Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трофическое группирование и динамика развития микробных сообществ в почве и ризосфере
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Трофическое группирование и динамика развития микробных сообществ в почве и ризосфере"
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет
На правах рукописи
Семенов Александр Михайлович
Трофическое группирование и динамика развития микробных сообществ в почве и ризосфере
03.00.07 - микробиология
ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР
Диссертация
на соискание ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада
Москва-2005 г.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Доктор биологических наук Доктор биологических наук
А.Н. Ножевникова Н.Д. Ананьева Б.А. Вызов
Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор А.И. Нетрусов
Защита диссертации состоится: «29» сентября 2005 г., в 15:30 ч. на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Диссертация разослана «_»_2005 г.
Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: г. Москва, 119992, Ленинские Горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии, Ученому секретарю Совета Н.Ф. Пискунковой. Факс: (095) 939-43-09 или (095) 939-27-63.
Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук
Н.Ф. Пискункова
Актуальность проблемы. В общей экологии предпринимаются попытки формулирования методологических положений, которые по своей значимости приближаются к основополагающим законам точных наук. К таковым можно отнести фундаментальные концепции экспоненциального роста, самоограничения и волнообразного развития популяций (Турчин, 2002). Эти и некоторые другие положения важны и в экологии микроорганизмов.
Современное состояние исследований экологии микроорганизмов характеризуется изобилием частных, иногда противоречивых фактов, которые трудно поддаются обобщению, из-за чего даже обзорные публикации не всегда несут в себе обобщения, а иногда сводятся к перечислению экспериментальных данных (Kent and Triplett., 2002; Mazzola, 2004). В этой связи обобщение разрозненных фактов, выдвижение новых концепций и гипотез является не менее важным и актуальным, чем получение новых экспериментальных результатов. Это касается всех разделов экологии микроорганизмов, в том числе представлений о структуре и функциях микробного сообщества (МС), способе и форме существования МС, стратегии его развития и регуляции.
Современные представления о МС, как основной функциональной и эволюционирующей единице, а также и компоненте биоразнообразия экосистем, базируются на исследованиях признанных специалистов в экологии микроорганизмов (Заварзин, 1970, 1976, 1986, 1987, 1989, 1990, 1998, 2004 а, б; Мишустин 1981; Slater and Lovatt, 1984; Звягинцев, 1987; Звягинцеве соавт.,1998; 1999; Ножевникова, 1987, 1991; Ананьева, 2003; Harris, 1994; Buckley, 2003; Garbeva et al., 2004). Тем не менее, многие представления о микробном сообществе, структуре, способе и формах функционирования, движущих силах развития и регуляции МС еще недостаточно познаны и понятны. Микробное сообщество гораздо менее познано и менее понятно, чем индивидуальный организм, и потребность в дальнейшем его познании нисколько не снижается.
Существенным моментом в познании сообществ является развитие представлений о группировании микроорганизмов в сообщества. Трофика компонентов МС, кинетика, определяющих рост процессов, способ и сила реакции на экологические факторы являются важными критериями для группирования микроорганизмов. Ранее созданные схемы и представления о группировании микроорганизмов уже не в состоянии объяснить получаемый новый экспериментальный материал (Semenov, 1991). Поэтому усовершенствование известных и разработка новых схем группирования микроорганизмов, структуры МС, выявление наиболее общих механизмов, объясняющих группирование, является важным этапом на пути к познанию МС.
Очевидно, что статический, подход при изучении МС обладает ограниченными возможностями для его познания (Звягинцев, 1987; Звягинцев с соавт., 1998). При таком подходе единство динамичности и стабильности МС трудно поддается пониманию. В МС, доминирующих в аэробных экосистемах, со слабо взаимосвязанными и дублирующими компонентами, особенно трудно выявить внутреннюю динамику их развития. Более перспективным является динамический подход, учитывающий все аспекты сукцессионных изменений при внешних воздействиях на МС, что позво сообществе,
последовательность и направленность его развития (Гузев, 1988). Представляется, что динамический подход необходимо активнее применять для познания законов функционирования, в частности, - регуляции сообществ и в сообществах.
Динамичность сообществ наиболее остро проявляется в цикличности их развития (Левченко, Старобогатов, 1990). Цикличность, волнообразность развития микробных популяций (МП) и микробных сообществ (МС), выражающаяся в колебательной динамике численности была замечена давно, и к этой проблеме микробиологи обращались неоднократно (Аристовская, 1972; Звягинцев, 1987; Полянская с соавт., 2005). Однако из-за сложности и полифункциональности проблемы всеобщность этого явления до сих пор остается очевидной не для всех микробных экологов. Факт колебательного развития микробных популяций и МС, а, следовательно, и процессов, осуществляемых микроорганизмами, зачастую игнорируется, хотя последствия недоучета этого явления весьма очевидны. Количество микроорганизмов и микробная биомасса, определяемые на максимуме или минимуме численности микроорганизмов, соответствующих осцилляционным пикам, будут существенно различаться. Учет цикличности развития МП и МС имеет важное значение при решении как глобальных проблем, например, оценке величин эмиссии парниковых газов в экосистемах, биологической активности и продуктивности почвенных и других систем, так и для локальных, но не менее важных проблем, таких как межмикробные взаимодействия, управление МП и МС в реакторах и др. Чем раньше придет понимание и признание факта колебательного развития МП и МС, тем больший прогресс будет достигнут в их познании.
Существует много причин того, что явление колебательного развитие МП и МС не принимается во внимание. Одна из них заключается в слабости аргументации движущих сил, причин и механизмов такого развития. Многие ранее известные гипотезы, объясняющие причины волнообразного развития МП и МС не убеждают в их всеобщности и повсеместности. Существенный прогресс в разрешении этой проблемы мог бы быть достигнут путем выдвижения новых гипотез, а тем более теорий, базирующихся на последних экспериментальных материалах и их обобщении.
В настоящей работе рассматриваются аэробные микробные сообщества.
Целью работы является развитие представлений об особенностях трофического группирования и структуре микробного сообщества, некоторых закономерностях регуляции активности МС, механизмах, способах и движущих силах пространственного и временного развития микробных популяций и микробных сообществ в почве и ризосфере.
Задачи.
1. Провести сравнительный анализ некоторых кинетических параметров роста и активности метаболизма микроорганизмов, сравнительный анализ известных концепций структуры гетеротрофного микробного сообщества и ввести новые представления о трофическом группировании гетеротрофных микроорганизмов в микробном сообществе.
2. Провести экспериментальные и теоретические исследования, направленные на подтверждение динамической концепции структуры МС.
3. Исследовать целлюлазную активность и состав представителей гидролитической группировки микробного сообщества при изменении факторов окружающей среды.
4. Провести подробное изучение пространственной и временной динамики развития микробных популяций и микробных сообществ в ризосфере и почве. Экспериментально и теоретически исследовать возможные механизмы и причины колебательного развития микробных популяций и микробных сообществ.
5. Определить механизм и возможный источник естественных и постоянно действующих нарушающих воздействий в микробных экосистемах, их роль и возможные последствия для МП и МС.
Защищаемые положения. 1. Трофическое группирование гетеротрофных микроорганизмов может быть осуществлено на основе таких физиологических показателей как: величины констант - К5 или Кт, характеризующих сродство транспортных систем к субстрату; величины затрат энергии на поддержания - т; величины дыхательной активности, а также концентрации и сложности субстрата, используемого компонентами МС.
2. В концепции структуры микробного сообщества почвы следует использовать представление о «норме реакции» его компонентов по отношению к концентрации субстратов и их сложности с одной стороны и пределам варьирования значений перечисленных выше физиолого-биохимических способностей микроорганизмов, с другой. Схема МС может быть представлена в виде симметрично-асимметричной структуры, включающей совокупность популяций, а также консорциумов и даже сообществ.
3. Регуляция ферментативной (на примере целлюлазной) активности МС в естественной среде обитания осуществляется не столько путем изменения активности каждого отдельного представителя сообщества, сколько через смену состава доминирующих представителей, т. е. путем сукцессии.
4. Микробные сообщества и микробные популяции во времени и в пространстве развивается волнообразно. Сукцессионные изменения происходят не от «волны» к «волне», а внутри каждой волны. Механизмом волнообразного развития МП и МС является последовательная смена фаз роста и отмирание компонентов популяций.
5. Роль естественной и постоянно действующей движущей силы волнообразного развития МП и МС играют разнообразные нарушающие воздействия, приводящие к «высвобождению» субстрата для микробных популяций и МС. Роль хищничества в волнообразной динамике существования и развития МП и МС является вторичной.
6. Всеобщим и постоянно действующим нарушающим фактором МП и МС может быть перемещение микроорганизмов в виде круговорота в экосистемах, связанное с функционированием пищевых цепей.
Научная новизна» 1. Предложена векторная концепция трофического группирования гетеротрофных микроорганизмов в МС, обобщающая и включающая более ранние концепции и обладающая объяснительными и предсказательными свойствами. Для группирования трофического многообразия микроорганизмов МС предлагается использовать представление о «норме реакции» организмов, включающее их генетическую стабильность и их морфофизиологическую изменчивость.
2. Показано, что в природном МС почвы увеличение гидролазной активности осуществляется путем изменения его состава, через сукцессию. Целлюлолитическое сообщество, доминирующее в олиготрофных гидроморфных почвах, не способно к высокой целлюлазной активности (ЦА). ЦА сообщества может быть существенно увеличена после значительных внешних воздействий и прохождения сукцессии.
3. Впервые установлено волнообразное пространственное и временное распределение бактерий в ризосфере вдоль корня растений. Такое же волнообразное развитие микроорганизмов имеет место и в неризосферной почве. Показана высокая эффективность применения гармонического анализа для выявлениия закономерных осцилляций МП и МС в ризосфере и почве. Впервые показано, что сукцессионные изменения волнообразного развития МП и МС происходят не от «волны» к «волне», а внутри волны. Обоснован механизм волнообразного развития микробных популяций и МС, которым является рост и отмирание компонентов МС.
4. Предложена гипотеза о природном, постоянно действующем источнике нарушающих воздействий МС, приводящих к осцилляции численности микроорганизмов. Таким источником является циркуляция микроорганизмов по пищевым цепям, в виде круговорота.
Практическая значимость работы. 1. Предложенная динамическая концепция трофического группирования микроорганизмов и структуры МС, волнообразный характер существования и развития МП и МС могут быть использованы при разработке индикаторов здоровья почвы. Количественными характеристиками анализа МС могут служить величины амплитуд, периоды колебаний численности микроорганизмов, а также время возврата параметров МС в исходное состояние после кратковременного воздействия нарушающего фактора природного или антропогенного происхождения.
2. Разработана система для непрерывной селекции МС с заданными свойствами из природных источников на основе проточного культивирования.
3. Результаты исследований (совместно с Центром биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН) использованы при разработке и изготовлении микрочипов для детектирования некоторых энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в образцах природных субстратов.
4. Результаты исследований выживания микроорганизмов и их перемещения в различных природных субстратах (экскременты животных, почва, растения, желудочно-кишечный тракт животных) будут использованы для разработки
системы анализа риска распространения энтеропатогенов при производстве овощной продукции.
5. Результаты исследований вошли в учебники, практикумы и методические пособия, подготовленные сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова для обучения студентов.
6. Разработаны и предложены курсы лекций и практических занятий для подготовки специалистов в Биотехнологическом центре МГУ им. М.В. Ломоносова по темам: «Селекция микробных сообществ с биоконтролирующими свойствами фитопатогенов» и "Оценка риска распространения энтеропатогенов с овощной продукцией".
Исследования выполнены по планам НИР, в рамках заданий ГНТП, грантов и стипендий в Институте микробиологии РАН и на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Отдельные исследования проводили в отделе фитопатологии Калифорнийского университета в Девисе, США и отделе наук о растениях, группе биологического земледелия университета Вагенингена, Нидерланды.
Автор благодарен сотрудника!* всех перечисленных выше коллективов, в которых выполнялись исследования за помощь, и дружескую поддержку, за внимательное и доброжелательное обсуждение результатов.
Автор выражает искреннюю признательность своему учителю в почвенной микробиологии, ныне покойному академику E.H. Мишустину.
Автор благодарен академику Г.А. Заварзину за инициацию научного интереса к познанию микробных сообществ.
Автор благодарен проф. Нетрусову А.И., Ивановскому Р.Н., Звягинцеву Д.Г., Умарову М.М., Никитину Д.И., Гузеву B.C., Солодовникову Ю.П., Семенову В.М., доцентам Колотиловой H.H. и Захарчуку Л.М., ст. н. сотрудникам Пискунковой Н.Ф. Савранскому В.В., Михайловичу В.М.
Особую благодарность автор выражает Семеновой Е.В. и Зеленеву В.В. Author is sincerely thankful to Prof. A.H.C. Van Brüggen, head of Organic Farming System Group (OFSG) of Wageningen University and RC, the Netherlands, for fruitful collaboration in field of soil microbiology, WUR docents Aad Termorshuizen and Joss Raaijmakers, docent Wim Blok and OFSG technician Oscar de Vos.
Основные положения диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", 12-14 декабря 1989, ИБФМ РАН, Пущино; конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами», 26 - 27 октября 1993 г, Институт микробиологии РАН, Москва; конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду", 17-19 мая 1994, Институт микробиологии РАН, Москва; международной конференции, посвященной памяти академика A.A. Басва 20-22 мая 1996, Москва; invited Lecture for California University in Riverside, Riverside, CA, USA, January, 1997; 97-th General Meeting of the American Soc. for Microbiol., May 4-8, 1997, Miami Beach, USA; 99-th General Meeting of the American Soc. for Microbiol., May 30-June 3, 1999, Chicago, USA; конференции "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов", к 110-летию со дня рождения проф. Е.Е. Успенского, 21.12.1999, МГУ, Биофак, Москва; всероссийской конференции «Перспективы развития
почвенной биологии», к 100- летию со дня рождения академика Е.Н. Мишустина, 22.02.2001, МГУ, факультет почвоведения, Москва; всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в XIX - XXI веках», 14 - 19 июня 2001 г., ВНИИ с/х микробиологии, Санкт-Петербург; invited Lecture for PE&RC of Wageningen University and Research Center, Wageningen, the Netherlands, 2000; ninth Int. Symp. on Microb. Ecol. (ISME-9), August 26-31, 2001, Amsterdam, the Netherlands; Nederlands Tijdschrift voor. Medische Microbiologie. Supplement bij Tiende Jaagang, 9-10 April 2002, Papendal, the Netherlands; первом съезде микологов России. "Современная микология в России», 11-13 апреля 2002, Москва; the Conference "Structure and Function of Soil Microbiota", September 18 - 20, 2003, Philipps-University, Marburg, Germany; Workshop in the framework of joint Dutch - Russia NWO project, 18-19 March 2004, Wageningen University & RC, the Netherlands; второй международной конференции «Биотехнология
- охране окружающей среды», 25-27 мая 2004 г., МГУ, биофак, Москва; APS Annual Meeting, July 31 - August 4, 2004, Anaheim, California, USA; invited Lecture for Frontis of Wageningen University & RC, 11 Nov., 2004, fhttD://frontiscms.co.dlo.nl/cms/web/program.rihD3?iaar=2004').
Результаты исследований представлены в 15 обзорах и главах книг, 27 экспериментальных статьях, одном патенте »23 тезисах.
Исследования поддержаны грантами и стипендиями: грант ГНТП "Биоразнообразие ". «Оценка и сохранение микробного разнообразия северных гумидных экосистем», 1994-1998; грант ГНТП России «Новейшие методы биоинженерии», направление 7
- «Биотехнология защиты окружающей среды», 1995-1997; NATO Collaborative Grant with A.H.C van Bruggen, "Role of Oligotrophic Bacteria in Nutrient Cycling and Soil N Retention" 19961997; USDA Cooperative grant with A.H.C. van Bruggen, "Biocontrol of Root Pathogens by Oligotrophic Bacteria" 1997-1999; Lindbergh Foundation Grant "Selection of Natural Microbial Communities for Biocontrol of Root Pathogens in a Continuous Flow System, a Novel Approach to selection of Biocontrol agents" 2000-2001; NATO Collaborative Linkage grant with A.H.C. van Bruggen, V.V. Savranski and D.I. Nikitin. "Development of Laser Technologies for Detection and Quantification of Microbial Populations and Processes" LST, CLG.976644, 2000-2001; Fellowship, Department of Plant Sciences, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, the Netherlands (0046PE&RC2000/.08.54.2.6), "Spatio-Temporal Distribution of Pseudomonas fluorescens and infections by Gaeumannomyces graminis f.sp. Iritici along roots of wheat plants", 2000; Fellowship; De Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelojk Onderzoek (NWO), "Wavelike fluctuations and microbial succession of oligotrophic and copiotrophic bacteria in the rhisosphere and soil from organic and conventional farms», 2002.; NWO grant with A H.C van Bruggen, V.M. Mikhailovich, Yu P Solodovnikov, V.I Severov, Russian-Dutch program for scientific cooperation, "Combining molecular and mathematical approaches for risk analysis of pathogen spread in the vegetable production and processing industry", 2002-2005; NATO-Russia Collaborative Linkage Grant (RCLG), "Risk analysis of pathogen spread in the vegetable production and processing industry" with A.H.C. van Bruggen, 2003 - 2004, NWO grant with A.H.C. van Bruggen and V.M Semenov, Russian-Dutch program for scientific cooperation, «Resilience of microbial communities to disturbances as an indicator of sequestration of С and N in soil: comparison of agricultural and semi-natural ecosystems», 2005- 2008.
Глава 1. Трофическое группирование гетеротрофных микроорганизмов и структура микробного сообщества
Представление о микробном сообществе является ключевым для экологии микроорганизмов. В зависимости от того, что вкладывается в понятие МС и как представляется его структура, избираются стратегия и тактика соответствующих исследований. МС - это некая совокупность таксономически разных, но функционально взаимодействующих популяций микроорганизмов, существующих некоторое время в соответствующем месте. Компоненты МС могут быть, как сильно связанными между собой, в том числе и физически, а МС - высокоспециализированным, так и слабо связанными, а МС - низко специализированным. В литературе используют и другие терминологические обозначения МС, как, например, «микробный комплекс», «консорциум» которые по своей сути близки между собой (Звягинцев, 1987; Добровольская, 2002). МС состоит из микробных популяций (МП), представляющих совокупность клеток одного вида.
В последние два десятилетия, в связи с активным развитием молекулярно-биологических методов идентификации микроорганизмов внимание к познанию трофической структуры аэробных микробных сообществ снизилось. В большей степени сохранился интерес к исследованию трофических взаимодействий в анаэробных МС, особенно в нишах антропогенного происхождения (Заварзин, Бонч-Осмоловская, 1981; Ножевникова, 1987, 1991; Заварзин, 1990 a; Zumstein et al., 2000; Hofman-Bang et al., 2003), а среди аэробных природных - к экстремальным (Заварзин с соавт., 1993, 1999; Заварзин, 2004). В основном же, в настоящее время, вместо физиолого-биохимических аспектов исследуют таксономическую сторону МС, его видовой состав компонентов (Kirk et al., 2004). Однако для познания МС необходимо иметь живые организмы, а не электрофоретические полосы ДНК. Выделяемые на средах микроорганизмы отражают, в первую очередь, трофический статус компонентов МС, а не таксономический. Поэтому для успешного и глубокого исследования МС необходимы как таксономический (молекулярно-биологический) так и физиологический подходы.
Целью настоящего раздела работы являлось обоснование новых представлений о трофическом группировании микроорганизмов и структуре гетеротрофного МС на основе некоторых наиболее общих кинетических характеристик роста и активности метаболизма микроорганизмов.
1. 1. Эволюция идей о трофическом группировании и структуре микробного сообщества
Важность познания структуры МС отражается в длительной истории исследования этого вопроса и попытках создания схем структуры МС. В разное время для познания трофической структуры МС использовались разные характеристики, как конкретных микроорганизмов, так и их групп (Таблица 1.1). Однако все известные схемы структуры МС не учитывали физиологическую «гибкость» организмов. Увеличение количества функциональных групп -
компонентов МС, также не решает этой проблемы (Заварзин, 1970; 1976). Как следствие этого, большинству известных схем МС свойственны «жесткость» и «статичность».
