Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии Mytilus trossulus in vivo и in vitro

Дячук, Вячеслав Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии Mytilus trossulus in vivo и in vitro
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии Mytilus trossulus in vivo и in vitro"

На правах рукописи

ДЯЧУК Вячеслав Алексеевич

МИОГЕННАЯ И НЕЙРОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК ЛИЧИНОК МИДИИ MYTILUS TROSSULUS IN VIVO И IN VITRO

03.00.30 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

OÜ3452G75

Владивосток - 2008

003452675

Работа выполнена в Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Одинцова Нэлия Адольфовна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Долматов Игорь Юрьевич

кандидат биологических наук, доцент

Токмакова Наталья Павловна

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится «5» декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д005.008.01 при Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН, по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17. Телефон: (4232) 310-905, факс: (4232) 310-900, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН. 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан «/» ноября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук йа«/«*'«^ Ващенко М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Выяснение механизмов, контролирующих дифференциацию мышечной и нервной системы, является одной из важнейших проблем современной биологии развития. Большинство исследований миогенеза и нейрогенеза было проведено на позвоночных животных. Однако прогресс, достигнутый в последнее время в изучении развития мышечной и нервной системы некоторых групп беспозвоночных животных, позволил выяснить общие закономерности развития двух систем.

Исследования последнего десятилетия в основном были направлены на выяснение механизмов специализации предшественников мышечных и нервных клеток всего лишь двух модельных объектов: дрозофилы Drosophila melanogaster и нематоды Caenorhabditis elegans. Расширение круга модельных объектов необходимо для понимания как общих, эволюционно консервативных основ миогенеза, так и его особенностей у представителей разных таксонов многоклеточных животных. Особый интерес в этом плане представляют двустворчатые моллюски.

У двустворчатых моллюсков обнаружены поперечно-полосатые, косо-исчерченные и гладкие мышцы. Гладкие мышцы моллюсков - это одна из общепринятых модельных систем для изучения регуляции мышечного сокращения и, в частности, механизма запирательного тонуса, регулируемого нейромедиаторами (Twarog, 1976). Сердцевину толстых нитей таких мышц образует белок парамиозин (Ruegg, 1961), на поверхности которого расположены миозин (Szent-Gyorgyi et а/., 1971), миород (Shelud'ko et at., 1999) и твитчин (Vibert et al., 1993). Предполагают, что фосфорилирование твитчина регулирует запирательный тонус гладких мышц двустворчатых моллюсков (Siegman et al., 1998), а в основе этого явления лежит образование твитчиновых сшивок между толстыми и тонкими нитями (Shelud'ko et al., 2004; 2007). Свойства мышц взрослых моллюсков интенсивно изучаются уже более 40 лет. Однако данные о времени начала дифференцировки, образования зрелых мышечных волок и последующего формирования мышечной системы в онтогенезе моллюска Mytilus trossulus отсутствуют.

Двустворчатые моллюски имеют бифазный жизненный цикл, в котором взрослому животному предшествует стадии свободно плавающих личинок. Очевидное эволюционное преимущество такого цикла -повышенная выживаемость и лучшее расселение потомков. Развитие некоторых двустворчатых моллюсков изучено на уровне электронной микроскопии (Ваупе, 1976; Cragg, 1985; Малахов, Медведева, 1985; Cragg, Crisp, 1991; Флячинская, Кулаковский, 1991). Детальное изучение мышц личинок двустворчатых моллюсков с применением современных методов биохимии и иммунологического маркирования ранее не предпринималось, а данные о взаимодействии мышечной и нервной систем, особенно на ранних этапах развития, отсутствуют. Использование первичной культуры клеток

личинок мидии Mytilus trossulus и современных адекватных маркеров дифференцировки могут помочь заполнить «белые пятна» в исследовании основных этапов развития мышечной и нервной систем моллюсков.

Цель и задачи работы

Целью работы было изучение закономерностей дифференцировки мышечных клеток, формирования мышечной системы и её взаимосвязи с нервной системой в раннем онтогенезе мидии Mytilus trossulus.

В рамках поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• выяснить последовательность появления мышечных белков в развитии мидии;

• определить стадию начала экспрессии гена твитчина в развитии мидии;

• провести детальный морфологический анализ развивающейся мышечной системы личинок мидии;

• установить время появления первых нервных клеток, взаиморасположение мышечных и нейрональных структур в раннем онтогенезе мидии;

• показать, что миогенная и нейрональная программы могут быть воспроизведены в первичной культуре клеток, полученной из личинок мидии премиогенных стадий развития.

Научная новизна и теоретическое значение работы

Впервые установлено, что парамиозин, белок толстых нитей мидии, присутствует в кортексе неоплодотворенных яйцеклеток мидии М. trossulus. Другие белки толстых нитей, твитчин и миозин экспрессируются одновременно в первых мышечных клетках личинок мидии и задолго до начала формирования мышечной системы личинки мидии велигера. Мышцы взрослого моллюска закладываются на стадии раннего велигера и развиваются параллельно с мускулатурой личинки. Показано, что поперечно-полосатые миофибриллы появляются на ранних стадиях развития личинок. Обнаружена кардинальная перестройка мышечной системы личинки во время метаморфоза, в результате которой развивается полноценная гладкая мускулатура взрослых моллюсков, способная к состоянию запирательного тонуса. Показано, что первые нервные клетки появляются раньше мышечных клеток личинок двустворчатых моллюсков. Миогенная и нейрональная программы, запускаемые в раннем онтогенезе моллюсков, могут быть реализованы в культуре клеток, полученных из личинок премиогенных стадий развития. Миогенная программа, воспроизведенная in vitro, сходна с таковой in vivo и в обоих случаях протекает без формирования многоядерных миотуб в отличие от миогенеза позвоночных животных.

Научно-практическое значение работы

Полученные маркеры дифференцировки мышечных клеток и тестированные в экспериментах маркеры нейрогенеза могут быть использованы для анализа нейро- и миоанатомии личинок и взрослых беспозвоночных животных и могут представлять интерес для специалистов, изучающих процессы дифференцировки клеток как in vivo, так и in vitro. Разработанные условия долговременного культивирования позволят проводить различные молекулярно-биологические манипуляции, для изучения механизмов индукции и ингибирования дифференцировки клеток. Методические разработки и часть результатов работы включены в программу лекций и практических занятий спецкурса «Теоретические и практические основы культивирования клеток морских беспозвоночных животных» для студентов Отделения биохимии и биотехнологии АЭМББТ ДВГУ.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были доложены на ежегодных конференциях Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН (г. Владивосток, 2003; 2006; 2008); на Ежегодной региональной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (г. Владивосток, 2004); на 8-ой Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2004); на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (г. Санкт-Петербург, 2006); на Международном симпозиуме «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (г. Москва, 2007); на семинаре Лаборатории структуры и функции хромосом Биологического НИИ СПбГУ (г. Санкт-Петербург, 2007) и на Международном симпозиуме «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008). По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН (гранты № 06-II-CO-06-025, № НТ-08-016-04), РФФИ (гранты № 03-04-49568, № 06-04-96039) и гранта «Лучший аспирант РАН-2008» Фонда содействия отечественной науке.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и 1 таблицей. Список литературы содержит 196 наименований, из них 185 на английском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал

В качестве объектов исследования использовали яйцеклетки и личинки мидии М. trossulus, находящиеся на разных стадиях развития, а также мышцы взрослых моллюсков. Личинок получали путем искусственного оплодотворения яйцеклеток мидии (индукция нереста термальным шоком) и в дальнейшем культивировали при 17°С в климатической камере. Материал для экспериментов собирали на стадиях яйцеклетки, двух бластомеров, бластулы (12 ч после оплодотворения), ранней, средней и поздней трохофоры (17-36 ч), раннего, среднего, позднего велигера (40-142 ч и 15 сут) и педивелигера (20 сут). Более поздние стадии развития мидии были отобраны из планктона.

Выделение актомиозиновых (AM) экстрактов мидии и их анализ

АМ-экстракты выделяли из личинок мидии, находящихся на разных стадиях развития, и гладких мышц взрослого моллюска (Odintsova ef а/., 2006). Эти препараты представляют собой нерастворимый белковый комплекс, который аналогичен актомиозину мышц взрослых животных. Такой подход позволяет контролировать появление в процессе развития именно мышечных форм сократительных белков, поскольку немышечные формы удаляются при предварительных отмывках материала растворами с низкой ионной силой.

ДСН-электрофорез и иммуноблоттинг

Состав белковых препаратов изучали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по стандартной методике (Laemmli, 1970) в модификации Шелудько (Shelud'ko et al., 1999). Полученные гели сканировали и оцифровывали для анализа интегральной оптической плотности белковых полос с использованием компьютерной программы FRLPSCAN версии 3.12 (Scanalytics, США). Идентификация отдельных белков, разделенных гель-электрофорезом, была выполнена методом иммуноблоттинга (Towbin etal., 1970).

Процедура получения первичной культуры клеток мидии

Первичные клеточные культуры личинок мидии М. trossulus получали по методу Одинцовой (Одинцова, 2001). Клетки (3x106 клеток/мл) культивировали в модифицированной среде Лейбовича (L-15) с антибиотиками, на покровных стеклах в чашках Петри (Lux, Швеция) или в 24-луночных планшетах (Nunc, Дания) при 15-17°С. Покровные стекла предварительно были обработаны аморфным углеродом (методом напыления) или адгезивными молекулами: коллагеном (I тип, Sigma, США),

поли-1--лизином (190 кДа, Sigma) или фибронектином (Sigma), как описано в работе Одинцовой с коллегами (Odintsova et al., 1994). Жизнеспособность клеток определяли методом прямого подсчета в камере Горяева после окрашивания трипановым синим (Serva, Германия). Первую полную смену среды проводили через сутки после посадки клеток. Последующие смены среды (50% объема) проводили в зависимости от состояния первичной культуры клеток через 3-5 сут. Для получения субпопуляций клеток трохофоры и избавления от контаминации мы использовали метод фракционирования в ступенчатом градиенте Перколла (Sigma). Концентрированную суспензию клеток (не менее 8.6x106 клеток/мл) фракционировали в Перколле, приготовленном на искусственной морской воде без ионов Са2+ и Mg2+ (CMFSW). После центрифугирования полученные фракции клеток отмывали от Перколла стерильным CMFSW (2 раза, 1000 д, 10 мин) и морской водой. Осадок клеток был ресуспензирован в среде L-15 с добавками. Клетки фотографировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert 200 или Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия).

Получение специфических антител к мышечным белкам

Поликпональные антитела кролика к парамиозину, миозину и твитчину, выделенные из запирательных мышц Crenomytilus grayanus (Shelud'ko et al., 2004) получали по методике Егорова (Егоров и др., 1991). Антитела к миороду были любезно предоставлены сотрудником NHLBI/NIH (США) К.6.Н C.B. Плотниковым. Их специфичность была доказана ранее (Plotnikov et al., 2003). Качество и титр антител в первичной сыворотке тестировали с помощью радиальной двумерной иммунодиффузии в 1%-ном агарозном геле (по Оухтерлони). Титр и специфичность ig-фракций вторичной (после повторных иммунизаций) сыворотки тестировали иммуноблоттингом, непрямой иммунофлуоресценцией с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии на гладких мышцах М. trossulus и поперечно-полосатых мышцах гребешка Mizuhopecten yessoensis.

Для иммунохимического маркирования мышечных клеток использовали полученные поликлональные антитела кролика (lg-фракции) к парамиозину, миозину и твитчину в разведении 1:800. Иммуноцитохимическое окрашивание проводилось двух- или трехступенчатым непрямым методом по стандартной методике (Voronezhskaya et al., 2008).

