Aggregation in Azospirillum brasilense Cd: conditions and factors involved in cell-to cell adhesiomo / L. Madi, Y. Henis // Plant Soil. 1989. -V. 115.-№. l.-P. 89-98.

115. Magee W.E. The interaction of cationic liposomes containing entrapped horse radish peroxidase with cells in culture. / W.E. Magee, C.W. Goff, J. Schoknecht et. al. // J. Cell Biol. 1974. - V. 63. - P. 492-504.

116. Marcelja S. Lipid-mediated protein interaction in membranes. / S. Marcelja // Biochim. et. biophys. acta 1976, - V. 455 - P. 1-7.

117. Margolis L.B. Lipid-cell interactions: a novel mechanism of transfer liposome-entrapped substances into cells. / L.B. Margolis, A.V. Victorov, L. D. Bergelson // Biochim. et biophys. acta. 1982. - V. 15. - P. 321-327.

118. Martin F.G. Phospholipid exchange between bilayer membrane vesicles. / F.G. Martin, R.C. MacDonald // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 321 -327.

119. Matora Larisa Yu Structural Effects of the Azospirillum Lipopolysaccharides in cell suspensions. / Larisa Yu Matora, Oksana В Serebrennikova, Sergei Yu. Shchygolev // Biomacromolecules. 2001. - V. 2. - P. 402-406.

120. Mazur A.K. New methodology for computer-aided modelling of biomolecular structure and dynamics. Non-cyclic structures. / A.K. Mazur, R.A. Abagyan // J. Biomol. Struct. Dyn. 1989. - V.6. - P. 815-832.

121. McCammon J. A. Dynamics of proteins and nucleic acids. / J. A McCammon., S.C. Harvey Cambridge: Cambridge University Press, 1987.

122. Mendelsohn R. , Raman and Fourier transform infrared spectroscopic studies of the intraction between glycophorin and dimyristoylphosphatidilcholine. / R. Mendelsohn, R. Dluhy, T. Taraschi, et. al. // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 6699-6706.

123. Michiels K.W. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp 7 to wheat roots. / K.W. Michiels, C.L. Croes, J. Vanderleyden // J. Gen. Microbiol. -1991 V. 137. - P. 2241-2246.

124. Michalchik E.V. New type of carbohydrate-carbohydrate interaction. / E.V. Michalchik, N.V. Shiyan, S.D. Bovin // Proc. Russian Acad. Sci. 1997. - V. 354. - P.261-264.

125. Michalchik E.V. Carbohydrate-carbohydrate interaction: zymosan and glucan from Saccharomyces cerevisiae bind mannosylated glycoconjugates. /

126. E.V. Michalchik, S.D. Shiyan, N.V. Bovin // Biochemistry. 2000. - V. 65. -P.494-501.

127. Moens W.E. Marked stimulation of lymphocyte-mediated attack on tumor cells by target-directed liposomes containing immune RNA. / W.E. Moens, J. H. // Cronenberger Cancer Res. - 1978. - V. 38. - P. 1173-1176.

128. Moiseeva E.V., Vodovozova E. L., Mikhalyov I. I., Molotkovsky J. G. // Mouse Genome. 1997. - V. 95. - P. 895-897.

129. Molecular Modelling software. 2002 - (http://origin.ch.ic.ac.uk/local/ organic/mod/).

130. Mullay J.A. Simple method for calculating atomic charges in molecules. / J.A. Mullay//J.Am. Chem.Soc. 1986. - V.108. - №.8. - P. 1770-1775.

131. Neuringer L.J. Difference in orientational order in phospholipids and sphingomyelin bilayers. / L.J. Neuringer, B.Sears, F.B. Jungalwala, E.K. Shriver//FEBS Lett. 1979. - V. 104. - P. 173-175.

132. Okon Y. Development and function of ^zo^/nV/wm-inoculated roots. / Okon Y., Y. Kapulnik//Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

133. Ostro M.J. Parameters affecting the liposomemediated insertion of RNA into eukaryotic cells in vitro. / M.J. Ostro, D. Lavelle, W. Paxton et. al. // Arch. Biochem. and Biophys. 1980. - V. 201. - P. 392-402.

134. O'Toole E.M. Monte Carlo simulation of folding transitions of simple model proteins using a chain growth algorithm. / E.M. O'Toole, A.Z. Panagiotopoulos //J. Chem. Phys. 1992. - V. 97. - P. 8644-8651.

135. Pagano R.E. Interaction of phospholipids vesicles with cultured mammalian cells. / R.E. Pagano, L. Huang, C. Weg // Nature. 1974. - V. 252. - P. 166-167.

136. Pagano R.E. Interaction of phospholipids vesicles cultured mammalian cells. II. Studies of mechanisms. / R.E. Pagano, L. Huang // J. Cell Biol. 1975. - V. 67. - P. 49-60.