1.2. Динамический подход к представлению о трофической структуре МС
Каждый организм имеет свои границы существования, а свойства и особенности организма отражаются в конкретных физиологических характеристиках и константах. Генетическая детерминированность свойств микроорганизмов, не исключает их физиологическую гибкость. Так как в дальнейшем придется оперировать такими понятиями как олиготрофные (ОБ) и копиотрофные бактерии (КБ), то представляется необходимым дать определения этим группировкам.
ОБ - это организмы, которые эволюционно адаптировались к существованию в местообитаниях, характеризующихся низкими концентрациями доступного субстрата и низкими потоками энергии. Они развиваются в таких условиях так как обладают высокоэффективными системами поглощения органических и неорганических веществ, количества которых в таких нишах могут характеризоваться нано- и даже пикомолярными концентрациями и высокоэффективной утилизацией этих веществ, вследствие уникальности регуляции метаболизма. Вместе с тем, олиготрофы, в пределах, характерных для каждого конкретного организма, могут развиваться и в достаточно богатых органическими веществами средах, природных или лабораторных. Однако только крайне бедные, но качественно полноценные среды приемлемы для выделения и характеристики олиготрофов, так как только в таких условиях могут проявиться конкурентные преимущества олиготрофов (Бетелоу, 1991). Приведенное определение ОБ не противоречит известным ранее определениям (Никитин, 1985), но является более полным, что важно для представлений, развиваемых в работе. К КБ относятся бактерии с противоположными характеристиками и для них принимается определение, данное I. Ротс1ех1ег (1981).
Исследования роста некоторых олиготрофных бактерий привели к пониманию того, что для разграничения ОБ и КБ достаточно определить их некоторые кинетические характеристики роста. Эти характеристики были предложены как физиологические основы олиготрофии. К ним относятся сродство к субстрату транспортных систем микроорганизмов (К5 - для кинетики роста и Кт - для кинетики транспорта субстратов), величина энергии, расходуемая организмом на нужды поддержания, которую обычно обозначают как ш и наличие/отсутствие и положение «узких мест» в метаболизме микроорганизма. Роль «узкого места» или лимитирующего участка метаболизма у олиготрофов выполняет, по-видимому, дыхательная цепь, а величина дыхательной активности может быть использована в качестве количественной характеристики. Оказалось, что предложенный подход вполне приемлем для группирования бактерий в целом (рис 1.1-1.3).
Помимо кинетических характеристик роста для разграничения ОБ и КБ необходимо учитывать концентрацию и тип потребляемых субстратов, как
Таблица 1.1. Эволюция идей о трофическом группировании и структуре микробного сообщества.
Группы
Дифференцирующие признаки Автор концепции
- Две группы: автохтонная и зимогенная
-14 групп, включая гидро-литиков и микрофлору рассеяния (диссипатрофы)
- Гетеротрофы разделены
Скорость роста и структура субстрата Скорость роста, способность продуцировать экзогидролазы, тип и концентрация субстрата Концентрация, тип субстрата
Виноградский, 1952
на копиотрофов и олиготрофов и кинетика роста
- 4 группы: автохтонная, зимогенная, олиготрофная и литотрофная
- г-К континуум
- 3 группы: олиготрофы, стеногетеротрофы и эвригетеротрофьг
- 3 группы: копиотрофы, гидролитики и олиготрофы
- автохтоны разделены
на 3 группы: гидролитиков патиентов и олиготрофов
Скорость роста, тип и концентрация субстрата
Скорость роста и концентрация субстрата Концентрация субстрата
Тип и концентрация субстрата, способность продуцировать гидролазы Способность продуцировать экзоферменты, структура субстрата и скорость роста
Заварзин, 1970; 1976; 1995
РоМехгег, 1981
Мишустин, 1982
Оегеоп&СЬе^ 1981
Ного\уИг ег а!., 1983
Гузев и Иванов, 1986
ОогсПепко, 1990
Опиппрофы
Рис. 1.1. Величины транспорта субстратов (Кт) у разных (копиотрофных и олиготрофных) микроорганизмов, (вешепоу, 1991).
Виды
это делалось и ранее (Таблица 1. 1). Анализ перечисленных характеристик микроорганизмов приводит к заключению, что все многообразие гетеротрофных
0,16
Ц12
0,08
ю
5*
(Ми
Копиотрофы
Опиппрофы
Рис. 1.2.
Величины
энергии
поддержания (т) у разных микроорганизмов при росте на среде с глюкозой (Бетепоу, 1991).
!УЬлфоорганкзмы
"ЗГ 250
а
Копиотрофы
Олиготрофы
Микроорганизмы
Рис. 1.3.
Величины
дыхательной
активности
некоторых
микроорганизмов.
(Бетепоу, 1991).
микроорганизмов можно представить в виде некого континуума. В нем на одном «конце» группируются микроорганизмы с экстремально высокими характеристиками, а на другом - с низкими. На рисунках 1.1 - 1.3 специально иллюстрируются контрастные характеристики микроорганизмов. При расположении микроорганизмов вдоль концентрационного градиента субстрата(ов) с учетом кинетических характеристик их роста и активности метаболизма микроорганизмы с крайними значениями будут существенно отличаться друг от друга. Однако известно, что большинство микроорганизмов имеет умеренные и близкие друг другу характеристики (Стейниер с соавт., 1979, Заварзин, 1990 б). Поэтому, подразделение всего многообразия микроорганизмов только на копиотрофов и олиготрофов не отражает все естество микробного мира
и даже принятие во внимание представлений о г - К континууме не решает проблему объединения непрерывности и дискретности.
В связи с этим, вместо жесткой категорийности предлагается схема МС, основанная на представлениях о «норме реакцию). Из общей генетики известно, что «норма реакции» отражает морфофизиологическую изменчивость организма
Вектор концентрации органического углерода:
Высокая Ншкая -►
Микрооргаишмы с «широкой» нормойреакищ (Больцмктво \ш!фоорганюмов)
Микроорганишы с «ркой» Микроорганизмы с «узкой»
нормойреащии нормойреакщш
(Истинные копиотрофы) (Истинные ашготрофы)
Рис. 1. 4. Схема структуры микробного сообщества. Симметрично-асимметричная структура с тремя разными, но частично перекрывающимися группами.
при неизменном генотипе. В предлагаемой схеме микроорганизмы подразделяются на три неравные группы, а МС представляется векторной, симметрично - асимметричной структурой, отражающей континуум форм, популяций, ассоциаций и сообществ (рис. 1.4). Две крайние группы представлены организмами с «узкой нормой реакции» в отношении концентрации и типа используемых субстратов, с одной стороны, и пределов варьирования физиологических характеристик (Кт, т и Удах.), с другой. Эти группировки соответствуют по своим свойствам истинным копиотрофам и истинным олиготрофам. Третья группировка с «широкой нормой реакции» включает большинство известных гетеротрофных микроорганизмов и занимает положение между группировками с «узкой нормой реакции». Так как МС существует во времени и в пространстве, то правомернее изображать структуру МС в виде трехмерной схемы, где учитываются пространственно-временные характеристики и трофическое группирование внутри его (рис. не приводится).
Предлагаемая динамическая концепция не отвергает предыдущие представления (табл. 1. 1), а включает или развивает их. Предлагаемая концепция трофической структуры МС обладает объяснительными и прогностическими свойствами. Концепция объясняет, например, почему на очень богатых или на
очень бедных средах вырастает меньше микроорганизмов, чем на разбавленных. Потому, что на разбавленных средах растут, как микроорганизмы с «широкой нормой реакции», так и часть микроорганизмов с «узкой нормой». Концепция объясняет, почему нередко известные олиготрофные бактерии таксономически находятся в типично «копиотрофных» таксонах, например Pseudomonas, Spirillum и даже Bacillus (Fry, 1990). Именно в этих родах сосредоточены бактерии с «широкой нормой реакции». Из предложенной схемы структуры MC следует, что количество, как истинных олиготрофов, так и копиотрофов не велико, а основная масса микроорганизмов представлена организмами с умеренными характеристиками. Промышленно важные микроорганизмы следует искать, в первую очередь, среди микроорганизмов с «широкой нормой реакции», а микроорганизмы с «узкой нормой реакции» будут превалировать в эконишах с экстремальными характеристиками.
1. 3. Экспериментальное и теоретическое подтверждение динамической концепции структуры микробного сообщества
Согласно предложенной динамической концепции MC предполагается, что истинно олиготрофных бактерий не много. Правомерность такого вывода нашла подтверждение в экспериментальных исследованиях пространственной и временной динамике копиотрофных и олиготрофных бактерий в ризосфере пшеницы и при построении математических моделей популяционной динамики микробного сообщества ризосферы.
Известно, что изолировать и учесть олиготрофные бактерии, как и отделить их от копиотрофных на данном этапе развития науки можно только путем посева образцов на бедные органическим веществом среды, содержащие от 1 до 15 мг/л органического углерода в виде легко утилизируемых веществ. Известно также, что даже на таких бедных средах, существенная часть вырастающих бактерий оказывается не олиготрофными (Suwa, Hattory, 1984). Выявить долю истинно олиготрофных бактерий в некотором приближении удается лишь путем пересева колоний, выросших на бедной среде, на богатую. Оказалось, что только 5 - 10 % колоний, полученных на бедной среде, были не способны расти на богатой среде с содержанием 1000 - 1500 мг/л Сорг. Следовательно, на бедных средах существенная часть вырастающих колоний представлена организмами, способными расти как при достаточно низкой концентрации доступного углерода, так и при достаточно высокой. Вполне очевидно, что эта часть организмов согласно предложенной выше схеме совпадает с группировкой бактерий с «широкой нормой реакции» (БШНР).
При исследовании бактериального разнообразия с помощью ПЦР и денатурирующего градиента гель электрофореза (ДГТЭ) ДНК бактерий вдоль корней пшеницы, изолированных на бедной и богатой средах, было выявлено только 33 ампликона из колоний, выросших на богатой среде (КБ), но 52 ампликона из колоний, выросших на бедной среде (ОБ). Эти результаты совпадают с предположением о том, что наиболее обильной трофической группировкой бактерий является группировка с широкой нормой реакции,
представители которой получают преимущества при росте на бедной среде (см. главу 3).
Экспериментальные результаты нашли подтверждение при математическом моделировании пространственной и временной популяционной динамики микробного сообщества ризосферы. Более подробное описание результатов исследования ризосферы будет дано в главе 3. Здесь же будет приведена только та часть математического моделирования, которая подтверждает предложенную выше динамическую схему структуры МС, в отношении правомерности существования группировки БШНР.
В этих исследованиях растения пшеницы выращивали в оранжерее, в специальных ризотронах, на двух почвах, отличающихся по содержанию Сорг (1.00 и 0.68 %,). Корни 2-х, 3-х и 4-х недельных растений пшеницы разрезали на 2-х см сегменты, начиная от кончика корня. Почву с каждого первого сегмента использовали для определения численности бактерий, а с каждого второго - для определения тотального водорастворимого СорГ Из 3-х и 4-х недельных растений получали от 22 до 25 сегментов для каждого вида анализа. На каждом сегменте учитывали количество боковых корней. Параллельно, на расстоянии 3-4 см от корней отбирали образцы для определения количества бактерий в неризосферной почве, а также образцы почвы для определения влажности. Ризосферную и неризосферную почвенные суспензии высевали на Сорг богатую и бедную (1000 ррт и 10 ррш Сорг.) среды, учитывая колониеобразующие единицы (КОЕ) КБ и ОБ. Гармонический (Фурье) анализ результатов этих экспериментов выявил наличие достоверных пространственных гармонических колебаний численности КОЕ бактерий вдоль корней.
Была построена математическая модель, названная «BACWAVE» (бактериальные волны). Цель модели - проверить следующие гипотезы: (1) численность КОЕ бактерий вдоль корня действительно имеет волнообразное распределение вследствие импульса субстрата (нарушающее воздействие), выделяемого растущим корнем пшеницы из зоны вблизи кончика корня; (2) численность и распределение боковых корней не влияет на пространственную и временную динамику; (3) хищничество не влияет на выявленную динамику.
С учетом скорости роста корня, провели преобразование динамики пространственных колебаний КОЕ КБ во временные, что позволило использовать точечную модель бактериальной динамики в ризосфере для описания пространственного распределения бактерий вдоль корня. Модель представляет собой систему двух дифференциальных уравнений, описывающих динамику бактериальной биомассы и субстрата (1, 2). В модели скорость роста и отмирания бактерий зависят от концентрации субстрата, поступающего от экссудатов, выделяемых вблизи кончика корня, при реутилизации части отмершей микробной биомассы и некоторого дополнительного подтока углерода, из почвы, образующегося, например, за счет разложения почвенного органического вещества. Удельная скорость роста бактерий была описана уравнением Моно, а зависимость удельной скорости отмирания бактерий от концентрации субстрата соответствовала обратной гиперболической кривой. Вследствие этого кривые удельной скорости роста и отмирания биомассы бактерий пересекаются в некой
«особой» точке, в которой не происходит изменения ни субстрата, ни биомассы (Рис. 1.5).
ах/А = (м(8)-15(8))*Х (1)
сй/сИ = -Х*ц (в) /У + Кг * Х*Э (Б) + ВвР + Ехи(1); (2)
где:
Ц(8) = Мтах*8/(К8*е+8),
В® = О^КДКсНБ/е), Ехи^) = ЕхиМ* ехр(-ЕхиТ*1),
Обозначения: I = время [ч]; X = биомасса бактерий [мкг С / см3 почвы]; в = содержание субстрата [мкг С / см3 почвы]; ц(8) = удельная скорость роста бактерий [ч-1] (зависит от концентрации субстрата); цтах = максимальная удельная скорость роста [ч'1]; К5 = субстрагная константа [мкг С / мл почвенного раствора]; = удельная скорость отмирания бактерий [ч"'] (зависит от концентрации субстрата); Оти!= максимальная удельная скорость отмирания бактерий [ч'1]; К<) = субстратная константа отмирания бактерий [мкг С / мл почвенного раствора]; У = экономический коэффициент для роста бактерий [мкг С / мкг С]; Кг = доля биомассы мертвых бактерий, подвергающаяся реутилизации в виде субстрата [безразмерная величина (-)]; ВОР = скорость подтока субстрата из почвы, при гидролизе почвенного органического вещества [мкг С / см3 почвы / ч]; в - влажность почвы [мл почв, раствора / см3 почвы]; Ехиф = скорость экссудирования корня [мкг С / (ч * см3 почвы)] (зависит от времени); ЕхиМ = максимальная скорость экссудирования [мкг С / (ч * см3 почвы)]; ЕхиТ = время, определяющее продолжительность экссудирования [ч"1].
Использованный подход позволил математически описать циклическую динамику роста и отмирания бактериальной биомассы в ризосфере. Исследование модели показало, что колебания бактериальной биомассы в ризосфере имеют затухающий характер, а скорость затухания в существенной степени определяется интенсивностью дополнительного подтока субстрата из почвы. В структуре модели не учитывали влияние боковых корней и хищников, и, тем не менее, были получены достоверные гармонические колебания биомассы бактерий. В связи с этим, можно полагать, что эти факторы или не играют роли в такой динамике или их роль незначительна.
В модели «ВАС\\^АУЕ» был описан волнообразный рост сообщества бактерий в ризосфере, изолированных только на богатой среде - КБ. При попытке моделирования одновременно динамик КБ и ОБ, используя те же подходы, что и при моделировании только КБ, возникли трудности. Как известно, КБ и ОБ потребляют одни и те же субстраты и существуют одновременно и совместно, и в пространстве и во времени. Использование экспериментальных данных - КОЕ ОБ, полученных при высеве образцов ризосферной почвы на бедную среду, не позволяло математически описать их волнообразную динамику тем же набором уравнений, что и КБ, так как в этом случае суммарная биомасса существенно превышала реальный уровень. Проблему удалось решить после добавления к двум трофическим группам КБ и ОБ, третьей группировки - БШНР и, соответственно, уменьшения биомассы ОБ, выявляемых на бедной среде. В модифицированной модели "BACWAVE" было предположено, что биомасса
БШНР является частью КБ, но которые вырастают на бедной среде. Для этой цели были проведены экспериментальные исследования и сделаны допущения: определены размеры клеток, вырастающих на богатых и бедных средах; определено
Субстрат, мкг С/мл почв, раствора Расстояние от кончика корня, см
Рис. 1. 5. Зависимость моделируемой удельной скорости роста и отмирания копиотрофных бактерий в ризосфере от концентрации субстрата (А) и распределение моделируемой биомассы вдоль корня пшеницы (Б).
соотношение численности бактериальных клеток в почве, принадлежащих к разным размерным (крупные, средние и мелкие) группам; и, допустив, что крупные и средние клетки соответствуют копиотрофам, а мелкие - олиготрофам. На основании этого были получены коэффициенты для расчета возможной биомассы копиотрофов, олиготрофов и БШНР. Для расчета биомассы КБ из КОЕ, вырастающих на богатой среде использовали коэффициент 0,074, а для олиготрофов - 0,009. Было предположено, что около половины клеток бактерий, вырастающих на богатой среде, способны также расти и на бедной среде, но не наоборот. Следовательно, БШНР могут составлять приблизительно половину копиотрофов, вырастающих на богатой среде. Долю биомассы копиотрофов, вырастающих на бедной среде, рассчитывали с использованием коэффициента 0,031. Следовательно, коэффициент для расчета биомассы истинно копиотрофных бактерий, не способных расти на бедной среде, должен составлять 0,074 - 0,031 = 0,043.
В расширенной модели зависимость удельной скорости роста ОБ от концентрации субстрата описывали модифицированным уравнением Моно, в котором учитывалось субстратное ингибирование (3, 4), (Перт, 1978). Зависимость удельной скорости отмирания ОБ от концентрации субстрата также отличалась от таковой для КБ, а именно, при возрастании концентрации субстрата
от нуля удельная скорость отмирания ОБ сначала снижалась, но при дальнейшим повышении субстрата, пройдя через минимум, возрастала (Рис. 1. 6).
dXc/dt = (nc(S)-Dc(S))-Xc; (3)
dXo/dt = (no(S) -Do(S)) ■ X0; (4)
dS/dt = -Xc ■ Цс (SyYc - Xo• Ho (S)/Y0 + Krc-Xc-Dc (S) + Кю ■ X0• D0 (S) + BG(t) + Exu(t);
dXDC/dt = (1- bvc) • DC(S) • Xc; dXD0/dt = (1- Кю) • D0(S) ■ X0;
Ccfu = Cc-Xc/Bc
Ocfu = Co • Xc/Bc + Oo • Xo/Bo
где:
Hc(S) = ^wS/(Ksc-0 + S);
Ho(S) = |Wo ' (S/G) / (Kso + (S/6) + (S/G)2/Kl0);
Dc(S) = Dmaxc • Кас / ( Кае + S/0);
D0(S) = D^o ' W(Kd0 + S/0) + KL • S/6;
BG(t) = BGF;
Exu(t) = ExuM • exp(-ExuT ■ t).