Иммунохимия

Для иммунохимического мечения мышечных белков, нейрональных элементов и ресничек использовали последовательную обработку личинок и культур клеток мидии первичными и вторичными антителами. Для

маркирования нейрональных элементов были использованы поликлональные антитела кролика к серотонину (5-НТ) и FMRFaMHfly (Immunostar, США) в разведении 1:2000. Выявление ресничных клеток проводили с помощью монокпональных антител мыши к ацетилированному а-тубулину (Sigma) в разведении 1:5000. Анти-кроличьи или анти-мышиные вторичные антитела были мечены флюоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) или тетраметилродамин изотиоцианатом (ТРИТЦ) (MP Biomedicals и Molecular Probes, США) в разведении 1:800-1:1000. Для детекции фибриллярного актина (Ф-актина) материал инкубировали с фаллоидином, меченым флуорохромом AlexaFluor 488 или AlexaFluor 532 в разведении 1:400 (Molecular Probes).

Личинки мидии после окрашивания заключали в среду Мовиол 4-88 (Calbiochem, США) с 2.5% раствором 1,4-диазабицикло [2.2.2.] октана (Sigma) в фосфатном буфере (ФБ), оставляя на сутки при комнатной температуре до полимеризации среды. Клетки окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолдигидрохлоридом (DAPI, Sigma) для визуализации ядер. Далее клетки заключали в среду Vectashield (Vector, США). Препарирование мышечных волокон гладкомышечного аддуктора взрослой мидии и поперечно-полосатой части аддуктора гребешка M. yessoensis проводили под бинокуляром (МБС-9, Россия). Волокна фиксировали 4% раствором параформальдегида в течение 2 ч при 4°С и отмывали ФБ с 0.1% раствором тритона Х-100 и хранили в ФБ с 0.03%-ным NaN3. Иммуноокрашивание белков мышц взрослого моллюска проводили аналогично окрашиванию мышечных белков личинок мидии. Стандартные контроли включали материал, инкубированный только с вторичными антителами.

Конфокальная лазерная микроскопия и обработка изображений

Регистрацию окрашенного личиночного материала и мышц взрослых животных проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе TSC SP5 и TSC SPE (Leica, Германия), оснащенным 4-мя лазерами: диодным (405 нм), аргоновым (488 нм) и гелий-неоновыми (543 и 633 нм). Последовательное сканирование срезов проводили в формате 1024X1024 точек на дюйм, используя объектив с масляной иммерсией Leica НСХ PL АРО 63Х с апертурой 1.4, электронным увеличением не более 3.5 и частотой сканирования 800-1000 Гц (лин./с).

Изображения внутреннего оригинального формата lif преобразовывали в стандартный формат изображения tlf. Для обработки полученных изображений использовали программу 3D визуализации. Анализ оптических срезов проводили, используя программу объемной реконструкции (3D). При перекрытии спектров использовали программу корректировки изображений ImageJ (National Institutes of Health, США) в каждом из каналов, учитывая адаптивное разделение на основе корреляции интенсивностей. Обработку изображений проводили с помощью пакета оригинальных программ LAS AF 1.7.0. и Adobe Photoshop 8.0.

Микроскопия генерации второй оптической гармоники

Характер распределения мышечного миозина у личинок (велигеров) мидии был проанализирован с помощью микроскопии генерации второй гармоники в лаборатории В. Молера (Центр Здоровья Университета Коннектикут, США). В качестве контроля были использованы поперечнополосатые волокна аддуктора гребешка М. yessoensis. С экспериментальной схемой установки можно ознакомится на сайте http://www.ccam.uchc.edu. Сканирование образцов было выполнено совместно с сотрудником NHLBI/NIH (США) к.б.н. С.В. Плотниковым.

Обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

Тотальную РНК выделяли из яйцеклеток, личинок, находящихся на разных стадиях развития и переднего аддуктора мидий, при помощи набора «Yellow-Solve» (Clonogen, Россия). Качество тотальной РНК проверяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле в однократном ТВЕ буфере. Гели окрашивали 0.01% раствором бромистого этидия и просматривали в ультрафиолетом свете на трансиллюминаторе UVT-1 (Biocom, Россия). Концентрацию тотальной РНК оценивали спектрофотометрически при длине волны 260 нм на спектрофотометре (UV 1240, Shimadzu, Япония). Праймеры к гену твитчина были подобраны с помощью программы Primer-master, версия 1.0 (Санкт-Петербург, Россия) на основе нуклеотидной последовательности РНК твитчина М. galloprovincialis, взятой из генетического банка: www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed (GenBank, АВ062881). Праймеры, прямой: 5'-77Т ТСА CAG GTT GGG LAG CG-3' и обратный 5'-САТ GGT АСС GAC AAC TGG ТС-3' фланкировали фрагмент в 780 пар оснований (п.о.) гена твитчина. Реакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе (UNO Thermoblock thermal cycler, Biometra, Германия), нагрев до 37°С в течение 60-70 мин, затем до 65С в течение 10 мин и охлаждение до 4'С. ПЦР проводили в амплификаторе, запрограммированном на первоначальный шаг денатурации в 3 мин при 95°С, затем на 35 циклов: 50 с при 95°С, 50 с при 50°С, 60 с при 72°С, затем при 72°С в течение 3 мин для доработки продуктов амплификации с последующим охлаждением до 4°С.

Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1.5% агарозном геле в однократном ТБЕ буфере. В качестве маркера молекулярных весов использовали синтетический маркер с шагом в 100 п.о. (100-1000 п.о., Сибэнзим).

Статистическая обработка полученных данных

Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена на персональном компьютере с использованием программ «Excel 7.0». Экспериментальные данные выражены как M±SD (среднее ± стандартное

отклонение от среднего). Достоверность различий средних величин (р) при межгрупповом сравнении устанавливали по ^критерию Стьюдента. Величины р<0.05 считали достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Доказательство специфичности антител

Полученные антитела к мышечным белкам мидии и коммерческие антитела к нейромедиаторам были использованы для детекции мышечной и нервной систем личинок мидии в процессе развития, а также для выявления миогенных и нейрональных клеток первичной в культуре.

На рис. 1 А, Б демонстрируется специфичность антител к мышечным белкам - твитчину (ТВ, 530 кДа, РипаЬага et а/., 2003), тяжелым цепям миозина (ТЦМ, 200 кДа) и парамиозину (ПМ, 100 кДа, БгепНЗуогду! е? а/., 1971). Видно, что электрофоретическая подвижность тестируемых белков на Р\ЮР-мембране такая же, как на полиакриламидном геле и 1д-фракции сыворотки не содержат антител к другим мышечным белкам. Кроме того, полученные нами антитела специфически связывались с белками сократительного аппарата поперечно-полосатых волокон аддуктора гребешка М. уеззоепз/'з и гладких мышц мидии М. Ковви/из с образованием характерного для обоих случаев исчерченного (поперечно-полосатого) и непрерывного (гладкого) паттерна окрашивания (рис. 1 В-3).

I ВЦ гчнн

Рис. 1. Демонстрация специфичности поликлональных антител к мышечным белкам посредством иммуноблоттинга и непрямой иммунофлуоресценции.

А - ДСН-электрофорез очищенных препаратов белков: ТЦМ, ПМ и ТВ; Б -иммуноблоттинг мышечных белков. В-3 - поперечно-полосатые мышцы гребешка М. уезэоепз'я (В - Д) и гладкие мышцы мидии М. {говви/ив (Е - 3). Линейка - 5 мкм.

МИОГЕНЕЗ IN VIVO

Экспрессия мышечных белков мидии М. trossulus

Методом ДСН-электрофореза были исследованы АМ-экстракты личинок мидии, находящихся на разных стадиях развития, и взрослых животных (рис. 2 А). Мы показали, что личинки ранних стадий развития мидии содержат белки, электрофоретическая подвижность которых совпадает с основными мышечными белками контрольного препарата, выделенного из гладких мышц взрослой мидии. С помощью иммуноблоттинга было установлено присутствие парамиозина в яйцеклетках, а твитчина и миорода - на стадии бластулы мидии (рис. 2 Б -Г). Таким образом, мышечные белки толстых нитей экспрессируются задолго до начала сборки функционально активной мышечной системы личинки мидии велигера (Дячук и др., 2005).

А —та

... ИШ&Р » -JTTiT

--1ЦМ

* —МР

<W—пм

<*Р швь тШг ИГ* —'•"•

»-А

*» ща» «а» акт 4т* —™

1 12 3 4 5

Рис. 2. ДСН-электрофорез (А) и иммуноблоттинг (Б-Г) АМ-экстрактов яйцеклеток, личинок и тканей мидии М. ^озви/ив .

А: 1 - АМ-экстракт яйцеклеток; 2 - АМ-экстракт бластулы (12 ч); 3, 4 - АМ-экстракты трохофор (17 и 48 ч); 5, 6 - АМ-экстракты велигеров (55 и 96 ч); 7 - АМ-экстракт переднего аддуктора взрослой мидии. Маркерные белки: ТВ (530 кДа); ТЦМ (200 кДа); миород (МР) (106-113 кДа); ПМ (100 кДа); актин (42 кДа, А), тропомиозин (36 кДа, ТМ); Б-Г: 1 - АМ-экстракт переднего аддуктора взрослой мидии; 2 - АМ-экстракт яйцеклеток; 3 - АМ-экстракт бластулы; 4 - АМ-экстракт трохофоры; 5 - АМ-экстракт велигера.

Данные денситометрии позволили нам оценить количественное соотношение мышечных белков сократительного аппарата мидии. Оказалось, что соотношение ПМ/ТЦМ у раннего и позднего велигера между собой отличается незначительно, однако сильно отличается от такового соотношения, полученного для гладкой мышцы взрослой мидии (см. таблицу, ОсШвоуа а!., 2006).

Таблица

Весовые соотношения ПМ/ТЦМ и А/ТЦМ в АМ-экстрактах велигера и мышцы взрослой мидии М. trossulus

Стадии развития мидии ПМ/ТЦМ А/ТЦМ

Велигер (55 ч) 0.3710.06 1.25+0.03

Велигер (96 ч) 0.59±0.02 1.2610.13

Взрослая мидия (передний аддуктор) 5.5210.67 5.76+0.75a 1.810.08 1.3Ю.16

р<0.05

aLevine et al., 1976 (передний ретрактор мидии М. trossulus)

6Margulis et al., 1979 (гладкая мышца мии Муа japónica)

Соотношение белков на стадии велигера не соответствует таковому в гладких мышцах взрослого моллюска, а характерно для поперечнополосатых мышц. Возможно, это связано с тем, что сформировавшаяся к стадии велигера сократительная система способна скорее к фазному сокращению характерному для поперечно-полосатых мышц, чем к тоническому, свойственному гладким мышцам взрослых мидий.

С помощью ОТ-ПЦР мы показали, что мРНК гена твитчина присутствует уже на стадии бластулы и последующих стадиях развития мидии (рис. 3).

Рис. 3. Экспрессия гена твитчина на ранних стадиях развития мидии при помощи ОТ-ПЦР.

Тотальная РНК была выделена из яйцеклеток (дорожка 1), бластулы (дорожка 2), ранней и поздней трохофоры (дорожки 3, 4), велигера (дорожка 5) и из переднего аддуктора взрослой мидии (дорожка 6). М - синтетический маркер с шагом в 100 п.о. (100-1000 п.о.) (Сибэнзим, Россия). Размер фрагмента 780 п.о. Контрольная реакция с тотальной РНК была отрицательной (данные не представлены).

Судя по раннему появлению твитчина в онтогенезе мидии и его способности взаимодействовать с другими белками толстых и тонких нитей, можно предположить инициирующую роль этого белка в сборке сократительного аппарата, как это показано в случае титина (Fürst et а/., 1989).

Миогенная дифференцировка клеток личинок мидии М. Ковви/из

В нашей работе мы впервые использовали метод двойного и тройного совместного иммуномечения мышечных и нейрональных клеток в личинках мидии. Это позволило выявить появление оформленных структур развивающейся мышечной системы и первых нейрональных клеток моллюска. Анализируя ранние стадии развития мидии, мы обнаружили, что из всех тестируемых белков толстых нитей в яйцеклетках присутствует только парамиозин, располагаясь в зоне их кортекса (рис. 4 А, Б). Неожиданным стало исчезновение парамиозина уже через 2 ч после оплодотворения на стадии двух бластомеров (рис. 4 В).

Рис. 4. Обнаружение парамиозина в раннем эмбриогенезе мидии.

А, Б - неоплодотворенные яйцеклетки; В - эмбрион на стадии двух бластомеров. Окрашивание антителами к парамиозину и DAPI для выявления ядер; Б - конфокальный срез. Окраска антителами к парамиозину и DAPI. Стрелками показаны скопления белка в кортексе яйцеклеток; В - стадия двух бластомеров (2 ч после оплодотворения). Видно отсутствие иммунореакции антител к парамиозину. Линейка - 20 мкм.

Немного позже можно отчетливо различить 4 клетки (32 ч, рис. 6 Б), а потом 6 мышечных клеток (36 ч, рис. 5 Ж - И; рис. 6 В), расположенных на анимальном полюсе трохофоры. Первые мышечные клетки имеют округлую форму, они одноядерные, их окраска распределена в цитоплазме гомогенно. Эксперименты с двойным мечением мышечных белков толстых нитей позволяют утверждать, что парамиозин, твитчин и миозин появляются одновременно на стадии трохофоры мидии и локализованы в одних и тех же клетках (рис. 5). Следующий шаг развития мускулатуры мидии - формирование поперечно-полосатого мышечного кольца на анимальном полюсе трохофоры (рис. 5 Ж - И; рис. 6 Г), от которого впоследствии отходит пара исчерченных волокон (рис. 6 Д).

Мышечное кольцо найдено и в других классах личинок моллюсков: у Polyplacophora на стадии ранней трохофоры (74 ч после оплодотворения при 10-12°С) (Wanninger, Haszprunar, 2002 a, b) и у некоторых представителей Gastropoda (Wanninger et al., 1999; Page, 1997). Однако необходимо отметить, что в вышеперечисленных работах поперечнополосатая исчерченность мышечного кольца не была показана.

А а» ранняя тровфора ßfli) ТВ1ГР1НН ь шримншш/ ТВДОЧШ В !

г ^ * t # поздняя трохоффа (36 ч) !Г~ # Щ ' Е Я

ж с. л рпшжн (41) ч) - • ■ и

Рис. 5. Локализация парамиозин- и твитчин-иммунореактивных клеток личинок мидии.

Окрашивание личинок антителами к парамиозину (А, Г, Ж), твитчину (Б, Д, 3) и ацетилированному а-тубулину (Ж - И). В, Е, И - совмещение окрасок. Линейка - 50 мкм.

У представителей класса моллюсков Scaphopoda мышечное кольцо вообще отсутствует.

Дальнейшее развитие мидии связано со смещением осевой плоскости личинки и закладкой створок раковины мидии. В результате этих событий кольцо, вероятно, разъединяется, и формируются 3 поперечно-полосатых ретрактора, прикрепленных в основании раковины (рис. 6 Е), дихотомически ветвящихся на стадии D-велигера (рис. 6 Ж). Ретракторы описаны у многих представителей двустворчатых моллюсков, имеющих, как предполагают, косо-исчерченную организацию толстых и тонких нитей (Cragg, 1985; Cragg, Crisp, 1991). Непарные и несимметричные ретракторые мышцы найдены у гастропод (Page, 1997). Их сократительная активность является причиной «онтогенетического скручивания» раковины. Вопрос о типе этих мышц остается дискуссионным, потому что нет неоспоримых доказательств организации миофибрилл у данных классов моллюсков. У представителей классов Polyplacophora и Scaphopoda отчетливо выраженные ретракторы не обнаружены (Haszprunar, Wanninger, 2000). Предполагают, что потеря ретракторов у более примитивных классов моллюсков является результатом вторичной редукции в эволюции этих животных. Это дает возможность предполагать независимую эволюцию классов внутри типа Mollusca (Haszprunar, Wanninger, 2000).

Счвел*гер

педжелигер

ювенильная особь

Рис. 6. Схематическое изображение развития мышечной системы личинок мидии М. {твзи/ив. Вид личинок с правой латеральной стороны.

А - на стадии ранней трохофоры (30 ч) видны первые две мышечные клетки (мио 1, 2) и зачаток раковинной железы (р.ж.); Б - на стадии средней трохофоры (32 ч) количество клеток увеличивается и появляется зачаток раковины (з.р.); В -на стадии поздней трохофоры (36 ч) обнаружено шесть мышечных клеток (мио 16); Г-на стадии велигера (40 ч) формируется первая мышечная структура, мышечное кольцо (мк) и желудок (ж); Д - на этой же стадии, но чуть позже (42 ч), мышечное кольцо приобретает поперечно-полосатую исчерченность; от кольца отходят парные миофибриллы (м.ф.); Е - на стадии среднего велигера (60 ч) мышечное кольцо разъединяется, формируются три пары ретракторов (лр 1 ,2, 3) и появляется передний аддуктор (п.ад.); (Ж) - на стадии более позднего велигера (90 ч, Б-велигер) ретракторы начинают активно развиваться и ветвиться в районе велюма; 3 - на стадии педивелигера (20 сут) появляются протракторы (лп 1, 2, 3), мышцы велюма (мв) и зачаток заднего аддуктора (з.ад.), развиваются мышцы пищеварительной системы (п.м.); И - после метаморфоза (после 30 сут) личинки поперечно-полосатые ретракторы и протракторы резорбируются. Отчетливо видны аддукторы (п.ад., з.ад.), мышечные пучки мантии (м.м.), ноги (м.н.) и толстые мышцы желудка (м.ж.).

На стадии среднего велигера появляется передний аддуктор, зачаток мышцы взрослого животного. На более поздних стадиях развития личинки мидии формируются гладкие мышцы пищеварительной системы, три пары исчерченных и ветвящихся протракторов велюма (рис. 6 3). После оседания в процессе метаморфоза резорбируются личиночные ретракторы и протракторы. После метаморфоза остаются только два гладкомышечных аддуктора, мышечные пучки мантии и ноги (рис. 6 И). Таким образом,

переход активно двигающейся личинки к малоподвижному образу жизни взрослого животного сопровождается постепенной утратой исчерченной и развитию гладкой мышечной ткани (Одинцова и др., 2007). Суммарная схема развития мышечной системы мидии представлена на рис. 6.

Мы обнаружили, что только после экспрессии белков толстых нитей и их сборки в незрелые саркомеры появляется Ф-актин, который встраивается в саркомеры на более поздней стадии развития мидии (60 ч). Наши результаты согласуются с данными других авторов, полученных при исследовании миогенеза у позвоночных и беспозвоночных животных. Экспрессия и сборка тонких нитей у позвоночных животных происходит независимо от толстых нитей и иногда с некоторой задержкой организации актина (Ehler et al., 1999). У С. elegans Ф-актин появляется только после экспрессии парамиозина, миозина, титина и кеттина (Hresko et at., 1994; Kolmerer et at., 2000). У D. melanogaster белки толстых и эластичных нитей (миозин и D-титин) в первых миобластах также появляются до экспрессии мышечной изоформы актина (Zhang et al., 2000).

Обнаружив поперечно-полосатую исчерченность мышц велигера, мы сравнили ее с организацией поперечно-полосатой мышцы гребешка М. yessoensis. Мечение антителами к миозину и фаппоидином для детекции Ф-актина выявило схожесть организации миофибрилл (рис. 7 А - В, Д - Ж).

\ д immMlff^\!iii)i"

ь. фДЧЛОИ'ШН ш рнц

фаллиидлн

в Ж '¡Vis'!,

МВГ - МВГ -

Рис. 7. Поперечно-полосатая исчерченность мышц моллюсков.

А - Г - мышцы личинки велигера мидии (60 ч); Д - 3 - поперечно-полосатые мышцы гребешка M. yessoensis; распределение миозина (А, Д), актина (Б, Е) и совмещение окрасок (В, Ж) в поперечно-полосатых мышцах моллюсков. Стрелками показана длина саркомера в расслабленном состоянии (около 2.5 мкм). Г, 3 - локализация миозина в мышцах велигера мидии и мышце гребешка была детектирована с помощью метода МВГ (съемка проведена совместно с сотрудником NHLBI/NIH, США, к.б.н. C.B. Плотниковым). Линейка: А-Ж-20 мкм, 3-10 мкм.

Более того, используя данные, полученные с помощью метода микроскопии второй гармоники, мы доказали поперечно-полосатую исчерченность миофибрилл и установили, что в зрелых миофибриллах личинок и взрослого гребешка длина саркомера совпадает и составляет около 2.5 мкм (в расслабленном состоянии, рис. 7 Г, 3). Поперечнополосатая исчерченность миофибрилл, обнаруженная на стадии раннего велигера, исчезает после метаморфоза педивелигера. До настоящего исследования, используя актин в качестве маркера развития мышечной системы, авторам более ранних работ, в которых использовался актин в качестве маркера развития, не удавалось обнаружить поперечно-полосатую организацию мышц личинок двустворчатых моллюсков (Wanninger, 2001). Только лишь ранние электронно-микроскопические работы по ультраструктуре личинок указывают на схожесть организации некоторых волокон с поперечно-полосатой структурой мышц позвоночных или косо-исчерченными волокнами мышц беспозвоночных животных (Ваупе, 1976).

Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии

Мы проанализировали взаимное распределение мышечных клеток и нейрональных элементов на ранних стадиях развития мидии (трохофоры и раннего велигера). Маркерами нервной системы моллюсков были нейромедиаторы - серотонин (5-НТ) и FMRFaMHfl. Ранее было показано, что антитела к этим нейромедиаторам выявляют самые первые элементы нервной системы и являются подходящими маркерами формирующихся ганглиев дефинитивной центральной нервной системы моллюсков (Croll, Voronezhskaya, 1996; Croll, 2000; Voronezhskaya et al., 2008). Это дает возможность детально изучить возникновение и развитие личиночной нервной системы. Мы обнаружили, что первые серотонин- и FMRFaMHfl-иммунореактивные клетки появляются на стадии ранней трохофоры на анимальном полюсе. Мышечные клетки, формирующие исчерченное кольцо, появляются позже (36 ч). Расположение 5-НТ- и FMRFaMHfl-иммунореактивных клеток относительно мышечного кольца различается. Как видно на рис. 8, три 5-НТ-иммунореактивные клетки расположены в центре мышечного кольца, а шесть FMRFaMHfl-HMMyHopeaKTHBHbix клеток -на периферии мышечного кольца. Часть отростков FMRFaMHfl-иммунореактивных клеток на стадии велигера располагается в велюме, а часть направлена к переднему аддуктору. На стадии раннего велигера мы обнаружили четыре серотонин-иммунореактивные клетки (рис. 8 В, Е).

Известно, что развитие и функционирование мышц неотъемлемо связано с их иннервацией. Сенсорные нейроны апикального органа личинок мидии могут быть связаны с мышцами, что, вероятно, приводит к способности личинки быстро реагировать на внешние сигналы.

А ✓ 5 II I/; i - 11 5-НТ клетки \ MX В * *

Г щ. д FMJJF клетки J- jy« Е

5 4 \ мк / Wf п.ад. / лр

ШИТ!-- - ш

Рис. 8. Локализация мышечных структур и сенсорных нейронов трохофоры и велигера мидии.

5-НТ- (А, Б, В) или FMRFaMHfl- (Г, Д, Е) (красная окраска) и парамиозин-иммунореактивные клетки (зеленая окраска) на ранних стадиях развития личинок. А, Г - на стадии трохофоры (28 ч) появляются первые нейрональные элементы (показано стрелками); Б, Д - на стадии трохофоры (36 ч) видно три 5-НТ-иммунореактивные клетки, локализованные в центре мышечного кольца и шесть РМЯРамид-иммунореактивных клеток; В - на стадии велигера (60 ч) выявлены четыре 5-НТ-иммунореактивные клетки с нейропилем, содержащим варикозные расширения (отмечено звездочками). С боковой стороны видно только две 5-НТ-иммунореактивные клетки (показано стрелками). Е - нейрофибриллы FMRFaMHfl-иммунореактивных клеток велигера (60 ч) простираются от велюма к переднему аддуктору (п.ад.) (стрелка). Линейка - 50 мкм.

Возможно, что поперечно-полосатое мышечное кольцо функционально активно и может регулировать положение сенсорных нейронов апикального органа личинки. В то же время, мы не обнаружили специфических связей между первыми мышечными клетками и нейронами на ранних стадиях развития мидии. Вопрос, регулируют ли нейромедиаторы сокращение ретракторов личинки мидии, до сих пор не решен. Известно, что во время развития дрозофилы дифференцировка мышц личинок происходит до иннервации, однако нейроны необходимы для сократительной активности мышц на более поздних стадиях развития (Broadie, Bate, 1993).

МИОГЕНЕЗ IN VITRO

Миогенная дифференцировка клеток личинок мидии в культуре

Ранее разработанный метод получения миогенных клеточных культур из личинок премиогенных стадий развития дал нам возможность более детально исследовать стадии миогенной дифференцировки мидии in vitro.

Миогенная дифференцировка клеток мидии в культуре происходит на всех субстратах, за исключением коллагена. Мы предполагаем, что отсутствие мышечного фенотипа клеток, культивируемых на коллагене (1 мг/мл), видимо, происходит из-за того, что этот субстрат в такой концентрации не является подходящим субстратом для миогенной дифференцировки клеток личинок мидии. Мы показали, что из-за отсутствия твердого субстрата актиновые и парамиозиновые (или миозиновые) фибриллы оказываются закрученными вокруг ядра клеток и не формируют строго упорядоченные нити, образующие саркомер. Подобное ингибирование миофибриллогенеза было отмечено у скелетно-мышечных симпластов (Puri et al., 1980) и кардиомиоцитов (Bechern et а/., 1985) при культивировании их на неадгезивном субстрате.

Через 2 ч после посадки клеток мидии на фибронектин, полилизин или стекло, покрытое углеродом, они прикреплялись к тестируемым субстратам, а через 12 ч были отмечены первые спонтанные сокращения. Количество сокращающихся клеток увеличивалось по мере дальнейшего культивирования. На поздних стадиях культивирования мы наблюдали сокращение целых колоний монослойных клеток. Используя антитела к мышечным белкам и фаллоидин для выявления Ф-актина, мы обнаружили, что уже через 2 ч появляются нити актина, но отсутствуют другие тестируемые белки. Экспрессия белков толстых нитей была обнаружена через 6 ч культивирования, а их распределение в клетках было диффузно (рис. 9 А - В).

Через 12 ч мы обнаружили чередующееся распределение белков толстых нитей и актина (рис. 9 Г - Е), создающее поперечную исчерченность, что коррелирует с появлением первых сокращений клеток. Эти клетки можно рассматривать как терминально-дифференцированные постмитотические миоциты, поскольку синтез ДНК в них не обнаружен. Клетки, культивируемые на всех субстратах (кроме коллагена), оставались одноядерными с латерально расположенным ядром. Необходимо отметить, что длина саркомеров клеток в культуре совпадала с таковой у личинок мидий (2.5 мкм). Однако через 20 сут после начала культивирования клеток, исчерченность распределения толстых и тонких нитей сменилась на диффузное расположение белков в цитоплазме клеток, свойственное гладким мышцам взрослой мидии (рис. 9 Ж - И). Процесс формирования миотуб на протяжении всего времени культивирования нами обнаружен не был.

Общепризнанными на сегодняшний день являются две модели сборки миофибрилл: модель «матрицы», в которой основой будущего саркомера являются стресс-фибриллы, и модель «независимой сборки» единиц саркомера (Sanger et al., 2006). Однако у некоторых представителей позвоночных и беспозвоночных животных миофибриллогенез не подходит ни под одну из общепринятых моделей (Sanger et al., 2006).

Рис. 9. Изменение организации сократительных белков в процессе сборки саркомеров в клетках мидии.

Парамиозин (красная окраска, А, Г, Ж), актин (зеленая окраска, Б, Д, 3) и совмещенная картина окрашивания белков (В, Е, И). Клетки культивировали в течение 2 ч (А - В), 12 ч (Г - Е) и 30 сут (Ж - И). Длина саркомера составляет 2.5 мкм. Отсутствие поперечно-полосатой исчерченности мышечных клеток на поздних сроках культивирования (Ж - И). Линейка: А - В - 10 мкм, Г - И - 20 мкм.

Например, сборка саркомеров у рыбы Danio rerio происходит в отсутствие стресс-фибрилл и структур-предшественников миофибрилл (Costa et al., 2002). Миоциты эмбриона, не сливаясь, созревают в поперечно-полосатые мышечные клетки без формирования миотуб (Costa et al., 2003). Аналогичную ситуацию мы наблюдали в первичной культуре клеток мидии, дифференцирующихся в миоциты. Как и у D. rerio, мышечные клетки мидии, не сливаясь в миотубы, созревают в поперечно-полосатые миоциты, тем самым, повторяя программу миогенеза в развитии моллюска. Однако между программами миогенной дифференцировки у D. rerio и М. trossulus есть существенные различия. Прежде всего, у D. rerio первыми специализируются гладкие мышцы, а потом поперечно-полосатые (Roy et al., 2008), а у мидии наоборот.

На сегодняшний день известно мало работ, в которых говорится о независимости развития мышечной системы личинок и мышц взрослых особей моллюсков (Cragg 1985; Crag, Crisp 1991). Нами обнаружен параллелизм развития двух мышечных систем мидии. В результате

метаморфоза мускулатура личинки, а именно ее поперечно-полосатая часть (ретракторы и протракторы) резорбируются. По-видимому, процессы, происходящие in vivo, реализуются также и в культуре клеток. Действительно, поздних стадиях культивирования клеток мидии мы не обнаружили исчерченных мышечных клеток.

Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток мидии in

vitro

Исследование нейронов и миоцитов в условиях культуры важно для изучения взаимодействия отдельных типов клеток в процессе развития и влияния их друг на друга. Мы обнаружили, что на начальных этапах культивирования расположение мышечных и нейрональных клеток было хаотично (рис. 10 А, Б, Г, Д). После диссоциации все клетки имели округлую форму. Первые 5-НТ- и FMRF-амид-иммунореактивные клетки появляются через 4 часа после их посадки в чашки. Однако на более поздних стадиях культивирования, после терминальной дифференцировки обоих типов происходила ассоциация клеток в колонии (рис. 10 В, Е). Интересно, что в центре каждой колонии располагались серотонин- и FMRFaMHfl-иммунореактивные клетки, а миоциты располагались на периферии и объединялись с другими агрегатами, формируя сеть сокращающихся клеток.

А /парамиозкн . /"-г-4* * о Б V •• V ••" . . *' • 'Si ■ ' 4%. > ч-i * • В Лгарамшшш/ V' * ■' '. , гЬ ■ •'>.3 • Í- ." >' , " • • V N ~ / :. ■ /

Г / ла]Гв мно i н и " . г Д /геарамнознн . V : С ?' Е FM РР&арадгнозкн/ / ж .

Рис. 10. Детекция нейронов и миоцитов в первичной культуре клеток мидии.

А, Б, В - окраска клеток антителами к серотонину (зеленая окраска); Г, Д, Е - окраска клеток антителами к РМРРамиду (зеленая окраска), парамиозину (красная окраска) и ОАР\ (синяя окраска, В, Е) клеток личинок М. ¡говви/из на разных стадиях культивирования. А, Г - 2 сут в культуре, Б, Д - 9 сут в культуре и В, Е - 25 сут в культуре. Линейка - 10 мкм.

Мы обнаружили феномен агрегации нейронов и миоцитов в первичной культуре клеток личинок мидии. Способ образования агрегатов в культуре, вероятно, происходит путем взаимного перемещения миоцитов и нейронов. За время совместного культивирования клеток, нейроны мидии не были распластаны и не формировали отростки, находясь в плотных агрегатах, состоящих, в основном, из эпителио-подобных округлых клеток и ресничных трофобластов. Феномен безотростчатой агрегации нейронов в культуре ткани после их искусственной диссоциации известен (Сотников, 1985). Процесс агрегации может протекать неравномерно и сопровождаться на время выходом нейронов из агрегатов. В нашей системе in vitro перемещения нейронов из агрегата на поздних стадиях культивирования мы не наблюдали. Полученная in vitro модель является сложной и подходящей системой для дальнейшего изучения молекулярных основ взаимодействия как нейронов и мышц, так и других типов клеток. Подобная гетерогенная система клеток может быть использована для тестирования гормонов беспозвоночных животных, а исследования такого рода могут раскрыть механизмы координированного развития различных типов клеток.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что парамиозин, белок толстых нитей мышц мидии, присутствует в кортексе неоплодотворенных яйцеклеток. Другие белки толстых нитей, твитчин, миозин и миород, экспрессируются задолго до начала формирования мышечной системы личинки мидии велигера.

2. Экспрессия гена, кодирующего твитчин, начинается со стадии бластулы.

3. Первые мышечные клетки появляются на стадии ранней трохофоры и формируют кольцо, состоящее из поперечно-полосатых мышечных клеток. Кольцо трансформируется на стадии велигера в отдельные поперечно-полосатые ретракторы, которые резорбируются в процессе метаморфоза личинки. При этом гладкие мышцы взрослого моллюска закладываются до метаморфоза на стадии велигера и развиваются параллельно с мускулатурой личинки.

4. Нейрональные клетки появляются на стадии ранней трохофоры до появления первых мышечных клеток. Показано, что сенсорные клетки апикального органа расположены в центре и на периферии поперечнополосатого мышечного кольца поздней трохофоры. Морфологических контактов между нейронами и миофибриллами на ранних стадиях развития мидии не обнаружено.

5. Миогенная и нейрональная программы дифференцировки могут бьггь воспроизведены в культуре клеток. Миогенная программа, воспроизведенная in vitro, сходна с таковой in vivo и в обоих случаях

протекает без формирования многоядерных миотуб в отличие от миогенеза позвоночных животных. Обнаружена самоорганизация диссоциированных клеток мидии в культуре с образованием нейромышечных колоний. Синаптических контактов при кокультивирования миоцитов и нейронов не обнаружено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дячук В.А., Плотников С.В., Одинцова Н.А. Появление мышечных белков в онтогенезе мидии Mytilus trossulus (Mollusca: Bivalvia) // Биология моря. 2005. Т. 31, № 5. С. 376-379.

2. Odintsova N„ Dyachuk V., Kiselev К., Shelud'ko N. Expression of thick filament proteins during ontogenesis of the mussel Mytilus trossulus (Mollusca: Bivalvia) II Comparative Biochemistry and Physiology Part B. 2006. Vol. 144, № 2. P. 238-244.

3. Одинцова H.A., Яковлев K.B., Дячук B.A. Культуры клеток морских беспозвоночных: проблемы, успехи, перспективы II Труды международной научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2005», посвященной 75-летию основания КГТУ и 750-летию Кенигсберга-Калининграда, Калининград: издательство КГТУ, 2005. Ч. 1. С. 50-52.

4. Одинцова Н.А., Яковлев К.В., Дячук В.А. Регуляция процессов роста и дифференцировки клеток морских беспозвоночных в культуре // Тезисы докладов и сообщений Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург: издательство «Наука». Цитология. 2006. Т. 48. С. 785-786.

5. Одинцова Н.А., Дячук В.А., Карпенко А.А. Развитие мышечного аппарата и сократительной активности мидии Mytilus trossulus (Mollusca: Bivalvia) II Онтогенез. 2007. Т. 38, № 3. С. 235-240.

6. Одинцова Н.А., Яковлев К.В., Дячук В.А., Серов О.Л. Эволюционно консервативные гены плюрипотентности клеток морских беспозвоночных//Тезисы докладов и сообщений II съезда Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, Санкт-Петербург: издательство «Наука». Цитология, 2007. Т. 49, № 9. С. 780-781.

7. Дячук В.А., Одинцова Н.А. Направленная дифференцировка эмбриональных клеток мидии Mytilus trossulus в культуре II «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». Симпозиум с международным участием. М.: Т-во научных изданий КМК, 2007. С. 54-55.

8. Одинцова Н.А., Яковлев К.В., Дячук В.А., Борода А.В. Стволовые клетки морских беспозвоночных: регуляция пролиферации и направленной дифференцировки in vitro. Криосохранение II Информационный бюллетень. Выпуск 23. - СПб.: Ассоциация специалистов по клеточным культурам, Институт цитологии РАН, 2008. С. 23-30.

9. Dyachuk V.A., Odintsova N.A. Visualization of muscle protein expression pattern during mussel development // International Symposium «Biological Motility: Achievements and Perspectives», Pushchino, Russia. Abstracts of International Symposium. Пущино: Пущинский издательский центр РАН, 2008. С. 67-68.

10. Matusovsky O.S., Dyachuk V.A., Kisilev K.V., Shelud'ko N.S., Sobieszek A. Phosphorylation of myorod by endogenous kinase from molluscan smooth muscle II International Symposium «Biological Motility: Achievements and Perspectives», Pushchino, Russia. Abstracts of International Symposium. Пущино: Пущинский издатепьский центр РАН, 2008. С. 41-43.

Дячук Вячеслав Алексеевич

МИОГЕННАЯ И НЕЙРОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК ЛИЧИНОК МИДИИ MYTILUS TROSSULUS IN VIVO И IN VITRO

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Зак. № 99п. Формат 60x84 '/|6. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 29.10.2008 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор» 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел.: 32-70-49

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дячук, Вячеслав Алексеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Жизненный цикл и миогенез D. melanogaster.

1.2. Жизненный цикл и миогенез С. elegans.

1.3. Жизненный цикл и миогенез двустворчатых моллюсков.

1.4. Анатомия мышц взрослых двустворчатых моллюсков.

1.5. Маркеры мышечной дифференцировки.

1.6. Анатомия мышц личинок моллюсков.

1.7. Нейрогенез личинок моллюсков.

1.8. Роль белков, участвующих в сборке толстых филаментов.

1.9. Роль эластичных белков в сборке саркомеров.

1.10. Роль белков тонких филаментов в сборке саркомеров.

1.11. Миофибриллогенез позвоночных животных.

1.12. Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток беспозвоночных in vitro.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

3.1. Животные.

3.2. Получение актомиозиновых (AM) экстрактов мидии.

3.2.1. Выделение актомиозиновых экстрактов из яйцеклеток и личинок мидии и приготовление проб для электрофореза.

3.2.2. Выделение актомиозиновых экстрактов из переднего аддуктора взрослых животных и приготовление проб для электрофореза.

3.3. Электрофорез в 8% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

3.3.1. Приготовление геля.

3.3.2. Условия разделения и окрашивания гелей.

3.4. Количественный анализ белков, разделенных электрофорезом.

3.5. Получение поликлональных антител кролика к белкам толстых нитей гладких мышц мидии.

3.6. Иммуноблотгинг.

3.7. Процедура получения первичной культуры клеток мидии.

3.7. /. Фракционирование клеток личинок мидии в градиенте Перколла.

3.8. Антитела.

3.9. Иммунохимия.

3.10. Сканирующая конфокальная лазерная микроскопия и обработка изображений.

3.12. Определение пролиферативной активности клеток in vitro.

3.12.1. Детекция БДУ в культуре клеток мидии.

3.12.2. Выявление активности щелочной фосфатазы в культуре клеток мидии 44 4.1. Выделение тотальной РНК и ее очистка.

4.1. ОТ-ПЦР.

4.2. Статистическая обработка полученных данных.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. МИОГЕНЕЗ IN VIVO.

4.1.1. Экспрессия мышечных белков мидии М. trossulus.

4.1.1.1. Изменение состава мышечных белков в онтогенезе мидии.

4.1.1.2. Количественная оценка соотношения основных белков мышц личинок и взрослых моллюсков.

4.1.2. Анализ экспрессии твитчина на разных стадиях развития мидии.

4.1.3. Детекция парамиозина в раннем эмбриогенезе мидии.

4.1.4. Морфологический анализ развивающейся мышечной системы.

4.1.5. Локализация мышечных и нейрональных элементов на ранних стадиях развития мидии.

4.2. МИОГЕНЕЗ IN VITRO.

4.2.1. Первичная культура клеток личинок мидии М. trossulus.

4.2.2. Пролиферация клеток на разных субстратах.

4.2.3. Выявление активности щелочной фосфатазы.

4.2.4. Миофибриллогенез in vitro.

4.2.5. Миогенная и нейрональная дифференцировка в первичной культуре клеток мидии.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. МИОГЕНЕЗ IN VIVO.

4.1.1. Анализ белкового состава мышц личинок мидии.

4.1.2. Миогенная и нейрональная дифференцировка личинок мидии М. trossulus

4.2. МИОГЕНЕЗ IN VITRO.

4.2.1. Поведение клеток в культуре.

4.2.2. Миофибриллогенез.

4.2.3. Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток в культуре мидии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии Mytilus trossulus in vivo и in vitro"

Актуальность проблемы

Выяснение механизмов, контролирующих дифференциацию мышечной и нервной системы, является одной из важнейших проблем современной биологии развития. Большинство исследований миогенеза и нейрогенеза было проведено на позвоночных животных. Однако прогресс, достигнутый в последнее время в изучении развития мышечной и нервной систем в некоторых группах беспозвоночных животных, позволит выяснить общие закономерности развития двух систем.

У двустворчатых моллюсков обнаружены поперечно-полосатые, косо-исчерченные и гладкие мышцы. Гладкие мышцы моллюсков - это одна из общепринятых модельных систем для изучения регуляции мышечного сокращения и, в частности, механизма запирательного тонуса, регулируемого нейромедиаторами (Twarog, 1976). Сердцевину толстых нитей таких мышц образует белок парамиозин (Riiegg, 1961), на поверхности которого расположены миозин (Szent-Gyorgyi et al., 1971), миород (Shelud'ko et al., 1999) и твитчин (Vibert et al., 1993). Предполагают, что фосфорилирование твитчина регулирует запирательный тонус гладких мышц двустворчатых моллюсков (Siegman et al., 1998), а в основе этого явления лежит образование твитчиновых сшивок между толстыми и тонкими нитями (Shelud'ko et al., 2004; 2007). Свойства мышц взрослых моллюсков интенсивно изучаются уже более 40 лет. Однако данные о времени начала дифференцировки, образования зрелых мышечных волок и последующего формирования мышечной системы в онтогенезе моллюска Mytilus trossulus отсутствуют.

Двустворчатые моллюски имеют бифазный жизненный цикл, в котором взрослому животному предшествует стадии свободно плавающих личинок. Очевидное эволюционное преимущество такого цикла - повышенная выживаемость и лучшее расселение потомков. Развитие некоторых двустворчатых моллюсков изучено на уровне электронной микроскопии (Ваупе, 1976; Cragg, 1985; Малахов, Медведева, 1985; Cragg, Crisp, 1991; Флячинская, Кулаковский, 1991), но детальное изучение мышц личинок двустворчатых моллюсков с применением современных методов биохимии и иммунологического маркирования ранее не предпринимались, а данных о взаимодействии мышечной и нервной систем, особенно на ранних этапах развития, отсутствуют. Использование первичной культуры клеток личинок мидии Mytilus trossulus и современных адекватных маркеров дифференцировки могут помочь заполнить «белые пятна» в исследовании основных этапов развития мышечной и нервной систем моллюсков.

Цель и задачи работы

В рамках поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• выяснить последовательность появления мышечных белков в развитии мидии;

• определить стадию начала экспрессии гена твитчина в развитии мидии;

• провести детальный морфологический анализ развивающейся мышечной системы личинок мидии;

• Выяснить, возможно ли воспроизведение миогенной и нейрональной программ дифференцировки в первичной культуре клеток полученной из личинок мидии премиогенных стадий развития.

Научная новизна и теоретическое значение работы

Впервые установлено, что парамиозин белок толстых нитей мидии присутствует в кортексе неоплодотворенных яйцеклеток мидии М. trossulus. Другие белки толстых нитей, твитчин и миозин, экспрессируются одновременно в первых мышечных клетках личинок мидии и задолго до начала формирования мышечной системы личинки мидии велигера. Мышцы взрослого моллюска закладываются на стадии раннего велигера и развиваются параллельно с мускулатурой личинки. Показано, что поперечно-полосатые миофибриллы появляются на ранних стадиях развития личинок. Обнаружена кардинальная перестройка мышечной системы личинки во время метаморфоза, в результате которой развивается полноценная гладкая мускулатура взрослых моллюсков, способная к состоянию запирательного тонуса. Показано, что первые нервные клетки появляются раньше мышечных клеток личинок двустворчатых моллюсков. Миогенная и нейрональная программы, запускаемые в раннем онтогенезе моллюсков, могут быть реализованы в культуре клеток, полученных из личинок премиогенных стадий развития. Миогенная программа, воспроизведенная in vitro, сходна с таковой in vivo и в обоих случаях протекает без формирования многоядерных миотуб в отличие от миогенеза позвоночных животных.

Научно-практическое значение работы

Апробация работы и публикации

2006); на Международном симпозиуме «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (г. Москва, 2007); на семинаре Лаборатории структуры и функции хромосом Биологического НИИ СПбГУ (г. Санкт-Петербург,

2007) и на Международном симпозиуме «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008). По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Финансовая поддержка работы

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Дячук, Вячеслав Алексеевич

ВЫВОДЫ

2. Экспрессия гена, кодирующего твитчин, начинается со стадии бластулы.

3. Первые мышечные клетки появляются на стадии ранней трохофоры и формируют кольцо, состоящее из поперечно-полосатых мышечных клеток. Кольцо трансформируется на стадии велигера в отдельные поперечнополосатые ретракторы, которые резорбируются в процессе метаморфоза личинки. При этом гладкие мышцы взрослого моллюска закладываются до метаморфоза на стадии раннего велигера и развиваются параллельно с мускулатурой личинки.

5. Миогенная и нейрональная программы дифференцировки могут быть воспроизведены в культуре клеток. Миогенная программа, воспроизведенная in vitro, сходна с таковой in vivo и в обоих случаях протекает без формирования многоядерных миотуб в отличие от миогенеза позвоночных животных. Обнаружена самоорганизация диссоциированных клеток мидии в культуре с образованием нейромышечных колоний. Синаптических контактов при кокультивирования миоцитов и нейронов не обнаружено.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Нэлии Адольфовне Одинцовой и заведующему лаборатории биофизики клетки ИБМ им. А.В. Жирмунского Николаю Семеновичу Шелудько. Я также искренне благодарен моим коллегам из лаборатории сравнительной физиологии ИБР им. Н.К. Кольцова РАН д.б.н. Л.П. Незлину, д.б.н. Е.Е. Воронежской, сотруднику NHLBI/NIH (США) к.б.н. С. Плотникову за ценные замечания и комментарии в обсуэ/сдении работы, заведующей лаборатории структуры и функции хромосом д.б.н. Е.Р. Гагинской за предоставленную возможность работы в ЦКП "ХРОМАС" СПбГУ и сотрудников лаборатории А. Юргениса и А. Радаева. Отдельная благодарность сотрудникам вивария ТИБОХа и лично Г.Ф. Павленко за возможность работы по получению антител, главному специалисту группы электронной микроскопии ИБМ им. ЖирмуДВО РАН Д.В. Фомину за помощь в напылении стекол и научному сотруднику ИБМ ДВО РАН Н.К. Колотухиной за помощь в сборе личинок мидии из планктона. Я также искренне благодарю моих коллег из лаборатории и биофизики клетки и лаборатории генетики ДВО РАН: Яковлева КВ., Кипрюшину Ю.О., Матусовского О.С, Матусовскую Г.Г. и Семину А.В. за помощь в работе, ценные советы и теплую рабочую атмосферу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе представлены результаты исследования анатомии мышц в процессе развития двустворчатого моллюска М. trossulus. Сделан акцент на развитие мышечной и нервной системы личинок мидии ранних стадий развития мидии. Описаны пространственные и временные паттерны экспрессии и организации мышечных белков в строго-упорядоченные структуры, саркомеры. Впервые установлено, что парамиозин белок толстых нитей мидии присутствует в кортексе неоплодотвореиных яйцеклеток мидии М. trossulus. Мышечные белки экспрессируются одновременно в первых мышечных клетках личинок мидии и задолго до начала сборки мышечной системы личинки мидии велигера. Показано, что исчерченные миофибриллы появляются на ранних стадиях развития личинок. Обнаружена резорбция поперечно-полосатой части мышечной системы личинки после метаморфоза, в результате которой развивается полноценная гладкая мускулатура взрослых моллюсков, способная к состоянию запирательного тонуса. Показано, что мышечные клетки и нейроны личинок появляются на ранних стадиях развития мидии, однако нейроны дифференцируются немного раньше, чем миоциты. Обнаружено, что серотонин-иммунореактивные клетки расположены в центре поперечно-полосатого мышечного кольца, а РМИРамидные клетки на его периферии. Впервые разработаны условия миогенной и нейрональной дифференцировки клеток личинок мидии в культуре. С помощью специфических маркеров прослежены основные стадии морфогенеза нейронов и миоцитов. Миогенная программа, воспроизведенная in vitro, сходна с таковой in vivo и в обоих случаях протекает без формирования многоядерных миотуб в отличие от миогенеза позвоночных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дячук, Вячеслав Алексеевич, Владивосток

1. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализаМ: Высшая школа, 1991. 288 с.

2. Жуков Е.К., Итина Н.А., Магазаник Л.Г., Мандельштам Ю.Г., Наследов Г.А., Свидерский В.Л.,Скоробовичук Н.Ф., Ушаков В.Б. Развитие сократительной функции мышц двигательного аппрата. Л.-.Наука. 1974. 170 с.

3. Керкис А.Ю., Исаева В.В. Влияние прикрепления к твердому субстрату на структурную организацию скелетно-мышечных симпластов //Цитология. 1988. Т.ЗО, №1. С. 44-48.

4. Малахов В.В., Медведева Л. А. Эмбриональное и раннее личиночное развитие двустворчатого моллюска Mytilus edulis (Mytilida, Mytilidae) // Зоол. Журнал. 1985. Т. LXIV, вып. 12. С. 1808-1814.

5. Мотавкин П.А., Хотимченко Ю.С., Деридович И.И. Регуляция размножения и биотехнология получения половых клеток у двустворчатых моллюсков. М.: Наука. 1985.216 с.

6. Одинцова Н.А., Дячук В.А., Карпенко А.А. Развитие мышечного аппарата и сократительной активности мидии Mytilus trossulus (Mollusca: Bivalvia). Онтогенез. 2007. Т. 38, №. 3. С. 235-240.

7. Одинцова Н.А. Основы культивирования клеток морских беспозвоночных. Владивосток: Дальнаука. 2001. 162 с.

8. Озернюк Н.Д. Регуляция миогенеза // Известия АН. Серия Биологическая. 1998. №3. С. 330-343.

9. Озернюк Н.Д. Сравнительные особенности миогенеза у беспозвоночных, низших и высших позвоночных животных // Онтогенез 2004. Т. 35, № 6. С. 441450.

10. Сахаров Д.А., Каботянский Е.А. Интеграция поведения крылоногого моллюска дофамином и серотонином // Журн. общей биологии. 1986. Т. 47. С. 234245.

11. Флячинская Л.П., Кулаковский Э.Л. Личиночное развитие двустворчатого моллюска Mytilus edulus (Mytilida, Mytilidae) // Зоол. Журнал. 1991. Т. 70, вып. 11. С. 23-29.

12. Ambros V.R. Control of developmental timing in Caenorhabditis elegans II Current Opinion in Genetics and Development 2000. Vol. 10. P. 428-433.

13. Ayme-Southgate A., Boubaix C., Riebe Т., Southgate R. Assembly of the giant protein projectin during myofibrillogenesis in Drosophila indirect flight muscles // BMC Cell Biology. 2004. Vol.5 P. 1-11.

14. Barber B.J., Blake N.J. Intra-organ biochemical transformations associated with oogenesis in the bay scallop, Argopecten irradians concentricus (Say), as indicated by 14C incorporation //Biol. Bull. 1985. Vol. 168, № 1. P. 39-49.

15. Bate M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila // Development 1990. Vol. 110, № 3. P. 791-804.

16. Bate M., Arias A.M. The Development of Drosophila melanogaster И Drosophila / Ed. Bate M., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. P. 200-290.

17. Bayne B.L. The biology of mussel larvae // Marine mussels: their ecology and physiology / Ed.: Bayne B.L. Cambridge University Press, Cambridge. 1976. P. 81-120.

18. Beach R.L., Jeffery W.R. Multiple actin genes encoding the same muscle isoform are expressed during ascidian development // Dev. Biol. 1992. Vol. 151. P. 55-66.

19. Bechem M., Pieper F., Pott L. Guinea pig arterial cardioballs // Basic Res. Cardiol. 1985. Vol. 80, suppl. 1. P. 19-22.

20. Beinbrech G., Ashton F.T., Pepe F.A. The invertebrate myosin filament: subfilament arrangement of the solid filaments of insect flight muscles // Biophys J. 1992. Vol. 61, № 6. P. 1495-512.

21. Bejsovec A., Anderson P. Functions of the myosin ATP and actin binding sites are required for C. elegans thick filament assembly // Cell. 1990. Vol. 60, № 1. P. 133-40.

22. Benian G.M., Kiff J.E., Neckelmann N., Moerman D.G., Waterston R.H. Sequence of an unusually large protein implicated in regulation of myosin activity in C. elegans II Nature 1989. Vol. 342. P. 45-50.

23. Berker K. A., HartN.H. Reorganization of filamentous actin and myosin-II in zebrafish eggs correlates temporally and spatially with cortical granule exocytosis // J. Cell Sci. 1999. Vol. 112. P. 97-110.

24. Bhadriraju K., Hansen L.K. Extracellular matrix- and cytoskeleton-dependent changes in cell shape and stiffness II Exp.Cell Res. 2002. Vol. 278. P. 92-100.

25. Bird A.F., Bird J. The structure of nematodes // Nematode / Ed.: Bird A.F. S. Diego, CA, Academic Press, 1991. P. 102-180.

26. Braubach O.R., Dickinson A.J.G., Evans C.C.E., Croll R.P. Neural control of the velum in larvae of the gastropod, Ilyanassa obsolete II J. Exp. Biol. 2006. Vol. 209. P. 4676-4689.

27. Broadie K.S., Bate M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster II J. Neurosci. 1993. Vol. 13. P. 144-166.

28. Broadie K.S., Bate M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster // J. Neurosci. 1993a. Vol. 13. P. 167-180.

29. Broadie K.S., Bate M. Muscle development is independent of innervation during Drosophila embryogenesis // Development 1993b. Vol. 119. P. 533-543.

30. Broadie K.S., Bate M. Innervation directs receptor synthesis and localization in Drosophila embryo synaptogenesis // Nature 1993c. Vol. 361. P. 350-353.

31. Broadie K.S., Bate M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis // Neuron 1993d. Vol. 11. P. 607-619.

32. Brown S.J, Riddle D.L. Gene interactions affecting muscle organization in Caenorhabditis elegans II Genetics. 1985, Vol. 110, № 3. P. 421-440.

33. Bucher E.A., Seydoux G.C. Gastrulation in the nematode Caenorhabditis elegans // Seminars in Developmental Biology 1994. Vol. 5. P. 121-130.

34. Bullard В., Linke W.A., Leonard K. Varieties of elastic protein in invertebrate muscles // J. Muscle Res. Cell Motil. 2002. Vol. 23. P. 435-447.

35. Buznikov G.A., Lambert PI.W., Lauder J.M. Serotonin and serotonin-like substances as regulators of early embryogenesis and morphogenesis // Cell Tissue Res. 2001 Vol. 305, №2. P. 177-86.

36. Campagnola P.J., Loew L.M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. //Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21. P. 1356-1360.

37. Chen S.N., Wen C.M. Establishment of the cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding 11 Methods in Cell Science. 1999. Vol. 21. P. 183-192.

38. Chiba S., Awazu S., Itoh M., Chin-Bow S.T., Satoh N., Satou Y., Hastings K.E.M. A genome wide survey of developmentally relevant genes in Ciona intestinalis. IX. Genes for muscle structural proteins // Dev. Genes Evol. 2003. Vol. 213. P. 291-302.

39. Christensen M., Estevez A., Yin X., Fox R., Morrison R., McDonnel M., Gleason C., Miller III D.M., Strange K. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells // Neurons 2002. Vol. 33. P. 503-514.

40. Cohen C. Matching molecules in the catch mechanism // Proc. Natl. Acad.Sci. USA-Biol. Sci. 1982. Vol. 79. P. 3176-3178.

41. Cooley L., Verheyen E., Ayers K. chickadee encodes a profiling required for intercellular cytoplasm transport during Drosophila oogenesis // Cell. 1992. Vol. 69. P. 173-184.

42. Costa M.L., Escaleira R.C., Manasfi M., Souza L.F., Mermelstein C.S. Cytoskeletal and cellular adhesion proteins in zebrafish (Danio rerio) myogenesis // Bras. J. Med. Biol. Res. 2003. Vol. 36, № 8. P. 1117-1120.

43. Cragg S.M. The adductor and retractor muscles of the veliger of Pecten maximus (L) (Bivalvia) // J. Molluscan Stud. 1985. Vol. 51. P. 276-283.

44. Cragg S. M., Crisp D.J. The biology of scallop larvae // Biology, Ecology and Aquaculture of Scallops / Ed.: Shumway S.E. Elsevier, Amsterdam. 1991. P. 75-132.

45. Cripps R.M., Suggs J., Bernstein S. Assembly of thick filaments and myofibrils occurs in the absence of the myosin head // EMBO J. 1999. Vol. 18, № 7. P. 1793-1804.

46. Croll R.P. Insights into early molluscan neuronal development through studies of transmitter phenotypes in embryonic pond snails // Microsc Res Tech. 2000 Vol. 49, № 6. P. 570-8.

47. Croll R.P., Voronezhskaya E.E. Early FMRFamide-like immunoreactive cells in gastropod neurogenesis // Acta Biol. Hung. 1995.Vol. 46. P.295-303.

48. Crossley„ A.C. The morphology and development of the Drosophila muscular system //. The Genetics and Biology of Drosophila /Ed.: Ashburner M., Wright T.R.F. 1978. Vol. 2b, P. 499-560.

49. Cumin R. Normantafel zur Organogenese von Limnaea stagnalis (Gastropoda, Pulmonata) mit besonderer Berucksichti gung der Mittekdarmdruse // Rev. Suisse Zool. 1972. Vol. 79. P. 709-774.

50. Davidson В., Swalla B.J. A molecular analysis of ascidian metamorphosis reveals activation of an innate immune response // Development. 2002. Vol. 129. P. 4739-4751.

51. Dickinson A.J.G., Nason J., Croll R.P. Histochemical localization of FMRFamide, serotonin and catecholamine in embryonic Crepidula fornicata (Prosobranchia: Gastropoda) // Zoomorphology. 1999. Vol. 119. P. 49-62.

52. Dickinson A.J.G., Croll R.P., Voronezhskaya E.E. Development of embryonic cells containing serotonin, catecholamines and FMRFamide-related peptides in Aplysia californica I I Biol. Bull. 2000. Vol. 199. P.305-315.

53. Dlugosz A.A., Antin P.B., Nachmias V.T., Holtzer II. The relationship between stress fiber-like structures and nascent myofibrils in cultured cardiac myocytes // J. Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 2268-2278.

54. Donoghue M.J., Sanes J.R. All muscles are not created equal // Trends Genet. 1994. Vol. 10. P. 396-401.

55. Du A., Sanger J.M, Linask K.K., Sanger J.W. Myofibrillogenesis in the first cardiomyocytes formed from isolated quail precardiac mesoderm // Dev. Biol. 2003a. Vol. 57. P. 382-394.

56. Du A., Sanger J.M., Sanger J.W. Cardiac myofibrillogenesis follows similar pathways in ovo, in explants, and in tissue culture 11 Mol. Biol. Cell. 2003b. Vol. 14. P. 423a.

57. Ehler E., Rothen B.M., Haemmerle S.P., Komiyama M., Perriard J.C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments // J. Cell Sci. 1999. Vol. 112. P. 1529-1539

58. Elekes K. Electron microscopic autoradiography of serotonin uptake in the ganglia of Anodonta cygnea L. II Acta Biol. Acad. Sci. Hung. 1976. Vol. 27. P. 183-190.

59. Elekes К. Autoradiographic localization of monoamine uptake in the central nervous system of the marine mollusc (Mactra stultorum L., Pelecypoda) //Neurosci. 1978. Vol. 3. P. 49-58.

60. Elliott A. The arrangement of myosin on the surface of paramyosin filaments in the white adductor muscle of Crassostrea angulata II Proc. R. Soc. Lond. 1974. Vol. 186B.P. 53-66.

61. Engler A., Sen S., Sweeney H.L., Discher D.E. Matrix elasticity stem cell lineage specification // Cell. 2006. Vol. 126. P.677-689.

62. Epstein H.F., Casey D.L., Ortiz I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multifilament assemblages // J. Cell Biol. 1993. Vol.122. P. 845-858.

63. Epstein H.F., Waterston R.H., Brenner S. A mutant affecting the heavy chain of myosin in Caenorhabditis elegans И J. Mol. Biol. 1974. Vol. 90. P. 291-300.

64. Fallon J.R., Nachmias V.T. Localization of cytoplasmic and skeletal myosins in developing muscle cells by double-label immunofluorescence // J. Cell Biol. 1980. Vol. 87. P. 237-247.

65. Ferrari M.B., Ribbeck K., Hagler D.J., Spitzer N.C. A calcium cascade essential for myosin thick filament assembly in Xenopus myocytes // J. Cell Biol. 1998. Vol 141. P. 1349-1356.

66. Fernandes J., Bate M., Vijayraghavan K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila // Development 1991. Vol. 113, № 1. P. 67-77.

67. Florey E. Acetylcholine as sensory transmitter in Crustacea // J. Сотр. Physiol. 1973. Vol. 83. P. 1-16

68. Furst A., Mahowald A. Cell Division Cycle of Cultured Neural Precursor Cells from Drosophila//Dev.Biol. 1985. Vol. 112. P. 467-476.

69. Furst D.O., Osborn M., Weber K. Myogenesis in the mouse embryo: differential onset of expression of myogenic proteins and the involvement of titin in myofibril assembly //J. Cell Biol., 1989. Vol. 109. P. 517-527.

70. Giribet G., Wheeler W. On bivalve phylogeny: a high-level analysis of the Bivalvia (Mollusca) based on combined morphology and DNA sequence data // Invert Biol. 2002. Vol. 121. P. 271-324.

71. Goddart J.H.R. Ametamorphic direct development in Dendrodoris behrensi (Nudibranchia: Dendrodorididae), with a review of developmental mode in the family // PCAS. 2005. Vol. 56, № 19. P. 201-211.

72. Grimaldi A., Tettamanti G., Guidali M.L., Brivio M.F., Valvassori R., Eguilor M. A hedgehog-like signal is involved in slow muscle differentation in Sepia officinalis (Mollusca) // ISJ. 2007. Vol 4. P. 1-9.

73. Grimmelikhuijzen C.J.P., Dockray G.J., Schot L.P.C. FMRFamid-like immunoreactivity in the neuron system of hydra // Histochemistry. 1982. Vol. 73. P. 499508.

74. Haba G.De L., Kamali H.M., Tiede D.M. Myogenesis of avian striated muscle in vitro: Role of collagen in myofiber formation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1975. Vol. 72, № 7. P. 2729-2732.

75. Hadfield M.G., Carpizo-Ituarte E.J., Carmen K.D., Nedved B.T. Metamorphic Competence, a Major Adaptive Convergence in Marine Invertebrate Larvae // Amer. Zool. 2001. Vol. 41. P. 1123-1131.

76. Hakeda S., Endo S., Saigo K. Requirements of kettin, a giant muscle protein highly conserved in overall structure in evolution, for normal muscle function, viability, and flight activity of Drosophila // J. Cell Biol. 2000. Vol. 148. P. 101-114.

77. Hall Z.W., Sanes, J.R. Synaptic structure and development: The neuromuscular junction //Neuron 1993. Vol. 10. P. 99-122.

78. Haszprunar G., Wanninger A. Molluscan muscle systems in development and evolution // J. Zool. Syst. Evol. Res. 2000. Vol. 38. P. 157-163.

79. Hauschka S., Konigsberg I.R. The influence of collagen on the development of muscle clones // Proc. Nat. Acad.Sci. US. 1966. Vol. 55. P. 119-126.

80. Hessling R., Westheide W. Are Echiura derived from a segmented ancestor? Immunohistochemical analysis of the nervous system in developmental stages of Bonellia viridis И J. Morphol. 2002. Vol. 252, № 2. P. 100-13.

81. Hill C., Weber K. Monoclonal antibodies distinguish titins from heart and skeletal muscle//J. Cell Biol. 1986. Vol. 102. P. 1099-1108.

82. Holland L.Z. Muscle development in amphioxus: morphology, biochemistry, and molecular biology // Isr. J. Zool. 1996. Vol. 42. P. 235-246.

83. Holtzer H., Hijikata Т., Lin Z.X., Zhang Z.Q., Holtzer S., Protasi F., Franzini-Armstrong C., Sweeney H.L. Independent assembly of 1.6 micron long bipolar MHC filaments and I-Z-I bodies // Cell Struc. Funct. 1997. Vol. 22. P. 83-93.

84. Hresko M.C., Williams B.D., Waterston R.H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans II J. Cell Biol. 1994 Vol. 124, №4. P. 491-506.

85. Holtzer H., Weintraub H., Mayne R., Mochan B. The cell cycle, cell lineages, and cell differentiation // Curr. Top Dev. Biol. 1972. Vol. 7. P. 229-256.

86. Hooper S., Thuma J.B. Invertebrate muscle: muscle specific genes and proteins // Physiol. Rev. 2005. Vol. 85. P. 1001-1060.

87. Kagawa H., Gengyo K., McLachlan A.D., Brenner S., Karn J. Paramyosin gene (unc-15) of Caenorhabditis elegans: molecular cloning, nucleotide sequence and models for thick filament structure // J. Mol. Biol. 1989. Vol. 207. P. 311-333.

88. Kagawa H., Takuwa К., Sakube Y. Mutations and expressions of the tropomyosin gene and the troponin С gene of Caenorhabditis elegans II Cell Struct. Funct. 1997. Vol. 22. P. 213-218.

89. Khaitlina S.Y. Functional specificity of actin isoforms. In International Review of Cytology a Survey of Cell Biol. Academic Press Inc, San Diego. 2001. Vol. 202, pp. 3598

90. M.H, DiLullo C., Schultheiss Т., Holtzer S., Murray J.M., Choi J., Fischman D.A., Holtzer H. The vinculin/sarcomericalpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes // J. Cell Biol. 1992. Vol. 117. P. 1007-1022.

91. Maekawa S., Toriyama M., Sakai H. Tropomyosin in the sea urchin egg cortex // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 178. P. 657-662.

92. Malanga C. J., Poll K.A. Effects of serotonin (5-HT) and dopamine (DA) on particle transport by frontal gill cilia of three species of bivalve molluscs // Fed. Proc. 1979. Vol. 34, №3. P. 801.

93. Margulis B.A., Bobrova I.F., Mashanski V.F., Pinaev G.P. Major myofibrillar protein content and the structure of mollusc adductor contractile apparatus // Comp Biochem. Physiol. A. 1979. Vol. 64. P. 291-298.

94. Masaki Т., Yoshizaki C. Differentiation of myosin in chick embryos // J. Biochem. 1974. Vol. 76, №1. P. 123-131.

95. Moerman D., Fire A. Muscle: structure, function, and development // C. Elegans II. Cold Harbor Lab. Press, 1997. P. 50-79.

96. Myers C.D., Goh P.Y., Allen T.S., Bucher E.A., Bogaert T. Developmental genetic analysis of troponin T mutations in striated and nonstriated muscle cells of Caenorhabditis elegans //J. Cell Biol. 1996. Vol. 132. P. 1061-1077.

97. Myers P.R., Sweeney C. The determination of the catecholamines and their metabolites in the pedal ganglion of Quadrula pustulosa (Mollusca, Pelecypoda) // Com. and Gen. Pharmacol. 1972. Vol. 3. P. 277-282.

98. Naganuma Т., Degnan B.M., Horikoshi K., Morse D.E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens II Mol. Marine Biol. Biotechnol. 1994. Vol. 3. P. 131-140.

99. Nezlin L.P., Voronezhskaya E.E. Novel, posterior sensory organ in the trochophore larvae of Phyllodoce maculata (Polychaeta) // Proc. R. Soc .Lond. B. 2003. Vol.270. P. 159-162.

100. Odintsova N.A., Ermak A.V., Tsal L.G. Substrate selection for long-term cultivation of marine invertebrate cells // Сотр. Bioch. Physiol. 1994. Vol. 107A. P. 613-619.

101. Odintsova N.A., Khomenko A. V. Primary cell culture from embryos of the Japanese scallop Mizuchopectenyessoensis (Bivalvia) // Cytotechnol. 1991. Vol. 6, № 1. P. 49-54.

102. Odintsova N.A., Plotnikov S.V., Karpenko A. A. Isolation and partial characterization of myogenic cells from larvae in vitro // Tissue & Cell. 2000. V. 32, № 5. P. 417-424.

103. Odintsova N., Dyachuk V, Kiselev K, Shelud'ko N. Expression of thick filament proteins during ontogenesis of the mussel Mytilus trossulus (Mollusca: Bivalvia). Comp.Biochem. Biophys. B. 2006, V. 144/2: 238-244.

104. Olson E.N. The MyoD family, a paradigm for development? // Genes Devel. 1990. Vol.4. P. 1454.

105. Page L.R. Larval shell muscle in the abalone Haliotis kamtschatkana II Biol.Bull. 1997. Vol. 193. P. 30-47.

106. Page L.R., Parries S.C. Comparative study of the apical ganglion in planktotrophic caenogastropod larvae: ultrastructure and immunoreactivity to serotonin // J. Сотр. Neurol. 2000. Vol. 418.P. 383-401.

107. Painter S.D. FMRFamide inhibition of a molluscan heart is accompanied by increases in cyclic AMP // Neuropeptides. 1982. Vol. 3. P. 19-27.

108. Painter S.D., Greenberg M.J. A survey of the responses of Bivalve hearts to the molluscan neuropeptide FMRF-amide and 5-hydroxytryptamine // Biol. Bull. 1982. Vol. 162, №3. P. 311-332.

109. Pasacreta T.C., Byers T.J., Dubreuil R., Kiehart D. P., Branton D. Drosophila spectrin: the membrane skeleton during embryogenesis. // J. Cell Biol. 1989. Vol.108. P. 1697-1709.

110. Plesch B. An ultrastructural study of the musculature of the pond snail Lymnaea stagnalis (L.) // Cell Tissue Res. 1977. Vol. 180. P. 317-340.

111. Plotnikov S.V., Karpenko A.A., Odintsova N.A. Comparative characteristic of Mytilus muscle cells developed in vitro and in vivo I I J. Exp. Zool. 2003. Vol. 298 A. P. 77-85.

112. Polyak E., Standiford D.M., Yakopson V., Emerson C.P., Franzini-Armstrong C. Contribution of myosin rod protein to the structural organization of adult and embryonic muscles in Drosophila // J. Mol. Biol. 2003. Vol. 331. P. 1077-1091.

113. Poulson D.F. Histogenesis, organogenesis and differentiation in the embryo of Drosophila melanogaster И Biology of Drosophila /Ed.: Demerec M. Wiley, New York, 1950. P. 168—274.

114. Price D.A., Greenberg M.J. Purification and characterization of a cardioexcitatory neuropeptide from the central ganglia of a bivalve mollusc // Prep. Biochem. 1977. Vol. 7. P. 261-281.

115. Priess J. R., Hw H.D. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in the elongation of the embryo // Dev. Biol. 1986. Vol. 117. P. 156-173.

116. Puri E.C., Caravatti M., Perriard J.C., Turner D.C., Eppenberger H.M. Anchorage-independent muscle cell differentiation//Proc.Nat. Acad.Sci. US. 1980. Vol. 77. P. 5297-5301.

117. Raven C. P., Morphogenesis: the analysis of molluscan Development, second ed. Pergamon, Oxford, 1966.

118. Rhee D., Sanger J.M., Sanger J.W. The premyofibril: evidence for its role in myofibrillogenesis //Cell Motil. Cytoskeleton. 1994. Vol. 28, № 1. P. 1-24.

119. Riddle D.L., Brenner S. Indirect suppression in Caenorhabditis elegans II

120. Genetics. 1978. Vol. 89(2). P. 299-314.

121. Robertson C.W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes // J. Morph. 1936. Vol. 59. P. 351-399.

122. Roy S., Wolff C., Ingham P.W. The u-boot mutation identifies a Hedaehog-regulated myogenic switch for fiber-type diversification in the zebrafish embryo // Gene and Dev. 2001. Vol. 15. P. 1563-1576.

123. Ruegg J. C. Smooth muscle tone // Physiol. Rev. 1971. Vol. 51. P. 201-248. Sakharov D.A. The multiplicity of neurotransmitters: the functional significance // Zh Evol Biokhim Fiziol. 1990. Vol. 26, № 5. P. 733-741.

124. Salvaterra P.M., Bournias-Vardiabasis N., Nair Т., Hou G., Lieu C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells // J. Neuroscience 1987. Vol. 7, № 1. P. 10-22

125. Sanger J.W., Kang S., Siebrands C.C., Freeman N., Du A., Wang J., Stout A.L., Sanger J.M. How to build a myofibril // J. Muscle Res. Cell Motil. 2005. Vol. 26. P.343-354

126. Satou Y. Gene expression profiles in tadpole larvae of Ciona intestinalis II Dev. Biol. 2002. Vol. 242. P. 188-203.

127. Schneider J. A. Bivalve systematics in the 20th century // J. Paleontol. 2001. Vol. 75. P. 1119-1127.

128. Schultz J.R., Tansey Т., Gremke L., Storti R.V. A muscle specific intron enhancer required for rescue of indirect flight muscle and jump muscle function regulates Drosophila tropomyosin I gene expression // Mol. Cell Biol. 1991. Vol. 11. P. 1901— 1911.

129. Seecof R.L., Unanue R.L. Differentiation of embryonic Drosophila cells in vitro // Exp. Cell Res. 1968. Vol. 50. P. 654-660.

130. Shelud'ko N.S., Preminger N.K. Myosin-actin weight ratio phasic and tonic parts of scallop adductor // Сотр. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 93A. P. 327-330.

131. Shelud'ko N.S., Matusovskaya G.G., Permyakova T.V., Matusovsky O.S. Twitchin, a thick-filament protein from molluscan catch muscle, interacts with F-actin in a phosphorylation-dependent way // Arc. Biochem. Biophys. 2004. Vol. 423. P. 269-277.

132. Shelud'ko N.S., Tuturova K. Ph., Permyakova T.V., Plotnikov S. V., Orlova A.A. A novel thick filament protein in smooth muscles of bivallvia mollusks // Com. Biochem. Physiol. 1999. Vol. 122. P. 277-285.

133. Shott R.J., Lee J. J., Britten R.J., Davidson E.H. Differential expression of the actin gene family of Strongylocentrotus purpuratus // Dev. Biol. 1984. Vol. 101. P. 295-306.

134. Sohn R.L., Vikstrom K.L., Strauss M., Cohen C., Szent-Gyorgia A.G. A 29 residue region of the sarcomeric myosin rod is necessary for filament formation // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 266. P.317-330.

135. Standiford D.M., Davis M.B., Miedema K., Franzini-Armstrong C., Emerson C.P. Myosin rod protein: a novel thick filament component of Drosophila muscle // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 265. P. 40-55.

136. Sulston J.E., Schierenberg E., White J.G., Thomson J.N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans // Dev. Biol. 1983. Vol. 100. P. 64-119.

137. Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C., Kendrick-Jones J. Paramyosin and the filaments of molluscan "catch" muscles. II. Native filaments: isolation and characterization // J. Mol. Biol. 1971. Vol. 56, № 2. P. 239-258.

138. Thompson J.T., Kier W.M. Ontogeny of mantle musculature and implications for jet locomotion in oval squid Sepioteuthis lessoniana // J. Ex.p Biol. 2006. Vol. 209, № 3. P. 433-43.

139. Tomlinson C.R, Beach R.L., Jeffery W.R. Differential expression of a muscle actin gene in muscle cell lineages of ascidian embryos // Development. 1987. Vol. 101. P. 751-765.

140. Towbin H., Gordon J., Staehelin T. Electroforetic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 4350-4354.

141. Treager R.T., Squire J.M. Myosin content and filament structure in smooth and striated muscle // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 77. P. 279-290.

142. Tskhovrebova L., Trinick J. Role of titin in muscle regulation // Biophys. J. 2002. Vol. 82. P. 400a.

143. Twarog B.M., Muneoka Y. Calcium and the control of contraction and relaxation in a molluscan catch muscle // Cold Spring Harbor symposium on quantitative biology 1976. Vol. 37. P. 489-504.

144. Vibert P., Edelstein S. M.5 Castellani L., Elliott B. W. Mini-Titins in striated and smooth molluscan muscles structure, location and immunological cross-reactivity // J. Muscle Res. Cell Motil. 1993. Vol. 14. P. 598-607.

145. Vinos J., Maroto M., Garesse R., Marco R., Cervera M. Drosophila melanogaster paramyosin: developmental pattern, mapping and properties deduced from its completecoding sequence // Mol. Gen. Genet. 1992. Vol. 231, № 3. P. 385-94.

146. Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P., Odintsova N.A., Plummer J.T., Croll R.P. Neuronal development in larval mussel Mytilus trossulus (Mollusca: Bivalvia) // Zoomorphology. 2008. Vol. 127. P. 97-110.

147. Voronezhskaya E.E, Tyurin S.A, Nezlin L.P. Neuronal development in larval chiton Ischnochiton hakodadensis (Mollusca: Polyplacophora) // J. Сотр. Neurol. 2002. Vol. 444. P. 25-38.

148. Walthall W.W., Li L., Plunkett J.A., Hsu C.Y. Changing synaptic specifications in the nervous system of Caenorhabditis elegans Differentiation of the DD motoneurons. //Journal ofNeurobiology 1993. Vol. 24. P.1589-1599.

149. Wanninger A. Micromorphology and gene expression in muscle and shell development of the mollusca // Dissertation zur Erlangung des doktorgrades der Fakultat fur Biologie der Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen, Munchen, Marz, 2001. P. 1176.

150. Wanninger A., Haszprunar G. Chiton myogenesis: Perspectives for the development and evolution of larval and adult muscle systems in molluscs // J. Morphol. 2002a. Vol. 251. P. 103-113.

151. Wanninger A., Haszprunar G. Muscle development in Antalis entalis (Mollusca, Scaphopoda) and its significance for scaphopod relationships // J. Morphol. 2002b. Vol. 254. P.53-64.

152. Wanninger A., Haszprunar G. The development of the serotonergic and FMRF-amidergic nervous system in Antalis entalis (Mollusca, Scaphopoda) // Zoomorphology. 2003. Vol. 122. P. 77-85.

153. Wanninger A., Koop D., Bromham L., Noonan E., Degnan B.M. Nervous and muscle system development in Phascolion strombus (Sipuncula) // Dev. Genes Evol. 2005. Vol. 215. P. 509-518.

154. Wanninger A., Ruthensteiner В., Lobenwein S., Salvenmoser W., Dictus W.J., Haszprunar G. Development of the musculature in the limpet Patella (Mollusca, Patellogastropoda) // Dev. Genes Evol. 1999. Vol. 209, № 4. P. 226-238.

155. Warn R., Gutzeit H., Smith L., Warn A. F-actin rings are associated with the ring canals of Drosophila egg chambers // Exp. Cell Res. 1985. Vol. 157. P. 355-363.

156. Watabe S., Iwasaki K., Funabara D., Flirayama Y., Nakaya M., Kikuchi Y. Complete amino acid sequence of Mytilus anterior byssus retractor paramyosin and its putative phosphorylation site // J Exp Zool. 2000. Vol. 286. P. 24-35.

157. Waterston R.H. The minor myosin heavy chain, MHC A, of Caenorhabditis elegans is necessary for the initiation of thick filament assembly // EMBO J. 1989. Vol. 8. P. 3429-3436.

158. Waterston R.H., Thomson J.N., Brenner S. Mutants with altered muscle structure of Caenorhabditis elegans II Dev. Biol. 1980. Vol. 77. P. 271-302.

159. Winkleman L. Comparative studies of paramyosins // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1976. Vol. 55. P. 391-397.

160. White J. Muscle development // The nematode C. elegans / Ed.: Wood W.B. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988. P. 81-122.

161. Wollesen Т., Wanninger A., Klussmann-Kolb A. Neurogenesis of cephalic sensory organs of Aplysia californica II Cell Tissue Res. 2007. Vol. 330. P. 361-379.

162. Wood W.B. C. elegans development // The nematode C. elegans / Ed.: Wood W.B. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 1988. P. 215-241.

163. Yamada A, Yoshio M, Kojima H, and Oiwa K. An in vitro assay reveals essential protein components for the "catch" state of invertebrate smooth muscle // Proc Natl Acad Sci USA 2001.Vol. 98. P. 6635-6640.

164. Yamada A., Yoshio M., Oiwa K., Nyitray L. Catchin, a novel protein in molluscan catch muscles, is produced by alternative splicing from the myosin heavy chain gene. J Mol Biol. 2000. Vol. 295. P. 169-178.

165. Yang Z. Phylogenetic analysis using parsimony and likelihood methods // J. Molec. Evol. 1996. Vol. 42. P. 294-307.

166. Young P. E., Pesacreta Т. C., Kiehart D. P. Dynamic changes in the distribution of cytoplasmic myosin during Drosophila embryogenesis // Development 1991. Vol. 111. P. 1-14.

167. Zhang Y., Featherstone D., Davi/W^Rushton E., Broadie K. Drosophila D-titin is required for myoblast fusion and skeletal muscle striation // J. Cell Sci. 2000. Vol. 113. P. 3103-3115.

Информация о работе

Дячук, Вячеслав Алексеевич
кандидата биологических наук
Владивосток, 2008
ВАК 03.00.30

Диссертация

Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии Mytilus trossulus in vivo и in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы