Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ГОРОДСКИХ ПОЧВ И ВЛИЯНИЕ ПОЛЛЮТАНТОВ НА ПОПУЛЯЦИЮ ESCHERICHIA COLI В СИСТЕМЕ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ГОРОДСКИХ ПОЧВ И ВЛИЯНИЕ ПОЛЛЮТАНТОВ НА ПОПУЛЯЦИЮ ESCHERICHIA COLI В СИСТЕМЕ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ"



IIa нравах рукописи -

ЛЮЛИН СТАНИСЛАВ ЮРЬЕВИЧ

МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ГОРОДСКИХ ПОЧВ И ВЛИЯНИЕ ПОЛЛЮТАНТОВ НА ПОПУЛЯЦИЮ ESCHERICHIA COLI В СИСТЕМЕ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

/Z.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Российского государственного аїрарного университета - МСХЛ имени К Л Тимирязева

Научный руководите чь

Официальные оппоненты

Кандидл к и > шичыких u.tk іоцені О В С ишічі»

локюр оиотоги іеских на\к про{>е».*.ор.І I! Иоробыва

ЛОМОрОИиК ІИЧЄ1-Ь.ИХ IUMv

профессор.І В Мосипа

Ведушая организация Государственное научное "-"чреждение

Всероссийский научно исс едоватеть^кии инсппуг юрчов им ВР Зшп яиса РАС ЧН

Защита диссертации состоится _2007 і » /і і на uujачии

диссертационного совета Д 220 043 03 при Российском гос\дарственж ч аграрном университете - МСХА имени К \ Тимирязева

Адрес 127550 Москва 1 имирязевсхая vi д 44 Ученый сочст Р1 АУ М( Ч \ имени К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ МСХА имени К А I ичиря (<.ва

Автореферат разостан г и размещен на сайте университеи

\vw\v птасас! ги.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук профессор '' В А Каїишш

Актуальность. Как известно, интенсивная и многофункциональная дея-

природными факторами почвообразования, приводя к формированию специфических почв. В Москве только около 6% площади близки к природным экосистемам, на остальных же территориях формируются так называемые урбоэкосисте-мы, которые создаются в результате деградации, уничтожения или замещения природных экосистем. Новообразованные экосистемы характеризуются меньшей рекреационной ценностью, нарушением биокруговорота, сокращением биоразнообразия как по составу, так и по структурно-функциональным характеристикам, увеличением числа патогенных микроорганизмов, причем экология микроорганизмов, в том числе и патогенных, в пределах урбоэкосистем может быть качественно отлична от той, которая была установлена за многолетнюю историю изучения естественных экосистем. Исследования последних лет показывают, что динамику энтеробактерий, в частности Escherichia coli, в почвах не всегда можно объяснить фекальным загрязнением. Способность микроорганизмов занимать все возможные экологические ниши обуславливает необходимость изучения вопроса использования патогенными микроорганизмами, в частности энгеробактериями, растений в качестве возможного местообитания. В настоящее время перестала отвергаться сама возможность длительного существования патогенных микроорганизмов в почвах, водоемах или растениях (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997). Известно, что многие микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae способны проникать внутрь растительных тканей и сохраняться там длительное время. Подобная способность показана для иерсиний (Гордейко В.А., 1991), клебсиелл (Бирюкова О.В., 2001; Соколова А.Я., 2006) и кишечной палочки (Solomon E.B. et al.,2002; Cooley M.B. et al.,2003; Ingham S.C. et al.,2004; Johannessen G. S. et al., 2004). В свете изложенных фактов представляет интерес изучение популяций энтеробактерий в системе почва-растение при загрязнении почвы нефтепродуктами и тяжелыми металлами, являющимися одними из основных загрязнителей шрод-

тельность человека в пределах крупных городов преобладает над ми

ской среды.

РГАУ-МСаА имени К.А. Тимирязева ІІНБ имскк Н.И. Жслеэиова

Следовательно, изучение особенностей городских почв, растите тьности, мониторинг их состояния, особенно в районах массовой застройки, необходим для эффективного оздоровления окружающей среды и населения городов

Целью работы являлось изучение микробных сообществ городских почв, поведения интродуцированной попутяции энтеробактерий в системе почва-растение, а также определение действия поллютантов на взаимодействие растений и микроорганизмов

Задачи исследования

1 Изучить динамику численности основных групп микроорганизмов, в том числе

и саннтарно-показательных, в почвах района «Филевская пойма» г Москвы,

2 Исследовать особенности динамики популяции Escherichia coli в системе почва-растение в условиях антропогенной нагрузки,

3 Определить влияние загрязнения почвы тяжелыми металлами и нефтепродуктами на взаимодействие энтеробактерий и растений,

4 Оценить возможности использования микробных биопрепаратов для подавления активности энтеробактерий и снижения антропогенного воздействия на окружающую среду

Научная новизна. Впервые проведен комплексный многолетний микро-биологичесюш мониторинг почв района массовой застройки «Филевская пойма» Дана количественная характеристика основных групп микроорганизмов, в том числе санитарно-показатетьных, и оценена биологическая активность почв Показана персистенция клеток Е coli в растения различных семейств из почвы через корневую систему и оценена длительность присутствия кишечной палочки внутри растительных тканей Впервые установлено, что в устовиях интенсивного загрязнения почвы нефтепродуктами и тяжелыми металлами на фоне общего снижения численности интродуцированной популяции Е coli в почве и растениях, наблюдается увеличение доли кишечной палочки в растениях Подобное поведение бактерии в системе почва-растение свидетельствует о возможности превращения растений в резервуар патогенных бактерий в условиях интенсивной антропогенной нагрузки, что может являться дополнительным источником загрязнения ок-

ружакяцей среды энгеробактериями. Выявлена способность биопрепарата «Псев-домин», на основе штамма Pseudomonas putida 91-96, подавлять рост Е. coli в почве и внутри растительных тканей.

Практическая значимость. Показана возможность использования микробного метаболического коэффициента (qC02), для определения степени нарушения состояния микробных сообществ почв урбанизированных территорий. Оптимизирована методика определения динамики E.coli в системе почва-растение. Рекомендуется использовать биопрепарат «Псевдомин» для ускорения очищения почв от энтеробактерий, в том числе Е. coli.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной научной конференции, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, 2005); на V Всероссийской научно-практической конференции «Экология и ресурсо- и энергосберегающие технологии на предприятиях народного хозяйства (промышленность, транспорт, сельское хозяйство)» (Пенза, 2005); на Международной научной конференции, посвященной 190-летию со дня рождения первого директора Петровской земледельческой и лесной академии Н.И. Железнова (Москва, 2006); на IV Международной научно-практической конференции «Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России» (Пенза, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на if.^страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение; обзор литературы; описание объектов и методов исследования; результаты и обсуждение; выводы и список литературы, включающий ^^наименования, в том числе зарубежных авторов; приложения. Диссертация иллюстрирована таблица-

^Х

ми и \9. рисунками.

Объекты, методы и условия проведения экспериментов

Объекты н методы проведения мониторинга. Для изучения динамики численности основных групп микроорганизмов в почвах района массовой застройки «Филевская пойма» были заложены пробные площадки на различном

расстоянии от предполагаемого источника загрязнения - завода им Хруничева, расположенного в Западном административном округе Москвы в пределах муниципального округа 'Филевский парк" Микробиологическому изучению были подвергнуты почвы района, расположенного по адресу Филёвский бутьвар, территории домов №№ 34 (пробная площадка № 1) - 450 м, 35 (пробная площадка № 2) - 480 м, 40 (пробная площадка № 3) - 850 м, 41 (пробная площадка № 4) - 910 м, территория стройплощадки дома (владение 10) (пробная площадка Уз 5) - 1200 м В качестве контроля была выбрана аллювиальная почва в рекреационной зоне на берегу Москвы-реки типичная для данного района до начала застройки (пробная площадка № 0) - 1300м До начала массовой застройки почвы пробных площадок исследуемой территории можно было отнести к пойменным аллювиальным, во время и посте окончания застройки - к урбаноземам и урбанотехнозе-мам, а в 2005 г, после проведенной разбивки газонов - к реплантоземам Почвы всех пробных площадок легкого механического состава, характеризуются нейтральной реакцией среды, хотя в некоторых счучаях наблюдается смещение кислотно-щелочного баланса в сторону подщетачивания, что характерно для почв города, невысокой гидролитической кислотностью (1 9-2,5 мг-экв/100 г почвы) Насыщенность основаниями составляла от 87,7 до 93,5 %, содержание гумуса - от 1,3 до 5,2 % Содержание тяжелых металлов в почвах не превышало ПДК Закладку пробных площадок и отбор образцов почв проводили согласно «Методическим указаниям по сашгтарно-микробиологическому исследованию почв» (1977) Площадь каждой пробной площадки составляла 25 мг Образцы почв отбирали из слоя 0-10 см Отбор проб проводили 16 июля 2003 г, 24 сентября 2003 г, 26 июля 2004 г, 29 сентября 2004 г, 19 июля 2005 i , 28 сентября 2005 г Объектами исследования служили основные группы почвенных микроорганизмов в том числе и санитарно-показательные Учет микроорганизмов проводился по общепринятой методике согласно «Методам почвенной микробиологии и биохимии» (1991) Учитывали бактерии, использующие органические формы азота, бациллы, бактерии, использующие минеральные формы азота, актиномицеты, микроскопические грибы, целлюлозоразлагаюшие микроорганизмы, Azotabacter chroococcum Учет

санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ) проводили согласно «Методическим указаниям по санитарно-микробиологическому исследованию почв» (1977). Учитывали бактерии группы кишечной палочки (БПКП); Clostridium perfringens-, термофильные микроорганизмы; нитрифицирующие бактерии. Для сравнения данных в наблюдениях оценивали разность соответствующих средних по t-критерию, вычисляя наименьшую существенную разность (НСР) (Доспехов Б.А.,1985; Дёрффель К.,1994; Вейр Б., 1995). Респирометрические показатели ба-зальное (БД) и субстрат-индуцированное дыхание (СИД), микробную биомассу (СМ1П[) и микробный метаболический коэффициент (qCC>2) определяли в ИФ-ХиБПП РАН (г. Пущино), методами, предложенным в работах Дж. Андерсона и К. Домша (Anderson J.P.E., Domsch К.Н., 1978), в модификации Н.Д. Ананьевой (Ананьева Н.Д. и др., 1993,1997).

Объекты и методы модельных экспериментов. Для изучения особенности динамики популяции Escherichia coli в системе почва-растение в условиях антропогенной нагрузки была проведена серия модельных опытов. Объектами исследований служили бактерии Escherichia coli непатогенного штамма и бактерии Pseudomonas putida штамма 91-96, полученные из коллекции кафедры микробиологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева. В опытах использовали следующие декоративные и сельскохозяйственные растения - класс Двудольных (Dicotylédones): астра однолетняя (Callistephus chinensis), календула лекарственная (Calendula officinalis), салат латук (Lactuca sativa), тыква крупноплодная (Cucurbita maxima), огурец (Cucumis sativus), кабачок (Cucurbita рерро var.giraumontia сорта "Грибов-ские 37), капуста (Brassica oleraceae), ' редис (Raphanus sativus), свекла (Beta vulgaris), томат (Licopersicon esculentum); класс Однодольных (Monocotyledones): пшеница (Triticum durum), рожь (Secale cerealé), овес (Avena sativa), ячмень (Hordeum sativum), мятлик луговой (Роаpratensis сорта «Compact»). В опытах использовалась дерново-подзолистая среднесуглинистая окультуренная почва. Перед закладкой опыта в почве и на семенах растений определяли наличие клеток БПШ. До момента инокуляции растения выращивали в течение 10 суток в горшочках с почвой объёмом 500 мл (масса почвы 450 г). Для приготовления иноку-

лята использовали культуру Е coli, выращенную на ЧПБ в течение 24 часов при температуре 37°С и разведешто стерильной водой в пропорции 1 10 Титр иноку тага составлял 7,0 108 КОЕ/мл Инокутат вносили в ризосферу растений через стерильную стеклянную Г-образную трубочку стерильным шгтрицем Численность интродуцированных популяций бактерий определяли на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки после инокуляции в 4-х кратной повторности Для поверхностной стерилизации растительного материала его извлекали из почвы и промывали мыльным раствором до полного очищения от частичек почвы и споласкивали стерильной водой Затем растения на 5-10 секунд погружали в 70% этанол Дальнейшую стерилизацию поверхности растений осуществляли гипохлоритом натрия, выпускаемым под маркой 'Белизна", разведенным стерильнои водой в пропорции 1 3, в течение 3 минут Посте стерилизации растительный материал тщательно промыва-ти в стерильной воде Стерилизованное растение помещали в стерильную ступку со стерильным кварцевым песком, посте чего туда добавляли стерильную воду пропорционально массе растительного материала (1 10) Растительный материал растирали до получения однородной суспензии Численность интродуцированных популяций Е coli определяли высевом в жидкую среду Кесслера-Свенертона методом преде тьных разведений с последующим пересевом на среду Эндо, микро-скопированием с окраской по Граму и проведением оксидазной реакции Наибо-тее вероятное количество клеток в единице объёма рассчитывали по таблице Мак-Креди Грам- и оксидазо- отрицательные колонии бактерий, выросшие на среде Эндо, подвергались исследованию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), что позволяло достоверно отличить Е coli от других энтеробактерий В качестве праймера использовали нуклеотидную последовательность, фланкирующую ген ответственный за синтез универсального стрессового белка специфичного для кишечной палочки (uspA) (Chen J , Griffiths М W, 1998) ПЦР проводили в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА им К А Тимирязева В модельных экспериментах по изучению воздействия поллютантов на динамику Е coli в системе почва-растение использовали ту же почву, что и в предыдущей серии опытов, а также почву, загрязненная соляркой (2 % от массы почвы) и aue-

татом свинца (свинец в количестве 10 ПДК/кг почвы). Солярку и ацетат свинца (в ввде водного раствора с содержанием свинца 0,32 г/кг почвы) вносили в почву, тщательно перемешивали, распределяли по горшочкам, после чего высевали семена растений. В опытах по изучению возможности применения биопрепарата «Псевдомин» для оздоровления почвы использовали ту же почву, что и в предыдущей серии опытов, а также почву, загрязненную соляркой (2 % от массы почвы). Перед закладкой опыта в почве и на семенах растений определяли наличие клеток БГКП и Pseudomonas putida. До момента инокуляции растения проращивали в течение 10 суток в горшочках с почвой объемом 500 мл (массой 450 г). Растения инокулировали суспензией E.coli, содержащей 7,010* КОЕ/мл и суспензией Р. putida, содержащей 8,0-106 КОЕ/мл. Анализ проводили на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки после инокуляции, в 4-х кратной повторности. Численность Pseudomonas putida в почве и растениях определяли путем высева предельных разведений глубинным способом на среду МПА в четырехкратной повторности. Идентификацию псевдомонад проводили по «Определителю бактерий Берджи» (1997) и по монографии Скворцовой Н.И. «Идентификация почвенных бактерий рода Pseudomonas» (1983). По окончании срока наблюдения (30 суток) в почве определяли субстрат-индуцированное дыхание (СИД), базальное дыхание (БД), микробную биомассу (МБ) и микробный метаболический коэффициент (qC02).

Результаты исследований и их обсуждение

1.Микробные сообщества почв района «Филевская пойма» 1.1. Численность основных групп микроорганизмов в почвах пробных площадок района «Филевская пойма»

Городская среда оказывает существенное влияние на формирование микробных сообществ почв (рис. 1-3). Наблюдалось значительное изменение численности различных групп микроорганизмов при непосредственном антропогенном воздействии. На пробных площадках №№ 1 и 2, расположенных ближе к территории завода, численность бактерий, использующих органические формы азота, была ниже (1,0-10в- 1,8-Ю6 КОЕ/г), чем на контрольной пробной площадке (3,2-106 КОЕ/г). Также на этих пробных площадках была ниже численность и доля бацилл - 7,5-10,5 %, по сравнению с 24-23% на контрольной площадке. На пробной пло-

шадке № 5 за годы наблюдения произошло существенное снижение чистенности бактерий, использующих органические формы азота, и бацилл, что связано с нарушением почвенного покрова во время строительства Кроме того, на данной площадке снизилась численность актиномицетов до 6,2-105 КОЕ/г по сравнению с 1,1 106 КОЕ/г на контрольной пробной площадке, однако на 30 % уветичилась их доля среди бактерий использующих минеральные формы азота, составив 60 % По сравнению с контрольной пробной площадкой, на всех прочих пробных площадках плотность азотобактера в период наблюдения была ниже на 30 - 80 % Динамика численности других групп микроорганизмов - микроминетов, целлю-лозоразлагаюших микроорганизмов, бактерий, использующих минеральные формы азота, была не столь показатетьна

СЭ Бактерии испольэуюидое органические формы азота ■ Бациллы

1 £ во к I

1

¡3 «о

я

Л!

1

Ж

1

Рис.1. Динамика численности н соотношение бактерий, использующих органические формы азота и бацилл

О Бактерии испольэуюи**« минеральные формы азота ■ Акт ином и нет ы

Рнс»2. Динамика численности и соотношение бактерий, использующих минеральные формы азота и актиномицетов

Пробны* площадки

Рис.3. Плотность АгогоЬааег сИгоососсит в почвах пробных площадок

1.2. Респирометрические показатели и микробный метаболический коэффициент как индикаторы состояния микробных сообществ городских почв

Известно, что чем ниже такие респирометрические показатели как субстрат-

индуцированное (СИД) и базальное дыхание (БД), тем хуже состояние микробных сообществ, тем ниже их активность. Однако оба этих показателя в значительной мере зависят от температуры и влажности среды. Микробный метаболический коэффициент (яСОг), не зависящий от факторов окружающей среды, позволяет дать более точную характеристику состояния микробных сообществ. Теоретически, величина этого коэффициента должна быть более высокой в молодых или нарушенных экосистемах, низкой - в климаксных и более устойчивых (Ананьева Н.Д., 2003). Респирометрические показатели и показатели микробного метаболического коэффициента почв района «Филевская пойма» представлены в табл. 1.

Таблица 1

Показатели микробиологической активности почв пробных площадок района «Филевская пойма», 2005 г.

№ пробной СИД, мкг С-СОг г" БД, мкг С-С02 г"1 почвы час"1 чСОз Смик мкг С г"

площадки 1 почвы час"1 1 почвы

0 5,87 ± 0,39 0,91± 0,04 1,92 475 ±31

1 2,81 ±0,22 0,45± 0,02 1,99 228 ± 18

2 3,07 ± 0,30 1,07± 0,08 4,28 249 ± 24

3 2,52 ± 0,29 0,75 ± 0,05 3,67 205 ± 23

4 2,75 ± 0,8 0,59 ±0,02 2,63 223 ± 14

5 0,32 ±0,23 0,17± 0,03 6,27 27 ± 19

Низкие ресшфометрические показатели (СИД 0,32 ± 0,23, БД 0,17± 0,03) и высокий микробный метаболический коэффициент (цС02 6,27) позволяют предположить, что в наихудшем состоянии находятся почвы на стройплощадке дома Наилучшие значения респирометрических показателей (СИД 5,87 ± 0,39, ЬД 0,91а: 0,04) и микробного метаболического коэффициента (цСО; 1,92) получены на контрольной пробной площадке На прочих пробных площадках показатели различаются незначитетьно Низкие значения респирометрических показателей (СИД 2,52 ± 0,29 - 3,07 ± 0,30, БД 0,45± 0,02 - 1,07 х 0,08) и высокие значения микробного метаболического коэффициента (цСОг 1,99 - 4 28) свидететьствуют о нарушении состояния микробных сообществ почв данных площадок, вызванном антропогенной нагрузкой

1.3. Динамика численности санитарно-показательных микроорганизмов в почвах пробных площадок района "Филевская пойма"

Нами была изучена динамика численности различных групп санитарно-показатетьных микроорганизмов бактерий группы кишечной палочки (БГКП), термофильных и нитрифицирующих бактерий, С1овтйтт рег/гт^еп.<: Средняя за 2003-2005 гг численность санитарно-показательных микроорганизмов в почвах пробных площадок района «Филевская пойма» представлена в табл 2

Таблица 2

Численность СИМ в почвах пробных площадок района «Фнлевская пойма»

Номер проб- Чистенность, КОЕ/г а с в

ной площадки БГКП 1 С рег/гтееж Термофилы Нитрификаторы

0 ЦЫО" I 2 4 10* 8,1 10" 9 0 104

1 3,8 10' 1 3 8 104 2 8 104 1,1 10"

1 1,9 104 1,1 10* 8,2 Ю-' 2 8 104

3 4,9 Ю3 '| 8 5 Ю"5 2,1-Ю4 5 9 104

4 3,2- Ю4 2 8 Ю5 4,2 104 2,9 104

5 2 7 104 ; 2,1 104 1,9 10" 3,2 104

Исследуемая территория подвергалась постоянному и интенсивному загрязнению санитарно-похазательными микроорганизмами, на что указывала высокая численность бактерий группы кишечной палочки (3,8 103 - 1,1 105 КОЕ/г) С рег/гтвет (8,5-Ю3 - 2,4 106 КОЕ/г) и термофилов (1,9 103 - 4,2 104 КОЕ/г) Чис-

10

тенность санитарно-показатечьных микроорганизмов и степень загрязненности почв (как правило, почвы относились к категория загрязненных, или сильно загрязненных, редко - к категории чистых) на всех площадках за годы наблюдений оставались приблизительно на одном уровне, вместе с тем наблюдался постоянный процесс самоочищения почв, на что указывала высокая численность нитрифицирующих бактерий (1,1 >104 - 9,0 104 КОЕ/г) Таким образом, результаты мониторинга показывают, что в городских условиях санитарно-показатетьные микроорганизмы являются неотъемлемым компонентом микробных сообществ почв, составляя его значительную часть, сопоставимую по чистенности (10J - 105 КОЕ/г а.с в почвы) с такими группами почвенных микроорганизмов как банилты или микромицеты Однако динамика численности санитарно-показатетьиых микроорганизмов не коретлирует с численностью основных физиологических групп микроорганизмов Удаленность пробных плошадок от вероятного источника загрязнения - завода им Хруничева никак не влияла на чистенность санитарно-показательных микроорганизмов, в частности наиболее загрязненной являлась контрольная пробная площадка Однако вследствие того, что известны факты проникновения энтеробактерий в растения и сохранения в них, при оценке санитарного состояния территорий необходимо анализировать и растения на присутствие санитарно-показательных микроор! анизмов

2. Изучение популяции Escherichia coli в системе почва-растение в условиях антропогенной нагрузки (модельные опыты)

2.1. Исследование проникновения Escherichia coli в растения различных семейств и длительности ее сохранения в них

Особый интерес представляет определение круга растительных организмов, в которые способны проникать энгеробактерии, в частности кишечная палочка. Результаты опытов по изучению проникновения Е coli в растения различных семейств и длите чьности ее сохранения в них представлены в табл 3

Кишечная палочка способна проникать внутрь тканей растений различных семейств, причем при исследовании растений одного семейства наблюдается тенденция к сохранению кишечной палочки внутри растительных тканей в течение приблизительно одинакового времени

Таблица 3

Проникновение Е.соИ внутрь тканей различных растений н длительность ее

сох ранения в них

Растение 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки

Салат латук + + + + -

Астра + + + + -

Календула - - - - -

Тыква + + + + -

Кабачок + + + + -

Огурец + + + + -

Капуста - - - - -

Редис + - - - -

Свекла - - - - -

Томат + - - - -

Пшеница + + + + -

Рожь + + + + -

Овес + + + +

Ячмень + + + - -

Мятлик + + + + +

Так, во всех исследованных растениях семейства тыквенных (кабачок, огурец, тыква) E.coli сохранялась на протяжении 14 суток, как и у ряда растений семейства мятликовых (овес, пшеница, рожь). Однако в растениях ячменя Escherichia coli обнаруживалась в течение 7 суток, а в мятлике - 30 суток. В растениях семейства сложноцветных (салат латук, астра) клетки E.coli сохранялись в течение 14 суток, но растения календулы являются исключением - в них кишечная палочка вообще не обнаруживалась. Общеизвестно, что календула является лекарственным растением, содержащим антимикробные вещества различной природы. У растений семейства капустных кишечная палочка обнаруживалась в растениях только на первые сутки после инокуляции. Показано (Sarwar М. et al., 1998; Lazzeri L., Manici L.M., 2000), что капустные способны синтезировать целый спектр бактерицидных веществ. Можно предположить, что именно наличие и концентрация различных веществ, выделяемых растением, служит фактором, определяющим способность и длительность колонизации растительных тканей различными энтеробактериями, в том числе кишечной палочкой.

2.2. Динамика численности пнтродуцированной популяции Escherichia coli в

растениях и почве

Результаты изучения динамики численности интродуцированной популяции

кишечной палочки в различных частях растений и в почве, в которой выращивались данные растения, представлены на рис 4-5 В модельных экспериментах показано, что кишечная палочка способна проникать из почвы внутрь растительных тканей кабачка и мятлика и существовать в растениях на протяжении 30 суток у мятлика и 14 суток у кабачка К тетки этих бактерий проникают в корни и надземную часть растения причем численность их в корнях больше чем в надземной части Так на 1 сутки наблюдения численность Е colt в корнях мятлика составля-ia 9 0 105 КОЕ'г, в надземной части 3,4 104 КОЕ'г, а на 14 сутки - 8,0 103 и 85 КОЕ'г соответственно У кабачка на 1 сутки наблюдения численность кишечной палочки в корнях достигала 4,4 104 КОЕ/г, а в надземной части 2,6 104 КОЕ/г, а на 14 сутки - 50 и 20 КОЬ/г соответственно Установлено, что за время наблюдения члстенность кишечной палочки внутри растительных тканей постепенно уменьшается на 3-4 порядка Escherichia coli в течение 30 суток выявляется в почве, как с растениями, так и в почве без растений При этом ее численность в варианте с растением на порядок ниже, чем без растения

» Корни кабачка ш - Надзем часть -А-Корни мятлика — --Надзем часть

Рис.4. Динамика численности интродуцированной популяции Е.соН в растениях мяттика и кабачка

Рис. 5. Динамика численности интродуиированной популяции Exoli в почве

2.3. Влияние загрязнения почвы тяжелыми металлами и нефтепродуктами на процесс колонизации растений бактериями Escherichia coli

Известно, что в городской среде, в силу повышенной антропогенной нагрузки, меняется характер протекания многих биологических процессов. Тяжелые металлы и нефтепродукты являются главными загрязнителями городской среды, определяющими направление и характер развития микробных сообществ городских почв («Экология города», 2004; Агаркова М.Г., 1991; Марфенина О.Е., 1991; Герасимова М.И., и др., 2003). В то же самое время, почвы населенных пунктов подвергаются интенсивному загрязнению санитарно-показательными микроорганизмами (Мишустин Е.Н. и др., 1979; Поздеев O.K., 2001). В связи с этим несомненный интерес вызывает влияние загрязнения почвы тяжелыми металлами и нефтепродуктами на популяцию E.coli в системе почва-растение.

На протяжении периода наблюдения (30 суток), численность кишечной палочки в почве снижается с 1,4-108 КОЕ/г на 1 сутки до 3,0-103 КОЕ/г на 30 сутки в контрольном варианте, с 1,4-Ю7 КОЕ/г до 2,5-Ю2 КОЕ/г при загрязнении почвы соляркой и с 1.0-106 КОЕ/г до 0,3*102 КОЕ/г при загрязнении почвы ацетатом свинца (рис. 6). Численность кишечной палочки в период наблюдения в загрязненных почвах была на 1 - 2 порядка ниже, чем в варианте без внесения поллю-тангов, что можно объяснить токсическим действием нефтепродукта (солярки) и

тяжелого металла (свинца) на этих бактерий Кишечная палочка проникала в растительную ткань из почвы, как в контрольном варианте, так и в вариантах почвы с поллютантами, и сохранялась в растениях в течение 30 суток (рис 7) Численность кишечной палочки в растениях также как и в почве сокращалась, причем в вариантах с загрязните тями на 1 -14 сутки наблюдения она была ниже контрольной на I- 2 порядка, К 30 суткам численность кишечной палочки в контрольном варианте и в вариантах с поллютантами сравнивалась, достигая численности 30 КОЕ/г а с в

Е coli в почве без по шютантов

--■--Е coli в почве загрязненной со іяркой

-▲-П coli в почве загрязненной апетатом свинца

1 ООЕ~Ю

«

0

<1 1 OOL-4>8

^ i.ooehja

g i.ooe-u4

1 І ООЕ-Ю2

" 1 ООЕ-00

Время, CVTKH

Рис 6. Дннамнка численности интродуиированной популяции Е coli в почве в присутствии поллютантов

• I' coli в растениях (почва без подшогантов)

— и — h coli в растениях (почва, загрязненная соляркой)

А Е coli в растениях (почва, загрязненная ацетатом свинца)

Время, су-гки

Рис. 7. Динамика численности интродуиированной популяции E.coh в растениях в присутствии поллютантов

Одновременно наблюдалось изменение соотношения численностей интро-дуцированной популяции E.coli в почве, в которой выращивались растения, и внутри растений, произраставших на этой почве. В контрольном варианте процентное соотношение численностей кишечной палочки в растениях и почве увеличивалось с 0,8 % в первые сутки, до максимального значения 5 % на 14 сутки, а затем к 30-м суткам уменьшалось до 1 %. В присутствии загрязнителей это соотношение постоянно увеличивалось, достигая максимума к 30-м суткам (33 % при загрязнении соляркой и 50 % при загрязнении ацетатом свинца).

Таким образом, на основании проведенных модельных экспериментов, можно заключить, что кишечная палочка способна проникать га почвы в ткани растений различных семейств, как класса двудольных, так и однодольных. Escherichia coli проникает не только в корни, но и колонизирует надземную часть растения. Поллютанты (солярка и ацетат свинца) подавляют развитие E.coli в почве и растениях, однако под влиянием солярки и ацетата свинца происходит перераспределение популяции кишечной палочки в системе почва - растение. 3. Исследование возможности применения биопрепарата «Псевдомин», на основе штамма Pseudomonasputida 91-96, для оздоровления почвы, загрязненной энтеробактериямн Бактерии рода Pseudomonas известны своей способностью к биодеградации стойких органических соединений. Показано, что бактерии Pseudomonas putida штамма 91-96 весьма эффективно деградируют нефтепродукты, за 2,5 месяца трансформируя их на 91,6 - 98,4 %, на их основе разработан биопрепарат «Псевдомин» (Емцев В.Т. и др., 1998, 2000; Станкевич Д.С., 2002). Кроме того, виды рода Pseudomonas известны своим антагонистическим действием в отношении ряда фитопатогенных бактерий и грибов (Faltin F., et al., 2004; Wang С., et al., 2004; D6niel F., et al., 2004; Fakhouri W. D., Buchenauer H., 2002). Вообще, бактерии рода Pseudomonas относятся к группе PGPR (plant growth-promoting rhizobac-teria) - ризобактериям, стимулирующим рост растений (Klopper J.W. et al., 1991). Исходя из этих, а также полученных нами в предыдущих исследованиях данных, особый интерес представляло изучение взаимодействия интродуцированных по-

пуляций Pseudomonas piaida и Escherichia coli в системе почва - растение в «чистой» и загрязненной нефтепродуктами (соляркой) почвах Для изучения этих взаимодействий нами был поставлен модельный опыт Как видно из полученных данных (рис 8-11) в вариантах с совместным внесением в почву популяций Е coli и Рputida, численность интродуцированных бактерий кишечной палочки была на 1 - 2 порядка ниже, чем в вариантах без внесения Pseudomonas putida В почве, загрязненной соляркой, снижение количества клеток Е coli происходило быстрее и почва очищалась от интродуцированной популяции кишечной палочки в течение 14 суток Наличие клеток Р putida в растительных тканях приводило к освобождению растений от клеток Е coli в течение 7-14 суток, по сравнению с 30 сутками у растений, которые выращивались в почве, в которую не вносились бактерии Рputida Показатели СИД в почве, загрязненной соляркой, были ниже (1.42±0,4-1,51-0,291 чем в незагрязненной почве (1,92±0,6) Однако в вариантах, где в загрязненную почву вносилась культура Р putida данные показатели были выше (2,26±0,3-3 51±0,16), чем в контроле, что может свидетельствовать о протекающих процессах деструкции внесенного нефтепродукта и улучшении состояния почвы, вызванного действием Р putida Таким образом, биопрепарат «Псевдо-мин», созданный на основе штамма Pseudomonas putida 91-96, можно рекомендовать для ускорения самоочищения почвы и растений от энтер обакт ер и и, особенно в условиях загрязнения почв нефтепродуктами

Чпш» naimPpvadi lufn f.-.l 1 •• - I' fundi

I OOE+Ö8

< 1 00E-O7 -■ 1 OOF-Юб -

* l,0OE~O5

^ l ООЕ-Ю4

t 1 0OF~03

r

Время, сутки

Рис 8. Динамика численности интродуиированиой популяции Kcoli в почве без поллютантов и с их внесением

• • - 4* - - Незагрязненная почва ■" Незагр. поч ва-t-P. put ida

- — Загрязненная почва —»Загрязненная почва+P.put ida

В ре мв, суткм

Рис.9. Динамика численности интродуцированной популяции Е.соИ в растениях, произраставших на почве без поллютантов и с их внесением

Незагр.почва Л Загр. почва —— Ж-1- ■ Незагр. почва+Е. coli — —Ч— — Загряз. почва+Е. coli

■вим* Незагр.почва с рвет. М Загряз.почва с раст. • ■ Незагр.почв с раст.-+-Е.coli Загряз.почва с раст.+-Е.coli

1.00Е+06

1.00Е+05

Время, суткм

Рис.10. Динамика численности интродуцированной популяции Pseudomonasputida в почве без поллютантов и с их внесением

— Неэагр.почаа

-Загряз.почва

• Нвзагряэ.почва+Е.с©Н - - -х- - • Загряз.почва+ЕсоМ

Время» сутки

Рис.11. Динамика численности интродуцированной популяции Pseudomonas putida в растениях, произраставших на почве без поллютантов и с их внесением

выводы

1 Сочетание классических методов учета численности и респирометриче-скнх показателей микробиологической активности позволило vcraHOBirrb что городская среда оказывает существенное влияние на формирование микробных сообществ почв - наблюдается значительное изменение чистенности различных групп микроорганизмов при непосредственном антропогенном воздействии снижается численность и доля бацилл на 10 — 20 %, на территории строек при снижении численности уветичивается на 30 % доля актиномицетов среди бактерий, использующих минеральные формы азота, снижается плотность азотобактера на 30 - 80 %

-Данные, полученные методами учета чистенности микроорганизмов, ко-репируют с респирометрическими показателями микробиологической активности, в частности, уменьшение численности микроорганизмов сопровождается сшшением с}бстрат-индуциров<шного и базального дыхания и увеличением микробного метаболического коэффициента,

-Санитарно-показатетьные микроорганизмы составляют значительную часть микробных сообществ городских почв, сопоставимую по численности с такими группами почвенных микроорганизмов как микромицеты или цехтюлозо-разтагаюпше микроорганизмы

2 Установлено, что Escherichia coli способна проникать из почвы через корни в ткани растений различных семейств и сохраняться там от 1 до 30 суток, причем численность ее в корнях на 1-2 порядка выше, чем в надземной части

-Численность кишечной палочки внутри растительных тканей и в почве m время наблюдения уменьшается на 3-4 порядка, однако численность ее в почве в вариантах с растениями на 20-50 % ниже, чем в вариантах без растения

3 Выявлено, что в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами и тяжелыми металлами на фоне общего снижения численности интродуцированной популяции Е coli в почве и растениях происходит увеличение доли Е coli в растениях до 30-50% Подобное поведение бактерии в системе почва-растение свидетельствует о возможности превращения растений в резервуар патогенных бактерий в

19

условиях интенсивной антропогенной нагрузки, что может являться дополнительным источником загрязнения окружающей среды энтеробакгериями.

5. Показано, что совместное внесение интродуцированных популяций Escherichia coli и Pseudomonas putida в ризосферу растений ведет к тому, что растения очищаются от кишечной палочки в течение 14 суток, при этом численность Р. putida в растениях возрастает. Это обуславливает возможность использования биопрепарата «Псевдомин», на основе штамма Pseudomonas putida 91-96, для ускорения самоочищения почв от энтеробактерий, в частности E.coli.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Люлин С.Ю., Селицкая О.В. Особенности микробных сообществ урбанизированной территории в пределах муниципального округа "Филевский парк" г.Москвы//В сборнике: Экология и ресурсо- и энергосберегающие технологии на предприятиях народного хозяйства (промышленность, транспорт, сельское хозяй-ство)/Материалы V Всероссийской научно-практической конференции. Пенза,2005 .-С.100-104.

2. Люлин С.Ю., Селицкая О.В. Динамика популяции Escherichia coli в системе почва - растение//В сборнике: Экология и ресурсо- и энергосберегающие технологии на предприятиях народного хозяйства (промышленность, транспорт, сельское хозяйство)/Материалы V Всероссийской научно-практической конференции. Пенза,2005.-С. 104-106.

3. Люлин С.Ю., Селицкая О.В. Динамика популяции Escherichia coli в системе почва - растение при загрязнении ее нефтепродуктами и тяжелыми металлами/® сборнике: Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России/Материалы IV Международной научно-практической конференции. Пенза, 2006.-С.142-145.

4. Люлин С.Ю., Селицкая О.В. Особенности микробных сообществ урбанизированных территорий на примере района «Филевская пойма»//Известия ТСХА,2006.-№ 4. -С.25-33.

5. Селицкая О.В., Люлин С.Ю. Динамика популяции Escherichia coli в системе «почва - растение»//Доклады ТСХА. 2007.-Выпуск 279.-Часть 2.-С.190-194.

У

-о Р.

"Л

//• Л Л л с V

- у.

Г 1; Л"' /г/" С''''

/

^ ''¿V ' Г"'

СУ /

./¿¿Л у) о Я ^

1,25 печ л Зак 336 Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44