Обозначения: t = время, ч; Xc = биомасса КБ, мкг С/см3 почвы; Хо = биомасса ОБ, мкг С/см3 почвы; S = концентрация субстрата, мкг С/см3 почвы; Xdc = устойчивая фракция биомассы отмерших КБ, мкг С/см3 почвы; Хоо = устойчивая фракция биомассы отмерших ОБ, ми С/см3 почвы; Ccfu = количество КОЕ, вырастающих на богатой среде, КОЕ/ г сухой почвы; 0Crj = количество КОЕ, вырастающих на бедной среде, КОЕ / г сухой почвы; Hc(S) = удельная скорость роста КБ, ч"1; no(S) = удельная скорость роста ОБ, ч'1; Цтмс =Цтю КБ, ч'^Цтио ОБ, ч"'; Ksc = Ks КБ, мкг С/мл почвенного раствора; Kso = Ks ОБ, мкг С/мл почвенного раствора; К,о = константа субстратного ингибирования роста ОБ, мкг С/мл почвенного раствора; Dc(S) = удельная скорость отмирания КБ, ч'1; Do(S) = удельная скорость отмирания ОБ, ч ; Dmaxc = максимальная скорость отмирания КБ, ч" ; Dmaxo = максимальная скорость отмирания ОБ, ч"1; К^с = субстратная константа отмирания КБ, мкг С/мл почвенного раствора; Kdo - субстратная константа отмирания ОБ, мкг С/мл почвенного раствора; Kl = константа, определяющая увеличение скорости отмирания в зависимости от концентрации субстрата, мл почвенного раствора / ч • мкг С; BG(t)= актуальная скорость подтока субстрата из почвы, мкг С/(ч ■ см3 почвы); BGF = начальное значение подтока субстрата из почвы, мкг С/(ч • см3 почвы); Yc - экономический коэффициент для КБ, мкг С/мкг С; Yo = экономический коэффициент для ОБ, мкг С/мкг С; К,с — отмершая фракция биомассы КБ, подвергающаяся реутилизации, -; К,-;, — отмершая фракция биомассы ОБ, подвергающаяся реутилизации, 0 = влажность почвы, мл раствора /см3 почвы; ExuM = максимальная скорость экссудирования, мкг С/(ч • см3 почвы); ЕхиТ = продолжительность экссудирования корня, ч"1; Вс= фактор пересчета КОЕ/r сух почвы КБ в биомассу С / см3 почвы, мкг С • г сух. почвы / КОЕ см3; Во= фактор пересчета КОЕ / г сух. почвы ОБ в биомассу С / см3 почвы, мкг С • г сух. почвы / КОЕ см3; Сс= общая фракция КБ, которые вырастают на богатой среде, безразмерная; Со= общая фракция КБ, вырастающих как на богатой, так и на бедной средах, безразмерная; Оо= общая фракция ОБ, вырастающих на бедной среде, безразмерная.
В результате примененного подхода удалось смоделировать волнообразную популяционную динамику копиотрофных и олиготрофных бактерий
одновременно и совместно, как это имеет место в природе. Таким образом, представление о существовании группировки бактерий с широкой нормой реакции получает подтверждение с точки зрения функционирования МС, что даёт основание рассматривать присутствие БШНР в составе МС почвы как объективный факт.
Рис. 1. 6. Зависимость удельной скорости роста и отмирания КБ и ОБ от концентрации субстрата в почвенном растворе, в шкале от 0 до 1 ООО мкг С/мл раствора (А) и в шкале от 0 до 0,1 мкг С/ мл раствора (Б).
1. 4. Поверка представлений о динамичной структуре МС при селекции МС для практического использования
Идея о микробном сообществе как динамичной структуре, сочетающей непрерывность и дискретность, была использована на практике при селекции МС с биоконтролирующими (БК) свойствами патогенов корней растений. Известно, что традиционные подходы поиска БК-агентов позволяют получать только индивидуальные организмы. Однако применение индивидуальных микроорганизмов в качестве БК-агентов не всегда успешно на практике. В связи с этим, было предложено селекционировать МС с БК-свойствами, Для селекции
МС с БК-свойствами была создана многостадийная проточная система культивирования микроорганизмов (Рис. I. 7). Система включала сосуд (I) для культивирования фитопатогена, сосуд (П) для селекции бактериального сообщества - антагониста фитопатогена и сосуд (III) для завершения селекции и контроля супрессивных свойств отселектированного МС, определяемого по состоянию здоровья выращиваемых в нем растений. Система прошла проверку при селекции МС с БК-свойствами против Phytophtora parasitica - патогена томатов Lykopersicum esculentum L.
Экспериментально установлено, что система обеспечивает устойчивый рост растений в отсутствии фитопатогена и длительный и устойчивый рост одного фитопатогена без потери им вирулентности. Одновременное культивирование патогена и растений естественно приводит к быстрой гибели растений. О БК способности селектируемого МС судили по состоянию корневой системы растений, и, в конечном итоге, по выживанию растений при их культивировании совместном с патогеном. Болезнь растений проявляется в виде некрозов участков корней или всего корня, в результате чего растение погибает в течение 4-6 дней.
Перед внесением почвы во второй сосуд, скорость подачи питательной среды в первый сосуд была подобрана так, чтобы гриб полностью потреблял источник углерода. После внесения во второй сосуд почвы, с супрессирующим потенциалом, исследовали динамику почвенного МС во втором и третьем сосудах. Определяли численность КБ и ОБ, а также динамику растворимого органического вещества (РОВ) во втором и третьем сосудах.
Динамика развития сообщества во втором сосуде включала две фазы: быстрое снижение численности обеих трофических групп бактерий и последующее медленное снижение с установлением некого квазистационарного состояния. Сразу после внесения почвенной суспензии численность КБ в сосуде II составляла 9,0*106 КОЕ/мл, а в конце культивирования 4,8*105 КОЕ/мл. В сосуде III: 1,8 *107 КОЕ/мл - в начале и 4,6*105 КОЕ/мл в конце. Численность ОБ во II сосуде в начале и конце культивирования составляли соответственно 8.3*106 КОЕ/мл и 7.3* IО5 КОЕ/мл, а в третьем - 7.3*105 КОЕ/мл и 3.5*105 КОЕ/мл соответственно. Наблюдения показали, что со временем растения перестали болеть и погибать, т. е. произошла селекция сообщества с БК-свойствами -«микробного фильтра». Несмотря на то, что на корнях обнаруживали мицелий фитопатогена, они выглядели здоровыми, а при их микроскопии не обнаруживали зон лизиса и некрозов. Защитное действие отселектированного МС для растений было проверено в вегетационных сосудах. Одновременное внесение фитопатогена и отселектированного МС обеспечивало здоровое состояние растений (отсутствие гнили на корнях и участков поражения) в течение 2-х недель. Таким образом, имел место явный эффект защиты растений отселектированным МС. При скорости разбавления в первом сосуде (0,013-0,015 ч'1) субстрат - сахароза -практически полностью использовался грибом и, в вытекающей из первого сосуда жидкости, обнаруживались лишь его следовые количества 4-8 мкг/мл. Однако концентрация РОВ во втором сосуде достигала 50 - 80 мкг/мл (исходная концентрация сахарозы в среде - 100 мкг/мл). Следовательно, выживание МС во втором сосуде могло происходить за счет потребления РОВ, образующихся при
отмирании фитопатогена, а также его метаболитов. Так как концентрация РОВ во П и Ш сосудах в несколько раз превышала концентрацию, которую нужно использовать для выделения ОБ, можно утверждать, что отселектированное МС с БК-свойствами принадлежало к группировке БШНР. Тем самым подтверждается
1. Насос (хДдавищуха 11. Цхирачшя крьика
ИЫфашкяиедвиютияатхпи 7. Ктаганы- тяжиуы 11 СЬс>лыд1я отбора проб
3. \4ццлка \апипвя. Я Фитьтр-кгашнвьпадагахв
4. Элекгрвд рН метра ЧХсгчатъй сосуд Д.тя роста рапаий
5.(Ьеди»п«лыьЕТибки 10. Отверстия див растений
Рис. 1 7. Многостадийная система проточного культивирования для селекции МС с биоконтролирующими свойствами фитопатогенов
прогностическое свойство динамической концепции МС о том, что биотехнологически важные микроорганизмы следует искать среди микроорганизмов с ПШР.
Заключение к главе
Преложен новый подход в трофическом группировании гетеротрофных микроорганизмов и МС. Группирование осуществляется на основании кинетических параметров роста, таких как К5 (Кт), величины энергии поддержания и дыхательной активности с одной стороны и концентрации и сложности используемых субстратов, с другой. Новая концепция учитывает
относительность понятий олиготрофные и копиотрофные бактерии, объединяя большинство гетеротрофов в группировку микроорганизмов с широкой нормой реакции. Предложенная концепция выстраивает множество гетеротрофных микроорганизмов в дискретно-непрерывный ряд по отношению к концентрации и характеру субстрата и рассматривает МС как динамичную структуру, меняющую численное соотношение компонентов в ответ на изменение количества и качества субстрата.
Новая концепция МС обладает объяснительными и предсказательными свойствами и получила экспериментальную проверку и теоретическое подтверждение в математических моделях роста микробного сообщества ризосферы. Предложенная концепция группирования гетеротрофных бактерий и структуры МС предсказывает, что количественно группировка истинно олиготрофных бактерий не может быть многочисленной, как, по-видимому, и истинно копиотрофных, и основная масса бактерий представлена группировкой с широкой нормой реакции.
С учетом представлений о динамической структуре МС предложена технология для селекции МС, пригодного для практического использования. Изолированное сообщество с биоконтролирующими свойствами корневых фитопатогенов могло принадлежать только к группировке микроорганизмов с ШНР. Об этом свидетельствует концентрация водорастворимого органического углерода в селекционных сосудах II и Ш, что еще раз подтверждает прогностические свойства динамической концепции МС.
Глава 2. Регуляция активности микробного сообщества
Динамическая структура МС предполагает и его динамический ответ при различных воздействиях на МС. Нарушающие воздействия на сообщества экосистем сопровождаются сукцессией аутогенного и аллогенного типов (Одум, 1986). Можно полагать, что изменения компонентного состава сообщества, инициированные воздействиями, отразятся на активности и направленности процессов в эконише, экотопе, и в экосистеме. В этой связи, ответные реакции МС на какие-либо нарушающие воздействия, нужно рассматривать и с точки зрения регуляции, в частности, ауторегуляции активности МС. Использование в микробной экологии методов инициированного микробного сообщества, субстрат-индуцированного дыхания и некоторых других позволяет оценить «силу» нарушающих воздействий и характерный отклик микробного сообщества (Апёегеоп, ОотзсЬ, 1978; вигеу е! а1., 1982; Гузев, 1989; Ананьева с соавт., 2002 а; Ананьева, 2003;).
Значимость «обычных» нарушающих воздействий (иссушение - увлажнение почвы, замораживание - оттаивание, перемещение в почве или по почве представителей микро- и макрофауны, рост растений и др.) на микробные сообщества недооценена. Такая недооценка, видимо связана с их очевидностью, постоянностью и повсеместностью и, по-видимому, приемлема в макроэкологии, (Левченко, Старобогатов, 1990; Ананьева с соавт., 2002 б.). Однако каждое нарушающее воздействие, несомненно, имеет последствия для микроорганизмов.
Каждое нарушающее воздействие приводит к ответной реакции МП и МС, в соответствии с фактором и силой воздействия (Ананьева, 2003). В связи с этим возникают вопросы: одинаково ли реагирует популяция микроорганизмов и МС на какое-либо нарушающее воздействие? Отражаются ли сукцессионные изменения на активности процессов, осуществляемые тем или другим МС? Важность ответов на эти и другие, близкие по значимости вопросы несомненна для микробной экологии.
Цель настоящего раздела работы заключалась в изучении связи сукцессии в МС при внешних нарушающих воздействиях с изменением активности процессов, осуществляемых этим МС.
2. 1. Реакция МС на внешнее нарушающее воздействие: сукцессия в амилолитическом МС при возрастающих концентрациях углеводородов нефти
Для выявления динамической реакции МС на внешнее нарушающее воздействие исследовали реакцию амилолитического МС дерново-подзолистой почвы на возрастающие концентрации нефти методом инициированного микробного сообщества (Гузев, 1989; вигеу е1 а1., 1982) (рис. 2. 1). Была
Рис. 2.1. Сукцессия в амилолитическом МС дерново-подзолистой почвы при увеличении концентрации нефти (нарушающий фактор). Шкала для концентрации нефти -логарифмическая. Сила доминирования вида характеризуется расстоянием между ними (см. А, Б. В). Заключением видовых названий микромицетов в рамки в виде точек и в виде сплошных линий подчеркивается различие видового состава при разных концентрациях нефти.
Концентрация нефти (lg), мл/кг почвы
О 0.3 1 3 10 30 100 300
......................................................
| etomium globosum, 3 — Oidiodendron griseuni, 4 — Strepto-''myieS~$'p''.\ cft7'g albus, 6 —
Gliocladium funbriatum, 7 — Pemcillium lanosum. S — P parilli. 9 - МпШргрПл re.manni/mn\10 - P.funiculosum, | [/ / - Aspergillus ustus, 12 -P tardum; A - доМИИйнт, Ь -часто встречающийся на — редко встречающийся микроорганизмы.
выявлена 4-ступенчатая реакция амилолитического МС - от отсутствия какого-либо влияния, до полного подавления активности сообщества. В структуре МС произошла смена доминирующих видов микромицетов. Вместо Oideodendron griseum и Streptomyces sp. cfr. albus стали доминировать Mortierella remanniana и Pénicillium tardum. Произошла смена часто и редко встречающихся видов. Кроме того, произошли функциональные изменения в сообществе. Если при концентрации нефти ниже 50 мл/кг почвы МС было представлено типичными амилолитическими микроорганизмами, то при ее более высокой концентрации преимущественное развитие получили УВ-окисляющие микроорганизмы, т.к. колонизировали нефть, а не крахмал. Эти исследования показали важность отслеживания при сукцессионных изменениях в МС не только компонентного состава, но функционального состава.
2. 2. Регуляция гидролазной активности МС под действием температуры и минерального питания
Исследование связи сукцессионных изменений в МС с изменением активности процессов, осуществляемых этим МС, удобно и важно проводить на примере природных и широко распространенных нарушающих воздействий и процессов. Таковыми являются воздействия температуры и минеральных элементов на гидролазную (целлюлазную) активность (ЦА) МС. В изучении регуляции ЦА индивидуальных микроорганизмов достигнут существенный прогресс (Lee et al., 2002). Известно, что ЦА индивидуального организма, помимо генетического уровня, может регулироваться на физиологическом уровне, при изменении внешних факторов: /о, состава среды, условий роста и др., (Boer, Koivula., 2003; Olsson et al., 2003; Panagiotou et al., 2003). Однако совсем не очевидно, что активность МС, тем более in situ, будет также регулироваться внешними воздействиями (to, влага, минеральное питание), как и активность индивидуального организма.
Исследование регуляции ЦА МС под действием внешних факторов проводили на примере влияния температуры, влажности и минерального питания на МС гидроморфных почв олиготрофных верховых болот, традиционно называемых торфами. Разложение растительных остатков в таких экосистемах происходит крайне медленно. Поэтому ответы на поставленные выше вопросы важны при решении и других проблем, например, выявления естественных механизмов изменения in situ ЦА МС олиготрофных верховых болот. Этот аспект проблемы особенно важен в связи отмечаемыми глобальными изменениями климата.
Определение ЦА проводили в образцах из верхних горизонтов торфа (3-11 см) верхового болота Сосвятский мох, (Лесоболотный стационар лаборатории лесоведения РАД Тверская обл.). ЦА в микрокосмах и in situ определяли методом оценки давления разрыва целлофановой пленки после инкубирования ее в присутствии целлюлазопродуцирукнцих агентов (Гузев с соавт. 1988), в собственной модификации. Чтобы получать результаты в общепринятых для
целлюлазной активности единицах (мкг редуцирующих Сахаров в ед. объема за ед. времени), было проведено калибрование метода путем определения давления
О 10 20 30 40 50 60« Температура, С
Рис. 2. 2. Зависимость ЦА гидроморфной почвы от температуры
разрыва после инкубирования целлофановой пленки в растворе препарата целлюлазы с известной активностью. Зависимость ЦА от температуры имела вид одновершинной кривой (рис. 2. 2). Максимальная ЦА в торфоболотной почве проявлялась при 38°, увеличившись по сравнению с ЦА при 25° в четыре раза. При 38°, и в меньшей мере при 25°
Таблица 2. 1. Сукцессия микромицетов под воздействием температуры.
Идентифицированные виды
Время, сутки Инкубация торфа при 25°С Инкубация торфа при 38°С
Выделение микромицетов на среде при температуре:
25» 38° 25° 38°
1-2 С. раппогшп А. п^ег нет роста С. раппогит Р./ип1си1о5ит
7-8 Р. ш1оЫ/егшп Р. таПепхИ Реп1с1Шит ¡р. АярегцШиэ ¡р. РепкЦИит ¡р. нет роста Р. /ипкЫояит А. /шт^миз
10 нет роста нет роста нет роста А. /шт^Ших Р./иякШотт
14-16 Р. Ш/оп1/егит Р. уаг1оШ охухрогит Р. /ип1си105шп Л.fшn¡gatus А. иггет Р. /ипкШохит Р./ипкШотт А.Аип£айв А. /шЩаХи*
20 МусеНа йегШа кет роста нет роста А./итфШш
24 Мусе11а ЛегШа АзрегцШтзр. Р. скгЬщепшп нет роста Р. /ип1си1о5ит А. /ит^/Лш Р. /ипкШотт Р. /ипкШозит А./шп^<Лш А. /ит/цтиз
и се
а* *
ч 8
и £
а
£
(+) 14, Р (250 Ч8]4^);25<>
(+)1Ч,Р(250 и81Ч/8); 38«
10 20
Время, сутки
Рис. 2. 3. ЦА в гидроморфной почве при внесении минеральных элементов и изменении температуры.
на почве и целлофановых мембранах наблюдали активный рост грибного мицелия. Дальнейшее сравнительное исследование ЦА и изменение состава комплекса микромицетов проводили при температурах 25° и 38°. При этом чашки, инокулированные грибами, изолированными из микрокосмов, инкубированных при 25° и 38°, делили на две партии и одну из них инкубировали при 25°, а другую при 38°. В этих исследованиях температура ниже 25° не применялась, так как в этом случае нужно было существенно удлинять время инкубирования, а это приводило к снижению достоверности данных о ЦА. Сравнительный анализ комплекса микромицетов, обнаруживаемых при 25° и 38°, показал их существенные различия (Табл. 2. 1). Более высокая ЦА, имеющая место при 38°, обеспечивалась другим комплексом микромицетов, чем при 25°.
Для бедных минеральными элементами экосистем, которыми являются верховые торфа, можно ожидать, что биогенные элементы будут значительным стимулирующим фактором развития микроорганизмов и проявления высокой ЦА. Действительно, внесение минеральных элементов (И, Р, К, Б) в виде смеси солей при 25° приводило к заметному увеличению ЦА (рис. 2. 3, А и В). При повышении температуры до оптимальной (38°) и внесении минеральных элементов ЦА возрастала в 10 раз, т.е. имел место эффект синергизма (рис. 2. 3, Б и Г). При дальнейшем увеличении концентрации солей (до 1000 мг К/кг торфа при 93% влажности) ЦА возросла незначительно или не менялась вовсе. Т.о.,
различия действия разных доз солей заключались в пролонгировании эффекта, обеспечивая высокую ЦА в течение 30 и более суток (рис. не приводятся).
Совместное воздействие температуры и минеральных солей также приводило к изменению состава комплекса микромицетов в микрокосмах (Табл. 2. 2). Доминирующие микромицеты обнаруживались как на целлофановых мембранах, так и на поверхности торфа, откуда проводили их прямую изоляцию. Наибольшее родовое и видовое разнообразие микромицетов имело место в варианте без внесения минеральных элементов и при более низкой температуре (Табл. 2. 1), но в этих условиях была наименьшей ЦА. Следовательно, условия, оптимальные для проявления максимального разнообразия микромицетов, не совпадают с условиями, оптимальными для проявления максимальной ЦА. Значительное повышение ЦА достигалось после существенного изменения состава микромицетов, фактически другим сообществом. В нашем случае это достигалось внешними воздействиями, повышением температуры и внесением минеральных элементов (Табл. 2. 2), т.е. оптимизацией или устранением лимитирующих факторов. На основании полученных данных можно сделать вывод, что сообщество микромицетов, доминирующее в естественных условиях -при низкой температуре и дефиците минеральных элементов, не способно обеспечить высокую ЦА ш situ. Следовательно, при отсутствии внешних воздействий в таких экосистемах разложение растительных остатков и органического вещества в целом, будет происходить замедленно, приводя к накоплению.
Таблица 2. 2. Сукцессия микромицетов под действием минеральных элементов и температуры.
Время, дни Идентифицированные виды
Инкубация торфа при 25°С Инкубация торфа при 38°C
Выделение микромицетов на среде при температуре:
25" 38" 25° 38"
1-2 С раппогит A. fumigalus нет роста P. funiculosum A. fumigatus
3 нет роста нет роста T. viride A. fumigatus* P.funiculosum P. variotii A. fumigatus
5-7 Т. viride Т. viride нет роста A. foetidus A. fumigatus P. funiculosum A. foetidus P.funiculosum A. fumigatus A. foetidus
14-15 P.funiculosum Т. viride P.funiculosum P. funiculosum P.funiculosum A. fumigatus
20-23 Т. viride P.funiculosum F. oxysporum P.funiculosum P. implicatum P. funiculosum A. foetidus P.funiculosum A, foetidus A. fumigatus
2. 3. Изменения ЦА гидроморфной почвы при чередовании циклов высушивания - увлажнения
Известно, что высушивание - увлажнение почвы приводит к отмиранию с последующей активацией и ростом выживших компонентов MC (Jager et а., 1975; Ананьева с соавт., 1997), а динамика развития MC в этом случае имеет колебательный характер. Нами прослежена связь нарушающих воздействий в виде высушивания - увлажнения с изменением активности целлюлолизиса и составом микроорганизмов его осуществлявших.
В этих экспериментах верховой торф с исходной влажностью 93% инкубировали в эксикаторах над дистиллированной водой при 38° с частым определением ЦА без компенсации потери влаги. При таком длительном инкубировании влажность торфа самопроизвольно снижалась до 36%. После доведения влажности до исходного уровня, поддерживали ее постоянной в течение месяца. Затем цикл высушивания - увлажнения повторяли (рис. 2.4). При незначительном изменении влажности торфа ЦА имела умеренную колебательную динамику. После уменьшения влажности торфа до ~ 70% ЦА начала заметно снижаться и достигла практически нуля при влажности около 36%. Увлажнение торфа до исходного уровня привело к резкому возрастанию ЦА и, далее, в течение более чем месяца наблюдались незатухающие колебания ЦА со значительной амплитудой. В течение второго цикла медленного высушивания -увлажнения закономерность повторилась. При этом ЦА резко возросла на порядок и длительно сохранялась с наличием незатухающих колебаний,
Рис. 2. 4. ЦА в гидроморфной почве при чередовании циклов высушивания -увлажнения.
не связанных с изменением влажности торфа (рис. 2. 4). Т.о., высокая ЦА, с ярко выраженным колебательным характером имела место только после нарушающего воздействия в виде высушивания - увлажнения. Так как в торф не добавляли каких-либо питательных веществ, то циклическое развитие целлюлолитических микроорганизмов было возможным только за счет гидролиза органического вещества торфа, целлофановых мембран и реутилизации компонентов отмершей биомассы микроорганизмов. Как и в предыдущих экспериментах при разной влажности и соответственно ЦА наблюдалась видовая сукцессия микромицетов.
Заключение к главе
Гидролазная активность чистой культуры микроорганизмов может быть существенно и целенаправленно изменена путем регулирования условий роста продуцента. Изменение гидролазной активности МС в ответ на изменение внешних условий происходит за счет перестройки состава сообщества, т. е. является результатом аллогенной сукцессии. Увеличение концентрации нефтяного загрязнения дерново-подзолистой почвы сопровождалось изменением состава МС, и, по-видимому, активности, так как доминирующее исходно амилолитическое сообщество микромицетов, замещалось УВ-окисляющим. Полученные закономерности регуляции активности МС in situ, согласуются с концепцией эколого-микробиологической оценки состояния почвы в условиях техногенного загрязнения (Гузев и Левин, 2001).
Нарушающие воздействия, в виде внесения минеральных элементов, изменения температуры и влажности приводили к изменению целлюлолитического сообщества верхового торфа. ЦЛ сообщество верхового торфа повышало свою активность через смену состава сообщества - через сукцессию. В связи с этим, также можно полагать, что, если в экотопе или эконише обнаруживается изменение активности какого либо процесса, то это указывает на сукцессионные изменения, происходящие в данной нише или экотопе.
Изменение (усиление) ЦА в верховом торфе может происходить за счет устранения лимитирующих факторов (внесение минеральных компонентов роста микроорганизмов) и под действием чередующихся циклов высушивания-увлажнения, которые все вместе представляют собой внешние нарушающие воздействия. Низкая ЦА в олиготрофных экосистемах и замедленное разложение растительных остатков обусловлены не столько следствием комплекса неблагоприятных факторов, сколько спецификой состава целлюлолитического сообщества. Повышение ЦА в гидроморфных почвах может быть достигнуто какими-либо воздействиями, приводящими к сукцессии. Колебательная динамика ЦА в верховых болотах, вызванная нарушающими воздействиями может быть причиной флуктуации эмиссии парниковых газов, что согласуется с полученными нами ранее результатами и литературными данными (Hwang et al., 2004) динамики потоков СОг и СН4 из различных экотопов, в том числе из гидроморфных почв верховых болот. Предполагается, что осцилляции МС могут служить чувствительным индикатором эмиссионной активности почв.
Глава 3. Волнообразная пространственная и временная динамика микробных популяций и сообществ в ризосфере и в почве
Популяционная гетерогенность природных MC, заключающаяся в одновременном существовании и развитии в одном и том же месте нескольких микробных популяций, в условиях постоянных нарушающих воздействий, с неизбежностью предопределяет флуктуирующий характер их динамики. Действительно, колебания численности микроорганизмов в почве отмечали давно, в лабораторных экспериментах и при полевых наблюдениях, при учете на чашках и при учете клеток под микроскопом, как бактерий, так и грибов, а также и простейших и нематод (Cutler et.al., 1922; Thornton and Taylor, 1935; Худяков, 1972; Аристовская, 1980; Звягинцев и Голимбет, 1983; Derbyshire, 1994). В естественных условиях, в почве колебания численности микроорганизмов проявляются в виде кажущихся иррегулярными флуктуаций, не коррелирующих с внешними экологическими факторами, такими как температура и влажность (Аристовская, 1980). Недостаточный методический уровень, использованный в предыдущих исследованиях этого явления и несоответствующий проблеме анализ результатов не позволил понять причины, движущие силы и механизмы такой формы развития MC (Аристовская с соавт., 1977; Полянская с соавт., 2005). Ограничившись только констатацией факта, так и не раскрыв движущих сил, причин, а особенно значимости и роли волнообразной динамики микроорганизмов для микробной экологии, проблему перевели в разряд обсуждаемых, но не решаемых. Следствием этого явилось множество гипотез, всячески объясняющих, но не раскрывающих сути явления (Паников и Горбенко, 1989), игнорирование этого явления при проведении исследований и интерпретации результатов, а также отсутствие даже попыток использования этого явления в практических целях.
Однако колебательная динамика развития микробных сообществ, как и процессов, ими осуществляемых, обнаруживающаяся во всех экосистемах и, являющаяся повсеместной не может больше игнорироваться вследствие сложности и трудоемкости процесса регистрации этого явления. Учет колебательного развития МП и MC стал необходим для дальнейшего понимания, как общебиологических процессов, так и при практическом применении знаний о MC. Фундаментальным и практическим аспектами применения знаний о колебательной форме существования и развития MC в экосистемах является область фитопатологии, определение здоровья почвы, очистка экосистем от загрязнений, интродукция микроорганизмов в экосистемы с индикаторными и другими целями. Эти и многие другие направления не могут успешно решаться без учета колебательной природы развития микробного сообщества.
При планировании своих исследований по поиску и применению биоконтролирующих агентов корневых фитопатогенов (середина 90-х годов XX века), автором был обнаружен явный недостаток фундаментальных знаний о структуре MC в ризосфере вдоль корней растений. С одной стороны, имелось множество публикаций, посвященных микробиологии ризосферы (Кожевин, 1989;
Полянская, 1996; Кравченко, 2000, The Rhizosphere, 2001), а с другой, популяционная динамика микроорганизмов вдоль корней растений была изучена довольно фрагментарно. Вместе с тем, следует отметить, что в свете нашего открытия, волнообразная динамика ныне угадывается и в некоторых более ранних исследованиях (Schippers and Vuurde., 1978; Van Vuurde and Schippers., 1980; Scott et al., 1995). Однако, как этими, так и другими исследователями явление волнообразной динамики развития MC вдоль корней растений было не замечено и не понято.
В связи с этим автор начал исследования с подробного изучения пространственной и временной динамики распределения бактерий вдоль корней растений. Эти исследования инициировали дальнейшее детальное изучение феномена и в неризосферной почве, поиск этого явления в других эконишах, вызвали интерес и поставили вопросы о причинах, механизмах, движущих силах явления, а также подтолкнули к осмыслению важности этого процесса и возможности использования в практических целях.
Целью настоящего раздела работы являлось экспериментальное и теоретическое изучение и обобщение результатов исследований колебательного развития микробных популяций и сообществ в ризосфере и почве и выяснение его причин и механизмов.
3.1. Пространственная и временная динамика бактериального сообщества в ризосфере вдоль корней растений
В качестве объекта использовали растения пшеницы (Triticum durum). Схема эксперимента уже описана в разделе 1.3. Анализ результатов показал, что распределение КОЕ вдоль корней подчиняется логнормальному закону. В распределении КОЕ и Сорг вдоль корней наблюдались значительные флуктуации, В связи с этим был использован гармонический (Фурье) анализ результатов, который показал, что в численностях КОЕ бактерий имеют место достоверные пространственные гармонические колебания. Такие колебания имели место в ризосфере, неризосферной почве и при определении ризосферного эффекта (рис. 3. 1). Выраженность ризосферного эффекта, как и четкость волнообразной динамики, зависела от обогащенности почвы органическим веществом, оба явления были существеннее в почве с более низкой обеспеченностью СорГ.. Тем не менее, достоверные гармоники были выявлены, как для КБ, так и для ОБ, в обоих повторностях эксперимента. При этом, если для КБ выявлялись гармоники, как первого, так и второго и третьего порядков, то для ОБ только первого и второго.
Так как волнообразная форма распределения бактерий вдоль корней обнаруживалась для всех временных периодов роста растений, а пики максимумов и минимумов несколько смещались с увеличением возраста растений относительно основания корня, то, следовательно, можно говорить о «движущейся или бегущей волне» плотности микробных популяций вдоль корней растений (рис. 3. 11). Визуально положение пиков численностей КБ относительно ОБ в каждый временной период, несколько различались между собой, иллюстрируя различия поведения разных трофических групп, хотя
корреляционный анализ не выявил значимых различий. Не выявлено корреляции и между численностью КОЕ и распределением вдоль корней концентрации СорГ, между КОЕ и распределением
Расстояние от кончика корвя, см
Рис. 3.1. Распределение КОЕ копиотрофных (А) и олиготрофных (Б) бактерий, боковых корней и водорастворимого органического углерода вдоль корня пшеницы.
боковых корней, между КОЕ и влажностью почвы вдоль корней. Таким образом, в отличие от ранее известных представлений, согласно которым распределение бактерий вдоль корней зависит от зоны экссудирования корня, обилия развития боковых корней или возрастных изменений корня (Schippers and Vuurde., 1978; Scott et al., 1995), наши исследования выявили истинную волнообразную динамику.
3. 2. Пространственная и временная динамика инфицирования корней растений фнтопатогенными грибами
Открытие волнообразной пространственной и временной динамики распределения КБ и ОБ вдоль корней растений выдвинуло проблему о всеобщности обнаруженного явления в природе и, в частности, поставило вопрос о том, происходит ли инфицирование корней растений фитопатогенами грибами случайным образом или закономерным. С этой целью в экспериментах, методически аналогичных предыдущим, провели исследование закономерности инфицирования корней пшеницы фитопатогенным грибом Rhizoctonia solani AG8.
Ризотроны с 4-х недельными растениями пшеницы вскрывали, и склероции гриба раскладывали вдоль корней растений с интервалом 2-3 мм, на расстоянии 1 мм от поверхности корня. В этой серии экспериментов было инокулировано по 8 корней растений в 2-х ризотронах. Ризотроны закрывали и растения продолжали расти в обычном режиме. Через неделю корни изымали, отмывали и вырезали 1 или 2 см сегменты через каждые 5 см. Поверхность сегментов подвергали стерилизации и, стерильные сегменты в соответствующем порядке раскладывали на селективную питательную среду для выявления Rhizoctonia solani AG8. Выросшие колонии микромицетов отсевали на соответствующие среды и идентифицировали.
При анализе колоний на агаре вокруг сегментов корней пшеницы помимо интродуцента R. solani AG8 обнаруживался еще один фитопатоген, принадлежащий к роду Pythium (в основном Р. ultimum). Провели учет сегментов, оказавшихся инфицированными тем и другим фитопатогенами отдельно. Так как эксперимент проводился во множестве повторностей, а корни несколько различались, в частности по длине, то, в связи с этим были рассчитаны пропорции инфицированных участков вдоль корней, начиная от кончика корня. Так как численности инфицированных участков корней флуктуировали, то эти результаты подвергли гармоническому анализу, который и выявил достоверные гармонические колебания, как для R. solani, так и для Pythium sp. Были выявлены гармоники третьего порядка, с периодами 30 см для обоих патогенов (Рис. 3. 2). Однако пики инфицирования (наиболее частое инфицирование) разными грибами, были в разных местах вдоль корня. Частота инфицированных участков для R. solani увеличивалась к основанию корня, а для Pythium sp. - уменьшалась. Следовательно, R. solani преимущественно инфицирует более старые участки корня, а Pythium sp. - более молодые.
Периоды волнообразного распределения инфицированных участков корней были аналогичны периодам колебаний у 4-х недельных растений (третьи гармоники, 32 см) численности КБ, но не ОБ. При этом в колебаниях численностей КБ, их пики отрицательно коррелировали (были в противофазе) с пиками инфицированных участков грибом Pythium sp, но не R. solani. Это дает основание предполагать, что поиск бактерий для биотехнологических целей следует искать среди представителей MC с широкой нормой реакции, а биоконтролирующих агентов против Pythium sp. среди КБ. В целом же имеется основание констатировать, что как искусственно интродуцированный в почву гриб (R. solani), так и природная популяция (Pythium sp.) инфицировали корни растений, не случайным, а периодическим, закономерным образом.
Из литературы известно, что временная динамика численности грибов (конидий и фрагментов мицелия) в почве имеет флуктуирующий характер (Звягинцев, Голимбет, 1983). В других исследованиях (Gilligan, Baily, 1997) было показано, что численные значения вероятностей инфицирования семян редиса склероциями R. solani AG4, разложенными с интервалом от 1 до 15 мм от поверхности семян также носят волнообразный характер. Проведенный нами гармонический анализ данных, опубликованных этими авторами, выявил наличие
достоверных гармонических колебаний. Таким образом, осциллирующий характер взаимодействия патогена и корней осуществляется как вдоль корней, так
0,6
• Эксперим. ИЛгоЛ ----Гарм. ШтоЛ*
* Эксперим. КБ -Гарм. КБ
—I-1-1-1-1-1——I-1-1—
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
5,0Е+07 4,0Е+07
3,0Е+07 | •1
♦ Эксперим. РуОДит - - - - Гарм. РуШит
а "Эксперим. КБ" -Гарм. КБ
-0,6 I и-1-1-1-1-1-1-1-1—
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
2,0Е+07 "3
в
о
1,0Е+07 2 0,0Е+00
5,0Е+07 4,0Е+07
*
3.0Е+07 м
2,0Е+07 "р
я о
1,0Е+07 ^ Е
0,0Е+00
Расстояние от кончика корня, см
Рис. 3. 2. Экспериментальные данные и гармонический анализ КОЕ КБ и пропорций инфицированных сегментов Я. яоШт Ав 8 (А) и РуШит ер. (Б). (* -Данные после проведения детрендированния).
и перпендикулярно корню и, следовательно, не только бактерии, но и микромицеты развиваются в почве и ризосфере волнообразно.
3.3. Природа и механизмы волнообразного развития МС
В литературе имеется довольно много гипотез, объясняющих осцилляции МП и МС в почве и ризосфере (Звягинцев, 1987; Кожевин, 1989). К заслуживающим внимания можно отнести следующие: (1) влияние боковых корней, (2) хищничество и (3) циклы роста и отмирания почвенных (ризосферных) микроорганизмов вследствие временного локального истощения субстрата.
Наиболее реалистичной представляется гипотеза о чередовании роста и отмирания части микробного сообщества вследствие временного истощения субстрата. Представляется, что после локального накопления субстрата в каждой конкретной точке пространства за счет автолиза части ранее отмерших клеток, подтока субстрата извне при разложении почвенного органического вещества, и др. происходит «вспышка» роста микроорганизмов. Это выражается в увеличении популяционной плотности и появлении пика на графике. В ризосфере, где источник субстрата - кончик корня постоянно движется, инициирование роста, а потом и отмирания клеток также постоянно смещается и в пространстве и, естественно, во времени. В силу этого и имеет место «движущаяся или бегущая волна» популяционной плотности, но, как это будет показано ниже, не видового разнообразия. Тем не менее, эта гипотеза нуждалась в дальнейшем изучении.
В наших экспериментах не обнаружено корреляции между пространственной динамикой численности боковых корней и распределением численностей КОЕ КБ и ОБ, однако эта гипотеза заслуживала специальных исследований. Гипотеза о роли хищничества выглядит менее реалистичной и могла бы быть исключена уже чисто логически. Во-первых, интенсивное выедание бактерий заканчивалось бы быстрым расходованием доступного углерода, необходимого для возобновления роста микроорганизмов, что привело бы к быстрому затуханию их роста, чего не было в экспериментах. Во-вторых, учитывая время генерации протозоа и нематод с одной стороны и скорость роста корней (4+/- 0,2 см/сутки) с другой, периоды волн КОЕ должны были бы быть существенно большими, чем в наших экспериментах. Тем не менее, эта гипотеза нуждалась в дальнейшей проверке.
Еще одна «поверхностная» гипотеза - это влияние фотопериодизма на волнообразное развитие бактерий вдоль корня. Однако она не может быть принятой во внимание, так как в этом случае периоды «волн» бактериального сообщества должны соответствовать сегментам прироста корня за сутки, т.е. приблизительно 4+/- 0,2 см в сутки. Однако периоды волн бактериального сообщества не зависели от скорости роста корней за сутки и составляли 30 или более см.
3. 3. 1. Исследования пространственной и временной динамики распределения бактерий вдоль искусственного корня
|*ОС НАЦИвНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА I С.Петербург I ^ ' 09 ЭТО акт ) 1 1 ■■-« 4
Искусственный корень - это система, физически копирующая функционирование естественного корня растений - (рис. 3. 3). Тонкая тефлоновая трубка с закрытым концом («кончик корня»), но несколькими отверстиями вблизи кончика, помещалась в синтетическую диализную трубку, один конец которой также герметично закрывали. Искусственные экссудаты равномерно, с рассчитанной скоростью потока, выдавливались насосом из шприца и попадали из тефлоновой трубки в диализную трубку, а из нее в почву. Тефлоновая трубка равномерно двигалась (вытягивалась) из диализной трубки с помощью часового механизма. Было создано две системы, в одной скорость роста «корня» (скорость вытягивания тефлоновой трубки) равнялась 4,2 см в сутки, т.е. скорость, близкая скорости роста корней пшеницы в наших экспериментах, а в другой - скорость роста «корня» равнялась 1,1 см в сутки. Эксперимент был повторен дважды. Продолжительность эксперимента для быстрорастущего корня составила 500 часов, а для медленнорастущего 1 тыс. часов.
Рис. 3. 3. Схема конструкции искусственного корня. 1. Ризотрон с почвой. 2. Неподвижная пластиковая диализная трубка с подвижной тефлоновой трубкой -«корень» внутри. 3. Удерживающий и герметизирующий затвор в диализной трубке. 4. Подвижная тефлоновая трубка - «корень», вытягиваемая в направлении 5 часовым механизм -6.7. Нить, соединенная с грузом 11, способствующая равномерному движению часового механизма. 8. Направление движения нити. 9. Направляющее колесо для движущейся нити. 10. Направление движения эксудатов.12. Кронштейн. 13. Насос, движущий поршень шприца -14, подающего искусственные экссудаты из колбы 15.
Через установленное время, диализная трубка, разрезалась, на 1 или 2-см сегменты и «ризосферная» почва - почва, прилипшая к диализной трубке, плюс
незначительное количество почвы, захваченное из-под диализной трубки, высевалась на богатую и бедную среды для определения КОЕ КБ и ОБ на г. сух. почвы. Отбирали также «неризосферную» почву для определения численности бактерий и влажности почвы. Данные КОЕ подвергались статистической обработке. Как и в случае естественных корней, вокруг искусственного корня обнаруживался достоверный ризосферный эффект, а также существенные закономерные колебания численностей КОЕ КБ и ОБ. В связи с тем, что в экспериментах использовали почву бедную органическим веществом, а источником экссудатов был только кончик корня, то наблюдалось довольно быстрое затухание колебаний от кончика к основанию. Так как расстояния, пройденные быстро и медленно растущими корнями за 500 и 1000 часов соответственно, различались, то и визуально выявляемые периоды волн, также различались. Однако, после трансформации пространственных колебаний, с учетом «скоростей роста», во временные оказалось, что величины периодов колебаний КОЕ как КБ, так и ОБ для быстро- и медленнорастущих «корней» практически одинаковы. То есть, нарастание численности бактерий и достижение пика - максимум волны, как и снижение численности не зависели от скорости роста корня, а определялись биологией обитающих в данной почве бактерий (рис. 3.4).
Для быстрорастущего корня были выявлены гармоники: для КБ третьего порядка, а для ОБ - второго, третьего и четвертого порядков. Для медленно растущего, для КБ гармоники третьего порядка, а для ОБ - второго и шестого.
Эксперименты с искусственным корнем позволили исключить следующие гипотезы. (1). Исключалась гипотеза об определяющей роли распределения и обилия боковых корней в волнообразной динамике бактерий, так как искусственный корень не имел боковых корней. Волнообразное развитие МС могло инициироваться только нарушающим воздействием выделяемых «искусственных экссудатов». В эксперименте исключалось влияние на МС других ризодепозитов и механическое нарушающее воздействие, так как искусственный корень двигался внутри диализной трубки. (2). Не могла быть значимой и гипотеза и о ведущей роли хищников в волнообразном развитии бактериального сообщества. В этом эксперименте использовалась почва, в течение двух лет хранившаяся в воздушно сухом состоянии в г. Девис, Калифорния, США, где температура в летний период в тени достигает свыше +40°С градусов и, следовательно, количество выживших цист и яиц не могло быть обильным. Кроме того, в конце эксперимента, перед посевом почвенной суспензии на среды каждое первое разведение почвенной суспензии подвергалось тщательному микроскопированию на предмет выявления простейших или нематод. Ни первые, ни вторые обнаружены не были. (3). В этом эксперименте проверялась и еще одна зависимость - о влиянии скорости роста корня на волнообразную динамику развития МС. Периоды и амплитуды колебания численностей бактерий не зависели от скорости роста корней и, следовательно, они определяются биологией доминирующих в этой почве популяций бактерий.
Таким, образом, основной механизм волнообразного развития микроорганизмов в ризосфере - это циклический рост и отмирание
микроорганизмов вследствие временного и локального лимитирования роста субстратом. На рисунке 3. 4 видно, что колебания численности бактерий имело место и в неризосферной почве, однако биомасса бактерий там была существенно меньше и пики осцилляций были менее отчетливыми. Результаты эксперимента с искусственным корнем указывают на то, что волнообразное развитие бактерий в ризосфере вдоль корней присуще всем растениям. Можно полагать, что и вдоль боковых корней растений имеет место такое же волнообразное развитие
* Ршосферт по»*а
4 Врпнфпгаа
О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Щ 1Ъссптие от кшнка юрня, см
$ 4» § 400 и 3® 5*300 250
И 200
О 150 И 100 в 59 2 О
Б
Л
460 400 350 300 250 200 150 100 50 О
10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 Еассгояж от мпнка мрпя, см
100 200 300 400 Вр»я, часы
100 200 300 Времи, Ш]
500
400
500
Рис. 3. 4. Пространственная (А и В) и временная, за 500 часов (Б и Г) динамика копиотрофных бактерий в ризосфере и неризосферной почве в эксперименте с искусственным корнем.
микробных популяций. Если это так, то эти осцилляции будут «интерферировать» с осцилляциями вдоль основных корней, что будет приводить к «смазыванию» и маскированию явления.
3.3.2. Исследования временной динамики бактерий в почве
Волнообразное развитие микроорганизмов в почве выявлено раньше, чем это
было выявлено в ризосфере (Cutler et.al., 1922; Thornton and Taylor, 1935). Можно полагать, что природа, движущие силы, механизмы и последствия волнообразного развития MC в ризосфере и в неризосферной почве одна и та же. В ризосфере основными нарушающими фактороми являются субстрат экссудатов и другие ризодепозиты, биомасса отмершей части микробного сообщества и механическое воздействие на почву растущего корня. В неризосферной почве основным субстратом мо?кет быть только легкодоступная для потребления микроорганизмами фракция почвенного органического вещества, включающая
Их/
•е--о--о--е-е--®"®"о
1s
Дни
Рис. 3. 5. Динамика КОЕ и различно окрашенных (ФИТЦ и ФДА) и учтенных с использованием люминесцентного микроскопа клеток бактерий в почве после внесения свежих растительных остатков. Полное название красителей приведено в тексте.
отмершую биомассу. Такое предположение подтвердилось при определении динамики водорастворимого органического углерода в почве и математическими моделями.
Естественно, что при попадании в почву дополнительного субстрата, следует ожидать более значительные флуктуации почвенного МС. Поэтому исследование волнообразной динамики развития МС в почве, проводили в
эксперименте с внесением в почву растительных остатков в виде смеси травы и клевера (Т+К) и ежедневным определением численности бактерий. Смесь почвы с растительными остатками была расфасована в большое число сосудов с таким расчетом, чтобы избежать физических нарушающих воздействий на МС при отборе почвенных проб. Ежедневно учитывали КОЕ бактерий, а также клетки бактерий под люминесцентным микроскопом, общее количество - при окрашивании их флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) и физиологически активные (живые), при окрашиванием флюоресцеиндиацетатом (ФДА), а также влажность почвы, рН, ЕЬ, N-N11», N-N03.
Были выявлены закономерные затухающие колебания численности бактерий всеми методами (рис. 3. 5). Гармонический анализ результатов выявил достоверные осцилляции МС с тремя или четырьмя пиками в течение тридцати дней. Пики КОЕ появлялись обычно на один - два дня раньше, чем при микроскопическом учете. Другие исследуемые параметры (рН, ЕЬ, N-N1^4, N-N03) не имели волнообразной динамики (рис. не приводятся). Полученные результаты позволяют сделать два важных вывода. Во-первых, только живые организмы обладают таким свойством как колебательная динамика вследствие роста и отмирания части популяций. Во-вторых, колебательная динамика бактерий не является прямым следствием изменчивости физико-химических параметров почвы.
Полученные результаты позволяют предположить, что периоды и амплитуды волнообразной динамики МС после нарушающего воздействия, могут быть использованы в виде количественных характеристик реакции МС на нарушающие воздействия при создании системы индикации здоровья почвы.
Детальные исследования ежедневной динамики численности бактерий в почве были проведены в дополнительной серии экспериментов. Одну часть почвы не подвергали каким либо воздействиям (контроль), а другую сначала прогревали при 80° С в течение суток, повторно увлажняли и вносили в пробирки. Ежедневно брали случайным образом по три пробирки из каждого варианта и в них проводили прямой учет клеток под люминесцентным микроскопом после окрашивания красителями ФИТЦ и ФДА. В этих экспериментах, повторенных три раза, как и в предыдущих, были выявлены выраженные флуктуации численности бактерий с заметным затуханием амплитуд во времени. Гармонический анализ выявил достоверные гармоники в обоих вариантах эксперимента (рис. не приводятся).
Нарушающими факторами в этих экспериментах были в одном варианте только механическое перемешивание в начале эксперимента, а в другом еще и высушивание с последующим увлажнением. Колебания численностей бактерий были обнаружены как в контрольной, так и в прогретой почве, освобожденной от хищников, что указывает на отсутствие или незначительную роль последних в волнообразной динамике развития бактерий в почве.
Результаты гармонического анализа некоторых литературных данных. Чтобы убедиться в повсеместности явления волнообразных колебаний численности микроорганизмов были обработаны экспериментальные данные, полученные другими авторами. Такие результаты были получены в рамках
выполнения Международной биологической программы и представляют ежедневный длительный учет численности бактерий в различных почвах, относящихся к различным почвенно-климатическим зонам бывшего Советского Союза и, в которых имеют место выраженные флуктуации численности бактерий. Представляли интерес результаты, опубликованные в сборнике «Вопросы численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов». 1972. Наука, Ленинград, авторами Паринкиной О.В., Щаповой JI. Н. и Зыкиной JI.B. В этом и другом сборнике - «Закономерности развития почвенных микроорганизмов». Гл. редактор Скарлато О.А., отв. Редактор. Аристовская Т.В. Ленинград. 1975, статьи Домрачевой Л.И., Егоровой C.B., Ефремовой Т.Н., Евдокимовой Г.А., Перемузовой Л.А. и Егоровой С.В и Стефурак В.П. содержатся не только рисунки, но и цифровые данные. Гармонический анализ некоторых экспериментальных данных из этих сборников выявил достоверные гармонические колебания численности бактерий в исследуемых почвах, которые не зависели от влажности и температуры.
3.3.3. Исследование роли хищничества в волнообразном развитии бактерий.
В литературе имеется разная оценка роли простейших и нематод в выедании бактерий в почве (Darbyshire, 1994; Brussard 1998). Чтобы получить прямые данные о роли хищников в волнообразной динамике развития бактерий были проведены детальные исследования популяционной динамики нематод и простейших в почве. Схема эксперимента была такой же как описано в разделе 3. 3. 2. В первой части эксперимента вели ежедневный учет разных возрастных групп нематод, протозоа и бактерий после внесения в почву смеси травы с клевером (Т+К). Эта часть эксперимента была повторена два раза. Во второй части эксперимента использовали стерилизованную гамма-излучением почву и растительные остатки (Т+К), с тем, чтобы исключить влияние хищников на динамику бактерий. В этом эксперименте стерильную почву, смешивали с гамма-стерилизованными остатками Т+К и инокулировали суспензией бактерий, полученной из такой же почвы путем фильтрации почвенной суспензии через стерильные фильтры с размером пор 0,8 мкм. Ежедневно учитывали ФИТЦ-окрашенные клетки бактерий.
В нестерильной почве были выявлены достоверные осцилляции бактерий, причем два первые пика численности бактерий имели место в первые 7 суток. Гармонический анализ данных выявил достоверные гармоники пятого, шестого и седьмого порядков в разных повторностях этого эксперимента, с доминированием гармоник пятого порядка с периодом колебания в 5 дней.
Ежедневный учет общей численности нематод не выявил их колебаний. Имело место монотонное нарастание общей численности со второй недели эксперимента. Ежедневная динамика численности только бактериотрофных нематод (БТН) выявила скачкообразное нарастание их численности, частично совпадающее с частотой колебания численности бактерий. Статистическая обработка данных динамики БТН в первой части эксперимента выявила достоверные гармоники с периодом 5 дней. Однако при более детальном
исследовании таксономического и функционального состава БТН было (в первой повторности этой части эксперимента доминировали представители ЮтЬс1Шс1ае, а во втором - В1р1о§аБ1епс1ае) установлено, что фактически это были не колебания, а скачкообразное нарастание численности вследствие активации вышедших из яиц молодых нематод (Баиейагуае, рис. 3. 6). Гармонический анализ этих результатов выявил гармоники 8-го порядка с периодом в 4 дня, тогда как бактерии имели периоды колебаний не менее 5 дней.
3
и 9" о В
а
вО
в
2
!
я
£
Рис. 3. 6. Динамика общего количества бактерий (А) и бактериотрофных нематод (Б) в эксперименте (первой повторности эксперимента). Представлена сумма значимых гармоник, после процедуры «фильтрации» и «сглаживания».
Т.о., в отличие от модели Лотки-Волтерра, где колебания численности бактерий объясняется выеданием их хищниками, показано, что осцилляции численности бактерий не связаны непосредственно с колебаниями численности БТН, а коррелируют с изменением скорости роста БТН. Чередование неактивной и активной стадий в синхронизированной после нарушающего воздействия популяции хищников могут совпадать с чередованием периодов роста и отмирания бактериального сообщества. Кроме того, динамика нарастания
численности БТН в целом, была слишком медленной, чтобы ею можно было объяснить снижение количества бактерий после их первого максимума, который имел место уже в течение двух дней после начала эксперимента.
В почве без хищников также имело место волнообразное развитие бактериального сообщества. Гармонический анализ выявил две достоверные гармоники, четвертого и пятого порядков при доминировании гармоники четвертого порядка с периодом около 7 дней. В целом, отличие динамики MC в почве без хищников заключалось в том, что заметно увеличились периоды и амплитуды пиков и колебания численности бактерий не затухали дольше, по сравнению с не стерилизованной почвой (рис. не приводятся).
Нарастание численности простейших происходило также слишком медленно, чтобы этим можно было объяснить снижение численности бактерий после первых двух пиков их численности, имевших место в течение первой недели. Как раз наоборот, пики хищников следовали за пиками своих жертв -бактерий.
В математической модели «BACWAVE», где воспроизводится пространственная и временная динамика КБ в ризосфере и в ее расширенном варианте (см. гл. 1. 3), когда моделировали одновременно рост и развитие в ризосфере, как КБ, так и ОБ, были получены осцилляции микробной биомассы бактерий без вклада и влияния хищников на динамику развития бактерий. Таким образом, если хищничество и играет какую-то роль в снижении численности бактерий в почве и ризосфере, то эта роль далеко не главная, а вторичная и незначительная. Основным механизмом колебательного развития MC в почве и ризосфере является чередование роста и отмирания части MC.
3. 4. Исследование сукцессии микробного сообщества при волнообразном развитии
Логикой исследований был выдвинут вопрос о закономерностях и особенностях сукцессии микроорганизмов в ризосфере вдоль корня. С этой целью провели серию исследований, включающих: 1) распределение вдоль корней пшеницы маркированной популяции бактерий Pseudomonas fluorescens 32 gfp, интродуцированной в почву; 2) распределение ампликонов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и денатурирующего градиента гель электрофореза (ДГГЭ) ДНК, изолированной непосредственно из ризосферной и неризосферной почвы и из колоний бактерий, выросших на богатой и бедной средах, после посева ризосферной и неризосферной почвы; 3) динамику роста Р. fluorescens 32 gfp на поздней стационарной стадии в периодической культуре; 4) математическое моделирование, описывающее волнообразные осцилляции бактериального сообщества в ризосфере, почве.
3. 4. 1. Распределение вдоль корней пшеницы маркированной популяции бактерий Pseudomonas fluorescens 32 gfp, интродуцированной в почву.
Бактерия была маркирована способностью синтезировать зеленый флюоресцирующий белок - поэтому индивидуальные клетки можно было учитывать под люминесцентным микроскопом, а колонии - при освещении темно голубым светом. Схема эксперимента была, как описано в разделе 3. 1. Исследовали корни 3-х недельных растений пшеницы, выросших в почве с интродуцированной суспензией клеток Р. /¡иогеясемх 32 ^р (4х 108- ] х 109 клеток / г. сух. почвы). Распределения популяции интродуцентов исследовали разными методами. Часть корней разрезали на сегменты (1,5 см каждый, 25 сегментов в каждой повторности) и, в ризосферной и неризосферной почве проводили учет клеток Р. Аиогезсет 32 методом посева и прямым счетом под микроскопом. Часть корней разрезали на две равные части и помещали на селективную агаризованную среду с антибиотиками.
Динамика интродуцированной в почву Р Аиогенсет 32 вдоль корней
Рис. 3. 7. Трехнедельный корень пшеницы, выросший в почве с предварительно интродуцированной в почву популяцией Р {\иоге$сет 32 После 2-х суточного инкубирования корня на агаре; сфотографирован при освещении темно голубым светом.
растений, имела волнообразный характер, что обнаруживалось как методом посева, так и учетом клеток под люминесцентным микроскопом. Были выявлены гармоники первого, второго и третьего порядков для численностей КОЕ и клеток (рис. 4. 1). В отличие от популяционной плотности аборигенных бактерий в ризосфере, было обнаружено интенсивное затухание осцилляции популяции Р. Аиогеясет 32 от основания к кончику корня. Это является следствием того, что исходно, в неризосферной почве, клетки Р. Аиогевсет 32 интенсивно отмирали и пространство, достигнутое кончиком корня через три недели (около 45 см глубины) содержало слишком мало клеток для выявления их используемыми методами.
На корнях растений, выращенных в почве с популяцией P. fluorescens 32 gfp и инкубированных затем на агаризованной среде для псевдомонад с антибиотиками, были обнаружены разно светящиеся участки (Рис. 3. 7). Следовательно, после нарушающего воздействия на растущем корне происходит упорядочивание случайно распределенной популяции, и она начинает развиваться волнообразно. Можно полагать, что разные популяции бактерий в одном месте будут по разному реагировать на одинаковые нарушающие воздействия. Наоборот, одна и та же популяция в разных местах будет реагировать на одно и тоже нарушающее воздействие одинаково. Это дает основание предположить, что пики численностей бактерий в хорошо перемешанной почве будут состоять из одной или немногих доминирующих популяций, имеющих сходные физиологические характеристики.
Использованный в этих исследованиях штамм P. fluorescens 32 gfp является активным биоконтролирующим агентом фитопатогенного гриба Gaeumannomyces graminis вар. tritici, за счет продуцирования 2,4-диацетилфлюроглюцинола (Raaijmakers, J.M., и De Souza, J.T., Университет Вагенингена, персональное сообщение). Наши исследования указывают на необходимость учета факта волнообразной динамики интродуцентов при их практическом использовании с целью биоконтроля, а также и другими целями.
3. 4. 2. Распределение вдоль корней пшеницы ампликонов ПЦР и ДГГЭ анализа ДНК, изолированной из колоний ризосферных КБ и ОБ и из ризосферной почвы
Схема эксперимента была такой же, как описано в разделе 3. 1. Объектом анализа было микробное сообщество ризосферы пшеницы Triticum aestivum L. Корни 4-х недельных растений разрезали на 40 - 50 сегментов (1,5 см длиной) с одновременным отбором такого же количества образцов неризосферной почвы в качестве контроля, а также образцов для определения влажности почвы. Последовательно, почву с одного сегмента использовали для приготовления почвенной суспензии и учета бактерий высевом на среды, а почву со следующего сегмента - для прямого выделения ДНК. Почвенную (ризосферную и неризосферную) суспензии высевали на богатую и бедную Сорг. среды, учитывая КОЕ КБ и ОБ. Эксперимент проводили одновременной с почвами, возделываемыми по традиционной интенсивной (ИТ) и экологически чистой технологии (ЭЧТ).
После того как колонии были учтены, с каждой чашки из всех колоний КБ и ОБ отбирали равное количество биомассы, выделяли ДНК и амплифицировали с универсальными эубактериальными праймерами (U968GC и L1401r; Heuer and Smalla, 1997). Из почвы, собранной с каждого альтернативного сегмента прямой экстракцией выделяли ДНК, подвергали ее очистке и амплификации с такими же праймерами. Продукты ПЦР (ампликоны) разделяли с помощью ДГГЭ с использованием соответствующих контролей и стандартов. Сканированные имиджи ДГГЭ гелей анализировали с использованием Phoretix ID (NonLinear Dynamics Ltd, Newcastle upon Tyne, UK) программы, определяя удельную
плотность, количество и расположение (подвижность) ампликонов. Результаты такого анализа «располагали» в соответствующем порядке вдоль корня и подвергали гармоническому анализу и другим видам анализов (каноник дискриминантный анализ, SAS Institute, Inc., Сагу, NC).
Рис. 3. 8. Пример распределения относительной интенсивности отдельных ампликонов 16 Б гБЫА изолированной непосредственно из ризосферной почвы вдоль корня, начиная от кончика корня. А - ампликон синхронен и в фазе с КОЕ КБ. Б - ампликон синхронен, но в противофазе с КОЕ ОБ. В - ампликон смещен к основанию корня. Тонкая сплошная и пунктирная линии - гармоники КБ и ОБ соответственно. Сплошная жирная линия гармоника ампликона. Заштрихованные кружочки - экспериментальные данные ампликона. По оси ординат ОП -оптическая плотность ампликонов.
Данные пространственной динамики КОЕ вдоль корней пшеницы подвергали анализу на выявление ризосферного эффекта, который был достоверно обнаружен, а также соответствующему статистическому анализу, в
том числе и на наличие достоверных гармонических колебаний. Достоверные гармоники были выявлены в распределении КОЕ обеих трофических групп бактерий вдоль корней.
С учетом того, что исследовали различно возделываемые почвы, при анализе КОЕ было выявлено 33 амликона из колоний, выросших на богатой среде (КБ) и 52 ампликона из колоний, выросших на бедной среде (ОБ). Эти результаты еще раз подтверждают вывод о том, что наиболее обильной трофической группировкой бактерий является группировка с широкой нормой реакции, представители которой как раз и получают преимущества при росте на бедной среде (см. гл. 1).
Большинство наиболее интенсивных (по ОП) и идентичных (по расположению на электрофореграммах) ампликонов, полученных на основе анализа ДНК выделенной из КОЕ КБ, ОБ или непосредственно из почвы осциллировали с той же фазой, как и КОЕ КБ. Гармонический анализ этих результатов выявил достоверные колебания, совпадающие с гармониками КОЕ КБ. Среди других групп идентичных ампликонов, но с меньшей интенсивностью также были выявлены достоверные колебания, однако они были в противофазе с КОЕ и, наконец, часть ампликонов как бы группировалась только в некоторых зонах корня, например, вблизи основания или кончика корня (рис. 3. 8).
Дискриминантный анализ ДГГЭ результатов выявил различия в амллихонах, полученных при использовании различно возделываемых почв, между ризосферной и неризосферной почвой и между восходящими и нисходящими плечами волн вдоль корней. Наиболее важный результат этих исследований состоит в том, что состав ампликонов изменялся внутри каждого пика (каждой волны), но оставался довольно стабильным от волны к волне. Тем самым показано, что представители некоторых, наиболее обильных по численности таксономических единиц бактерий (видов, родов) росли и отмирали во времени и в пространстве более или менее одновременно. Наоборот, представители других, менее обильных по численности таксонов, имели другие характеристики роста и отмирания и реагировали по другому, на нарушающее воздействие или может быть совсем не реагировали на растущий корень, и поставляемый им субстрат (рис. 3. 9). Принимая во внимание местоположение образцов относительно кончика корня, как временной и пространственной точки начала сукцессии, полученные результаты могут быть истолкованы следующим образом. Имеет место сукцессия бактерий в пределах каждой волны, и этот процесс в существенной степени повторяется от волны к волне. Качественное состояние почвы, определяющее состав МС, влияет на проявление и прохождение сукцессии. Это согласуется с отмеченным в разделе 3. 1 фактом, где гармонические колебания были более выражены в почве более бедной Сорг.
3. 5. Динамика Р. /¡иогезсею 32 в поздней стационарной фазе роста при периодическом культивировании
Колебания численности клеток имеют место не только в почвенной среде, но и в чистой культуре при контролируемых условиях. В этих исследованиях наблюдали рост Р. Аиогейсет 32 в жидкой среде, содержащей (г/л): протеозо пептон - 2; К2НРО4 - 1,5; М^О^ШгС) - 1,5; глицерин - 15 мл/л; антибиотики канамицин и рифамицина по 50 мг/л. рН среды 7,0, в трехлитровых колбах с одним литром среды, стационарно, осуществляя перемешивание раз в сутки в ручную в течение минуты и перед отбором проб, температура + 25° С. Пробы отбирали через день, на протяжении 60-ти дней. Клетки учитывали под микроскопом и посевом, водорастворимый Сорг. определяли бихроматным методом, после фильтрации культуры через нейлоновый бактериальный фильтр с размером пор 0,2 мкм.
Возделывание/возрастающие и ниспадающие плечи КОЕ
гч а
з
.......... у ■ . А А* А А а? □ □
А 1 АД А 0 * ( . .. ................ .,. С ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ сап 1 яв ■
а ИТ, ниспадающее плечо ■ ИТ, возрастающее плечо д ЭЧТ, ниспадающее плечо а ЭЧТ, возрастающее плечо
Рис. 3. 9. Сукцессия РСЯ-1ХЮЕ ампликонов «внутри» волн КОЕ. Дискриминантный анализ ДГТЭ ампликонов из КОЕ различно возделываемой почвы, и возрастающих и ниспадающих «плеч» волн.
Были получены типичные кривые роста культуры, с соответствующими фазами. Полагая, что в фазах ускорения, экспоненциальной и даже в фазе замедления процессы роста преобладают над отмиранием, основное внимание обращалось на стационарную фазу роста. Гармонический анализ результатов (с процедурами усреднения, и сглаживания) выявил достоверные гармонические колебания численности клеток в стационарной фазе роста. Достоверные гармоники обнаружены и при анализе концентрации остаточного органического углерода в культуральной жидкости. При этом если колебания численности клеток имели слабовыраженный тренд затухания во времени, то в колебаниях концентрации остаточного Сорг наблюдали отчетливое затухание. Колебательная
динамика численности клеток в стационарной фазе чистой культуры P.fluorescens 32 gfp при наличии значительной концентрации органического углерода в среде согласуется с теорией лимитирования и ингибировании роста микроорганизмов (Перт, 1978; Работнова, Позмогова, 1979). Даже при избытке общего органического углерода, рост микроорганизмов может полностью остановиться из-за исчерпания одного незаменимого и имеющегося в минимуме компонента среды, а тем более - нескольких (Egli, Zinn., 2003).
а7,0 -6,0
0.5,0
s 4,0
I 3,0
¡2,0
М 1,0
0,0
8,0 | 7,0 и 6,0
Оа о
и 5,0 ^ 4,0 3,0
0 10 20 30 40 50 60
Время, сутки
Рис. 3. 10. Результаты гармонического анализа численности клеток Р. Аиогеьсет 32 (А) и остаточного углерода в среде (Б) в стационарной фазе роста при периодическом культивировании.
Таким образом, колебательный характер развития свойственен не только сообществу, но и чистой культуре, индивидуальной популяции клеток в отсутствии хищников и паразитов. Колебание содержания общего органического углерода в культуральной жидкости происходило в противофазе колебанию численности клеток. Достоверные колебания имели место в стационарной фазе роста, суть которой и заключается в квазистационарном равновесии роста и отмирания части популяции клеток.
Необходимо отметить, что колебательная динамика роста чистых культур бактерий, а особенно дрожжей, как при периодическом, так и непрерывном
культивировании достаточно хорошо исследована и широко представлена в литературе (Porro et al., 1988; Chen & McDonald, 1990; Vadasz et al., 2001).
3. 6. Математическое моделирование волнообразной динамики развития бактерий.
Для идентификации механизмов волнообразного развития микроорганизмов в ризосфере и почве были разработаны математические модели. Волнообразную динамику роста и отмирания бактериального сообщества в ризосфере вдоль корня растений пшеницы описывает модель "BACWAVE" - бактериальные волны (раздел 1. 3.), в которой заложен один механизм колебательного развития бактериального сообщества - рост и отмирание части этого сообщества с реутилизацией части мормассы. Движущей силой развития сообщества было нарушающее воздействие в виде растущего и экссудирующего кончика корня. Использованный на дыхание и ассимиляцию субстрат возмещался за счет почвенного органического вещества.
Варьирование скоростей роста и отмирания клеток позволяло моделировать разные амплитуды и периоды развития бактериального сообщества. Помимо этого, были имитированы движущиеся или бегущие волны вдоль корней растений. Смещение пиков численности бактерий вдоль корней при сравнении динамики распределения бактерий разновозрастных корней - движущиеся волны, которые наблюдали и экспериментально, указывают на то, что волнообразное развитие бактериального сообщества является объективной реальностью, а не артефактом, так как для формирования движущихся волн нужен постоянно действующий «генератор». Таким генератором являются нарушающие воздействия, в ризосфере - это растущий и экссудирующий корень (Рис. 3.11).
Модель "BACWAVE" была дополнена и расширена с цельно одновременного описания популяционной динамики КБ и ОБ, вырастающих богатой бедной средах соответственно (гл. 1. 3.). В этой модификации была смоделирована колебательная динамика двух разных трофических групп, потребляющих один и тот же субстрат в одно время и в одной и той же точке пространства. Особенностью этих двух модификаций модели является то, что колебание бактериальной биомассы достигалось только за счет оптимизации параметров роста и отмирания бактерий в системе субстрат - потребитель.
Помимо модёлей, имитирующих популяционную динамику развития бактерий в ризосфере, была создана другая, комплексная математическая модель «BACWAVE - WEB». Эта модель учитывает не только копиотрофных и олиготрофных бактерий, но и микроорганизмов - гидролитиков и хищников бактерий - популяционную динамику развития простейших и нематод. Эта модель включает динамику процесса разложения микроорганизмами растительных полимеров, внесенных в почву, разложение разных фракций почвенного органического вещества для обеспечения микроорганизмов источником углерода, энергии и источником азота. Эта модель, разработанная на основе собственных и литературных данных является почти адекватной функционирующей почвенной экосистемой.
е
у
и 'X
•ч
»
Я
си а>
ев ю
ее о о ев
о Я П
20
40 60 80 100
3 2 1 0
1 1
1--1-1- Б
20
40
60
80 100
20
40
60
80
100
Расстояние от основания корня (см)
Рис. 3.11. Движущиеся или бегущие волны бактериальной биомассы вдоль корня растений как функция растущего и экссудирующего корня.
Компьютерное имитирование показало, что волнообразная динамика развития различных трофических групп бактерий в почве после внесения растительных остатков имеет место, как в присутствии, так и в отсутствии хищников. Некоторое влияние выедания бактерий хищниками сказывается только на более поздних стадиях развития почвенного МС. Бактерии, выявляемые на бедной среде (ОБ) оказывают стабилизирующее действие на колебания других трофических групп бактерий, и являются главным источником питания для хищников. Тем самым подтвердился ранее сделанный автором вывод, основанный на сравнении популяционной динамики копиотрофных и олиготрофных бактерий и нематод. В этой модели еще раз было подтверждено, что волнообразная динамика микроорганизмов является следствием взаимодействий потребителя и субстрата, которым служит органический углерод, а, например, динамика разных форм минерального азота не является волнообразной.
Заключение к главе
Динамика микробных популяций и сообществ в ризосфере и в почве подчиняется волнообразным пространственным и временным колебаниям. С учетом литературных данных можно утверждать, что колебательное существование и развитие МП и МС повсеместно и постоянно. Механизм колебательного развития МП и МС - это чередование фаз роста и отмирания, с автолизом и реутилизацией отмершей биомассы и восполнением недостающего количества органического углерода за счет подтока субстрата из окружающей среды, например, за счет гидролиза почвенного органического вещества. Чередованию фаз роста и отмирания подвержена только часть популяции и популяций, эту часть, по-видимому, можно назвать активной частью сообщества. Из-за различия в физиологических характеристиках популяций, разной кинетики роста, различной трофности, т.е. популяционной гетерогенности рост и отмирание разных МП происходит с разной скоростью. В силу этого «возрастающие плечи» и «ниспадающие плечи» волны различны по своим доминирующим популяциям. Следовательно, сукцессия происходит внутри каждой волны, а не от волны к волне и поэтому индивидуальные волны не зависимы друг от друга. Движущей силой колебательного развития микроорганизмов являются различного вида и силы нарушающие воздействия. В результате нарушающих воздействий, особенно в гетерогенной системе, происходит локальное «высвобождение» субстрата, приводящее к локальному росту микроорганизмов. Фундаментальность характера причинно-следственной связи нарушающих воздействий и последующего волнообразного развития МП и МС представляется уместным выразить в виде концепции «о нарушающих воздействиях и волнообразном развитии МП и МС».
Наличие движущихся волн популяционной плотности микроорганизмов вдоль корней в совокупности с ранее выявленным П.А. Кожевиным (1989) феноменом бегущих волн перпендикулярно корню является свидетельством всеобщности и повсеместности явления.
Установленные закономерности фактически решают проблему соотношения и связи временных и пространственных осцилляций. Все в природе, в том числе и осцилляции численности микроорганизмов, происходит во времени. В пространстве, осцилляции будут выглядеть как упорядоченные, последовательные, в том случае если было достаточно сильное, одновременное для всего исследуемого пространства нарушающее воздействие. Упорядоченные, закономерные осцилляции почвенного микробного сообществ можно получить и на очень большой площади, если микробные популяции на этом пространстве сходны по своей трофике и кинетике роста, а нарушающий фактор достаточен по силе воздействия. При незначительной силе «основного» нарушающего фактора, но при достаточно большой площади, избранной для наблюдений, будут превалировать локальные, не замечаемые исследователем нарушающие факторы и в силу этого исследователь будет регистрировать как бы случайные, независимые временные флуктуации.
Предложенный механизм возникновения «волн» и сукцессии в движущихся осцилляциях закрывает ряд спекулятивных вопросов, постоянно сопровождающих исследуемую проблему. Один из них о том, не являются ли выявляемые осцилляции следствием статистических манипуляций? Во-первых, наличие регулярных осцилляций численности МП и МС после нарушающего воздействия было продемонстрировано в большом количестве независимых и разнообразных экспериментов, а также их многократно наблюдали в природных условиях - в почвах различных природных зон и генезиса. Во-вторых, колебательное развитие микроорганизмов в различных эконишах достаточно успешно воспроизводится в настоящее время с помощью математических моделей, учитывающих рост и отмирание микроорганизмов и их взаимодействие с субстратом согласно общепринятым подходам. В математической модели, состоящей из системы обыкновенных дифференциальных уравнений и не содержащей периодических компонентов, математически описывается динамика развития микробных популяций в соответствии с представлениями об их функционировании и численными значениями. Решение этих уравнений, представляет собой совокупность колебательных затухающих функций, отражающих динамику микроорганизмов и субстрата и не зависящих от получаемых экспериментально серий данных, но вместе с тем, эти функции очень близко аппроксимируют экспериментальные данные динамики численности (биомассы) микроорганизмов в почве и ризосфере. Этот факт является важным аргументом в пользу существования колебаний численности МП и МС, так как внешнее проявление колебательной динамики получает подтверждение с точки зрения внутренних движущих сил и свойств функционирования МП и МС. В-третьих, всякое волнообразное распределение множества дискретных точек в пространстве будет оставаться всегда статическим во времени, а в ризосфере мы имеем движущиеся, бегущие волны.
Постоянно действующим генератором движущихся волн являются различные нарушающие воздействия. В ризосфере, эту функцию выполняет растущий, экссудирующий корень. Дополнительным экспериментальным подтверждением природного, а не искусственного или случайного характера феномена, является достоверные гармонические колебания пропорций инфицированных участков корней растений пшеницы грибом А 50/аиг АО-8. Равномерно разложенные вдоль корня склероции А $о1ат АО-8 инфицировали корни не случайно, а периодично, закономерно.
Важным теоретическим вопросом, решаемым в настоящей работе, является соотношение микро и макро осцилляций МП и МС. Известно, что с изменением (уменьшением или увеличением) размера или расстояния отбора, например, почвенного образца параметры колебаний (амплитуды, периоды) также изменяются (уменьшаются или увеличиваются). Причина этого феномена, по-видимому, заключается в том, что с изменением «размера» образца изменяется разнообразие и обилие «захватываемых» для анализа популяций. Осцилляции определяются неким количеством доминирующих по численности популяций. Для анализа же обычно отбираются образцы с ограниченного ареала, и, в связи с этим, с уверенностью можно говорить, что в образцах доминантами являются
более или менее, но одни и те же по физиологии и кинетике роста популяции. При анализе они дают сходные результаты в виде сходных пиков. Т.о., при минимизации образца или анализируемого пространства происходит и минимизация вовлекаемых в анализ популяций и численностей их представителей, что и выражается в появлении микро осцилляций.
Естественно, остались пока еще и нерешенные вопросы. Нет результатов прямых определений количества отмирающих клеток в почве. На сегодняшний день, такие исследования не могут быть проведены достаточно качественно из-за отсутствия приемлемых и доступных методов. Микроскопия с ее разнообразными красителями, в том числе люминесцентными, пока не в состоянии дать удовлетворительные результаты. Балансовые расчеты активных или живых и общего количества клеток, учтенных с помощью специфичных красителей, дают довольно противоречивые и сложные для трактовки результаты. Поэтому доступны только расчеты на основе учета не отдельных клеток, а «биомассы»,они достаточно убедительны.
Глава 4. О роли нарушающих воздействий в развитии MC и связи этих воздействий с круговоротом микроорганизмов в природе
В предыдущих главах показано, что МП и MC развиваются и функционируют волнообразно. Перечислим некоторые источники нарушающих воздействий, приводящих их к колебательному развитию MC.
1). Высушивание торфяно-болотистой почвы с последующим увлажнением приводило к длительным, циклическим изменениям целлюлазной активности этой почвы. Глобальность роли такого нарушающего фактора, как краткосрочное высушивание почвы и других природных субстратов с последующим увлажнением к настоящему времени уже достаточно широко понята, принята во внимание и продолжает активно изучаться. Основная причина пульсационной динамики поведения MC и ее активности после высушивания - увлажнения - это кратковременное отмирание части популяций микроорганизмов при высушивании и активизация роста с потреблением мортмассы клеток после увлажнения (Ларионова, Розанова, 1993; Ананьева с соавт., 1997; Magid et al., 1999; Ларионова с соавт., 2001; Ананьева, 2003; Благодатская с соавт., 2005;).
2). Экссудирующий кончик корня и в целом растущий корень, который является источников ризодепозитов - субстратов, потребляемых почвенными микроорганизмами, вызывает значительные осцилляции ризосферных МП и MC. Кроме того, перемещение кончика корня вызывает механическое нарушение почвы, что также приводит к высвобождению субстратов из почвы.
3). Рост пшеницы в почве с интродуцированной популяцией Р. fluorescens 32 gfp приводил к волнообразному развитию бактериальной популяции в ризосфере. В этом эксперименте имел место комплекс нарушающих воздействий; механическое перемешивание почвы, внесение популяции микроорганизмов, часть которых постепенно отмирала, становясь субстратом, а также растущий корень. Сходные нарушения имели место при интродукции Rhizoctonia solani AG 8 в ризосферу корней пшеницы.
4). Внесение свежих растительных остатков в почву приводило к значительным осцилляциям почвенного МС. В этих экспериментах также имело место двойное нарушающее воздействие - внесение субстрата и механическое перемешивание почвы.
5). В других экспериментах, по изучению с почвенного МС, очевидным нарушающим фактором служило перемешивание почвы при отборе образцов.
6). Математическое моделирование результатов воспроизводит волнообразную реакцию микробного сообщества в системе субстрат потребитель, в которой субстрат выполняет роль нарушающего МС фактора. Даже в чистой культуре P. fluorescens 32 gfp в поздней стационарной фазе наблюдалась колебательная динамика популяции бактерий, «задаваемая» какими-то лимитирующими факторами роста.
Таким образом, экспериментальные и литературные данные демонстрируют прямую причинно-следственную связь нарушающих воздействий и последующего волнообразного развития МП и МС.
В природе постоянно происходит «поступление» субстратов в ту или иную систему (нишу) тем или иным способом наряду с их «высвобождением», «закреплением», потреблением и перемещением, что создает непрерывное нарушающее воздействие в функционировании МС. При этом микроорганизмы выступают не только потребителем субстратов, но и их источником. В природных условиях, постоянное и непрерывное внесение или перемещении субстрата в эконишах, экотопах и экосистемах происходит в процессе, известным под названием пищевой цепи. Частица вещества, бактериальная клетка, совокупность клеток и частиц, перемещаясь по «большой» пищевой цепи и совершая на этом пути «петли», могут, рассматриваться постоянным и непрерывным пространственно-временным нарушающим фактором, вызывающим волнообразное развитие микробных популяций.
Колебательное существование индивидуальной популяции микроорганизмов имеет место даже в условиях постоянного снабжения популяции субстратом и максимального перемешивания, имеющего место при хемостатном культивированием при низких скоростях разбавления (Smith, 1981; Smith, WaltmanP. 1995).
В выдвигаемой в настоящей работе гипотезе круговорота микроорганизмов, как основного источника нарушающих воздействий микробная клетка является и объектом (субстратом потребления) и субъектом (отклик в виде роста или отмирания) любых нарушающих воздействий. Во-первых, биомасса микроорганизмов является источником углерода и энергии для других гетеротрофных организмов. Во-вторых, микроорганизмы выступают основными возбудителями окислительно-восстановительных, ферментационных и других процессов во всех эконишах. В третьих, любое вещество, используемое в пищу более высоко организованным, чем микроорганизм биологическим объектом почти всегда инокулирована микроорганизмами и перенос пищи, тем самым сопровождается переносом микроорганизмов. В четвертых, при попадании в новую эконишу значительного количества новых микроорганизмов может произойти смена состава доминирующего МС с преобладанием «пришельцев» и
изменением активности и направленности процессов. В пятых, даже при попадании в нестерильную систему стерильного субстрата (эксперимент с использованием стерилизованных гамма-излучением растительных остатков) происходит волнообразное развитие микробного сообщества.
Как «пастбищный», так и «детритный» варианты пищевой цепи однонаправлены и не могут охватить и объяснить всего многообразия перемещения микроорганизмов в экосистемах (Одум, 1986). В природе микроорганизмы перемещаются не только по цепи, а скорее в виде цикла. Циклическая природа перемещения микроорганизмов отмечена эпидемиологами (Черкасский, 1994). Представляется, что цикл микроорганизмов (ЦМ) в экотопах и экосистемах в виде отдельных клеток, популяций и сообществ через основные природные местообитания (почва, вода -> растения -> животные -> экскременты и экскреты животных и растений и опять почва и вода) как раз и является постоянно действующим источником нарушающих воздействий. Такие циклы существуют наряду и благодаря пищевым цепям, движению потоков вещества и энергии в экосистемах. Однако в отличие от последних, которые однонаправлены и не замкнуты, ЦМ может быть обратимым, но замкнутым. Почву и воду, растения, животных и их экскременты и экскреты можно рассматривать как «узлы», «хранилища», «инкубаторы» и «ферментеры», в которых происходит селекция и размножение наиболее приспособленных к каждому конкретному месту обитания микроорганизмов, потребление веществ и энергии, создание новых веществ, содержащих энергию. Следствием этого является формирование новых устойчивых к определенным условиям микробных сообществ. Наряду с глобальным ЦМ, который сформировался вследствие филогенеза всего живого мира, имеют место микроциклы и/или укороченные циклы (петли), которые отражают эволюционное развитие каждого отдельного узла, например, короткий цикл почва - растение - почва, почва - животное - экскременты - почва и т.д.
Несомненно, что перемещение и распространение микроорганизмов в природе осуществляется и другим способом, который превалирует в представлениях и не только специалистов, считаясь основным - это рассеяние микроорганизмов с воздушными и водными потоками. Такое ненаправленное, вероятностное, диссипативное распространение микроорганизмов, несомненно, способствует тому, что «все есть везде», а природа отбирает. Этот способ миграции микроорганизмов тоже следует считать нарушающим фактором, приводящим к волнообразному развитию МП и МС. Однако для регистрации таких диссипативных нарушающих воздействий нужны соответствующие методы, способные регистрировать и дифференцировать разно уровневые нарушающие воздействия. При попадании незначительного количества микроорганизмов в подходящие условия, тот или иной микроорганизм, будет сначала активно расти, с максимальным доминированием роста над отмиранием (Кожевин, 1989, 2000). На этой стадии развития практически невозможно заметить отмирание, а, следовательно, и колебательную динамику роста популяции в целом. Колебательное развитие МП и МС начнется после «первого» истощения субстрата.
Целью настоящего раздела работы является обоснование гипотезы о том, что одним из природных источников и перманентно действующих механизмов нарушающих воздействий на микробные сообщества может быть круговорот микроорганизмов, т.е., перемещение МП и МС вдоль пищевой цепи с образованием цикла.
4. 1. Интродукция микроорганизмов в природные субстраты, как нарушающее воздействие, приводящее к волнообразному развитию МС
Простейшим примером связи перемещения значительного количества микроорганизмов в какую-либо эконишу с возникновением достоверных осцилляций численности микроорганизмов является интродукция
3500,0 | 3000,0 в 2500,0 -
и
Ц 2000,0 -&
1 1500,0
I 1000,0 -
* 500,0 -0,0
О
| 250,0 § 200,0 £ 150,0 -100,0 -
I
§ 50,0
Й 0,0 ¡4
-50,0
10
20
30
40
• Эксприм. данные
Б
О Сглаженные
—Га|^с
•ОО
10
20
30
40
Расстояние от кончика корня, см
Рис. 4. 1. Популяционная динамика бактерии Р. Аиогезсет 32 вдоль корней 3-х недельных корней растений пшеницы, в почве возделываемой по ИТ (А) и по ЭЧТ (Б). Семена пшеницы были посеяны в почву, с предварительно интродуцированной популяций Р. ]\иоге$сет 32 (ИТ - возделывание почвы по интенсивной технологии. ЭЧТ - по экологически чистой технологии).
микроорганизмов в почву или в другой естественный субстрат. Исследованию этого процесса посвящено множество публикаций. Однако в большинстве таких исследований подсчет интродуцентов проводили только несколько раз в течение 30, 60 и даже более суток. Этого достаточно, чтобы обнаружить интродуцента, но недостаточно для выявления осцилляционной динамики, обнаружение которой возможно лишь при ежедневном учете численности микроорганизмов (Кожевин, 1989; Полянская, 1996). В экспериментах (см. главу 3) по исследованию популяционной динамики почвенного МС в ризосфере вдоль корней растений было достоверно показано упорядочивание развития природного МС после нарушающего воздействия в виде растущих корней. Волнообразное развития природного почвенного МС имело место и при внесении растительных остатков в почву и наблюдении ежедневной динамики почвенного МС.
После интродукции суспензии Р. Аиогеясет 32 в почву, и выращивания в ней растений пшеницы были обнаружены достоверные осцилляции популяции этой бактерии вдоль корней растений (рис. 4. 1). Т. е., нарушающее воздействие в виде растущего корня упорядочивает, гармонизирует равномерно рассеянную в почве популяцию бактерий.
Результаты эксперимента с интродукцией склероций К $о\ат Ав 8 в ризосферу корней пшеницы, где происходило волнообразное инфицирование корней растений, также свидетельствуют об инициировании волнообразного развития естественного МС и интродуцируемой популяции этим нарушающим воздействием.
Приведенные данные можно рассматривать как экспериментально подтвержденную связь между массированным перемещением популяции микроорганизмов в новую эконишу (из колбы в почву) и волнообразным развитием микроорганизмов.
4. 2. Перемещение популяции интродуцента по цепи субстратов: экскременты крупного рогатого скота -> почва -> ризосфера и филлосфера растений -> беспозвоночные животные.
В природе микроорганизмы являются объектом постоянной миграции из субстрата в субстрат: попадающие в сферу влияния корней становятся ризосферными, а вынесенные из почвы на поверхности проростков -филлосферными. Микроорганизмы поедаются различными животными или поступают в организм с пищей. В желудочно-кишечном тракте часть популяций бактерий и грибов частично или полностью погибает, лизируется, становясь субстратом метаболизма животного, другие выживают и даже размножаются, увеличивая свою численность, поэтому в экскрементах их обнаруживается гораздо больше, чем в исходном субстрате (Ищенко, 1995; Вызов, 2003). То есть, в природе микроорганизмы мигрируют из одной экониши в другую, третью и т.д. При прослеживании таких многократных перемещений микроорганизмов было важно, с одной стороны, исследовать закономерности направленной миграции
% 1.E+I2 l.E+11 £ 1,E+10 l.E+09 О l.E+08 -) • l.E+07
20 40 60 80 100 120 Сутки
1,0ЕЧ2 l.OB-ll 1,0E+10 1.0E+09 1.0EH» 1,0ЕНГ7 1.0B06 l.OEH»
Рис. 4.1. Популяционная динамика A- P.fluorescens 32 gfp, Б-E. coli 99507 фяВ-S. typhimurium MAE 110 gfp исходно интродуцированных в ЭКРС и после стабилизации численности перенесенных в почву. Стрелкой отмечено время смешивания ЭКРС с почвой.
даз,
рМ1 «дао '1
■ _ ЗУООЕЯО
¡2 о
§№07
0> I |до|
и13<в1
1»6 9ДЕ+04
Кеим/Чидо Ki/tajx Ri/fcqx Ki/r.q* Ki/eqk Ki/qcih Ki/ohi
EffiooüiB ЗКГС ЗКРСшрвд сикя мсигеря icpii,(<jx авбел=(<У1
ЗФС антши! ЭЮОЯЛШ ЕШМПП ®c) П0
cvnfi
Рис. 4. 2. Количество клеток Б. ¡урЫтигтт МАЕ 110 ф на различных фазах эксперимента по исследованию перемещения этой бактерии в цепи: культура -> ЭКРС -> почва -> корни и стебли растений (кресс-салат)
этой смеси. На стеблях и корнях отдельно, после смыва определена численность клеток и КОЕ S. typhimurium (рис. 4. 2). Оказалось, что как корни, так и стебли содержали значительное количество клеток S. typhimurium.
После скармливания части растений кресс-салата виноградными улитками (Helix pomatia), в их экскрементах обнаружили боле 6,0*105 кл. бактерий в гр. сух. субстрата.
Заключение к главе.
Наряду с хаотичным рассеянием микроорганизмов с потоками воздуха и воды, возможно существование их направленного и циклического потока. «Переходы» микроорганизмов из одного местообитания в другое, миграция вместе с окружающими их веществами по цепи взаимосвязанных ниш оказывают нарушающие воздействия на экониши и их МС. Нарушающие воздействия испытывают на себе и сами «мигранты». Каждое перемещение сопровождается стрессом, как аборигенов, так и «пришельцев». Вследствие нарушающих воздействий аборигенные и «пришедшие» (интродуцированные) МП и МС, реагируют сукцессией и «волнообразным» развитием.
При движении веществ и микроорганизмов по пищевым цепям и циклу в целом, происходит с одной стороны потеря (изъятие) энергии из веществ, а с другой - качественное и количественное изменение состояния МС, выражающееся в селекции наиболее приспособленных для условий конкретной экониши микроорганизмов.
С точки зрения обще экологических представлений, нарушающие воздействия и волнообразное развитие, по-видимому, можно рассматривать, как совокупность аутогенной (высвобождение субстрата) и аллогенной (круговорот микроорганизмов с пищевой цепью) сукцессий. Гипотеза цикла или круговорота микроорганизмов гармонирует с представлениями о динамической структуре МС, его регуляции in situ и форме существования и развития МС. Трофическое группирование микроорганизмов подчеркивает гибкость МС, а, следовательно, способность к адаптации, учитывает единство конкуренции и кооперации в МС. В процессе перемещения микроорганизмов происходит поступление новых микроорганизмов в новые экониши, создаются нарушающие воздействия, вызывающие сукцессии с волнообразным развитием микробных популяций и МС.
Общее заключение.
В работе предложен новый, динамический подход к трофическому группированию гетеротрофных микроорганизмов и новая схема структуры микробного сообщества. Новое видение трофического группирования и схемы гетеротрофного микробного сообщества стало возможным на основе объединения различных уровней исследований, экспериментального - физиолого-биохимического и теоретического - математического моделирования.
Для трофического группирования предложено использовать представление о норме реакции организмов, которое включает генетическую детерминированность свойств и физиологическую гибкость, способность к адаптации. В качестве характеристик для такого группирования предложено использовать некоторые кинетические параметры роста, а также концентрацию и состав используемых субстратов. К кинетическим параметрам роста относятся величины сродства транспортных систем микроорганизмов к субстратам, которые выражаются как К, и/или Км, величины энергии поддержания организмов и величины дыхательной активности. При таком подходе все многообразие гетеротрофных микроорганизмов относительного друг друга, в соответствии с перечисленными кинетическими характеристиками роста, вдоль вектора концентрации субстрата можно расположить в некий ряд. В этом ряду, микроорганизмы, с крайне низкими значениями, указанных параметров и имеющие преимущества в условиях низких концентраций легкодоступного органического углерода, будут группироваться на одной стороне вектора, а на другой - микроорганизмы с противоположными свойствами. Эти две группировки, предложено обозначать как группировки с «узкой нормой реакции». Предположено, что эти группировки немногочисленны и соответствуют истинно олиготрофным и истинно копиотрофным микроорганизмам. Другое множество микроорганизмов, обладающее умеренными характеристиками будет располагаться между этими крайними группировками. Таких микроорганизмов большинство, при этом часть из них может выживать и развиваться как при достаточно низких, так и достаточно высоких концентрациях субстрата. В связи с этим, относительно некоторых микроорганизмов создается впечатление об их эвритопности, что, конечно не так. Для характеристики именно этих микроорганизма в первую очередь и предложен термин «микроорганизмы с широкой нормой реакции».
Критерии группирования микроорганизмов по их трофности и расположение того или иного организма в континууме его кинетических характеристик (Кт или К5, т, и Уо2пмх.) надежны, просты и доступны для использования в исследованиях. Предложенная схема группирования подтверждается результатами экспериментальных и теоретических исследований и даже обладает объяснительными и предсказательными свойствами. Можно полагать, что предложенная схема будет полезной при объяснении уже известных или вновь получаемых научных фактов.
В предложенном группировании используются в основном физиолого-биохимические свойства микроорганизмов (за исключением концентрации субстратов), а не факторы окружающей среды, как температура, влажность, рН, соленость и другие. Этим, последним, называемым иногда еще экотопическими, подчинены все организмы, как с «узкой», так и с «широкой нормой реакции». Группирование микроорганизмов в соответствии с этими факторами будет не трофическим, а экотопическим. Это выходит за рамки проблемы трофического группирования и структуры МС, но имеет отношение к другой проблеме изучаемой в настоящей работе, а именно к сукцессионным изменениям МС, регуляции МС при внешних воздействиях.
В работе показано, что при внешних нарушающих воздействиях в МС посредством сукцессии изменяется не только состав сообщества, но и его активность. Показано, что аллогенная сукцессия проявляется в виде значительных осцилляций активности МС. Учитывая тот факт, что микробный процесс значим и существенен, если микроорганизмы, его осуществляющие, не только достаточно активны, но и если их достаточно много, можно полагать, что осцилляция активности МС непосредственно связана с осцилляцией численности микроорганизмов и наоборот. Многочисленные литературные данные и результаты этой работы дают основание сделать вывод о всеобщности колебательной динамики развития микроорганизмов в природных местообитаниях, а, следовательно, и таких процессов, как, например, эмиссия парниковых газов и др.
В настоящей работе, с использованием различных методических приемов и математического моделирования был детально исследован феномен волнообразного развития МП и МС в природных субстратах. Впервые показана волнообразная динамика развития бактериальных популяций и сообществ вдоль корней растений. Доказана всеобщность и повсеместность этого явления. Показано, что «бегущие или «движущиеся» волны микробных популяций генерируются не только перпендикулярно корню (Кожевин, 1989), но и вдоль корня. Тем самым, в целом, был внесен вклад в понимание механизма волнообразного развития МП и МС.
Периодичность роста и отмирания МП из-за временного, локального истощения субстрата, особенно в гетерогенной среде, является основной причиной осцилляций. Часто дискутируемая в литературе гипотеза хищничества в качестве главной причины волнообразного развития МП не нашла достаточного экспериментального подтверждения. Роль хищничества может быть только вторичной. Другие, экзотические гипотезы возможных механизмов волнообразного развития МП и МС, предложенные в свое время разными исследователями и которые были следствием слабости экспериментальных и теоретических исследований, не подтвердились при систематическом и разностороннем исследовании явления.
Помимо механизма волнообразного развития МП и МС в работе дано экспериментальное объяснение движущих сил волнообразного развития, которыми являются многочисленные и разнообразные нарушающие воздействия. Представляется, что причинно-следственное единство нарушающих воздействий и последующего волнообразного развития МП и МС может претендовать на роль всеобщей концепции в экологии микроорганизмов. Причинно-следственный характер концепции указывает на ее объективность и возможность практического применения для тестирования почвенных экосистем и определения «здоровья почвы».
Реальность и объективность нарушающих воздействия как движущей силы волнообразного развития МП и МС может восприниматься лишь при условии наличия не менее реального постоянно действующего источник нарушающих воздействий. Предполагается, что роль такого постоянно действующего и повсеместного источника нарушающих воздействий выполняет направленное
перемещение микроорганизмов, МП и МС по цепи взаимосвязанных природных экониш: почва (вода) -> растения -> пищеварительные тракты животных -> экскременты и экскреты животных и растений -> почва (вода) в виде круговорота или цикла микроорганизмов, тем самым еще раз связывая эти компоненты экосистемы в единое целое. Такое перемещение микроорганизмов, МП и МС с пищевой цепью, и вдоль цепи, но в отличие от цепи, в которой происходит истощение энергии и в силу чего она конечна, перемещение микроорганизмов с образованием и замыканием в цикл, с образованием множества микроциклов и петель, рассматривается как наиболее вероятный, перманентно действующий источник нарушающих воздействий, приводящий к высвобождению субстрата в конкретной микрозоне и вследствие этого волнообразному развитию, обитающих в этой микрозоне МП. Естественно, что эта гипотеза требует дальнейших всесторонних исследований, выходящих далеко за рамки настоящей работы.
Выводы
1. Предложено новое группирование гетеротрофных микроорганизмов на основе использования представления о норме реакции, включающей генетическую детерминированность и физиологическую гибкость организмов. При таком группировании микробное сообщество представляется в виде динамичной, симметрично-асимметричной структуры с тремя взаимно перекрывающимися группировками, представляя собой континуум популяций, видов, ассоциаций и их функций. Предложенная структура микробного сообщества обладает объяснительными и предсказательными свойствами и получила экспериментальное и теоретическое подтверждение.
2. Регуляция гидролазной активности микробного сообщества в природных местообитаниях осуществляется не столько через изменение активности каждого отдельного компонента микробного сообщества, сколько через изменение доминирующих представителей в сообществе, через сукцессию. Сукцессия, является следствием нарушающих воздействий и сопровождается колебательной реакцией микробного сообщества, в частности, в проявлении целлюлазной активности микробного сообщества. Этот способ реакции микробного сообщества, по-видимому, свойственен всем функциональным группам микроорганизмов.
3. Микробные популяции и микробные сообщества в ризосфере и почве развиваются волнообразно. Механизмом волнообразного развития является рост и отмирание части микробных популяций и микробных сообществ. Движущими силами такого волнообразного развития является постоянно возникающие в природе нарушающие воздействия, приводящие к изменению поступления субстрата в систему «субстрат - потребитель». Хищничество, как причина волнообразной динамики микробных популяций и микробных сообществ играет вторичную, подчиненную роль. Волнообразное развитие микробных сообществ сопровождается сукцессией. Сукцессия протекает не от «волны» к «волне», а внутри каждой волны. Нарастание количества микроорганизмов, приводящее к пику или максимуму волны, определяется численностью некоторых
доминирующих популяций. При отмирании клеток доминирующих популяций происходит снижение их численности и появление новых доминирующих форм.
4. Нарушающие воздействия в микробных популяциях и микробных сообществах разнообразны и их действие может носить аддитивный характер. Предполагается, что основным, повсеместным и постоянно действующим нарушающим фактором является перемещение микроорганизмов вдоль пищевой цепи с образованием цикла, т.е. круговорот микроорганизмов. Гипотеза круговорота или цикла микроорганизмов объединяет разные представления о структуре микробного сообщества, отражает гибкость микробного сообщества, сукцессию, способность к адаптации, отбор наиболее приспособленных, связывает нарушающие воздействия и волнообразное развитие микробных популяциях и микробных сообществах.
5. Количественные характеристики амплитуд и периодов «волн», численности микроорганизмов, возникающих после нарушающих воздействий могут быть использованы для управления природными микробными сообществами и разработки показателей здоровья почвы. Для управления микробными сообществами необходимо или применить соответствующей силы нарушающее воздействие, инициирующее колебания и сукцессию или наоборот минимизировать воздействия, способствуя внутренней буферной способности микробных сообществ.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации Обзоры и главы в книгах
1. Semenov A.M., 1987. Characteristics of soil Prosthecobacteria. Proc. of the 9-th Int. symp. on soil biol. and conserv. of the Biosphere. (Ed. by J. Szegi). Acad. Kiado. Budapest. Hungary, p. 697 - 702.
2. Semenov A.M., 1991. Physiological bases of oligotrophy of microorganisms and concept of microbial community. Microb. Ecol. 22:239-247.
3. Семенов A.M., 1991. Культивирование я физиология роста олиготрофных микроорганизмов. Итоги науки и техники, сер. микробиологическая. ВИНИТИ. М. т. 24. с. 149 - 178.
4. Semenov A.M. and Staley J.T., 1992. Ecology of polyprosthecate bacteria. Advances in Microbial Ecology. 12:339-382.
5. Panikov N.S., Belyaev A.S., Semenov A.M., and Zelenev V.V., 1993. Methane production and uptake in some terrestrial Ecosystems of the former USSR. In.: Biogeochemistiy of Global Change: Radiatively Active Trace Gases. R. S. Oremland (Ed.). Chapman & Hall Inc. N-Y. 1993. p. 221 - 224.
6. Van Bruggen A.H.C. and Semenov A. M., 2000 In search of Biological Indicators for Soil Health and disease suppression. Applied Soil Ecology. 15(l):13-24.
7. Семенов A.M., 2000. О структуре микробного сообщества. Поиск и характеристика причин и механизмов динамичности и стабильности. Труды научн. конф. "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов". К 110-летию со дня рождения проф. Е.Е. Успенского. МГУ, биофах, 21.12.1999. М. Диалог - МГУ. с. 21 - 25.
8. Семенов A.M., 2001. Осцилляции микробных сообществ в почвах. Труды Всероссийской конференции. К 100-летию со дня рождения академика Е.Н. Мишустина. 22.02.2001. М. МАКС Пресс, с. 57-72.
9. Franz Е., van Bruggen A.H.C. and Semenov A.M., 2004. Risk-analysis of human pathogen spread in the vegetable industry: a comparison between organic and conventional production chains. In: van Boekel
M A.J.S , Stein A. and van Brüggen A.H.C. (Eds) Bayesian statistics and quality modelling in the agro-food production chain. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht., 81-94.
10. Семенов A.M., 2004. Микробно-растительные взаимодействия. В кн. "Экология микроорганизмов». Учебник для студ. Вузов. Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия» 2004. 145-164.
11. Семенов А.М , Цавкелова Е.А., Юдина Т.Г., Богданов А.Т. 2005. «Изучение морфологии и цитологии микроорганизмов». В практикуме по микробиологии. Учеби. пособие, для студ. высш. уч. заведений. М. Из дат. центр. Академия. 2005. с. 56-93.
12 Колотилова H.H., Семенов A.M. 2005. «Методы количественного учета микроорганизмов». В практикуме по микробиологии. Учебн. пособие, для иуд. высш. уч. заведений. М. Издат. центр. Академия. 2005. с. 101-114.
13. Семенов A.M., Нетрусов А.И. 2005. «Идентификация микроорганизмов из природных сообществ без выделения в чистые культуры». В практикуме по микробиологии. Учебн. пособие, для студ. высш. уч. заведений. М. Издат. центр. Академия. 2005. с. 143-159.
14. Семенов A.M., Цавкелова Е.А. 2005. «Цикл азота и микроорганизмы в нем участвующие». В практикуме по микробиологии. Учебн. пособие, для студ. высш. уч заведений. М. Издат. центр. Академия. 2005. с. 434-445.
15. Van Brüggen А.Н.С., Semenov А.М., Van Diepeningen A.D., de Vos О.J., Blok W.J. 2005. Relation between soil health, wave-like fluctuations in microbial populations, and soil-bome plant disease management. European J. Plant Pathology. (Принято к опубл.).
Статьи в рецензируемых журналах
1. Семенов A.M., Окороков Л.А., Васильева JI В., 1988. Поглощение глюкозы Labrys monachus -почкующейся простекобактерией с радиальной симметрией клетки. Микробиология, т. 57. № 6 стр. 912-916.
2. Семенов A.M., Ботвинко И.В., 1988. Экзогликан Prosthecomicroblum pneumatievm. Микробиология, т. 57, № 3. с. 511 - 512.
3. Паников Н.С., Семенов А.М., Тарасов A.A., Беляев A.C., Кравченко И.К., Смагина М.В., Палеева MB., Зеленев В.В., Скупченко К.В., 1992. Образование и потребление метана в почвах Европейской части СССР. Журнал экологической химии. № 1. с. 9 - 26.
4. Паников Н.С., Титлянова A.A., Палеева MB., Семенов A.M., Миронычева-Токарева Н.П., Макаров В.И., Дубинин Е.В., Ефремов С.П., 1993. Эмиссия метана из болот Западной Сибири. Доклады Академии Наук., 330, № 3. с. 388-390.
5. Семенов A.M., Ботвинко И.В., Стейли Дж Т., 1993. Экзополисахариды бактерий рода Ancalomicrobium. Микробиология, т. 62. № 2. с. 249 - 252.
6. Низовцева ДВ., Семенов A.M., Паников НС., 1994. Целлюлазная активность торфяно-болотистой почвы при разных температурах. Микробиология, т 63. № 5. с 897 -901
7. Семенов A.M., Низовцева Д.В., Паников Н.С., 1995 Влияние температуры и минеральных элементов на целлюлазную активность и развитие микромицетов в образцах торфа из верхового болота. Микробиология, т. 64. № 1. с. 97 - 103.
8. Низовцева Д.В., Семенов A.M., Паников Н.С, 1995. Влияние влажности на целлюлазную активность микроорганизмов в верховом болоте. Микробиология. Т. 64. № 6. с. 841 - 846.
9. Semenov А М; Batomunkueva В Р; Nizovtseva D V; Panikov N S., 1996. Method of determination of cellulase activity in soils and in microbial cultures, and its calibration. J of Microbiol Methods, v.24: 259-267.
10. Семенов A.M., Низовцева Д.В., Паников Н.С. 1997. Целлюлазная активность в верховых болотах и прилегающих автоморфных почвах. Почвоведение. № 1. с. 64 - 68.
11. Паников Н. С., Низовцева Д.В., Семенов А.М., Сизова М.В., 1997. Динамика дыхательной активности микроорганизмов в верховом болоте и прилегающей автоморфной почве. Микробиология, т. 66. № 2. с. 160 - 164.
12. Сембнов A.M., Куличевская И.С., Халимов Э.М., Гузев B.C., Паников Н.С., 1998 Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов - деструкторов нефти. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 34. № 5. с. 133-139.
13. Van Brüggen А.Н.С., Semenov, А. М., 1999. A new approach to the search of indicators of root disease suppression. Austral-Asian Plant Pathol., 28:4-10.
14. Semenov A.M., van Brüggen A.H.C. and Zelenev V.V., 1999. Moving waves of bacterial populations and total organic carbon along roots of wheat. Microbial Ecology, 37:116-128
15. Van Brüggen A.H.C., Semenov A.M, Zelenev V.V., 2000. Wave-like distributions of microbial populations along an artificial root moving through soil. Microbial Ecology, 40:250-259.
16. Zelenev V.V., van Brüggen A.H C., and Semenov A.M., 2000. "BACWAVE", a spatial-temporal model for traveling waves of bacterial populations in response to a moving carbon source in soil. Microbial Ecology, 40:260-272.
17. Van Brüggen A.H.C., Termorshuizen A.J., Semenov A.M., 2000. Hyphal growth and colony expansion. New Phytologist, 146:355- 356.
18. Pokarzhevskii A D., Van Straalen N.M., Semenov A.M., 2000. Agar as a medium for removing soil from earthworm guts. Soil Biol. Biochem., 32:1315-1317.
19. Van Brüggen A.H.C., Semenov A.M., Zelenev V.V., 2001. Consequences of running waves of microbial populations in the rhizosphere for infection by root pathogens. J. Russian Phytopathol. Soc., 2:1-7.
20. Van-Bruggen A.H.C., Semenov A.M., Zelenev V.V., 2002. Wavelike distributions of infections by an introduced and naturally occurring root pathogen along wheat roots. Microbial Ecol., 44:30-38.
21. Семенов B.M., Семенов A.M., Ван Бругген A.X.K., Феррис X., Кузнецова T.B. 2002. Трансформация азота почвы и растительных остатков сообществом микроорганизмов и микроскопических животных. Агрохим., N1. с. 5-11.
22. Semenov A.M., Van Brüggen A.H.K., Kunenkova N.N., Franz E., Semenova E.V., Mikhailovich V.M., Sobolev A.Yu, Lapa S.A., Solodovnikov Yu.P., Sayler R. J., Romling U., Netrasov A.I. 2004. Experiments for the risk analysis of the spread of enteropathogens in the environment within the microbial cycle. Труды Второй Международной Научной Конференции "Биотехнология -охране окружающей среды " (к 250-летию Московского i осударственного университета им. М.В. Ломоносова) Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 25-27 мая 2004 г. с. 163-168
23. Zelenev V.V, R. Berkelmans, А. Н. С. van Brüggen, Т. Bongers and А. М. Semenov. 2004. Daily changes in bacterial-feeding nematode populations oscillate with similar periods as bacterial populations after a nutrient impulse in soil. Applied Soil Ecology. 26:93-106.
24. Zelenev V.V., A.H.C. van Brüggen, and A.M. Semenov., 2004. Short-term Wave-like Dynamics of Bacterial Populations in Response to Nutrient Input fiom Fresh Plant Residues in Soil. Microb. Ecol. http://www.springerlink.com/index/l 0.1007/s00248-003-1054-3
25. Zelenev V.V., A.H.C. van Brüggen, and A.M. Semenov., 2005. Modelling Wave-like Dynamics of Oligotrophic and Copiotrophic Bacteria along Wheat Roots in response to nutrient input from a growing root tip. Ecological Modeling. (Accepted in January 2005).
26. Zelenev V.V., van Brüggen A.H.C., Leffelaar P.A., Bloem J., Semenov A.M., 2005. Oscillating dynamics of bacterial populations and their predators in response to fresh organic matter added to soil: the simulation model 'BACWAVE-WEB'. Soil Biol, and Biochem. (Accepted in January 2005).
27. Van Diepeningen A.D., De Vos 0., Zelenev V.V., Semenov A. M., and Van Brüggen A.H.C.. 2005. "DGGE fragments oscillate with or counter to fluctuations in cultivable bacteria along wheat roots". Microb. Ecol. (Accepted 4-05-2005. Manuscript Ш MECO-2005-0012.R1).
Патент
Мартыненко В И., Бондарев Ю.П. Кузнецова Н.Ф., Толмачева H.A., Семенов А.М , Шильцова МА. 1998. Биостимулятор роста растений «Симбионт - Универсал» и сообщество микроорганизмов. Патент № 2100932 на изобретение. Зарегистрирован в государственном реестре изобретений 10. 01.1998 г.
Тезисы конференций
1. Семенов A.M. 1989. Явление лимитирования и ингибирования роста у олиготрофов. Тез. докл. всес. конф. "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов".
12-14 дек. 1989. Пущино. стр. 81
2. Semenov A.M., 1989. Physiological basis of oligotrophy of Polyprosthecate bacteria. Abstr. of the Fifth Int. Symp. on Microb. Ecol. (ISME 5). 27 Aug.- 9 Sept. 1989. Kyoto. Japan, p. 203.
3. Семенов A.M, Низовцева Д.В., 1993. Целлюлазная активность новых штаммов микромицетов, изолированных из торфяно-болотистой почвы олиготрофного болота Тезисы докладов конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами». 26 - 27 окт 1993 г. М. с. 96.
4. Куличевская И.С., Гузев B.C., Семенов A.M. 1994. Популяционная динамика углеводородокисляющих микроорганизмов, интродуцярованных в загрязненную нефтью почву. Тез. докл. конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду". 17-19 мая 1994. М. ИНМИ РАН. с. 59.
5. Куличевская И.С., Семенов A.M., Паников Н.С., 1994. Популяционная динамика клубеньковых бактерий в ризоплане люцерны в зависимости от условий выращивания инокулята. Тез. докл. Конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду". 17-19 мая 1994. М. ИНМИ РАН. с. 59 - 60.
6. Semenov A.M., Nizovtseva D.V., 1994. Factors, determining high cellulolitic activity of microorganisms during breakdown of mosses sphagnum residuals. Abstr. of 7-th Intern. Congr. of Bacteriol. and Appl. Microbiol. Div. Prague. Czech. Rep. July 3rd-8th. 1994. p. 410.
7. Semenov A.M., Nizovtseva DV., Panikov N.S., Kulichevskaya I.S., 1995. Determination of cellulase activity during decomposition of plant litters in soil. Standardization of methods. Abstr. of Conf. "Driven by Nature. Plant litter Quality and Decomposition". Wye College, Univ. of London. Sept. 17-20.1995. p. 33.
8. Semenov A.M., Van Bruggen A.H.C., Hu.S„ Maloney P.E., 1997. Dynamics of different trophic groups of bacteria and soluble carbon and nitrogen after cover crop incorporation. Abstr. of the 97-th General Meet, of ASM. May 4-8,1997. Miami Beach, p. 400.
9. Van Bruggen A.H.C., Semenov A.M., Hu.S., Grunvald N.J., Maloney P.E., 1997. Microbial succession in relation to cover crop decomposition and soluble nitrogen in soil. Abstr. of the 97-th General Meet, of ASM. May 4-8,1997. Miami Beach, p. 400.
10. Semenov A.M., Van Bruggen A.H.C., Zelenev V.V., 1999. 'Wave-like' patterns of heterotrophic bacteria and organic carbon along wheat roots. Abstr. of the 99-th General Meet, of ASM. May 30-June 3,1999. Chicago, p. 491.
11. Van Bruggen A.H.C., Semenov A.M., Zelenev V.V., 1999. Modeling of Wavelike Spatial Distribution of Microorganisms and Substrate along Roots. Abstr. of the 99-th General Meet of ASM. May 30-June 3,1999. Chicago. USA. p. 491.
12. Семенов A.M., Ван Бругген A.X.K., Зеленев B.B., 2001. Феномен волнообразного развития сапротрофных и фитопатогенных микроорганизмов в ризосфере в общей экологической концепции «Нарушения экосистем и осцилляции микробных сообществ». Тезисы докладов Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в XIX - XXI веках» 14-19 июня 2001 г. Санкт-Петербург 2001г. с. 72-73.
13. Семенов AM, Ван Бругген А.Х.К., Городецкая Л.В., Семёнова Е.В. 2001. Система для непрерывной селекции микробных сообществ с биоконтролирующими свойствами корневых патогенов. Тезисы докладов Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в XIX - XXI веках». 14-19 июня 2001 г. Санкт-Петербург 2001г. с. 73-74.
14. Semenov A.M., Van Bruggen A.H.C., Ferris H., 2001. Could oligotrophic bacteria be a source of slow-release nitrogen in soil? Abstract of Ninth Int. Symposium on Microbial Ecol (ISME-9) August 26-31,2001. Amsterdam, The Netherlands, p. 126.
15. Van Bruggen A.H.C., Semenov A.M , 2001. Relation between oligotrophic copiotrophic bacterial colonies on agar plates and direct microscopic counts during initial stages of cover crop decomposition
in soil. Abstract of Ninth Int. Symposium on Microbial Ecol. (ISME-9). August 26-31, 2001. Amsterdam, The Netherlands, p. 126.
16. Zelenev V.V., Van Bruggen A.H.C., Semenov A.M., 2001. Modeling of wave-like dynamics of oligotrophic bacteria along wheat roots in response to nutrient Input from a growing Root tip. Abstract of Ninth Int. Symposium on Microbial Ecol. (ISME-9). August 26-31, Amsterdam, The Netherlands, p. 126.
17. Van Diepeningen A.D., de Vos O.J., Semenov A.M, Zelenev V.V., van Bruggen A.H.C., 2002. Moving waves of bacteria along roots of wheat. Abstract. Nederlands Tijdschrift voor. Medische Microbiologie. Supplement bij Tiende Jaagang, April 2002. Papendal, 9-10 April. 2002. S 42.
18. Семенов A.M., Ван Бругген A.X.K., Зеленев В.В., 2002. Волнообразное развитие сапротрофных и фитопатогенных микроорганизмов в почве и ризосфере в обще экологической концепции, «нарушения экосистем и осцилляции микробных сообществ». Тез. докл. Перв. съезда микологов России. 11-13.04. 2002. Москва, с. 81.
19. Semenov A., Van Bruggen A., Mikhailovich V., Solodovnikov Yu., Semenova E., 2003. Molecular Biotechnology for Research of Microbial Cycle in Environment Abstracts of First International and National Symposium on Biotechnology. Secretariat. Biotechnology. University of Sindh, Jamshoro. Pakistan. 2003. March 22-23. p. 31-32.
20. Van Diepeningen A.D., de Vos O.J., Semenov A.M., Zelenev V.V., van Bruggen A.H.C., 2003. "Moving waves of bacterial populations along of roots of wheat". Symposium on "Structure and Function of Soil Microbiota". Philipps-University. Marburg, Germany. September 18 - 20, 2003. p. 180.
21. Semenov A.M., Van Bruggen A.H.C., Van Diepeningen A. D., Zelenev V.V., DeVos O., 2003. The new dynamic concept in rhisosphere ecology. Abstract of 11-th International Congress on Molecular Plant Microbe Interactions. July 18-26, 2003. St.-Peteisburg, Russia, p.314.
22. Семенов A.M., Ван Бругген A.X.K., Куненкова H.H., Семенова Е.В., Нетрусов А.И., 2004 Судьба генно-инженерных штаммов при многоступенчатой интродукции в природные субстраты. Материалы Международной конференции 26-28 мая 2004 г., Минск, Белоруссия, В сб. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». М 2004. с. 161-163.
23. Семенов А.М. 2005. Круговорот микроорганизмов в наземных экосистемах. Тез. докл. Конференции «Биосферные функции почвенного покрова, посвящ. 100-летаю со дня рожд. чл-корр. АНСССР В.А Ковды». 15-17 февраля 2005 г. Пущино. с. 86.
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 18.08.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл 3,0 Тираж 100 экз. Заказ 484 Тел. 939-3890. Тел /Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
5 î
i t
i
»
РНБ Русский фонд
¡51*' 2006-4
11691
-
Семенов, Александр Михайлович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.07
- Формирование микробного сообщества и фунгистазиса чернозема выщелоченного в условиях агрофитоценозов
- Гетеротрофные микроорганизмы в почвах искусственных лесных биогеоценозов южнотаежной подзоны Красноярского края
- Сравнительная оценка микробоценоза почв в ризосфере Zea mays в условиях монокультуры и в севообороте на разных агрохимических фонах
- Микробная сукцессия в почве
- Мультисубстратное тестирование почвенных микробных сообществ