137. Papahadjopoulos D. Studies on membrane fusion. III. The role of clcium-induced phase changes. / D. Papahadjopoulos, W.J. Vail, C. Newton et. al. // Biochim. at biophys. acta. 1977. - V. 465. - P. 579-598.

138. Patriquin D.J. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses. / D.J. Patriquin, J. Dobereiner, D.K. Jain // Can. J. Microbiol. 1983. -V. 29.-P. 900-915.

139. Poste G. Activation of macrophages by lymphocyte mediators encapsulated in liposomes. / G. Poste, I.J. Fidler // In. Manual of macrophage methodology. N. Y, 1981.-P. 431-438.

140. Purisima E.O. An approach to the multiple-minima problem in protein folding by relaxing dimensionality. Tests on enkephalin. / E.O. Purisima, H.A. Scheraga//J. Mol. Biol. 1987. - V.196. - P.697-709.

141. Raz A. Biochemical, morphological and ultrastructural studies on the uptake of liposomes by murine macrophages. / A. Raz, C. Bucana, W. Foyer et. si. // Cancer. Res. 1982. - V. 41. - P. 487-494.

142. Rensvoude J. Cell-induced leakage of liposome contents. / J. Rensvoude, D. Hoekstra // Biochemistry. -1981. V. 20. - P. 540-546.

143. Rongen H.A.H., Bult A., van Bennekom W.P. // J. Immunol. Meth. 1997. -V. 204.-P. 105-133.

144. Sadasivan L. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: exopolysaccharides and cyst formation. / L. Sadasivan, C.A. Neyra //J. Bacterid. 1985. - V. 163. - №. 2. - P. 716-723.

145. Schaumann T. The program FANTOM for energy refinement of polipeptides and proteins using a newton-raphson minimizer in torsion angle space. / T. Schaumann, W. Braun, K. Wuthrich // Biopolymers. 1990. - V.29. - P. 679694.

146. Scherphof G. Disintegration of phosphatidylcholine liposomes in plasma as a result of interaction with HDL. / G. Scherphof, F. Roerdink, M. Waite, J. Parks //Biochim. et biophys. acta. 1978. - V. 542. - P. 296-307.

147. Scherphof G. The involvement of the lipid phase transition in the plasma-induced dissolution of multulammelar phosphatidylcholine vesicles. / G. Scherphof, F. Roerdink, M. Waite, J. Parks // Biochim. et biophys. acta. 1979. -V.556.-P. 196-207.

148. Schmidt G. Immunochemistry of R lipopolisaccharides of Escherichia coli. Studies on R mutants with an incomplete core, derived from E. coli 08: K27. / G. Schmidt, B. Jann, K. Jann // Europ. J. Biochem. 1970. - V. 16. - № 2. - P. 382-392.

149. Stubbs C.D. Effect of double.the dynamic properties of hydrocarbon region of lecithin bilayers chemistry. / C.D. Stubbs, T. Kouyama, K. Kinosita, A. Ikegami // Europ. J. Biochem. 1981. - V. 20. - P. 4257-4262.

150. Suckling K.E. The importance., phospholipid bilayer and the length of the cholesterol molecule in .structure. / K.E. Suckling, H.A.F. Blaiz, G.S Boid. et.al. // Biochim. et biophys acta. 1979. - V.551. - P. 10-21.

151. Sweet C. Activation of glucose diffusion from egg lechitin liquid crystals by serum albumin. / C. Sweet, J.E. Zull // Biochim. et biophys. acta. 1969. - V. 173.-P. 94-103.

152. Vose P.B. Development in nonlegume N-fixing systems / P.B. Vose // Can. J. Microbil. 1983. - № 8. - P.837-850.

153. Weiner S.J. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. / S.J. Weiner, P.A. Kollman, D.A. Case, U.C. Singh et al. // J.Am.Chem.Soc. 1984. - V. 106. - P.765-784.

154. Wollenweber H.W. Analysis of lypopolysaccharide (lipid A) fatty acids. / H.W. Wollenweber, E.Th. Rietschel // J. Microbiol Methods. 1990. - V. 11. -P. 195-211.

155. Yamazaki N., Kojima S., Bovin N. V., Andre S., Gabius S., Gabius H.-J. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. - V. 43. - P. 225-244.

156. Zamudio M. Adhesiveness and root hair deformation of Azospirillum strains for wheat seedlings. / M. Zamudio, F. Bastarrachea // Soil. Biol. Biochem. -1994.-V. 26. №. 6.-P. 791-797.

157. БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую признательность профессору, д.х.н. Кузнецову П.Е. за постоянное внимание, всестороннюю поддержку и ценные консультации при проведении математических расчетов и компьютерных экспериментов, обсуждении результатов.

Информация о работе

Арефьева, Оксана Анатольевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Моделирование полисахарид-полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и адсорбции на корнях пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы