Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов

Куприянов, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов"

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

КУПРИЯНОВ Алексей Александрович

ДИНАМИКА ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИЙ В ЦЕПИ ВЗАИМОСВЯЗАННЫХ ПРИРОДНЫХ СУБСТРАТОВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

ии3485Э88

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003485988

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Семенов Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Ушакова Нина Александровна

доктор биологических наук, профессор Кураков Александр Васильевич

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 11 декабря 2009 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 10 » ноября 2009 г.

Ученый секретарь /

Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н. Ф. Пискункова

Актуальность проблемы. Исследование путей распространения микроорганизмов в природных средах и их активности, прослеживание судьбы популяций в естественных субстратах, контаминация почвы и других природных местообитаний, определение риска попадания микроорганизмов, в том числе патогенных, в организм человека и животных с пищей, в частности с овощной продукцией, продолжает оставаться актуальной задачей (Заварзин, 1989; Кожевин, 1989; Добровольская, 2002; Ranjard, 2001; Natvig, 2002; Ingham, 2004; Semenov, 2004; Franz, 2005; Van Brüggen, 2008).

Традиционным методическим приемом исследования выживания микроорганизмов в естественных субстратах является интродукция их в такие субстраты и прослеживание популяционной динамики в конкретном субстрате. Закономерности поведения сапротрофных микроорганизмов при их интродукции и динамика выживания в одном субстрате неоднократно исследовались (Звягинцев, 1987; Звягинцев и Голимбет, 1983; Кожевин, 1989; Семенов, 2005; Ahn, 2001; Zelenev, 2005). Исследования выживания микроорганизмов, а тем более энтеропатогенов, при последовательном перемещении их из одного в другой или третий субстрат все еще редки (Шустрова и др., 1992; Semenov, 2004).

D подавляющем большинстве работ, связанных с выявлением динамики микроорганизмов в природе и особенно патогенных микроорганизмов, исследователи ограничиваются прослеживанием их наличия и численности только в одном природном субстрате или местообитании (Wang, 1996; Kudva, 1998; Himathongkham, 1999; Jiang, 2002). Однако существует проблема перемещения микроорганизмов из одного местообитания в другие, а тем более перемещения через несколько разных местообитаний в виде цепи и даже с образованием цикла (Семенов, 2005). Закономерности именно такого распространения сапротрофных, а особенно патогенных, микроорганизмов остаются малоизученными, хотя указания на существование такого цикла высказывались давно, а само явление несомненно и интереснее, и важнее, чем просто динамика выживания микроба в одном субстрате (Мишустин и др., 1979; Литвин и др., 1997; Семенов, 2005).

В настоящее время в разных странах широко развернулось движение за производство «экологически чистых» продуктов, охрану природы от бесконтрольной химизации и, в том числе, от распространения генетически модифицированных организмов и, в частности, микроорганизмов (ГММ). В повседневной практике внесение некомпостированного или недостаточно компостированного навоза в почву - нередкость, особенно при использовании «экологически чистых» технологий производства продуктов. Это песет в себе серьезную опасность для человека быть инфицированным такими штаммами бактерий как Е. coli 0157:Н7, Salmonella spp., Campilobacter jejuni, Listeria monocytogenes и другими. Бактерии Salmonella spp., Escherichia coli 0157:H7 являются наиболее распространенными возбудителями пищевых отравлений в мире, связанных с употреблением инфицированных мясных и молочных продуктов, фруктов, овощей и их производных, в частности, соков и шоре (Altwegg, 1998; Brackett, 1999; Rangel ei al., 2005). ^

1 V

Резервуарами и распространителями упомянутых энтеропатогенов традиционно рассматривают животных. Однако последние исследования показывают, что энтеропатогсны успешно выживают и вне желудочно-кишечных трактов (ЖКТ) животных (Van Brüggen et al., 2008). Именно этими фактами вызваны те массированные исследования, развернувшиеся в зарубежных научных центрах (Natvig, 2002; Solomon, 2002; Ingham, 2004; Franz, 2005).

Энтеробактерии способны проникать в ткани растений, выживая в них, и поэтому опасность распространения инфекций существенно возрастает (Лголин, 2007; Solomon, 2002; Klerks, 2007).

Таким образом, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения изучение явления многократного перемещения микроорганизмов через различные, но взаимосвязанные местообитания, способность конкретной популяции проходить по цепи взаимосвязанных субстратов, в том числе в виде цикла и количественные закономерности таких перемещений являются важными и нужными.

Целью работы являлось изучение выживания бактерий, сапротрофных и аналогов энтеропатогенных, при перемещении в цепи природно-связанных субстратов с образованием цикла: животные - экскременты животных - почва - растения и опять животные и выявление количественных закономерностей динамики перемещающихся популяций.

Для выполнения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. В лабораторных экспериментах изучить закономерности выживания аналогов энтеропатогенных Salmonella Typhimurium МАЕ 110 gfp, Escherichia coli 0157:117 gfp и сапротрофных Pseudomonas ßuorescens 32 gfp бактериальных популяций в краткосрочных экспериментах при интродукции их в экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) и последующем перемещении в серии природных субстратов в зависимости от исходной численности бактерий.

2. Определить длительность выживания исследуемых популяций бактерий в краткосрочных и долгосрочных экспериментах при интродукции их в ЭКРС и после перемещения в почву при циклически изменяющейся и постоянной температуре, а также при дальнейшем перемещении на растения, через ЖКТ животных и в экскрементах животных.

3. Определить способность избранных бактерий расти в комбикорме, используемом для кормления разных сельскохозяйственных животных.

4. Изучить способность исследуемых бактерий проходить через ЖКТ коров при попадании таких бактерий в пищеварительный тракт с кормами, динамику выживания бактерий в экскрементах и при последующем перемещении бактерий в почву, на растения и через ЖКТ других животных.

5. Исследовать способность бактерий проходить через ЖКТ птиц (кур) при попадании в ЖКТ с кормами, динамику их выживания в экскрементах и в воде при инокуляции воды такими экскрементами.

Научная новизна. Впервые в серии лабораторных и натурных экспериментов на примере представителей энтеронатогенных и сапротрофных бактерий проведены сравнительные исследования возможности перемещений индивидуальных бактериальных популяций через серию природных местообитаний: животные - их экскременты - почва - растения и опять животные с фактическим образованием цикла. Показана возможность существования укороченных цепей и циклов. Результаты дают основание полагать, что циркуляция микроорганизмов может происходить не только в виде замкнутой цепи-цикла, но и в виде замкнутой сети. Выявлена возможность активного роста энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в комбикорме с последующим прохождением этих бактерий через ЖКТ разных животных. Установлено, что циклически меняющаяся температура, соответствующая природному режиму день-ночь, более негативно действует на выживание энтеропатогенных и сапротрофных бактерий, как в ЭКРС, так и смеси ЭКРС-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо принимать во внимание при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов в природе. В круговороте или цикле микроорганизмов имеются местообитания, в которых может происходить увеличение численности микроорганизмов. Показано, что на растениях, может происходить «подращивание» популяций патогенных микроорганизмов. Получено подтверждение положению о том, что численность иитродуцента, сравнимая или несколько меньшая численности культивируемых аборигенов, является более оптимальной для прохождения по цепи субстратов, чем очень высокая или очень низкая численности. Установлено, что при интродукции микроорганизмов в природные субстраты имеет место не ограниченный акт существования конкретного микроорганизма в том конкретном местообитании, а скорее последовательная многоступенчатая интродукция с возможными отдаленными последствиями для экосистемы.

Практическая значимость. Полученные результаты найдут применение при разработке методик оценки риска распространения энтеропатогенных микроорганизмов в природе, а также для разработки методических пособий и рекомендаций по предотвращению неконтролируемого распространения генетически модифицированных микроорганизмов в природе. Результаты исследований следует направить в органы санэпидемнадзора для использования при разработке мер и правил санитарно-эпидемиологического контроля пищевой продукции и, в первую очередь, для разработки мер и правил выращивания, хранения и переработки овощной продукции.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях и симпозиумах: «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; «Автотрофныс микроорганизмы», Москва, 2005; «Микроорганизмы и биосфера», Москва, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ: 4 экспериментальные статьи, 3 тезисов конференций, 2 статьи приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, списка литературы, который

содержит 222 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 141 страницах текста и включают 19 рисунков и 4 таблицы.

Место проведения работы, сотрудничество и благодарности. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Исследования поддержаны NWO - RFBR (Dutch - Russia) collaborative grants (Dossier numbers 047.014.001 and 047.0147.011) for A.H.C. van Bruggen and A .M. Semenov. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю Семенову А.М., д.б.н, проф. Нетрусову А.И., д.б.н. Захарчуку Л.М., к.б.н. Пискунковой Н.Ф., а также всем сотрудникам и аспирантам кафедры микробиологии биофака МГУ. Особая благодарность и признательность к.б.н., доц. Семёновой Е.В.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы, их выявление и культивирование. Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Исследования проводились с антибиотикоустойчивыми и авирулентными штаммами (гены вирулентности удалены).

Salmonella enterica var. Typhiraurium МАЕ 110 gfp получена от д-ра Ю. Ремлинг (микробиологический центр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция). Escherichia coli 0157:Н7 штамм В6-914 gfp-91 получена из лаборатории проф. А. Ван Бругген, Университет Вагенингена, Нидерланды. Pseudomonas fluorescens 32 gfp получена от Dr. J.M. Raaijraakers, Университет Вагенингена, Нидерланды.

Gfp-меченые бактерии учитывали прямым учетом под люминесцентным микроскопом (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, СПб ОМО) и посевом на селективные среды с последующим освещением колоний голубым спетом лампы (PL-S, Philips, Eindhoven, The Netherlands).

S. Typhimurium gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, агар - 17, с добавлением иалидиксовой кислоты (50 мг/л) и канамицина (50 мг/л). Е. coli 0151 :H1 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон -10, NaCl - 10, агар - 17 с добавлением ампициллина (50 мг/л). P. fluorescens 32 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: бактопептон - 2; К2НР04 - 1,4; MgS04-7H20 - 1,5; глицерин - 15 мл/л; агар - 17 с добавлением канамицина (50 мг/л) и рифампицина (50 мг/л). Для предотвращения роста грибов во всс среды добавляли циклогексимид (100 мг/л). Учет аборигенных копиотрофпых бактерий проводили посевом на среду: 0.5 г MgS04*7H20, 0.5 г KN03, 1.3 г К2НР04*ЗН20, 0.06 г Ca(N03)2*4H20, 2.5 г глюкозы, 0.2 г гидролизата казеина, 17 г агара в 1 л дистиллированной воды. Олиготрофные бактерии учитывали на той же среде при уменьшении концентрации глюкозы и гидролизата казеина в 100 раз.

Биомассу бактерий выращивали в тех же, но на жидких средах с последующим центрифугированием, отмыванием и доведением до требуемого титра.

Для изучения перемещения популяций бактерий и выживания их в разных природных субстратах использовали: экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС), дерпово-подзолистую почву, прудовую воду, комбикорм.

При определении выживания бактерий в филосфере и ризосфере растений использовали кресс-салат (Lepidium sativum L.) и овес (Avena sativa L.)

В экспериментах по выживанию бактерий при перемещении через ЖКТ животных использовали коров (Bos taurus taurus L.), мышей (Mus musculus cf.), морских свинок (Cavia aperça L.), кур (Callus gallus domesticas L.) и беспозвоночных животных -виноградных улиток [Helixpomatia L.).

Для выявления хищников (протозоа и нематод) в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва использовали метод предельных разведений.

Определение водорастворимого органического углерода (ВОУ) в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва производили бихроматным методом.

Постановка экспериментов. Для выявления динамики прогревания ЭКРС в зависимости от его массы 0,5, 1,0 и 2,0 кг ЭКРС помещали в емкости и инкубировали в течение 10 сут. при циклическом режиме: 8 ч при 25°С и 16 ч при 15"С. При интродукции в ЭКРС суспензии бактерий исходная инокуляционная доза бактерий составляла от Ю10 кл/г сух. ЭКРС до 105 КОЕ/г сух. ЭКРС в зависимости от цели эксперимента. ЭКРС инкубировали при постоянной и/или циклически изменяющейся температуре, инкубирование ЭКРС проводили от 10 до 55 сут. Момент смешивания ЭКРС, содержащего интродуцированные бактерии, с почвой в каждом конкретном случае определяли экспериментально. При этом половину объема ЭКРС отбирали и смешивали с почвой в соотношении 1:6, что в пересчете на сухую массу составляло 1:16. Эту часть экспериментов мы называем краткосрочными. Оставшуюся часть ЭКРС продолжали инкубировать в тех же условиях, периодически определяя численность ингродуцентов, а смешивание с почвой производили только через несколько недель. Эту вторую часть экспериментов мы называем долгосрочными. Смеси ЭКРС-почва инкубировали при тех же условиях, что и ЭКРС. После инкубирования в смесь ЭКРС-почва производили посев семян кресс-салата. В филосфере и ризосфере выросшего кресс-салата определяли численность . интродуцентов, а часть его скармливали виноградным улиткам с последующим определением численности бактерий в экскрементах улиток.

Для определения роста бактерий в кормах, применяемых для кормления с/х животных, использовали комбикорм. Готовили суспензию 12 г комбикорма в 100 мл нестерильной водопроводной воды, инокулировали суспензию исследуемыми бактериями в количестве ~102 КОЕ/г сух. вещ. и культивировали на качалке при 250 об/мин в течение 30 ч при температуре 25°С для P. jluorescens 32 gfp и 37UG для S. Typhimurium МАЕ 110 gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp. В динамике отбирали пробы и учитывали КОЕ с пересчетом на г сух. комбикорма.

Выживание бактерий при прохождении через ЖКТ коров с пищей исследовали путем скармливания коровам 1,5 кг предварительно "запаренного" (смесь 1 кг комбикорма с 500г горячей воды) и охлажденного комбикорма, содержащего -101 КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий. Через сутки после кормления собирали

образцы ЭКРС и учитывали в них искомые бактерии посевом на . селективные питательные среды. Для определения динамики выживания бактерий в собранных ЭКРС, навески ЭКРС помещали в емкости и инкубировали при 18°С в течении 11 сут. с отбором проб для учета интродуцентов. После этого проводили смешивание ЭКРС с почвой в соотношении 1:6 и продолжали инкубировать в тех же условиях, определяя динамику численности. Затем в эту смесь высевали семена овса. В филосфере и ризосфере семидневных всходов овса определяли численность меченых бактерий и далее скармливали проростки мышам и морским свинкам с выявлением исследуемых бактерий в их экскрементах.

Проверку выживания бактерий при прохождении через пищеварительный тракт птиц с пищей исследовали путем скармливания курам 1,5 кг комбикорма, содержащего ~107 КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий. Через сутки после скармливания проводили сбор экскрементов и определяли в них исследуемые бактерии. Собранные экскременты помещали в емкости и инкубировали при 18°С в течение 8 сут. с регулярным определением динамики числснносги бактерий, после чего проводили смешивание экскрементов с водой в соотношении 1:10 и определяли динамику выживания исследуемых бактерий в течение 18 сут.

Все эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Сравнение выживания разных бактерий и разных условий проводили с использованием t-теста. Данные динамики выживания бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва были подвергнуты аппроксимации логистическими уравнениями. Статистический анализ проводили с помощью программ в Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Модельные эксперименты по выживанию бактерий в разных природных субстратах в зависимости от популяционной плотности бактерий и колебаний температуры. Настоящий раздел работы имел своей целью изучить динамику выживания представителей энтеропатогенных и сапротрофных бактерий при перемещении их в серии природных субстратов при разной исходной численности испытуемых микроорганизмов, а также при циклически изменяющейся температуре, соответствующей смене дня и ночи.

1. 1. Динамика прогревания ЭКРС. В природных условиях температура изменяется, нередко циклически, в первую очередь, при смене дня и ночи. Следовательно, важны знания закономерностей выживания бактерий не столько в условиях стабильной температуры, сколько при циклически изменяющейся. Температурный режим был избран на основе анализа собственных трехлетних данных среднелетней дневной и ночной температур в Московской области (Талдомский район). В наших экспериментах стабильно повторяющиеся результаты были достигнуты через 216 часов после начала эксперимента. Было установлено, что температура ЭКРС при его массе 0,5 кг колебалась наиболее близко к задаваемым значениям 25"С "днем" и 15'С

"ночью" по сравнению с массами 0,1 и 2 кг. В связи с этим, для дальнейших экспериментов была избрана масса 0,5 кг ЭКРС.

1. 2. Выживание бактерий, интродуцированных в разной концентрации в ЭКРС, их динамика в смеси ЭКРС-почва, на растениях кресс-салата и в экскрементах виноградных улиток. Эксперименты имели своей целью сравнение популяционной динамики бактерий в зависимости от инокуляционной (инфекционной) дозы.

1. 2. 1. Динамика выживания интродуцентов в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Популяционная динамика выживания S. Typhimurium gfpuE. coli 0157:117 gfp в ЭКРС в краткосрочных экспериментах была довольно сходной и мало зависела от исходной инокуляционной дозы. Как при самой высокой инокуляционной дозе 9,5-Ю8 кл/г ЭКРС для S. Typhimurium gfpnE. coli 0157:Н7 gfp. так и при самой низкой 7,1-Ю4 КОЕ/г ЭКРС и б,8Т01 КОЕ/г ЭКРС для S. Typhimurium gfp и Е. coli Ol57:H7 gfp соответственно, их численность через Ю сут. осталась довольно стабильной (5,5ТО8 кл/г и 5,8-104 КОЕ/г ЭКРС). Популяционная динамика Р. fluorescens 32 gfp в целом была схожа с энтеробактериями, однако, при наивысшей концентрации снижение численности за наблюдаемые 10 сут было более выраженным (рис. 1).

Динамика энтсробактсрий в смеси ЭКРС-почва была, в целом, сходна с таковой в ЭКРС, хотя снижение численности интродуцентов было более интенсивным, чем это наблюдалось в ЭКРС. При этом наиболее заметное снижение численности для энтеробактерий имело место при наибольшей и наименьшей инокуляционных дозах (рис. 1).

Заметное снижение численности интродуцентов в смеси ЭКРС-почва может быть объяснено несколькими причинами. В первую очередь, снижением субстратов, о чем косвенно свидетельствует уменьшение концентрации ВОУ в этих субстратах. Если в ЭКРС было обнаружено 7,8-104 мкг ВОУ/г сухого вещества, то в смеси ЭКРС-почва только 1,2-103 мкг ВОУ/г сухого всщсства.

При выявлении хищников бактерий было установлено, что в пробах разведений ЭКРС только в первом разведении обнаруживались простейшие. В смеси ЭКРС-почва обнаруживаются еще и незначительная численность нематод. В других разведениях ни простейшие, ни нематоды никогда не обнаруживались, следовательно, выедание бактерий хищниками крайне незначительно.

По сравнению с динамикой интродуцентов, как Р. fluorescens 32 gfp, так и энтеробактерий и в ЭКРС, и в смеси ЭКРС-почва, которая была довольно стабильной, динамика аборигенов была волнообразной, как это имеет место у природных популяций бактерий (Кожевин, 1989; Zelenev et а!, 2004; Semcnov, 2005). В динамике КОЕ аборигенов, учитываемых на богатой среде - копиотрофов и на бедной - олиготрофов, в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва имели место пики возрастания и снижения численности (рис. 2). Усредненная численность аборигенов в целом соответствовала тем «промежуточным» начальным численностям интродуцентов (108 и 107) в наших экспериментах, которые оказались наиболее оптимальными при выживании исследуемых интродуцентов в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

^ 1.0Е+09

1.0Е+07

1,ОЕ+01

; 3

I и

\ ЕЙ

1.0Е+09 1.0Е+07 1.0Е+05

1.0Е+03 ]

1.0Е+01 +---------

Время, сут

Б I -в- 1

20!

—I—-

т-1:

Время, сут

1 5

1.0Е+09 Т

8 1.0Е+07

1.0Е+05

—В— 1 -♦- 2 -1кг- 3 - 4

-i

1.0Е+03 '

1.0Е401

Время, сут

Рис. 1. Динамика выживания: А - 5. ТурЫтигшт МАЕ 110 ¿/р; Б - Е. соИ 0157-.Н7 &р; В - Р. ]Ъюгезсет 32 при интродукции в ЭКРС с последующим перемещением в почву в зависимости от исходной концентрации клеток; стрелкой показано время смешивания с почвой. Исходная концентрация: 1 - 109кл/г сух. ЭКРС, 2 -108 кл/ г сух. ЭКРС, 3- 107 кл/г сух. ЭКРС, 4 - 105 КОЕ/г сух. ЭКРС.

1. 2. 2. Численность интродуцентов на растениях и в экскрементах виноградных улиток после скармливания растений улиткам. Судьба энтеробактерий и псевдомонады при разных исходных инокуляционных дозах была прослежена на растениях и в экскрементах животных после скармливания этих растений беспозвоночным (рис. 3). Закономерности выживания популяций интродуцентов, по крайней мере энтеробактерий, в филосфере и ризосфере кресс-салата отличались от таковых в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва. Если в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва, хотя и медленно, но происходило снижение численности, то на растениях, как в ризосфере, так и в филосфере обнаружено увеличение численности всех исследованных бактерий. Таким образом, растения кресс-салата как местообитание оказалось благоприятным и для энтеробактерий, и для сапротрофной псевдомонады, условия которого способствовало их росту или концентрированию.

Таким образом, оптимальной концентрацией бактерий для интродукции в природные субстраты и успешного прохождения по цепи разных субстратов в краткосрочных исследованиях при постоянной температуре является такая, которая более или менее совпадает с концентрацией, выявляемых на средах аборигенов.

1.0Е+Ю

олпготрофы I Рис. 2. Динамика

: численности аборигенных I бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва на богатой и бедной средах; стрелкой показано время смешивания с почвой.

1.3. Краткосрочная и долгосрочная динамика выживания бактерий, интродуцированных в ЭКРС при циклически меняющейся температуре, и их численность в смеси ЭКРС-почва, на растениях кресс-салата и в экскрементах виноградных улиток.

В этой серии экспериментов решались задачи как определения длительности выживания популяций в цепи природных субстратов, так и влияние циклически изменяющейся температуры по сравнению с постоянной на выживание исследуемых бактерий.

1.3.1. Краткосрочная и долгосрочная динамика выживания бактерий в ЭКРС и в смесн ЭКРС-почва при циклически меняющейся температуре. Сразу после внесения суспензии каждого конкретного интродуцента с ЭКРС количество бактерий составляло в среднем Ю10 кл/г сух. ЭКРС.

! | 1,OE+09

CQ ><

1 1.0E+07

9 1.0E+05

5 1.0E+03

: I

l.OE+Ol

' 3

. сV CQ 1.0Е+09

. х:

о 1.0Е+07

! 1.0Е+05

КОЕ+ОЗ

<и

\й 1,0Е+01

liffii

Iii

i./rcy.x. ЭКРС кл./гсух. ЭКРС кл./гсух смеси перед ЭКРС-почна смешиванием с почвой

аш!

Ш II

Ifl

KJl./r сух. ЭКРС

Й,

а 1 HB 2 @3 □ 4

faf

Iii

кл./г сух смеси кл./гсух кл./гсух КОЕ/гсух

перед посевом корней кресс- стеблей кресс- экскрементов

семян кресс- салата салата виноградной салата улитки

0 1 Ш 2 ВЗ □4

Ul-

кл./гсух. кл./г сух. смеси кл./г сух. смеси кл./гсух. кл./гсух. КОЕ/г сух

ЭКРС перед ЭКРС-почва перед посевом корней кресс- стеблей кресс- •экскрементов

смешиванием с семян кресс- салата салата виноградной

почвой салата улитки

1.0Е+09

1.0Е+07 j 1.0Е+05 1.0Е+03 LOE+Ol -

кл /г сух. ЭКРС

т □ 2 аз □ 4

Iii

кл./г сух ЭКРС пепел смешиванием с почвой

:л./г сух. смеси кл./г сух смеси кл./г сух ЭКРС-почва перед посевом корней кресс-семян кресс- салата салата

кл./гсух КОЕ/г сух стеблей кресс- декрементов салата виноградной улитки

Рис. 3. Динамика выживания: А - S. Typhimurium МАЕ 110 gfp: Б - Е. coli 0157:Н7 gfp; В - Р. fluorescens 32 gfp, интродуцированных в ЭКРС при разной исходной численности и в последующих ключевых точках при перемещении интродуцентов в почву, на растения кресс-салата и через ЖКТ улиток после скармливания им выращенного кресс-салата. Исходная концентрация: 1 - 109кл/г сух. ЭКРС, 2 - 1Ö8 кл/ г сух. ЭКРС, 3 - 107 кл/г сух. ЭКРС, 4 - 105 КОЕ/г сух. ЭКРС.

Со временем численность Е. coli 0157:Н7 gfp и Р. fluorescens 32 gfp постепенно снижалась и через 15 сут составила 5-Ю7 кл/г сух. ЭКРС для Р. fluorescens 32 gfp и 3,0-Ю7 кл/г сух. ЭКРС для Е. coli 0157:Н7 gfp. Численность S. Typhimurium gfp в течении первых 8 сут после интродукции также снизилась до 2,6-Ю8 кл/г сух. ЭКРС, но затем произошла стабилизация и даже некоторое увеличение численности. На 15-й день динамики численность S. Typhimurium gfp составляла 3,4-108 кл/г сух. ЭКРС (рис. 4).

Для изучения динамики выживания бактерий в серии разных субстратов необходима их достаточно высокая популяционная плотность. Хотя в динамике численности S. Typhimurium gfp наступила стабилизация, но численность Е. coli Ol57:Н7 gfp и Р. fluorescens gfp уменьшалась, то в связи с этим через 15 сут после интродукции было произведено смешивание ЭКРС с интродуцентами с почвой (рис. 4). Чтобы не допустить уменьшения численности интродуцентов ниже детектируемого уровня, а с другой стороны, чтобы как можно дольше проследить динамику выживания интродуцентов, было проведено разделение массы ЭКРС так, чтобы динамика численности каждой бактерии в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва была бы исследована и при краткосрочном инкубировании, и при долгосрочном.

После смешивания ЭКРС с почвой численность интродуцентов из-за разведения, естественно, резко уменьшилась в среднем на порядок и составила 2,9Т07, 2,5ТО7 и 3.4Т07 кл/ г сух. вещ. для S. Typhimurium gfp, Е. coli 0157:Н7 gfp и Р. fluorescens 32 gfp соответственно. В дальнейшем, в течение последующих 20 сут, имело место плавное уменьшение численности интродуцентов, которое было более выражено у Е. coli 0157:Н7 gfp, слабее у S. Typhimurium gfp и практически не наблюдалось у Р. fluorescens 32 gfp (рис. 4).

В долгосрочных экспериментах при инкубировании ЭКРС до 55 сут у всех бактерий наблюдалось снижение численности, однако скорость снижения была разной. Наибольшее снижение, более порядка, как при учете КОЕ, так и клеток, выявлено в популяции Е. coli 0157:Н7 gfp, а минимальное снижение - в популяции сальмонеллы.

Смешивание ЭКРС с почвой в долгосрочном эксперименте, как это было и в краткосрочном, сначала привело к скачкообразному уменьшению численности интродуцентов, которое составило 1,2-106, 4,0-105 и 1,М0б кл/г сух. вещ. для S. Typhimurium gfp, Е. coli 0157:Н7 gfp и Р. fluorescens 32 gfp соответственно. Дальнейшая динамика интродуцентов несколько различалась. Происходило уменьшение численности КОЕ в популяции сальмонеллы и Е. coli 0157:Н7 gfp, а численность клеток оставалась довольно стабильной. В популяции Р. fluorescens 32 gfp в смеси ЭКРС-почва наблюдалась, фактически, противоположная закономерность (рис. 4). Было выявлено, что Е. coli OI57:H7 gfp и, особенно, Р. fluorescens 32 gfp выживают лучше при постоянной температуре (данные не приводятся), а выживание ¿'. Typhimurium gfp не зависело от изменений температуры.

Для уточнения закономерностей выживания исследуемых бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва нами была проведена аппроксимация данных динамики различными моделями. В краткосрочных экспериментах в ЭКРС снижение численности Е. coli 0157:Н7 gfp и Р. fluorescens 32 gfp более соответствовало экспоненциальному закону, в

то время как в популяции S. Typhimurium gfp наблюдалась или линейная зависимость (отсутствие снижения), или флуктуации численности. После смешивания ЭКРС с почвой экспоненциальная закономерность снижения наблюдалась у Е. coli 0157:Н7 gfp и S. Typhimurium gfp, в популяции Р. fluorescens 32 gfp наблюдалась стабилизация численности (линейная зависимость).

1. 3. 2. Численность бактерий на растениях и в экскрементах виноградных улиток после скармливания растений улиткам в краткосрочных и долгосрочных экспериментах.

Для получения количественных показателей выживания исследуемых бактерий на растениях, а, следовательно, определения возможности контаминации овощной продукции, в смеси ЭКРС-почва провели выращивание кресс-салата. Перед посевом численность интродуцентов в смеси ЭКРС-почва составляла 8,2-105, 7,0-105 и 5,0-106 кл./г сухого вещества в краткосрочном и 9,5-Ю5, 3,0-105 и 4,7-Ю5 кл./г сухого вещества в долгосрочном эксперименте для S. Typhimurium gfp, Е. coli 0157:Н7 gfp и Р. fluorescens 32 gfp соответственно (рис. 5).

В случае с S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157-.Н7 gfp имело место некоторое увеличение численности интродуцента в филосфере до 1,1-107 и 2,8Т06, а в ризосфере до 5,9-Ю6, 1,4-10б кл./г сухого вещества в краткосрочном эксперименте, а в долгосрочном эксперименте в филосфере до 4,4-106 и 4,3-Ю5 кл./г сухого вещества и в ризосфере до 5,4-Ю6 и 5,6-Ю5 кл./г сухого вещества соответственно. Численность Р. fluorescens 32 gfp в филосфере составила 2,9-Ю6 и 4,2-Ю5, а в ризосфере - 1,5-106 и 5,6-Ю3 кл./г сухого вещества в краткосрочном и долгосрочном экспериментах соответственно, то есть несколько уменьшилась. Последний факт несколько неожиданный, так как некоторые исследователи склонны рассматривать Р. fluorescens как типично ризосферную бактерию (рис. 5 А-В), однако большую приспособленность к «ризосфере-филосфере» продемонстрировали энтеропатогены, а не сапротроф.

Инфицированные растения кресс-салата были скормлены виноградным улиткам. В их экскрементах методом посева на среды были также выявлены искомые бактерии (рис. 5 А-В). Численность ^-бактерий в экскрементах улиток, по сравнению с численностью на растениях, заметно уменьшилась и составила для S. Typhimurium gfp 4,7-Ю5 и 5,2-Ю4, для Е. coli 0157:Н7 gfp 1,7Т05 и 1,8Ю5, для Р. fluorescens 32 gfp 1,8-105 и 1,7-105 КОЕ/г сухого вещества в краткосрочном и долгосрочном экспериментах соответственно. Однако численность исследуемых бактерий оставалась достаточно высокой и, таким образом, беспозвоночные, в нашем случае виноградные улитки, могут являться активными переносчиками энтеропатогенов в природе.

1,0E+1 i

и m

. 1,0E+09 Ef u

23 1.0E+07

я 1.0E+05

5 U0E+03 L0E+01

l.OE+ll

I-0E+09

- клетки -КОЕ

1.0E+07

щ О

- 1.0E+05 fe

£ 1,0E+03

1,0E+01

0 5 10 15 20 25 30 35 Время, сут

0 10 20 30 40 50 60 70; Время, сут

10 15 20 25 30 35 Впемя. суг

0 10 20 30 40 50 60 70 Время, сут

Рис. 4. Динамика выживания: А - 5. Typhimurium МАЕ 110 gfp\ Б - Е. coli 0157:117 gfp\ В - Р. fluorescens 32 gfp при интродукции в ЭКРС с последующим перемещением в почву в краткосрочных (А, Б, В) и в долгосрочных (Г, Д, Е) экспериментах при циклически меняющейся температуре; стрелкой показано время смешивания с почвой.

2. Численность микроорганизмов при перемещении по цепи местообитаний: коровы - их экскременты - почва - растения - грызуны и их экскременты. При

изучении динамики выживания бактерий в модельных экосистемах было установлено, что бактерии успешно выживают в разных естественных субстратах. Далее была поставлена задача провести натурные эксперименты, используя крупный рогатый скот (коров) и других млекопитающих, которые традиционно считаются резервуарами, инкубаторами, переносчиками и др. микроорганизмов, в том числе патогенных.

1,0Е+]2 1.0Е+10 1 .0Е+08 1.0Е+06 I.0E+04

Кпеткн/.мл до ЭКРС

ЭКРС

ЭКРС перед

□ краткосрочный эксперимент (35 дн.) П долгосрочный эксперимент (75 дн.)

Кл /г сух. Кл./г сух смеси перед корней кресс-посевом салата

Кл/гсух. КОЕ/гсух псблей крссс- экскрементов салата виноградной

i,oi;+12

1.0Е+10 1,0Е+08 1.ÜE+06 I „0Е+04

Клетки/мл t внесенияi ЭКРС

ЭКРС

Б □ краткосрочный эксперимент (35 дн.)

□ долюерочный эксперимент (75 дн.)

тЬ

КлУг сух Кл./г су v ЭКРС перед смеси смешиванием ЭКРС+поч!

И ш

Кл./г сух Кн./гсух. КОЕ/гсух

Lopiicii кресс- счебней крссс- -экскрсмопгол салата силпча ииноградной

I.0E+I2 1.0Е+10 1.0Е+08 1,0Е+06 1.0Е+04

Клетки/мл ; внесенияi

Кл /г сух

Кл./г сух Кл./г су

ЭКРС перед см ее .

□ краткосрочный эксперимент (35 дн.)

□ долгосрочный эксперимент (75 дн.)

fTtl

lOi/t сух, КОЕ/г с

Рис. 5. Динамика выживания: А - S. Typhimurium МАЕ НО gfp; Б - Е. coli 0157:117 gfp; В - Р. fluorescens 32 gfp, интродуцированных в ЭКРС при циклически изменяющейся температуре и в последующих ключевых точках при перемещении интродуцентов в почву, на растения кресс-салата и через ЖКТ улиток после скармливания им выращенного кресс-салата в краткосрочном и долгосрочном экспериментах.

2. 1. Динамика роста бактерий в суспензии комбикорма. Наиболее простой вариант инфицирования животных различными микроорганизмами - это поступление микроорганизмов с кормом и, в частности, с комбикормом. Комбикорма дают животным в разной форме: в сухом виде, влажном, а в некоторых случаях и в виде довольно жидкой суспензии. Мы исследовали динамику роста энтеропатогенов и сапротрофа в суспензии комбикорма. С некоторыми вариациями, но фактически для всех бактерий, была выявлена традиционная кривая роста с выходом на стационарную фазу через сутки. S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp имели короткий лаг-период, а Р. fluorescens 32 gfp росла без такового. Через сутки численность клеток бактерий составила 1.2><106 для S. Typhimurium gfp, 5.8*106 для Р. fluorescens 32 gfp и 6.9><105 для Е. coli 0157:117 gfp на грамм сухого комбикорма.

2. 2. Численность исследуемых бактерий в экскрементах коров после скармливания коровам инокулированного комбикорма и после смешивания ЭКРС с почвой. Определение численности меченых бактерий в ЭКРС проводили через 24 ч после скармливания коровам инокулированного комбикорма. В свежесобранных образцах было обнаружено 7.0хЮ3, 3.2* 102 и 7.1 *103 КОЕ/г сух. вещ. S. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp соответственно. Далее собранные экскременты инкубировали в течение 11 сут в лабораторных условиях, как и в предыдущих экспериментах. Схема эксперимента приведена на рис. 6. При инкубировании экскрементов произошло некоторое увеличение численности меченых бактерий, составив через 11 сут 2.5><104, 5.9*10' и l.lxlO4 КОЕ/г сух. вещ. 5. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp соответственно (рис. 7). В предыдущих экспериментах, когда проводили искусственную интродукцию бактерий в свежесобранные ЭКРС, такого факта не наблюдалось. Выявленный факт представляется очень важным с точки зрения экологии и эпидемиологии бактерий в целом и энтеропатогенов в частности. По-видимому, увеличение численности энтеропатогенов при прохождении ЖКТ животных происходит не только и не столько в самом ЖКТ, а в свежевыдеяенных экскрементах. Хотя такое заключение является предварительным и нуждается в специальных исследованиях.

Рис. б. Схема эксперимента исследования перемещения бактерий по цепи местообитаний-субстратов: корм - желудочно-кишечный тракт животных - экскременты животных - почва - растения и опять животные с фактическим образованием цикла.

Поело выявленной стабилизации численности gi^-бактерий в ЭКРС было произведено смешивание ЭКРС с почвой в соотношении 1:16 по сух. вещ. (рис. 7). Численность бактерий после смешивания составила 2.2х 103, 6.4х 102 и 5.2х Ю3 КОЕ/г сух. вещ. S. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp соответственно. При определении численности бактерий в смеси ЭКРС-почва через 3 сут было установлено, что их численность не снизилась, в отличие от предыдущих экспериментов. Таким образом, условия в ЭКРС, возможно из-за присутствия воздуха, являются более благоприятными для выживания исследуемых бактерий, чем в ЖКТ.

■ S. Typhimurium МАЕ 110 gíp Е. coli 01S7-.H7 gfp -»—Р. fluorescens 32 gfp

d U0E+07

g, 1,0E+O5 4

i Ш

: 5 1.0E+03 «

1,0E+01

Время, сут

Рис. 7. Динамика численности S. Typhimurium МАЕ 110 gfp; Е. coli 0157:Н7 gfp-, Р. fluorescens 32 gfp в ЭКРС, полученного после скармливания коровам инокулированного комбикорма и после смешивания ЭКРС с почвой; стрелкой показано время смешивания с почвой.

2. 3. Численность исследуемых баюернй на растениях и в экскрементах мышей и морских свинок после скармливания им растений. Для выявления возможности инфицирования исследуемыми бактериями кроме кресс-салата и других растений, через 3 сут. после смешивания ЭКРС с почвой в эту смесь был посеяны семена овса. Перед посевом овса численность меченых бактерий в смеси ЭКРС-почва составила 3.8xlü\ 8.0х 103 и 9.5x103 КОЕ/г сух. вещ. S. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp соответственно.

Через 7 сут после появления всходов был произведен учет численности бактерий в филосфере и ризосфере проростков овса. В филосфере растений овса было обнаружено 4.4*1 ()\ 1.3х] О' и !.5х104 КОЕ/г сух. стеблей S. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp н Е. coli 0157:117 gfp соответственно, а в ризосфере 8.9Х103, 2.4*104 и 6.2Х104 КОЕ/г сух. корней S. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp и Е. coli 0157:117 gfp соответственно, то есть как в филлосфере, так и в ризосфере выявлено увеличение численности меченых бактерий.

Для определения выживания бактерий при прохождении через ЖКТ животных, инфицированные растения овса скормили грызунам. Одна наземная часть растений овса

была скормлена мышам, а другая морским свинкам. В собранных экскрементах мышей было обнаружено 5.8*103, 2.5ХЮ4 и 2.1 х 104 КОЕ/г сух. экскрементов S. Typhimurium gfp, Р. ßuorescens 32 gfp и Е. coli 0157:117 gfp соответственно, а в экскрементах морских свинок было обнаружено 1.6*103, 1.9><104 и 1.8*104 КОЕ/г сух. экскрементов S. Typhimurium gfp, Р. fluorescens 32 gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp соответственно. Таким образом, популяции исследованных бактерий смогли два раза пройти через ЖКТ разных млекопитающих и тем самым фактически совершив полный цикл. Кроме этого, настоящими экспериментами еще раз было показана способность грызунов служить активными векторами распространения различных бактерий и инфицировать разные природные местообитания.

Таблица 1. Выживание исследуемых бактерий в серии природных субстратов после скармливания их крупному рогатому скоту.

Субстрат Исследуемые бактерии, КОЕ/г сухого субстрата

S. Typhimurium МАЕ 110 gfp Е. coli Ol57:117 gfp Р. fluorescens 32 gfp

Количество инокулюма в комбикорме при скармливании коровам 2,0±0,8*10 2,2±0,5*ю' 2,2±0,6*10

ЭКРС через сутки после скармливания 7,0±2,7*103 7,1±2,4*103 3,2±0,9*\0¿

ЭКРС перед смешиванием с почвой 2,5±1,6*104 1,1±0,4*104 5,9±0,6*10J

Смесь ЭКРС - почва 2,2±1,0*103 5,2±1,8*103 6,4±1,3*10¿

Смесь ЭКРС - почва перед посевом овса З,8±1,1*103 9,5±3,3*103 8,0±1,2*103

Надземная часть овса 4,4±1,6*103 1,5±0,4*104 1,3±0,7*104

Корни овса 8,9±1,4*10' 6,2±1,1*104 2,4±0,7*I04

Экскременты мышей 5,8±0,3*103 2,1±0,4*104 2,5±0,2*104

Экскременты морских свинок 1,6±0,8*10J l,8±0,2*10i 1,9±0,1*104

1,0E+09 1.0E+07

£ l,0E+05

- Нестер, вода -.Стер, вода

- Экскременты

1,0Е+03 1.0Е+01

10 15

Время, сут

—*— Нестер, вода —в— Стер, вода —•— Экскременты

10 15

Время, сут

Рис. 8. Численность S. Typhimurium МАЕ 110 gfp; Е. coli 0157:117 gfp; Р. fluorescens 32 gfp в экскрементах кур после скармливания курам инокулированного комбикорма и после смешивания экскрементов с водой; стрелкой показано время смешивания с водой.

3. Перемещение микроорганизмов в цепи природных субстратов: птицы - их экскременты - вода. Птицы являются наиболее мобильными векторами в распространении микроорганизмов. С одной стороны, они часто питаются вблизи различных животных, нередко питаясь их экскрементами, а затем во время миграции перемещаются не только над сушей, но и над водными объектами. При этом суша и вода

могут контаминироваться различными, в том числе и патогенными, бактериями, что впоследствии может привести к инфицированию разных животных и людей. Целью исследования было изучение выживания исследуемых бактерий при прохождении через ЖКТ птиц и возможность выживания в водной среде после ее контаминирования.

3. 1. Численность исследуемых бактерий в экскрементах кур после скармливания курам инокулированного комбикорма и контаминирования этими экскрементами воды. После скармливания курам комбикорма, содержащего 107 кл. меченых бактерий/г сух. комбикорма, в собранных через сутки экскрементах кур было обнаружено до 1,2*104 меченых клеток энтеробактерий и 104 клеток Р. fluorescens 32 gfp в грамме сухого вещества (рис. 8).

Наблюдение динамики численности меченых бактерий проводили в течение 8 сут. При этом в экскрементах выявили значительное увеличение численности S. Typhimurium gfp - почти на два порядка, несколько меньше для Е. coli 0157:Н7 gfp и отсутствие прироста у Р. fluorescens 32 gfp. После этого провели смешивание экскрементов со стерильной и нестерильной водой. Определение численности исследуемых бактерий в нестерильной и в стерильной воде выявило монотонно убывающую динамику популяций бактерий. При этом в стерильной воде снижение было несколько медленнее, чем в нестерильной, что может быть связано с конкурентным давлением со стороны водных аборигенов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нашими исследованиями показано, что три вида бактерий: сапротрофная Р. fluorescens 32 gfp и две энтеробактерий - потенциальные энтеропатогены - S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp при разной исходной численности способны успешно и длительно выживать в различных природных субстратах. Даже при самой низкой исходной популяционной плотности бактерии способны проходить сложную и длинную цепь местообитаний, указывая тем самым на не единомсстное существование в природе каждой конкретной популяции микроорганизмов, а на последовательное и многократное перемещение всей или части популяции в ряду субстратов, что можно, по-видимому, назвать многоступенчатой интродукцией или инокуляцией.

В естественных экосистемах температура крайне редко бывает стабильной. При исследовании влияния колебаний температуры на динамику выживания бактерий интенсивное уменьшение численности бактерий имело место при циклически меняющейся температуре по сравнению с постоянной. Колебания температуры, по-видимому, увеличивают расход субстратов и энергии клетками, в частности, энергозатраты на поддержание.

Было отмечено, что популяционная плотность интродуцентов, сравнимая или несколько меньшая плотности вырастающих на средах аборигенов, является более оптимальной для прохождения интродуцентов по циклу субстратов, по сравнению с очень высокой или очень низкой популяционной плотностью. Это вероятно связано с тем, что при интродукции бактерий в ЭКРС с высокой исходной численностью быстро

наступает недостаток питательных веществ, что и приводит к значительному уменьшению численности бактерий до установления определенной равновесной концентрации. Неоднократным определением ВОУ в ЭКРС, перед интродукцией туда бактерий, а также перед и после смешивания ЭКРС с почвой было выявлено более чем на порядок снижение этого показателя. С другой стороны, при исходной низкой интродуцируемой концентрации бактерии, особенно энтеропатогены, могут испытывать сильное конкурентное давление со стороны автохтонных микроорганизмов, что может привести к снижению популяциопной плотности ниже детектируемого уровня.

Общей целью экспериментов было прослеживание динамики исследуемых бактерий в цепи природных местообитаний, в частности на растениях. На растениях кресс-салата как в ризосфере, так и в филосфере выявлено увеличение численности всех исследованных бактерий. Тоже самое было выявлено и для проростков овса. Следовательно, экониша растений благоприятна и для сапротрофной псевдомонады, и для энтеробактерий, способствуя их росту или концентрированию. В связи с этим, использование недокомпостированных органических смесей, а тем более свежего навоза, при выращивании таких "зеленых" витаминов и других овощей может приводить к серьезным последствиям в виде пищевых отравлений и даже эпидемий.

Для выявления возможности прохождения эптеропатогепов и сапротрофа через ЖКТ животных, растения кресс-салата скармливали виноградным улиткам, которые, как известно, являются активными потребителями растительного материала и тем самым активными переносчиками различных микроорганизмов. Хотя в экскрементах улиток выявлено некоторое уменьшение численности бактерий на грамм их сухих экскрементов, по сравнению с кресс-салатом, тем не менее, главным является то, что исследуемые бактерии способны преодолевать этот серьезный экологический барьер. Кроме того, вполне очевидно, что исследованные беспозвоночные являются активными распространителями микроорганизмов в природе, действительно играя роль векторов в эпидемиологическом смысле.

После того как была изучена динамика выживания бактерий при искусственном инокулировании ЭКРС с последующим прослеживанием перемещения бактерий через серию субстратов и выявления способности интродуцентов сохранять популяционную плотность длительно и на высоком уровне, было решено проследить выживание исследуемых бактерий при непосредственном попадании их в ЖКТ коров и способности прохождения через ЖКТ коров. При успешном исходе первой части такого эксперимента предполагалось проследить дальнейшую судьбу интродуцентов, определяя их численность в экскрементах, почве после смешивания с ЭКРС, на растениях, выращиваемых в такой смеси, а также и в экскрементах жинотных после скармливания таких растений разным животным.

Перед скармливанием коровам инокулированного исследуемыми бактериями корма было определено выживание этих бактерий в суспензии комбикорма. Попадание патогенных микроорганизмов с комбикормом в ЖКТ животных реально при кормлении животных. Было выявлено, что комбикорм при достаточной температуре и влажности может являться хорошим субстратом для размножения разных, в том числе и

патогенных, бактерий, и, следовательно, приводить к инфицированию сельскохозяйственных животных.

Выявленное уменьшение численности меченых бактерий в экскрементах коров позволяет отметить то, что условия ЖКТ коров, по-видимому, не совсем благоприятны для исследованных бактерий, но и не смертельны. Исследуемые бактерии успешно выживали в собранных и инкубируемых в лаборатории экскрементах даже с некоторым увеличением численности, успешно выживали в смеси ЭКРС с почвой, на растениях овса и были способны проходить через ЖКТ других теплокровных животных (мышей и морских свинок), преодолевая специфические условия, связанные с изменением температуры, pH, кислородного режима и доступности субстратов.

Показано, что в ЖКТ грызунов происходит, хотя и не столь значительное, но вполне заметное увеличение численности бактерий Е. coli 0157:Н7 gfp, а также и Р. fluorescens 32 gfp. Этот интересный факт, несомненно, нуждается в дальнейших исследованиях, особенно учитывая следующий важный аспект. При выживании энтеропатогенов в ЖКТ грызунов, с учетом высокой подвижности последних, возникает серьезная опасность контаминации больших площадей крайне опасными бактериями Е. coli 0157:Н7, вызывающих энтерогеморрагический синдром с высокой смертностью заболевших.

Помимо слежения за перемещением исследуемых бактерий через серию твердых субстратов, была проверена судьба этих бактерий при попадании их с экскрементами в воду. Для этого были выбраны наиболее мобильные векторы в перемещении микроорганизмов в природе - птицы, в нашем случае - куры. После скармливания инокулированного исследуемыми бактериями корма курам в их экскрементах были обнаружены искомые бактерии, то есть, исследуемые бактерии были способны проходить ЖКТ кур. Более того, при инкубировании экскрементов в лабораторных условиях наблюдалось увеличение численности маркированных бактерий. После смешивания (инокулирования) экскрементами кур воды сначала было выявлено уменьшение численности бактерий из-за разбавления. Однако в дальнейшем имел хотя и слабый, но прирост численности бактерий с дальнейшим плавным уменьшением численности. Бактерии в течение всего эксперимента (25 сут) успешно выявлялись. Наши результаты указывают на серьезную опасность распространения с экскрементами кур не только Salmonella ssp., что является твердым фактом, но и штаммов Е. coli 0157:Н7, что является новым фактом. Учитывая, что инфекционная доза шига-токсин продуцирующих (STEC)/ энтерогемморагических (ЕНЕС) штаммов Е. coli 0157:Н7 крайне низка - менее 100 кл., то выявленные в наших экспериментах численности Е. coli 0157:Н7 в экскрементах кур - до 3,6* 10ч представляются впечатляющими.

Нашими исследованиями твердо показано, что именно одна и та же популяция бактерий может проходить весь цикл без привнесения дополнительно такой же популяции извне, хотя вполне реалистично предположить возможность и попутной инокуляции сходной популяцией микроорганизмов того или иного природного субстрата. Вместе с тем нами показано, что в некоторых нишах, в частности на растениях и в ЖКТ грызунов, происходит, хотя и не столь значительное, но вполне заметное

увеличение численности бактерий Е. coli 0157:Н7 gfp и Р. ßuorescens 32 gfp. Этот интересный факт, несомненно, нуждается в дальнейших исследованиях.

В связи с тем, что исследованные микроорганизмы вызывают различные заболевания человека и обнаружена их высокая выживаемость в различных эконишах, то современные представления эпидемиологии о резервуарах, источниках, «носительстве» и прочее нуждаются в соответствующей корректировке.

Помимо практической значимости нашими исследованиями обосновывается и такой важный теоретически факт как существование круговорота микроорганизмов в виде перемещения отдельных популяций микроорганизмов или в комплексе с разными популяциями через ряд взаимосвязанных природных субстратов в виде цикла. При «расщеплении» или «диссипации» таких популяций с перемещением сразу в несколько новых местообитаний, по-видимому, можно говорить не только о круговороте микроорганизмов в виде цегш, но и в виде сети. Этот факт с одной стороны вполне естественен, однако с другой, далеко не для всех и всегда очевидный. Именно благодаря подобным перемещениям, как это было показано в настоящей работе, в природе, по-видимому, сохраняются большинство не только энтеропатогенных, но и сапротрофных микроорганизмов. Полученные результаты показывают, что сохранение и поддержание популяции того или иного микроорганизма в природе зависит не только от того, как долго он может выживать в том или ином субстрате, но и от того, как успешно он может выживать при перемещении из одного субстрата в другой, третий и т.д.

ВЫВОДЫ

1. Сапротрофные и энтеропатогенные бактерии способны активно расти в кормах животных и проходить через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) животных, длительно (до 70 сут) выживать и увеличивать численность в экскрементах животных, сохранять популяциоиную численность при попадании в почву и/или воду и перемещаться на растения, при этом даже увеличивая численность па растениях по сравнению с почвой, повторно проходить через ЖКТ других животных при поедании животными этих растений. Полученные результаты свидетельствуют о способности каждой индивидуальной популяции бактерий к циклическим перемещениям в экосистеме. Циклическое перемещение популяций бактерий возможно через разное количество промежуточных звеньев.

2. Соответствующие суточному циклу изменения температуры в режиме день-ночь более негативны для выживания бактерий в экскрементах животных и смеси экскременты-почиа, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо учитывать при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов, особенно патогенных, в природе.

3. Популяционная плотность интродуцентов, сравнимая или несколько меньшая плотности выявляемых на средах «аборигенных» бактерий является более подходящей для прохождения интродуцентов по цепи разных природных субстратов, по сравнению с очень высокой или очень низкой популяциоиной плотностью.

4. При интродукции микроорганизмов в природные местообитания имеет место не краткосрочный и одиночный акт существования микроорганизма в конкретном субстрате или местообитании, а последовательное многоступенчатое внедрение микроорганизма в экосистему. Показано, что генетически модифицированные микроорганизмы (ГММ) способны к длительной циркуляции в разных местообитаниях. Обильное и неконтролируемое применение ГММ в практике может привести к их длительному внедрению в экосистемы с положительными или отрицательными последствиями для компонентов этих экосистем.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Куприянов A.A., Семенов A.M., Куненкова H.H., Ван Бругген A.X.K. Многоступенчатая интродукция бактерий в природные субстраты при разной исходной инокуляционной численности // Почвоведение. 2009. № 9. С. 1119-1127.

2. Куприянов A.A., Семенов A.M., Ван Бругген А.Х.К., Нетрусов А.И., Семенова Е.В. Динамика выживания энтеропатогенных и сапротрофных бактерий при прохождении через пищеварительный тракт птиц, в их экскрементах и в воде // Вестник Московского университета. Биология. 2009. Т. 64. № 3. С. 102-106.

3. Куприянов A.A., Куненкова H.H., Ван Бругген А.Х.К., Семенов A.M. Перемещение бактерий из экскрементов животных в почву и сопряженные с ней местообитания // Почвоведение. 2009. № 11. С. 76-83.

4. Семенов A.M., Куприянов A.A., Куненкова H.H., Семенова Е.В., Ван Бругген A.X.K. Круговорот микроорганизмов в наземных экосистемах // Доклады ТСХА. 2007. Выпуск 279. Ч. 2. С. 208-212.

5. Куприянов A.A., Семенов A.M., Ван Бругген A.X.K. Перемещение энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в цикле экониш // Известия РАН. Серия биологическая. Принята к опубликованию.

6. Semenov A.M., Kuprianov A.A. & van Brüggen A.H.C. Transfer of enteric pathogens to successive habitats wilhin microbial cycles // Microbial Ecology (submitted).

7. Куприянов A.A., Семенов A.M., Van Brüggen A.H.C. Генетически модифицированные микроорганизмы в естественных субстратах: многоступенчатая интродукция или неконтролируемая контаминация? // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды. Материалы международной конференции. Саратов. 14-16 сентября 2005 г. Тезисы докладов. С. 138-139.

8. Куприянов A.A., Семенов A.M., Семенова Е.В., Van Brüggen A.H.C. Возможность преодоления экологических барьеров аналогом энтеропатогеняого микроорганизма Salmonella Typhimurium МАЕ 110 gfp при интродукции в естественные субстраты // Автотрофныс микроорганизмы. Всероссийский симпозиум с международным участием, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 21-24 декабря 2005 г. Тезисы докладов. С. 94.

9. Куприянов A.A., Семенов A.M., Семенова Е.В., Нетрусов А.И., Van Brüggen A.H.C. Закономерности перемещения бактерий в системе естественных местообитаний: животные - экскременты - почва - растения - животные // Микроорганизмы и биосфера. Материалы международной научной конференции. Москва. 19-20 ноября 2007 г. Тезисы докладов. С. 73-74.

Отпечатано в коницентре «СТПРИП'Г» Москва. Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globns9393338fS.yandcx.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 05.11.2009 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куприянов, Алексей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение.

1. Основные среды обитания микроорганизмов.

1.1. Животные как местообитание микроорганизмов.

2. Эпидемиологические и экологические представления о местообитаниях, распространении, колонизации и других характеристиках микробных популяций и сообществ

2. 1. Эколого-эпидемиологичеекая характеристика Escherichia coli, Salmonella enterica var. Typhimurium и Psendomonas fluorescens.

3. Популяциоппая динамика микроорганизмов в природных субстратах и факторы окружающей среды, влияющие на эти процессы.

3.1. Закономерности популяционной динамики микроорганизмов при их интродукции (инокуляции) в разные среды.

4. Распространение и перемещение микроорганизмов в окружающей среде.

4. 1. Микроорганизмы, как объекты направленного перемещения по цепи взаимосвязанных природных субстратов.

5. Методы исследования циркуляции микроорганизмов в природе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов"

Актуальность проблемы. Исследование путей распространения микроорганизмов в природных средах и их активности, прослеживание судьбы популяций в естественных субстратах, контаминация почвы и других природных местообитаний, определение риска попадания микроорганизмов, в том числе патогенных, в организм человека и животных с пищей, в том числе с овощной продукцией, продолжает оставаться актуальной задачей (Заварзин, 1989; Кожевин, 1989; Добровольская, 2002; McCaig, 2001; Ranjard, 2001; Natvig, 2002; Ingham, 2004; Semenov, 2004; Franz, 2005; Van Bruggen, 2008).

Традиционным методическим приемом исследования выживания микроорганизмов в естественных субстратах является интродукция их в такие субстраты и прослеживание популяционпой динамики в конкретном субстрате. Закономерности поведения сапротрофных микроорганизмов при их интродукции и динамика выживания в одном субстрате исследованы довольно хорошо (Звягинцев, 1987; Звягинцев и Голимбет, 1983; Кожевин, 1989; Семенов, 2005; Ahn, 2001; Zelenev, 2005). Исследования выживания микроорганизмов, а тем более энтеропатогенов, при последовательном перемещении их в другой или третий субстрат все еще редки (Шустрова с соавт., 1992; Semenov A.M., 2004).

В подавляющем большинстве работ, связанных с выявлением динамики микроорганизмов, в том числе патогенных, в природе, исследователи ограничиваются прослеживанием их наличия и численности только в отдельном природном субстрате или местообитании (Wang, 1996; Kudva, 1998; Himathongkham, 1999; Jiang, 2002). Однако существует проблема перемещения микроорганизмов из одного местообитания в другие, а тем более перемещения через несколько разных местообитаний в виде цепи и даже цикла (Семенов, 2005). Такой вариант распространения как сапротрофных, так и энтеропатогенных микроорганизмов остается малоизученным, хотя указания на существование такого цикла высказывались давно, а само явление, несомненно, важнее и интереснее, чем просто выживание микроба в одном субстрате (Мишустин с соавт., 1979; Литвин с соавт., 1997).

В настоящее время в развитых странах широко развернулось движение за производство экологически чистых продуктов, охрану природы от бесконтрольной химизации и, в том числе, от распространения генетически модифицированных организмов. В повседневной практике внесение некомпостированного или недостаточно компостированного навоза в почву — нередкость, особенно при использовании «экологически чистых» технологий производства продуктов. Это несет в себе серьезную опасность для человека быть инфицированным такими штаммами бактерий как Е. coli 0157:Н7, Salmonella spp, Campilobacter jejuni, Listeria monocytogenes и некоторыми другими. Бактерии Salmonella spp., Escherichia coli 0157:H7 являются наиболее распространенными возбудителями пищевых отравлений в мире, связанных с употреблением инфицированных мясных и молочных продуктов, фруктов, овощей и их производных, в частности, соков и пюре (Altwegg, 1998; Brackett, 1999; Rangel et al., 2005).

Резервуарами и распространителями упомянутых энтеропатогеннов традиционно считали животных. Однако последние исследования показывают, что они успешно выживают и вне желудочно-кишечных трактов (ЖКТ) животных (Van Bruggen, 2008). Именно этими фактами вызваны массированные исследования, развернувшиеся в зарубежных научных центрах (Natvig, 2002; Solomon, 2002; Ingham, 2004; Franz, 2005).

Учитывая тот факт, чго энтеробактерии способны проникать и в ткани растений, выживая в них, опасность распространения инфекций существенно возрастает (Люлин, 2007; Solomon, 2002; Klerks, 2007).

Результаты наших исследований могут оказаться полезными для развития традиционных фундаментальных тем, в частности, дальнейшего развития теоретических представлений о миграции микроорганизмов. Распространение микроорганизмов в природе происходит главным образом двумя путями -ненаправленной диссипацией и векторным переносом. В этой связи представляется важным выяснить потенциальные возможности одной и той же популяции микроорганизмов выживать в разных природных субстратах. Интересным представляется и решение вопроса о том, что является более важным для микроорганизма: способность максимально долго выживать в одной конкретной нише (нише-фаворите) с поддержанием необходимой популяционной плотности или постепенно, снижая плотность, но быть способным проходить через ряд субстратов. Результаты исследований важны для расширения знаний о последствиях интродукции ГМ микроорганизмов в природные местообитания с целью предотвращения их неконтролируемого распространения.

Таким образом, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения изучение явления многократного перемещения микроорганизмов через различные, но взаимосвязанные местообитания, способность конкретной популяции проходить через ряд взаимосвязанных субстратов, в том числе в виде цикла и количественные закономерности таких перемещений являются важными и нужными.

Целью работы являлось изучение выживания бактерий, сапротрофных и аналогов энтеропаюгенных, при перемещении в цепи природносвязанных субстратов с образованием цикла: животные - экскременты животных - почва -растения и опять животные и выявление количественных закономерностей динамики перемещающихся популяций.

Для выполнения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. В лабораторных экспериментах изучить закономерности выживания аналогов энтеропатогенных Salmonella Typhimurium МАЕ 110 gfp, Escherichia coli 0157:Н7 gfp и сапротрофных Psendomonas fluorescens 32 gfp бактериальных популяций в краткосрочных экспериментах при интродукции их в экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) и последующем перемещении в серии природных субстратов в зависимости от исходной численности бактерий.

4. Изучить способность исследуемых бактерий проходить через ЖКТ коров при попадании таких бактерий в пищеварительный тракт с кормами, динамику выживания бактерий в экскрементах и при, последующем перемещении бактерий в почву, на растения и через ЖКТ других животных.

Научная новизна. Впервые в серии лабораторных и натурных экспериментов на примере представителей энтеропатогенных и сапротрофных бактерий проведены сравнительные исследования возможности перемещений индивидуальных бактериальных популяций через серию природных местообитаний: животные - их экскременты - почва - растения и опять животные с фактическим образованием цикла. Показана возможность существования укороченных цепей и циклов. Результаты дают основание полагать, что циркуляция микроорганизмов может происходить не только в виде замкнутой цепи-цикла, но и в виде замкнутой сети. Выявлена возможность активного роста энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в комбикорме с последующим прохождением этих бактерий через ЖКТ разных животных. Установлено, что циклически меняющаяся температура, соответствующая природному режиму день-е ночь, более негативно действует на выживание энтеропатогенных и сапротрофных бактерий, как в ЭКРС, так и смеси ЭКРС-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо принимать во внимание при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов в природе. В круговороте пли цикле микроорганизмов имеются местообитания, в которых может происходить увеличение численности микроорганизмов. Показано, что на растениях, может происходить «подращивание» популяций патогенных микроорганизмов. Получено подтверждение положению о том, что численность интродуцента, сравнимая или несколько меньшая численности культивируемых аборигенов, является более оптимальной для прохождения по цепи субстратов, чем очень высокая или очень низкая численности. Установлено, что при интродукции микроорганизмов в природные субстраты имеет место не ограниченный акт существования конкретного микроорганизма в том конкретном местообитании, а скорее последовательная многоступенчатая интродукция с возможными отдаленными последствиями для экосистемы.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях и симпозиумах: «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; «Автотрофные микроорганизмы», Москва, 2005; «Микроорганизмы и биосфера», Москва, 2007.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, списка литературы, который содержит 222 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 141 страницах текста и включают 19 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Куприянов, Алексей Александрович

выводы

1. Сапротрофные и энтеропатогенные бактерии способны активно расти в кормах животных и проходить через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) животных, длительно (до 70 сут) выживать и увеличивать численность в экскрементах животных, сохранять популяционную численность при попадании в почву и/или воду и перемещаться на растения, при этом даже увеличивая численность на растениях по сравнению с почвой, повторно проходить через ЖКТ других животных при поедании животными этих растений. Полученные результаты свидетельствуют о способности каждой индивидуальной популяции бактерий к циклическим перемещениям в экосистеме. Циклическое перемещение популяций бактерий возможно через разное количество промежуточных звеньев.

2. Соответствующие суточному циклу изменения температуры в режиме день-ночь более негативны для выживания бактерий в экскрементах животных и смеси экскременты-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо учитывать при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов, особенно патогенных, в природе.

Заключение

Все природные экосистемы почвенные и водные, а также растения и животные, которые, являясь хотя и компонентами экосистем, но с другой стороны, они, по существу, сами по себе тоже являются экосистемами, обильно заселены разнообразными микроорганизмами. Микроорганизмы, обитающие в экосистемах, экотопах, эконишах и всех других местообитаниях, адаптированы к сосуществованию внутри этих местообитаний, а также и к местообитаниям, а границы таких местообитаний называют еще экологическими барьерами. Однако резких границ между этими экологическими системами не существует, а-обитатели этих систем обладают еще и своими нормами реакции в отношении окружающих их физико-химических и биологических факторов. Микроорганизмы перемещаются, главным образом, пассивно и не направлено, но вместе с тем в существенной степени и направленно перемещаются между разными экосистемами, экотопами, эконишами и просто местообитаниями. Повсеместность обитания микроорганизмов объясняется не только следствием их диссипативного распространения, но и направленной циркуляцией, которая в свою очередь является следствием круговорота вещества в экосистемах, наличием жизненных циклов более высокоорганизованных живых систем и функционированием пищевой цепи в экосистемах. В результате имеет место распространение, расселение и заселение вновь образуемых местообитаний.

Имеется много экспериментального материала о существовании и функционировании микробных популяций в естественных средах и субстратах, динамике их роста и активности. Этот материал был получен, как путем наблюдений за природными популяциями или даже сообществами микроорганизмов и их функционированием в природных средах, так и в экспериментах, в том числе, путем интродукции в среды и субстраты различными способами меченых микробных популяций. Экспериментальный материал в большей или меньшей степени, но обобщен в виде наиболее общих закономерностей, концепций и даже теорий, отражающих рост и развитие микробных популяций и даже сообществ в естественных средах, динамику их развития, трансформацию простых и сложных субстратов, реакции на физические, химические и биологические факторы. Однако подавляющее большинство этого экспериментального материала и его обобщение отражают дискретно полученные результаты. Связи же, необходимые для получения целостного представления о явлениях и процессах, как правило, получают путем реконструирования событий, а такая реконструкция может оказаться далеко неадекватной естеству процессов. В настоящее время разработаны методы, позволяющие аккуратно и довольно долго прослеживать популяционную динамику не только индивидуальных микробных популяций, но даже и созданных ассоциаций в естественных местообитаниях -почве и воде, на растениях и в растениях, на животных и в животных. С этой целью удобно использовать микроорганизмы, несущие гены, кодирующие и синтезирующие внутри клетки белки с разным свечением (Veening et al., 2004). Перспективным является и FISH-метод, хотя его чувствительность не всегда удовлетворительна. Различные варианты микрочипов также являются достаточно эффективными методами, хотя и требуют очень дорого оборудования и квалифицированных специалистов для использования, как оборудования, так и интерпретации результатов.

Прослеживание популяционной динамики при последовательном перемещении интересующей исследователя популяции через несколько местообитаний позволяет получать уже не дискретные результаты и реконструированное представление, а истинно динамическое представление в его целостности, движении и развитии.

Прослеживание за конкретной популяцией микроорганизмов при перемещении ее через несколько разных природных субстратов, по существу, является многоступенчатой интродукцией. Такое явление, и это вполне очевидно, является широкораспространенным и даже повсеместным явлением в природе. Выявление закономерностей такой многоступенчатой интродукции микроорганизмов и получение количественных данных об этом явлении стало важным и актуальным в силу многих причин и, в частности, в связи с использованием генетически модифицированных организмов.

При исследовании циркуляции микроорганизмов через естественные местообитания достоверность и надежность результатов, их практическая значимость в существенной степени зависит от микроорганизмов, избранных в качестве объектов исследований. В связи с этим часто используют микроорганизмы с «широкими» эколого-физиологическими возможностями и более того, стараются проследить за опасными для здоровья человека, животных и растений микроорганизмами, то есть патогенными микроорганизмами. Такой подход, по-видимому, оправдан, так как среди патогенов довольно много космополитов, а- результаты таких исследований представляют не только академический интерес, но сразу же найдут и практическое применение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы

Микроорганизмы.

Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Исследования проводились с антибиотикоустойчивыми и авирулентными штаммами (гены вирулентности удалены).

Salmonella enterica var. Typhimurium МАЕ 110 gfp (далее для краткости S. Typhimurium gfp) получена от д-ра Юты Ремлинг (микробиологический ценгр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция). GFP-кассета интегрирована в хромосому, но без идентификации ее расположения. Для конструирования gfp-штамма была использована плазмида PAG408, включающая участок инициации трансляции, ^-конструкцию, ген канамицинустойчивости, ген гентамицинустойчивости, а также 5-Т участки, которые используются для встраивания в хромосому.

Escherichia coli 0157:Н7 штамм В6-914 gfp-91 (далее для краткости Е. coli 0157:Н7 gfp) получена из лаборатории проф. А. Ван Бругген, Университет Вагенингена, Нидерланды. Штамм не продуцирует шигаподобных токсинов 1 и 2 типов (Stxl" и Stx2"), содержит ген ампициллинустойчивости. Статистически достоверных различий в выживании между шигатоксин-положительными (Stxl+ и Stx2+) и отрицательными (Stxl" и Stx2") штаммами Е. coli 0157:Н7 не выявлено (Kudva et al., 1998; Scott et al., 2006).

Pseudomonas fluoresceins 32 gfp получена от Dr. J.M. Raaijmakers, Университет Вагенингена, Нидерланды. Штамм был выделен с корней пшеницы, растущей в почве, обладающей супрессирующей активностью к болезни пшеницы, именуемой «полегание пшеницы», и где до этого выращивали пшеницу на протяжении 27 лет в монокультуре. Этот штамм эффективно контролирует Gaeumannomyces graminis var. tritici (гриб, вызывающий полегание пшеницы) и продуцирует 2,4-диацетилфлороглюцинол. Спонтанный рифампицин-устойчивый штамм 32 был трансформирован плазмидой PVSP61TIR Dr. Sayler R.J. (биологический факультет, университет Арканзаса, США). Плазмида PVSP61TIR была любезно предоставлена Dr. Lindow S. (Университет Беркли, Калифорния,

США). Эта плазмида содержала конститутивно экспрессируемые гены gfp-конструкции и канамицинустойчивости.

Проявление активности GFP легко детектируется под люминесцентным микроскопом, и объединение генетической информации в штамме подтвердилось с помощью ПЦР ДНК-фингерпринтом дикого штамма P. fluorescens 32 и трансформированного P. fluorescens 32 gfp . Стабильность GFP-пакета была проверена в течение долгого времени культивирования трансформированного микроорганизма на среде без антибиотиков (Vialette et al., 2004; Solomon and Matthews, 2005; Van Bruggen et al., 2008).

Бактерии были сохранены при -80°С и проверены на жизнеспособность перед использованием.

Избранные для исследований бактерии фактически не отличались по физиолого-кинетическим и экологичесим характеристикам от натуральных бактерий и «кастрирование» генов вирулентности не повлияно на них (Durso et al., 2004).

Экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) были собраны на ферме крупного рогатого скота ЗАО «Московский конный завод №1» Одинцовского района Московской области. Рацион кормления животных включал кг/особь/сутки: зеленая масса - 2,5; сено - 1; комбикорм сухой - 3,0; соль на зеленую массу - 40 г/особь/ сутки. В экспериментах использовали свежесобранные экскременты. Исходная влажность экскрементов в среднем составляла 70%, рН - 7,1.

Почва. Использовали дерново-подзолистую почву, отобранную в Ботаническом саду МГУ имени М. В. Ломоносова недалеко от растений облепихи (Hippophae rhamnoides L.) с глубины 0 -15 см. Почву просеивали через сито (ячейки 2 мм) и хранили в полиэтиленовом пакете при комнатной температуре. Почва содержала: общего углерода - 39,6 мг/г, общего азота - 2,9 мг/г, азота аммонийного - 3,8 мкг/г, азота нитратного - 85,5 мкг/г, фосфора в виде фосфат-ионов - 17,7 мкг/г, рН почвы - 6,6. Фракционный состав почвы был следующим: (среднее в объемных %): глина - 11,7; песок - 31,8 и илистые частицы - 56,5.

Вода. Использовали природную воду, отобранную из пруда вблизи пос. Николина Гора Одинцовского района Московской области. Использовали нестерильную и стерильную воду. Стерилизацию проводили автоклавированием при повышенном давлении в 0,5 атм в течение 30 мин.

Растения. Для выявления способности интродуцентов колонизировать растения использовали кресс-салат {Lepidium sativum L.) сорта Витаминный, производитель "Агрофирма Аэлита", всхожесть семян 92,5 % и овес (Avena sativa L.) сорта Горизонт, всхожесть семян 85%.

Комбикорм. Для определения динамики роста бактерий в суспензии комбикорма использовали комбикорм для сельскохозяйственных животных производства ОАО «Истра-Хлебопродукт», состав: ячмень, отруби, пшеница, шрот рапсовый, жмых подсолнечниковый, с добавлением соли и микроэлементов.

Животные.

Крупный рогатый скот (КРС) {Bos taurus taurus L.). В экспериментах по выживанию исследуемых бактерий при прохождении их через желудочно-кишечный тракт КРС использовали коров-нетелей черно-пестрой породы в возрасте 1 года.

Грызуны. Для проверки вероятности выживания исследуемых бактерий при прохождении их через желудочно-кишечный тракт грызунов использовали лабораторных мышей (Mus musculus cf.) и морских свинок (Cavia aperea L.). В лаборатории животных содержали в емкостях при 18-20°С, кормили специализированными кормовыми смесями с добавлением сочных кормов (морковь, капуста) и сена для морских свинок.

Куры (Gallas gallus domesticus L.). Использовали кур-несушек породы "Московская" в возрасте 1 года.

Беспозвоночные животные. Для выявления выживания исследуемых бактерий при прохождении их через ЖКТ беспозвоночных использовали виноградных улиток (.Helix pomatia L.), собранных в Ботаническом саду МГУ. В лаборатории улиток содержали в стеклянных емкостях при 18-20°С и кормили листьями капусты и тонкими срезами моркови.

Динамика прогревания ЭКРС при циклически меняющейся температуре в зависимости от объема ЭКРС. Экскременты массой 0,1, 0,5 и 2,0 кг помещали в пластиковые горшки, закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой, в каждый горшок в середину субстрата вставляли термометр. Эксперимент проводили в трех повторностях. Режим инкубирования составлял 8 ч при 25°С и 16 ч при 15°С.

Выращивание бактерий и подготовка инокулюма.

S. Typhimurium gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, агар - 17, вода дистиллированная. рН среды 7,2 - 7,4. Добавляли антибиотик налидиксовая кислота (50 мг/л). После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик канамицин (50 мг/л).

Е. coli 0157:Н7 gfp выявляли на среде (LB-media), содержащей г/л: дрожжевой экстракт (Difco) - 5, бактопептон (Difco) - 10, NaCl - 10, агар - 17. Вода дистиллированная 1 л. рН среды 7,2 - 7,4. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик ампициллин (50 мг/л).

P. fluoresceins 32 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: бактопептон - 2, К2НР04 - 1,4, MgS04-7H20 - 1,5, глицерин - 15 мл/л, агар - 17. рН среды 7,0 - 7,2. После автоклавирования вносили стерилизованные фильтрацией антибиотики канамицин (50 мг/л) и рифампицин (50 мг/л).

Все среды автоклавировали при 0,5 атм в течение 30 мин.

Биомассу бактерий для интродукции или инокуляции выращивали в тех же, но жидких средах. Бактерии выращивали до достижения начальной стадии стационарной фазы роста (~ 24 часа для S. Typhimurium gfp и 15 часов для Е. coli 0157:Н7 gfp и P. fluorescens 32 gfp). Температура выращивания бактерий составляла 37°С для S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp и 25°С для Р. fluorescens 32 gfp. Клетки концентрировали центрифугированием (Backman J 6 В) при 5000 об/ мин в течение 20 мин, t° 4 - 5 °С. Биомассу отмывали один раз дистиллированной водой и ресуспендировали в дистиллированной воде.

Для интродукции в ЭКРС и инокуляции коров посевной материал выращивали в колбах объемом 250 мл со 100 мл среды на качалке при 300 об/мин и соответствующей температуре. При интродукции в ЭКРС через ~ 24 часа для S. Typhimurium gfp и 15 часов для Е. coli 0157:И7 gfp и P. fluorescens 32 gfp посевной материал переносили в 3-х литровые колбы с 900 мл среды и соответствующими антибиотиками и также культивировали до достижения начальной стадии стационарной фазы роста.

Методы учета g/^-меченых бактерий.

G/p-мсченые бактерии выявляли прямым учетом под люминесцентным микроскопом (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, Санкт-Петербургское ОМО) и посевом на селективные среды с последующим освещением колоний голубым светом лампы (black-light lamp, PL-S, Philips, Eindhoven, The Netherlands).

Для учета численности g//?-бактерий навески ЭКРС весом в 1 г сырой массы разводили в 9 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивали, и делали серию разведений для учета под микроскопом и методом посева.

На предметное стекло наносили 10 мкл в трех повторностях, раздавливая каплю покровным стеклом 22x22 мм, и просчитывали от 50 до 100 полей зрения. Пересчет клеток на грамм сухого субстрата (ЭКРС, почвы или их смеси) производили по формуле: ((число клеток во всех полях зрения/число просчитанных полей зрения) * 36482,9 [число полей зрения на одном покровном стекле] * 100 * разведение образца)/сухой вес 1 г субстрата.

При посеве на агаризованную среду на каждую чашку наносили 0,05 - 0,1 мл суспензии. Посев производили в трех повторностях. Чашки с P. fluorescens 32 gfp инкубировали при 25°С и 37°С - S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp в течение 4-5 дней. Флуоресцирующие колонии обнаруживали и учитывали под темно-голубым светом лампы в темной комнате. Количество колоний образующих единиц (КОЕ) пересчитывали на 1 г сухого субстрата.

Учет аборигенных микроорганизмов.

Учет аборигенов проводили посевом на среду для копиотрофных бактерий. Среда содержала 0.5 г MgS04*7H20, 0.5 г KN03, 1.3 г К2НР04*ЗН20, 0.06 г Ca(N03)2*4H20, 2.5 г глюкозы, 0.2 г гидролизата казеина и 17.0 г агара на 1 л дистиллированной воды. Олиготрофные бактерии учитывали на той же среде при уменьшении концентрации глюкозы и гидролизата казеина в 100 раз. Навески ЭКРС или смеси ЭКРС-почва весом 1 г сырой массы разводили в 9 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивали и делали серию разведений для учета методом посева. После этого 50 мкл суспензии наносили на питательную среду и инкубировали 60 ч при 28°С, затем производили подсчет колоний и пересчитывали на 1 г сухого субстрата.

Обнаружение хищников в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Для проведения этого эксперимента уже описанным методом была получена биомасса Е. coli в одной 3-х литровой колбе. Плотность клеток в итоговой суспензии составляла 1,2 * 10 10 клеток/мл. Для обнаружения и определения численности хищников (протозоа и нематоды) в субстратах была использован метод предельных разведений: из каждого опыта отбирались пробы субстрата массой 1 г и суспендировались в 9 мл воды. Затем делали ряд разведений (1 мл из раннего разведения на 8 мл воды), и в каждую пробирку вносили по 1 мл суспензии клеток Е. coli (итоговый объем 10 мл). При наличии хищников мутная опалесцирующая жидкость в пробирках должна осветляться, а конечное разведение, в котором происходит осветление, позволяет вычислить их примерную численность. Длительность проведения эксперимента определялась временем, необходимым для развития простейших из цист и вылуплением особей нематод из яиц, которое составляет для простейших от одного до трех и более дней, а для нематод от недели до 3-х недель. В течение этого времени каждые 3-7 дней проводили микроскопирование первых трех разведений с целью обнаружения хищников с использованием объектива х20. Объем пробы 10 мкл. Просматривали всю площадь стекла, отмечая факт обнаружения искомых хищников; при обнаружении проводился примерный подсчет их количества, которое затем пересчитывали на 1 г субстрата.

Определение водорастворимого органического углерода.

Для этого 1 г субстрата поместили в химически чистую пробирку, добавили 9 мл стерильной воды и тщательно перемешали на вортексе. Полученную суспензию фильтровали через бактериальный фильтр с размером пор 0,22 мкм. К 1,6 мл фильтрата добавили 2,4 мл раствора А. (Раствор А готовили путем добавления 100 мл концентрированной серной кислоты к 20 мл дистиллированной воды и 1,175 г К2СГ2О7). В качестве контроля вместо фильтрата использовали дистиллированную воду. Смесь перемешивали и оставляли при 140°С на 20 мин. Затем быстро охлаждали в ледяной бане и измеряли на спектрофотометре (фотометр КФК - 3) при длине волны 590 нм и с оптическим путем 1 см. По калибровочному графику определяли исходное количество растворенного углерода.

Для построения калибровочного графика 2,5 г глюкозы растворяют в 1 л дистиллированной воды, исходная концентрация углерода соответствует 1 г/л. Приготовляются разведения так, чтобы концентрация углерода составляла 10, 50, 100, 200, 400, 500 мкг/мл. В дальнейшем повторяется процедура, описанная выше, и строится калибровочный график.

Постановка экспериментов

Инокуляция бактериями ЭКРС. Массу ЭКРС помещали в прочный полиэтиленовый мешок с соотношением объема ЭКРС-воздух ~ 1:5. Постепенно 200 мл бактериальной суспензии было добавлено к ЭКРС, чтобы начальная концентрация была приблизительно Ю10 кл/г сухого ЭКРС. Инокуляцию ЭКРС проводили через 4 суток инкубации в термостате при циклически меняющейся температуре. В отдельном эксперименте, другие начальные концентрации бактерий были использованы, от 105 доЮ9 КОЕ/г сух. ЭКРС. Навески ЭКРС в количестве 500 г вносили в пластиковые емкости объемом 0,7 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при температуре 18°С. Объем суспензии подбирали таким образом, чтобы конечная влажность ЭКРС не превышала 90%.

Для учета численности g/p-меченых бактерий отбирали образцы сразу после интродукции, на следующий день, через день и далее с частотой 3-7 дней.

В отобранных образцах определяли содержание влаги, путем их высушивания при 105° С. Учет интродуцентов проводили методом прямого учета под люминисцентным микроскопом и методом посева на агаризованную среду с соответствующими антибиотиками.

Смешивание ЭКРС с почвой. Момент смешивания ЭКРС, содержащего интродуцированные бактерии с почвой, в каждом конкретном случае определяли экспериментально, а именно- после достижения состояния популяционной плотности интродуцента (выход на «плато») в исследуемом субстрате. Как правило, это происходило в течение 2-х - 3-х недель. После этого половину содержимого горшков отбирали и смешивали с почвой в соотношении 1:6 (425 г почвы на 75г ЭКРС), что составило в пересчете на сухой вес 1:16. Эту часть экспериментов мы называем краткосрочными. Оставшуюся часть ЭКРС продолжали инкубировать в тех же условиях, периодически определяя численность интродуцентов, а смешивание с почвой производили только через несколько недель. Эту вторую часть экспериментов мы называем долгосрочными. Влажность ЭКРС перед смешиванием с почвой составляла около 68%, влажность почвы доводили до 14%. Влажность смеси ЭКРС-почва сразу после смешивания составила около 15%.

В эксперименте с разными начальными концентрациями бактерий смешивание с почвой производили через 10 сут после инокуляции ЭКРС.

Выращивание растений кресс-салата. Семена кресс-салата (0,5 г.) высевали в горшки, содержащие смесь ЭКРС-почва с интродуцентом. Горшки закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой для сохранения водного режима и помещали под лампу дневного света. Через 5 сут, когда проростки достигали ~ 3 см длины, производили подсчет растений в каждом горшке и срезали по 30 растений (надземная часть). Срезанные растения помещали в центрифужную пробирку объемом 40 мл и заливали 10 мл стерильной дистиллированной воды, плотно закрывали резиновой пробкой обернутой фольгой и энергично встряхивали на вортексе в течение 30 сек. Извлеченные из пробирок с помощью пинцета растения подсушивали на фильтровальной бумаге (промокнув капельную влагу) и взвешивали сначала во влажном состоянии, а затем после высушивания до постоянного веса. Смыв с каждых 30 растений центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре, затем сливали надосадочную жидкость, а осадок ресуспендировали в 1 мл стерильной дистиллированной воды. В полученной суспензии определяли количество g^b-содержащих бактерий прямым счетом под микроскопом и посевом на селективную питательную среду.

Для выявления бактерий на корнях кресс-салата, 30 корней осторожно извлекали из почвы, аккуратно отряхивали от комочков почвы и три раза отмывали стерильной водой. Для этого корни помещали в центрифужные пробирки со стерильной дистиллированной водой, закрывали пробкой, встряхивали 30 сек на вортексе, жидкость сливали и процедуру повторяли. Отмытые корни после удаления капельной влаги взвешивали сначала во влажном состоянии, а потом после высушивания. В надосадочной жидкости определяли g/р-бактерии описанным выше способом, а количество ризосферной почвы определяли после высушивания.

Скармливание инокулированных g/^-мечеными бактериями растений кресс-салата виноградным улиткам и учет численности g/p-меченых бактерий в их экскрементах. В стерильные пластиковые горшки помещали по одной активно питающейся улитке. Улиток перед проведением экспериментов сутки не кормили. В каждый горшок вносили по 50 растений кресс-салата, срезанных в тех же горшках, в которых определяли численность бактерий в филосфере и ризосфере. Через 24 ч проводили однократный сбор экскрементов. Определяли количество колоний образующих единиц (КОЕ)/г экскрементов. Посев проводили в 3-кратной повторности. Эксперименты проведены три раза в трех повторностях.

Выращивание g/^-бактерий в суспензии комбикорма.

Для определения динамики роста бактерий в суспензии комбикорма 12 г комбикорма смешивали со 100 мл нестерильной водопроводной воды. Суспензии комбикорма инокулировали соответствующими бактериями в размере

•у приблизительно 10 КОЕ/г сух. вещ. и инкубировали на качалке при 250 об/мин в течение 30 часов при температуре 25°С для P. fluorescens 32 gfp и 37°С для S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157:Н7 gfp. В динамике отбирали пробы и производили учет КОЕ с пересчетом на грамм сухого комбикорма.

Скармливание коровам инокулированного g/^-бактериями комбикорма.

Проверку вероятности выживания бактерий при прохождении через ЖКТ коров с пищей исследовали путем скармливания им 1.5 кг предварительно "запаренного" (смесь 1 кг комбикорма с 500г горячей воды) и охлажденного п комбикорма, содержащего 10'КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий.

Эксперимент проводили 3 раза с разными коровами, то есть всего 9 коров для каждой бактерии. Животных кормили утром, комбикорм давали в кормушки для каждой коровы. Во время проведения экспериментов не выявлено отклонений в физиологическом состоянии коров.

Мониторинг популяций g/^-бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Через 24 ч после инокуляции собирали образцы ЭКРС и учитывали в них искомые бактерии посевом на селективные питательные среды.

Для определения динамики выживания бактерий в ЭКРС навески собранных ЭКРС в количестве 500 г вносили в пластиковые емкости объемом 0.7 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при постоянной температуре +18°С.

Момент смешивания ЭКРС, содержащих тест-бактерии, с почвой определяли экспериментально, а именно после достижения квазистационарного состояния популяционной плотности интродуцентов (выход на "плато") в исследуемом субстрате.

Выращивание растений овса. Семена овса по 5 г высевали в емкости со смесью ЭКРС-почва, содержащими соответствующую тест-бактерию. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой для поддержания влажности и помещали под лампу дневного света. Через 7 сут после появления всходов производили подсчет растений в каждом горшке и срезали по 1 г растений (надземная часть растений была 5-6 см). Срезанные растения помещали в центрифужную пробирку объемом 40 мл и заливали 10 мл стерильной дистиллированной воды, плотно закрывали резиновой пробкой обернутой фольгой и энергично встряхивали на вортексе в течение 30 сек. Извлеченные из пробирок растения подсушивали на фильтровальной бумаге (промокнув капельную влагу) и взвешивали сначала во влажном состоянии, а затем после высушивания до постоянного веса. В полученной суспензии определяли количество g/р-содержащих бактерий посевом на питательную среду.

Для выявления интродуцента на корнях овса, корни осторожно извлекали из почвы, аккуратно отряхивали от комочков почвы и с 1 г смывали ризосферную почву стерильной водой. Корни помещали в центрифужные пробирки, закрывали пробкой, встряхивали 30 сек на вортексе, жидкость сливали, и процедуру повторяли. Отмытые корни после удаления капельной влаги взвешивали сначала во влажном состоянии, а потом после высушивания до постоянного веса. Ризосферную почву отделяли и определяли ее количество после высушивания. В надосадочной жидкости определяли g/р-бактерии методом посева.

Скармливание инокулированных g/p-мечеными бактериями растений овса грызунам и учет численности g/^-меченых бактерий в их экскрементах.

Для скармливания растений овса мышам и морским свинкам в стерильные пластиковые емкости помещали по три особи в эксперименте с мышами и по одной особи в эксперименте с морскими свинками. Мышей и морских свинок перед проведением экспериментов сутки не кормили. В каждую емкость вносили по 1 г растений овса, срезанных в тех же емкостях, в которых определяли численность интродуцента в филосфере и ризосфере. Через 4-5 ч проводили однократный сбор экскрементов в эксперименте с мышами и через 24 ч в эксперименте с морскими свинками. Определяли количество КОЕ/г экскрементов методом посева, который проводили в 3-кратной повторности.

Скармливание инокулированного бактериями корма курам.

Использовали "запаренный" (смесь 1 кг комбикорма с 500г горячей воды) и охлажденный комбикорм. Комбикорм инокулировали мечеными бактериями до конечной концентрации

10' КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий и скармливали пяти особям кур. Сразу после скармливания кормушки убирались, а пол в помещении, где содержались куры, застилали чистой пленкой.

Определение динамики выживания бактерий в экскрементах кур. Сбор экскрементов проводили приблизительно через сутки после скармливания. В свежесобранных экскрементах сразу учитывали исследуемые бактерии и после этого подвергали их инкубации в течение 8 сут, в динамике определяя выживание бактерий. Навески экскрементов делили на три равные части в количестве 50 г и вносили в пластиковые емкости объемом 0,1 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при постоянной температуре +18°С. Влажность экскрементов после сбора составляла в среднем 42%, рН 6,3.

Смешивание экскрементов кур с водой и прослеживание динамики меченых бактерий в воде. Момент смешивания экскрементов, содержащих тест-бактерии, с водой определяли экспериментально, а именно, после достижения квазистационарного состояния популяционной плотности интродуцента (выход на «плато»). Влажность экскрементов перед смешиванием с водой составляла в среднем 40%. Смешивание экскрементов с водой производили в соотношении 1:10, то есть 10 г экскрементов смешивали с 90 мл воды и инкубировали в темноте при температуре +18°С.

Статистический анализ.

Эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Сравнение выживания бактерий, в том числе в экспериментах при постоянной и циклической температурах, проводили с использованием t-теста. Статистический анализ проводили с помощью программ в Excel.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куприянов, Алексей Александрович, Москва

1. Аристовская Т.В. Микробиологические процессы в формировании почвы. Ленинград: Наука. 1980. 250 с.

2. Беляков В.Д. Эпидемический процесс. Теория и метод изучения. Л.: Медицина, 1964. 168 с.

3. Беляков В.Д., Ряпис Л.А. Сапрофиты медицинского значения и природа их полипатогенности на примере псевдомонад / Экол. возбуд. сапронозов. М.: Медицина 1988. С. 7-20.

4. Беляков В.Д., Яфаев Р.Х. Эпидемиология. М.: Медицина, 1989. 234 с.

5. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. Екатеринбург: Изд-во УрО РАН. 1997. 277 с.

6. Бызов Б.А. 2003. Зоомикробные взаимодействия в почве. Автореферат дисс. на соискание уч. степ, доктора биол. наук. М.: МАКС Пресс. 2003. 52 с.

7. Бызов Б.А. Зоомикробные взаимодейсивия в почве. М.: ГЕОС. 2005. 213 с.

8. Воронин Л.В., Захарова Л.И. Сапротрофные грибы озер Латвии // Изв. Латв. АН. 1991. Т. 12. № 533. С. 41 43.

9. Гвоздяк Р.И., Яковлева Л.М. Об особенностях патогенности Pseudomonas aeruginosa И ЖМЭИ. 1987. № 3. С. 3-5.

10. Головченко А.В., Полянская Л.М. Сезонная динамика численности и биомассы микроорганизмов по профилю почвы // Почвоведение. 1996. С. 12271233.

11. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. Экология водных микроорганизмов. М.: Наука, 1977. 264 с.

12. Громашевский Л.В. Общая эпидемиология. М.: Медицина, 1965. 260 с.

13. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ. "Академкнига". 2002. 282 с.

14. Заварзин Г.А. Микробное сообщество в прошлом и настоящем // Микробиологический журнал. 1989. Т. 51. С. 3-14.

15. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука. 2004. 348 с.

16. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Московскогогосударственного университета им. М.В. Ломоносова. 1987. 256 с.

17. Звягинцев Д. Г., Голимбет В. Е. О кратковременных изменениях численности микроорганизмов в почве // Микробиология. 1981. Т. 50. В. 3. С. 556560.

18. Звягинцев Д.Г., Голимбет В.Е. Динамика микробной численности, биомассы и продуктивность микробных сообществ в почвах // Успехи микробиологии. 1983. №18. С. 215-231.

19. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология. М.: Дрофа. 2005. 445 с.

20. Карта миграции птиц. Приложение к National Geographic. Россия. Май.2004.

21. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М.: МГУ. 1989. 172 с.

22. Кожевин П.А., Полянская JI.M., Звягинцев Д.Г. Динамика развития различных микроорганизмов в почве // Микробиология. 1979. Т. 48. С. 490-494.

23. Козловская JI.C. Особенности взаимоотношений почвенных беспозвоночных с микроорганизмами // Почвенные микроорганизмы как компоненты биогеоценоза. М.: Наука, 1984. С. 53-66.

24. Корчмару С.С. Интродукция естественных бактериальных комплексов в ризосферу растений. Автореферат дисс. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. М.: Изд-во Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. 1995. 20 с.

25. Кравченко Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями. Автореферат дис. на соиск. уч. степ. докт. биол. наук. М.: Изд-во Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. 2000. 50 с.

26. Леонова-Ерко Е.И. Влияние корневых экзометаболитов на синтез физиологически активных веществ ризобактериями. Автореферат дис. на соиск. уч степ. докт. биол. наук. Изд-во Российской академии с/х наук. Всероссийский НИИ с/х микробиологии. 2000. 22 с.

27. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Интегративные процессы в современной эпидемиологии // ЖМЭИ. 2002. № 4. с. 63-72.

28. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармарус-Принт. 1998. 256 с.

29. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде // ЖМЭИ. 1994. Приложение 1. С. 83-87.

30. Люлин С. Ю. Микробные сообщества городских почв и влияние поллютантов на популяцию Escherichia coli в системе почва-растение. Автореф. дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук М. 2005. 20 с.

31. Мамилов А.Ш., Бызов Б.А., Покаржевский А.Д., Звягинцев Д.Г. Регуляция микрофауной биомассы и активности почвенных микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. С. 727-736.

32. Мирошниченко М.Л. Биоразнообразие анаэробных термофильных микроорганизмов морских гидротермальных полей. Дисс. в виде научн. доклада на соиск. уч. степ. докт. биол. паук. М.: МАКС Пресс. 2005. 60 с.

33. Мишустин Е.Н., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. М.: Наука, 1979. 264 с.

34. Одум Ю. Экология. В 2-х т. Т. 1. М.: Мир. 1986. 328 с.

35. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. Новосибирск: Наука. 1978. 276 с.

36. Полянская Л.М., Гейдебрехт В.В., Звягинцев Д.Г. Биомасса грибов в различных типах почв // Почвоведение. 1995 а. № 5. С. 566-572.

37. Полянская Л.М., Головченко А.В., Звягинцев Д.Г. Микробная биомасса в почвах//Доклады РАН. 1995 б. Т. 344. С. 846-848.

38. Полянская Л.М., Иванов К.Е., Гузев B.C., Звягинцев Д.Г. Оценка динамики численности грамотрицательных бактерий в почве // Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 848-853.

39. Рябченко Н.Ф., Степанова Т.В., Румер Л.М., Мозговая И.Н., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Конъюгативный перенос плазмиды pAMfix из стрептококков в бациллы в вермикомпосте // Микробиология. 1996. Т.65. № 5. С. 663 667.

40. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука. 1986. 199 с.

41. Семенов A.M., Мурзаков Б.Г., Мишустин Е.Н., Аристархова В.И.

42. Активность некоторых групп почвенных микроорганизмов при различных способах обработки почвы и различной системе удобрений. Тез. докл. республ. конф. «Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Кишинев. 1988. С. 27 28.

43. Семенов A.M. Культивирование и физиология роста олиготрофных микроорганизмов // Итоги науки и техн. Сер. Микробиология. 1991. Т. 24. С. 149178.

44. Семенов A.M. Осцилляции микробных сообществ в почвах. Труды Всероссийской конференции к 100-летию со дня рождения академика Е.Н. Мишустина. Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. М.: МАКС Пресс. 2001 а. С. 57-72.

45. Семенов A.M. Микробно-растительные взаимодействия. В учебн. для студ вузов «Экология микроорганизмов», под. ред А.И. Нетрусова. М.:Академия. 2004. 272 с.

46. Семенов A.M. Трофическое группирование и динамика развития микробных сообществ в почве и ризосфере. Автореф. дис. на соискание уч. степени док. биол. наук в виде научн. докл. 2005 а. М.: МГУ. 66 с.

47. Семенов A.M. Круговорот микроорганизмов в наземных экосистемах. Тез. докл. конференции «Биосферные функции почвенного покрова», поев. 100-летию В.А. Ковды. Пущино. 2005 б. С. 86.

48. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наукова думка, 1990. 186 с.

49. Тарасевич И.В. Экология риккетсий (итоги и перспективы) // Экол. и попул. генетика микроорган. 1975. № 5. С. 97-103.

50. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными // Микробиология. 1996. Т. 65. С. 102-110.

51. Ушакова Н. А. Дикие животные и населяющие их микроорганизмы:теоретические предпосылки разработки биологически активных препаратов // Сборник научных статей Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. М: КМК. 2005. С. 473-479.

52. Ушакова Н. А. Изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях. Авторсф. дис. на соискание уч. степени док. биол. наук. М.: МГУ. 2006. 51 с.

53. Хаккер Й. Медицинская микробиология. В кн. «Современная микробиология» под ред. Ленгелера. 2005. Т.2. М.: Мир. 496 с.

54. Харин С.А. Микроскопические грибы в местообитаниях, ассоциированных с дождевыми червями. Автореф. дисс. на соик. уч. степени канд. биол. наук. М.: Цифровичек. 2009. 21 с.

55. Хомяков Н.В., Харин С.А., Нечитайло Е.Ю., Голышин П.Н., Кураков А.С., Вызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости червей // Микробиология. 2007. Т. 76. № 1. С. 55-65.

56. Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека. Справочник эпидемиолога. 1994. М.: Медицинская газета. 617 с.

57. Шинк Б. Экофизиология и экологические ниши прокариот. В кн. «Современная микробиология» под ред. Ленгелера. 2005 а. Т.2. М.: Мир. 496 с.

58. Шинк Б. Местообитания прокариот. В кн. «Современная микробиология» под ред. Ленгелера. 2005 б. Т.2. М.: Мир. 496 с.

59. Шустрова Н.М., Дубровский Ю.А. Природные резервуары условно-патогенных бактерий / Потенц. патоген, бактерии в природе. М. 1991. С. 30-42.

60. Шустрова Н.М., Мисуренко Е.Н., Литвин В.Ю. О возможности передачи Yersinia pseudotuberculosis по цепочке почва-растение-животное // ЖМЭИ. 1992. № 4. С. 10-12.

61. Abd Н., Johansson Т., Golovliov I., Saudstrom G., Forsman M. Survival and growth of Franciella tularensis in Acanthamoeba castellanii II Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 600-606.

62. Agrios G.N. Plant Pathology. Fourth Ed. San Diego: Ac. Press. 1997. 635 P.

63. Ahn Y.-B., Beaudette L.A., Lee H., Trevors J.T. Survival of a GFP-labeled polichlorinated biphenil degrading psychrotolerant Pseudomonas spp. in 4° and 22° С soil microcosms // Microb. Ecol. 2001. V. 42. P. 614 623.

64. Alam M.J. and Zurek L. Association of Escherichia coli 0157:H7 with houseflies a cattle farm // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 7578-7580.

65. Altwegg M. and Bockemuhl J. Escherichia and Shigella. In: Ballows A. and Duerden B.I. (eds.) Microbiology and Microbial Infections. 9-th Edition. Systematic Bacteriology. 1998. V. 2. Arnold. London. P. 935- 967.

66. Anderson K.L. The complex world of gastrointestinal bacteria // Can. J. Animal. Sci. 2003. V. 82. P. 409 427.

67. Andrews J.H. and Harris R.F. The ecology and biogeography of microorganisms on plant serfaces // Annu. Rev. Phytopathol. 2000. V. 38. P. 145-180.

68. Andrews W.H., Wilson C.R., Romero A., Poelma P. The morrocan food snail Helix aspersa, as a source of Salmonella // Appl. Microbiol. 1975. V. 29. P. 328-330.

69. Atasoglu C., Newbold C.J., Wallace R.J. Incorporation of 15N. ammonia by the cellulolytic ruminal bacteria Fibrobacter succinogenes BL2, Ruminococcus albus SY3, and Ruminococcus flavefaciens 17 // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2819-2822.

70. Atlas R.M. and Bartha R. 1998. Microbial Ecology: fundamentals and applications. Fourth ed. Benjamin/Cummings Science Publishing. CA. 694 P.

71. Armstrong G. L., Hollingsworth J. and Morris, J.G. Emerging foodborne pathogens: Escherichia coli 0157:H7 as a model of entry of a new pathogen into the food supply of the developed world// Epidemiologic Reviews. 1996. V. 18. P. 29-51.

72. Bach S.J., Stanford K. and McAllister T.A. Survival of Escherichia coli 0157:H7 in feces from corn- and barley-fed steers // FEMS Microbiology Letters. 2005. V. 252. P. 25-33.

73. Bar M., von Hardenberg J., Meron E., Provenzale A. Modelling the survival of bacteria in drylands: the advantage of being dormant // Proc. R. Soc. Lond. 2002. V. 269. P. 937-942.

74. Beuchat L. R. Vectors and conditions for preharvest contamination of fruits and vegetables with pathogens capable of causing enteric diseases // British Food Journal. 2006. V. 108. P. 38-53.

75. Brackett R.E. Incidence, contributing factors, and control of bacterial pathogens in produce // Postharvest Biol. Technol. 1999. V. 15. P. 305-311.

76. Byzov B.A., Khomyakov N.V., Kharin S.A., Kurakov A.V. Fate of soil bacteria and fimgy in the gut of erthworms // Europ. J. of Soil Biol. 2007. V. 43. P. 149156.

77. Callaway T.R., Elder R.O., Keen J.E. Anderson R.C. and Nisbet D.J. Forage feeding to reduce preharvest Escherichia coli populations in cattle // Journal of Dairy Science. 2003. V. 86. P. 852-860.

78. Caprioli A., Morabito S., Brugere H. and Oswald E. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: Emerging issues on virulence and modes of transmission // Veterinary Research. 2005. V. 36. P. 289-311.

79. Chung K.H., Bang W. and Drake M.A. Stress response of Escherichia coli II Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2006. V. 5. P. 52-64.

80. Cooley M.B., Miller G.M., Mandrell R.E. Colonization of Arabidopsis thaliana with Salmonella enterica and enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 and competition by Enterobacter asburiae II Appl. Environ. Micribiol. 2003. V. 69. P. 49154926.

81. Cooley M.B., D. Chao and R. E. Mandrell. Escherichia coli 0157:H7 survival and growth on lettuce is altered by the presence of epiphytic bacteria // J. Food Protection. 2006. V. 69. P. 2329-2335.

82. Davis M.A., Cloud-Hansen R.F., Carpenter J., Hovde C.J. E. coli 0157-H7 in environments of culture-positive cattle // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 68166822.

83. Dale W., Griffin D.W., Kubilay N., Kocak M., Gray M.A., Borden T.C., Shinn E.A. Airborne desert dust and aeromicrobiology over the Turkish Mediterranean coastline // Atm. Environm. 2007. V. 41. P. 4050^1062.

84. Dandie C.E., Thomas S.M., McClure N.C. Comparison of a range of green fluorescent protein-tagging vectors for monitoring a microbial inoculant in soil // Letters in Appl. Microbiol. 2001. V. 32. P. 25-30.

85. Darwin K.H. and Miller V.L. Molecular basis of the interaction of Salmonella with the intestinal mucosa // Clinical Microbiology Reviews. 1999. V. 12. P. 405-428.

86. Darbyshire J.F. Soil Protozoa. Wallingford: CAB International. 1994. 209 P.

87. Deaker R., Roughley R.J., Kennedy I.R. Legume seed inoculation technology -a review // Soil Biol. & Biochem. 2004. V. 36. P. 1275-1288.

88. Dechesne A., Pallud C., Bertolla F., Grundmann G. Impact of the microscale distribution of Pseudomonas strain introduced into soil on potential contacts with indigenous bacteria//Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 8123-8131.

89. Diez-Gonzalez F., Callaway T.R., Kizoulis M.G. and Russell J.B. Grain feeding and the dissemination of acid-resistant Escherichia coli from cattle // Science. 1998. V. 281. P. 1666-1668.

90. Drahos D.J. Methods for detection, identification and enumeration of microbes /Microbial ecology of leaves. New-York: Springer-Verlag. 1991. P. 135-155.

91. Durso L.M., Smith D. Hutkins R.W. Measurements of fitness and competition of commensal Escherichia coli and E. coli 0157:H7 strains // Appl. Environ. Micriobiol. 2004. V. 70. P. 6466-6472.

92. Duffy B.K. and Defago G. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Peudomonas fuorescens biocontrol strains // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 2429-2438.

93. Errampalli D., Leung K., Cassidy M.B., Kostrzynska M., Blears M. and Lee H. Application of green fluorescent protein as a molecular marker in environmental microorganisms // Journal of microbiological methods. 1999. V. 35. P. 187-199.

94. Favier C.F. Vaughan E.E., De Vos W.M., Akkermans A.D. Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 219-226.

95. Feinerman E., Bosch D.J., Pease J.W. Manure applications and nutrient standards // Amer. J. Agr. Econ. 2004. V. 86. P. 14-25.

96. Fialho A.M., Stevens F.J., Tapas K., Chakrabarty A.N. Beyond host-pathogen interactions: microbial defense strategy in the host environment // Current Opinion in Biotechnol. 2007. V. 18. P. 279-286.

97. Fliefibach A., Oberholzer H.R., Gunst L., and Mader P. Soil organic matter and biological soil quality indicators after 21 years of organic and conventional farming // Agriculture, Ecosystems and Environment. 2007. V. 118. P. 273-284.

98. Foltz V.D. Salmonella ecology // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1969. V. 46. P. 222-224.

99. Forshell L.P. and Wierup M. Salmonella contamination: a significant challenge to the global marketing of animal food products // Revue Scientifique et Technique Office International des Epizooties. 2006. V. 25. P. 541-554.

100. French-Constant R., Waterfield N., Daborn P., Joyce S., Bennet H., Au C., Dowling A., Boundy S., Reynolds S., Clarke D. Photorhabdus: towards a functionalgenomic analysis of a symbiontand pathogen // FEMS Microbiol. Review. 2003. V. 26. P. 433-456.

101. Foster J.W. and Spector M.P. How Salmonella survive against the odds // Annual Review of Microbiology. 1995. V. 49. P. 145-174.

102. Franz E., Semenov A.V., van Bruggen A.H.C. Modeling the contamination of lettuce with Escherichia coli 157:H7 from manure-amended soil and the effect of intervention strategies // J. Appl. Microbiol. 2008 a. V. 105. P. 1569 1584.

103. FranzE., Semenov A.V., Termorshuizen A.J., de Vos O.J., Bokhorst J.G. and van Bruggen A.H.C. Manure-amended soil characteristics affecting the survival of E. coli 0157:H7 in 36 Dutch soils // Environmental Microbiology. 2008 b. V. 10. P. 313-327.

104. Fukushima H. and Seki R. High numbers of Shiga toxin-producing Escherichia coli found in bovine faeces collected at slaughter in Japan // FEMS Microbiology Letters. 2004. V. 238. P. 189-197.

105. Gagliardi J.V. and Kams J.S. Persistence of Escherichia coli 0157:H7 in soil and on plant roots // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 4. P. 89-96.

106. Giller K.E., Witter E. and McGrath S.P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils // Soil Biol, and Biochem. 1998. V. 30. P. 1389-1414.

107. Gong J., Foster R.J., Yu H., Chambers W.R., Sabour P.M., Chen S. Molecular analysis of bacterial populations in the ilrum of broiler chickens and comparison with bacteria in the cecum // FEMS Microb. Ecol. 2002. V. 41. P. 171-179.

108. Griffiths B.S., Young I.M., Caul S. Nematode and protozoan population dynamics on decomposing barley leaves incubated at different soil matric potentials // Pedobiologia. 1995. V. 39. P. 454-461.

109. Griffiths B.S., Bonkowski M., Roy J., Ritz K. Functional stability, substrate utilisation and biological indicators of soils following environmental impacts // Applied Soil Ecology. 2001. V. 16. P. 49-61.

110. Guan T.Y. and Holley R.A. Pathogen survival in swine manure environments and transmission of human enteric illness // J. Environm. Qual. 2003. V. 32. P. 383-392.

111. Guber A.K., Shelton D.R., Pachepsky Ya.A. Effect of manure on Escherichia coli attachment to soil // J. Environm. Qual. 2005. V. 34. P. 2086-2090.

112. Heyndricks M., Pasmans F., Ducatelle R., Decostere A. and Haesebrouck. Recent changes in Salmonella nomenclature: the need for clarification // Veterinary journal. 2005. V. 170. P. 275-277.

113. Himathongkham S., Bahari S., Riemann H. and Cliver D. Survival of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella typhimurium in cow manure and cow manure slurry // FEMS Microbiology Letters. 1999. V. 178. P. 251-257.

114. Howard M.B., Hutcheson S.W. Growth dynamic of Salmonella enterica strains on alfalfa sprouts and in waste seed irrigation water // Appl. Environ. Microbiol.2003. V. 69. P. 548-553.

115. Hwang I. and Farrand S.K. A novel gene Tag for identifying microorganisms released into the environment // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 913-920.

116. Ibekwe A.M., Watt P.M., Grieve C.M., Sharma V.K., Lyons S.R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli 0157:H7 in dairy wastewater wetlands // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 10. P. 48534862.

117. Ibekwe A.M. and Grieve C.M. Changes in developing plant microbial community structure as affected by contaminated water // FEMS Microb. Ecol. 2004. V. 48. P. 239-248.

118. Ipharraguerre I.R. and Clark J.H. Usefulness of ionophores for lactating dairy cows // Animal Feed Science and Technology. 2003. V. 106. P. 39-57.

119. Jiang X., Morgan J., Doyle M.P. Fate of Escherichia coli 0157:H7 in manure-amended soil // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 2605-2609.

120. Johannessen G.S., Bengtsson G.B., Heier B.T., Bredholt S., Wasteson Y., Pervik L.M. Potential uptake of Escerichia coli 0157:H7 from organic manure into crisphead lettuce // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 2221-2225.

121. Karmali M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli II Clinical Microbiology Reviews. 1989. V. 2. P. 15-38.

122. Kaper J.B., Nataro J.P. and Mobley H.L.T. Pathogenic Escherichia coli II Nature Reviews Microbiology. 2004. V. 2. P. 123-140.

123. Kersters K., Ludwig W., Vancanneyt M., Devos P., Gillis M., Schleifer K.H. Recent changes in the classification of pseudomonads: an overview // Syst. Appl. Microbiol. 1996. V. 19. P. 465-477.

124. Klerks M.M., Van Gent-Pelzer M., Franz E., Zijlstra C. and van Bruggen, A.H.C. Physiological and molecular response of Lactuca sativa to colonization by Salmonella enterica serovar Dublin // Appl. Environm. Microbiol. 2007. V. 73. P. 49054914.

125. Kragelund L., Hosbond C., Nybroe O. Distribution of metabolic activity and phosphate starvation response of lux-tagged Pseudomonas fluorescens reporter bacteria in the barley rhizosphere // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 4920^1928.

126. Kudva I.T., Blanch K. and Hovde C.J. Analysis of Escherichia coli 0157:H7 survival in ovine or bovine manure and manure slurry // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 3166-3174.

127. Latour X., Philippot L., Corberand T. and Lemanceau P. The establishment of an introduced community of fluorescent pseudomonads in the soil and in the rhizosphere is affected by the soil type // FEMS Microb. Ecol. 1996. V. 30. P. 163-170.

128. Lawley T.D., Bouley D.M., Hoy Y.E., Gerke C., Relman D.A., Monack D.M. Host transmission of Salmonella enterica ser. Typhimurium is controlled by virulence factorc and indigenous intestinal microbiota // Infect. Immun. 2008. V. 76. P. 403-416.

129. Le Juene J., Besser Т., Hancock D. Cattle Water Throughs as Reservoirs of Escherichia coli 0157 // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 3053-3057.

130. Lederberg J., Shope R.E., Oaks S.C. (Edit). Emerging infections. Microbiol threats to health in the United States. Washington: Nat. Acad. Press. 1992.

131. Lemke Т., van Allen Т., Hackstein J., Brune A. Cross-epithelial hydrogen transfer from the midgut compartment drives methanogenesis in the hindgut of cockroaches // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4657-4661.

132. Lim J. Y., Sheng H., Seo K.S., Park Y.H., Hovde C.J. Characterization of an E. coli OX51-Ш plasmid 0157 deletion mutant and its survival and persistence in cattle // Appl. Environm. Microbiol. 2007. V. 73. P. 2037-2047.

133. Lin J., Smith M.P., Chapin K.C., Baik H.S., Bennett G.N. and-Foster J.W. Mechanisms of acid resistance in enterohemorrhagic Escherichia coli II Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 64. P. 3166-3174.

134. Looper M.L., Edrington T.S., Flores R., Rosenkrans C.F., Aiken G.E. Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella in water abd in soil from tall fescue paddocks //Foodborne Pathogenes and Disease. 2006. V. 3. P. 203 208.

135. Mader P., Flieflbach A., Dubois D., Gunst L., Fried P. and Niggli U. Soil fertility and biodiversity in organic farming // Science. 2002. V. 296. P. 1694-1697.

136. Maeda H. Paradigm shift in microbal pathogenesis: an alternative to the Koch-Pasteur paradigm on the new millennium: Abst. 13th Int. Cong, of IOM. Fukuoka, Japan. 2000. P. 35.

137. Miller W.G.L., Lindow S.E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions // Gene. 1997. V.191. P. 149-153.

138. Moreno Y., Alonso J.L., Botella S., Ferrus M.A., Hernandez J. Survival and injury of Arcobacter after artificial inoculation into drinking water // Research in Microbiology. 2004. V. 155. P. 726-730.

139. Moter A., Gobel U.B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms // J. of Microbiol. Meth. 2000. V. 41. P. 85-112.

140. Mulyukin A., Suzina N., Sorokin V., Soina V., Vorobyova E., Duda V., El-Registan G. Dormant state in bacteria: conceptions and implications for terrestrial biogeoscience and astrobiology // Geophysical Research Abstracts. 2003. V. 5. P. 1003.

141. Nicholson F.A., Groves S.J. and Chambers B.J. Pathogen survival during livestock manure storage and following land application // Bioresource Technology. 2005. V. 96. P. 135-143.

142. Nielsen E.M., Skov M.N., Madsen J.J., Lodal J., Jespersen J.B., Baggesen D.L. Verocytotoxin-producing Escherihia coli in wild birds and rodens in close proximity to farms // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 6944-6947.

143. Noda S., Ohkuma M., Yamada A., Hongoh Y., Kudo T. Phylogenetic position and in situ identification of ectosymbiotic spirochetes on protists in the termite gut//Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 625-633.

144. Normander В., Prosser J. Bacterial origin and community composition in the barley phytosphere as a function of habitat and presowing conditions // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 4372-4377.

145. Nour S., Lawrence J., Zhu H., Swerhone G., Welsh M., Welacky Т., Topp E. Bacteria associated with cysts of the soybean cyst nematode (Heterodera glucines) // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 607-615.

146. Obi S.K.C, Nzeako B.C. Salmonella, Arizona, Shigella and Aeromonas isolated from the snail Ahatina achatina in Nigeria // Ant. Van Leeuwenhoek. 1980. V. 46. P. 475-481.

147. Old D.C. and Threlfall E.J. Salmonella. In: Ballows, A. and Duerden, B.I. (eds.) Microbiology and Microbial Infections. 9-th Edition. Systematic Bacteriology. V. 2. Arnold. London. 1998. P. 970 997.

148. Palleroni N.J. Genus I. Pseudomonas. In.: Bergey's manual of syst. bacteriol. Sec. Ed. V. 2. The Proteobacteria. Part B. Springer. 2005. P. 323-379.

149. Pietronave S., Fracchia L., Rinaldi M., Martinotti M.G. Influence of biotic and abiotic factors on human pathogens in a finished compost // Water Res. 2004. V. 38. P.1963-1970.

150. Prosser J.I. Molecular marker systems for detection of genetically engineered microorganisms in the environment // Microbiology. 1994. V. 140. P. 5-17.

151. Raaijmakers J.M., Vlami M. and de Souza J.T. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents // Ant. van Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P. 537-547.

152. Rangel J.M., Sparling P.H., Crowe C., Griffin P.M., Swerdlow D.L. Epidemiology of Escherichia coli 0157:H7 outbreaks, United States, 1985-2002 // Emerg. Infect. Dis. 2005. V. 11. P. 603-609.

153. Recobert G., RichaumeA., Jocteur-Monrozier L. Distribution of genetically-engineered Escherichia coli population introduced into soil // Lett. Appl. Microbiol. 1995. V. 21.P.38-40.

154. Riley L.W., Remis R.S. and Helgerson S.D. Hemmorhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype // New England Journal of Medicine. 1983. V. 308. P. 681-685.

155. Rodgers S. Preserving non-fermented refrigerated foods with microbial cultures a review // Trends in Food Sci. & Technol. 200l.V. 12. P. 276-284.

156. Roling W., Breukelen В., Braster M., Lin B. and van Verseveld H. Relationships between microbial community structure and hydro chemistry in a landfill leachate-polluted aquifer // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 10. P. 4619-4629.

157. Romling U., Sierralta K., Eriksson K., Normark S. Malticellular and aggregative behaviour of Salmonella typhimurium strains is controlled by mutations in the agfD promoter // Mol. Microbiol. 1988. V. 28. P. 249-264.

158. Romling U., Rohde M., Olsen A., Normark S., Reinkoster J. AgfD , the checkpoint of multicellular and aggregative behaviour of Salmonella typhimurium regulates at least two independent pathways // Mol. Microbiol. 2000. V. 36. P. 10-23.

159. Russel J.A., Moran N.A. Horizontal transfer of bacterial symbionts: heritability and fitness effects in a novel aphid host // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 7987-7994.

160. Russel J.B., Diez-Gonzalez F. and Jarvis G.N. Potential effect of cattle dietson the transmission of pathogenic Escherichia coli to humans // Microbes and Infection. 2000. V.2.P. 45-53.

161. Scherm H. and van Bruggen A.H.C. Global warming and nonlinear growth: How important are changes in average temperature? // Phytopathology. 1994. V. 84. P. 1380-1384.

162. Seepersadsingh N., Adesiyun A.A. Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella spp. in pet mammals, reptiles, fish aquarium, and birds in Trinidad // J. Vet. Med. 2003. V. 50. P. 488-493.

163. Semenov A.M. Physiological bases of oligotrophy of microorganisms and the concept of microbial community // Microb Ecol. 1991. V. 22. P. 239-247.

164. Semenov A.M., Van Bruggen A.H. C., Zelenev V.V. Moving waves of bacterial populations and total organic carbon along roots of wheat // Microb Ecol. 1999. V. 37. P. 116-128.

165. Semenov A.V., Franz E., Van Overbeek L., Termorshuizen A.J., Van Bruggen A.H.C. Estimating the stability of Escherichia coli 0157:H7 survival in manure-amended soils with different management histories // Environm. Microbiol. 2008. V.10.P. 1450- 1459.

166. Schets F.M., During M.; Italiaander R., Hejnen L., Rutjes S.A., Van Der Zwaluw W.K., De Roda Husman A.M. Escerichia coli 0157:H7 in drinking water from private water supplies in the Netherlands // Water Research. 2005. V. 39. P. 4485-4493.

167. Shaw C., Pawluk S. Faecal microbiology of Octolasion tyrtaeum, Aporrectodea turgida and Lumbricus terrestris and its relation to the carbon budgest of three artificial soils // Pedobiology. 1986. V. 29. № 6. P. 377-389.

168. Snell-Castro R., Godon J.J., Delgenes J.P. and Dabert P. Characterisation of the microbial diversity in a pig manure storage pit using small subunit rDNA sequence analysis // FEMS Microbiology Ecology. 2005. V. 52. P. 229-242.

169. Solomon E.B., Yaron S., Matthews K.R. Transmission of Escherichia coli 0157:H7 from contaminated manure and irrigation water to lettuce plant tissue and its subsequent internalization // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 1. P. 397-400.

170. Solomon E.B., Matthews K.R. Use of fluorescent microspheres as a tool to investigate bacterial interactions with growing plants // J. Food Prot. 2005. V. 68. P. 87073.

171. Spiers A.J., Buckling A., Rainey P.B. The causes of Pseudomonas diversity // Microbiology. 2000. V. 146. P. 2345-2350.

172. Suarez A., Guttler A., Stratz M., Staender L.H., Timmis K.N., Guzman C.A. Green fluorescent protein-based reporter systems for genertic analysis of bacteria including monocopy applications // Gene. 1997. V. 196. P. 69-74.

173. Temelli S., Dokuzlu C., Cem Sen M.K. 2006. Determination of microbiological contamination sources during frozen snail meat processing stages. Food Control. V. 17. P. 22-29/

174. Thomason B.M., Dodd D.J., Cherry W.B. Increased recovery of salmonellae from environment //Appl. Microbiol. 1977. V. 30. P. 764-767.

175. Torsvik V. and 0vreas L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems // Current Opinion in Microbiology. 2002. V. 5. P. 240-245.

176. Trautmann M, Lepper Ph.M., Haller M. Ecology of Pseudomonas aeruginosa in the intensive care unit and the evolving role of water outlets as a reservoir of the organism // Am J. Infect. Control. 2005. V. 33. P. 41-49.

177. Turnbull G.A., Morgan J.A.W., Whipps J.M., Saunders J.R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonization of wheat roots // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 36. P. 21-31.

178. Tyler H.L. and Triplett E.W. Plants as a Habitat for Beneficial and/or Human Pathogenic Bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 2008. V. 46. P. 53-73.

179. Unge A., Tomboliny R., Molbak L., Jansson J.K. Simultaneous monitoring of cell number and metabolic activity of specific bacterial populations with a dual gfp-luxAB marker system //Appl. Environm. Microbiol. 1999. V. 65. P. 813-821.

180. U.S. Department of Agriculture National Organic Program Standards (Title 7, Code of Federal Regulations, Part 205.203). Washington, D.C.: U.S. Department of Agriculture. 2000.

181. Van Diepeningen A.D., de Vos O.J., Korthals G.W. and van Bruggen A.H.C. Effects of organic versus conventional management on chemical and biological parameters in agricultural soils // Applied Soil Ecology. 2006. V. 31. P. 120-135.

182. Van Elsas J.D., Hill P., Chronakova A., Grekova M., TopalovaY., Elhottova D., Kristufek V. Survival of genetically marked Escherichia coli 0157:H7 in soil as affected by soil microbial community shifts // ISME J. 2007. V. 1. P. 204-214.

183. Vanselow B.A., Krause D.O. and McSweeney C.S. The Shiga toxin-producing Escherichia coli, their ruminant hosts, and potential on-farm interventions: a review // Australian Journal of Agricultural Research. 2005. V. 56. P. 219-244.

184. Vasiliev V.B., Vavilin V.A. Generalists or specialists in activated sludge microorganisms community//Ecol. Modelling. 1991. V. 55. P. 47-55.

185. Vialette M., Jandos-Rudnik A.M., Guyard C., Legeay O., Pinon A., Lange M. Validating the use of green fluorescent-marked Escherichia coli 0157:H7 for assessing the organism behaviour in foods // J. Appl Microbiol. 2004. V. 96. P. 1097-1104.

186. Vicente M., Hodgson J., Massidda O., Tonjum Т., Henriques-Normark В., Ron E.Z. The fallacies of hope: will we discover new antibiotics to combat pathogenic bacteria in time? // FEMS Microbiol Rev. 2006. V. 30. P. 841-852.

187. Wainwright M., Wickramasinghe N.C., Narlikar J.V., Rajaratnam P. Microorganisms cultured from stratospheric air samples obtained at 41 km // FEMS Microbiology Letters. 2003. V. 218. P. 161-165.

188. Wang G., Zhao T. and Doyle M.P. Fate of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157.-H7 in bovine feces // Appl. and Environ. Microbiol. 1996 V. 62. P. 2567-2570.

189. Wang L., Mankin K.R. and Marchin G.L. Survival of fecal bacteria in dairy cow manure // Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 2004. V. 47. P. 1239-1246.

190. Winfield M.D., Groisman E.A. Role of nonhost environment in the lifestyles of Salmonella and Escherichia coli П Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 36873694.

191. Young J.M., Takikawa Y., Gardan L., Stead D.E. Changing concepts in the taxonomy of plant pathogenic bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1992. V. 30. P. 67105.

192. Zelenev V.V., van Bruggen A.H.C., Semenov A.M. Short-term wavelike dynamics of bacterial populations in response to nutrient input from fresh plant residues // Microb. Ecol. 2005. V. 49. P. 83-93.

Информация о работе

Куприянов, Алексей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куприянов, Алексей Александрович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Куприянов, Алексей Александрович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куприянов, Алексей Александрович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология