Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование характерных для шизофрении нарушений на уровне метаболического и иммунного статуса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моделирование характерных для шизофрении нарушений на уровне метаболического и иммунного статуса"



^изииэш^ тгтьвпгазиъ ^втазга-ъъьгь иаадзьъ имиииьи

=ии. РгиС[111)р)шО|1 шСЩшО 1|ЬОишв1иЗЬт)|1

и^икцшО «-фщЬтш ЦртшгЬьф

С[щпфрЬ0|тщ(10 рОпрп2 [иш0^ш[1П1й0Ьр|1 15пгф|ид[лрги15о орсциСфцф (фиршфп|ш]йш1^ш0 й (иЗгиОш^О 4шрфшЦ1бш1)йЬр[1 йш1|шрг(ш1|пЦ

Ч. 00.04 - ЦЬОишр^ш Сишйшфтт^шйр ^ЬОишршОии^шй с)|илтр]п10(}Ьр(1 рЫ)5шйпф шиифбшО^ Гшцдйшй

ш1лЬОш|ипип1р|шО

и ь 1 и ИР I1 Р

ЬРШЬ-- 2000

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна

Айвазян Виолетта Арташесовна

МОДЕЛИРОВАНИЕ ХАРАКТЕРНЫХ ДЛЯ ШИЗОФРЕНИИ НАРУШЕНИЙ НА УРОВНЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО И ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия

ереван 2000

Umbüujfunuriipjuuü ptüLuü hiuuuiiuwilbi. t ЗЧ QliU 1Гп[Ы(пцш^й ijbüuijupujlinipjujü (lOuinhinniinh ttfiuiuiljuG funphprjruü:

Q|iuiiu1jluG nbljujtJujpübp ЦЬЬи. qfiui. ipil|innp U.U.PnjiugjuiG

ЧЧ 4UU ш1|шг>ьйьйг<и 1< ДЛ lupiuqjnqjUJÜ

'ЧшгшпОш^шО QÖrn.]n3uj|xinийЬр' ЦЬСи. фш. iyil)innp ПЛ. ЦидЗшишй

ljhCu. qfim. ptljümöni kll. lujqujpjujü

Unuijuiuiiup Цш^йшЦЬрцп^тй' bpUujQ[i 'ЧЬшш^шй ^шйш(ишршй|1

ljtiDuujß|ii5hujjh ujäpfinG

Tlm2Uiujuiünipjni.CD l]uijuj[juj|_nL1 «Z5j> >läjyiktjfcfi.OOOp. d. /J^frG

ЗЧ QllU Ч. PnLG[iujpjmCi|i шйЦшО LibGuLiigfiCitiUJjh fiGum|iLnnLuifiG L)h9 042 i3muGuiq[iuiUjg4uj6 funphprjji G(iuuinn3 (375014, bpLiuG, 'Лшргидо 11Ци1ф 5/1)

UinbüiufununipjiuG[i ЦшрЬ^Ь t дшйпршйш^ fiüuintiuinnri(i QpmriiupujGnLÜ

Ubriüiuqfifio шггшвЦшй t «¿f»

UuiuOuiqfiiiiujgiluJd funphprj.fi qfiwujljujü Ешрштгцир'

1)Ьйи. qfiui. nnljwnp, щрпф. sltjtA и UfiiSnGjujG

Тема диссертации утверждена на заседании Ученного совета Института молекулярной биологии HAH РА.

Научные руководители: доктор биол. наук. A.C. Бояджян

академик HAH РА К.Г. Карагезян

Официальные оппоненты: доктор биол. наук, проф. Р.Г. Камалян

канд. биол. наук. КА- Казарм

Ведущая организация: Кафедра биохимии Ереванского

Государственного университета

Защита состоится 2000г. в ч. на заседании

специализированного совета 042 при Институте биохимии им. Г. Бунятяна HAH РА

(375014, Ереван, ул. Паруйра Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии. Автореферат разослан AU><%o^L 2000г. Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биол. наук., проф. A.A. Симонян

Р6//Р 03 0-3 О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Шизофрения является наследственным психическим заболеванием с комплексной аутосомно-рецессивной генетикой, характеризующееся расстройством умственной деятельности и эмоциональной сферы личности. (Andreasen, 1995; Zee, 1995; First & Pincus, 1999). В процессе исследований этиопатогенеза шизофрении был накоплен огромный фактический материал, на основании которого и сформировались современные теоретические представления о молекулярных патомеханизмах этого заболевания.

Дофаминовая теория, принятая всеми исследователями, утверждает, что одной из причин развития шизофрении является гиперактивация дофаминовой системы мозга, как результат гиперактивации A2RD (Abi-Dargham et al, 1998; Laruelle & Abi-Dargham, 1999; AMI et al, 1999).

Одно из центральных мест в гиперактивации дофаминовой трансмиссии при шизофрении отводится ферменту ДБМ (КФ 1.14.17.1), катализирующему биосинтез НА из ДА и локализованному в ЦНС в нейросекреторных гранулах окончаний адре-нергических нейронов (Schwarzenbrunner et al, 1990). Предполагают, что гиперактивация Д2РД в мозговой ткани при шизофрении является, частично, результатом сверх-образовапия ДА, обусловленного понижением уровня активности ДБМ. Учеными были получены данные, свидетельствующие о низком уровне активности ДБМ (Markia-nos et al, 1990; Daniel et al, 1994; Маилян и др., 1996; Wei et al,1998), нарушении баланса между уровнями НА и ДА, в пользу второго, и высоком уровне ДА (Оке & Adams, 1987; Оке et al, 1988; Neylan, 1996; Lmdstrom et al, 1999) в мозгу у больных шизофренией. Однако до настоящего времени не показано наличие прямой связи между понижением активности ДБМ и сверхобразованием ДА при шизофрении.

На сегодняшний день нет также сомнений в серьезном нарушении иммунного статуса организма при шизофрении и вовлеченности в ее патогенез аутоиммунных реакций. При шизофрении наблюдается активация песпецифического клеточного и специфического гуморального компонентов иммунной системы, угнетение специфического клеточного иммунитета, опосредованного Т-хелперами-1 и активация гуморального иммунитета, опосредованного Т-хелперами-2. (Коляскина и Секирина, 1990; Muller & Ackenheil, 1995; Katila et al, 1996; Wike et al, 1996; VanKammen, 1996; Wilke et al, 1996; Mittleman et al, 1997; Cazullo et al, 1998; Rothermimd et al, 1998; Katila et al, 1999; Muller et al, 1999; Printz et al, 1999; Schwarz et al, 1999; Sperrier-Unterweger et al, 1999).

Важно отметить, что все характерные для патогенеза шизофрении нарушения в статусе иммунной системы и количественные сдвиги продуктов секреции иммуно-компетентных клеток регистрировались как в крови, так и в спиномозговой жидкости и мозгу пациентов. Это свидетельствует о нарушениях на уровне иммунной системы головного мозга. Данное заключение подтверждается также обнаружением в спино-мозгой жидкости и крови у больных шизофренией высокого титра AT к антигенам тканевых структур мозга и тимоцитов, нейромедиаторам и их рецепторам, специфичным для мозговой ткани белкам и некоторым другим. Показана фиксация AT к нейроантигенам на тканях мозга у больных шизофренией, умерших в период обострения (К.рыжановский и Магаева, 1990; Berquist et al, 1993; Levy-Soussan et al, 1996; Arinami et al, 1998; Wiesmann et al, 1999; Захаренко и др., 1999; Klyushnik et al, 1999).

Таким образом, вовлеченность в патогенез шизофрении аутоиммунных реакций на уровне ЦНС не оставляет сомнений. Однако, до настоящего времени не ясно, является ли шизофрения заболеванием аутоиммунной природы, иначе говоря, являются ли аутоиммунные реакции этиологическим фактором шизофрении.

Для обоснования аутоиммунной природы заболевания, в патогенезе которого главную роль играют генетически детерминированные аутоиммунные реакции, учеными сформулирована система необходимых и достаточных требований, одним из которых является наличие положительной или отрицательной ассоциации аллелей полиморфных локусов HLA с наследованием данного заболевания (Крыжаыовский, Магаева, 1990; Smith & Germolec, 1999). К сожалению, в случае шизофрении результаты экспериментов в отмеченном направлении весьма противоречивы. Одни данные свидетельствуют о наличии подобной ассоциации, (Nimgaonkar et al, 1997; Sasaki et a), 1999; Chadda et al, 1999; Arinami et al, 1999), ряд других - свидетельствует об обратном (Campion et al, 1992; Jacobsen et al, 1998; Jonsson et al, 1998; Hawi et al, 19S9).

Другим обоснованием аутоиммунной природы заболевания является демонстрация возможности моделирования его в эксперименте введением животным соответствующих аутоАТ (Крыжановский, Магаева, 1990; Smith & Gcrmoloc, 1999). Однако, в случае шизофрении подобная модель не была получена. Следовательно, до настоящего времени вопрос об аутоиммунной природе шизофрении оставался открытым.

Развитию аутоиммунных реакций отводится одно из центральных мест в дофаминовой теории шизофрении. Многие исследователи пытаются обосновать существование взаимосвязи между аутоиммунными процессами и гиперактивацией дофаминовой трансмиссии при шизофрении. В частности, нами было выдвинуто предцоложе-

ние, что аутоиммунный процесс может развиваться на уровне образования специфичных к ДБМ АТ. Взаимодействие АТ с ДБМ приведет к блокаде фермента, понижению интенсивности катализируемого ею биосинтеза НА из ДА, сверхобразованию ДА и гиперактивации дофаминергической трансмиссии в ЦНС. Это предположение было в дальнейшем высказано и другими учеными. Однако, до настоящего времени не было представлено экспериментальных данных, подтверждающих или опровергающих вышеотмеченное предположение или' демонстрирующих связь между развитием аутоиммунных реакций и погашением уровня активности ДБМ при шизофрении.

Таким образом, несмотря на многочисленность исследований, направленных на выяснение молекулярно-клеточных патомеханизмов генерации и развития шизофрении, в сложной проблеме этиологии и патогенеза этого заболевания многое еще остаётся неясным. Причина этого заключается как в противоречивости имеющихся данных, так и в отсутствии адекватной экспериментальной "модели" шизофрении. В настоящее время единственная экспериментальная "модель" этого заболевания - "амфе-таминовый психоз" основана на внутримозтовом введении животным агонистов ДА (Ре]Ге1 е1 а1, 1999; СавШег апс! СоМтап-ИаМз, 1999; СоттШ е( а1, 1999; СшоуаП е1 а1, 1999). Эта модель не воспроизводит ни один из этапов наблюдаемых при шизофрении нарушений в обменных процессах или иммунном статусе организма, а лишь отражает конечный результат отмеченных нарушений - гиперактивацию Д2РД.

Исходя из вышеизложенного, очевидно, что значительный прогресс в исследованиях молекулярных этиопатомеханизмов шизофрении может быть достигнут при наличии экспериментальной модели, отражащей основные, характерные для шизофрении метаболические и иммунологические сдвиги, и модулирующей их взаимосвязь.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы заключалась в выявлении возможной взаимосвязи между гиперактивацией дофамииергической трансмиссии и развитием аутоиммунных процессов при шизофрении.

Задача настоящей работы, в связи с вышеотмеченным, состояла в получении модели, имитирующей наблюдаемые при шизофрении развитие аутоиммунных реакций, низкий уровень активности ДБМ, дисбаланс между уровнями НА и ДА и сверхобразование ДА в мозговой ткани, а также отражающей взаимосвязь этих нарушений.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые получена экспериментальная модель, имитирующая наблюдаемые при шизофрении развитие аутоиммунных реакций, низкий уровень активности ДБМ,

дисбаланс между уровнями НА и ДА в мозговой ткани и сверхобразование ДА, а также отражающая взаимосвязь между отмеченными нарушениями.

Показано, что дисбаланс между уровнями ДА и НА в ЦНС и сверхобразование ДА могут быть обусловлены понижением активности ДБМ в результате блокады фермента аутоАТ. Настоящая работа предоставляет определенные доказательства в пользу вовлеченности аутоиммунных реакций в гиперактивацию Д2РД при шизофрении с участием ДБМ.

Кроме того, демонстрация возможности "моделирования" одного из этапов характерного для шизофрении нарушения обмена веществ запуском аутоиммунных реакций является свидетельством аутоиммунной природы шизофрении.

Таким образом, теоретическая значимость данной работы состоит в развитии и уточнении современных воззрений о молекулярных этиопатомеханизмах шизофрении.

Практический выход настоящей работы состоит в том, что полученная экспериментальная "модель" шизофрении может быть успешно применена в биохимических и иммунологических исследованиях этиопатогенеза этого заболевания, а также в фармакологии при изучении эффектов ряда терапевтических препаратов, используемых при лечении шизофрении и изыскании путей повышения эффективности этих препаратов. Подходы, используемые нами при моделировании на животных характерных для шизофрении нарушений на молекулярном уровне, могут быть успешно применены для создания моделей других нейроиммунных заболеваний.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном Армяно-Швейцарском симпозиуме по актуальным проблемам психиатрии (Ереван, 1996), на Международной конференции "Мозг и иммунная система" (Ереван-Дилижан, 1997), XII Обшем Собрании Европейского Нейрохимического Общества (Санкт-Петербур, Россия, 1998) и на Ученом совете Института молекулярной биологии HAH РА (Ереван, 2000).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 15 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, в котором отражены современные представления о молекулярных патомеханизмах генерации и развития шизофрении, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, общих выводов и указателя литературы, содержащего 214 источников.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты исследования отражены в 5 работах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В опытах использовали белых крыс-самцов массой 150-200г и кроликов породы шиншилла массой 1,5-2,Окг.

Очистку АБМ из мозгового слоя надпочечников быка проводили по методу Ljones et al (1976). Полученную элсктрофоретически гомогенную фракцию ДБМ с удельной активностью 17-25мкмоль/мин/мг белка хранили при -70°С в 20мМ К-фосфатном буфере рН 6,5 при концентрации 4мг в 1мл, без потери кативности в течение 1 года. Метод позволяет получить около 10мг фермента из ШОг мозгового слоя надпочечников. Выход фермента контролировали определением его удельной активности.

Иммунизацию кроликов бычьей ДБМ проводили в 2 этапа (с интервалом 30 дней), введением в подколенный лимфатический узел раствора фермента в 20мМ К-фосфатном буфере рН 6,5 (4мг/мл) из расчёта 0,8мг белка/кг массы животного. Через 10 дней после второй иммунизации в антисыворотке обнаруживались AT к ДБМ.

Очистку специфичных к АБМ AT из антисыворотки кроликов, иммунизированных бычьим ферментом, проводили посредством фракционирования 40% сульфатом аммония, ионнообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ("Sigma", США) и гель-фильтрации на сефарозе 6В ("Pharmacia", Швеция) при 5°С. Описанные процедуры позволяют получить 16мг электрофоретически гомогенного препарата AT (фракция иммуноглобулинов G) из 40мл кроличьей антисыворотки. Препараты хранили при -70"С в ЮмМ Na-фосфатном буфера, рН 7,5, при концентрации 2-4мг/мл, без потери пативпости в течение 1 года. Выход AT к ДБМ, начиная с этапа хроматографии, контролировали двойной иммунодиффузией на агаре.

Двойную иммунолиффузию на агаре ("Difco", США), для определения специфичности антисыворотки и AT прово&или методом Ouchterlony (1967).

Получение меченых пиридоксальфосфатом AT проводили инкубацией раствора AT (4мг/мл) с 10-кратным молярным избытком пиридоксалъфосфата ("Fluka", Швейцария) при рН 8,5 в ЮмМ Na2HPO, в течение 1 часа в темноте, при комнатной температуре. Затем добавляли насыщенный раствор боргидрита Na и lMNaH2P04, доводили рН смеси до 7,5. Избыток пиридоксалъфосфата удаляли гель-фильтрацией на сефа-дексе G-50 ("Pharmacia", Швеция), уравновешенном ЮмМ Na-фосфэтным буфером, рН 7,5. Концентрацию включившегося в состав AT пиридоксалъфосфата рассчитывали, исходя из значения его коэффициента молярной эксгинкции при 334нм (9700 М"' х см'1). В результате вышеописанной обработки на 1 молекулу AT

приходилось 5 молекул пиридоксальфосфата. Контрольные эксперименты показали, что модифицированные пиридоксальфосфатом AT сохраняют способность к специфическому взаимодействию с ДБМ. Полученные препараты использовали в течение 24 часов.

Введение крысам специфичных к АБМ AT в ЮмМ Ыа-фосфатном буфере, pH 7,5, проводили субокципитально. Контрольным животным вводили буфер без AT, или с AT, подвергнутыми термообработке (60°С, 20 мин) и потерявшими способность к взаимодействию с ДБМ.

Тест на неспецифическую цитотоксичность AT к АБМ проводили на культуре клеток нейробластомы (субклон N-2a опухоли С-1300; РФ). Клетки культивировали в присуствии AT на среде Игла с 10% сывороткой крови зародыша коровы (РФ). К 1мл среды добавляли 0,01мл раствора AT (2,6мг/мл). Перед добавлением в среду AT стерилизовали под воздействием рентгеновских лучей (100 рентген, 15 мин), что не влияло на способность AT к взаимодействию с ДБМ. В контрольных экспериментах использовали ту же среду без AT. Э1Д определяли по критерию образования колоний согласно формуле: = (число колоний/число посеянных клеток) х 100% (Duncan& Brooks, 1983). Окраску проводили кристаллическим фиолетовым (РФ). Динамику размножения клеток исследовали посевом их равного количества во флаконы Карреля и подсчетом в камере Фукса-Розенталя.

Гомогенность белковых препаратов определяли ЭФ в 7,5% ПЛАТ, pH 8,9 (Davis, 1964), используя реактивы фирмы "Reanal", Венгрия.

Определение концентрации АБМ и специфичных к ферменту AT проводили сгтектрофотометрически, исходя из значений коэффициентов их оптического поглощения при 280нм, соответственно, 12,4 (Scotland & Ljones, 1979) и 13,5 (Ройт, 1991).

Общее содержание бежа определяли по методу Lowry et al. (1951), с бычьим сывороточный альбумином ("Sigma", США) в качестве стандарта.

Определение активности АБМ проводили двумя методами. Один из них, основанный на спектрофотометрическом определении модифицированного продукта (р-окси-бензальдегида), катализируемой ферментом реакции (Kuzuya & Nagatsu, 1969), использовали при контроле выхода бычьей ДБМ на этапах ее очистки, а также для оценки удельной активности гомогенных препаратов фермента. В качестве субстрата использовали тирамин ("Sigma", США). Продукт ферментативной реакции (окситира-мин) предварительно выделяли из инкубационной смеси иопнообменной хроматографией на дауэксе Н+, 50Wx8, ("Fluka", Швейцария). Удельную активность выражали в

мкмолях окснтирамина, образующегося за 1мин на 1мг белка. Второй метод (Matsui et al, 1981), основан па электрохимической регистрации продукта, катализируемой ДБМ реакции, ВЭЖХ в обращенной фазе на колонке с силикагелем, модифицированным октадецилсиланом, размер частиц 10мхм ("Yanapak ODS", Япония). Этот метод использовали для определения активности ДБМ в сыворотке крови и гомогенатах ткани мозга крыс с тирамином или ДА ("Sigma", США) в качестве субстратов. Удельную активность выражали в имолях продукта (окситирамина или НА), образующегося за 1мин на 1г ткани или в пмолях продукта, образующегося за 1мин на 1мл сыворотки.

Определение содержания НА и АА в ткани головного мозга крыс проводили методом флуоресцентного анализа (Euler & Lishajko, 1963). Метод основан на экстракции катехоламиков из ткани мозга, разделении их хроматографией на окиси алюминия ("Fluka", Швейцария) и переводом (химической модификацией и облучением кварцевыми лучами) в сксииндольпые производные, отличающиеся друг от друга зависимостью параметров флуоресценции от рН.

ЭФ проводили на приборе "М-6" ("Reanal", Венгрия), снабженном платиновым электродом, в гелевых трубках длиной 10см и диаметром 6мм.

Спектрофотометрические и флуориметпические измерения проводили на спектрофотометре "Specord М-40", ("Zeiss", Германия) и спектрофлуориметре "MPF-44A" ("Peikiii-Elmer", США) в стеклянных и кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,2, 0,5 и 1,0см, при комнатной температуре.

ВЭЖХ проводили на хроматографе "L-2000", снабженным "VMD-101" электрохимическим детектором ("Yanako Ltd", Япония).

Облучение кварцевыми и рентгеновскими лучами проводили ргутно-кварцевой лампой "ОКН-11-М" и на приборе "РУМБ-26"(РФ), соответственно.

Обработку экспериментальных данных проводили персональным компьютером на базе процессора "Intel Pentium-133", используя программу "Enzfittor" (Англия).

Статистическую обработку проводили по t-критерию Стыодента, пользуясь программой "(-EASE" (Румыния).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВОЗДЕЙСТВИЕ СПЕЦИФИЧНЫХ К ДБМ АТ НА УРОВНИ ЛА И НА В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС. Результаты этой части исследований воспроизводились в 15 отдельных экспериментах (и), в каждом из которых было использовано 10 экспериментальных животных. Измерения проводились в 2 параллелях для каждого животного. Как следует из данных, представленных в таблице 1, через 1 час после субокципитального введения крысам специфичных к ДБМ АТ '(2,6мкг/г массы животного) происходит резкое снижение в мозговой ткани концентрации НА (приблизительно в 25 раз, р=10'9, 1 = 8.958, п= 15) и повышение концентрации ДА (приблизительно в 3 раза, р = 6,7х10'9, 1 = 8.178, п=15) по сравнению с контрольными животными.

Отмеченное воздействие проявляется при введении не менее !,2мкг АТ/г массы животного. Максимальный эффект наблюдался при введении Змкг АТ/г массы животного. Введение более концентрированных растворов АТ не приводит к дальнейшему изменению уровней НА и ДА в мозговой ткани (рис.1).

Воздействие специфичных к ДБМ АТ на уровни НА и ДА стабильно в течение 612 часов при введении их животным в концентрации, близкой к насыщающей (рис.2).

Таблица 1.

НА ДА

Параметр Контроль Опыт Контроль Опыт

п 15 15 15 15

М 0,3387 0,0138 0,4053 1,18

шш О.Ю 0,01 0,32 0,80

шах 0,5500 0,0196 0,64 1,50

б 0,1403 0,0049 0,1465 0,3364

т 0,0362 0,0013 0,0378 0,0868

С 41,42 35,50 36,14 28,51

1 0,95 1,06 1,07 1,359

Содержание НА и ДА (мкг/г) в ткани головного мозга крыс в норме (контроль) и через 1 час после субокципитального введения специфичных к ДБМ АТ (опыт) в концентрации 2,6мкг/г массы животного.

ВОЗДЕЙСТВИЕ СПЕЦИФИЧНЫХ К ЛБМ AT НА УРОВЕНЬ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС. Результаты этой части исследований воспроизводились в 15 отдельных экспериментах, в каждом из которых было использовано 10 экспериментальных животных. Измерения проводились в 2 параллелях для каждого животного. Как следует из данных, представленных в таблицах; 2,3, через 30 мин после субокципиталъного введения крысам' специфичных: к ДБМ AT (2,бмкг/г массы животного) удельная активность ДБМ в мозговой ткани и сыворотке крови понижается приблизительно в 3 раза по сравнению с исходными значениями удельных активностей фермента в отмеченных тканях у контрольных животных. Отмеченные данные получены с ДА (для мозговой ткани р<10"'°, t=17.8, п=15; для сыворотки крови р<1010, t = 22.9, u = 15) и тирамином (для мозговой ткани р<10"ш, t=22.0, п= 15; для сыворотки крови р<10'10, t= 19.1, п=15) в качестве субстратов ДБМ.

Воздействие AT на активность ДБМ з мозговой ткани и сыворотке крови проявляется при введении не менее 1,2мкг АТ/г массы животного. Максимальный эффект наблюдался при введении Змкг АТ/г массы животного. Введение более концентрированных растворов AT не приводило к дальнейшему изменению удельной активности ДБМ как в мозговой ткани, так и в сыворотке крови (рис.3). Воздействие AT к ДБМ на активность фермента как в мозговой ткани, так и в сыворотке крови стабильно 6-12 часов при введении их в концентрации, близкой к насыщающей (рис.4).

Таблица 2.

СУБСТРАТ

ДА Тирамин

Параметр Контроль Опыт Контроль Опыт

п 15 15 15 15

М 5.40 1.95 4.75 1.35

min 4.0 1.3 3.9 1.2

max 6.3 2.4 5.6 1.7

8 0.70 0.25 0.58 0.17

m 0.180 0.065 0.150 0.045

С 12.96 12.82 12.21 12.59

t 3.0 3.0 3.2 3

Удельная активность ДБМ (нмоль/мин/г) в ткани головного мозга крыс в норме (контроль) и через 1 час после субокципиталъного введения АТ к ДБМ (опыт) в ко-центрации 2,6мкг/г массы животного.

Таблица 3.

СУБСТРАТ

М Тирамин

Параметр Контроль Опыт Контроль Опыт

ц 15 15 15 15

М 24.1 8.57 19.7 7.2

ПИП 20.0 6.9 16.0 6.0

тах 29.0 9.5 25.0 8.5

5 2.47 0.91 2.35 0.92

т 0.64 0.23 0.61 0.24

С 10.2 10.6 11.9 12.8

1 3.8 3.7 3.2 3.0

Удельная активность ДБМ (пмоль/мин/мл) с ДА и тирамином в качестве субстрата, в сыворотке крови крыс в норме (контроль) и через 1 час после субокципитальпого введения АТ к ДБМ (опит) в концентрации 2,бмкг/г массы животного.

[АТ1 к ДБМ, мкг/г массы животного

Рис.1. Зависимость уровней НА и ДА в ткани головного мозга крыс от концентрации специфичных к ДБМ А Г.

Измерения проведены через I час после субокципитальпого введения АТ к ДБМ. Отмечена величина среднего квадратаческого отклонения (±&).

О 4 8 12 Ю 20 21

11--1 г

'•о.

К

9$-5-5-д-

'О

8 Е в а а

Цвдщы

Рис.2. Зависимость уровней НА и ДА в ткани головного мозга крыс от времени, прошедшего после введения специфичных к ДБМ АТ.

1 - контрольная группа животных, 2 • опытная группа животных. Концентрация введенных АТ составляет 2,6 мкг/г массы животного.Отмечена величина средней квадратической ошибки | + т).

Время, часы

Рис.4. Зависимость удельной активности ДБМ в ткани головного мозга и сыворотке крови крыс с ДА 11,31 и пгирамином (2,4) в качестве субстрата от времени, прошедшего после введения специфичных к ДБМ А Т.

1,2 - контрольная группа животных, 3,4 • опытная труппа животных. Концентрация введенных АТ составляет 2,бмкг/г ткани мозга. Отмечена величина среднего квадратического отклонения | + .

7 г

0 12 3 4

[АТ) к ДБМ, мкг/г массы животного

12 3 4

[АТ] к ДБМ, мкг/г массы животного

Рис.3. Зависимость удельной активности ДБМ в ткали головного мо.чга и сыворотке крови крыс с ДА (1) и тирамином (2) в качестве субстрата от концентрации специфичных к Д£АТ АТ.

Измерения проведены через 30 мин после субокципитального введения АТ к ДБМ. Отмечена величина среднего квадратичсского отклонения (+6).

КРИТЕРИИ НАПРАВЛЕННОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ АТ К ДБМ. Эксперименты с использованием меченых пиридоксальфосфатом АТ к ДБМ показали, что субокципитально введённые крысам АТ доходят до ткани мозга. В этих экспериментах через 1 час после введения АТ (2,бмг/г массы животного) крыс забивали, мозг промывали физиологическим раствором для удаления крови и гомогенизировали в 10 мМ Ыв-фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,1 % тритон Х-100 и 1 % 1ЧаС1 (2 мл буфера на 100мг ткани мозга) в гомогенизаторе Погтера. Гомогенат центрифугировали при 15000д, ЗОмин к осадок вновь подвергали вышеописанной процедуре. Суммарный надосадочный раствор диализовали против того же буфера без тритона, а затем против того же буфера без ЫаС1. Далее раствор концентрировали до Змл и подвергали гель-фильтрации на колонке с сефарозой 6В (1,8х 25см), уравновешенной ЮмМ буфером. В элюируемых с колонки фракциях регистрировали характерное для пиридоксальфосфата А при 334нм и I при 405нм ().,иб 334нм). Аналогичные процедуры проводили с контрольными животными. На рис.5 показаны диаграммы элгоции, полученные при гель-фильтрации мозговых экстрактов опытных и контрольных животных. Как следует из представленных данных, через 1 час после введения меченые пиридоксальфосфатом АТ к ДБМ обнаруживались в белковых экстрактах мозга опытных животных. Результаты этой части исследований воспроизводились в 2 отдельных экспериментах, в каждом из которых было использовано 5 экспериментальных животных. Измерения проволились в 2 параллелях для каждого животного. О специфичности воздействия АТ на уровни ДА и НА свидетельствуют: " "эффект насыщения": максимальный эффект воздействия АТ на уровни как НА и ДА в мозговой ткани, так и активностей ДБМ в мозговой ткани и сыворотке крови наблюдался при введении Змкг АТ/1 г массы животного, дальнейшее повышение концентрации АТ не приводило к изменению отмеченных параметров;

■ отсутствие каких-либо изменений в уровнях ДА и НА в мозговой ткани и удельных активностей ДБМ в мозговой ткани и сыворотке крови при введении животным буфера с АТ, ияактивированными термообработкой;

■ корреляция между понижением удельной активности ДБМ (как в мозговой ткани, так и в крови), возрастанием содержания субстрата - ДА и понижением содержания продукта - НА, катализируемой ДБМ реакции, в мозговой ткани животных под воздействием специфичных к ферменту АТ, а также сходный характер за-

висимостей изменения отмеченных параметров от концентрации введенных АТ и времени, прошедшего после их введения; ■ отсутствие цитотоксического эффекта в воздействии АТ, о чём свидетельствуют результаты исследований на культуре клеток нейробластомы, являющиеся средними трёх отдельных экспериментов (три посева), каждый из которых включал 20 параллелей. Согласно результатам этих исследований, Э„л клеток нейробластомы, инкубировашшх в среде с АТ, практически не отличалась от Э„ контрольных клеток и составляла, соответственно, 63% и 61%. На рис.6 показана логарифмическая фаза роста клеток в присутствии и без АТ к ДБМ.

А.33) им (_)

1450 нм {- - )

Азз4 НМ ( _ ) 0>6

1<50 им {- -)

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

5 10 15

Номер фракции

5 10 15 Номер фракции

Рис.5. Диаграммы злюции белковых экстрактов мозга крыс, подвергнутых введению меченых пиридоксальфосфатом АТ (а) и буфера без АТ (б).

Объем каждой фракции составлял Змл, нулевой объем колонки, определенный по объему выхода декстрана синего (2 кДа), - 26мл. Стрелками отмечены фракции, содержащие меченые пиридоксальфосфатом АТ.

£ о н

V

о <

и к ¡т4

10

0.1

01234567 Сутки

Рис.6. Динамика размножения клеток нейробластомы в присутствии (Д-Д) и без (О-О) АТ к ДБМ.

Согласно представленным данным АТ не влияют на проляферативную активность клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты настоящего исследования свидетельствуют, что субокципиталыю введенные крысам АТ к ДБМ блокируют фермент в мозговой ткани, приводя к понижению его активности, соответственно, к возрастанию концентрации субстрата (ДА) и понижению концентрации продукта катализируемой им реакции (НА).

Отмеченные выше критерии направленности и специфичности действия АТ к ДБМ свидетельствуют, что эффекты, наблюдаемые нами в результате субокципиталь-ного введения крысам специфических к ДБМ АТ, обусловлены непосредственным

взаимодействием AT с ферментом и, соответственно, блокадой последнего. Так, эксперименты с мечеными пиридоксальфосфатом AT четко демонстрируют, что субокди-питально введенные AT доходят до ткани мозга. Таким образом, можно с достаточной степенью достоверности утверждать, что субокципитально введенные AT к ДБМ доходят до места локализации фермента в мозговой ткани.

С другой стороны, эксперименты по изучению воздействия AT на рост и Э„, клеток нейробластомы позволяют исключить возможность того, что наблюдаемые нами .эффекты являются результатом неспецифического цитотоксического воздействия AT. О специфическом воздействии AT свидетельствуют и "эффект насыщения", и ряд вышеотмеченных корреляций.

Хотелось бы обратить внимание на тог факт, что во всех экспериментах, параллельно с определением активности ДБМ в мозговой ткани, определялась и активность фермента в сыворотке крови. Как свидетельствуют литературные данные (Schamberg & Kirshner, 1976; Goldstein & Cubeddu, 1976; Патон, 1982), содержание ДБМ в крови обусловлено ее высвобождением из адренергических нейронов. Таким образом, изменение содержания или активности ДБМ в ЦНС непременно должно отразиться на содержании или активности фермента в крови и соответствующим образом коррелировать с отмеченным изменением, что и наблюдается в наших экспериментах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые получена модель, имитирующая наблюдаемые при шизофрении развитие аутоиммунных реакций, низкий уровень активности ДБМ, дисбаланс между уровнями ДА и НА в мозговой ткани и сверхобразование ДА. Полученная модель также отражает взаимосвязь между отмеченными нарушениями.

Показано, что дисбаланс между уровнями НА и ДА в ЦНС и, соответственно, сверхобразование ДА, могут быть обусловлены понижением активности ДБМ, в результате блокады фермента аутоАТ. Следовательно, настоящее исследование свидетельствует, что понижение активности ДБМ при шизофрении может являться результатом характерных для этого заболевания аутоиммунных реакций и демонстрирует возможность существования взаимосвязи между последними и гиперактивацией Д2РД при шизофрении.

Как уже было отмечено, многочисленные литературные данные свидетельствуют о вовлеченности аутоиммунных процессов в патогенез шизофрении, однако четких обоснований аутоиммунной природы этого заболевания до настоящего времени не

было представлено. Для обоснования аутоиммунной природы заболевания, в патогенезе которого главную или существенную роль играют аутоиммунные реакции, учеными сформулирована система необходимых и достаточных требований, одним из которых является возможность моделирования заболевания в эксперименте иммунизацией животных соответствующими аутоантигеиами (Крыжановский, Магаева, 1990; Smith & Germolec, 1999). В этой связи результаты настоящей работы фактически предоставляют доказательства аутоиммунной природы шизофрении.

Таким образом, результаты настоящего исследования в значительной степени развивают и уточняют современные воззрения сб этиопатогенезе шизофрении.

Отсутствие адекватной экспериментальной "модели" шизофрении в значительной степени препятствует прогрессу в исследованиях молекулярных этиопатомеханизмов генерации и развития данного заболевания. В настоящее время единственная экспериментальная модель шизофрении - "амфетаминовый психоз", основавшая на использовании агоннстов ДА, не воспроизводит ни одну из стадий нарушения обменных процессов и иммунпологического статуса организма у больных шизофренией, а лишь отражает конечный результат этих нарушений (Segal and Kuczenski, 1997; Sams-Dodd, 1998; Feifel et al, 1999; Castner and Goldman- Rakis, 1999; Gorriti et al, 1999; Ginovart et al, 1999). Поэтому применение специфичных к ДБМ AT для "моделирования" шизофрении является несравненно более перспективным подходом. Полученная нами модель отражает не только один из этапов нарушения метаболизма при шизофрении, но и имитирует характерные для этого заболевания аутоиммунные реакции.

Полученная экспериментальная "модель" шизофрении может быть успешно применена в биохимических и иммунологических исследованиях этиопатогенеза этого заболевания, а также в фармаколотии при изучении эффектов ряда терапевтических препаратов, используемых при лечении шизофрении и изыскании путей повышения эффективности этих препаратов. Подходы, используемые нами при моделировании на животных характерных для шизофрении нарушений на молекулярном уровне, могут быть применены при моделировании других нейроиммушгых заболеваний.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель, имитирующая некоторые характерные для шизофрении метаболические и иммунологические нарушения и их взаимосвязь. Модель основана на субокципитальном введении животным специфичных к дофамин-|3-монооксигеназе антител.