Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности

Речкина, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности"

На правах рукописи

РЕЧКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С ПРИ ПОМОЩИ ТЕХНОЛОГИИ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ, АНАЛИЗ ИХ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

03.00.03. - Молекулярная биология 03.00.06. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д И Ивановского РАМН

Научные руководители:

кандидат биологических наук, Лидеман Людмила Фроловна кандидат биологических наук, Масалова Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Месянжинов Вадим Викторович

Доктор медицинских наук, профессор, чл -корр РАМН Урываев Леонид Викторович

Ведущая организация:

НИИ вирусных препаратов им О Г Анджапаридзе, РАМН

Защита состоится « 5 » декабря 2005 г в 12 00 часов

на заседании диссертационного Совета Д 001 020 01 при ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (адрес 123098, Москва, ул Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Автореферат разослан « 3 » ноября 2005 г

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

3ssk± 2/У/l IM

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Значительный рост показателей заболеваемости острым гепатитом С в последние годы, частое поражение лиц молодого возраста, высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени определяют повышенное внимание к этому заболеванию.

Вскоре после открытия вируса гепатита С (ВГС) в 1989 году стало очевидно, что изучение нативных вирусных белков представляет сложную задачу в связи с низким уровнем накопления вируса в организме хозяина и отсутствием клеточной системы для его культивирования. В то же время изучение молекулярных механизмов взаимодействия вируса с клеткой-хозяином, в частности, изучение натуральных вирусных белков, необходимо для решения теоретических проблем- локализации антигенных и иммуногенных детерминант, определения протективных эпитопов. Кроме того, сведения об особенностях взаимодействия белков ВГС с иммунной системой организма больного могут быть полезны для решения задач практической медицины -создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

В настоящее время антигенная структура белков ВГС изучена недостаточно. Известно в основном о локализации линейных антигенных детерминант. Вместе с тем показано, что антитела к некоторым белкам ВГС, например, к белку NS3, направлены преимущественно к конформационно-зависимым эпитопам [Chen et al, 1998]. По оценке Schwab и соавт. (1993), доля линейных детерминант на белковых молекулах составляет лишь 2% от общего числа эпитопов.

Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к различным вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики ВГС-инфекции. Однако, в некоторых случаях антитела к вирусу отсутствуют, например, в период «окна», при запаздывании иммунного ответа или при иммуносупрессиях. Высокий уровень генетической вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант. В основе перечисленных недостатков - использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, которые по строению не всегда точно соответствуют натуральным вирусным белкам, а также неполное знание антигенной структуры возбудителя.

Цели и задачи исследовании

Цели данной работы:

- изучение экспрессии белков ВГС в клетках печени больных острым гепатитом С;

- картирование антигенных детерминант белков ВГС методом фагового дисплея и изучение их иммуногенных и антигенных свойств.

Для достижения целей нами были поставлены следующие задачи-

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИЕ C.I 09

БИБЛИОТЕКА I

"■ЭГ^И:

1. С помощью моноклональных антител (МКА) исследовать выявляемость отдельных антигенных детерминант (АД) нативных вирусных белков в клетках биопсий печени больных острым гепатитом С (ОГС).

2. Получить фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты вирусных белков и картировать эти антигенные детерминанты.

3. Оценить иммуногенные свойства антигенных детерминант белков ВГС, экспонированных на фаговых частицах.

4. Разработать метод детекции антител к отдельным детерминантам в сыворотках больных гепатитом С, используя в качестве антигенов полученные фаговые клоны.

5 С помощью данного метода изучить спектр антител у больных гепатитом С на разных стадиях заболевания.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые показано, что отдельные антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в клетках печени больных ОГС с различной частотой. Наиболее часто выявляются четыре антигенных детеминанты на белках NS4 и NS5, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

2. Установлена структурная организация 6 антигенных детерминант, не описанных ранее, в составе белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС

3. Показано, что антигенные детерминанты белков ВГС, экспонированные на поверхности фаговых частиц, индуцируют у мышей развитие вирусспецифического гуморального ответа.

4. Разработан лабораторный метод выявления антител у больных ГС к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах.

5. Показано, что на ранних сроках после манифестации инфекции (до 1 месяца) спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции. Данный критерий может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С.

Основные положения, выносимые на защиту. 1 Установлено, что частота выявления отдельных антигенных детерминант белков ВГС в клетках биопсий печени больных ОГС различается. В целом индивидуальные белки core, NS3, NS4 и NS5 выявляются в клетках печени 100% пациентов с острым гепатитом С.

2. Получены фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты белков ВГС. Определены ключевые аминокислотные остатки 11 антигенных детерминант на белках core, NS3, NS4 и NS5, участвующие в связывании с антителами, установлена конформация 6 детерминант.

3. Показана иммуногенная активность антигенных детерминант белков ВГС в составе фаговых частиц.

4. Разработана схема детекции антител к отдельным антигенным детерминантам белков ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С с использованием фагов, несущих пептиды, имитирующие эти детерминанты (т.н. фаговые мимотопы).

5. Установлено, что у больных ОГС частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам достоверно выше по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении стадий инфицирования

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (2004 г.), Российской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (2005 г.), на Конгрессе «EuroVirology» (Мадрид, Испания, 2004 г.), а также на Конгрессе по гастроэнтерологии (Монреаль, Канада, 2005 г.) В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН 29 сентября 2005 г

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 10 докладов в материалах российских и международных конференций, 1 статья принята в печать.

Структура и объем диссертации.

Материалы изложены на 125 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 155 источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 1S рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты. В исследования были включены больные гепатитом С, поступившие в инфекционную клиническую больницу №1 г. Москвы в период с декабря 2000 г. по январь 2005 г. Группа больных ОГС составляла 33 человека, из них 20 пациентам была проведена пункционная биопсия печени (ПБП). Сыворотки больных ОГС исследовали в динамике в сроки от 10 дней до 2 лет от начала заболевания. Группа больных ХГС составляла 43 человека.

Диагноз ОГС и ХГС ставился на основании общепринятых эпидемиологических и клинико-лабораторных данных, а также исключения других этиологических факторов. При оценке исхода ОГС критериями предполагаемой реконвалесценции считали стойкую нормализацию печеночных проб и отсутствие РНК в сыворотке крови. Хронизацию заболевания констатировали при выявлении РНК и/или повышении активности трансаминаз Клиническая характеристика больных проведена к.м.н., с.н.с. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН Шкурко Т.В.

В качестве отрицательных контролей служили сыворотки крови анти-ВГС негативных доноров (п=36), полученных из Гематологического научного центра РАМН, Москва.

Морфологический анализ ткани печени. Образцы ткани получали методом чрескожной ПБП иглой Менгини в среднем на 33,6 ± 3,8 день от начала заболевания после уменьшения желтухи и снижения уровня АЛТ по крайней мере до 300 мкмоль/мин л Морфологическую характеристику ткани печени

проводили по системе METAVIR, согласно которой гистологическую активность (А) гепатита оценивали по сумме двух компонентов - ступенчатого некроза (PMN) и интралобулярного некроза (LN); A=PMN+LN В качестве отрицательных контролен использовали биопсии печени от 3 пациентов с хроническим гепатитом В (ХГВ) Морфологический анализ срезов печени выполнен к.м.н. Келли Е И (ИКБ №1, г Москва)

Моноклональные антитела. Для выявления белков ВГС в клетках печени и аффинного отбора фагов использовали 21 моноклональное антитело (МКА) к рекомбинантным белкам вируса гепатита С генотипа 1b: core, NS3, NS4A, NS4B и NS5 Получение и свойства МКА описаны ранее [Masalova et al., 2002; Масалова и др , 1996, 2002; Масалова, Кущ, 2003; Абдулмеджидова и др , 2003] и приведены в табл. 1 Титр МКА с рекомбинантными белками в ИФА составляет от 10"5 до 9x10"7

Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание. Криостатные срезы печени фиксировали в ацетоне при -20°С, затем блокировали эндогенную пероксидазу в смеси метанол/Н202 (37,5%)/вода в соотношении 50/1/12 в течении 20 мин После промывки стекол фосфатно-солевым буфером (ФСБ), на срез наносили МКА в концентрации 10 мкг/мл Затем инкубировали срезы с биошнилированными антимышиными антителами и после - со стрептавидином, меченным пероксидазой (Dako LSAB2 System, Дания). В качестве субстрата для проявления пероксидазной реакции использовали диаминобензидин (ДАБ, Sigma, США). Ядра докрашивали гематоксилином Карачи. В качестве отрицательных контролен использовали МКА к белкам ВИЧ-1

Фаговая библиотека. Использовали две фаговые библиотеки случайных эпитопов, сконструированные в лаборатории J.M. Gershoni (Tel Aviv University, Israel) на базе вектора Fthl [Enshell-Seijffers et al., 2001] Нуклеотидные последовательности, кодирующие двенадцатичленные пептиды, фланкированные цистеиновыми остатками в одной библиотеке (рУТП/СХ^С) и семичленные пептиды (pVlII/X-) - в другой, были встроены в ген поверхностного белка фага fd - pVÏÏI

Аффинный отбор. Аффинный отбор проводили по схеме, описанной ранее [Enshell-Seijffers et.al., 2001] с небольшими изменениями. На дно лунки 6-луночной панели (Corning, Costar) сорбировали протеин А из St Aureus (US Biomedical, США) в концентрации 25 мкг/мл в Трис-HCl буфере (ТБС, 50тМ Трис, рН 7,5) После блокирования 0,25% раствором желатины в ТБС с 0,5% Твин-20 (ТБСЖ) вносили МКА к белкам ВГС в концентрации 10 мкг/мл в ТБСЖ и инкубировали в течение ночи при +4°С Иммобилизованные МКА инкубировали со смесью фагов из фаговой библиотеки в конечной концентрации 1011 TU/мл в ТБСЖ 4 часа при комнатной температуре. Несвязавшиеся фаговые частицы отмывали ТБС с 0,5% Твин-20 Связавшиеся фаги элюировали буфером 0,1 M HCl-глициновый буфер, 1 мг/мл БСА (рН 2,2) Элюат нейтрализовали 1M Трис-HCl (рН 9,1) до рН 7,0-7,5 Фаги, связавшиеся с МКА в первом раунде, амплифицировали, заражая ими клетки E.coli. Проводили 3 раунда аффинного отбора

Трансдукция клеток E.coli фагами. Культуру Е coli (штамм DH5a5F ) выращивали в среде LB на качалке (200 об/мин) при 37°С (стандартные условия) до А«о~1,5. Затем клетки инкубировали 30 мин на качалке (60 об/мин) для формирования F-пилей К 1,5 мл суспензии клеток добавляли 500 мкл фагового элтоата и инкубировали 30 мин без перемешивания. После чего добавляли 5 мл среды 2TY и инкубировали 1 час при 37°С на качалке. К зараженным клеткам добавляли 45 мл среды 2TY с тетрациклином (20 мкг/мл), растили в стандартных условиях для выделения фагов, которые использовали в последующих раундах аффинного отбора. После 3-его раунда зараженные клетки высевали на 1,6% LB-arap с тетрациклином (20 мкг/мл) для получения отдельных колоний и проведения иммуноскрининга. Концентрацию фагов определяли подсчетом колоний на агаре после высева Е coli, зараженных 10 мкл препарата фага.

Иммуноскрининг. Отдельные колонии засевали в 200 мкл среды ТВ с тетрациклином (20 мкг/мл) в лунку 96-луночной панели с U-образным дном и выращивали в течение ночи в стандартных условиях Осаждали клетки центрифугированием панелей 1 час х 2500 об/мин Супернатант переносили в плоскодонные панели с 50 мкл/лунку смеси полиэтиленгликоль-NaCl (17% ПЭГ-6000, 3,3M NaCI). Перемешивали пробы и инкубировали 2 часа при +4°С, центрифугировали 1 час х 2500 об/мин. Осадок фагов ресуспендировали в 100 мкл 0ДМ ФСБ pH 7,4.

Фаги сорбировали на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Schleicher & Schuell, Германия) с помощью водоструйного насоса в аппарате DOT-apparatus (BioRad, США) После блокирования (5% сухое молоко на ФСБ-0,1% Твин 20), мембрану инкубировали с МКА в концентрации 1-5 мкг/мл на СМ-ФСБТ. Несвязавшиеся МКА отмывали 4 раза ФСБТ и вносили козьи антитела к IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (Сорбент, Россия). Реакцию проявляли, используя в качестве субстрата диаминобензидином (ДАБ) В случае положительной реакции мембрана в месте сорбции фага окрашивалась в коричневый цвет Для секвенирования ДНК отбирали фаговые клоны, наиболее интенсивно реагирующие с МКА, на которых были отобраны, и не реагирующие с МКА другой специфичности

Выделение одноцепочечной фаговой ДНК и секвенирование. ДНК позитивных фаговых клонов выделяли с помощью набора Quagen (Германия) по протоколу производителя Для секвенирования использовали праймер 5'-ТТТСACGTTGAАААТСТСС-3' и набор реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant Секвенирование проводили на базе Центра «ГЕНОМ» ИМБ РАН.

Анализ результатов секвенирования. По нуклеотидной последовательности расшифровывали аминокислотную последовательность пептидной фаговой вставки, аминокислотные остатки (а о.) представляли в однобуквенном коде Для поиска мотивов, гомологичных фаговому пептиду, использовали сравнительный анализ пептидных вставок и аминокислотных последовательностей белков ВГС при помощи метода, разработанного

Денисовым Д A [Enshell-Seijffers et al, 2003], и алгоритма ClustalW. Кроме аналогичных а о., учитывали и гомологичные а о., которые были сгруппированы по физико-химическим свойствам их радикалов: R=K=H; E=D; S=T; L=V=I=M; A=G, Q=N; W=F=Y [Иванисенко, Ерошкин, 1997, Pereboeva et.al., 2000, Enshell-Seijffers et al, 2003]

Иммунизация мышей. Самок мышей линии С57В1 (16-18 г) иммунизировали трехкратно с интервалом 3 недели фагами, имитирующими АД 3f4 белка NS5A. Иммунизацию проводили в вариантах суспензия фагов без адъюванта (б/а); фаги, обработанные ультразвуком; фаги с адъювантом Фрейнда, фаги с синтетическими гликоиептидами гепоном или глюкозаминил-мурамилдипептидом (ГМДП); фаги с гликопептидом растительного происхождения - Иммуномаксом. Фаги вводили внутрибрюшинно в концентрации 108 TU/мышь, что составляло 200 мкг белка/мышь Контрольные группы иммунизировали фагом без пептидной вставки Fth с теми же адъювантами Каждая группа состояла из 5 мышей.

Кровь у мышей отбирали через 2 недели после каждой иммунизации. Уровень антител в пулах сывороток оценивали в непрямом ИФА, используя в качестве антигенов рекомбинантный белок NS5A и фаг без пептидной вставки Fth.

Реакция иммуно-ДОТа фаговых клонов с сыворотками больных ГС.

Отдельные фаговые клоны сорбировали на нитроцеллюлозную мембрану, как описано выше. После блокирования, инкубировали мембраны с сыворотками больных ГС в разведении от 1:50 до 1.50000 Отмывали несвязавшиеся сывороточные Ig, вносили антитела к IgG человека, меченные пероксидазой (Сорбент, Россия). Реакцию проявляли, как указано выше В качестве ОК использовали сыворотки анти-ВГС негативных доноров и фаг без вставки Fth.

Иммуноферментный анализ. Непрямой ИФА. В лунки 96-луночных панелей Dynatech (Германия), или Nunc (Дания) сорбировали фаговые частицы в концентрациях от 10 до 101 TU/мл или рекомбииантные белки ВГС (1 мкг/мл). Затем вносили сыворотки больных ГС, МКА к белкам ВГС или мышиные сыворотки в серийных разведениях. После отмывки добавляли антивидовые антитела, меченные пероксидазой (Сорбент, Россия) В качестве субстрата использовали оргофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин гидрохлорид (ТМБ, US Biomedical, США). Оптические плотности оценивали при длине волны 492 нм (ОФД) или в двухволновом режиме 450/620 нм (ТМБ).

Сендвич-ИФА №1. В лунки 96-луночных панелей сорбировали кроличьи поликлональные антитела к фагу fd (Sigma). После блокирования вносили фаговые клоны в блок-растворе. Затем добавляли МКА к белкам ВГС в концентрации 5 мкл/мл либо сыворотки больных ГС в разведениях 1.50 - 1.1000 на 5% СМ-ФБРТ или в казеине, либо сыворотки, истощенные на Fth и лизате E.coli. Инкубировали с конъюгатами и проявляли реакцию, как указано выше.

Сендвич-ИФА №2. В лунки 96-луночных панелей сорбировали МКА к белкам ВГС либо сыворотки больных ГС в разведении 1 10 Вносили смеси фаговых клонов с мимотопами АД белков ВГС в растворе казеина. Затем пробы инкубировали с кроличьими поликлональными антителами к бактериофагу fd

(Sigma) в казеине Добавляли козьи антитела к Ig кролика, меченные пероксидазой, и проявляли реакцию с помощью субстрата ТМБ, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение экспрессии отдельных антигенных детерминант белков ВГС в клетках печени больных ОГС

Отдельные АД были выявлены в клетках биоптатов печени больных с различной частотой, которая варьировала от 32% для МКА 6dl до 95% для МКА 3fl2. Количество окрашенных клеток не зависело от МКА' у разных пациентов при окраске одним тем же МКА сильно варьировали как количество окрашенных клеток, так и интенсивность окраски Наибольший процент окрашенных клеток обнаруживали при окраске препаратов гепатоцитов МКА 3fl2 к белку NS4A, МКА ldll и 6Ы1 к белку NS4B, а также МКА 2с9 к белку NS5A. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Эффективность выявления белков ВГС в срезах печени пациентов с ОГС

Рекомбинантные белки МКА Кол-во пациентов с Кол-во пациентов с различным числом окрашенных клеток (по

положит. баллам)

! название послед-ть результ. ИГХ 4 3 2 1

1f9 9/19 (47%) 0 1 0 8

1-90 а.о. 6dl 6/19(32%) 0 1 1 4

U12 9/16 (56%) 0 1 3 5

core 27 7/19(37%) 1 0 2 4

1-150 а.о. 37 14/19 (74%) 2 1 3 8

D4 9/19 (47%) 2 0 1 6

4g5 1/3 (33%) 0 0 1 0

2gl2 12/18 (67%) 2 1 2 7

2h4 14/18 (78%) 0 3 0 11

NS3 1356-1459 6e9 6/9 (67%) 0 2 0 4

а.о. 5u2 12/19 (63%) 1 3 5 3

Sb2 14/19(74%) 2 1 6 5

4h8 10/19 (53%) 2 0 4 4

1677-1756 а.о. 3fl 2 18/19(95%) 5 3 5 5

NS4 ldll 17/19(89%) 5 3 2 7

6Ы1 14/19 (74%) 5 3 2 4

2c9 15/19(79%) 5 2 3 5

2193-2300 а.о. 3f4 9/19(47%) 0 2 1 6

NS5A lcS 14/17(81%) 1 2 6 5

6dl2 8/15 (53%) 0 1 2 5

5a9 8/15 (53%) 0 0 1 7 S

Примечания оценка количества окрашенных МКА клеток в баллах 4 - >50%, 3 - 25-50%, 2 -10-24%, 1 - <10%, «0» - отсутствие окрашенных клеток

Разная частота детекции одних и тех же белков ВГС различными МКА, вероятно, свидетельствует о влиянии экспонированности индивидуальных эпитопов на выявляемость белков Нельзя исключить также, что различная эффективность выявления отдельных АД может быть связана с инфицированием больных разными генотипами ВГС Так, в дальнейшем, при картировании эпитопов нами было показано, что структура некоторых АД различается у вирусов, принадлежащих к разным генотипам

Оценку ИГХ-реакции с индивидуальными белками ВГС в печени проводили, суммируя результаты окраски серийных срезов отдельными МКА к данному белку Белки ВГС были выявлены со следующей частотой- core и NS4A 95%, NS3 - 90%, NS4B и NS5A - 89%; в целом хотя бы один из белков был обнаружен у всех (100%) пациентов Ранее при изучении образцов печени 69 пациентов с ХГС с помотцыо тех же МКА было показано, что белки ВГС определялись у 74% больных, а индивидуальные белки - у 28-65% пациентов [Масалова и др, 2003] Статистический анализ показал, что различия в выявлении белков ВГС в печени пациентов с ОГС и ХГС высоко достоверны Важно отметить, что количество клеток печени, содержащих белки ВГС, при ОГС было больше, чем при ХГС: 51+7% против 33±3% (р=0,006). Полученные данные, возможно, свидетельствуют о более высокой транскрипционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС

При изучении окрашенных клеток в ткани печени было установлено, что антигены ВГС локализуются в цитоплазме гепатоцитов Окрашивание носило диффузный характер, иногда в виде мелких гранул, для белка NS4B часто наблюдалось крупнозернистое окрашивание. У большинства больных ОГС прослеживалось более интенсивное окрашивание клеток у очагов лимфоидной инфильтрации. Следует отметить, что инфицированные гепатоциты выглядели либо морфологически нормальными, либо имели те же морфологические изменения, что и неинфицированные У 3-х больных наблюдалось цитоплазматическое окрашивание мононуклеарных клеток в печени, причем у одного пациента более 50% лимфоцитов в инфильтратах были интенсивно окрашены МКА к белку NS4B. Все МКА были тестированы со срезами печени ВГС-негативных пациентов; результаты ИГХ во всех случаях были отрицательными. MICA к ВИЧ не выявляли окрашенных клеток в печени пациентов с ОГС (рис. 1).

Для выявления связи между детекцией вирусных антигенов в печени и клиническими, биохимическими, морфологическими параметрами ОГС, был проведен корреляционный анализ. По количеству антиген-позитивных (Аг+) клеток пациенты были условно разделены на 2 группы В 1-ую (12 человек) вошли больные с интенсивной ИГХ реакцией, у которых хотя бы один из исследованных белков выявлялся более чем в 50% клеток печени; во 2-ую - 8 больных, в печени которых было выявлено менее 30% окрашенных клеток. Полученные данные свидетельствуют, что суммарная вирусная нагрузка (оцененная по белкам) в печени прямо коррелировала со степенью ступенчатого некроза (PMN, р<0,05). Впервые показано, что индивидуальные белки ВГС

■v i .w'fAiS

• 4 ' ' .

'о «Г .*г

. / а «*

♦» Л'*

Рисунок 1.

Иммуногнстохимическое окрашивание клеток печени больного ОГС а срез, окрашенный МКА с белку NS5A; б. срез, окрашенный МКА, неспецифичным к

белкам ВГС

Часть окрашенных клеток обозначена черными стрелками, лимфоидные инфильтраты обозначены белыми стрелками. Докрасна ядер гематоксилином Ув. 400

вносят разный вклад в патологические изменения печеночной ткани. В наибольшей степени с гистологической активностью (А) было ассоциировано накопление белка NS3 (табл. 2). При этом было установлено, что экспрессия белков ВГС ассоциирована только со степенью ступенчатого, но не интралобулярного некроза. Наибольший вклад в прогрессирование PMN вносили белки NS3, NS5A и core (табл. 2). Эти результаты могут свидетельствовать о прямом цитопатическом действии ВГС.

Таблица 2

Зависимость между выявлением белков ВГС в печени и гистологической активностью

гепатита у больных ОГС

Параметры Белки ВГС в печени |

Core NS3 NS4A NS4B NS5A |

время от начала желтухи доПБП -0,48* р=0,048 0,3 Р=0,3 <0,3 -0,34 р=0,2 <0,3 I

гистологическая активность по METAVIR А 0,35 р=0,1 0,5 р=0,02 <0,3 <0,3 <0,3 1

PMN 0,44 р=0,049 0,52 р=0,02 0,34 р=0,2 <0,3 0,41 1 р=0,045 1

LN <0,3 0,4 Р=0,1 <0,3 <0,3 <0,3 J

Примечания: * коэффициенты корреляции (г) и значения достоверности (р); г<0,3 трактуется как отсутствие корреляции и для этих значений р не указывается; статистически достоверные значения г (р<0,05) выделены жирным шрифтом

Ранее при изучении соге-белка в модельных системах было показано, что при избыточном накоплении он может оказывать прямое цитотоксическое действие [Раую, 2003; ЯеаШоп, 2004]. Получены также данные, указывающие на участие белков N83 и в индукции патологических изменений клеток

[Pavio, 2003]. С другой стороны, выявленная связь между накоплением белков NS3, NS5A и core и некрозом клеток печени, а также топографическая ассоциация Аг+ клеток с лимфоидными инфильтратами позволяет предположить также участие иммуноопосредованного механизма повреждения гепатоцитов.

Обнаружено, что соге-белок чаще выявляется в печени пациентов, которым проводили ПБП в более ранние сроки от начала заболевания (табл. 2). Уменьшение накопления этого белка может отражать снижение репликативной активности ВГС с течением времени и служить маркером ранней стадии ОГС. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что у пациентов с ХГС накопление соге-белка, изученного с помощью тех же МКА, коррелировало с обнаружением минус-цепей РНК ВГС в печени, характеризующих репликацию вирусного генома [Масалова и др., 2003].

Факторы, определяющие исход ОГС, до сих пор не выявлены. В нашем исследовании 3 пациента из 15, у которых можно было проследить исход заболевания, по-видимому, элиминировали ВГС. Сравнение групп пациентов с вероятной ремиссией и с хронизацией гепатита позволило установить достоверно большее накопление белков NS4A (р=0,045) и NS3 (р<0,001) ВГС в печени пациентов первой группы. Можно предположить, что для долговременного контроля за репликацией ВГС необходим высокий уровень экспрессии данных вирусных белков на ранних стадиях инфицирования, что способствует их более эффективной презентации иммунокомпетентным клеткам, активации Т-лимфоцитов по Th-1 типу и активной продукции гамма-интерферона и других провоспалительных цитокинов.

Таким образом, проведенные исследования с использованием МКА, направленных к пяти белкам ВГС, продемонстрировали более интенсивное накопление белков ВГС в печени при ОГС по сравнению с ХГС и выявили значительные различия между пациентами по количеству и распределению индивидуальных вирусных белков. Сопоставление результатов иммуногистохимического выявления белков в печени in situ с биохимическими, клиническими и морфологическими данными впервые позволило получить прямые данные о роли белков ВГС в патогенезе ОГС и исходе заболевания. Белки NS4A и NS3, связанные с клиренсом ОГС, могут быть перспективным компонентом вакцин против гепатита С.

Картирование антигенных детерминант.

Вторая часть работы посвящена картированию АД белков ВГС, специфически взаимодействующих с МКА, которые использовались нами для изучения экспрессии вирусных белков в клетках печени больных ОГС.

Картирование проводили методом фагового дисплея, в качестве антител-мишеней для аффинного отбора использовали 11 МКА к белкам core (5 МКА), NS3 (1 МКА), NS4 (2 МКА) и NS5A (3 МКА). Результаты выравнивания аминокислотных последовательностей пептидных вставок на отобранных

фаговых клонах с первичными последовательностями белков ВГС приведены на рис. 2 - 4,6.

При картировании соге-белка показано, что эпитоп МКА 1 f9 состоит из а о , образующих мотив YPWPL, располагается между 81-85 а о. (рис 2) Ранее было установлено, что МКА 1 f9 взаимодействует с синтетическими пептидами в области 76-90 а.о. соге-белка [Масалова и др , 2002].

В литературе также есть указания на существование АД на центральном участке соге-белка ВГС. Так, Jolivet-Reynaud с соавт. (1998), проводившие исследования взаимодействия 10 анти-core позитивных сывороток больных гепатитом С с 8-членными пептидами, перекрывающими последовательность core 1 -86, обнаружили, что все сыворотки связывались с пептидами из области 73-86 а о Ching с соавт (1992), используя набор синтетических 10-мерных перекрывающихся пептидов, определили участок 73-89 а о белка core, который распознавался сыворотками больных гепатитом С.

Т о , полученные с помощью фагового дисплея результаты подтвердили эти данные и позволили более точно локализовать В-клеточный эпитоп в центральной части соге-белка

Эпитоп, опознаваемый МКА 27, по-видимому, является конформационно-зависимым, т к прямой гомологии между мотивами пептидов позитивных фаговых клонов, отобранных из библиотек pVIII/CXnC и PVIII/X7, и последовательностью соге-белка не обнаружено Эти данные подтверждают результаты пептидного картирования, проведенного ранее в лаборатории клеточной инженерии, МКА 27 не взаимодействовали с 12-мерными пептидами, перекрывающими последовательность белка core [Масалова и др., 1996]. В связи с тем, что третичная структура core ВГС в настоящее время не установлена, определить точную локализацию всего эпитопа не представляется возможным Однако, используя алгоритм ClustalW и принцип функциональной взаимозаменяемости аминокислотных остатков, можно предположить локализацию мотива RWWL(V,I)SGD на участке 74-99 а о Ключевые а.о. могут находиться в следующих положениях: R74, W83, W96, L(V,I)97, L(V,I)98, S99 (рис. 2) Эти а о , а также G и D, встречаются в последовательности большинства фаговых пептидов (мимотопов) Скорее всего, указанные а о сближены друг с другом в пространстве в составе третичной структуры core

Анализ фаговых мимотопов показывает, что эпитоп D4 располагается в пределах 56-88 а о и является конформационно-зависимым (рис. 2) Это заключение объясняет результаты пептидного картирования, полученные в нашей лаборатории ранее МКА D4, полученные к рекомбинантному белку core 1-150 ао, не взаимодействовали с короткими пептидами, перекрывающими последовательность белка core, а также с рекомбинантным белком с последовательностью 1-80 а о core [Масалова и др, 1996], в связи с чем локализация эпитопа предполагалась на С-концевой части молекулы Согласно

----1 4С ----|----| 5С ----1----| 60 ----I----| ----| . 70 . .. I ----|----| ---- 80 90 1----I ----I----I 100 110

core lb VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG RRQPIPKVRR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT

Детер\шнанта 1©

(1 клон) YIWPTYGTER CPS

(2 клона) YPAPWGSDTT PQVY

(3 клона) YGWPTETSNR PD

(2 клона) YAWPEENDVT QV

(2 клона) RDTQ YPWPGQWE

(2 клона) YPFPIP

Детерминанта 27

(1 клон) R . -W............ . WVMSG WEASV

{1 клон) R. . . .w............ WWSD

(1 клон) R. . . .w............ WLVGP

(1 клон) NTS DQQR . .w............ ■ WIDS

(1 клон) PR. . . .w............ WVDP

(1 клон) PR. . . .w............ WVDN

(2 клона) GR. . . .w............ . WXDG

(1 клон) R. . . .w............ WVDGD

(1 клон) R . .w............ . WLQGD

(1 клон) R. . . .w............ . WIGDG

(1 клон) SAGR.. . .w............ WT

(1 клон) K. . ■ WTEGG

(4 клона) DDT LMIK.. . . WRNPT

(1 клон) DDS NALK ..LATKS

(1 клон) AAETGQKSKEAE

(1 клон) GTNLNPTFLSEP

Детерминанта 04

(8 клонов) SQPR. . .......... P.SR.. ...PMYPN

(4 клона) AESVS. .......... P.GR.. . . . LMKY

Детерминанта 1а12

(1 клон) LLPTV RGAPPDA

(8 клонов) TQV RGDP D

Рисунок 2

Строение антигенных детерминант белка core ВГС

Жирным шрифтом выделены а о , участвующие в связывании моноклонального антитела

нашим данным, фрагмент core 1-80 а.о. содержит лишь часть эпитопа D4, а отсутствие взаимодействия МКА с этим фрагментом, по-видимому, обусловлено тем, что мотив 84-88 а.о. критичен для связывания

Полученных нами результатов по картированию АД lai2 недостаточно для локализации всего эпитопа Однако, можно предположить, что часть его находится в пределах 36-38 а.о. соге-белка. Согласно полученным нами ранее результатам, МКА lai2 не взаимодействовали с пептидами, перекрывающими последовательность белка core, но реагировали с рекомбинантным белком 1-80 а.о. [Масалова, Кущ, 2003].

Данные об антигенной активности области (36)LLP(38) совпадают с результатами других исследователей: был описан иммунодоминантный эпитоп VYLLPR [Cerino et.al., 1993; Siemoneit et.al., 1994] и сообщалось о том, что с пептидом VYLLPRRG взаимодействовали 100% исследованных сывороток больных гепатитом С [Jolivet-Reynaud et.al., 1998]. Кроме того, в исследованиях, посвященных изучению кристаллической структуры гидрофобного домена белка core ВГС с использованием МКА 19D9D6, было установлено, что в состав этого эпитопа входят аминокислоты (36)LLP(38). Авторы считают, что эпитоп, опознаваемый МКА 19D9D6, не является линейным, а имеет конформационно-зависимую природу [Menez et al., 2003]. Из всего вышесказанного был сделан вывод о конформационной зависимости эпитопа МКА lai2.

В результате аффинной селекции на МКА 4g5 были отобраны фаговые клоны, несущие фаговые вставки: 1) CNREHQSPSRLHDC, 2) CSNNQSPSRMSEIC, 3) CRMEGCAAGAxPC, 4) CKQKKESEHENARC, 5) CGGGKQAKEVGEEC. Указанные мотивы не имеют прямой гомологии с первичной последовательностью белка core ВГС и использованные нами методы анализа не позволили выделить общий мотив, поэтому локализовать этот эпитоп на белке core в данный момент не представляется возможным.

Эпитоп на белке NS3, опознаваемый МКА 2h4, является конформационно-зависимым. Его мотив (1363)NI(V)EE(D)(1366), вероятно, является линейной частью эпитопа 2h4 (рис. За). Основываясь на данных по трехмерной модели хеликазного домена белка NS3 (Protein Data Bank, код 1A1V), можно предположить, что а.о., участвующие в образовании второго мотива, располагаются в составе полипротеина ВГС в следующих позициях: К1378 или 1386, Е1372, R1389, D1447 или 1449. Мотив NIEE и а.о. мотива KERE сближены друг с другом в пространстве в составе третичной структуры хеликазного домена NS3 (рис. 36, нумерация аминокислотных остатков приведена согласно PDB 1A1V).

Антитела к хеликазному домену NS3 при развитии иммунного ответа появляются в сыворотках одними из первых и являются важным прогностическим признаком при течении ВГС-инфекции [Mondelli et al., 1994]. Однако картирование белка NS3 осложняется конформационно-зависимым характером большинства эпитопов [Chen et.al., 1998]. Их не удается картировать с помощью синтетических пептидов [Khudyakov et al, 1995], и даже метод фагового дисплея не всегда эффективен для их локализации [Pereboeva et al., 1998]. Авторы, впервые описавшие конформационный B-клеточный эпитоп на

NS3 с помощью человеческих МКА СМЗ.В6, локализовали его на участке 13631454 а о. [Mondelli et.al, 1994], что совпадает с данными, полученными в нашем исследовании Похожий эпитоп был описан в работе по картированию АД методом фагового дисплея с библиотекой 12-мерных пептидов, экспонированных в составе белка pill фага М13. В состав картированного в данном случае эпитопа входят 9 а.о. из участка 1376-1398 [Jolivet-Reynaud et.al., 2004].

При картировании с помощью фагов эпитопа МКА ldll его удалось локализовать на участке (1713)SHLxY(1717) (рис. 4).

Ранее при картировании эпитопа МКА ldll с помощью коротких пептидов было обнаружено, что МКА опознает линейный эпитоп на участке 1711-1732 [Masalova et al, 2002]. Похожий антигенный эпитоп был описан в литературе При картировании антигенно-активной области в центральной части белка NS4 с помощью пептидов авторы обнаружили, что один из главных антигенных эпитопов располагается между 1710-1728 а о [Simmonds, et al., 1999, Chang eta!., 1999]. Методом фагового дисплея удалось подтвердить линейный характер эпитопа, и сузить участок его локализации и определить конкретные а.о., формирующие эпитоп.

Эпитоп 6Ы1 локализован на участке 1748-1754 а о. белка NS4B. Он представлен мотивом (1748)PVxxxKW(1754) (рис. 4). Вероятно, конформация эпитопа, опознаваемого МКА 6Ы1, зависит от вторичной структуры белка При помощи метода предсказания вторичной структуры белка Garnier-Robson было показано, что этот участок белка NS4B образует альфа-спираль и аминокислоты PV и KW сближены друг с другом в составе ее витков (рис 5а).

Ранее в опытах по денатурации рекомбинантного белка NS5A было показано, что МКА 2с9 чувствительны к конформации белка [Масалова, Кущ, 2003]. Однако, при картировании методом фагового дисплея обнаружено, что мотив детерминанты непрерывный (рис. 6). Согласно методу предсказания вторичной структуры белков Garnier-Robson показано, что участок белка NS5A 2260-2276, на котором локализуется данный эпитоп, образует вторичную структуру типа альфа-спирали (рис. 56). Это указывает на зависимость эпитопа от вторичной структуры белка.

Эпитоп 3f4 по результатам картирования методом фагового дисплея имеет линейный характер и опознает аминокислотный мотив (2223)DADL(V)xE(D)ANL(2231) (рис. 6). Подтверждением служит то, что МКА 3f4 эффективно связывались с денатурированным NS5A [Масалова, Кущ, 2003] В отличие от 3f4, МКА 1 с5 были чувствительны к денатурации антигена, хотя и опознают сходный мотив на белке NS5A. Как видно на рис. 6, детерминанта 1с5 состоит из линейного мотива (2223)DxDLxEAN(2230) и из мотива DT(S)L, локализация которого неизвестна в связи с отсутствием модели третичной структуры белка NS5A. Следует отметить, что МКА 3f4 и 1с5 не взаимодействовали перекрестно с мимотопами друг друга. Т.о. можно сделать вывод о том, что детерминанты, опознаваемые данными МКА, имеют различное строение, частично перекрываясь.

. I .

1360

. I .. I

1 330

N53 lb TVPHP NIEEVALSNV GEIPFYGKAT Детерминанта 2h4

il клон) NIADVGWAKE RE

(1 клон) ADFG N.EENPM.KR

(1 клон) EETQLTKA SAHR

1 клон) AVGDMAGOKD RD

1 клон) WRPGTVKE RDLV

1 клон) WIKE REbAQE

1 клон) DAFGE RSGENLL

А Б

Рисунок 3.

Строение антигенной детерминанты 2Ь4 хеликазного домена бежа N83 А. выравнивание аминокислотных последовательностей участка белка N83 и фаговых пептидных вставок Здесь и на рис 4 жирным шрифтом выделены а о , участвующие в связывании антитела Б. локализация антигенной детерминанты на модели третичной струткуры хеликазного домена белка N83 1 - положение а о в составе хеликазного домена, 2 - положение а о в составе полипротеина

Нумерация а о на рисунке приведена согласно РОВ 1А1У Здесь и на рис 5 красным цветом обозначены кислые а о (Л и Е), синим - основные а о (К и К), зеленым - алифатические а.о (V, Ь, I, М), голубым - амиды аминокислот (Ы и 0), желтым - а о , содержащие гидроксильную группу (в и Т), бежевым - аминокислота, содержащая имино-группу (Р),

малиновым - ароматический а о. (V/) ----I----I ----I----I ... I----I ----I----I ----I----I ----I..

1710 1720 1730 1740 1750

NS4 lb VLYQEFDF.MF EASHLPYIEQ GMQLAEQFKQ KALGLLQTAT KQAEAAAPW ESKWRAL

Детерминакга 1<111

{1 клон) RDEE TTSHLHYT

{1 КЛОН) YKP EQSHLAYESS

(1 КЛОН) SHLVYTTS ESGQ

(1 КЛОН) Т SSTHLMYGHE G

(1 КЛОН) MGHLNYMSD RGQ

(1 КЛОН) KTSHFQYPGA GE

(1 клон) RRGV HGSQLGYE

(1 клон) TEKIPWPQE RTT

(1 клон) SD KETAMV1AC

Дстсрмина1гга 6Ь11

(2 клона) STTGPVS WVKWS

(1 клон) AGYQPSV EKKWN

(5 клонов) RTTMFVM НАКИМ

(33 клона) PAV LEKYGT

Рисунок 4

Выравнивание аминокислотных последовательностей участка белка N84 и фаговых пептидных вставок, имитирующих детерминанты 1(111 и 6Ь11

Рисунок 5

Вторичная структура антигенных детерминант белков К84А и Ш5А ВГС А Вторичная структура участка белка N84, на котором локализуется детерминанта 6Ь11 Б Вторичная структура участка белка N85 А на котором локализуется детерминанта 2с9

— I — I — I — I — I — I — I — I — I — I — I ... I — I — I — I 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270

NS5A lb LSAPS LKATCTTRHD SPDADLIEAN LLWRQEMGGN ITRVESENKV VILDSFFPLR AEEDEREVSV PAEILRRSRK Детерминанта 3f4 (8 клонов) {2 клона) f1 клон ) (1 клон) (1 клон) [1 клон) (1 клон) (1 КЛОН) (1 КЛОН) (1 КЛОН)

Детерминанта 1с5

(1 КЛОН)

{5 клонов) (8 клонов) (1 клон) Детермината 2с9 (1 клон) (1 клон) (1 клон) (1 клон) ti клон) (1 клон) (1 клон) Í1 клон) (1 клон}

Рисунок 6

Выравнивание аминокислотных последовательностей фаговых мимотопов 3f4, 1с5 и 2с9 и участка белка NS5A Жирным шрифтом выделены а о , участвующие в связывании

антитела

Антигенная структура белка NS5A изучалась ранее с помощью пептидов [Khudyakov et.al., 1995], коротких рекомбинантных белков [Dou et.al., 2002], методом фагового дисплея пептидов случайного состава и фрагментов белков ВГС [Pereboeva et.al., 1998; Pereboeva et.al., 2000]. Было показано, что высокой антигенной активностью обладает участок 2212-2313 а.о. белка NS5A. Анализ профиля гидрофильности белка NS5A при помощи алгоритма Hope and Woods, позволил установить, что потенциально иммуногенные детерминанты могут располагаться внутри этого участка, в частности, в положениях 2260-2265 и 2268-2273 а.о. [Rosa et.al., 1995]. Это совпадает с локализацией детерминанты 2с9 (а.о. 2261-2270), определенной в нашей работе.

Интересно отметить, что все три эпитопа, картированные на белке NS5 методом фагового дисплея, располагаются в его функционально значимом домене - в пределах сайта устойчивости к интерферону (2219-2419 а.о.) [Enomoto et.al., 1995].

Все АД, изученные в нашей работе, картированы для субтипа lb, т.к. МКА были получены при иммунизации мышей рекомбинантными белками, соответствующими по аминокислотной последовательности данному генотипу. Анализ изученных АД показал, что большинство из них консервативны либо гомологичны для ряда других субтипов: 1а, 2а, 2Ь, За.

Исключением являются детерминанты на белке NS4, связывающие МКА ldll и 6Ы1. Участок, содержащий АД ldll, высоковариабелен при сравнении

GADTDLNDAN WG

DLDLHAAN LSPL YTDLDLRMAN AW GLESDLMAAN ун SSYRELREAH QL AETREAN LRHSG ADVRDAN LMVNG KAIPELAEAN RQ SAIPSLREAN Kl VTAPH RT

ADLDANIAN DTL VDQAVRKAH DSP GPFSIIAJUt DTL MADLVSAM RKGS

EDRESVL AINP DLEGRESTQ G L GDPBQREHVS H VAOQGREAVL SL AMDRE G YAARGRRLVS M

KDLPT EVYKTTK AEPQDLFG GPGE RPG GTVMDLEPV

разных генотипов Детерминанта 1 dl 1 присутствует только у вирусов, относящихся к генотипу 1 (субтипы la, lb). Действительно, ранее в литературе было показано, что взаимодействие сывороток больных гепатитом С с пептидом из области 1710 - 1728 а.о. зависело от генотипа ВГС, которым они инфицированы [Bhattacherjee etal., 1995] В детерминанте 6Ы1 консервативными для всех рассмотренных нами генотипов являются только а о Р и W, а о. К и V варьируют, причем замены в большинстве случаев не гомологичны.

Таким образом, при помощи технологии фагового дисплея было локализовано 11 АД на белках core, NS3, NS4B и NS5A. Наиболее точно картировано 6 эпитопов, 3 из которых являются линейными (МКА Ш, ldl 1 и 3f4 на белках core, NS4B, NS5A, соответственно), 2 эпитопа зависели от вторичной структуры белка (МКА 6bl 1 белка NS4B и 2с9 белка NS5A) и 1 - от третичной структуры белка NS3 (МКА 2h4) Для 5 остальных исследованных эпитопов также определены ключевые а о , участвующие в связывании МКА, и выдвинуты предположения о локализации этих а о в первичной последовательности белков ВГС Их локализацию можно будет уточнить после расшифровки третичной структуры белков ВГС.

Изучение иммуногенных свойств отдельных детерминант

Представляло интерес выяснить, обладают ли АД в составе фаговых частиц иммуногенными свойствами. Для этого мышей иммунизировали фагами со вставкой, имитирующей АД 3f4 (CSAIPSLREANKIC) белка NS5A в смеси с различными адъювантами. Данный фаговый клон, имитирующий линейную АД, был выбран, поскольку локализовался в сайте устойчивости к интерферону белка NS5A.

Во всех группах мышей был выявлен сильный антифаговый гуморальный ответ. Уже после первой иммунизации, независимо от присутствия вставки, титр антител к фагам достигал 10", а в группах с ПАФ и ГМДП - КГ1. После 3-ей иммунизации активность антифаговых антител сравнялась во всех группах, титр вырос до 10"6.

Активность специфических антител, индуцированных пептидной вставкой фагового клона, оценивали в непрямом ИФА против рекомбинантного белка NS5A. Специфические антитела обнаруживали во всех группах, иммунизированных фагом со вставкой из области NS5A При этом после 1-й и 2-й иммунизаций титр aHra-NS5A антител не зависел от присутствия адъюванта. После 3-й иммунизации наибольшей активностью обладали антитела в группах, иммунизированных фагом с ПАФ и Иммуномаксом (рис. 7). Титр антител в этих группах достигал 2x10"4. Специфические антитела в сыворотках мышей, иммунизированных фагами без вставки, отсутствовали

Т.о. на примере эпитопа белка NS5A показано, что фаговые частицы с пептидами, имитирующими АД фаговых белков, индуцируют выработку антител против белков ВГС и могут использоваться как инструмент для создания вакцин против гепатита С.

100000

без адъюв ПАФ ГепонИммуномаксГМДП группы

□ 1 иммунизация ■ 2 иммунизация И 3 иммунизация

Рисунок 7

Гуморальный ответ мышей на иммунизацию фаговым клоном с мимотопом детерминанты 3£4 Изучение антигенных свойств отдельных детерминант

Следующим этапом работы было изучение возможности использования фаговых мимотопов для выявления специфических антител к отдельным АД в сыворотках больных ГС.

Отработка схемы реакции. В ходе разработки метода детекции антител к индивидуальным АД у больных ГС оптимизацию условий реакции проводили вначале на примере взаимодействия фаговых мимотопов с МКА. Фаги, взаимодействующие с МКА наиболее активно, отбирались для оценки антигенной активности по отношению к сывороточным антителам пациентов с ГС.

В ходе работы было апробировано несколько схем постановки реакции: иммуноДОТ, непрямой ИФА, сендвич ИФА (№1) с сорбцией кроличьих антифаговых антител на пластик. Однако во всех случаях мы столкнулись с проблемой неспецифического взаимодействия сывороток анти-ВГС негативных доноров с фаговыми клонами. Кроме того, все человеческие сыворотки взаимодействовали с вектором РЧЬ, не несущим мимотопов.

Неспецифические взаимодействия удалось минимизировать в сендвич-ИФА (№2) с сорбцией сывороток пациентов на пластик. Эта схема реакции была принята для выявления антител к отдельным АД белков ВГС при помощи Г

фаговых мимотопов.

Изучение спектра антител к отдельным АД белков ВГС в сыворотках '

больных ГС. Оценка различий в частоте выявляемое™ отдельных АД в сыворотках крови проводилась в группах больных с ОГС в срок до 1 месяца после начала заболевания (п=23) и больных ХГС (п=53).

Из представленных данных (рис. 8) видно, что все 11 исследованных фаговых мимотопов проявляли антигенную активность, но частота выявления антител различалась. Из всего ряда изученных детерминант, достоверно чаще у

пациентов с ОГС выявлялись антитела к АД 1а12 (core), 2h4 (NS3), 1 <311 и 6Ы1 (NS4) и к АД 2с9 (NS5A).

1а12 27 1f9 4gS D4 2h4 1d11

детерминанта

□ ОГС, срок до 1 мес ИХГС, срок >7 мес

Рисунок 8

Частота выявление антител к отдельным антигенным детерминантам у больных ОГС и ХГС

Представляло интерес проследить изменение спектра антител в динамике у пациентов с ОГС. Сравнивали частоту выявления антител у пациентов с последующей реконвалесценцией и больных, у которых инфекция перешла в хроническую форму. При анализе связи между частотой выявления антител к различным детерминантам и исходом заболевания в реконвалесценцию или хронизацию достоверных связей не обнаружено (табл. 3). Однако, между пациентами с различными исходами была обнаружена достоверная разница в широте спектра антител к разным детерминантам на ранних сроках заболевания (до 1 мес). Так, в среднем у реконвалесцентов антитела выявлялись к 6 АД из 11, а у хронизировавшихся - к 2 из 11 (р=0,023 по критерию Стьюдента).

Проанализирована связь между выявлением антител к АД и морфологической характеристикой ткани печени: индексом суммарной гистологической активности (А) и ее составляющими - интралобулярным (LN) и ступенчатым некрозом (PMN), а также индексом фиброза (F) Достоверной связи между этими показателями не выявлено (результаты не представлены).

Интересно было выяснить, существует ли связь между наличием антител к АД и выявляемостью этой детерминанты с помощью МКА в печени пациентов. Данная связь оценивалась с помощью корелляционного анализа Оказалось, что экспрессия большинства АД белков ВГС в клетках печени вызывает индукцию антител к этим эпитопам (табл. 3). В случае 4 АД (на белках core и NS5A) обнаружена достоверная корреляция средней и высокой степени между этими маркерами. В случае детерминанты 3f4 была установлена обратная корелляция между выявлением данной АД в печени больных ОГС при помощи МКА 3f4 и наличием антител к этой детерминанте в сыворотках (г=-1, р<0,001): у 100% пациентов, у которых АД 3f4 обнаруживалась в гепатоцитах, антител к данной

детерминанте в сыворотках не было. Несмотря на малое количество больных (п=6), у которых сравнивали наличие этих показателей, обнаруженный феномен может свидетельствовать о слабой иммуногенной активности эпитопа 3f4 in vivo. Это подтверждается также низкой частотой выявления (всего 4%) антител к этой детерминанте у широкой выборки больных ОГС и ХГС (рис. 8).

Таблица 3

Частота выявления антител к отдельным АД белков ВГС у пациентов с ОГС связь с

исходом заболевания и выявлением этих АД в печени

АД Пациенты с ОГС с различным исходам заболевания Р Корреляция между выявлением АД в печени и наличием антител к АД

Реконвалесценция N=5 Хроиизация N=10

% выявления антител* i»** Р кол-во пациентов***

1а12 80 30 0,200 0,500 0,114 11

27 0 10 0,714 0.625 0.040 11

1» 20 10 0,494 0.413 0.177 12

20 0 0,179 Н/и Н/и Н/и

I D4 20 10 0,494 0.633 0.028 12

2h4 100 40 0,094 0213 0 499 12

1 di 1 80 40 0,360 0 371 0 227 12

6Ы1 80 30 0,200 0 287 0 354 12

2с9 100 40 0,094 0.717 0.010 12

3f4 0 10 0,214 -1.000 <0.01 6

| IcS 0 0 - 0.864 0.002 10

Примечания * - в срок до 1 месяца от начала заболевания; **г - коэффициент ранговой корелляции Спирмена, жирным шрифтом выделены достоверные результаты (р<0,05), *** -количество пациентов, у которых проводили забор крови во время взятия ПБП

Выводы.

1. Показано, что антигенные детерминанты на пяти белках ВГС выявляются в клетках печени больных острым гепатитом С in situ с помощью моноклональных антител с различной эффективностью: от 32% до 95%.

2. Суммарно белки ВГС с помощью моноклональных антител в клетках биоптатов печени выявлены у 100% пациентов с острым гепатитом С, что достоверно выше, чем у больных с хроническим гепатитом С

3. Установлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в печени и некрозом ткани печени. Показано, что предполагаемая реконвалесценция ассоциирована с увеличением количества клеток печени, содержащих белки NS4A и NS3, в ранние сроки после манифестации острого гепатита С.

4 При помощи технологии фагового дисплея получены фаговые клоны с пептидными вставками, имитирующими 11 антигенных детерминант белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС При картировании установлено, что 3 антигенные детерминанты являются линейными, остальные содержат элементы вторичной и третичной структуры белков.

5 Показано, что аминокислотные последовательности, представляющие антигенные детерминанты белков ВГС в составе фагов (мимотопы),е способны индуцировать у мышей выработку антител, специфичных к вирусным белкам

6 Разработан метод выявления антител к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах, в сыворотках больных гепатитом С. Установлено, что частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам различается и достоверно выше у больных ОГС по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении ОГС и ХГС.

7 Показано, что спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам в срок до месяца после манифестации инфекции достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции, что может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С

Список опубликованных работ по теме диссертации

1) Масалова О В , Шкурко Т В , Речкина Е А , Келли Е И, Завалишина JIЭ, Петров А Н, Кузина О В , Русанова С А , Атанадзе С Н , Брагинский Д М, Малышев Н А , Франк Г А , Блохина Н П, Кущ А А Выявление индивидуальных антигенов вируса гепатита С (ВГС) в печени пациентов с острым гепатитом С // Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов, С -Петербург, 29-31 октября 2003 г, с 242

2) Фомина С Н, Масалова О В , Уланова Т И, Гурьянова С В , Речкина Е А , Вишневская Т В , Шкурко Т В , Андронова Т М , Бурков А Н, Новиков В В Экспериментальный анализ антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса гепатита С // Материалы XI Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 19-23 апреля 2004 г, с 484

3) Речкина Е А , Масалова О В , Шкурко Т В , Фомина С Н, Вишневская Т В , Завалишина Л Э , Франк Г А, Блохина Н П Дифференциальный анализ экспрессии белков вируса гепатита С в клетках печени больных острым гепатитом С // Материалы XI Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 19-23 апреля 2004 г, с 471-472

4) Шкурко Т В , Масалова О В , Речкина Е А , Келли Е И , Кузина О В , Брагинский Д М, Вишневская Т В , Фомина С Н, Малышев Н А , Блохина Н П, Кущ А А Клинико-морфологическая картина острого и хронического гепатита С и экспрессия антигенов HCV в клетках печени // Материалы IX Российской конференции "Гепатология сегодня", Москва, 2224 марта 2004 г, Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии, 2004, Т XIV, №1, с 30

5) Вишневская Т В , Масалова О В , Шкурко Т В , Птицына Ю С , Кравченко Г А , Речкина Е А , Келли Е И , Блохина Н П, Новиков В В , Кущ А А Уровень растворимого рецептора Fas-антигена у больных гепатитом С // Материалы IX Российской конференции "Гепатология сегодня", Москва, 22-24 марта 2004 г, Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии, 2004, Т XIV, №1, с 55

6) Rechkina Е, Denisova G , Masalova О , Lideman L, Kushch A The mapping of antigenic sites of nonstructural hepatitis С virus proteins by phage display // Abstracts of II Congress European Virology, Madrid, Spain, 5-9 September 2004, p 112

7) Шкурко T В , Масалова О В , Речкина Е А, Келли Е И, Брагинский Д М , Малышев Н А , Блохина Н П , Кущ А А Роль структурных и неструктурных белков ВГС в развитии вирусного гепатита Связь их детекции в печени с клинико-морфологической характеристикой // Материалы второй научно-практической конференции "Инфекционные болезни и антимикробные средства", Москва, 6-7 октября 2004 г, с 39

8) ТВ Вишневская, О В Масалова, Т В Шкурко, И В Евсегнеева, Ю С Птицына, Г А Кравченко, Е А Речкина, Е И Келли, H П Блохина, В В Новиков, А А Кущ Изменение уровня растворимых дифференцировочных антигенов клеток иммунной системы у больных острым и хроническим гепатитом С // Материалы VI Российской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва, 24-26 мая 2005 г., с 52-53

9) Е А Речкина, О В Масалова, Р И Атауллаханов, А А Кущ Изучение иммуногенности фаговых мимотопов, имитирующих антигенные детерминанты белка NS5A вируса гепатита С // Материалы VI Российской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты -проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва, 24-26 мая 2005 г, с 278-280

10) Rechkina ЕА, Denisova GF, Masalova OV, Lideman LF, Lesnova EI, Kushch A A Hepatitis С virus NS5 and Core phage mimotopes bind with hepatitis С patient's sera antibodies and induce specific immune response in mice // Abstracts of World Congress of Gastroenterology, Montreal, Canada, 10-14 September 2005

11) Вишневская ТВ, Масалова OB, Шкурко ТВ, Евсегнеева ИВ Птицына ЮС., Кравченко Г А, Речкина Е А, Келли Е И, Блохина H П, Новиков В В , Кущ А А Растворимые формы дифференцировочных антигенов в сыворотке крови больных гепатитом С //Медицинская иммунология, 2005, С-Петербург, Т 7, №1, с. 33-40

12) Масалова О В , Речкина Е А , Шкурко Т В , Келли Е И, Блохина H П , Вишневская Т В , Завалишина Л Э , Петров А H, Франк Г А , Малышев H А, Львов Д К, Кущ А А Белки вируса гепатита С в клетках печени при остром гепатите С связь с повреждением печени и исходом заболевания//Вопросы вирусологии, 2005, Т 50, №4, с 18-23

13) Речкина Е А , Денисова Г Ф , Масалова О В , Лидеман Л Ф , Денисов Д А , Леснова Е И, Атауллаханов Р И, Гурьянова С В , Кущ А А Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея // Молекулярная биология, в печати

Для заметок

Заказ № 2040 Тираж 85 экз. Усл. пл. 0,92

ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 " )) www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

РЕ093»

РНБ Русский фонд

2006-4 18872

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Речкина, Елена Александровна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

1 Обзор литературы.

1.1 Молекулярная организация вируса гепатита С.

1.2 Строение и функции вирусных белков.

1.3 Особенности ВГС-инфекции.

1.4 Антигенная структура белков ВГС и методы картирования.

2 Материалы и методы.

2.1 Иммуногистохимическая детекция белков.

2.1.1 Пациенты.

2.1.2 Исход ОГС.

2.1.3 Морфологический анализ.

2.1.4 Выделение МКА из асцитных жидкостей.

2.1.5 Моноклональные антитела.

2.1.6 Определение концентрации белка.

2.1.7 Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание.

2.2 Картирование антигенных детерминант белков ВГС.

2.2.1 Фаговая библиотека.

2.2.2 Аффинный отбор.

2.2.3 Трансдукция клеток E.coli фагами.

2.2.4 Иммуноскрининг.

2.2.5 Выделение одноцепочечной фаговой ДНК и секвенирование.

2.2.6 Анализ результатов секвенирования.

2.3 Изучение иммуногенности отдельных детерминант.

2.3.1 Иммунизация мышей.

2.3.2 Определение активности антител в сыворотках мышей.

2.3.3 Реакция бласттрансформации спленоцитов.

2.4 Изучение антигенных свойсв отдельных антигенных детерминант.

2.4.1 Реакция иммуно-ДОТа с сыворотками больных ГС.

2.4.2 Приготовление лизата E.coli.

2.4.3 Истощение сывороток больных.

2.4.4 Иммуноферментный анализ. Непрямой ИФА.

2.4.5 Сендвич-ИФА №1.

2.4.6 Сендвич-ИФА №2.

2.4.7 Статистическая обработка результатов.

3 Результаты.

3.1 Выявление натуральных антигенных детерминант в печени больных ОГС

3.2 Картирование антигенных детерминант.

3.3 Изучение иммуногенных свойств отдельных детерминант.

3.4 Изучение антигенных свойств отдельных детерминант.

4 Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности"

Актуальность проблемы

Значительный рост показателей заболеваемости острым гепатитом С, частое поражение лиц молодого возраста, высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени определяют повышенное внимание к этому заболеванию.

Изучение молекулярных механизмов взаимодействий вируса с клеткой-хозяином, в частности изучение нативных вирусных белков, представляет сложную задачу в связи с низким уровнем накопления вируса в организме хозяина и отсутствием клеточной системы для его культивирования. В то же время выяснение структуры и свойств индивидуальных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к различным вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики ВГС-инфекции. Однако в некоторых случаях антитела к вирусу могут отсутствовать, например, в период «окна», при запаздывании иммунного ответа и при применении иммуносупрессивной терапии. Высокий уровень генетической вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант. Часто отмечаются несовпадения в результатах тестирования контрольных панелей сывороток с помощью различных тест-систем. В основе перечисленных недостатков - использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, которые по строению не всегда точно соответствуют нативным вирусным белкам, а также неполное знание антигенной структуры возбудителя и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина.

Цели и задачи исследования

Цели данной работы:

- изучение экспрессии белков ВГС в клетках печени больных острым гепатитом С;

Для достижения целей нами были поставлены следующие задачи:

1. С помощью моноклональных антител (МКА) исследовать выявляемость отдельных антигенных детерминант (АД) нативных вирусных белков в клетках печени больных острым гепатитом С (ОГС).

2. Получить фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты вирусных белков, и картировать эти антигенные детерминанты.

3. Оценить иммуногенные свойства антигенных детерминант белков ВГС, экспонированных на фаговых частицах.

5. С помощью данного метода изучить спектр антител у больных гепатитом С на разных стадиях заболевания.

Научная новизна и практическая значимость.

2. Установлена структурная организация 6 антигенных детерминант, не описанных ранее, в составе белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что частота выявления отдельных антигенных детерминант белков ВГС в клетках печени больных ОГС различается. В целом индивидуальные белки core, NS3, NS4 и NS5 выявляются в клетках печени 100% пациентов с острым гепатитом С.

3. Показана иммуногенная активность антигенных детерминант белков ВГС в составе фаговых частиц.

1 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Речкина, Елена Александровна

Выводы

4. При помощи технологии фагового дисплея получены фаговые клоны с пептидными вставками, имитирующими 11 антигенных детерминант белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС. При картировании установлено, что 3 антигенные детерминанты являются линейными, остальные содержат элементы вторичной и третичной структуры белков.

5. Показано, что аминокислотные последовательности, представляющие антигенные детерминанты белков ВГС в составе фагов (мимотопы), способны индуцировать у мышей выработку антител, специфичных к вирусным белкам.

6. Разработан метод выявления антител к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах, в сыворотках больных гепатитом С. Установлено, что частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам различается и достоверно выше у больных ОГС по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении ОГС и ХГС.

7. Показано, что спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам в срок до месяца после манифестации инфекции достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции, что может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Речкина, Елена Александровна, Москва

1. Абдулмеджидова А.Г., Масалова О.В., Атанадзе С.Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител к рекомбинантному белку NS3 вируса гепатита С. // Вопросы вирусологии. 2002. - Т. 47, №1. -С. 21-25.

2. Иванисенко В.А., Ерошкин A.M. Поиск сайтов, содержащих функционально значимые замены в наборах родственных или мутантных белков. // Молекулярная биология. 1997.- Т. 31, №5. - С. 880 - 887.

3. Круглов И.В., Знойко О.О., Огиенко O.JI. и др. Спектр антител к различным антигенам HCV при разных вариантах течения хронической HCV-инфекции. // Вопросы вирусологии. 2002. - Т47, №2. - С. 11 - 16.

4. Круглов И.В., Огиенко O.JL, Знойко О.О. и др. Исследование сероконверсии к различным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С с различными исходами. // Вопросы вирусологии. — 2003. — Т.48, №2. С. 36 - 40.

5. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита С. // Доклады Академии Наук. -2002. Т. 383, №4. - С. 545-550.

6. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Шкурко Т.В. и др. Анализ белков вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом С. // Вопросы вирусологии. 2003. - Т.48, №1. - С. 9 - 14.

7. Масалова О.В., Кущ А.А. Моноклональные антитела к белкам вируса гепатита С инструмент для картирования антигенных детерминант,диагностики гепатита С и изучения вирусного патогенеза. // Российский Биотерапевтический журнал. 2003. - №3. - С. 7-23.

8. Пименов В.К. Синтетические пептиды в изучении антителопродукции к белкам вирусов гепатита С и D. // Автореф. канд биол наук. Н.Новгород. 2000.-С. 21.

9. Agnello V., Abel G., Elfahal M. et.al. Hepatitis С virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - P. 12766 - 12771.

10. Andre P., Perlemuter G., Budkowska A. et.al. Hepatitis С virus particles. and lipoprotein metabolism. // Seminars in liver disease. 2005. - V. 25. - N. 1. -P. 93-104.

11. Ballardini G., De Raffele E., Groff P. et al. Timing of reinfection and mechanisms of hepatocellular damage in transplanted hepatitis С virus-reinfected liver. // Liver Transpl. 2002. - V.8. - P. 10-20.

12. Barrera JM, Francis B, Ercilla G et al. Improved detection of anti-HCV in posttransfusion hepatitis by a thirdgeneration ELISA. // Vox Sang. 1995. -V. 68. -P. 15-18.

13. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of hepatitis С virus. // J. Gen. Virol.-2000.-Vol. 81.-P. 1631 1648.

14. Bassett S.E., Thomas D.L., Brasky K.M., Lanford R.E. Viral persistence, antibody to El and E2, and hypervariable region 1 sequence stability in hepatitis С virus-inoculated chimpanzees. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 1118 -1126.

15. Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. // Hepatology. 1996. - V.24. - P.289-293.

16. Bhattacherjee Y., Prescott L.F., Pike I. et.al. Use of NS4 peptides to identify type-specific antibody to hepatitis С virus genotypes 1, 2, 3, 4, 5 and 6. // Journal of General Virology. 1995. -V. 76. - P. 1737-1748.

17. Bocharov G., Ludewig В., Bertoletti A. et al. Underwhelming the immune response: effect of slow virus growth on CD8+ -T-lymphocyte responses. // J. Virol. 2004. V. 78. - P. 2247-2254.

18. Booth J.C., Foster G.R., Levine T. et al. The relationship to genotype in chronic HCV infection.//Liver.-1997.-V. 17. -№3. -P. 144-151.

19. Bowen D.G., Walker C.M. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis С virus infection. //Nature. 2005. - V. 436. - P. 946-952.

20. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis С virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. -V. 90. - P. 8234-8238.

21. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the core gene of 14 hepatitis С virus genotypes. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V. 91. - P. 82398243.

22. Buolant S., Becchi M., Penin F., Lavergne J.P. Unusual multiple recoding events leading to alternative forms of hepatitis С virus core protein from genotype lb. //J. Biol. Chem. -2003. V. 278. - P. 45785-45792.

23. Cerino A., Boender P., La Monica N. et.al. A human monoclonal antibody specific for the N terminus of the hepatitis С virus nucleocapsid protein. // J Immunol. 1993. -V. 151, №12. - P. 7005-7015.

24. Cerny A., Chisari. F.V. Immunological aspects of HCV infection. // Intervirology. 1994. - V. 37. - P. 119-125.

25. Chan S.W., Bye J.M., Jackson P., Allain J.P. Human recombinant antibodies specific for hepatitis С virus core and envelope E2 peptides from an immune phage display library. // J Gen Virol. 1996. -V. 77. - P. 2531 - 2539.

26. Chang J.C., Seidel C., Ofenloch B. et.al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS4 protein as modeled with synthetic peptides. // Virology.1999.-V. 257, N1.-P. 177-190.

27. Chang K.M. Immunopathogenesis of hepatitis С virus infection. // Clin. Liver Dis. 2003. - V.7. - P.89-105.

28. Chang SC, Yen J, Kang H. et.al. Nuclear localization signals in the core protein of hepatitis С virus. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.- V. 205. - P. 1284-1290.

29. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A. et.al. Limited humoral immunity in hepatitis с virus infection. // Gastroenterology. 1999. - V. 116. - P. 135-143.

30. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A. et.al. Human and murine antibody recognition is focused on the ATPase/Helicase, but not the protease domain of the hepatitis С virus nonstructural 3 protein. // Hepatology. 1998. - V. 28, N1. -P. 219-224.

31. Ching W.M., Wychowski C., Beach M.J. et.al. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. - V. 89, N8. - P. 3190-3194.

32. Cho H.S., Ha N.S., Kang L.W. et.al. Crystal structure of RNA helicase from genotype lb hepatitis С virus. A feasible mechanism of unwinding duplex RNA. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 15045-15052.

33. Choi J., Xu Z., Ou J.H. Triple decoding of hepatitis С virus RNA by programmed translational frameshifting. //Mol. Cell Biol. 2003. - V. 23. - P. 1489-1497.

34. Choo Q., Kuo G., Weiner AJ. et.al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. // Science. 1989. — V. 244. -P. 359-362.

35. Choo Q., Richman K.H., Han J.H. et.al. Genetic organization and diversity ofthe hepatitis С virus. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. -V. 88. - P. 2451-2455.

36. Choo S.H., So H.S., Cho J.M., Ryu W.S. Association of hepatitis С virus particles with immunoglobulin: a mechanism for persistent infection. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2337-2341.

37. Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of the secondary strucrure of proteins from their amino acid sequence. // Adv. Enzymol. 1978. - V. 47. - P. 145-148.

38. Chung R.T., Monto A., Dienstag J.L., Kaplan L.M. Mutations in the NS5A region do not predict interferon-responsiveness in american patients infected with genotype lb hepatitis С virus. // J. Med. Virol. 1999. - V. 58. - P. 353358.

39. Cocquerel L., Duvet S., Meunier J.C. et.al. The transmembrane domain of hepatitis С virus glycoprotein El is a signal for static retention in the endoplasmic reticulum. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 2641-2649.

40. Cocquerel L., Meunier J.C., Pillez A. et.al. A retention signal necessary and sufficient for endoplasmic reticulum localization maps to the transmembrane domain of hepatitis С virus glycoprotein E2. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 2183-2191.

41. Colin C, Lanoir D, Touzet S et.al. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis С virus antibody detection assays: an analysis of the literature. // J. Viral Hepat. 2001. - V. 8. - P. 87-95.

42. Cooper S, Erickson AL, Adams EJ, et al. Analysis of a successful immune response against hepatitis С virus. // Immunity. 1999. - V. 10. - P. 439-449.

43. Cwirla, S.E., Peters, E.A., Barrett, R.W., Dower, W.J. Peptides on phage: a vast library for identifying ligands. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. - V. 87. - P. 6378-6382.

44. Darling J.M., Wright T.L. Immune responses in hepatitis C: is virus or host the problem? // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. - V. 17. - P. 193-198.

45. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C. et.al. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes. // J. Virol. 1997. — V. 71. - P. 697-704.

46. Devlin J.J., Panganiban L.C., Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. // Science. 1990. - V. 249. - P. 404-406.

47. Dou X.-G., Talekar G., Chang J. et.al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS5A protein. // Journal of Clinical Microbiology. 2002. - V. 40, N1. -P. 61-67.

48. Egger D., Wolk В., Gosert R. et al. Expression of hepatitis С virus proteins induces distinct membrane alteration including a candidate viral replication complex. // J. Virol. 2002. - V.76. - P. 5974-6984.

49. Engelman D.M., Steitz T.A., Goldman A. // Annu. Rev. Biophys. Chem. -1986.-V. 15.-P. 321-353.

50. Enomoto N., Sakuma I., Asahina Y. et.al. Mutations in the nonstructural protein 5a gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis с virus lb infection. // N. Engl. J. Med. 1996. - V. 334. - P. 77-81.

51. Enshell-Seijffers D., Denisov D., Groisman B. et.al. The mapping and reconstitution of a conformational discontinuous B-cell epitope of HIV-1. // J. Mol. Biol. 2003. - V. 334. - P. 87-101.

52. Enshell-Seijffers D., Smelyanski L., Gershoni J.M. The rational design of a "type 88" genetically stable peptide display vector in the filamentous bacteriophage fd. // Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29, N10. - P. 50-63.

53. Ferreiro M.C., Dios P.D., Scully C. Transmission of hepatitis С virus by saliva? // Oral. Dis. 2005. - V. 11, N4. - P. 230-235.

54. Flegelova Z., Krchnak V., Nemecek V. et.al. Epitope mapping of non-structural (NS3/NS4) region of HCV protein using synthetic peptides. // In "Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis". Mayflower, Kingswinford, UK. -1994.-P. 505-508.

55. Flint M., Maidens C., Loomis-Price L.D. et.al. Characterization of hepatitis С virus E2 glycoprotein interaction with a putative cellular receptor, CD81. // Journal of virology, Aug. 1999. - V. 73, N8. - P. 6235-6244.

56. Gallinari P., Brennan D., Nardi C. et.al. Multiple enzymatic activities associated with recombinant NS3 protein of hepatitis С virus. // J. Virol. 1998. — V. 72. — P. 6758-6769.

57. Garnier J., Osguthorpe D.J., Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. //J. Mol. Biol. 1978. -V. 120, N1. - P. 97-120.

58. Gerlach J.T., Diepolder H.M., Jung M.C. et al. Recurrence of hepatitis С virus after loss of vims-specific CD4(+) T-cell response in acute hepatitis C. // Gastroenterology. 1999. - V. 117. - P. 933-941.

59. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J. et.al. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis. // J. Immunol. Methods. 1987. - V. 102. - P. 259-274.

60. Geysen H.M., Mason T.J., Rodda S.J. Cognitive features of continuous antigenic determinants. // J. Mol. Recognit. 1988. -V. 1. - P. 32-35.

61. Giannelli G., Antonaci S. Immunological and molecular aspects of liver fibrosis in chronic hepatitis С virus infection. // Histol. Histopaphol. 2005. — V. 20. — P. 939-944.

62. Giannini C., Brechot C. Hepatitis С virus biology. // Cell Death and Differentiation. 2003. - V. 10. - P. 27 - 38.

63. Goeser Т., Muller H.M., Pfaff E., Theilmann L. Characterization of antigenic determinants of the hepatitis С virus. // Virology. — 1994. — V. 205. — P. 462469.

64. Grakoui A., Wychowski C., Lin C. et.al. Expression and identification ofhepatitis С virus polyprotein cleavage products. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 1385-1395.

65. Gretch D.R. Diagnostic tests for hepatitis C. // Hepatology. 1997. - V. 26. -P. 43-47.

66. Grihalde N.D., Jack Chen Y.-C., Golden A. et.al. Epitope mapping of anti-HIV and anti-HCV monoclonal antibodies and characterization of epitope mimics using a filamentous phage peptide library. // Gene. 1995. - V. 166, N2. - P. 187-195.

67. Heller Т., Rehermann B. Acute hepatitis C: a multifaceted disease. // Seminars in liver disease. 2005. - V. 25. - P. 7-17.

68. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C. // Hepatology. 2002. —V. 36.-P. 21-29.

69. Hope R.G., McLauchlan J. Sequence motifs required for lipid droplet association and protein stability are unique to the hepatitis С virus core protein. //J. Gen. Virol.-2000.-V. 81.-P. 1913-1925.

70. Jolivet-Reynaud C., Adida A., Michel S. et.al. Characterization of mimotopes mimicking an immunodominant conformational epitope on the hepatitis С virus NS3 helicase. // Journal of Medical Virology. 2004. -V. 72. - P. 385-395.

71. Karlus P.A., Schulze G.E. //Naturwissenshaften. 1985. - V. 72. - P. 212-223.

72. Khudyakov Yu.E., Khudyakova N.S., Jue D.L. et.al. Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis С virus as modeled with synthetic peptides. // Virology. 1995. - V. 206. - P. 666-672.

73. Kim J.L., Morgenstern K.A., Lin C. et.al. Crystal structure of the hepatitis С virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. // Cell. 1996. - V. 87. - P. 343-355.

74. Kim J.L., Morgenstern K.A., Griffith J.P. et.al. Hepatitis С virus RNA helicase domain with a bound oligonucleotide: the crystal structure provides insights into the mode of unwinding. // Structure. 1998. - V. 6. - P. 89-100.

75. Kittlesen D.J., Chianese-Bullock K.A., Yao Z.Q. et.al. Interaction between complement receptor gClqR and hepatitis С virus core protein inhibits T-lymphocyte proliferation. // J. Clin. Invest. 2000. - V. 106, N10. - P. 1239 -1249.

76. Kuo G., Choo Q.L., Alter H.J. et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. // Science. 1989. — V. 244.-P. 362-364.

77. Kyte I., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105-132.

78. Lanford R.E., Notvall L., Chavez D. et.al. Analysis of hepatitis С virus capsid, El, and E2/NS1 proteins expressed in insect cells. // Virology. 1993. - V. 197.-P. 225-235.

79. Large M.K., Kittlesen D.J., Hahn Y.S. Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis С virus: Possible implications for hepatitis С virus persistence. //J. Immunol. 1999. -V. 162. - P. 931-938.

80. Lechner F., Wong D.K., Dunbar P.R. et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis С virus. // J. Exp. Med. 2000. - V. 191.-P. 1499-1512.

81. Lerat H., Berby F., Trabaud M.A. et.al. Specific detection of hepatitis С virus minus strand RNA in hematopoietic cells. // J. Clin. Invest. 1996. - V. 97. -P. 845-851.

82. Levy S., Todd S.C., Maecker H.T. CD81 (TAPA-1): a molecule involved in signal transduction and cell adhesion in the immune system. // Annu. Rev. Immunol. 1998.-V. 16.-P. 89-109.

83. Liu Q., Bhat R.A., Prince A.M. et al. The hepatitis С virus NS2 protein generated by NS2-3 autocleavage is required for NS5A phosphorylation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -V. 254. - P. 572-577.

84. Liu Q., Tackney C., Bhat R.A. et.al. Regulated processing of hepatitis. С virus core protein is linked to subcellular localization. // J. Virol. 1997. - V. 71, N1. -P. 657-662.

85. Lo S., Masiarz F., Hwang S.B. et.al. Differential subcellular localization of hepatitis С virus core gene products. // Virology. 1995. - V. 213. - P. 455461.

86. Longombardo G., Ferri C., Marchi S. et.al. Immune response to an epitope of the NS4 protein of hepatitis С virus in HCV-related disorders. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1998. - V. 87, N2. - P. 124-129.

87. Major M.E., Feinstone S.M. The Molecular Virology of Hepatitis C. // Hepatology. 1997.-V. 25, N6.-P. 1527-1538.

88. Marusawa H., Hijikata M., Chiba Т., Shimotohno K. Hepatitis С virus core protein inhibits Fas- and tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis via NF-kappaB activation. // J. Virol. 1999. - V. 73, N6. - P. 4713^1720.

89. Masalova O.V., Atanadze S.N., Samokhvalov E.I. et.al. Detection of hepatitis С virus core protein circulating within different virus particle populations. // Journal of Medical Virology. 1998. - V. 55. - P. 1-6.

90. Masalova O.V., Lakina E.I., Abdulmedzhidova A.G. et al. Characterization of monoclonal antibodies and epitope mapping of the NS4 protein of hepatitis С virus. // Immunol. Letters. 2002. - V.83. - P. 187-196.

91. McKinney M.M., Parkinson A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. // J. Immunol. Methods. 1987. - V. 96, N2. - P. 271-278.

92. McLauchlan J. Properties of the hepatitis С virus core protein: a structural protein that modulates cellular processes. // Journal of Viral Hepatitis. -2000. V. 7.-P. 2-14.

93. Menez R., Bossus M., Muller B.H. et.al. Crystal structure of a hydrophobic immunodominant antigenic site on hepatitis С virus core protein complexed to monoclonal antibody 19D9D6. // The Journal of Immunology. -2003.-V. 170.-P. 1917-1924.

94. Meola, A., Delmastro P., Monaci P. et.al. Derivation of vaccines from mimotopes: immunologic properties of HBsAg mimotopes displayed on filamentous phage. // J. Immunol. 1995. - V. 154. - P. 3162-3172.

95. Minenkova O., Gargano N., Tomassi A.D. et.al. ADAM-HCV, a new-concept diagnostic assay for antibodies to hepatitis С virus in serum. // Eur. J. Biochem. 2001. - V. 268. - P. 4758-4768.

96. Mondelli M.U., Cerino A., Boender P. et.al. Significance of the immune response to a major, conformational B-cell epitope on the hepatitis С virus NS3 region defined by a human monoclonal antibody. // J. Virol. 1994. - V. 68, N8.-P. 4829-4836.

97. Moradpour D., Englert C., Wakita Т., Wands JR. Characterization of cell lines allowing tightly regulated expression of hepatitis С virus core protein. //

98. Virology. 1996. -V. 222. - P. 51-63.

99. Moradpour D., Gosert R., Egger D. et.al. Membrane association of hepatitis С vims nonstructural proteins and identification of the membrane alteration that harbors the viral replication complex. // Antiviral research. -2003.-V. 60.-P. 103-109.

100. Moriya K., Fujie H., Shintani Y. et.al. The core protein of hepatitis С virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. //Nat. Med. 1998. -V. 4.-P. 1065-1067.

101. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et al. Virus taxonomy, sixth report of the international committee on taxonomy of viruses. // Vienna & New York: Springer. 1995. - P. 424-426.

102. Neddermann P., Tomei L., Steinkuhler C. et.al. The nonstructural proteins of the hepatitis С virus: structure and functions. // Biol. Chem. 1997. -V. 378.-P. 469-476.

103. Neumann A.U., Lam N.P., Dahari H. et.al. Hepatitis С viral dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha therapy. // Science. 1998. -V. 282.-P. 103-107.

104. Nikolaeva L.I., Blokhina N.P., Tsurikova N.N. et.al. Virus-specific antibody titers in different phases of hepatitis С virus infection. // Journal of Viral Hepatitis. 2002. - V. 9. - P. 429-437.

105. Okuda M., Li K., Beard M.R. et.al. Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis С virus core protein. // Gastroenterology. 2002. -V. 122. - P. 366-375.

106. Olenina L.V., Nikolaeva L.I., Sobolev B.N. et.al. Mapping and characterization of В cell linear epitopes in the conservative regions of hepatitis С virus envelope glycoproteins. // J. Viral. Hepat. 2002. - V. 9, N3. - P. 174182.

107. Park H.J., Byun S.M., Ha Y.J. et.al. Identification of immunodominant epitopes in the Core and nonstructural region of hepatitis С virus by enzymeimmunoassay using synthetic peptides. // J. Immunoassay. 1995. - V. 16. — P. 167-181.

108. Pavio N., Lai M.M. The hepatitis С virus persistence: how to evade the immune system? // J. Biosci. 2003. - V. 28. - P.287-304.

109. Pawlotsky J.M., Germanidis G. The non-structural 5 A protein of hepatitis С virus. // Journal of Viral Hepatitis. 1999. - V. 6. - P. 343-356.

110. Penin F., Combert C., Germanidis G. et.al. Conservation of the conformational and positive charges of hepatitis С virus E2 envelop glycoprotein hypervariable region 1 points to a role in cell attachment. // J. Virol. -2001. -V. 75. P. 5703-5710.

111. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A. et.al. Structural biology of hepatitis С virus. // Hepatology. 2004. - V. 39, N1. - P. 5-19.

112. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Wang L.F., Morris G.E. Hepatitis С epitopes from phage-displayed cDNA libraries and improved diagnosis with a chimeric antigen. // Journal of Medical Virology. — 2000. V. 60. — P. 144— 151.

113. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Morris G.E. Identification of antigenic sites on three hepatitis С virus proteins using phage-displayed peptide libraries. // Journal of Medical Virology. 1998. - V. 56. - P. 105-111.

114. Petrenko V.A., Vodyanoy V.J. Phage display for detection of biological threat agents. // Journal of Microbiological Methods. 2003.- V. 53. - P. 253 -262.

115. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S. et.al. Binding of hepatitis С virus to CD81. // Science. 1998. - V. 282. - P. 938-941.

116. Prezzi C., Nuzzo M., Meola A. et.al. Selection of antigenic and immunogenic mimics of hepatitis С virus using sera from patients. // The Journal of Immunology. 1996. -V. 156. - P. 4504 - 4513.

117. Ray R., Khanna A., Lagging L.M. et.al. Peptide immunogen mimicry of putative El glycoprotein-specific epitopes in hepatitis С virus. // J. Virol. —1994. V. 68, N7. - P. 4420-4426.

118. Ray R.B., Lagging L.M., Meyer K. et.al. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis С virus core protein. // Virus Res. —1995.-V. 37.-P. 209-220.

119. Ray R.B., Ray R. Hepatitis С virus core protein: intriguing properties and functional relevance. // FEMS Microbiology Letters. 2001. - V. 202. - P. 149-156.

120. Realdon S., Gerotto M., Dal Pero F. et al. Proapoptotic effect of hepatitis С virus core protein in transiently transfected cells is enhanced by nuclear localization and is dependent on PKR activation. // J. Hepatol. — 2004. — V. 40. -P.77-85.

121. Reed K.E., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The NS5A/NS5 proteins of viruses from three genera of the family flaviviridae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases. // J. Virol. 1998. — V. 72. - P. 6199-6206.

122. Rice C.M. Flaviviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, et al. // Fields Virology, 3rd edition. Philadelphia: Lippincott-Raven. 1996. - P. 931-959.

123. Rollier C., Depla E., Drexhage J. et al. Control of heterologous hepatitis С virus infection in chimpanzees is associated with the quality of vaccine-induced periferal T-helper immune response. // J. Virol. — 2004. — V. 78. — P.187-196.

124. Rosa C., Osborne S., Garetto F. et.al. Epitope mapping of the NS4 and NS5 gene products of hepatitis С virus and the use of a chimeric NS4-NS5 synthetic peptide for serodiagnosis. // Journal of Virological Methods. 1995. -V. 55.-P. 219-232.

125. Sagnelli E., Coppola N., Marrocco C. et.al. Diagnosis of hepatitis С virus related acute hepatitis by serial determination of IgM anti-HCV titres. // Journal of Hepatology. -2005. V. 42. - P. 646-651.

126. Saito I., Miyamura Т., Ohbayashi A. et.al. Hepatitis С virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. - V. 87. - P. 6547-6549.

127. Sansonno D., Iacobelli A.R., Cornacchiulo V. et.al. Immunohistochemical detection of hepatitis С virus-related proteins in liver tissue. // Clin. Exp. Rheumatol. 1995. - V. 13. - P. 29-32.

128. Santolini E., Migliaccio G., La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 3631-3641.

129. Scheuer P.J., Ashrafzadeh P., Sherlock S. et al. The pathology of hepatitis C. // Hepatology. 1992. - V. 15. - P. 567-571.

130. Scognamiglio P., Accapezzato D., Casciaro M.A. et al. Presence of effector CD8+ T cells in hepatitis С virus-exposed healthy seronegative donors. // J. Immunol. 1999. - V. 162. - P. 6681-6689.

131. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. - V. 249. - P. 386-390.

132. Seeff L.B., Buskell-Bales Z., Wright E.C. et al. Long-term mortality after transfusion-associated non-A, non-B hepatitis. // N. Engl. J. Med. 1992. — V. 327.-P. 1906-1911.

133. Sela M. Antigenicity: some molecular aspects. // Science. — 1969. V. 166.-P. 1365-1374.

134. Shimizu Y.K., Igarashi H. Kiyohara T. et al. A hyperimmune serumagainst a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis С virus can prevent viral infection in cell cultures. // Virology. 1996. -V. 223.-P. 409^412.

135. Siemoneit K., Cardoso M.S., Wolp A. et.al. Isolation and epitope characterization of human monoclonal antibodies to hepatitis С virus core antigen. // Hybridoma. 1994. - V. 13, N1. - P. 9-13.

136. Simmonds P.E., Holmes C., Cha T.-A. et.al. Classification of hepatitis С virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS5 region. //J. Gen. Virol. 1993. -V. 74. - P. 2391-2399.

137. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display. // Chem. Rev. 1997. - V. 97. -P. 391-410.

138. Smothers J.F., Henikoff S., Carter P. Affinity selection from biological libraries. // Science. 2002. - V. 298. - P. 621-622.

139. Sung V.M-H, Shimodaira S., Doughty A.L. et.al. Establishment of B-cell lymphoma cell lines persistently infected with hepatitis С virus in vivo and in vitro\ The apoptotic effects of virus infection. // J. Virol. 2003. - V. 77. — P. 2134-2146.

140. Takamizawa A., Mori C., Fuke I. et.al. Structure and organization of the hepatitis С virus genome isolated from human carriers. // J. Virol. 1991. - V. 65.-P. 1105-1113.

141. Taylor D.R., Shi S.T., Romano P.R. et.al. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. // Science. 1999. - V. 285. -P. 107-110.

142. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The

143. NS5A protein of hepatitis С virus is a zinc metalloprotein. // The Journal of Biological Chemistry. 2004. - V. 279, N 47. - P. 48576-48587.

144. Tellinghuisen T.L., Rice C.M. Interaction between hepatitis С virus proteins and host cell factors. // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - V. 5. - P. 419427.

145. Teo M., Hayes P. Management of hepatitis C. // British Medical Bulletin. -2004.- V. 70.-P. 51-69.

146. Thimme R., Bukh J., Spangenberg H.C. et al. Viral and immunological determinants of hepatitis С virus clearance, persistence, and disease. // PNAS. -2002.-V. 99.-P. 15661-15668.

147. Thimme R., Oldach D., Chang K.-M. et al. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection. // J. Exp. Med.-2001.-V. 194.-P. 1395-1406.

148. Tomei L., Failla C., Santolini E. et.al. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С virus polyprotein. // J. Virol. — 1993. V. 67. — P. 4017-4026.

149. Ueno Т., Misawa S., Ohba Y. et.al. Isolation and characterization of monoclonal antibodies that inhibit hepatitis С virus NS3 protease. // J'. Virol. — 2000. V. 74, N14. - P. 6300-6308.

150. Urbanelli L., Fortugno P., Bartoli F. et.al. 'Affinity maturation' of ligands for HCV-specific serum antibodies. // J. Immunol. Methods. 2000. — V. 236.-P. 167-176.

151. Wang L.-F., Yu M. Epitope identification and discovery using phage display libraries: application in vaccine development and diagnostics. // Current Drug Targets. 2004. - V. 5. - P. 1-15.

152. Welling G.W., Weijer W.J., van der Zee R., Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins. // FEBS Lett. 1985. - V. 188, N2.-P. 215-218.

153. Wienhues U., Ihlenfeldt H.-G., Seide C. et.al. Characterization of a linearepitope in the nonstructural region 4 of hepatitis С virus with reactivity to seroconversion antibodies. // Virology. 1998. - V. 245. - P. 281-288.

154. Wright P.E., Dyson H.J. Inrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. // J. Mol. Biol. 1999. - V. 293. - P. 321-331.

155. Xu Z., Choi J., Yen T.S. et.al. Synthesis of a novel hepatitis С virus protein by ribosomal frameshift. // EMBO J. 2001. - V. 20. - P. 3840-3848.

156. Yagnik A.T., Lahm A., Meola A. et.al. A model for the hepatitis С virus envelop glycoprotein E2. // Proteins. 2000. - V. 40. - P. 355-366.

157. Yamanaka Т., Kodama Т., Doi T. Subcellular localization of HCV core protein regulates its ability for p53 activation and p21 suppression. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002. - V. 294. — P. 528-534.

158. Yamanaka Т., Uchida M., Doi T. Innate form of HCV core protein plays an important role in the localization and the function of HCV core protein. // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2002. — V. 294. — P. 521-527.

159. Yasui K., Wakita Т., Kohara K.-T. et.al. The native form and maturation process of hepatitis С virus core protein. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 60486055.

160. Yip Y.L., Smith G., Ward R.L. Comparison of phage pill, pVIII and GST as carrier proteins for peptide immunisation in Balb/c mice. // Immunology Letters. 2001. - V. 79. - P. 197-202.

161. Zhang Z.-X., Chen M., Sonnerborg A. et.al. Distinguishing acute from symptomatic chronic hepatitis С virus infection by site-directed of the HCV structural proteins. // J. of Infectious Deseases. — 1995. — V. 171. — P. 13561359.

162. Zhu Z.Y., Minenkova O., Bellintani F. et.al. In vitro evolution of ligands for HCV-specific serum antibodies. // Biol. Chem. 2000. - V. 381. - P. 245254.

163. Zibert A., Kraas W., Meisel H. et.al. Epitope Mapping of antibodies directed against hypervariable region 1 in acute self-limiting and chronic infections due to hepatitis С virus. // Journal of Virology. 1997. - V. 71, N 5. -P. 4123-4127.

164. Zibert A., Kraas W., Ross R.S. et.al. Immunodominant B-cell domains of hepatitis С virus envelope proteins El and E2 identified during early and late time points of infection. // J. Hepatol. 1999. - V. 30, N 2. - P. 177-184.

165. Zibert A., Meisel H., Kraas W. et al. Early antibody response against hypervariable region 1 is associated with acute self-limiting infections of hepatitis С virus. // Hepatology. 1997. -V. 25. - P. 1245-1249.

Информация о работе

Речкина, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы