Митохондрии при окислительном стрессе в культуре клеток HeLa

Лямзаев, Константин Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Митохондрии при окислительном стрессе в культуре клеток HeLa
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Митохондрии при окислительном стрессе в культуре клеток HeLa"

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

НИИ физико-химической биологии 0030554"75 им. А.Н. Белозерского ,„

На правах рукописи

Лямзаев Константин Геннадьевич

Митохондрии при окислительном стрессе в культуре клеток

НеЬа.

03.00 04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003055475

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В.П. Скулачёв

Научный консультант: кандидат биологических наук

ведущий научный сотрудник Б.В. Черняк

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В .Д. Самуилов

доктор медицинских наук, профессор В.Г. Пинелис

Ведущая организация: Институт биохимии А.Н. Баха

Защита состоится 19 марта 2007 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском Государственном Университете им М В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 19 февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Л М В Медведева

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

В настоящее время термин «окислительный стресс» используется для обозначения широкой группы разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) и окислительное повреждение молекулярных компонентов клетки. Взаимоотношения между этими явлениями остаются не до конца выясненными, но, вероятно, большую роль при этом играет окислительное повреждение митохондрий, автокаталитически приводящее к усилению генерации ими АФК Механизмы образования АФК митохондриями в условиях окислительного стресса до сих пор остаются не ясными. Многочисленные данные, полученные в экспериментах с выделенными митохондриями и субмитохондриальными частицами, указывают на то, что главными супероксид-образующими компонентами дыхательной цепи являются NADH : убихиноноксидоредуктаза (комплекс I) и убихинон-цитохром с редуктаза (комплекс III). Не ясно, какой именно компонент комплекса I служит одноэлектронным донором для восстановления кислорода Более того, в физиологических условиях в клетках поддерживается высокий уровень NADH, который может препятствовать образованию супероксида комплексом I. Вероятно, по этой причине эксперименты на культурах клеток дают противоречивые результаты о роли комплекса I в генерации АФК. Ингибирование активности комплекса I в культуре клеток может приводить как к увеличению, так и к снижению уровня АФК в зависимости от типа клеток и стимула вызывающего окислительный стресс Подобная неоднозначность указывает на сложность механизмов генерации АФК митохондриями в физиологических условиях. Реакция клетки на окислительный стресс включает целый ряд защитных механизмов Прежде всего, происходит активация и дополнительная экспрессия многочисленных антиоксидантных систем, часть из которых направлена на защиту митохондрий Поврежденные митохондрии представляют значительную опасность для клетки и как источники АФК и как потребители NAD(P)H и АТФ, поэтому существуют механизмы служащие для уничтожения таких органелл Наконец, в случае исчерпания всех возможностей защиты, в клетке может запускаться программа гибели (апоптоз), позволяющая избежать распространения стресса в окружающих тканях. Исследования в этой области представляют большой интерес в связи с тем, что окислительный стресс, сопровождающийся повреждением митохондрий, наблюдается при многих, серьезных патологиях, представляющих собой актуальную проблему для здравоохранения, в частности при инфарктах, инсультах, нейродегенеративных заболеваниях Выяснение роли нарушения биоэнергетических функций митохондрий в индукции окислительного стресса, а также изучение механизмов защиты клетки от повышенной продукции АФК митохондриями позволит более эффективно бороться с этими заболеваниями.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель данной работы - исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса, а также клеточного ответа на стресс.

Задачи:

1. Исследование роли митохондрий в окислительном стрессе и апоптозе, вызванных пероксидом водорода

2 Исследование механизмов передачи сигнала гибели от апоптозных клеток к соседним клеткам

3 Изучение процесса избирательного уничтожения митохондрий в условиях, когда их биоэнергетические функции нарушены

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

В работе проведено исследование влияния ингибиторов дыхательной цепи на гибель клеток HeLa и окислительный стресс вызванные пероксидом водорода Показано, что пероксид водорода вызывает гибель клеток HeLa, причем ингибиторы дыхания значительно стимулируют как гибель клеток, так и продукцию в них АФК. Способность ингибиторов дыхания увеличивать продукцию АФК указывает на то, что именно дыхательная цепь митохондрий является основным продуцентом АФК при окислительном стрессе вызванном Н2О2 Важную роль митохондрий в образовании вторичных АФК подтвердили опыты с митохондриально направленным антиоксидантом MhtoQ, который эффективно защищал от АФК образующихся при обработке клеток пероксидом водорода Также было показано, что предварительная инкубация клеток с ингибитором флавиновых ферментов дифенилен йодониумом (DPI) подавляла генерацию АФК как в случае индукции окислительного стресса Н2О2, так и в случае комбинации Н2О2 и ингибиторов дыхания. Таким образом, можно предположить, что АФК в нашей модели образуются с участием флавинововых компонентов комплекса I дыхательной цепи в ходе окисления NADH

При индукции апоптоза в клетках HeLa обнаружено не случайное образование кластеров апоптозных клеток в монослойной культуре, что указывает на возможность передачи апоптозного сигнала между клетками. Для исследования этого явления разработана простая методика, в которой были исключены прямые межклеточные контакты. Клетки, в которых апоптоз был вызван фактором некроза опухолей (ФНО), или Н2О2, передавали клеткам-реципиентам апоптозный сигнал, который прерывался при добавлении каталазы в среду инкубации. Это доказывает, что сигнал о гибели передается с помощью пероксида водорода. Обработка клеток-индукторов или клеток-реципиентов митохондриально - направленным катионным антиоксидантом MhtoQ ингибировала передачу апоптозного сигнала. Предполагается, что образование АФК в

митохондриях играет ключевую роль как в выработке апоптозного сигнала, так и в его восприятии Вероятно, феномен передачи сигнала гибели соседним клеткам определяет увеличение зоны апоптозной гибели клеток вокруг пораженного участка ткани при инфарктах и инсультах, а так же деградацию некоторых органов в онтогенезе (т. наз «органоптоз»)

В условиях массового повреждения митохондрий под действием разобщителей ЕССР или ДНФ в сочетании с ингибиторами дыхательной цепи миксотиазалом или антимицином наблюдалась деградация митохондрий в клетках НеЬа При этом в течение 1-2 часов, митохондрии фрагментировались, далее через 24-48 часов фрагментированные митохондрии формировали кластеры в области ядра Дальнейшая инкубация клеток в этих условиях приводила к гибели 5070% популяции. Оставшиеся в живых клетки, морфологически практически не отличались от контрольных, но митохондрии в них претерпевали сильную деградации Вероятно, фрагментированные митохондрии собираются в кластеры, которые далее окружаются мембраной и выбрасываются из клетки в межклеточное пространство по механизму экзоцитоза Аутофагия, по-видимому, не играет ключевой роли в этом процессе. Можно предполагать, что наблюдаемая элиминация поврежденных митохондрий («митоптоз») является защитной реакцией клетки

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и апоптоза в последнее время приобретает все большее значение, что связано с участием этих процессов в развитии многих патологий человека, таких как инсульт, инфаркт, нейродегенеративные заболевания Понимание роли митохондрий в механизмах продукции АФК поможет поиску новых средств борьбы с этими заболеваниями Кроме того, новый феномен избирательного уничтожения митохондрий, описанный в этой работе, может помочь в понимании механизмов высокой устойчивости некоторых раковых опухолей к неблагоприятным условиям и к химеотерапии

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были представлены на Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущине, 2003), на 29-м Конгрессе ГЕВЭ (Варшава, Польша, 2004), на 13-й европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Пиза, Италия, 2004) на международной конференции Вю8аепсе2004 (Глазго, Шотландия, 2004), на 12-ой Европейская конференция по апоптозу ЕСЭО (Чанья, Греция, 2004), на научной школе «Свободные радикалы и заболевания экспрессия генов, клеточный метаболизм и патофизиология» (Спецес, Греция, 2004), на 13-ой Европейской конференции по апоптозу ЕСОО (Будапешт, Венгрия, 2005), на 14-ой европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Москва, Россия, 2006), на 14-ой Европейской конференция по апоптозу ЕСОО (Сардиния, Италия, 2006)

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 13 тезисов СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на страницах и включает введение, обзор

литературы, материалы и метода, результаты и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы Работа иллюстрирована рисунками Список литературы содержит источника. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

В работе использовались линии клеток карциномы человека HeLa Культуры клеток выращивали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (25 мМ), без пирувата, с добавлением гентамицина сульфата (0,08 мг/мл) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) в атмосфере 5% СОг при 37° С

Клетки трансфецировали плазмидой Mito-EYFP кодирующей зелёный флуоресцентный белок медузы слитый с митохондриальным адресом 8 субъединицы цитохромоксидазы Трансфекцию проводили по стандартному протоколу с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen). Селекцию трансфецированных клеток проводили в среде DMEM содержащей 500 мкг/мл дженитоцина

Регистрация дыхания клеток

Скорость потребления кислорода клетками HeLa измеряли полярографически, используя закрытый Pt-электрод Кларка, в ячейке объемом 0,5 мл при 37°С с постоянным перемешиванием. Для измерения дыхания в ячейку со средой DMEM с низким содержанием глюкозы (5,5 мМ), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, вносили суспензию клеток (5-7 х 10б клеток/мл) Рассчитывали скорость дыхания клеток, принимая растворимость кислорода в среде измерения при 37°С равной 406 нг-атомам кислорода/мл и выражали в нг-атомах кислорода/мин на 106 клеток

Визуализация митохондрий, аутофагосом и цитоскелета.

Митохондрии в живых клетках окрашивали с помощью митотракера зелёного (Molecular Probes), специфического флуоресцентного красителя, окрашивающего митохондрии независимо от мембранного потенциала Аутофагосомы выявляли с помощью монодансилкадаверина (0,05 мМ, 10 мин при 31°С) (Sigma), лизосомы окрашивали с помощью лизотракера желтого (0,5 цМ, 15 мин при 37°С) (Molecular Probes) Для окраски с помощью антител клетки фиксировали в 3,7% формальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере 15 мин и пермеабилизировали с помощью 0,5% тритона Х-100 10 мин Далее клетки инкубировали с моноклональными антителами к цитохрому С (Pharmingene), к I субъединице цитохромоксидазы (Pharmingene), тубулину (Sigma) или с поликлональными антителами к белку Вах (Pharmingene) Затем после отмывки клетки

окрашивали с помощью вторичных антител, конъюгированных с красителями Oregon green и Texas Red-X (Pharmmgene) Для окрашивания актиновых филаментов использовали фаллоидин меченый TRITC (Sigma). Клетки на покровных стеклах заключали в среду Vectashield (Vector, США) Препараты анализировали с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, используя конфокальные микроскопы Nikon Eclipse TE2000-U, LSM 510 (Carl Zeiss), а также флуоресцентный микроском Axiovert 200М (Carl Zeiss)

Определение клеточной гибели

Для определения конденсации и фрагментации хроматина, происходящей в клетках при апоптозе, использовали флуоресцентный краситель Hoechst 33342 - (2'-[4-этоксифенил]-5-[4-метил-1-пиперазинл]-2, 5'-би-1Н-бензимидазол) Краситель в концентрации 1 мкг/мл добавляли в конце инкубации к живым или фиксированным клеткам на 25 минут. Фиксированные 3,7%-ным раствором формальдегида клетки промывали фосфатным буфером (PBS) и заключали в среду Vectashield Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа при длине волны возбуждающего света 365 нм

Для определения некроза к нефиксированным клеткам добавляли флуоресцентный краситель пропидий иодид (PI) в концентрации 2 мкг/мл. Процент апоптозных и некрозных клеток определяли с помощью подсчета числа клеток с фрагментированным ядром и клеток, проницаемых для пропидий иодида, соответственно.

Электронная микроскопия

Для электронной микроскопии клетки фиксировали в 3% формальдегиде приготовленном на фосфатном буфере (pH 7,4) при 4°С в течении 2 часов, затем фиксировали 1% тетроксидом осмия в течении 1,5 часов. Далее препарат дегидратировали в этиловом спирте. Затем препарат заключали в Ероп-812 и делали ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома. Срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольду. Полученные препараты анализировали с помощью электронного микроскопа HU-11В (Hitachi, Япония)

Сканирующая электронная микроскопия

Клетки фиксировали 30 минут 2,5% глютаровым альдегидом приготовленном на среде Хенкса (pH 7,2) не содержащей ионы Са2+, Mg2+, далее дополнительно фиксировали тетрахлоридом осмия в 0,1 % кокадилатном буфере (pH 7,3) Клетки дегидратировали с использованием ацетона и высушивались с помощью аппарата фирмы «Balzers» Далее на препараты напыляли смесь золота с палладием и проводили анализ с помощью сканирующего электронного микроскопа - Hitachi 405А, 15 kV

Измерение продукции АФК и величины мембранного потенциала митохондрий в клетках HeLa

Для определения продукции активных форм кислорода (АФК) использовали флуоресцентные красители DCF-DA (2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) или его аналог 5-(и-6)-хлорметил-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат ацетоновый эфир (CM-H2DCFDA) (Molecular Probes) в концентрации 4 цМ для измерения мембранного потенциала использовали тетраметилродамин (TMRM) в концентрации 200 нМ. Красители добавляли в среду культивирования клеток на 15 минут, затем клетки промывали и анализировали с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии, а также с помощью проточного цитофлуориметра (Partee PAS-III)

Измерение концентрации пероксида водорода Измерения содержания Н2О2 в среде проводили флуориметрически (возбуждение при 530 нм, испускание при 590 нм), используя в качестве индикатора Amplex Red (Molecular Probes, США) и пероксидазу хрена

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика клеток линий HeLa

В своей работе для исследования роли биоэнергетических функций митохондрий в апоптозе и окислительном стрессе мы выбрали быстрорастущую недифференцированную опухолевую линию HeLa, с высоким уровнем окислительного фосфорилирования и гликолиза Было показано, что клетки HeLa обладают высокой устойчивостью, и не гибнут даже при длительной инкубации с митохондриальными ядами Во избежание эффекта Крэбтри (торможения дыхания и окислительного фосфорилирования в присутствии субстрата гликолиза) скорости потребления кислорода клетками HeLa измеряли в среде DMEM с низким содержанием глюкозы (5,5 мМ) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки В этих условиях ингибитор F0-субкомплекса Н+-АТРазы олигомицин и ингибитор F1-субкомплекса Н+-АТРазы ауровертин эффективно подавляли дыхание клеток HeLa (рис. 1) Это говорит о высокой степени сопряженности дыхания клеток. Разобщитель карбонилцианид-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) максимально стимулировал дыхание в концентрациях 0,1-0,2 мкМ, а в концентрациях свыше 2 |iM ингибировал дыхание (рис. 1). Разобщитель 2,4-динитрофенол (ДНФ) полностью разобщал окислительное фосфорилирование в довольно высоких концентрациях (0,1-0,2 мМ). Ингибиторы комплекса I дыхательной цепи ротенон и пиерицидин, а так же ингибиторы

комплекса III миксотиазол и антимицин А практически полностью подавляли дыхание клеток (рис.1)

Рис. 1 Эффект мкгохондриальных ингибиторов на дыхание клеток НеЬа Добавки олиго - олигомицин (5 мкг/мл), ауро - ауровертин В (10 цМ), ДНФ - 2,4-дишггрофенол (0,1мМ), рот - ротенон (2 цМ), миксо - миксотиазол (2 цМ) Концентрация клеток в пробе 5*10б клеток/мл

ИНДУКЦИЯ ГИБЕЛИ КЛЕТОК HELA ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА

Окислительный стресс в клетках HeLa вызывали добавлением Н2О2 в концентрациях 100 -200 цМ Клетки HeLa культивировали при низкой плотности, при которой клетки образовывали небольшие не связанные между собою островки (конфлюэнтность 30-40%) Пероксид водорода вызывал гибель 20-30% клеток через 17 часов после добавления. Эффект пероксида водорода значительно усиливался, если клетки предварительно инкубировали с ингибиторами дыхания пиерицидином или миксотиазолом (рис. 2)

РИС. 2 Гибель клеток вызванная Н2О2 Эффекты ингибиторов дыхательной цепи и MhtoQ Апототическая и некротическая гибель измерялась через 17 часов после добавления Н2О2 (100 цМ) Пиерицидин (2 цМ), миксотиазол (2 цМ) и zVADímk (50 цМ) добавляли за 1 час до Н2О2 Клетки инкубировали с 20 нМ MhtoQ в течение 7 дней, затем промывали и культивировали еще 24 ч

MhtoQ

H.CO

н,со

Рис. 3 Структура молекулы MhtoQ

+M11T0Q

Это позволило предположить, что окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода, стимулирует продукцию АФК в митохондриях, которая значительно усиливается при ингибировании дыхательной цепи

Гибель клеток HeLa определяли по морфологии ядер после окраски Hoechst 33342, при этом апоптозными считали клетки с конденсированным и

фрагментированным хроматином. При комбинации ингибиторов дыхания и Н2О2, наблюдалось появление большого количества клеток с нарушенной целостностью внешней мембраны (пропидий йодид положительные клетки), что является характерным признаком некроза (рис.2) Ингибитор каспаз zVAD-fmk предотвращал как апоптоз, так и некроз, вызванный комбинацией Н2О2 и ингибиторов дыхания, т е некроз в наших условиях был каспаз-зависимым (рис. 2)

В клетках с интактной внешней мембраной наблюдалось перемещение белка ВАХ в митохондрии и последующий выход цитохрома С в цитоплазму, что указывает на апоптозный характер гибели. Вероятно, при интенсивном окислительном стрессе, вызванном комбинацией Н2О2 и ингибиторов дыхания, на поздних стадиях апоптоза, может нарушаться целостность плазматической мембраны.

Роль митохондрий в окислительном стрессе, вызванном Н2О2, проверяли с помощью митохондриально направленного антиоксиданта MhtoQ. Это вещество состоит из хинонового остатка коэнзима Q, конъюгированного с катионом децилтрифенилфосфония, что позволяет ему электрофоретически накапливаться в митохондриях и эффективно восстанавливаться дыхательной цепью (рис. 3) Было показано, что предварительная инкубация клеток с MhtoQ в концентрации

Рис. 4 Разобщитель 1ССР предотвращает защитное действие МитоО при апогггозе, вызванном Н2Ог (100 рМ) \IhioQ (20 нМ) был добавлен как на рис.2 (черные столбики) РССР (1 рМ) был добавлен за 1 ч до Миго<3 и присутствовал в течение 7 дней инкубации Апоптоз измерили через 24ч после добавления к клеткам Н2О2

без добавок

пиер

Нг02

пиер+Н^З;

Рис 5 Комбинация Н2С>2 с ингибиторами дыхания вызывает падение мембранного потенциала митохондрий Клетки НеЬа инкубировали с Н202 (100 цМ, 45 мин) или/и пиерицидином (45 мин, 2 рМ) и окрашивали тетрометилродамином (200 нМ, 15 мин), затем анализировали с помощью проточного цитофлуориметра

20 нМ практически полностью подавляла апоптоз вызванный пероксидом водорода. Если инкубацию клеток с Мито(3 проводили в присутствии разобщителя то защитный эффект Мито(3 на апоптоз вызванный Н2О2, не проявлялся (рис. 4) При совместном действии Н2О2 с ингибиторами дыхания пиерицидином и миксотиазолом защитный эффект МитоС} также не проявлялся (рис. 2) Отсутствие защитного эффекта МитоО в этом случае можно объяснить тем, что комбинация Н2О2 с ингибиторами дыхания вызывает резкое падение мембранного потенциала, которое препятствует накоплению Мито<Э в митохондриях и проявлению его защитных свойств (рис. 5). Кроме того, ингибиторы могут предотвращать восстановление Мито<3 дыхательной цепью, а это необходимо для проявления его антиоксидантных свойств.

Таким образом, защитный эффект митохондриально направленного антиоксиданта МитоСЗ, а также способность ингибиторов дыхательной цепи пиерицидина и миксотиазола усиливать гибель клеток, вызванную Н2О2, указывает на важную роль митохондриальных АФК в этом процессе. Далее мы исследовали механизм образования АФК митохондриями при окислительном стрессе

ПЕРОКСИД ВОДОРОДА СТИМУЛИРУЕТ МИТОХОНДРИАЛЬНУЮ ПРОДУКЦИЮ АФК

Было показано, что пероксид водорода, добавленный к клеткам, вызывает накопление в них АФК, которое измеряли с помощью флуоресцентного красителя СМ-1ХТ-ОА. Показано, что добавленный Н2О2 разлагается в течение 15-20 минут (рис. 6), вероятно, вследствие высокой активности каталазы и других антиоксидантных ферментов в среде роста С другой стороны, в наших экспериментах значительное накопление АФК в клетках наблюдалось через 45 минут после того как клетки были обработаны Н2О2 (рис. 7), что указывает на активацию эндогенной продукции АФК добавленным пероксидом водорода Продукция вторичных АФК значительно стимулировалась ингибиторами дыхания пиерицидином и миксотиазолом (рис. 7). Сами по себе ни пиерицидин ни миксотиазол в используемых концентрациях не вызывали значительного

■>] ыкМ HjO>

■ го мьм на

л \\ \

V --о

окислительного стресса.

время, №ш

Важную роль митохондрий в образовании Рис. б Р„ниеН2о2(1 цМи 10Мм) вторичных АФК подтвердили ОПЫТЫ С митохондриально » присутствии клеток (2 х 105кл/мл) Измерения

направленным антиоксиданточ МитоСЗ, который эффективно предотвращал накопление АФК при обработке

содержания Н302 в среде роста клеток проводили флуориметрически, используя в качестве индикатора Amplex Red и пероксидазу хрена Данные получены совместно с М Ю Высоких

+»й

: MlíTfiQ

flJHC. 7 Образование АФК ь клетках McLa поеле обработки :i-C\' или комбинацией I ..-'<- с ингибиторами дыхания. Пнернцидин (2 р-М), миксотиазол (2 рМ) и DPI (10 цМ] добавляли за I час до (100 рМ). MhtoQ (20 пМ) был добавлен к клеткам как на puf.2 Уровень АФК измеряли, окрашивая клетки CM-DCFH-DA (4 jiM, 15 v-:.■ i:>

(A) Фотографии клеток i I е La полученные с помощью конфокального микроскопа Nikon Eel ipse TE2000-U.

i Ej; Интенсигшосп, флуоресценции CM-DCF рассчитанная fra основании данных конфокальной микроскопии. Результату обрабатывались в программе MaBab,

(B) Измерение уровня АФК (флуоресценции CM-DCF) а клетках с помощью проточного цитофлуориметра.

клеток пероксидом водорода (рис. 7). Эффект MhtoQ не проявлялся при комбинированном поз действии И;0; и ингибиторов дакания, что, по-видимому, было связано с падение мембранного потенциала митохондрий {см. предыдущую главу).

Эффект ингибиторов дыхания указывает па то, что источником АФК в митохондриях клеток NcLa является комплекс I, причем одним из возможных мест генерации АФК является флавиновый компонент комплекса I Для проверки этой возможности мы использовали дифе] силен ййдоннум (DPI), который является эффективным ингибитором различных ферментов содержащих флавины, Показано, что предварительная инкубАция клеток с DPI подавляла генерацию АФК как н случае индукции окислительного стресса Н3Ог, так и в случае комбинации 1ЬСЪ и ингибиторов дыхания (рис. 7) Эти резу] ьтаты указывают на участие комплекса I дыхательной цепи в генерации АФК митохондриями при окислительном стрессе. Однако, следует иметь в виду, что как внешняя мембрана, так н матрикс митохондрий содержат высокоактивные флавиновые ферменты (к примеру, моноамнпоокеидазы И Ot-кетоглуторатдегидрогеназа, соответственно), потенциально способные реагировать с кислородом с образованием супероксид-радикал а или пероксида водорода. В качестве восстановителя для этих ферментов может служить NAD(P)H, стационарная концентрация которого, определяется активностью комплекса [ и транедегн дроге пазы Учитывая, что ингибирование дыхания приводит к повышению уровня воссталовленноеги NAD/NADH можно предположить, что в этих условиях ускоряется генерация АФК а-кетоглуторатдегидрогепачой или другим подобным ферментом; Так или иначе, активность

Комплекса 1 может служить фактором. Определяющим скорость образования АФК в митохондриях.

М ИТОХО НДР НАЛ ЬН Ы Е АФК УЧАСТВУЮТ В ПЕРЕДАЧ К АПОПТСШЮГО СИГНАЛА МЕЖДУ КЛЕТКАМИ Изучая апоптоз, вызванный пероксядом водорода, мы обратили внимание на то, что апоптозные клетки распределяются и м о но слой ной Культуре клеток не случайным образом, а

формируют кластеры из близкорасположенных клеток. Это указывает на наличие сигнала,

(

контроль индуктор реципиент

]*кс. 8 Передача сигнала апогттоза о* ик. обработанных ФИО, к ютДО! нцм клеткам. Клетки на стекле-индукторе обрабатывали ФИО (]Û иг/мл) и îmcihhom (] i ; N ; в течение 3 ч. Затем стекло промывали и помещали ридоы со стеклом, на котором росли кл&тас-рецнпненты па 17 ч. Аполтозные клетки выявляли па изменению норфологии ялср (конденсация й фрагментация хроматина) после окраски Hoechst 33342. Стрелками показана область контакта деух стекол.

передающегося ût погибающих клеток к соседним клеткам и способного вызывать их гибель. Для проверки гипотезы о передаче сигнала гибели апоптозными клетками была разработана методика, и которой были исключены прямые межклеточные контакты. Клетки-индукторы и клетки-реципиенты растили на двух разных стеклах в разных чашках (рис. 8). Далее одно из стеко.ч обрабатывали агентом, индуцирующим ал о птоз, и после инкубации и промывки помещали рядом с другим стеклом в общую ташку 11етри.

В первой части работы апептоз клеток-индукторов вызывали, добавляя I !2С>2 в среду роста После промывки клетки-индукторы совмещали с клетками-реципиентами в среде, содержавшей ингибитор катализы, аыиттриазол. В этих условиях после 18 ч совместной инкубации наблюдался значительный апоптоз в клетках-реципиентах (рис. 9). Добавление 20 нМ мнтохондриалыю направленного антиоксиданта MhtoQ к клеткам-реципиентам, а также В процессе совместной инкубации предотвращало передачу сигнала апоптоза, не влияя на гибель клет о к-индукторов. Поскольку, кг к было показано выше, МитоО предотвращает апоптоз

Рис. 9 Передача си спала апоптоза от клеток, обработанных Н^О;. Клетки HcLa обрабатывали 50 цМ Н20з 3 раза с интервалом в I ч и промывали. Клетки-реципиенты совмещали с клетками-индукторами на 8 ч. В среде присутствовал аминотриазол (7 мМ). MhtoQ (20 нМ) был добавлен к клеткам-реципиентам за I ч до совмещения стекол и затем присутствовал в течение 18 ч совместной инкубации (черные столбики).

вызванный Н202, эти данные указывают на то, что именно И202 является сигнальной молекулой в этой модели.

Далее мы использовали другой индуктор клеточной гибели - фактор некроза опухоли (ФИО). На рисунке 10 показаны результаты опыта, в котором клетки-индукторы инкубировали Зч с ФНО в комбинации с ингибитором синтеза белка, эметином (необходимым для предотвращения экспрессии аитиапоптозных белков при ФНО-зависимой активации фактора транскрипции NF-кВ), промывали, помещали рядом с клетками-реципиентами и продолжали инкубацию в течение 17ч. Что бы исключить возможный эффект перераспределения молекул ФНО между стеклами, совместную инкубацию проводили в присутствии моноклональных антител к ФНО (рис, 10). Антитела не препятствовали гибели клеток-реципиентов, что позволяет исключить возможность передачи сигнала между стеклг ми с помощью ФНО.

Предположение об учгстии перекиси водорода в передаче ano птоз но го сигнала было подтверждено в опытах с каталазой. Добавление в среду инкубации этого фермента, специфически разлагающего Н2О2. эффективно подавляло апоптоз клеток на стекле-реципиенте (рис. 10) и при этом не влияло на апоптоз клепок па стекле-индукторе. При повышении концентрации каталазы

Рис. 10 Передача сигнала апоптоза от клеток, обработанных ФИО, к интакгным клеткам, Моноклональные антитела к ФНО (700 нг/мл) были добавлены одновременно с ФНО (штрихованный столбик) или после совмещения стекол. Ката лаза (2500 Е/мл) была добавлена в среду инкубации при совмещении стекол. Клетки обрабатывали ФНО как описано на рис. 8.

|я+МитоО|

и иду кто р реципиент

без добавок антителак ФНО каталаза контроль

. к.'1Г1Х1Н1кдуктпрм liciti ки-pïumi tiïiiiw

\ ill ■

Рис. П Передача сигнала а пси поза от клеток., обработанных ФНО, к ишшым клеткам. Клетки обрабатывали как па рис. 8. Клетки (индукторные или рсципиентные) инкубировали с МитоС? как описано на рис 2. Апоптоз определяли через 24 ч после совмещения стекол.

и.

wi MhtoQ MirnjQ и

MifrwJ и (Ч'КШ (fiKK1

наблюдалось небольшое (не Гюлее чем в 2 раза) снижение апоптоза на стекле-индукторе. Для проверки возможной роли митохондрий в продукции Н2О2 при передаче апоптозного сигнала был использован антиокендант MiitoQ. 13 эксперименте, представленном на рисунке I I клетки на стекле-индукторе или на стекле-реципиенте были преинкубированы 20 нМ MhtoQ. Показано, что передача сигнала апоптоза была подавлена, как при преинкубации с МитоС1 индуктора так и реципиента. В то же время, MhtoQ практически не влиял на развитие ФНО -зависимого апоптоза па стекле индукторе.

Измерения уровня Н2О2 в среде инкубации показали его заметное повышение через 1-4,5 г после совмещения стекол (рис. 12 Л). Это повышение наблюдалось несмотря на высокую скорость разложения Н2О2 в присутствии клеток (рис. 6). Уровень Н&г, измеренный в среде после

часы

Рис* 12 (А) Концентрация Н;Ог в среде (за вычетом уровня Н3Ог в контроле) и содержание апоптщных клеток на стсклс с клетками-индукторами (черные колонки) при различных сроках совместной инкубации. (Б) Концентрация Hj02 в среде роста клеток инкубированных с MhtoQ как описано на рпс.2. Клетки обрабатывали ФНО как на рис. 8. Измерения содержания HjO^ в среде проводили флуориметрически используя в качестве индикатора Amplex Red и пероксидазу хрена. Данные получены совместное МЛО, Высоких.

24 ч совместной инкубации клеток индукторов и реципиентов, был значительно ниже в том случае, если индукторные клетки были обработаны MhtoQ. Если же обработке подвергались лишь реципиентные клетки, то уровень Н2О2 практически не отличался от контрольного (рис. 12 Б) 11олучснные данные позволяют предполагать, что основным фактором передачи сиг нала о гибели между клетками является Н2О2, которая генерируется с участием митохондрий. Проникая в клетку, Н2О2 вызывает накопление активных форм кислорода (АФК) при участии митохондрий и эти «вторичные» ЛФК, в свою очередь, инициируют анотпоз (рис. 13).

Рис, 13 Схема, иллюстрируюшдя гтути генерации Н^О^ и ее участия в передаче и восприятии апоптоэного сигнала. Предполагается, что в процессе апоптоза (вызванного, например, ФНО или HjOj) в клетках-индукторах (стадии 1-3) происходит генерация Н^О? внутри митохондрий (стадия 4), В цитозоле клетки Н20> усиливает апоптозные процессы (стадии S), а, выйдя во внеклеточную среду (стадия 6) атакует клетку-реципиент (стадия 7), В клетке-реципиенте проникает в митохондрии (стадия S) и стимулирует в них продукцию Н1О5 (процесс, аналогичный стадии 4), что приводит к развитию апоптоза (аналогично стадии 5). MhtoQ ингибирует продукцию Н;0; в митохондриях (стадия 9). Разобщитель окислительного фосфорилирования FCCP предотвращает накопление MhtoQ в митохондриях и его защитное действие (стадия 10),

MirroQ

КЛС1К.1 - pon

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС ВЫЗЫВАЕТ ДРОБЛЕНИЕ М1 (ТОХОНДРИАЛЬНОГО РЕТИКУЛУМА

Слияние митохондрий в единую сеть позволяет использовать её в качестве внутриклеточного электрического кабеля, передающего энергию в виде мембранного потенциала с периферии клетки, где уровень кислорода, необходимого для дыхания, относительно высок, к центральной части клетки, где потребность в окислительных метаболитах и АТФ особенно

Рис. 14 Фрагментация

митохондриального ретикулума клеток HeLa под действием миксотиазола (2 дМ, 17 часов) и HjOj (50 jiM, 5 часов). Защитный эффект MhtoQ (клетки обрабатывали MhtoQ как на рис 2). Митохондрии визуализированы методом

трансфекции плазм идой кодирующей зелёный флуоресцентный белок слитый с митохондриальпым адресом 8 субъединицы цитохромоксидазы (Mito -EYFP).

без до б а в о к миксо Н202

высока Митохондриальная сеть является динамической структурой, чувствительной к различным воздействиям.

Было показано, что фрагментация митохондриального ретикулума под действием Н2О2 наступает через 4-5 часов после воздействия (рис. 14). Эта фрагментация значительно усиливается, если клетки одновременно с Н2О2 обработать ингибиторами дыхания миксотиазолом или пиерицидином (рис. 15) Сами по себе пиерицидин и миксотиазол также вызывали фрагментацию митохондрий, но значительно более слабую фрагментация наблюдалась лишь через 15-17 часов после добавки ингибиторов Эти данные согласуются с результатами, полученными при измерении уровня окислительного стресса, вызываемого действием Н2О2, миксотиазола, пиерицидина или комбинацией Н202 с пиерицидином или миксотиазолом

Предположение о том, что фрагментация митохондриального ретикулума зависит от продукции АФК митохондриями, было проверено с помощью митохондриально направленного антиоксиданта МитоС? Длительная инкубация клеток НеЬа с 20 нМ МитоС? предотвращала фрагментацию митохондрий как под действием ингибиторов дыхательной цепи миксотиазола и пиерицидина (не показано) так и под действием Н2О2 (рис. 15).

Полученные результаты позволяют предположить, что фрагментация митохондрий, вызванная как ингибиторами дыхания, так и Н2О2 опосредована повышением уровня АФК генерируемых дыхательной цепью митохондрий Чем выше уровень генерации АФК митохондриями, тем более интенсивно идет процесс их фрагментации

5 1 Я

3 У04

2.8

а- *

за •И

зш

I £

х о м

— 14 ч 024ч :

—

£ Б |

1 г

МитоС

Рис. 15 Миксотиазол усиливает дробление митохондриального ретикулума вызванное Н2О2 Защитное действие 20 нМ Мито<3 Клетки НеЬа инкубировались с миксотиазолом (Мухо, 2 ¿1М) или\и Н2О2 (50 цМ) в течение 4 часов (черные столбики) или 24 часов (белые столбики) Клетки обрабатывали Мито() как на рис.2 Представлены результаты трех независимых экспериментов

С;

МИКСО Г

ДНФ

ДНФ+ миксо

ГССР+ миксо

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС, ВЫЗВАННЫМ ПОВРЕЖДЕНИЕМ МИТОХОНДРИЙ, ПРИВОДИТ К ИХ ДЕГРАДАЦИИ

Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе, вероятно, является самым ранним

этапом программы направленной на защиту клетки от митохондрий с поврежденными функциями и служит для предотвращения повреждения всех митохондрий слитых в единую сеть. Окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода или ингибиторами дыхательной цепи, приводил к обратимой фрагментации митохондрий. Даже длительная инкубация в этих условиях не вызывала дальнейших изменений морфологии митохондрий. Отмывка клеток от ингибиторов дыхания или 11гОг приводила к восстановлению митохондрналькой сети через 17-24 ч. Бели усилить повреждение митохондрий, вызванное ингибиторами дыхания, с помощью разобщителей окислительного фосфор и лироваиия ДНФ или РССР, то это приводило к усилению окислительного стресса и клетках (рис, 16), ускорению фрагментации митохондрий, их кластеризации и деградации

РССГ

РИС* 16 Разобщители окислительного

фосфор ил про в апия усиливают окислительный стресс в клетках НсЬа. Клетки обрабатывали миксотиазолом (2 цМ), ДНФ (0,4 мМ), РССР (10 цМ) в течение 1 часа, затгм промывши, инкубировали с ОСР-ОА (4 дМ, 15 минут) и анализировали с помощью проточного цитофлуорим етра.

РнС. 17 Изменение морфологии митохондриального ретикулума при длительной инкубации с РССР (10 11М) Митохондрии в клетках НеЬа были визуализированы, используя плазм иду Мйо-ЕУРР. Ядра клеток окрашивали ПоесЬк! 33342. Стрелками указаны кластеры митохондрий. Масштаб 15 мкм.

11осс1ы 33342

контроль

На рисунке 18 показана серия оптических срезов клетки HcLa окрашенной на актин с помощью фаллондина, меченного TRITC (красный), а также антителами к цитохрому С (зеленый). Видно, что структура акт ¡нового цитоскелета остается нормальной даже через 96 часов инкубации с митохондриальными ядами, в условиях, когда митохондрии в клетке сильно

де градированы. Тубулиновый цитоскелет

\Nir-i ! ■' V Pl 1 / ■П'Гл.ТГ Г-TFf TIVI Г^ь ,',

также не нарушается (рис, 19). Эксперименты покачали, что ингибирование актипового цитоскелета (с помощью щггохалазина) не оказывает влияния на кластеризацию митохондрий, а разрушение тубулинового цитоскелета (с помощью колцемида) даже ускоряет этот процесс. Таким образом, механизм кластеризации митохондрий, по-видимому, отличается от сборки «аггрссом», состоящих из непереваренных продуктов п роте асом ной деградации, в которой шло скелет принимает активное участ ие.

Одним из возможных механизмов селективной деградации митохондрий может быть аутофагия Известно, что с помощью этого механизма происходит регуляция количества и качества клеточных органелл. В ряде случаев было показано, что аутофагия участвует в селективной деградации митохондрий в клетках претерпевающих апоптоз. а также в случае фотодинамического повреждения митохондрий. В наших экспериментах было показано, что инкубация клеток с FCCP и антимицином вызывает накопление как лизосом, так и аутофагосом. Несмотря на ювышение общего уровня аутофагии в клетке, мм не обнаружили коло кал и чащ но митохондришьпого материала с аутофагосомами. Кроме того, на электронных микрофотографиях клеток h cLa, подвергнутых действию разобщителей и ингибиторов дыхания, также не было обнаружено иутофагии митохондрий.

На рисунках (20 Л-Ж) показаны ультратоикис срезы клеток HcLa обработанных ДНФ и антимицином. Рис 20 Л иллюстрирует нормальное распределение митохондрий в контрольных клетках 1 leLa После 3 дней обработки ДНФ и антимицином клетки теряют свои митохондрии, на рисунке 20 Ь показан тнпич! ый срез клетки, в котором митохондрии не обнаруживаются

1'ие. 19 Структура митахоЕ<лрий и системы мнкротрубочек после дпшгелыюй инкубации с К С!' и ииксотиазолом. Мн:эхО'шрин визуализированы с помощью ппа"шиды Мзю-ЕУ КР (Л, В) или ЛЕгга [е.; к ииточро.чокекдазе (Б, Г). Микротрубочкн окрашены антителами к -губулииу. Ядра окрашены Ноес1к* 33342. Кляхн 1нкубирояались 96 часов в присутствии ]0 рМ РССР и 2 цМ миксотоиола (В,Г) шеи без добавок (Л,С). Стрелками указаны кластеры ипохондрий. Масштаб 15 меси.

Рис. 20 Фотографии, полученные с помощью электронной микроскопии. Контрольные клетки (Л) и клетки обработан ньес 3 дня ДНФ (0.4 inm) и 2 11 '•', нтимнинна А (С) или 2 им миксотийюля (в, Г)

МигоЕттотическое тельце (МТ) располагается рядом с ядром (В) нс коЕгтактируя с в НС IUÍIC й клеточной мембраной. На рисунке Г стрелкой поката i плотный контакт мембраны мктоптотического тела с плазматической мсмбрлЕЕОй клетки. МасЕЕЕтаб I J.4.1ТП |.\,1>: 0,5 El tu (Ü-EJ и 0,2 ... i: для вырезапЕЕОЙ секции рисунка I Фотографии получены совместно с В.Б. Сапруновой и Л Е. Ьакссвой.

С другой стороны, в ряде случаев в районе ядра видим образования окруженные мембраной и наполненные сферическими везикулами диаметром 50-200 им, а также другим электронно-плотным материалом (рис. 20 В). В.П. Скулачевым подобное образование было названо митоптотическим тельцем. Когда мнтоптическое тельце контактируют с внешней средой, плотность его содержимого резко снижается (рис, 20 Г).

На рисунке 20 Г видно, что содержимое митонтичсского тельца отделено от внешней среды однйй мембраной, причем в некоторых местах виден плотный контакт мембраны митонтичсского тельца с внешней клеточной мембраной. В других случаях данный контакт отсутствует, н йитоптическое тельце выглядит как большая экзоейма окруженная одной мембраной. Мембрана митонтичсского тельца довольно нестабильна и при контакте с внешней средой может разрушаться, в л ом случае ее содержимое свободно выходит в среду.

Рис. 20 Фотографии, полученные с помощью электронной микроскопии. Контрольные клетки (Л) и клетки обработанные 3 дня ДНФ (0.4 inM) и 2 11'-', птнмнинна А (С) или 2 иМ микеотнячола (В, Г)

Мнгаптаггичсскос тельце (MT) располагается ридом с ядром (В) не ко1гтактируя с внешней клеточной мембраной. На рисунке Г стрслкой поката i плотный контакт мембраны мктоггтогкческого тела с пллзматической мембраной клетки. Масштаб I IV |.\,I>: n,5 |Jm (Ü-EJ и 0,2 ... i: для вырезанной секции рисунка I Фотографии получены совместно с В.Б. Сапруновой и Л Е. Ьакеевой.

С другой стороны, в ряде случаев в районе ядра видим образования окруженные мембраной и наполненные сферическими везикулами диаметром 50-200 им, а также другим электронно-плотным материалом (рис. 20 В). 8.П. Скулачевым подобное образование было названо мнтоптотнческим тельцем. Когда митоптическое тельце контактируют с внешней средой, плотность его содержимого резко снижается (рис, 20 Г).

На рисунке 20 Г видно, что содержимое митоптичсского тельца отделено от внешней среды однйй мембраной, причем в некоторых местах виден плотный контакт мембраны митоптичсского тельца с внешней клеточной мембраной. В других случаях данный контакт отсутствует, н митоптическое тельце выглядит как большая экзосома окруженная одной мембраной. Мембрана митоптичсского тельца довольно нестабильна и при контакте с внешней средой может разрушаться; в л ом случае ее содержимое свободно выходит в среду.

Рис. 21 Фазовый контраст, флуоресцентная микроскопия и сканирующая электронная

микроскопия клеток обработанных в течении 96 ч ДНФ (0,4 тМ) и антимицином (2 цМ). Ми топтическое тельце ярко окрашено митотракером зелёным и отчетливо видно на фазовом контрасте (А,Г)-(А-В) Клетка с митсптическом тельцем на поверхности (В) структура митоптического тельца при большем увеличении (Г-Е) В эксперименте проведенным в тех же условиях на клетке виден «кратер», оставшийся после того как митоптозное тело отделилось в процессе фиксации препарата. Структура «кратера» при большей увеличении (Е), Масштаб 15 мкм (А,Г) , 10 мкм (БЛ), 3 мкм (В,Е)

В другой серии экспериментов проводились наблюдения за одной и той же клеткой, используя флуоресцентную и электронную микроскопию. Митохондрии в клетках, обработанных ДНФ в комбинации с антимицином, окрашивались митотракером зеленым, находили клетку с митоптическим телом и далее фиксировали ее для электронной микроскопии. Электронная микроскопия показала наличие в зоне, ярко окрашиваемой митотракером зеленым, большого количества сферических мембранных везикул иногда имеющих электронно-плотные включения и везикулы маленького диаметра. Это позволило заключить, что митоптическое тельце заполнено митохондриальным материалом. Подобные же структу ры окрашиваются антителами к цитохрому С, к цитохромоксидазе и к иорину (белку внешней мембраны митохондрий), а следовательно все компартменты митохондрий, по-видимому, входят в состав митоптического тельца.

Результаты экспериментов с использованием фазового контраста, флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии для наблюдения за одной и той же клеткой показаны на

рисунке 21. Сканирование клетки с митоптотическим телом показало, что митоптотическое тело имеет крайне неровную, бугристую поверхность и сильно выпячивается из клетки (рис. 21 В) В другом эксперименте, показанном на рисунке 21 Г-Е в процессе фиксации препарата большая часть митоптотического тела была потерянна, а на его месте видна большая выемка на внешней поверхности клетки (рис. 21Г). Полученные результаты указывают на то, что в клетках Не1л в условиях, когда биоэнергетические функции митохондрий нарушены, реализуется эффективный способ защиты клетки, связанный с выбрасыванием поврежденных митохондрий в межклеточное пространство

В последней серии экспериментов мы исследовали, что случится с клетками, которые избавились от своих митохондрий После четырехдневной инкубации с ингибиторами в выживших клетках практически не обнаруживалось митохондриального материала и лишь изредка наблюдались мелкие плотные кластеры митохондрий. После двухнедельной инкубации в среде, не содержащей ингибиторов, клетки полностью восстанавливают структуру мигохондриальнэго ретикулума Вероятно, несмотря на массовый митоптоз, индуцированный мигохондриальными ядами, в клетке может оставаться небольшой «неприкосновенный» запас митохондрий, благодаря юторому клетка может восстановить свои митохондрии

ВЫВОДЫ

1) В условиях окислительного стресса, вызванного Н2О2, в клетках происходит генерация АФК в митохондриях Основным источником АФК, вероятно, является флавиновый компонент комплекса I дыхательной цепи. Митохондриальная продукция АФК вызывает апоптотическую гибель клеток.

2) Апоптоз, вызванный ФИО или Н2О2, сопровождается образованием Н2О2 при участии митохондрий. Выход Нг02 в среду служит сигналом, вызывающим гибель соседних клеток Основной мишенью для Н2Ог в этих клетках также служат митохондрии

3) Ингибиторы дыхания и Н2О2, стимулируют фрагментацию митохондриального ретикулума Фрагментация митохондрий опосредована повышением уровня АФК, генерируемых дыхательной цепью и может быть обратима

4) Митохондриально-направленный антиоксидант МитоО, предотвращает накопление АФК, фрагментацию митохондрий и гибель клеток при окислительном стрессе

5) Повышенная продукция АФК митохондриями в сочетании с падением мембранного потенциала вызывает фрагментацию, кластеризацию и деградацию митохондрий (т н митоптоз) Основным механизмом митоптоза в этих условиях является выбрасывание митохондрий из клетки, вероятно, путем экзоцитоза Предполагается, что митоптоз является

механизмом защиты клеток от окислительного стресса и гидролиза АТФ, вызванного нарушением биоэнергетических функций митохондрий.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Pletjushkina O.Y., Lvamzaev К G . Popova E.N., Nepryakhina О К , Ivanova O.Y., Domnina L.V, Chernyak B.V., Skulachev V.P. «Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum». Biochim Biophys Acta., 2006; 1757,518-24

2) Chernyak В V, Izyumov D.S., Lvamzaev К G, Pashkovskaya A.A., Pletjushkina О Y., Antonenko Y N , Sakharov D V , Wirtz K.W., Skulachev V.P «Production of reactive oxygen species in mitochondria ofhela cells under oxidative stress» Biochim Biophys Acta., 2006,1757, 525-34.

3) Плетюшкина О Ю , Фетисова О.Ю., Лямзаев К Г.. Иванова О.Ю , Домнина JI В., Високих М.Ю, Пустовидко А.В , Алексеевский А.В , Алексеевский Д А., Васильев Ю.М., Марфи М.П., Черняк Б.В., Скулачев В.П «Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке» Биохимия, 2006, 71,№2, 75-82

4) Pletjushkina O.Y., Fetisova ЕК., Lvamzaev KG.. Ivanova O.Y, Domnina L.V., Vyssokikh M.Y., Pustovidko A V., Vasiliev J.M, Murphy M P , Chernyak B.V., Skulachev V.P. «Longdistance apoptotic ¡ailing of cells is mediated by hydrogen peroxide in a mitochondrial ROS-dependent fashion» Cell Death Differ., 2005,12,1442-4.

5) Черняк Б В., Плепошкина О.Ю, Изюмов Д.С., Лямзаев К Г.. Аветисян А В «Биоэнергетикой смерть», Биохимия, 2005,70,№2,294-301.

6) Lvamzaev K.G. Pletjushkina O.Y., Sapninova V.B, Bakeeva L E., Chernyak B.V., Skulachev V.P. «Selective elimination of mitochondria from living cells induced by inhibitors of bioenergetic functions» Biochem. Soc. Trans., 2004,32,1070-1

7) Lvamzaev K.G, Izyumov D.S., Avetisyan A.V., Yang F., Pletjushkina O.Y, Chernyak B.V «Inhibition of mitochondrial bioenergetics- the effects on structure ofmitochondria in the cell and on apoptosts» Acta Biochim Pol., 2004,51,553-62.

8) Изюмов Д С, Лямзаев К Г. Аветисян А В , Плетюшкина О Ю., Черняк Б В «Индукция апоптоза митохондриапьными ингибиторами» Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", ПУЩИНО, 16-18 июня, 2003, стр165

9) Pletjushkina O.Yu, Lvamzaev K.G . Izyumov D.S., Bakeeva L.E, Saprunova L.V., Chernyak B.V, Skulachev V.P. «Selective elimination of mitochondria ("mitoptosis") induced by the inhibitors of respiration and uncouplers» 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, WARSAW, POLAND, 26 June - 1 July , 2004, p 56

10) Pletjushkina О Yu, Lvamzaev К G . Saprunova V. В., Bakeeva L. E , Fuyu Y, Chernyak В V, Skulachev V. P. «Thread-grain transition of mitochondrial reticulum as a step of mitoptosis and apoptosis». 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies WARSAW, POLAND, 29 June-1 July, 2004, p 136

11) Chernyak В V , Izyumov D S , Avetisyan A V , Lvamzaev К G . Pletjushkina O.Y., Skulachev

V P «Inhibitors of mitochondrial bioenergetics in studies on structure of mitochondria in the cell, oxidative stress and apoptosis» 13th European Bioenergetics Conference August 21-26, PISA, ITALY, 2004, 2D,p 5

12) Lvamzaev К G . Pletjushkina О Y , Saprunova V В Bakeeva L E , Chernyak В V, Skulachev

V P «Selective elimination of mitochondria from living cell induced by inhibitors of bioenergetic functions» BioScience2004 - from molecules to organisms, SECC, GLASGOW, UK 18-22 July, 2004, p 186

13) Skulachev V P , Fetisova E К, Pletjushkina О Yu , Lvamzaev К G . Ivanova О Yu , Domnina L V , Vyssokikh M Yu , Pustovidko A V , Alexeevsky A A, Alexeevsky D A , Vasiliev J M, Murphy MP., Chernyak BV «Hydrogen peroxide, a long-distance apoptotic signal» 12|Ь Euroconference on Apoptosis CHANIA, GREECE, September 17-20, 2004, p 156

14)Lvamzaev KG . Domnina L V., Ivanova O.Yu , Skulachev IV Chernyak BV, Pletjushkina O.Yu «Fragmentation of mitochondrial network could be induced by reactive oxygen species produced by respiratory chain» 13th Euroconference on Apoptosis, BUDAPEST, HUNGARY, 1-4 October, 2005

15)Chemyak B V, Izyumov D S , Lvamzaev K G . Pletjushkina O.Yu «Mitochondria are involved in development of oxidative stress» 14* Euroconference on Apoptosis, CHIA, SARDINIA, Italy 29-September-4 October, 2006

16) Pletjushkina O Yu, Lvamzaev K G . Popova E, Nepryakhina O, Ivanova O Yu, Domnina L V, Chernyak B.V. «Reactive oxygen species affects structural and functional unity of mitochondrial network» 14th Euroconference on Apoptosis, CHIA, SARDINIA, Italy 29-September-4 October, 2006

17) Lvamzaev K G. Pletjushkina O.Yu, Chernyak B V «Selective elimination of mitochondria in HeLa cells during prolong treatment with mitochondrial inhibitors» 14th European Bioenergetics Conference, MOSCOW, RUSSIA, July 22-27, 2006, p 521

18) Chernyak B V., Izyumov D S , Lvamzaev K G . Pletjushkina O.Yu , Antonenko Y N , Sakharov D V , Wirtz K W , Skulachev V.P. «Production of reactive oxygen species in mitochondria of Hela cells under oxidative stress» 14th European Bioenergetics Conference, MOSCOW, RUSSIA, July 22-27, 2006,p IIS

19) Pletjushkina O Yu, Lvamzaev K G . Popova E, Nepryakhina O., Ivanova O Yu, Domnina L V, Chernyak B V. «.Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum» 14th European Bioenergetics Conference, MOSCOW, RUSSIA, July 22-27, 2006, p 126

20) Nepryakhina O , Lvamzaev K G . Pletjushkina O.Yu , Skulachev I V , Domnina L V , Ivanova O Yu, Chernyak B.V. «Intramitochondrial reactive oxygen species are important for dynamics of mitochondrial reticulum m living celh»U* European Bioenergetics Conference, MOSCOW, RUSSIA, July 22-27, 2006, p 526

Принято к исполнению 08/02/2007 Исполнено 09/02/2007

Заказ № 88 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 улу\У аШогеГега! ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лямзаев, Константин Геннадьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Генерация АФК дыхательной цепью митохондрий.

Генерация АФК в комплексе 1.

Генерация АФК в комплексе III.

Механизмы адаптации к окислительному стрессу.

Влияние АФК на сигнальные каскады и клеточную гибель.

Морфология митохондриального ретмкулума.

Белки, участвующие в слиянии митохондрий.

Модель слияния митохондрий.

Фрагментация митохондрий.

Взаимодействие белков участвующих во фрагментации митохондрий.

Регуляция белков участвующих во фрагментации митохондрий.

Фрагментация митохондрий при апоптозе.

Избирательное уничтожение митохондрий («митоптоз»).

Избирательное уничтожение митохондрий в процессе дифференцировки. а) Участие 15-липоксигеназы. б) Убиквитирование и АТФ зависимый протеолиз. в) Аутофагия и экзоцитоз митохондрий.

Избирательное уничтожение митохондрий при патологиях.

Избирательное уничтожение митохондрий в процессе запрограммированной гибели клеток.

Аутофагия.

Механизм формирования аутофагосом.

Аутофагия при патологиях.

Маркеры, определяющие специфичность аутофагии митохондрий.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования.

Замораживание и размораживание клеток.

Трансфекция клеток.

Регистрация дыхания клеток.

Визуализация митохондрий, аутофагосом и цитоскелета.

Определение клеточной гибели.

Электронная микроскопия.

Сканирующая электронная микроскопия.

Измерение продукции АФК и мембранного потенциала.

Измерение концентрации пероксида водорода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Характеристика клеток линии НеЬа.

Индукция гибели клеток НеЬа пероксидом водорода.

Пероксид водорода стимулирует митохондриальную продукцию АФК.

Участие митохондриальных АФК в передаче апоптозного сигнала между клетками.

Окислительный стресс вызывает фрагментацию митохондриального ретикулума.

Деградация поврежденных митохондрий при окислительном стрессе.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Митохондрии при окислительном стрессе в культуре клеток HeLa"

Реакция клетки на окислительный стресс включает целый ряд защитных механизмов. Прежде всего, происходит активация и дополнительная экспрессия многочисленных антиоксидантных систем, частьиз которых направлена на защиту митохондрий. Поврежденные митохондрии представляют значительную опасность для клетки и как источники АФК, и как потребители КАО(Р)Н и АТФ, поэтому существуют механизмы служащие для уничтожения таких органелл. Наконец, в случае исчерпания всех возможностей защиты, в клетке может запускаться программа гибели (апоптоз), позволяющая избежать распространения стресса в окружающих тканях. Так, в 1998 году В.П. Скулачевым была высказана гипотеза о том, что пероксид водорода, образующийся в процессе гибели клеток, может служить сигналом, вызывающим гибель соседних клеток (БкиЬскеу 1998). Такая передача сигнала может быть одним из механизмов защиты организма от заражения патогенами. К примеру, при локализованной вирусной инфекции вокруг зоны размножения вируса может возникать зона мертвых клеток, предотвращающая распространение инфекции по всему организму. Кроме того, передача сигнала апоптоза играет важную роль в терапии опухолей. Индукция апоптоза в опухоли под действием цитотоксических химиопрепаратов или облучения может затронуть лишь часть клеток, а гибель остальных произойдет под действием перекиси водорода. При этом могут быть уничтожены даже опухолевые клетки, защищенные от апоптоза, вызываемого цитотоксическими препаратами (например, в результате мутаций в сигнальных путях, зависимых от белков р53 или Шэ, как в случае клеток НеЬа), в то время как апоптоз, индуцированный Н2О2, не требует передачи сигнала по этим путям. Основной механизм гибели клеток в этом случае, вероятно, связан с окислительным повреждением митохондрий под действием внешней Н2С>2, что стимулирует продукцию «вторичных» АФК митохондриями и таким образом вызывает апоптоз клетки.

Исследования в этой области представляют большой интерес в связи с тем, что окислительный стресс, сопровождающийся повреждением митохондрий, наблюдается при многих серьезных патологиях, представляющих собой актуальную проблему для здравоохранения, в частности при инфарктах, инсультах, нейродегенеративных заболеваниях.

Выяснение роли нарушения биоэнергетических функций митохондрий в индукции окислительного стресса, а также изучение механизмов защиты клетки от повышенной продукции АФК митохондриями позволит более эффективно бороться с этими заболеваниями.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯЦель данной работы - исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса, а также клеточного ответа на стресс.

Основными задачами работы является:1. Исследование роли митохондрий в окислительном стрессе и апоптозе, вызванных пероксидом водорода.

2. Исследование механизмов передачи сигнала гибели от апоптозных клеток к соседним клеткам.

3. Изучение процесса избирательного уничтожения митохондрий в условиях, когда их биоэнергетические функции нарушены.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лямзаев, Константин Геннадьевич

выводы

1) В условиях окислительного стресса, вызванного Н202, в клетках происходит генерация АФК митохондриями. Основным источником АФК, вероятно, является флавиновый компонент комплекса I дыхательной цепи. Митохондриальная продукция АФК вызывает апоптотическую гибель клеток.

2) Апоптоз, вызванный ФНО или Н202, сопровождается образованием Н202 при участии митохондрий. Выход Н202 в среду служит сигналом, вызывающим гибель соседних клеток. Основной мишенью для Н202 в этих клетках служат митохондрии.

3) Ингибиторы дыхания и Н202, стимулируют фрагментацию митохондриалыюго ретикулума. Фрагментация митохондрий опосредована повышением уровня АФК, генерируемых дыхательной цепью и может быть обратима.

4) Митохондриально-направленный антиоксидант МитоС) предотвращает накопление АФК, фрагментацию митохондрий и гибель клеток при окислительном стрессе.

5) Повышенная продукция АФК митохондриями в сочетании с падением мембранного потенциала вызывает фрагментацию, кластеризацию и деградацию митохондрий (т.н. митоптоз). Основным механизмом митоптоза в этих условиях является выбрасывание митохондрий из клетки, вероятно, путём экзоцитоза. Предполагается, что митоптоз является механизмом защиты клеток от окислительного стресса и гидролиза АТФ, вызванного нарушением биоэнергетических функций митохондрий.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю академику В.П. Скулачёву и научному консультанту Б. В. Черняку за полученные знания, заботу, внимание и ценные советы, во время выполнения диссертациооного исследования. Особую благодарность выражаю О. 10. Плетюшкиной за помощь в освоении методов, плодотворные дискуссии, за постоянную поддержку и терпение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лямзаев, Константин Геннадьевич, Москва

1. Abeliovich, H., С. Zhang, W. A. Dunn, Jr., К. M. Shokat, and D. J. Klionsky. 2003. Chemical genetic analysis of Apgl reveals a non-kinase role in the induction of autophagy. Mol Biol Cell 14: 477-90.

2. Amutha, В., D. M. Gordon, Y. Gu, and D. Pain. 2004. A novel role of Mgmlp, a dynamin-related GTPase, in ATP synthase assembly and cristae formation/maintenance. Biochem J 381: 19-23.

3. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. 2005. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия 70: №2, 246-265

4. Anglade, P., S. Vyas, F. Javoy-Agid, M. T. Herrero, P. P. Michel, J. Marquez, A. Mouatt-Prigent, M. Ruberg, E. C. Hirsch, and Y. Agid. 1997. Apoptosis and autophagy in nigral neurons of patients with Parkinson's disease. Histol Histopathol 12: 25-31.

5. Arnoult, D., A. Grodet, Y. J. Lee, J. Estaquier, and C. Blackstone. 2005a. Release of OPA1 during apoptosis participates in the rapid and complete release of cytochrome с and subsequent mitochondrial fragmentation. J Biol Chem 280: 35742-50.

6. Arnoult, D., B. Gaume, M. Karbowski, J. C. Sharpe, F. Cecconi, and R. J. Youle. 2003. Mitochondrial release of AIF and EndoG requires caspase activation downstream of Bax/Bak-mediated permeabilization. Embo J 22: 4385-99.

7. Attardi, G., and G. Schatz. 1988. Biogenesis of mitochondria. Annu Rev Cell Biol 4: 289-333.

8. Azevedo, D., F. Tacnet, A. Delaunay, C. Rodrigues-Pousada, and M. B. Toledano. 2003. Two redox centers within Yapl for H202 and thiol-reactive chemicals signaling. Free Radic Biol Med 35: 889-900.

9. Bae, Y. S., S. W. Kang, M. S. Seo, I. C. Baines, E. Tekle, P. B. Chock, and S. G. Rhee. 1997. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J Biol Chem 272: 217-21.

10. Bae, Y. S., J. Y. Sung, O. S. Kim, Y. J. Kim, K. C. Hur, A. Kazlauskas, and S. G. Rhee. 2000. Platelet-derived growth factor-induced H(2)0(2) production requires the activation of phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem 275: 10527-31.

11. Baeuerle, P. A., and T. Henkel. 1994. Function and activation of NF-kappa B in the immune system. Annu Rev Immunol 12: 141-79.

12. Balijepalli, S., J. Annepu, M. R. Boyd, and V. Ravindranath. 1999. Effect of thiol modification on brain mitochondrial complex I activity. Neurosci Lett 272: 203-6.

13. Banaclocha, M. M., A. I. Hernandez, N. Martinez, and M. L. Ferrandiz. 1997. N-acetylcysteine protects against age-related increase in oxidized proteins in mouse synaptic mitochondria. Brain Res 762: 256-8.

14. Barrett, W. C., J. P. DeGnorc, Y. F. Keng, Z. Y. Zhang, M. B. Yim, and P. B. Chock. 1999. Roles of superoxide radical anion in signaltransduction mediated by reversible regulation of protein-tyrosine phosphatase IB. J Biol Chem 274: 34543-6.

15. Barrientos, A., and C. T. Moraes. 1999. Titrating the effects of mitochondrial complex I impairment in the cell physiology. J Biol Chem 274: 16188-97.

16. Bauer, G. 2000. Reactive oxygen and nitrogen species: efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis. Anticancer Res 20: 4115-39.

17. Bautista, J., R. Corpas, R. Ramos, O. Cremades, J. F. Gutierrez, and S. Alcgre. 2000. Brain mitochondrial complex I inactivation by oxidative modification. Biochem Biophys Res Commun 275: 890-4.

18. Bercovich, B., I. Stancovski, A. Mayer, N. Blumenfeld, A. Laszlo, A. L. Schwartz, and A. Ciechanover. 1997. Ubiquitin-dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70. J Biol Chem 272: 9002-10.

19. Berg, P. A., and R. Klein. 1992. Antimitochondrial antibodies in primary biliary cirrhosis. A clue to its etiopathogenesis? J Hepatol 15: 6-9.

20. Betarbet, R., T. B. Sherer, G. MacKenzie, M. Garcia-Osuna, A. V. Panov, and J. T. Greenamyre. 2000. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nat Neurosci 3: 1301-6.

21. Bleazard, W., J. M. McCaffery, E. J. King, S. Bale, A. Mozdy, Q. Tieu, J. Nunnari, and J. M. Shaw. 1999. The dynamin-related GTPase Dnml regulates mitochondrial fission in yeast. Nat Cell Biol 1: 298-304.

22. Bolwell, G. P., L. V. Bindschcdler, K. A. Blee, V. S. Butt, D. R. Davies, S. L. Gardner, C. Gerrish, and F. Minibayeva. 2002. The apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three-component system. J Exp Bot 53: 1367-76.

23. Borutaite, V., and G. C. Brown. 2006. S-nitrosothiol inhibition of mitochondrial complex I causes a reversible increase in mitochondrial hydrogen peroxide production. Biochim Biophys Acta 1757: 562-6.

24. Bovcris, A., E. Cadenas, and A. O. Stoppani. 1976. Role of ubiquinone in the mitochondrial generation of hydrogen peroxide. Biochem J 156: 435-44.

25. Branco, M. R., H. S. Marinho, L. Cyrne, and F. Antuncs. 2004.

26. Decrease of H202 plasma membrane permeability during adaptation to H202 in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 279: 6501-6.

27. Bruckdorfer, R. 2005. The basics about nitric oxide. Mol Aspects Med 26:3-31.

28. Camougrand, N., A. Grelaud-Coq, E. Marza, M. Priault, J. J. Bessoule, and S. Manon. 2003. The product of the UTH1 gene, required for Bax-induced cell death in yeast, is involved in the response to rapamycin. Mol Microbiol 47: 495-506.

29. Carlile, G. W., D. H. Smith, and M. Wiedmann. 2004. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood 103: 4310-6.

30. Cereghctti, G. M., and L. Scorrano. 2006. The many shapes of mitochondrial death. Oncogene 25: 4717-24.

31. Cerveny, K. L., and R. E. Jensen. 2003. The WD-repeats of Net2p interact with Dnmlp and Fislp to regulate division of mitochondria. Mol Biol Cell 14:4126-39.

32. Cerveny, K. L., J. M. McCaffery, and R. E. Jensen. 2001. Division of mitochondria requires a novel DMN1-interacting protein, Net2p. Mol Biol Cell 12:309-21.

33. Chen, H., A. Chomyn, and D. C. Chan. 2005. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J Biol Chem 280: 26185-92.

34. Chen, H., S. A. Detmer, A. J. Ewald, E. E. Griffin, S. E. Fraser, and D. C. Chan. 2003. Mitofusins Mfnl and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. J Cell Biol 160: 189-200.

35. Chinopoulos, C., and V. Adam-Vizi. 2001. Mitochondria deficient in complex I activity are depolarized by hydrogen peroxide in nerve terminals: relevance to Parkinson's disease. J Neurochem 76: 302-6.

36. Cipolat, S., O. Martins de Brito, B. Dal Zilio, and L. Scorrano. 2004. OPA1 requires mitofusin 1 to promote mitochondrial fusion. Proc Natl Acad SciUSA 101: 15927-32.

37. Clement, M. V., and S. Pervaiz. 1999. Reactive oxygen intermediates regulate cellular response to apoptotic stimuli: an hypothesis. FreeRadic Res 30: 247-52.

38. Crofts, A. R., S. Hong, N. Ugulava, B. Barqucra, R. Gcnnis, M. Guergova-Kuras, and E. A. Berry. 1999. Pathways for proton release during ubihydroquinone oxidation by the bc(l) complex. Proc Natl Acad Sci US A 96: 10021-6.

39. Cuezva, J. M., M. Krajcwska, M. L. dc Hercdia, S. Krajewski, G. Santamaria, H. Kim, J. M. Zapata, H. Marusawa, M. Chamorro, and J. C. Reed. 2002. The bioenergetic signature of cancer: a marker of tumor progression. Cancer Res 62: 6674-81.

40. De Camilli, P., S. D. Emr, P. S. McPherson, and P. Novick. 1996. Phosphoinositides as regulators in membrane traffic. Science 271: 1533-9.

41. Dc Grey, A. D. 2002. H02*: the forgotten radical. DNA Cell Biol 21: 251-7.

42. De Vos, K. J., V. J. Allan, A. J. Grierson, and M. P. Sheetz. 2005.

43. Mitochondrial function and actin regulate dynamin-related protein 1-dependent mitochondrial fission. Curr Biol 15: 678-83.

44. Debatin, К. M., and P. H. Krammer. 2004. Death receptors in chemotherapy and cancer. Oncogene 23: 2950-66.

45. Delettre, C., G. Lenaers, L. Pclloquin, P. Belenguer, and C. P. Hamel. 2002. OPA1 (Kjer type) dominant optic atrophy: a novel mitochondrial disease. Mol Genet Metab 75: 97-107.

46. Delettre, C., J. M. Griffoin, J. Kaplan, H. Dollfus, B. Lorenz, L. Faivre, G. Lenaers, P. Belenguer, and C. P. Hamel. 2001. Mutation spectrum and splicing variants in the OPA1 gene. Hum Genet 109: 584-91.

47. Демин, О. В., Вестерхов X. В., Холодснко Б.Н. 1998. Математическая модель образования супероксида в bcl комплексе митохондрий. Биохимия, 63: 755-770

48. Denu, J. М., and К. G. Tanner. 1998. Specific and reversible inactivation of protein tyrosine phosphatases by hydrogen peroxide: evidence for a sulfenic acid intermediate and implications for redox regulation. Biochemistry 37: 5633-42.

49. Dickcns, F., and F. Simer. 1930. The metabolism of normal and tumour tissue: The respiratory quotient, and the relationship of respiration to glycolysis. Biochem J 24: 1301-26.

50. Dixon, M. 1971a. The acceptor specificity of flavins and flavoproteins. I. Techniques for anaerobic spectrophotometry. Biochim Biophys Acta 226: 241-58.

51. Dixon, M. 1971b. The acceptor specificity of flavins and flavoproteins. 3. Flavoproteins. Biochim Biophys Acta 226: 269-84.

52. Dixon, M. 1971c. The acceptor specificity of flavins and flavoproteins. II. Free flavins. Biochim Biophys Acta 226: 259-68.

53. Dohm, J. A., S. J. Lee, J. M. Hardwick, R. B. Hill, and A. G. Gittis. 2004. Cytosolic domain of the human mitochondrial fission protein fisl adopts a TPR fold. Proteins 54: 153-6.

54. Droge, W., K. Schulze-Osthoff, S. Mihm, D. Gaiter, H. Schenk, H. P. Eck, S. Roth, and H. Gmunder. 1994. Functions of glutathione and glutathione disulfide in immunology and immunopathology. Faseb J 8: 1131-8.

55. Dubiel, W., M. Muller, and S. Rapoport. 1981. ATP-dependent proteolysis of rat liver mitochondria. Acta Biol Med Ger 40: K25-K29.

56. Dyall, S. D., M. T. Brown, and P. J. Johnson. 2004. Ancient invasions: from endosymbionts to organelles. Science 304: 253-7.

57. Elmore, S. P., T. Qian, S. F. Grissom, and J. J. Lemasters. 2001. The mitochondrial permeability transition initiates autophagy in rat hepatocytes. Faseb J 15: 2286-7.

58. Emerit, J., M. Edeas, and F. Bricaire. 2004. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Biomed Pharmacother 58: 39-46.

59. Eura, Y., N. Ishihara, S. Yokota, and K. Mihara. 2003. Two mitofusin proteins, mammalian homologues of FZO, with distinct functions are both required for mitochondrial fusion. J Biochem (Tokyo) 134: 333-44.

60. Eura, Y., N. Ishihara, T. Oka, and K. Mihara. 2006. Identification of a novel protein that regulates mitochondrial fusion by modulating mitofiisin (Mfn) protein function. J Cell Sei 119: 4913-25.

61. Fariss, M. W., K. F. Bryson, and M. A. Tirmenstein. 1997. Role of cellular thiol status in tocopheryl hemisuccinate cytoprotection against ethyl methanesulfonate-induced toxicity. Biochem Pharmacol 53: 651-61.

62. Fekkcs, P., K. A. Shcpard, and M. P. Yaffc. 2000. Gag3p, an outer membrane protein required for fission of mitochondrial tubules. J Cell Biol 151:333-40.

63. Fleury, C., B. Mignotte, and J. L. Vayssiere. 2002. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie 84: 131-41.

64. Frank, S., B. Gaumc, E. S. Bergmann-Leitner, W. W. Leitncr, E. G. Robert, F. Catez, C. L. Smith, and R. J. Youle. 2001. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell 1:515-25.

65. Fukushima, N. H., E. Brisch, B. R. Kcegan, W. BIcazard, and J. M. Shaw. 2001. The GTPase effector domain sequence of the Dnmlp GTPase regulates self-assembly and controls a rate-limiting step in mitochondrial fission. Mol Biol Cell 12: 2756-66.

66. Furuno, K., T. Ishikawa, K. Akasaki, S. Lee, Y. Nishimura, H. Tsuji, M. Himeno, and K. Kato. 1990. Immunocytochemical study of the surrounding envelope of autophagic vacuoles in cultured rat hepatocytes. Exp Cell Res 189: 261-8.

67. Galluzzi, L., N. Larochette, N. Zamzami, and G. Kroemer. 2006. Mitochondria as therapeutic targets for cancer chemotherapy. Oncogene 25: 4812-30.

68. Gasch, A. P., P. T. Spellman, C. M. Kao, O. Carmel-Harel, M. B. Eisen, G. Storz, D. Botstcin, and P. O. Brown. 2000. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell 11:4241-57.

69. Gasko, O., and D. Danon. 1972. Deterioration and disappearance of mitochondria during reticulocyte maturation. Exp Cell Res 75: 159-69.

70. George, M. D., M. Baba, S. V. Scott, N. Mizushima, B. S. Garrison, Y. Ohsumi, and D. J. Klionsky. 2000. Apg5p functions in the sequestration step in the cytoplasm-to-vacuole targeting and macroautophagy pathways. Mol Biol Cell 11: 969-82.

71. Goglia, F., and V. P. Skulachev. 2003. A function for novel uncoupling proteins: antioxidant defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet. FasebJ 17: 1585-91.

72. Goto, Y., A. Komiyama, Y. Tanabe, Y. Katafuchi, E. Ohtaki, and I. Nonaka. 1990. Myopathy in Marinesco-Sjogren syndrome: an ultrastructural study. Acta Neuropathol (Berl) 80: 123-8.

73. Gozuacik, D., and A. Kimchi. 2004. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism. Oncogene 23: 2891-906.

74. Greenamyrc, J. T., T. B. Shcrcr, R. Betarbct, and A. V. Panov.2001. Complex I and Parkinson's disease. IUBMB Life 52: 135-41.

75. Gricndling, K. K., D. Sorcscu, and M. Ushio-Fukai. 2000.

76. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circ Res 86: 494-501.

77. Griffin, E. E., J. Graumann, and D. C. Chan. 2005. The WD40 protein Caf4p is a component of the mitochondrial fission machinery and recruits Dnmlp to mitochondria. J Cell Biol 170: 237-48.

78. Griffin, E. E., S. A. Dctmcr, and D. C. Chan. 2006. Molecular mechanism of mitochondrial membrane fusion. Biochim Biophys Acta 1763:482-9.

79. Grigolava, I. V., M. Ksenzenko, A. A. Konstantinob, A. N. Tikhonov, and T. M. Kerimov. 1980. Tiron as a spin-trap for superoxide radicals produced by the respiratory chain of submitochondrial particles. Biokhimiia 45: 75-82.

80. Gronowicz, G., H. Swift, and T. L. Steck. 1984. Maturation of the reticulocyte in vitro. J Cell Sci 71: 177-97.

81. GruIIich, C., R. M. Duvoisin, M. Wicdmann, and K. van Lcyen. 2001. Inhibition of 15-lipoxygenase leads to delayed organelle degradation in the reticulocyte. FEBS Lett 489: 51-4.

82. Gucrtin, D. A., and D. M. Sabatini. 2005. An expanding role for mTOR in cancer. Trends Mol Med 11: 353-61.

83. Gus'kova, R. A., Ivanov, II, V. K. Kol'tovcr, V. V. Akhobadze, and A. B. Rubin. 1984. Permeability of bilayer lipid membranes for superoxide (02-.) radicals. Biochim Biophys Acta 778: 579-85.

84. Hales, K. G., and M. T. Fuller. 1997. Developmental^ regulated mitochondrial fusion mediated by a conserved, novel, predicted GTPase. Cell 90: 121-9.

85. Han, Z., Y. R. Chen, C. I. Jones, G. Mccnakshisundaram, J. L. Zwcicr, and B. R. Alcvriadou. 2006. Shear-Induced Reactive Nitrogen

86. Species Inhibit Mitochondrial Respiratory Complex Activities in Cultured Vascular Endothelial Cells. Am J Physiol Cell Physiol.

87. Harder, Z., R. Zunino, and H. McBride. 2004. Sumol conjugates mitochondrial substrates and participates in mitochondrial fission. Curr Biol 14: 340-5.

88. Hardvvick, J. S., and B. M. Sefton. 1995. Activation of the Lck tyrosine protein kinase by hydrogen peroxide requires the phosphorylation of Tyr-394. Proc Natl Acad Sei U S A 92: 4527-31.

89. Hariri, M., G. Millane, M. P. Guimond, G. Guay, J. W. Dennis, and I. R. Nabi. 2000. Biogenesis of multilamellar bodies via autophagy. Mol Biol Cell 11:255-68.

90. Hatefi, Y., and Y. M. Galante. 1977. Dehydrogenase and transhydrogenase properties of the soluble NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sei U S A 74: 846-50.

91. Haunstetter, A., and S. Izumo. 1998. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease. Circ Res 82: 1111-29.

92. Hauptmann, N., J. Grimsby, J. C. Shih, and E. Cadenas. 1996. The metabolism of tyramine by monoamine oxidase A/B causes oxidative damage to mitochondrial DNA. Arch Biochem Biophys 335: 295-304.

93. Hermann, G. J., J. W. Thatcher, J. P. Mills, K. G. Hales, M. T. Fuller, J. Nunnari, and J. M. Shaw. 1998. Mitochondrial fusion in yeast requires the transmembrane GTPase Fzolp. J Cell Biol 143: 359-73.

94. Hcynen, M. J., G. Tricot, and R. L. Verwilghen. 1985. Autophagy of mitochondria in rat bone marrow erythroid cells. Relation to nuclear extrusion. Cell Tissue Res 239: 235-9.

95. Hinshavv, J. E. 2000. Dynamin and its role in membrane fission. Annu Rev Cell Dev Biol 16: 483-519.

96. Irwin, C. C., L. I. Malkin, and H. P. Morris. 1978. Differences in total mitochondrial proteins and proteins synthesized by mitochondria from rat liver and Morris hepatomas 9618A, 5123C, and 5123tc. Cancer Res 38: 1584-8.

97. Ishii, T., K. Itoh, H. Sato, and S. Bannai. 1999. Oxidative stress-inducible proteins in macrophages. Free Radic Res 31: 351-5.

98. Izyumov, D. S., A. V. Avetisyan, O. Y. Pletjushkina, D. V. Sakharov, K. W. Wirtz, B. V. Chernyak, and V. P. Skulachev. 2004. "Wages of fear": transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis. Biochim Biophys Acta 1658: 141-7.

99. James, D. I., P. A. Parone, Y. Mattenberger, and J. C. Martinou. 2003. hFisl, a novel component of the mammalian mitochondrial fission machinery. J Biol Chem 278: 36373-9.

100. Jaroszewski, L., W. Li, and A. Godzik. 2002. In search for more accurate alignments in the twilight zone. Protein Sci 11:1702-13.

101. Johnstone, R. M., M. Adam, J. R. Hammond, L. Orr, and C. Turbide. 1987. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem 262: 9412-20.

102. Kamada, Y., T. Funakoshi, T. Shintani, K. Nagano, M. Ohsumi, and Y. Ohsumi. 2000. Tor-mediated induction of autophagy via an Apgl protein kinase complex. J Cell Biol 150: 1507-13.

103. Kametaka, S., A. Matsuura, Y. Wada, and Y. Ohsumi. 1996. Structural and functional analyses of APG5, a gene involved in autophagy in yeast. Gene 178: 139-43.

104. Kang, D., H. Narabayashi, T. Sata, and K. Takeshige. 1983. Kinetics of superoxide formation by respiratory chain NADH-dehydrogenase of bovine heart mitochondria. J Biochem (Tokyo) 94: 13016.

105. Karbowski, M., S. Y. Jeong, and R. J. Youle. 2004. Endophilin B1 is required for the maintenance of mitochondrial morphology. J Cell Biol 166: 1027-39.

106. Karbowski, M., Y. J. Lee, B. Gaumc, S. Y. Jeong, S. Frank, A. Nechushtan, A. Santel, M. Fuller, C. L. Smith, and R. J. Youle. 2002.

107. Spatial and temporal association of Bax with mitochondrial fission sites, Drpl, and Mfn2 during apoptosis. J Cell Biol 159: 931-8.

108. Karren, M. A., E. M. Coonrod, T. K. Anderson, and J. M. Shaw. 2005. The role of Fislp-Mdvlp interactions in mitochondrial fission complex assembly. J Cell Biol 171: 291-301.

109. Kashiwagi, A., H. Hanada, M. Yabuki, T. Kanno, R. Ishisaka, J. Sasaki, M. Inouc, and K. Utsumi. 1999. Thyroxine enhancement and the role of reactive oxygen species in tadpole tail apoptosis. Free Radic Biol Med 26: 1001-9.

110. Kegel, K. B., M. Kim, E. Sapp, C. Mclntyre, J. G. Castano, N. Aronin, and M. DiFiglia. 2000. Huntingtin expression stimulates endosomal-lysosomal activity, endosome tubulation, and autophagy. J Neurosci 20: 7268-78.

111. Kelso, G. F., C. M. Porteous, G. Hughes, E. C. Ledgerwood, A. M. Ganc, R. A. Smith, and M. P. Murphy. 2002. Prevention of mitochondrial oxidative damage using targeted antioxidants. Ann N Y Acad Sci 959: 26374.

112. Kelso, G. F., C. M. Porteous, C. V. Coulter, G. Hughes, W. K. Porteous, E. C. Ledgerwood, R. A. Smith, and M. P. Murphy. 2001.

113. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells: antioxidant and antiapoptotic properties. J Biol Chem 276: 4588-96.

114. Kennedy, B. K., N. R. Austriaco, Jr., J. Zhang, and L. Guarente. 1995. Mutation in the silencing gene SIR4 can delay aging in S. cerevisiae. Cell 80: 485-96.

115. Kent, G., O. T. Minick, F. I. Volini, and E. Orfei. 1966. Autophagic vacuoles in human red cells. Am J Pathol 48: 831-57.

116. Kiel, J. A., J. A. Komduur, I. J. van der Klei, and M. Veenhuis. 2003. Macropexophagy in Hansenula polymorpha: facts and views. FEBS Lett 549: 1-6.

117. Kihara, A., T. Noda, N. Ishihara, and Y. Ohsumi. 2001. Twodistinct Vps34 phosphatidylinositol 3-kinase complexes function inautophagy and carboxypeptidase Y sorting in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol 152:519-30.

118. Kissova, I., M. Deffieu, S. Manon, and N. Camougrand. 2004. Uthlp is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem 279: 39068-74.

119. Knebel, A., H. J. Rahmsdorf, A. Ullrich, and P. Hcrrlich. 1996. Dephosphorylation of receptor tyrosine kinases as target of regulation by radiation, oxidants or alkylating agents. Embo J 15: 5314-25.

120. Koshiba, T., S. A. Detmer, J. T. Kaiser, H. Chen, J. M. McCaffery, and D. C. Chan. 2004. Structural basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes. Science 305: 858-62.

121. Kotlyar, A. B., V. D. Sled, D. S. Burbaev, I. A. Moroz, and A. D. Vinogradov. 1990. Coupling site I and the rotenone-sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles. FEBS Lett 264: 17-20.

122. Koury, M. J., S. T. Koury, P. Kopsombut, and M. C. Bondurant. 2005. In vitro maturation of nascent reticulocytes to erythrocytes. Blood 105:2168-74.

123. Krishnamoorthy, G., and P. C. Hinkle. 1988. Studies on the electron transfer pathway, topography of iron-sulfur centers, and site of coupling in NADH-Q oxidoreductase. J Biol Chem 263: 17566-75.

124. Krocmer, G., and J. C. Reed. 2000. Mitochondrial control of cell death. Nat Med 6:513-9.

125. Kuge, S., M. Arita, A. Murayama, K. Maeta, S. Izawa, Y. Inouc, and A. Nomoto. 2001. Regulation of the yeast Yaplp nuclear export signal is mediated by redox signal-induced reversible disulfide bond formation. Mol Cell Biol 21: 6139-50.

126. Kuhn, H., J. Belkner, R. Wiesner, and A. R. Brash. 1990. Oxygenation of biological membranes by the pure reticulocyte lipoxygenase. J Biol Chem 265: 18351-61.

127. Kushnareva, Y., A. N. Murphy, and A. Andreyev. 2002. Complex I-mediated reactive oxygen species generation: modulation by cytochrome c and NAD(P)+ oxidation-reduction state. Biochem J 368: 545-53.

128. Labrousse, A. M., M. D. Zappaterra, D. A. Rube, and A. M. van der Bliek. 1999. C. elegans dynamin-related protein DRP-1 controls severing of the mitochondrial outer membrane. Mol Cell 4: 815-26.

129. Lam, E., N. Kato, and M. Lawton. 2001. Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: 848-53.

130. Larsen, K. E., and D. Sulzer. 2002. Autophagy in neurons: a review. Histol Histopathol 17: 897-908.

131. Lassus, P., X. Opitz-Araya, and Y. Lazcbnik. 2002. Requirement for caspase-2 in stress-induced apoptosis before mitochondrial permeabilization. Science 297: 1352-4.

132. Legesse-Miller, A., R. H. Massol, and T. Kirchhausen. 2003. Constriction and Dnmlp recruitment are distinct processes in mitochondrial fission. Mol Biol Cell 14: 1953-63.

133. Legros, F., A. Lombes, P. Frachon, and M. Rojo. 2002. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofiisins. Mol Biol Cell 13: 434354.

134. Lemasters, J. J. 2005. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res 8: 3-5.

135. Lewis, T. S., P. S. Shapiro, and N. G. Ahn. 1998. Signal transduction through MAP kinase cascades. Adv Cancer Res 74: 49-139.

136. Li, N., K. Ragheb, G. Lawler, J. Sturgis, B. Rajwa, J. A. Melendez, and J. P. Robinson. 2003. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem 278: 8516-25.

137. Liang, X. H., J. Yu, K. Brown, and B. Levine. 2001. Beclin 1 contains a leucine-rich nuclear export signal that is required for its autophagy and tumor suppressor function. Cancer Res 61: 3443-9.

138. Liang, X. H., L. K. Kleeman, H. H. Jiang, G. Gordon, J. E. Goldman, G. Berry, B. Herman, and B. Levine. 1998. Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin, a novel Bcl-2-interacting protein. J Virol 72: 8586-96.

139. Liberman, E. A., and V. P. Skulachev. 1970. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion. Biochim Biophys Acta 216: 30-42.

140. Liberman, E. A., V. P. Topaly, L. M. Tsofina, A. A. Jasaitis, and V. P. Skulachev. 1969. Mechanism of coupling of oxidativephosphorylation and the membrane potential of mitochondria. Nature 222: 1076-8.

141. Libcrski, P. P., B. Sikorska, J. Bratosiewicz-Wasik, D. C. Gajdusek, and P. Brown. 2004. Neuronal cell death in transmissible spongiform encephalopathies (prion diseases) revisited: from apoptosis to autophagy. Int J Biochem Cell Biol 36: 2473-90.

142. Liu, Y., G. Fiskum, and D. Schubert. 2002. Generation of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain. J Neurochem 80: 780-7.

143. Loffler, M., C. Becker, E. Wegerle, and G. Schuster. 1996.

144. Catalytic enzyme histochemistry and biochemical analysis of dihydroorotate dehydrogenase/oxidase and succinate dehydrogenase in mammalian tissues, cells and mitochondria. Histochem Cell Biol 105: 119-28.

145. Lundberg, A. S., W. C. Hahn, P. Gupta, and R. A. Weinberg. 2000. Genes involved in senescence and immortalization. Curr Opin Cell Biol 12: 705-9.

146. Lyng, F. M., C. B. Seymour, and C. Mothersill. 2000. Production of a signal by irradiated cells which leads to a response in unirradiated cells characteristic of initiation of apoptosis. Br J Cancer 83: 1223-30.

147. Marino, G., and C. Lopez-Otin. 2004. Autophagy: molecular mechanisms, physiological functions and relevance in human pathology. Cell Mol Life Sci 61: 1439-54.

148. Matsui, M., A. Yamamoto, A. Kuma, Y. Ohsumi, and N. Mizushima. 2006. Organelle degradation during the lens and erythroid differentiation is independent of autophagy. Biochem Biophys Res Commun 339: 485-9.

149. Matsui, M., M. Oshima, H. Oshima, K. Takaku, T. Maruyama, J. Yodoi, and M. M. Taketo. 1996. Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse thioredoxin gene. Dev Biol 178: 179-85.

150. McConnell, S. J., L. C. Stewart, A. Talin, and M. P. Yaffe. 1990.

151. Temperature-sensitive yeast mutants defective in mitochondrial inheritance. J Cell Biol 111:967-76.

152. McFarland, R., R. W. Taylor, and D. M. Turnbull. 2007. Mitochondrial disease-its impact, etiology, and pathology. Curr Top Dev Biol 77: 113-55.

153. McQuibban, G. A., S. Saurya, and M. Freeman. 2003.

154. Mitochondrial membrane remodelling regulated by a conserved rhomboid protease. Nature 423: 537-41.

155. Meeusen, S., J. M. McCaffery, and J. Nunnari. 2004. Mitochondrial fusion intermediates revealed in vitro. Science 305: 1747-52.

156. Menzies, R. A., and P. H. Gold. 1971. The turnover of mitochondria in a variety of tissues of young adult and aged rats. J Biol Chem 246: 24259.

157. Messerschmitt, M., S. Jakobs, F. Vogel, S. Fritz, K. S. Dimmer, W. Neupert, and B. Westermann. 2003. The inner membrane protein Mdm33 controls mitochondrial morphology in yeast. J Cell Biol 160: 553-64.

158. Minamikawa, T., A. Sriratana, D. A. Williams, D. N. Bowser, J. S. Hill, and P. Nagley. 1999. Chloromethyl-X-rosamine (MitoTracker Red) photosensitises mitochondria and induces apoptosis in intact human cells. J Cell Sci 112 (Pt 14): 2419-30.

159. Miwa, S., and M. D. Brand. 2003. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans 31: 1300-1.

160. Mizushima, N., T. Noda, and Y. Ohsumi. 1999. Apgl6p is required for the function of the Apgl2p-Apg5p conjugate in the yeast autophagy pathway. Embo J 18: 3888-96.

161. Mizushima, N., H. Sugita, T. Yoshimori, and Y. Ohsumi. 1998a. A new protein conjugation system in human. The counterpart of the yeast

162. Apgl2p conjugation system essential for autophagy. J Biol Chem 273: 33889-92.

163. Mizushima, N., T. Noda, T. Yoshimori, Y. Tanaka, T. Ishii, M. D. George, D. J. Klionsky, M. Ohsumi, and Y. Ohsumi. 1998b. A protein conjugation system essential for autophagy. Nature 395: 395-8.

164. Mothcrsill, C., and C. Seymour. 2003. Radiation-induced bystander effects, carcinogenesis and models. Oncogene 22: 7028-33.

165. Motoyama, N., T. Kimura, T. Takahashi, T. Watanabe, and T. Nakano. 1999. bcl-x prevents apoptotic cell death of both primitive and definitive erythrocytes at the end of maturation. J Exp Med 189: 1691-8.

166. Moye-Rowley, W. S. 2002. Transcription factors regulating the response to oxidative stress in yeast. Antioxid Redox Signal 4: 123-40.

167. Mozdy, A. D., J. M. McCaffery, and J. M. Shaw. 2000. Dnmlp GTPase-mediated mitochondrial fission is a multi-step process requiring the novel integral membrane component Fislp. J Cell Biol 151: 367-80.

168. Muller, F. L., Y. Liu, and II. Van Remmen. 2004. Complex III releases superoxide to both sides of the inner mitochondrial membrane. J Biol Chem 279: 49064-73.

169. Nakamura, H., K. Nakamura, and J. Yodoi. 1997. Redox regulation of cellular activation. Annu Rev Immunol 15: 351-69.

170. Nakamura, K., T. Hori, N. Sato, K. Sugie, T. Kawakami, and J. Yodoi. 1993. Redox regulation of a src family protein tyrosine kinase p561ck in T cells. Oncogene 8:3133-9.

171. Nemoto, Y., and P. De Camilli. 1999. Recruitment of an alternatively spliced form of synaptojanin 2 to mitochondria by the interaction with the PDZ domain of a mitochondrial outer membrane protein. Embo J 18: 29913006.

172. Nishino, I. 2003. Autophagic vacuolar myopathies. Curr Neurol Neurosci Rep 3: 64-9.

173. Ogier-Denis, E., and P. Codogno. 2003. Autophagy: a barrier or an adaptive response to cancer. Biochim Biophys Acta 1603: 113-28.

174. Ohsumi, Y. 2001. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 211-6.

175. Okamoto, K., and J. M. Shaw. 2005. Mitochondrial morphology and dynamics in yeast and multicellular eukaryotes. Annu Rev Genet 39: 50336.

176. Osteryoung, K. W., and J. Nunnari. 2003. The division of endosymbiotic organelles. Science 302: 1698-704.

177. Otsuga, D., B. R. Keegan, E. Brisch, J. W. Thatcher, G. J. Hermann, W. Bleazard, and J. M. Shaw. 1998. The dynamin-related GTPase, Dnmlp, controls mitochondrial morphology in yeast. J Cell Biol 143:333-49.

178. Owuor, E. D., and A. N. Kong. 2002. Antioxidants and oxidants regulated signal transduction pathways. Biochem Pharmacol 64: 765-70.

179. Paradics, G., G. Pctrosillo, M. Pistolcsc, N. Di Venosa, A. Federici, and F. M. Ruggicro. 2004. Decrease in mitochondrial complex I activity in ischemic/reperfused rat heart: involvement of reactive oxygen species and cardiolipin. Circ Res 94: 53-9.

180. Petiot, A., E. Ogicr-Dcnis, E. F. Blommaart, A. J. Meijer, and P. Codogno. 2000. Distinct classes of phosphatidylinositol 3'-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells. J Biol Chem 275: 992-8.

181. Piper, R. C., and J. P. Luzio. 2001. Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. Traffic 2: 612-21.

182. Pitts, K. R., Y. Yoon, E. W. Krueger, and M. A. McNiven. 1999. The dynamin-like protein DLP1 is essential for normal distribution and morphology of the endoplasmic reticulum and mitochondria in mammalian cells. Mol Biol Cell 10:4403-17.

183. Praefcke, G. J., and H. T. McMahon. 2004. The dynamin superfamily: universal membrane tubulation and fission molecules? Nat Rev Mol Cell Biol 5: 133-47.

184. Rao, G. N. 1996. Hydrogen peroxide induces complex formation of SHC-Grb2-SOS with receptor tyrosine kinase and activates Ras and extracellular signal-regulated protein kinases group of mitogen-activated protein kinases. Oncogene 13: 713-9.

185. Rapoport, S., J. Schmidt, and S. Prehn. 1985. Maturation of rabbit reticulocytes: susceptibility of mitochondria to ATP-dependent proteolysis is determined by the maturational state of reticulocyte. FEBS Lett 183: 370-4.

186. Raught, B., A. C. Gingras, and N. Sonenberg. 2001. The target of rapamycin (TOR) proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 7037-44.

187. Ravikumar, B., and D. C. Rubinsztein. 2004. Can autophagy protect against neurodegeneration caused by aggregate-prone proteins? Neuroreport 15:2443-5.

188. Reznikov, K., L. Kolcsnikova, A. Pramanik, K. Tan-No, I. Gilcva, T. Yakovlcva, R. Riglcr, L. Terenius, and G. Bakalkin. 2000. Clustering of apoptotic cells via bystander killing by peroxides. Faseb J 14: 1754-64.

189. Ricci, J. E., R. A. Gottlieb, and D. R. Green. 2003. Caspase-mediated loss of mitochondrial function and generation of reactive oxygen species during apoptosis. J Cell Biol 160: 65-75.

190. Rich, P. R., and W. D. Bonner. 1978. The sites of superoxide anion generation in higher plant mitochondria. Arch Biochem Biophys 188: 20613.

191. Riobo, N. A., E. Clcmcnti, M. Mclani, A. Boveris, E. Cadcnas, S. Moncada, and J. J. Poderoso. 2001. Nitric oxide inhibits mitochondrial NADH:ubiquinone reductase activity through peroxynitrite formation. Biochem J 359: 139-45.

192. Sachi, Y., K. Hirota, H. Masutani, K. Toda, T. Okamoto, M. Takigawa, and J. Yodoi. 1995. Induction of ADF/TRX by oxidative stress in keratinocytes and lymphoid cells. Immunol Lett 44: 189-93.

193. Santel, A., and M. T. Fuller. 2001. Control of mitochondrial morphology by a human mitofusin. J Cell Sei 114: 867-74.

194. Sato, H., M. Tamba, T. Ishii, and S. Bannai. 1999. Cloning and expression of a plasma membrane cystine/glutamate exchange transporter composed of two distinct proteins. J Biol Chem 274: 11455-8.

195. Satoh, M., T. Hamamoto, N. Sco, Y. Kagawa, and H. Endo. 2003. Differential sublocalization of the dynamin-related protein OPA1 isoforms in mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 300: 482-93.

196. Schewc, T., S. M. Rapoport, and H. Kuhn. 1986. Enzymology and physiology of reticulocyte lipoxygenase: comparison with other lipoxygenases. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 58: 191-272.

197. Schlumpberger, M., E. Schacffcler, M. Straub, M. Bredschneidcr, D. H. Wolf, and M. Thumm. 1997. AUT1, a gene essential for autophagocytosis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 179: 1068-76.

198. Schnurr, K., M. Hellwing, B. Seidemann, P. Jungblut, H. Kuhn, S. M. Rapoport, and T. Schewc. 1996. Oxygenation of biomembranes by mammalian lipoxygenases: the role of ubiquinone. Free Radic Biol Med 20: 11-21.

199. Seglen, P. O., and P. B. Gordon. 1982. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 79: 1889-92.

200. Semenza, G. L., D. Artemov, A. Bedi, Z. Bhujwalla, K. Chiles, D. Feldser, E. Laughner, R. Ravi, J. Simons, P. Taghavi, and H. Zhong. 2001. 'The metabolism of tumours': 70 years later. Novartis Found Symp 240: 251 -60; discussion 260-4.

201. Sesaki, H., and R. E. Jensen. 2001. UGOl encodes an outer membrane protein required for mitochondrial fusion. J Cell Biol 152: 112334.

202. Sesaki, H., and R. E. Jensen. 2004. Ugolp links the Fzolp and Mgmlp GTPases for mitochondrial fusion. J Biol Chem 279: 28298-303.

203. Shaw, J. M., and J. Nunnari. 2002. Mitochondrial dynamics and division in budding yeast. Trends Cell Biol 12: 178-84.

204. Sidoti-dc Fraisse, С., V. Rincheval, Y. Risler, B. Mignotte, and J. L. Vayssiere. 1998. TNF-alpha activates at least two apoptotic signaling cascades. Oncogene 17: 1639-51.

205. Sik, A., B. J. Passer, E. V. Koonin, and L. Pellegrini. 2004. Self-regulated cleavage of the mitochondrial intramembrane-cleaving protease PARL yields Pbeta, a nuclear-targeted peptide. J Biol Chem 279: 15323-9.

206. Simonnet, H., N. Alazard, K. Pfeiffer, С. Gallou, С. Beroud, J. Demont, R. Bouvier, H. Schagger, and C. Godinot. 2002. Low mitochondrial respiratory chain content correlates with tumor aggressiveness in renal cell carcinoma. Carcinogenesis 23: 759-68.

207. Simpson, C. F., and J. M. Kling. 1967. The mechanism of denucleation in circulating erythroblasts. J Cell Biol 35: 237-45.

208. Skulachev, V. P. 1996. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide-producing mitochondria and cell. FEBS Lett 397: 7-10.

209. Skulachev, V. P. 1988. Membrane Bioenergetics. Springer-Verlag New York, Inc

210. Скулачёв В.П. 1998 Возможная роль активных форм кислорода в противовирусной защите. Биохимия 63: 755-770

211. Skulachev, V. Р. 1999. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms. Mol Aspects Med 20: 139-84.

212. Skulachev, V. P. 2001. The programmed death phenomena, aging, and the Samurai law of biology. Exp Gerontol 36: 995-1024.

213. Song, W., and K. E. Zinsmaicr. 2003. Endophilin and synaptojanin hook up to promote synaptic vesicle endocytosis. Neuron 40: 665-7.

214. Starkov, A. A., G. Fiskum, C. Chinopoulos, B. J. Lorenzo, S. E. Browne, M. S. Patel, and M. F. Beal. 2004. Mitochondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex generates reactive oxygen species. J Neurosci 24: 7779-88.

215. Sullivan, S. G., D. T. Chiu, M. Errasfa, J. M. Wang, J. S. Qi, and A. Stern. 1994. Effects of H202 on protein tyrosine phosphatase activity in HER 14 cells. Free Radic Biol Med 16: 399-403.

216. Suzukawa, K., K. Miura, J. Mitsushita, J. Resau, K. Hirose, R. Crystal, and T. Kamata. 2000. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation requires generation of Rac 1-regulated reactive oxygen species. J Biol Chem 275: 13175-8.

217. Suzuki, K., T. Kirisako, Y. Kamada, N. Mizushima, T. Noda, and Y. Ohsumi. 2001. The pre-autophagosomal structure organized by concerted functions of APG genes is essential for autophagosome formation. Embo J 20: 5971-81.

218. Suzuki, M., S. Y. Jeong, M. Karbowski, R. J. Youle, and N. Tjandra. 2003. The solution structure of human mitochondria fission protein Fisl reveals a novel TPR-like helix bundle. J Mol Biol 334: 445-58.

219. Takahashi, M., and K. Asada. 1988. Superoxide production in aprotic interior of chloroplast thylakoids. Arch Biochem Biophys 267: 71422.

220. Takano-Ohmuro, H., M. Mukaida, E. Kominami, and K. Morioka. 2000. Autophagy in embryonic erythroid cells: its role in maturation. Eur J Cell Biol 79: 759-64.

221. Takeshige, K., and S. Minakami. 1979. NADH- and NADPH-dependent formation of superoxide anions by bovine heart submitochondrial particles and NADH-ubiquinone reductase preparation. Biochem J 180: 12935.

222. Tanner, A., B. H. Shen, and J. F. Dice. 1997. Turnover of F1F0-ATP synthase subunit 9 and other proteolipids in normal and Batten disease fibroblasts. Biochim Biophys Acta 1361: 251-62.

223. Tassa, A., M. P. Roux, D. Attaix, and D. M. Bechet. 2003. Class III phosphoinositide 3-kinaseBeclinl complex mediates the amino acid-dependent regulation of autophagy in C2C12 myotubes. Biochem J 376: 577-86.

224. Tieu, Q., and J. Nunnari. 2000. Mdvlp is a WD repeat protein that interacts with the dynamin-related GTPase, Dnmlp, to trigger mitochondrial division. J Cell Biol 151:353-66.

225. Tieu, Q., V. Okreglak, K. Naylor, and J. Nunnari. 2002. The WD repeat protein, Mdvlp, functions as a molecular adaptor by interacting with Dnmlp and Fislp during mitochondrial fission. J Cell Biol 158: 445-52.

226. Tolkovsky, A. M., L. Xue, G. C. Fletcher, and V. Borutaite. 2002. Mitochondrial disappearance from cells: a clue to the role of autophagy in programmed cell death and disease? Biochimie 84: 233-40.

227. Tompkins, A. J., L. S. Burwell, S. B. Digerness, C. Zaragoza, W. L. Holman, and P. S. Brookes. 2006. Mitochondrial dysfunction in cardiac ischemia-reperfusion injury: ROS from complex I, without inhibition. Biochim Biophys Acta 1762: 223-31.

228. Tooze, J., and H. G. Davies. 1965. Cytolysomes in Amphibian Erythrocytes. J Cell Biol 24: 146-50.

229. Trumpower, B. L. 1990. The protonmotive Q cycle. Energy transduction by coupling of proton translocation to electron transfer by the cytochrome bcl complex. J Biol Chem 265: 11409-12.

230. Turrens, J. F. 2003. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol 552: 335-44.

231. Turrens, J. F., and A. Boveris. 1980. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem J 191: 421-7.

232. Turunen, M., J. Olsson, and G. Dallner. 2004. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochim Biophys Acta 1660: 171-99.

233. Ushio-Fukai, M., R. W. Alexander, M. Akers, Q. Yin, Y. Fujio, K. Walsh, and K. K. Griendling. 1999. Reactive oxygen species mediate the activation of Akt/protein kinase B by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 274: 22699-704.

234. Vasquez-Vivar, J., В. Kalyanaraman, and M. C. Kennedy. 2000.

235. Mitochondrial aconitase is a source of hydroxyl radical. An electron spin resonance investigation. J Biol Chem 275: 14064-9.

236. Venkatraman, P., R. Wetzel, M. Tanaka, N. Nukina, and A. L. Goldberg. 2004. Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences and release them during degradation of polyglutamine-containing proteins. Mol Cell 14:95-104.

237. Виноградов А.Д. 2001 Комплекс I дыхательной цепи: структура, редокс компоненты и возможные механизмы трансформации энергии. Биохимия 66: 1346-1361

238. Виноградов А.Д., Гривенникова В.Г. 2005 Генерация супероксид-радика NADH: убихинон оксидоредуктазой митохондрий сердца. Биохимия 10: 150-160

239. Wallace, D. C. 2005. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet 39: 359-407.

240. Walton, J., and J. McAvoy. 1984. Sequential structural response of lens epithelium to retina-conditioned medium. Exp Eye Res 39: 217-29.

241. Watson, A., and F. J. Doherty. 1994. Calcium promotes membrane association of reticulocyte 15-lipoxygenase. Biochem J 298 (Pt 2): 377-83.

242. Whatley, S. A., D. Curti, and R. M. Marchbanks. 1996.

243. Mitochondrial involvement in schizophrenia and other functional psychoses. Neurochem Res 21: 995-1004.

244. Wood, M. J., G. Storz, and N. Tjandra. 2004. Structural basis for redox regulation of Yapl transcription factor localization. Nature 430: 91721.

245. Wurmser, A. E., and S. D. Emr. 2002. Novel PtdIns(3)P-binding protein Etfl functions as an effector of the Vps34 Ptdlns 3-kinase in autophagy. J Cell Biol 158: 761-72.

246. Xue, L., G. C. Fletcher, and A. M. Tolkovsky. 2001. Mitochondria are selectively eliminated from eukaryotic cells after blockade of caspases during apoptosis. Curr Biol 11: 361-5.

247. Yang, J., X. Liu, K. Bhalla, C. N. Kim, A. M. Ibrado, J. Cai, T. I. Peng, D. P. Jones, and X. Wang. 1997. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 275: 1129-32.

248. Yu, T., R. J. Fox, L. S. Burwell, and Y. Yoon. 2005. Regulation of mitochondrial fission and apoptosis by the mitochondrial outer membrane protein hFisl. J Cell Sci 118: 4141-51.

249. Yue, Z., S. Jin, C. Yang, A. J. Levine, and N. Heintz. 2003. Beclin 1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 1507782.

250. Zermati, Y., C. Garrido, S. Amsellem, S. Fishelson, D. Bouscary, F. Valensi, B. Varet, E. Solary, and O. Hermine. 2001. Caspase activation is required for terminal erythroid differentiation. J Exp Med 193: 247-54.

251. Ziegler, A., M. von Kicnlin, M. Decorps, and C. Remy. 2001. High glycolytic activity in rat glioma demonstrated in vivo by correlation peak 1H magnetic resonance imaging. Cancer Res 61: 5595-600.

Информация о работе

Лямзаев, Константин Геннадьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Митохондрии при окислительном стрессе в культуре клеток HeLa - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы