Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование метаболизма стероидных соединений растений за счет экспрессии кДНК Cypiiai цитохрома Р450scc животного происхождения

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Моделирование метаболизма стероидных соединений растений за счет экспрессии кДНК Cypiiai цитохрома Р450scc животного происхождения"

На правах рукописи

БЕРДИЧЕВЕЦ Ирина Николаевна

МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕТАБОЛИЗМА СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РАСТЕНИЙ ЗА СЧЕТ ЭКСПРЕССИИ кДНК СУР11А1 ЦИТОХРОМА Р450бсс ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2010

004

603439

004603489

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Государственного научного учреждения «Институт генетики и цитологии HAH Беларуси» и в группе геномики растений Отдела геномики Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Научные руководители: академик HAH Беларуси, профессор,

доктор биологических наук Николай Александрович Картель

доктор биологических наук Георгий Вячеславович Шпаковский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Елена Анатольевна Калашникова

кандидат биологических наук Татьяна Игоревна Одинцова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится " Оу " СМ&С&Я в ^часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Губкина, д. 3. E-mailaogen@vigg.ru Факс: (499) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Губкина, д.З.

Автореферат разослан амуиил 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения физиологической роли генов, вовлеченных в процессы роста и развития растений при нормальных условиях жизнедеятельности и при воздействии стрессовых факторов, для изучения механизмов регуляции экспрессии генов, осуществляемой на различных уровнях, для поиска и изучения функциональной значимости регуляторных последовательностей геномов. Особый интерес представляет использование трансгенных растений для моделирования отдельных этапов метаболизма вторичных соединений растений, включая алкалоиды, фитогормоны, лигнин и другие важные соединения. Такие исследования важны как с фундаментальной, так и с практической точек зрения: например, для направленного изменения метаболических путей в растениях с целью синтеза в растительных клетках соединений, необходимых для решения важных социальных проблем в области промышленности, медицины, сельского хозяйства.

Цель исследования: изучить возможность направленного изменения метаболизма стероидных соединений в растениях с помощью переноса и экспрессии в них кДНК СУРНА! животных, которая кодирует митохондриальный цитохром Р4503сс-

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать экспрессионный вектор для трансформации растений, в котором полноразмерная последовательность кДНК СУР11А1 находится под контролем конститутивного промотора 358 РНК СаМУ.

2. Провести трансформацию растений табака полученным экспрессионным вектором.

3. Провести молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака.

4. Определить функциональную активность цитохрома Р4503сс путем сравнительного определения продукта катализируемой им реакции -прегненолона - в контрольных и трансгенных растениях табака.

5. Изучить особенности метаболизма ряда других стероидных соединений (таких как прогестерон и брассиностероиды) в трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК СУР11А1 цитохрома Р4503сс животного происхождения.

Научная новизна. Впервые показано, что гетерологичный ген, кодирующий полноразмерную последовательность кДНК СУР11А1, экспрессируется в растениях табака с образованием функционально активного белкового продукта. Выявлено, что экспрессия гетерологичного гена СУРНА] в трансгенных растениях приводит к формированию у них фенотипа, характеризующегося сокращённым периодом вегетативного развития (раннее цветение и созревание семенных коробочек), увеличенной биомассой и

повышенной продуктивностью (количество и качество семян). Впервые показано, что белковый продукт гена CYP11A1 животного происхождения интегрируется в стероидогенную систему растений, вызывая изменения в метаболизме стероидных соединений, что, по-видимому, и обусловливает формирование у трансгенных растений фенотипа, отличающегося от фенотипа контрольных растений.

Практическая значимость. Сконструированный экспрессионный вектор и разработанные методические подходы могут быть использованы для изменения метаболизма стероидных соединений в хозяйственно важных видах растений с целью направленного улучшения их полезных свойств.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях, конгрессах и съездах: III Съезд генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004 г.; Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004 г.; Международная научная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 68 июня 2005 г.; 12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, Denmark, 21-24 Aug. 2005; 6th International Symposium "Recent Advances in Plant Biotechnology: From Laboratory to business", Ceske Budejovice, Czech Republic, 12-15 Sept. 2005; Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB 2008), Tampere, Finland, 17-22 Aug. 2008; FEBS Advanced Course «Cytochrome P450 systems: from structure to application», Kranjska Gora, Slovenia 23-28 Sept., 2008; V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009 г.; V Международная научная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Алушта, 21-25 сентября 2009 г.; Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, 28 сентября -1 октября 2009 г.

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 4 статьях в научных журналах и сборниках, 15 материалах и тезисах международных научных конференций. Получен один патент на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы ((ЬР наименований), изложена на страницах машинописного текста, содержит ^ таблиц и Ч10 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе использовали стерильную субкультуру табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI, выращенную при температуре 25°С в условиях 16-часового светового дня и освещенности 10002000 лк.

Для экспериментов по трансформации растений использовали полученный на основе бинарной плазмиды pGreen0229 экспрессионный вектор pGBP450f, в котором последовательность кДНК CYP11AI цитохрома P450scc из коры надпочечников быка находится под контролем конститутивного промотора 35S РНК CaMV (рис. 1). Экспрессионный вектор содержит селективный ген bar под контролем промотора нопалинсинтазы (Pnos).

Pnos, Tnos - промотор и терминатор гена

нопалинсинтазы, bar - селективный ген, кодирующий фосфинотрицин ацетилтрансферазу, p35S - промотор 35S РНК CaMV, t35S - терминатор 35S РНК CaMV, CYP11A1 - целевой ген, кодирующий цитохром P450scc, LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК, соответственно.

LB Pnos bar Tnos RB

pGreen0229

LB Pnos bar Tnos p35S CYP11A1 t35S RB pGBP450f

Рис. 1. Схема области Т-ДНК исходного вектора рСгееп0229 и сконструированного на его основе экспрессионного вектора рСВР45(Н.

Трансформацию растений табака проводили методом прямого переноса ДНК в протопласты с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) (РойусиБ е1 а1., 1991). Отбор трансформированных клеточных колоний, каллусо- и морфогенез проводили на селективной среде, содержащей 20 мг/л фосфинотрицина. Для отбора первичных трансформантов регенеранты растений укореняли на среде в присутствии селективного агента.

Молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов растений проводили с использованием методов ПЦР, блот-гибридизации по Саузерну и ОТ-ПЦР.

Прегненолон в стероидсодержащей фракции растений определяли методом ГХ-МС анализа (газовая хроматография и масс-спектрометрия). Прогестерон в растительных экстрактах и в хроматографических фракциях, совпадающих по подвижности с прогестероном, определяли иммуноферментным методом согласно инструкции по использованию набора ПРОГЕСТЕРОН-ИФА (разработан в Институте биоорганической химии НАН Беларуси и любезно предоставлен А.Г. Прядко). Относительное содержание брассиностероидов в семенах растений определяли иммуноферментным

методом (разработан в Институте биоорганической химии HAH Беларуси: Хрипач и др., 2007).

Фенотипическую характеристику растений проводили на 30 растениях каждой независимой линии трансгенных и контрольных растений в поколении Т3.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Получение и молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака

Сконструированный вектор pGBP450f, несущий экспрессионную кассету кДНК CYP1JA1, а также исходный вектор pGreen0229 были использованы для прямой трансформации растений табака с помощью ПЭГ. Растения-регенеранты отбирали на селективной среде, содержащей фосфинотрицин. Контрольные растения табака, используемые во всех экспериментах, также получены из протопластов. На рис. 2 представлена схема эксперимента. В результате проведенных работ по трансформации, регенерации и селекции были отобраны:

- 4 независимые линии первичных трансформантов растений, полученных с использованием экспрессионного вектора pGBP450f с целевым геном (независимые линии растений обозначены нами CYPL1-CYPL4, а независимые трансформанты растений каждой линии обозначались, соответственно, CYPL1-1, CYPL1-2, CYPL2-1, CYPL3-1 и т.д.);

- 4 независимые линии первичных трансформантов растений, полученных с использованием экспрессионного вектора pGreen0229 (пустой вектор) (независимые линии растений обозначены нами pGl-pG4, а независимые трансформанты растений каждой линии pGl-1, pGl-2, pG2-l и т.д.);

- 4 независимые линии контрольных растений, полученных из протопластов (эти линии растений обозначены нами К1-К4, а независимые трансформанты растений каждой линии обозначены К1-1, К2-1, К.3-1, КЗ-2 и т.д.).

Геномную ДНК первичных трансформантов табака, отобранных на селективной среде, анализировали методом ПЦР (рис. ЗА). Во всех исследованных первичных трансформантах табака линий CYPL1-CYPL4 идентифицирован фрагмент целевой последовательности, размер которого соответствует теоретически рассчитанному - 502 п.н. (рис. ЗА); во всех первичных трансформантах табака линий pGl-pG4 выявлен специфический фрагмент гена bar (данные в автореферате не приводятся).

Прямая трансформация протопластов табака с помощью ПЭГ

Образование клеточных колоний на селективной среде

Каллусо- и морфогенез

Укоренение на селективной среде

Молекулярно-генетический анализ

Перенос в грунт, получение семян

Анализ расщепления

Анализ стабильного наследования трансгена в поколениях

Морфолого-биохимическая характеристика

Создание экспрессионного вектора

Выделение мезофильных протопластов табака

Рис. 2. Схема экспериментов по созданию и анализу трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК СУР11Л1 цитохрома Р450«сс из коры надпочечников быка.

MvK1 23456789 10 11 Б В

К 1 2 3 4 M1 V К 1 2 3 4 М1

Рис. 3. Молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака.

А: ПЦР-анализ. Б: Блот-гибридизация по Саузерну. В: ОТ-ПЦР анализ. Маркеры молекулярного веса: М - GeneRuler I kb Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва), Mi - lOObp + l,5kb DNA ladder («СибЭнзим», Россия), v - положительный контроль (плазмидный вектор pGBP450f), К - контрольное растение-регенерант, l-ll - первичные трансформанты табака с введенной кДНК CYP11 А, п.н. - пар нуклеотидов.

Результаты блот-гибридизации по Саузерну геномной ДНК трансгенных растений с использованием специфического зонда к последовательности кДНК CYP11A1 (1354 п.н.) показали, что в геноме первичных трансформантов содержится одна копия гетерологичного гена (рис. ЗБ). Для проверки экспрессии целевого гена на уровне транскрипции проведен ОТ-ПЦР анализ с использованием суммарной мРНК первичных трансформантов, который позволил выявить продукт реакции (502 п.н.), размер которого соответствует теоретически рассчитанному. Проведенный анализ подтвердил эффективную транскрипцию целевого гена в первичных трансформантах (рис. ЗВ).

Таким образом, молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака позволил доказать не только интеграцию гетерологичного гена CYP11A1 в геном растений табака, но и его экспрессию на уровне транскрипции.

2. Исследование функциональной активности цитохрома Р450зсс в трансгенных растениях табака

Для выяснения функциональной активности гетерологичного цитохрома Р450зсс в трансгенных растениях, мы провели определение в них прегненолона - продукта реакции, которую катализирует этот цитохром в стероидогенных тканях животных (рис. 4).

Рис. 4. Начальные стадии биосинтеза стероидных гормонов животных:

отщепления боковой цепи холестерина с превращением его в прегненолон, окисление (дегидрогенирование) которого по третьему положению приводит к образованию прогестерона.

Для этого из фракции суммарных липидов, полученной из листьев контрольных и трансгенных растений табака, методом тонкослойной хроматографии выделяли фракцию стероидов, хроматографическая подвижность которой соответствует прегненолону, взятому в качестве образца-свидетеля. Хроматографические зоны, соответствующие по подвижности стандартам (холестерину и прегненолону), экстрагировали с хроматографической пластинки, проводили реакцию ацетилирования и далее анализировали с помощью ГХ-МС (газовая хроматография и масс-спектрометрия). Идентификация прегненолона основана на сравнении полных масс-спектров стандартного образца ацетата прегненолона и фракции со временем удерживания 20,340 мин., которое совпадает со временем удерживания ацетата прегненолона (рис. 5а). Для сканирования хроматограммы выбран ион m/z 298, который присутствует в масс-спектре ацетата прегненолона (рис. 5а). ГХ-МС анализ позволил обнаружить фракцию, соответствующую по времени удерживания и масс-спектру ацетату прегненолона (рис. 5в). Это доказывает образование прегненолона в листьях трансгенных растений. Отметим, что при исследовании контрольных растений прегненолон не выявлен (рис. 56), что согласуется с литературными данными.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что в трансгенных растениях табака синтезируется цитохром P450scc, который проявляет присущую ему функциональную активность и катализирует биосинтез прегненолона.

Следует отметить, что цитохром P450Scc У растений до настоящего времени не обнаружен, однако, пример аналогичной реакции отщепления боковой цепи холестерина с образованием прегненолона существует.

прегненолон

1 ■ I

iff,

' 20.34

холестерин

retention time

,55 1]07 121 147

- - -•'- TAt - :? л

И I :'; ! !!i

Ii! .Iii ;i ! ¡у t .ч. ¡1 .!ä 173

Рис. 5. Идентификация ирегненолона в стероидсодержашей фракции из листьев трансгенных растений табака, несущих кДНК CYP11A1. (а) - Ионная хроматография стероидсодержащей фракции из листьев трансгенных растений, совпадающей по хроматографической подвижности с прегненолоном: 1 - стандартный образец ацетата прегненолона, 2 - фракция из листьев трансгенных растений, (б) - Идентификация прегненолона по характеристическому иону (m/z 298) во фракции из трансгенных растений (1) и его отсутствие во фракции из контрольных растений (2). (в) - Сравнение масс-спектров прегненолона (1) и ГХ-МС фракции трансгенного растения, время удерживания которой совпадает со временем удерживания стандартного образца ацетата прегненолона (2).

Так, в митохондриях растений рода Digitalis sp. (наперстянках), превращение холестерина в прегненолон является ключевой стадией в биосинтезе кардиотонических стероидных гликозидов - карденолидов (Lindemann and Lucner, 1997). Попытки клонировать ген этого белка пока оказались безуспешными, однако не исключено, что этот белок по своей природе является растительным аналогом цитохрома P450scc, который структурно значительно отличается от P450scc животных, что и обусловливает трудности его идентификации в растениях.

Г.....Т1

350

M/Z mass-charge ratio

3. Наследование гетерологичного гена CYP11A1 у репродуктивного потомства трансгенных растений табака поколений Ti-T3

Первоначально получали первое поколение Т[ растений от самоопыления исходных трансформантов линий CYPL1-CYPL4. Для этого в конце вегетационного периода собирали семенные коробочки трансгенных и контрольных растений, после периода покоя семена табака подвергали поверхностной стерилизации и вводили в культуру in vitro для анализа фенотипического расщепления. Стабильность наследования Т-ДНК оценивали по соотношению фосфинотрицин-устойчивых и фосфинотрицин-чувствительных потомков на селективной среде, т.е. по соотношению нормальных зеленых проростков к белым, нежизнеспособным. Семена всех линий трансгенных растений (CYPL1-CYPL4) высаживали по 25 шт. в четырех повторностях на чашки Петри с культуральной средой T-med (Nitsch and Nitsch, 1969). Поскольку известно, что процесс стерилизации снижает всхожесть семян табака в среднем на 13±7% (при уровне значимости р<0,05) расщепление оценивалось только по проросшим семенам. Предполагалось, что наследование будет происходить по закону Менделя (расщепление по фенотипу 3:1). Данное предположение проверяли при помощи методов статистического анализа. Результаты анализа наследования трансгена CYP11A1 в поколении Tj для части трансформантов табака из разных линий приведены в табл. 1.

Таблица 1. Анализ наследования трансгена CYP11A1 в поколении Ti табака

Линии растений Всхожесть семян на селективной среде, шт Отношение проростков, устойчивые: чувствительные Достоверность расщепления

Всего высажено Проросло % Ф т х2* Р Модель

У Н У н

CYPL1-1 100 94 94 75 19 70 24 0,237 0,05 3 1

CYPL1-2 100 91 91 76 15 72 19 0,302 0,05 3 1

CYPL1-5 100 100 100 69 31 75 25 0,166 0,05 3 1

CYPL2-1 100 88 88 65 23 66 22 0,806 0,05 3 1

CYPL2-3 100 79 79 61 18 59 20 0,605 0,05 3 1

CYPL2-6 100 89 89 71 18 67 22 0,326 0,05 3 1

CYPL2-7 100 86 86 70 16 64 22 0,138 0,05 3 1

CYPL3-1 100 99 99 76 23 74 25 0,644 0,05 3 1

CYPL3-3 100 95 95 73 22 71 24 0,637 0,05 3 1

CYPL3-4 100 100 100 70 30 75 25 0,248 0,05 3 1

CYPL3-8 100 84 84 62 22 63 21 0,801 0,05 3 1

CYPL4-1 100 99 99 79 20 74 25 0,247 0,05 3 1

CYPL4-2 100 95 95 75 20 71 24 0,345 0,05 3 1

CYPL4-4 100 99 99 73 26 74 25 0,817 0,05 3 1

CYPL4-8 100 80 80 65 15 60 20 0,197 0,05 3 1

Примечание: У - устойчивые к фосфинотрицину проростки; Н - чувствительные к фосфинотрицину проростки; Ф - фактическое соотношение устойчивых и неустойчивых к фосфинотрицину проростков; Т -теоретически ожидаемое соотношение, Р - доверительный интервал. * - фактическое расщепление соответствует теоретическому (х"мо.о5=3,841, df=l)

Как видно из табл. 1 у растений всех тестируемых линий наблюдаются расщепления, близкие к 3:1, что является результатом самоопыления родительских растений. Полученные данные соответствуют закону менделевского расщепления и позволяют сделать заключение о стабильном характере наследования интегрированной в геном трансгенных растений гетерологичной кДНК CYP11A1.

Трансгенные растения табака поколения Ть а также последующих поколений Т2 и Т3 анализировали на присутствие перенесенных генов в геноме методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Этот метод был разработан в нашей лаборатории в ИОГен РАН для эффективного отбора и анализа трансгенных растений (Бердичевец и др., 2008).

Анализ трансгенных растений линий CYPL1-CYPL4 проводили с использованием трех пар праймеров, специфических к последовательностям: 1) кДНК CYP11A1 (целевой ген, фрагмент 502 п.н.); 2) гена домашнего хозяйства NtGA2, кодирующего а-субъединицу ГТФ-связывающего белка табака (контроль качества образцов ДНК, фрагмент 608 п.н.); 3) терминатора нопалинсинтазы Tnos (регуляторный элемент селективного гена, фрагмент 188 п.н.). На рис. 6 представлен пример результатов анализа трансгенных растений табака поколения Т3.

700_» ...........■*-700

500_». _ ,_,_► - — — — ^ ZZ m S — ~ — ~ 4-500

Ml V w К pG I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Мг

Рис. б. Пример результатов анализа трансгенных растений табака поколения Т] методом мультиплексной ПЦР. Mi - маркер молекулярного веса GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва), v - положительный контроль (плазмидный вектор pGBP450f), w - контроль чистоты реакции (вместо проб ДНК взята вода), К - контрольное растение линии Kl, pG - трансгенное растение линии pGl, трансформированное пустым вектором pGreen0229, 1-11 - трансгенные растения табака с введенной кДНК CYP11A1 линий: 1-3 -CYPL1, 4-6 - CYPL2, 7-9 - CYPL3, 10,11 - CYPL4. М2 - маркер молекулярного веса GeneRuler Low Range DNA Ladder («Fermentas», Литва).

Как видно из представленных на рис. 6 данных, во всех исследуемых образцах ДНК трансгенных растений табака поколения Тз присутствуют как селективный, так и целевой гены.

Растения табака, трансформированные пустым вектором поколений Tl - Т3 анализировали мультиплексной ПЦР с двумя парами праймеров - к гену домашнего хозяйства NtGA2 и регуляторной последовательности селективного гена bar - Tnos (рис. 7).

700—► MGA2 _ ^ __ -4 700

500—► — ттт ■ *тш *""' Ч—500

200—► — — -..........• 4—200

М. V u К 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II Мг

Рис. 7. Пример результатов анализа растений табака, трансформированных пустым вектором pGreen0229, поколения Тз методом мультиплексной ПЦР.

Mi - маркер молекулярного веса GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва), v - положительный контроль (плазмидный вектор pGreen0229), w - контроль чистоты реакции (вместо проб ДНК взята вода), К - контрольное растение линии К1, 1-11 - растения табака линий: 1-3 - pGl, 4-6 - pG2, 7,8 - pG3, 9-11 - pG4. Мг - маркер молекулярного веса GeneRuler Low Range DNA Ladder («Fermentas», Литва).

Таким образом, молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в трех поколениях подтвердил результаты анализов по самоопылению трансгенных растений.

4. Сравнительная фенотипическая характеристика контрольных и трансгенных растений табака

При создании и анализе трансгенных растений нами было замечено, что, начиная уже с ранних стадий развития, фенотип трансформантов существенно отличается от фенотипа контрольных растений. Трансгенным растениям всех независимых линий присущ фенотип с сокращенным периодом вегетативного развития с образованием большей биомассы (рис. 8) по сравнению как с контрольными растениями, так и с растениями, трансформированными пустым вектором;_

Рис. 8. Растения табака поколения Тз в возрасте четырех месяцев.

К1 - линия контрольных растений, CYPL1, CYPL4 - независимые линии трансгенных растений, экспрессирующих кДНК СУРНА].

к1 cypl1 cypl4

Для морфологического анализа были выбраны трансгенные растения табака поколения Т3, которые, согласно данным мультиплексной ПЦР (рис. 6), стабильно наследуют целевой ген.

В табл. 2 приведены результаты морфологической характеристики трансгенных растений поколения Тз по таким параметрам, как высота растения, диаметр стебля, площадь листа, количество коробочек и вес тысячи семян. Как видно из представленных данных, по этим показателям трансгенные растения линий СУРЬ достоверно отличаются от контрольных (К1), а также трансгенных растений линии рО!.

Таблица 2. Морфологическая характеристика трансгенных растений поколения Тз, экспрессирующих кДНК СУРНА 1

Линия Высота растения, см Диаметр стебля, мм Площадь листа, см2 Кол-во коробочек, шт Вес 1000 семян, мг

СУРЫ 139±12* 1,74±0,42* 480±65* 63±14* 69,8±1,9*

СУРЬ2 132±14* 1,82±0,43* 425±87* 51±21* 80,2±0,9*

СУРЬЗ 130±11* 1,87±0,60* 338±58* 80±14* 65,2±1,5*

СУРЬ4 124±12* 1,96±0,50* 610±102* 58±20* 80,5±1,3*

рв1 89±24 1,29±0,28 210±31 39±13 50,3±0,9

К1 87±15 1,24±0,28 241±38 36±13 50,3±1,7

Примечание: Данные - средние (± станд. откл.) для выборки п=30.

* - различия достоверны при Р<0,01.

Было отмечено, что у трансгенных растений табака линий СУРЬ цветение и образование семенных коробочек происходит в среднем на две недели раньше, чем у контрольных растений и трансгенных растений линий рй (рис. 9).

Рис. 9. Влияние экспрессии кДНК СУР11А1 цитохрома Р4508сс на время цветения трансгенных растений табака МсоЛапа шЬасит Ь.

1 - контрольные растения (К) ,

2 - трансгенные растения табака с пустым вектором линий рв,

3 - трансгенные растения табака линий СУРЬ.

8 6

1 2 3 4 5 6

Недели с момента начала цветения растений.

Сокращенный период вегетативного развития у трансгенных растений табака линий CYPL свидетельствует о влиянии экспрессии кДНК CYP11A1 на процессы развития растений. Вероятнее всего, это влияние обусловлено проявлением функциональной активности цитохрома P450scc и биосинтезом биологически-активных стероидных соединений - производных прегненолона - продукта реакции, катализируемой цитохромом P450Scc-

Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет сделать заключение о том, что гетерологический цитохром P450Scc функционирует в трансгенных растениях табака, приводит к изменениям в метаболизме стероидов у трансформантов растений, что, вероятно, и обусловливает формирование фенотипа трансгенных растений, отличающегося от фенотипа растений дикого типа и трансгенных растений с пустым вектором.

5. Сравнительное изучение уровня прогестерона в контрольных и трансгенных растениях табака и Digitalis purpurea L.

Известно, что экзогенные стероидные гормоны животных оказывают значительное влияние на физиологические процессы в растениях (Janeczko and Skoczowski, 2005). Следует отметить, что прегненолон не является гормоном и, по-видимому, наблюдаемый нами фенотип трансгенных растений не может быть связан только с его биосинтезом. Однако, известно, что продукт биотрансформации прегненолона, образующийся в результате действия фермента 3ß-гидроксистероид-дегидрогеназы/кетостероид-изомеразы (3ß-HSD), прогестерон (рис. 4), обладает физиологической активностью не только в организме животных, но и в растениях (Janeczko and Skoczowski, 2005; Yang et al., 2005). Отметим, что прогестерон обнаружен у многих двудольных и однодольных растений (lino et al., 2007).

Возможность трансформации прегненолона в прогестерон в культуре клеток табака была показана еще в 1968 году (Graves et al., 1967). Позднее Seidel et al. обнаружили ферментативную активность, присущую 3ß-HSD (рис. 4), в растениях табака и картофеля, и показали, что этот фермент вовлечен в биосинтез брассиностероидов (Seidel et al., 1990). В настоящее время в геноме арабидопсиса Arabidopsis thaliana идентифицировано два гена, кодирующих 3ß-HSD, которые структурно близки генам, кодирующим 3ß-HSD человека (Witt, 2008). Кроме этого, в геноме Arabidopsis и риса обнаружены мембранные стероидсвязывающие белки, гомологи мембранных стероидсвязывающих белков животных (Yang et al., 2005; lino et al., 2007). Yang et al. показали, что прогестерон способен связываться с этими белками и участвовать в регуляции роста растений: в низких концентрациях стимулировать рост растений, а в высоких - подавлять (Yang et al., 2005).

На основании этих данных мы предположили, что в трансгенных растениях линий CYPL за счет ферментативной активности 3ß-HSD из прегненолона может образовываться прогестерон. Для подтверждения этого предположения с использованием иммуноферментного анализа, мы определили относительное содержание прогестерона в экстрактах из контрольных и

трансгенных растений табака, а также из растений наперстянки (рис. 10). Для проведения такого анализа мы выбрали одну независимую линию трансгенных растений СУРЬ4, стабильно наследующую и экспрессирующую трансген, у которой выявлены отличия в фенотипе от линий контрольных растений по большинству исследованных показателей (рис. 6, табл. 2).

Полученные нами данные позволили установить, что содержание прогестерона в листьях трансформантов растений табака линии СУРЬ4 значительно превышает таковое в листьях контрольных растений и схоже с содержанием прогестерона в наперстянке.

Digitalis

Рис. 10. Содержание прогестерона в экстрактах из листьев растений табака и наперстянки. К - линия контрольных растений, CYPL4 - линия трансгенных растений табака, экспрессирующая кДНК CYP11A1 цитохрома P450scc- Digitalis - Digitalis purpurea L.

Мы предполагаем, что высокий уровень прогестерона в трансгенных растениях табака исследуемой линии CYPL4 обусловлен превращением прегненолона в прогестерон за счет фермента 3ß-HSD, который способен катализировать превращение прегненолона в прогестерон (Witt, 2008). При этом нельзя исключить, что влияние экспрессии гетерологичного гена CYP11A1 на увеличение уровня прогестерона в трансгенных растениях может быть опосредованным, поскольку путь его биосинтеза в растениях пока не изучен, как и не изучены все возможные метаболические пути превращений прегненолона в растениях табака. Тем не менее, весьма вероятно, что прогестерон является одним из тех стероидных соединений, которые могут обуславливать фенотипические особенности трансгенных растений табака. Это предположение согласуется с данными литературы. Известно, что экзогенный прогестерон индуцирует раннее цветение растений Arabidopsis thaliana, причем в более низких концентрациях, чем брассиностероид 24-эпибрассинолид (Janeczko and Skoczowski, 2005).

К CYPL4

6. Сравнительное изучение уровня 2411-брассиностероидов в контрольных и трансгенных растениях табака

Известно, что важнейшими регуляторами роста и развития растений являются брассиностероиды, которые имеют структурное сходство со стероидными гормонами животных (К1шрас11 е1 а1., 1999). Для того чтобы выяснить, сказывается ли экспрессия гетерологичного гена СУР11А1 на изменении уровня 2411-брассиностероидов в семенах трансгенных растений табака независимых линий СУРЬ, мы провели сравнительные исследования относительного содержания этих соединений у контрольных и трансгенных растений всех независимых линий. В исследовании использованы растения поколения Т3 (рис. 11).

1 100

о"! 80

ю * || ®

о

Рис. 11. Относительное содержание 24-эпибрассиностсроидов (БС) в семенах контрольных и трансгенных растений табака Nicotiana tabacum. К - контрольные растения табака, 1-4 - независимые линии трансгенных растений табака: 1-CYPL1, 2 - CYPL2, 3 - CYPL3, 4 - CYPL4. Содержание БС в контроле принято за 100%.

Как видно из представленных данных, в семенах трансгенных растений всех линий CYPL1-CYPL4 по сравнению с контрольными растениями отмечено достоверное снижение уровня 2411-брассиностероидов, при этом независимые линии CYPL варьируют между собой по этому показателю.

Известно, что в растениях птиценожки Ornithopus sativus Brot, метаболизм брассиностероидов идет с отщеплением боковой цепи (Kolbe et al., 1994). У животных эту реакцию катализирует цитохром P450Scc- Механизм этой реакции в растениях, у которых обнаружены стероидные соединения с отщепленной боковой цепью, пока не установлен. Мы не исключаем, что в трансгенных растениях табака линий CYPL также происходит отщепление боковой цепи брассиностероидов, приводя к образованию соединений, которые не взаимодействуют с антителами к 24Я-брассиностероидам, но, возможно, проявляют брассиностероидподобную активность. Кроме этого, весьма вероятно, что экспрессия гетерологичной последовательности к ДНК CYP11A1 в растениях может приводить к подавлению эндогенных растительных цитохромов Р450, участвующих в биосинтезе брассиностероидов. В пользу этого предположения свидетельствуют данные литературы о карликовом фенотипе трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК цитохрома Р450 из печени кролика (Saito et al., 1991). По мнению авторов, это может быть

шшш

К 1

обусловлено подавлением на уровне транскрипции экспрессии генов эндогенных стероидных гидроксилаз в трансгенных растениях за счет сходства структуры гомологичных и гетерологичных мРНК.

Мы предполагаем, что снижение уровня 2411-брассиностероидов в трансгенных растения табака компенсируется повышенным биосинтезом прогестерона. Возможно, снижение уровня 2411-брассиностероидов в трансгенных растениях табака линий CYPL создает предпочтительные условия для проявления росторегулирующей активности прогестерона, так как в работе Yang et al. показано, что 2411-брассиностероиды взаимодействуют с прогестеронсвязывающим белком, но с более высокими константами связывания, чем прогестерон (Yang et al., 2005).

ВЫВОДЫ

1. Показано, что полноразмерная последовательность кДНК CYP11A1 животного происхождения экспрессируется и стабильно наследуется в трансгенных растениях табака.

2. Экспрессия гетерологичной последовательности кДНК CYP11A1 в растениях приводит к формированию фенотипа трансгенных растений, характеризующегося сокращённым периодом вегетативного развития (раннее цветение и созревание семенных коробочек), увеличенной биомассой и повышенной продуктивностью (количество и качество семян).

3. Доказано, что в трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1, осуществляется реакция отщепления боковой цепи стеринов с образованием прегненолона, что приводит к повышению содержания в растительных клетках прогестерона.

4. Показано, что экспрессия последовательности кДНК CYP11AI животного происхождения в растениях приводит к снижению уровня 2411-брассиностероидов.

5. На созданных экспериментальных моделях - трансгенных растениях табака - впервые показано, что белковый продукт кДНК CYP11A1 животного происхождения совместим с электоронно-транспортными белками растений, проявляет присущую ему функциональную активность и, следовательно, способен интегрироваться в стероидогенную систему растений, что сопровождается изменениями в метаболизме стероидных соединений.

6. На основании полученных результатов и имеющихся литературных данных предложен возможный механизм гормональной регуляции и формирования фенотипа трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450Scc животных, включающий: (а) частичное подавление синтеза эндогенных цитохромов Р450 растений, участвующих в биосинтезе брассиностероидов; (б) компенсацию снижения уровня 24R-брассиностероидов повышенным биосинтезом прогестерона (в результате превращений: холестерин —» прегненолон —> прогестерон); (в) проявление росторегулирующей активности прогестерона.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. С.Г. Спивак, И.Н. Бердичевец, Р.П. Литвиновская, C.B. Драч, H.A. Картель, Г.В. Шпаковский. Некоторые особенности метаболизма стероидов в трансгенных растениях табака Nicotiana tabacum, несущих кДНК CYP11A1 цитохрома P450scc из коры надпочечников быка // Биоорганическая химия. 2010. Т. 36, №2. С. 241-250.

2. С.Г. Спивак, И.Н. Бердичевец, Д.Г. Ярмолинский, Т.В. Манешина, Г.В. Шпаковский, H.A. Картель. Создание и характеристика трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L., экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450scc Н Генетика. 2009. Т. 45, № 9. С. 1217-1224.

Патент па изобретение

1. H.A. Картель, Г.В. Шпаковский, С.Г. Спивак, Г.Г. Бричкова, Д.Г. Ярмолинский, И.Н. Бердичевец. Т.В. Манешина. Рекомбинантная плазмида pGBP450f и способ получения трансгенных растений табака с повышенной продуктивностью и устойчивостью к грибным фитопатогенам. Патент РФ № 2237717. Зарегистр. 10.10.2004.

Статьи в сборниках

1. Бердичевец И.Н., Гордукова М.А., Шимшилашвили Х.Р., Синдаровская Я.Р., Шелудько Ю.В., Фадеев B.C., Голденкова-Павлова И.В. Дизайн системы праймеров и условий мультиплексной ПЦР для эффективного отбора и анализа трансгенных растений / «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Сборник научных трудов. Редколлегия: В.А. Кунах (главный редактор). Т. 7. Киев, «Логос». 2009. С. 204-208.

2. Спивак С.Г., Бердичевец И.Н., Картель H.A. Трансгенные растения табака, экспрессирующие ген CYP11A1 цитохрома P450scc животного происхождения // Факторы экспериментальной эволюции организмов. Сборник научных трудов. Редколлегия: В.А. Кунах (главный редактор). Т. 3. Киев, «Логос». 2006. С. 639-644.

Тезисы докладов (избранные)

1. И.Н. Бердичевец, С.Г. Спивак, H.A. Картель, Г.В. Шпаковский. Ключевой фермент стероидогенеза животных функционирует в растениях, повышая иммунитет и ускоряя процессы роста и развития // Сборник тезисов Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино. 28 сентября - 1 октября 2009 г. С. 26-27.

2. И.Н. Бердичевец, Х.Р. Шимшилашвили, Я.Р. Синдаровская, Ю.В. Шелудько. Разработка системы праймеров мультиплексной ПЦР для отбора и анализа трансгенных растений // Материалы V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г. С. 533.

3. G.V. Shpakovski, I.N. Berdichevets, E.K. Shematorova, D.G. Shpakovski, N.A. Kartei, S.G. Spivak. Structure-function conservation of steroidogenic systems of plants and animals: phylogeny of the main components // 17th Annual

International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology & 8th European Conference on Computational Biology [ISMB/ECCB 2009]. Stockholm, Sweden. June 27-July 2, 2009. P.D18.

4. H.A. Картель, С.Г. Спивак, И.Н. Бердичевец, Т.В. Манешина, Г.В. Шпаковский. Трансгенные растения табака, несущие кДНК CYP11A1 цитохрома P450scc из коры надпочечников быка // Материалы V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г. С. 546.

5. I.N.Berdichevets, S.G.Spivak, G.V.Shpakovski, N.A.Kartel. Functional activity of mammalian cytochrome P450scc in transgenic tobacco plants // FEBS Advanced Course: Cytochrome P450 systems: from structure to application. Kranjska Gora, Slovenia. Sept. 23-28,2008. P. 154.

6. И.Н. Бердичевец, M.A. Гордукова, Я.Р. Синдаровская, X.P. Шимшилашвили, И.В. Голденкова-Павлова. Разработка метода мультиплексной полимеразной цепной реакции для анализа трансгенных растений // Материалы Международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты. Под редакцией Н.П. Максимовой. Минск. Издательский центр БГУ. 2008. С. 44-46.

7. I. Berdichevets, S. Spivak and N. Kartel. Phenotypic differences in transgenic tobacco plants expressing cDNA CYP11AI mammalian P450scc // Physiol. Plant. 2008. V. 133. P. 100.

8. S.G. Spivak, I.N. Berdichevets, D.G. Yarmolinsky, T.V. Maneshina, G.V. Shpakovski, N.A. Kartel. Expression of mammalian steroidogenic cytochrome P450scc (iCYP11A1) gene in transgenic tobacco plants // Materials of the 6th International Symposium "Recent Advances in Plant Biotechnology: From Laboratory to Business". Ceske Budejovice, Czech Republic, Sept. 2005. P. 13.

9. N.A. Kartel, S.G. Spivak, I.N. Berdichevets, D.G. Yarmolinsky, T.V. Maneshina, G.V. Shpakovski. Transgenic tobacco plants carrying CYP11A1 gene of bovine cytochrome P450SccH Journal of Plant Biotechnology. 2005. V. 118, suppl. 1. P. 144.

10. Спивак С.Г., Бердичевец И.Н., Поляков Ю.С., Картель H.A. Некоторые особенности стероидогенеза и фенотипа трансгенных растений табака, экспрессирующих ген CYP11A1 цитохрома P450Scc животного происхождения // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-8 июня 2005 г. С. 390-393.

11. Спивак С.Г., Бердичевец И.Н., Шпаковский Г.В., Бричкова Г.Г., Ярмолинский Д.Г., Манешина Т.В., Лукьянчук О.В., Картель Н.А. Синтез карденолидов в трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК цитохрома P450scc животного происхождения // Материалы Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск. 24-26 ноября 2004 г. С. 188-189.

12. Бердичевец И.Н., Манешина Т.В., Ярмолинский Д.Г., Спивак С.Г., Шпаковский Г.В., Картель Н.А. Трансформация растений табака рекомбинантной плазмидой pGBP450f, экспрессирующей кДНК CYP11A1 цитохрома P450scc из коры надпочечников быка // Материалы Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск. 24-26 ноября 2004 г. С. 33-34.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям академику Николаю Александровичу Картелю за неоценимую помощь в планировании и обсуждении экспериментов и их результатов, а также доктору биологических наук Георгию Вячеславовичу Шпаковскому за помощь в проведении исследований и обсуждение основных научных результатов и положений диссертации.

Автор признателен сотрудникам лаборатории молекулярной генетики ГНУ «Институт генетики и цитологии HAH Беларуси» за помощь в проведении данной работы, и особенно Татьяне Владимировне Манешиной и Татьяне Николаевне Вересовой.

Особая благодарность и искренняя признательность автора - к.б.н., в.н.с. лаборатории химии липидов ГНУ «Институт биоорганической химии HAH Беларуси» Светлане Григорьевне Спивак за длительное и плодотворное сотрудничество, помощь при освоении современных методов и в проведении экспериментов, а также за неоценимую помощь в обсуждении полученных результатов, и особенно за понимание и поддержку. Автор благодарит за помощь сотрудника лаборатории химии липидов ИБОХ HAH Беларуси Владимира Давыдова.

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории химии стероидов ИБОХ HAH Беларуси д.б.н., г.н.с. Р.П. Литвиновской и к.б.н., в.н.с. C.B. Драч за помощь в проведении ряда экспериментов.

Автор признателен и благодарен сотрудникам группы геномики растений Отдела геномики УРАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН за помощь в проведении ряда экспериментов и лично д.б.н., г.н.с. Ирине Васильевне Голденковой-Павловой за неоценимую помощь в обсуждении полученных результатов, понимание и поддержку во всех начинаниях.

Автор благодарен к.б.н. Юрию Шелудько, к.б.н. Ирине Герасименко и к.б.н. Яне Синдаровской за проведение совместных исследований.

Безмерную и сердечную благодарность автор выражает своим родителям Ларисе Григорьевне и Николаю Леонидовичу Бердичевец, родным Александре Павловне Ураевой и Анне Титовне Бердичевец и близким за моральную поддержку.

Моя самая искренняя признательность и благодарность моему мужу -Павлу Рыжкову - за поддержку, понимание и терпение.

Заказ № 145-а/04/10 Подписано в печать 28.04.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 Г^)} с/г. ги; е-таИ: т/о @с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бердичевец, Ирина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гены, кодирующие цитохром Р450-зависимые монооксигеназы, и их физиологическая роль в функционировании 7 стероидогенных систем животных и растений

1.1.1 Суперсемейство генов цитохромов Р

1.1.2 Сравнительная характеристика стероидогенных систем животных и растений

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Конструирование экспрессионного вектора pGBP450f для ^ трансформации растений табака

3.2 Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК CYP11A

3.3 Молекулярно-генетический анализ первичных ^ трансформантов табака

3.3.1 Анализ трансформантов табака методом ПЦР

3.3.2 Анализ трансформантов табака методом ^ блот-гибридизации по Саузерну

3.3.3 Анализ экспрессии кДНК CYP11A1 методом ОТ-ПЦР

3.4 Исследование функциональной активности цитохрома P450Scc zr oZ в трансгенных растениях табака

3.5 Изучение наследования гетерологичной кДНК CYP11A1 у репродуктивного потомства трансгенных растений табака поколений

3.5.1 Анализ трансформантов табака поколений Т2 и Т3 ^ методом мультиплексной ПЦР

3.6 Фенотипическая характеристика трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450Scc из коры 100 надпочечников быка

3.7 Иммуноферментное определение прогестерона в трансгенных растениях табака

3.8 Определение содержания брассиностероидов в трансгенных растениях табака, несущих кДНК CYP11A

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование метаболизма стероидных соединений растений за счет экспрессии кДНК Cypiiai цитохрома Р450scc животного происхождения"

Долгое время считалось, что стероидные гормональные системы животных и растений принципиально различны. Только в последнее десятилетие стали накапливаться данные об определённой структурной и функциональной консервативности путей и регуляции синтеза биологически активных стероидных соединений у этих двух важнейших царств живой природы. Установлено, что основные стадии в процессах биосинтеза и метаболизма стероидных гормонов животных и брассиностероидов растений катализируют цитохромы Р450, в обоих системах функционируют такие ферменты, как стероид 5а-редуктаза (5aR) и

Л5-гидроксистероиддегидрогеназа/Д5-Л4-кетостероидизомераза (Зр-HSD).

Однако, несмотря на очевидное сходство процессов стероидогенеза в растениях и животных, между ними существует фундаментальное отличие, заключающееся в том, что в растениях отсутствует ключевой фермент биосинтеза стероидных гормонов животных - митохондриальный цитохром P450scc (cholesterol side chain cleavage enzyme), катализирующий отшепление боковой цепи холестерина с образованием прегненолона, который является предшественником всех стероидных гормонов животных. Хотя присутствие митохондриальных цитохромов у растений до сих пор не доказано, известно, что в митохондриях наперстянки Digitalis sp, происходит превращение холестерина в прегненолон. Более того, недавно в растениях обнаружен ряд стероидных гормонов животных (17-гидроксипрогестерон,

16-дегидроксипрогестерон, андростендион), а также гомологи белков-рецепторов, контролирующих транспорт холестерина в клетках животных. Следовательно, в растениях возможна трансформация стероидов, подобная таковой у животных. Это открывает перспективы использования генов животного происхождения для переноса и экспрессии в растениях с целью направленного моделирования стероидного метаболизма растений.

В связи с вышеизложенным, актуальной научной задачей было создание и всестороннее изучение трансгенных растений, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1, кодирующего цитохром P450Scc животных.

Такие генетические исследования важны как с фундаментальной, так и с практической точек зрения. С точки зрения фундаментальной научной теории эта работа позволила бы ответить на следующие вопросы:

1) возможна ли интеграция животного цитохрома P450scc в стероидгидроксилирующую систему растений, 2) какие метаболические превращения прегненолона возможны в растениях и, наконец, 3) какие биологически-активные стероиды способны оказывать влияние на формирование фенотипа трансгенных растений.

С практической точки зрения указанные исследования могут иметь следующие перспективы: 1) создание растений с повышенными биологическими потенциями (высокой скоростью роста и развития, а также с высокой продуктивностью и устойчивостью к фитопатогенам,

2) трансформация лекарственных растений с целью повышения содержания биологически-активных стероидных соединений, которые могут найти свое применение в медицинской практике, 3) применение полученных данных при создании экзогеных стимуляторов роста, развития и иммунитета растений.

Цель исследования: изучить возможность направленного изменения метаболизма стероидных соединений в растениях с помощью переноса и экспрессии в них кДНК CYP11A1 животных, которая кодирует митохондриальный цитохром P450Scc

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать экспрессионный вектор для трансформации растений, в котором полноразмерная последовательность кДНК CYP11A1 находится под контролем конститутивного промотора 35S РНК CaMV.

2. Провести трансформацию растений табака полученным экспрессионным вектором.

3. Провести молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака.

4. Определить функциональную активность цитохрома P450Scc путем сравнительного определения продукта катализируемой им реакции -прегненолона — в контрольных и трансгенных растениях табака.

5. Изучить особенности метаболизма ряда других стероидных соединений (таких как прогестерон и брассиностероиды) в трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450Scc животного происхождения.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Бердичевец, Ирина Николаевна

выводы

1. Показано, что полноразмерная последовательность кДНК CYP11A1 животного происхождения экспрессируется и стабильно наследуется в трансгенных растениях табака.

2. Экспрессия гетерологичной последовательности кДНК CYP11A1 в растениях приводит к формированию фенотипа трансгенных растений, характеризующегося сокращённым периодом вегетативного развития (раннее цветение и созревание семенных коробочек), увеличенной биомассой и повышенной продуктивностью (количество и качество семян).

3. Доказано, что в трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1, осуществляется реакция отщепления боковой цепи стеринов с образованием прегненолона, что приводит к повышению содержания в растительных клетках прогестерона.

4. Показано, что экспрессия последовательности кДНК CYP11A1 животного происхождения в растениях приводит к снижению уровня 2411-брассиностероидов.

5. На созданных экспериментальных моделях - трансгенных растениях табака - впервые показано, что белковый продукт кДНК CYP11A1 животного происхождения совместим с электоронно-транспортными белками растений, проявляет присущую ему функциональную активность и, следовательно, способен интегрироваться в стероидогенную систему растений, что сопровождается изменениями в метаболизме стероидных соединений.

6. На основании полученных результатов и имеющихся литературных данных предложен возможный механизм гормональной регуляции и формирования фенотипа трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450Scc животных, включающий: (а) частичное подавление синтеза эндогенных цитохромов Р450 растений, участвующих в биосинтезе брассиностероидов; (б) компенсацию снижения уровня 2411-брассиностероидов повышенным биосинтезом прогестерона (в результате превращений: холестерин —> прегненолон —> прогестерон); (в) проявление росторегулирующей активности прогестерона.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бердичевец, Ирина Николаевна, Москва

1. Дейнеко Е.В. Изучение экспрессии геторогичных и собственных генов трансгенных растений (на примере Nicotiana tabacum L.) при инбридинге // Дисс. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук / Новосибирск. 2004. 354 с.

2. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филиппенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака СNicotiana tabacum L.) // Генетика. 1998. Т. 43. С. 1212-1219.

3. Лузиков В.Н., Новикова Л.А., Спиридонова В.А. Исаева Л.В., Вилан Д., Хыогоссон М., Глазер Э. Конструирование гетерологических митохондрий: импорт предшественника цитохрома P450Scc быка в растительные митохондрии // Биохимия. 1994. Т. 59. С. 1098-1101.

4. Патрушев Л. И. Экспрессия генов. 2000. Москва: Наука, с. 527.

5. Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana //Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

6. Arensburg J., Payne A.H., Orly J. Expression of steroidogenic genes in maternal and extraembryonic cells during early pregnancy in mice // Endocrinology. 1999. V. 140. P. 5220-5232.

7. Ayabe S. and Akashi T. Cytochrome P450s in flavonoid metabolism // Phytochem. Rev. 2006. V. 5. P. 271-282.

8. Azpiroz R., Wu Y., LoCascio J.C., Feldmann K.A. An Arabidopsis brassinosteroid-dependent mutant is blocked in cell elongation // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 219-230.

9. Bak S. and Feyereisen R. The involvement of two P450 enzymes, CYP83B1 and CYP83A1, in auxin homeostasis and glucosinolate biosynthesis // Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 108-118.

10. Bak S., Tax F.E., Feldmann K.A., Galbraith D.W., Feyereisen R. CYP83B1, a cytochrome P450 at the metabolic branch point in auxin and indole glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 101-111.

11. Barrett M. Metabolism of herbicides by cytochrome P450 in corn // Drug Metabol. Drug Interact. 1995 .V. 12. P. 299-315.

12. Bate N.J., Sivasankar S., Moxon C., Riley J.M.C., Thompson J.E., Rothstein S.J. Molecular characterization of an Arabidopsis gene encoding hydroperoxide lyase, a cytochrome P-450 that is wound inducible // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 1393-1400.

13. Benveniste I., Tijet N., Adas F., Philipps G., Salaun J.P., Durst F. CYP86A1 from Arabidopsis thaliana encodes a cytochrome P450-dependent fatty acid omega-hydroxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 243. P. 688-693.

14. Berenbaum M.R. Coumarins. In Herbivores: Their interactions with secondary plant metabolites. San Diego: Academic, ed. G. Rosenthal, M. Berenbaum. V. 1. P. 221-249.

15. Bernhardt R. Cytochromes P450 as versatile biocatalysts // J. Biotechnol. 2006. V. 124. P. 128-145.

16. Bertges W.J., Kinney D.A., Pieters E.P. Glufosinate ammonium: review and update //North Cent. Weed Sci. Proc. Soc. 1994. P.49-57

17. Bishop G.J., Koncz C. Brassinosteroids and plant steroid hormone signaling // Plant Cell. 2002. V. 14. P. S97-S110.

18. Chappie C. Molecular-genetic analysis of plant cytochrome P450-dependent monooxygenases // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998 V. 49. P. 311-343.

19. Chaudhry Q., Schroder P., Werck-Reichhart D., Grajek W., Marecik R. Prospects and limitations of phytoremediation for the removal of persistent pesticides in the environment // Environ Sci Pollut Res Int. 2002 Y. 9. P. 4-17.

20. Choe S. Brassinosteroid Biosynthesis and Metabolism. In Plant Hormones. Biosynthesis, Signal Transduction, Action! 2007. ed. Davis P.J. Springer Netherlands.

21. Choe S., Dilkes B.P., Fujioka S., Takatsuto S., Sakurai A., Feldmann K.A. The DWF4 gene of Arabidopsis encodes a cytochrome P450 that mediates multiple 22a-hydroxylation steps in brassinosteroid biosynthesis // Plant Cell. 1998. V. 10.P. 231-243.

22. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.

23. Clouse S.D., Langford M., McMorris T.C. A brassinosteroid-insensitive mutant in Arabidopsis thaliana exhibits multiple defects in growth and development // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 671-8.

24. Compagnone N.A., Bulfone A., Rubenstein J.L., Mellon S.H. Expression of the steroidogenic enzyme P450scc in the central and peripheral nervous systems during rodent embryogenesis // Endocrinology. 1995. V. 136. P. 2689-2696.

25. Creelman R.A. and Mullet J.E. Oligosaccharins, brassinolides, and jasmonates: nontraditional regulators of plant growth, development, and gene expression // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1211-1223.

26. Croteau R., Kutchan T.M., Lewis N.G. Natural products (secondary metabolites). In Biochemistry and molecular biology of plants, ed. B. Buchanan, W Gruissem, R. Jones,. Rockville: Am. Soc. Plant Physiol. 2000. P. 1250-1318.

27. Duan H. and Schuler M.A. Differential expression and evolution of the Arabidopsis CYP86A subfamily // Plant Physiol. 2005. V. 137. P. 1067-1081.

28. Durst F. and Nelson D.R. Diversity and evolution of plant P450 and P450-reductases // Drug Metabol. Drug Interact. 1995. V. 12. P. 189-206.

29. Ehlting J., Hamberger В., Million-Rousseau R., Werck-Reichhart D. Cytochromes P450 in phenolic metabolism // Phytochem. Rev. 2006. V. 5. P. 239-270.

30. Elstra В., Touraev A., Brinkmann A.O., Heberle-Bors E., Tunen A.J.V. Sterol hormones stimulate germination and tube growth of in vitro maturated tobacco pollen // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 639-643.

31. Finsterbuch A., Lindemann P., Grimm R. A5 -3P-hydroxysteroid dehydrogenase from Digitalis lanata Ehrh. a multifunctional enzyme in steroid metabolism? // Planta. 1999. V. 209. P. 478-486.

32. Fjaervik E. and Zotchev S.B. Biosynthesis of the polyene macrolide antibiotic nystatin in Streptomyces noursei // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 67. P. 436-443.

33. Flavell R.B. Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3490-3496.

34. Franz J.E., Мао M.K., Sikorski J.A. Uptake, transport and metabolism of glyphosate in plants. In Glyphosate: A unique global herbicide. ACS monograph. 1997. P. 143-181.

35. Frear D.S. Wheat microsomal cytochrome P450 monooxygenases: characterization and importance in the metabolic detoxification and selectivity of wheat herbicides // Drug Metabol Drug Interact. 1995. V. 12. P. 329-357.

36. Fujioka S. and Yokota T. Biosynthesis and metabolism of brassinosteroids 11 Annu. Rev. Plant Biol. 2003. V. 54. P. 137-164.

37. Fujita S., Ohnishi Т., Watanabe В., Yokota Т., Takatsuto S., Fujioka S., Yoshida S., Sakata K., Mizutani M. Arabidopsis CYP90B1 catalyses the early C-22 hydroxylation of C27, C28 and C29 sterols // Plant J. 2006. V. 45. P. 765-774.

38. Graves J.M.H. and Smith W.K. Transformation of pregnenolone and progesterone by cultured plant cell // Nature. 1967. V. 214. P. 1248-1249.

39. Gunsalus I.C. and Sligar S.G. Oxygen reduction by the P450 monoxygenase systems // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1978. V. 47. P. 1-44.

40. Gupta D., Bhardwaj R., Nagar P.K., Kaur S. Isolation and characterization of brassinosteroids from leaves of Camellia sinensis (L.) O. Kuntze // Plant Growth Reg. 2004. V. 43. P. 97-100.

41. Hannemann F., Bichet A., Ewen К. M., Bernhardt R. Cytochrome P450 systems — biological variations of electron transport chains // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1770. P. 330-344.

42. Hartman M.A. Plant sterols and membrane // Trends in Plant Science. 1998. V. 3.P. 170-175.

43. Harvey P.J., Campanella B.F., Castro P.M., Harms H., Lichtfouse E., Schaffner A.R., Smrcek S., Werck-Reichhart D. Phytoremediation of polyaromatic hydrocarbons, anilines and phenols // Environ Sci. Pollut Res. Int. 2002. V. 9. P. 29-47.

44. Hasler J.A., Estabrook R.W., Murray M., Pikuleva I., Waterman M.R., Capdevila J., Holla V., Helvig C., Falck J., Farrell G. Human cytochromes P450 // Mol. Aspects Med. 1999. V. 20. P. 1-137.

45. Hedden P. and Kamiya Y. Gibberellin Biosynthesis: Enzymes, Genes and Their Regulation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 431-460.

46. Hellens R.P., Edwards E. A., Leyland N. R. et al. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 819-832.

47. Helliwell C.A., Chandler P.M., Poole A., Dennis E.S., Peacock W.J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 V. 98. P. 2065-2070.

48. Helliwell C.A., Poole A., Peacock W.A., Dennis E.S. Arabidopsis ent-kaurene oxidase catalyzes three steps of gibberellin biosynthesis // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 507-510.

49. Helliwell С.A., Sheldon C.C., Olive M.R., Walker A.R., Zeevaart, J.A., Peacock W.J., Dennis E.S. Cloning of the Arabidopsis ent-kaurene oxidase gene GA3 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9019-9024.

50. Hemm M.R., Ruegger M.O., Chappie C. The Arabidopsis ref2 mutant is defective in the gene encoding CYP83A1 and shows both phenylpropanoid and glucosinolate phenotypes // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 179-194.

51. Howe G.A., Lee G.I., Itoh A., Li L., DeRocher A.E. Cytochrome P450-dependent metabolism of oxylipins in tomato. Cloning and expression of allene oxide synthase and fatty acid hydroperoxide lyase // Plant Physiol. 2000. V. 123. P.711-724.

52. Hull A.K., Vij R., Celenza J.L. Arabidopsis cytochrome P450s that catalyze the first step of tryptophan-dependent indole-3-acetic acid biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 2379-2384.

53. Janeczko A. and Skoczowski A. Mammalian sex hormones in plants // Folia histohcimica et cytobiologia. 2005. V. 43. P. 71-79.

54. John M.E., John M.C., Asnley R.P. Identification and Characterization of cDNA clones specific for cholesterol side-chain cleavage cytochrome P-450 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 5628-5632.

55. Kahn R. and Durst F. Function and evolution of plant cytochrome P450 // Recent Adv. Phytochem. 2002. V. 34. P. 151-189.

56. Kandel S., Sauveplane V., Olry A., Diss L., Benveniste I., Pinot F. Cytochrome P450-dependent fatty acid hydroxylases in plants // Phytochem. Rev. 2006. V. 5. P. 359-372.

57. Kauschmann A., Jessop A., Koncz C., Szekeres M., Willmitzer L., Altmann T. Genetic evidence for an essential role of brassinosteroids in plant development // Plant. J. 1996. V. 9. P. 701-713.

58. Kayes-Wandover K.M. and White P.C. Steroidogenic enzyme gene expression in the human heart // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. V. 85. P. 2519-2525.

59. Khripach V.F., Zhabinskii V.N., de Groot A. Brassinosteroids. A new class of plant hormones. San Diego Acad. Press. 1999.

60. Kim G.T., Fujioka S., Kozuka Т., Tax F.E., Takatsuto S., Yoshida S., Tsukaya H. CYP90C1 and CYP90D1 are involved in different steps in the brassinosteroid biosynthesis pathway in Arabidopsis thaliana II Plant J. 2005. V. 41. P.710-721.

61. Kim G.T., Tsukaya H., Uchimiya H. (1998) The ROTUNDIFOLIA3 gene of Arabidopsis thaliana encodes a new member of the cytochrome P-450 family that is required for the regulated polar elongation of leaf cells // Genes Devel. 1998. V. 12. P. 2381-2391.

62. Kim H.B., Schaller H., Goh C.H., Kwon M., Choe S., An C.S., Durst F., Feldmann K.A., Feyereisen R. Arabidopsis cyp51 mutant shows postembryonic seedling lethality associated with lack of membrane integrity // Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 2033-2047.

63. Kim J. and DellaPenna D. Defining the primary rout for lutein synthesis in plants: the role of Arabidopsis carotenoid beta-ring hydroxylase CYP97A3 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 3474-3479.

64. Koka C.V., Cerny R.E., Gardner R.G., Noguchi Т., Fujioka S., Takatsuto S., Yoshida S., Clouse S.D. A putative role for the tomato genes

65. DUMPY and CURL-3 in brassinosteroid biosynthesis and response // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 85-98.

66. Kolbe A., Schneider В., Porzel A., Voigt В., Krauss G., Adam G. Pregnane-type metabolites of brassinosteroids in cell suspension cultures of Omithopus sativus II Phytochemistry. 1994. V. 36. P. 671-673.

67. Krochko J.E., Abrams G.D., Loewen M.K., Abrams S.R., Cutler A.J. (+)-Abscisic acid 8'-hydroxylase is a cytochrome P450 monooxygenase // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 849-860.

68. Kutchan T.M. Alkaloid biosynthesis the basis for metabolic engineering of medicinal plants // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1059-1070.

69. Kwon M., Fujioka S., Jeon J.H., Kim H.B., Takatsuto S., Yoshida S., An C.S., Choe S. A double mutant for the CYP85A1 and CYP85A2 genes of Arabidopsis exhibits a brassinosteroid dwarf phenotype // J. Plant Biol. 2005. V. 48. P. 237-244.

70. Le Goascogne C., Robel P., Gouezou M., Sananes N., Baulieu E.E., Waterman M. Neurosteroids: cytochrome P-450scc in rat brain // Science. V. 237. P. 1212- 1215.

71. Lepesheva G.I., Waterman M.R. Sterol 14alpha-demethylase cytochrome P450 (CYP51), a P450 in all biological kingdoms // Biochim. Biophys. Acta. 2007 V. 1770. P. 467-477.

72. Li J., Biswas G., Chao A. Conservation of function between mammalian and plant steroid 5a-reductases (5aR). // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 3554-3559.

73. Li J., Nagpal P., Vitart V., McMorris T.C., Chory J. A role for brassinosteroids in light-dependent development of Arabidopsis // Science. 1996. V. 272. P. 398-401.

74. Lindemann P. and Luckner M. Biosynthesis of pregnane derivatives in somatic embryons of Digitalis lanata II Phytochemistry. 1997. V. 46. P. 507-513.

75. Lindemann P., Koch A., Degenhardt В., Hause G., Grimm В., Papadopoulos V. A novel Arabidopsis thaliana protein is a functional peripheral-type benzodiazepine receptor // Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 723-733.

76. Mannerlof M. and Tenning P. Screening of transgenic plants by multiplex PCR // Plant Mol. Biol. Rep. 1997. V. 15. P. 38^15.

77. Matocha M.F. and Waterman M.R. Synthesis and processing of mitochondrial steroid hydroxylases. In vivo maturation of the precursor forms of cytochrome P-450scc, cytochrome P-450(l l)beta, and adrenodoxin // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 12259-12265.

78. Matzke M.A. and Matzke A.J.M. How and why do plants inactivate homologues (trans)genes? // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 679-685.

79. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.J.M. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 401-415.

80. Mendes M.V., Anton N., Martin J.F., Aparicio J.F. Characterization of the polyene macrolide P450 epoxidase from Streptomyces natalensis that converts de-epoxypimaricin into pimaricin // Biochem. J. 2005. V. 386. P. 57-62.

81. Meyer К., Cusumano J.C., Somerville С., Chappie C.C.S. Ferulate-5-hydroxylase from Arabidopsis thaliana defines a new family of cytochrome P450-dependent monooxygenases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 6869-6874.

82. Meza T. J., Enerly E., Born В., Larsen F., Mandal A., Aalen R. В., Jakobsen K. S. A human CpG island randomly inserted into a plant genome is protected from methylation // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 133-142.

83. Mizutani M., Ohta D., Sato R. Isolation of a cDNA and a genomic clone encoding cinnamate 4-hydroxylase from Arabidopsis and its expression manner in planta // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 755-763.

84. Morohashi К., Sogawa К., Omura Т., Fujii-Kuriyama Y. Gene structure of human cytochrome P-450(SCC), cholesterol desmolase // J. Biochem. 1987. V. 101. P. 879-887.

85. Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

86. Nakamura M., Satoh Т., Tanaka S., Mochizuki N., Tokota Т., Nagatani A. Activation of the cytochrome P450 gene, CYP72C1, reduces the levels of active brassinosteroids in vivo // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 833-840.

87. Nakaya M., Tsukaya H., Murakami N., Kato M. Brassinosteroids control the proliferation of leaf cells of Arabidopsis thaliana II Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 239-244.

88. Nebert D.W. and Gonzales F.J. P450 genes: structure, evolution and regulation // Ann. Rev. Biochem. 1987. V.56. P. 945-993.

89. Nelson D.R. Cytochrome P450 nomenclature, 2004 // Methods Mol. Biol. 2006. V. 32. P. 1-10.

90. Nelson D.R., Ming R., Alam M., Schuler M.A. Comparison of Cytochrome P450 genes from six plant genomes // Tropical Plant Biol. 2008. V. 1. P. 216-235.

91. Nielsen K.A. and Meller B.L. Cytochrome P450s in Plants. In the Cytochrome P450: Structure, mechanism, and biochemistry, ed. Paul R. Ortiz de Montellano. Kluwer Academic Plenum Publishers, New York, 2005. P. 553-583.

92. Niemeyer H.M. Hydroxamic acids derived from 2-hydroxy-2H-l,4-benzoxazin-3(4H)-one: key defense chemicals of cereals // J. Agric. Food Chem. 2009. In Press.

93. Nitsch J.P. and Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science. 1969. V. 163. P. 85-87.

94. Noguchi Т., Fujioka S., Choe S., Takatsuto S., Tax F.E., Yoshida S., Feldmann K.A. Biosynthelic pathways of brassinolide in Arabidopsis // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 201-209.

95. Noguchi Т., Fujioka S., Takatsuto S. Arabidopsis det2 is defective in the conversion of (24R)-24-methelcholest-4-en-3-one to (24R)-24-methyl-5a-cholestan-3-one in brassinosteroid biosynthesis. // Plant Physiology. 1999. V. 120. P. 833-839.

96. Nomura Т., Jager C.E., Kitasaka Y., et al. Brassinosteroid defficiency due to trancated steroid 5a-reductase causes dwarfism in Ik mutant of pea // Plant Physiology. 2004. V. 135. P. 2220-2229.

97. Nomura Т., Kushiro Т., Yokota Т., Kamiya Y., Bishop G.J., Yamaguchi S. The last reaction producing brassinolide is catalyzed by cytochrome P-450s, CYP85A3 in tomato and CYP85A2 in Arabidopsis // J Biol. Chem. 2005. V. 280. P.17873-17879.

98. Paquette S.M., Bak S., Feyereisen R. Intron-exon organization and phylogeny in a large superfamily, the paralogous cytochrome P450 genes of Arabidopsis thaliana IIDNA Cell Biol. 2000. V. 19. P. 307-317.

99. Pauli G.F., Friesen G.B., Godecke Т., Farnsworth N.R., Glodny B. Occurrence of progesterone and related animal steroids in two higher plants // J. Nat. Prod. 2010. V. 73. P. 338-345.

100. Payne A.H. and Hales D.B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones // Endocrine Rev. 2004. V. 25 P. 947-970.

101. Payne A.H. and Youngblood G.L. Regulation of expression of steroidogenic enzymes in Leydig cells // Biol. Reprod. 1995. V. 52. V. 217-225.

102. Piccioni A., Dance R., Alban C. The plant biotin synthase reaction. Identification and characterization of essential mitochondrial accessory protein compartments // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 24906-24975.

103. Pietrzak M., Shillito R.D., Hohn Т., Potrykus I. Expression in plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation with a new plant expression vector // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 5857-5868.

104. Potrycus I. and Schillito R.D. Protoplast: Isolation, culture, plant regeneration // Plant Mol. Biol. 1986. V. 118. P. 549-578.

105. Potrycus I., Muttelstein Sheid O., Suatter C., Sautter G. Gene transfer to plants. EMBO advanced cources. Zurich: Swiss Federal Institute of Technology. 1991. 125 p.

106. Rogers S.O. and Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Mol. Biol. 1985. V. 5. P. 69-76.

107. Rosati F., Danza G., Guarna A. New evidence of similarity between human and plants steroid metabolism: 5a-reductase activity in Solanum malacoxylon // Endocrynology. 2003. V. 144. P. 220-229.

108. Ruegger M., Meyer K., Cusumano J.C., Chappie C. Regulation of ferulate-5-hydroxylase expression in Arabidopsis in the context of sinapate ester biosynthesis // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 101-110.

109. Russell D.W., and Wilson J.D. Steroid 5 alpha-reductase: two genes/ two enzymes // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 25-61.

110. Saito K., Noji M., Ohmori S., Imai Y., Murakoshi I. Integration and expression of a rabbit liver cytochrome P-450 gene in transgenic Nicotiana tabacum II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 7041-7045.

111. Saito S„ Hirai N., Matsumoto C., Ohigashi H., Ohta D., Sakata K., Mizutani M. Arabidopsis CYP707As encode (+)-abscisic acid 8'-hydroxylase, a key enzyme in the oxidative catabolism of abscisic acid // Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 1439-1449.

112. Sambrook J., Fritsch F.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989.

113. Sambrook J. and Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition. 2001.

114. Schiffler B. and Bernhardt R. Bacterial (CYP 101) and mitochondrial P450 systems — how comparable are they? // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 312. P. 223-228.

115. Schuhegger R., Nafisi M., Mansourova M., Petersen B.L., Olsen C.E., Svatos A., Halkier B.A., Glawischnig E. CYP71B15 (PAD3) catalyzes the final step in camalexin biosynthesis // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 1248-1254.

116. Schiller M.A. Plant cytochrome P450 monooxygenases // Crit. Rev. Plant Sci. 1996. V. 15. P. 235-284.

117. Seidel S., Kreis W., Reinhard E. 5-3-hydroxysteroid dehydrogenase/5-4-ketosteroid isomerase (Зр-HSD), a possible enzyme of cardiac glycoside biosynthesis, in cell cultures and plants of Digitalis lanata EHRH // Plant Cell Rep. 1990. V. 8. P. 621-624.

118. Seigler D.S. Plant secondary metabolism. Boston: Kluwer. 1998.776 p.

119. Shimada Y., Goda H., Nakamura A., Takatsuto S., Fujioka S., Yoshida S. Organ-specific expression of brassinosteroid-biosynthetic genes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis // Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 287-297.

120. Simard J., Melner M.H., Bretron N. Characterisation of macague 3{3-hedroxy-5-ene steroid dehydrogenase/A5-A4isomerase: structure and exoression in steroidogenic and oerioheral tissues in primate. // Mol. Cell. Endocrynol. 1991. V. 75. P. 101-110.

121. Simersky R., Novak O., Morris D.A., Pouzar V. and Strnad M. Identification and Quantification of several mammalian steroid hormones in plants by UPLC-MS/MS //J. Plant Growth Regul. 2009. V. 28. P. 125-136.

122. Sono M., Roach M.P., Coulter W.D., Dawson J.H. Heme-containing oxygenases // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2841-2887.

123. Takei K., Yamaya Т., Sakakibara H. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. //J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 41866-41872.

124. Takumi S., Ida M., Haisa Y., Ando S., Nakamura C. Genomic structure and homeologous relationship of the two a-subunit genes of а heterotrimeric GTP-binding protein in tobacco // Genome. 2002. V. 45. P. 626-633.

125. Tanaka Y. Flower colour and cytochromes P450 // Phytochem. Rev. 2006. V. 5. P. 283-291.

126. Thompson J., Rao Movva N., Tizard R., Crameri R., Davies E. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus // EMBO J. 1987. V. 6. P.2519-2523

127. Vancanney G., Sanz C., Farmaki T. Hydroperoxide lyase depletion in transgenic potato plants leads to an increase in aphid performance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 8139-8140.

128. Watson C.J., Froehlich J.E., Josefsson C.A., Chappie C., Durst F., Benveniste I., Coolbaugh R.C. Localization of CYP86B1 in the outer envelope of chloroplasts // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P.873-878.

129. Werck-Reichart D., Bak S., Paquette S.M. Cytochromes P450. In the Arabidopsis book. 2002. Rockville: American Society of Plant Biologist, pp. 1-28.

130. Werck-Reichhart D. and Feyereisen R. Cytochromes P450: a success story // Genome Biol. 2000. V. 1. P. 3003.1-3003.9.

131. Werck-Reichhart D. Cytochromes P450 in phenylpropanoid metabolism // Drug Metabol. Drug Interact. 1995. V. 12. P. 221-243.

132. Werck-Reichhart D., Hehn A., Didierjean L. Cytochromes P450 for engineering herbicide tolerance // Trends Plant Sci. 2000. V. 5. P. 116-123.

133. Wittstock U. and Halkier В.A. Cytochrome Р450 CYP79A2 from Arabidopsis thaliana L. catalyzes the conversion of L-phenylalanine to phenylacetaldoxime in the biosynthesis of benzylglucosinolate // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 14659-14666.

134. Yamamoto R., Fujioka S., Demura Т., Takatsuto S., Yoshida S., Fukuda H. Brassinosteroid levels increase drastically prior to morphogenesis of tracheary elements // Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 556-563.

135. Yang X., Xua Z. H. and Xue H.W. Arabidopsis membrane steroid binding protein 1 is involved in inhibition of cell elongation // Plant Cell. 2005. V. 17. P. 116-131.

136. Young M.J., Clyne C.D., Cole T.J., Funder J.W. Cardiac steroidogenesis in the normal and failing heart // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. V. 86. P. 5121-5126.

137. Youngblood G.L., Nesbitt M.N., Payne A.H. The structural genes encoding P450scc and P450arom are closely linked on mouse chromosome 9 // Endocrinology. 1989. V. 125. P. 2784-2786.

138. Zhou N., Tootle T.L., Glazebrook J. Arabidopsis PAD3, a gene required for camalexin biosynthesis, encodes a putative cytochrome P450 monooxygenase //Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2419-2428.

139. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Статьи

140. I. Berdichevets, S. Spivak and N. Kartel. Phenotypic differences in transgenic tobacco plants expressing cDNA CYP11A1 mammalian P450SCC // Physiol. Plant. 2008. V. 133. P. 100.

141. N.A. Kartel, S.G. Spivak, I.N. Berdichevets, D.G. Yarmolinsky, T.V. Maneshina, G.V. Shpakovski. Transgenic tobacco plants carrying CYP11A1 gene of bovine cytochrome P450Scc H Journal of Plant Biotechnology. 2005. V. 118, suppl. 1. P. 144.