Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная переработка целлюлозосодержащего органического сырья в водород

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная переработка целлюлозосодержащего органического сырья в водород"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Биологический факультет

на правах рукописи

САДРАДЦИНОВА ЭЛЬМИРА РАМИЗ-КЫЗЫ

МИКРОБНАЯ ПЕРЕРАБОТКА ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО ОРГАНИЧЕСКОГО СЫРЬЯ В ВОДОРОД

03.02.03 - Микробиология 03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

2 5 НОЯ 2010

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович

доктор биологических наук Кожевникова Алла Николаевна

кандидат химических наук Скляр Владимир Ильич

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино, Московская область

Защита состоится 2010 г. в /У на заседании диссертационного

совета Д.501,001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «2|» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На сегодняшний день одной из глобальных проблем для человечества является поиск новых альтернативных источников энергии, так как современные способы ее получения путем переработки горючих полезных ископаемых (нефть, газ, каменный уголь) приводят к серьезному загрязнению окружающей среды, а цены на топливо неизбежно растут. Следовательно, становятся актуальными исследования, связанные с поиском и разработкой новых энергетических технологий, таких, как получение энергии с помощью возобновляемых источников (солнечная, энергия ветра, воды и т.д.). Одним из перспективных направлений в этой области является получение энергии путем сжигания водорода (Das and Veziroglu, 2001).

По оценкам экспертов, водород является весьма перспективным экологически чистым топливом будущего (www.biohydrogen.nl). Выбор водорода как энергоносителя определяется не только его исключительно высокой теплотой сгорания, но и практически неисчерпаемыми запасами сырья для его производства. Однако развитие водородной энергетики связано, в первую очередь, с поиском экономичных способов получения водорода. Все более многообещающими в данной области становятся микробиологические методы получения этого вида топлива. В связи с этим появился даже специальный термин — «бповодород», которьim называют водород, полученный биологическим путем (т.е. с помощью микроорганизмов, например, бактерий). Запасы водорода, связанного в органическом веществе и в воде, практически неисчерпаемы. Поэтому исследования, посвященные получению биоводорода, в первую очередь направлены на использование в качестве исходного сырья органических отходов, количество которых неизбежно возрастает (Soetacrt and Vandamme, 2009).

В последние 10-15 лет биоэнергетика стала самостоятельной отраслью Большой энергетики, и во всем мире, включая Россию, ведутся активные исследования в области получения альтернативных источников энергии, в частности водорода, с помощью микроорганизмов. Исходя из вышеизложенного, исследования, посвященные поискам и разработкам систем получения топливного водорода с помощью микроорганизмов из возобновляемых растительных отходов (целлюлозы), следует считать крайне актуальными и своевременными.

Исследования проведены при финансовой поддержке федеральной целевой программы Министерства образования и науки Российской Федерации «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы в рамках реализации проекта «Проведение поисковых научно-исследовательских работ по направлению

«Производства топлив и энергии из органического сырья», ГК №П558, а так же при поддержке европейского гранта РР6 «НууоМюп» БЕв-б № 019825.

Цель работы. Основной целью данной работы является разработка мембранной биореакторной системы для получения водорода из целлюлозосодержащего органического сырья.

Достижение данной цели предполагало решение следующих задач:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов водорода, способных эффективно разлагать целлюлозосодержащее органическое сырье в анаэробных термофильных условиях;

- разработка мембранных модулей для отделения водорода из среды ферментации и оценка эффективности сепарации газов;

- интеграция мембранного модуля в ферментационную систему для переработки органического сырья в биоводород;

- разработка фототрофного биореактора для переработки продуктов первичного разложения органического сырья в водород.

Научная новизна. В работе впервые рассмотрены и предложены:

- сочетание термофильного и фототрофного анаэробных биореакторов, для непрерывного образования биоводорода при утилизации целлюлозосодержащих органических отходов;

- использование полимерных мембран для непрерывного извлечения биоводорода из культуральной жидкости в сконструированном мембранном блоке сепарации, работающем на границе раздела двух фаз (газа и жидкости);

- сочетание мембранного блока сепарации и биореакторов в одной установке, обеспечивающих эффективный процесс утилизации целлюлозосодержащих органических отходов с образованием топливного биоводорода.

Практическая значимость. Полученные в результате проведенных исследований сведения могут быть применены для разработки в дальнейшем установок для получения водорода за счет двухстадийного процесса сбраживания целлюлозы, который может быть затем очищен до степени технической чистоты с помощью мембранных газоразделяющих систем.

Подобные установки могут быть смонтированы в любой точке страны, где имеются растительные ресурсы или органические отходы для переработки, с получением водорода в качестве энергоносителя для целей локальной энергетики.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях: 3-ем Московском международном конгрессе «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (март 2006, Москва), 3-ем российско-французском семинаре «PICS» (октябрь 2006, Москва), «Регшеа-2007» (сентябрь 2007, Шиофок, Венгрия), "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (декабрь 2007, Москва), 11-я научная конференции "Экосистемы, организмы, инновации-П" (июнь 2009, Москва), «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (декабрь 2009, Москва), «Биотехнология: экология крупных городов» (март 2010 г., Москва), EurAsiaBio-2010 (Москва, апрель 2010 г.), «Регшеа-2010» (сентябрь 2010, Словакия).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, 4 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 8 тезисов докладов на международных и российских конференциях и получен 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (129 литературных источников, из которых 37 отечественных и 92 иностранных). Работа изложена на 115 страницах, содержит 19 таблиц и 52 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Для выделения сообществ целлголозолитических микроорганизмов, способных активно образовывать водород при разложении целлюлозосодержащего органического сырья производили отбор следующих образцов из различных экологических ниш, в которых теоретически возможен данный процесс: нл закрытого пресного водоема, разложившиеся образцы камыша (прикорневая часть, корни), опад полуразложившейся листвы из лесного водоема, содержимое кишечника различных видов тараканов (американского, мадагаскарского, черного, туркестанского), содержимое кишечника термитов, дождевой червь (целиком, включая содержимое кишечника), образцы

компостированного жома красного и белого винограда (из различных резервуаров), образцы химуса толстого кишечника антилопы Гну, зебры, жирафа, черной антилопы, пони, слона, пулировамные пробы навоза коров, образцы содержимого горячих гейзеров из Долины гейзеров на полуострове Камчатка и т.д. Пробы отбирали в различные температурные сезоны, в анаэробные герметичные флаконы. Всего было отобрано более 42 образцов. Культивирование вели на двух типах питательных сред.

Для решения поставленных задач по второму (световому) этапу преобразования целлюлозы в водород из коллекции кафедры микробиологии МГУ была подобрана культура фототрофных микроорганизмов Rhodobacter capsulatus В 10, использующих продукты первой стадии разложения целлюлозы (ацетат и лактат), как самый эффективный продуцент водорода из числа исследованных культур (Зотова, 2004).

Культивированнс. Выделение сообществ водородобразующих целлюлозолитиков проводили на двух средах: среде Имшенецкого для выделения анаэробных целлюлозолитиков состава (г/л): NaNH4P04 - 1,5;К2НР04 - 0,5;КН2Р04 - 0,5;MgS04 * 7Н20 -0,4;NaCI - 0,1; MnS04 * 4Н20 - следы; Fe S04 * 7Н20 - следы; СаСОз - 2,0; пептон - 5,0. pH среды-7,0 - 7,2 до стерилизации;

и среде DSM 640 состава (г/л): NH4C1 - 0,9; КН2Р04 - 0,75; К2НР04 - 1,5; дрожжевой экстракт («Difco») — 1,0; цистеин (в виде 25%-го раствора) -2 мл/л, микроэлементы -1 мл/л. Раствор микроэлементов имел следующий состав (мг/л): FeCI2 х 4 Н20 - 1,5; ZnCl2 - 70,0; MnCI2 * 4Н20 - 100,0; Н3В03- 6,0; СоС12 * 6 Н20 - 190,0; СиС12 * 2 Н20 — 2,0; NiCl2 * 6 Н20 — 24,0; Na2Mo04 * 2 Н20 — 36,0; Na2W04 -15,0; Na2Se03 х 5Н20 -15,0.

В качестве источников углерода использовали фильтровальную бумагу в количестве 15,0 г/л или целлобиозу в количестве 7,5 г/л. Растворы цистеина и микроэлементов готовили отдельно и добавляли непосредственно перед засевом. Степень анаэробное™ среды отслеживали но изменению окраски раствора резазурина (0,15 г/л), который добавляли в количестве 1 мл/л.

Для культивирования применяли модифицированную технику Хангейта (Митрофанова, 1995). Объем посевного материала составлял 10% от общего объема среды. Культивирование образцов вели при двух температурных режимах - 60°С и 70' С в условиях перемешивания на качалках (фирмы New Brunswick) с частотами вращения 35 и 50 об/мин.

Культивирование клеток Rb. capsulatus BIO проводили на модифицированной среде Ормерода не содержащей связанного источника азота следующего состава (г/л): СаС12 -0,075; MgS04*7H20 - 0,2; FeS04*6H20 - 0,012; ЭДТА - 0,02; лактат натрия (в виде 10%го раствора) - 0,1, дрожжевой экстракт (в виде 10%го раствора) - 0,01, микроэлементы - 1 мл/л. Раствор микроэлементов имел следующий состав (г/л): Н3ВО4 - 2,8; MnS04*7H20 - 2,1;

Na2Mo04*2H20 - 0,75; ZnS04*7H20 - 0,24; Cu(N03)2*3H20 - 0,04. Буферный раствор добавляли в объеме 15 мл/л, состав буфера - (г/л): КН2Р04-4,0; К2НР04- 60.

Посевной материал вносили в объеме 10% от общего объема среды (для выращивания планктонной культуры).

В качестве источника азота в данной среде использовали газообразный азот и одновременно этим создавали анаэробные условия. Бактерии выращивали при температуре 27" - 30°С, в условиях периодического и проточного культивирования в герметичных стеклянных флаконах объемом 120 мл, содержащих 50 мл среды или в двублочном биореакторе общим объемом 5 л.

Иммобилизация клеток. Для иммобилизации клетки предварительно выращивали до достижения стационарной фазы роста. Далее клетки отделяли от питательной среды центрифугированием (5000g, +4°С, 25 мин). Полученную биомассу суспендировали в 8% растворе ПВС в массовом соотношении 1:20. Суспензию раскапывали в стерильные планшеты и замораживали при -18°С, затем медленно оттаивали при °€5 Полученные гранулы переносили в свежую питательную среду.

Изучение морфологии клеток. Морфологию клеток изучали методами световой и электронной микроскопии. Окраску по Граму проводили согласно общепринятой методике (Нетрусов, 2005). Эффект биофоулинга мембран, а также детальное изучение морфологии клеток полученных культур проводили на сканирующем электронном микроскопе JEOL -JSM-6380LA (Япония). Препараты для электронной микроскопии фиксировали по стандартной методике. В качестве материала напыления использовали золото и платину.

Определение продуктов брожения. Состав газовой фазы определяли с помощью метода газовой хроматографии, на хроматографе Кристалл 2000 М (Россия) с катарометром, оснащённым угольной колонкой 1000 х 2,5 мм - газ-носитель - аргон, температура термостатата колонок - 150°С. Данные, полученные при проведении хроматографического анализа обрабатывали на компьютере с помощью программного обеспечения Chromatec Analytic 2.5 (Россия).

Концентрацию газа измеряли при атмосферном давлении. Избыточное давление во флаконах, образовавшееся во время культивирования, измеряли манометром и учитывали при подсчете конечной концентации продукта.

Для определения состава летучих жирных кислот (ЛЖК - ацетата, пропионата, бутирата и др.) в культуральной жидкости в качестве продуктов брожения использовали метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на приборе Кристалл 2000 М (Россия), оснащённом микрокапилярной колонкой Zebron ZB- FFAP (15м х 0,32 мм * 0,50 мкм). Газ -носитель — аргон, расход газа - 15 мл/мин, детектор - ПИД, температура детектора - 200°С.

Измерения проводили в условиях температурного градиента в термостате от 70 до 160°С. Результаты хроматографии были обработаны при помощи программного обеспечения Chromatec Analytic 2.5 (Россия).

Для определения концентрации глюкозы и молочной кислоты использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Измерения проводили на приборе «Аквилон» с УФ-детектором (Россия). В качестве подвижной фазы использовали бидистшшированную воду, которую доводили до значения pH 3,5 концентрированной серной кислотой (чда). Скорость потока элюента - 0,5 мл/мин. Разделение вели на колонке С18 (250x4,6 mm) Luna, производитель - PHENOMENEX (USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка процесса термофильного сбраживания целлюлозы с образованием водорода. Первым этапом исследований стало определение возможных источников выделения требуемых микроорганизмов, подбор оптимальных условий роста продуцентов и исследование продуктов темновой ферментации целлюлозы как субстрата.

Из естественных источников обитания (гниющий стог сена, лиственный опад, ил со дна пруда, термальные источники, образцы почвы, а также симбионтная микробиота животных и насекомых) получена серия накопительных культур целлюлозолитических микроорганизмов (всего было выделено 42 термофильных микробных сообщества), образующих водород и смесь продуктов метаболизма, выделяемых в среду культивирования. В процессе работы отбирали микробные ассоциации, образующие максимальное количество водорода. Культивирование отобранных образцов продолжали па протяжении 168 часов при 60 и 70°С на среде с целлюлозой (фильтровальная бумага) в качестве субстрата.

В результате стало возможным сравнение полученных сообществ по количеству образованного водорода (рис. 1).

Как видно из представленных диаграмм, наиболее продуктивными оказались сообщества № 4, 8, и 9, то есть симбионтная микробиота пищеварительного тракта животных (корова и пони) и образцы донных осадков пресного водоема. При изучение диаграмм видно, что образование водорода сообществами при 60° С превосходит в 2-3 раза продукцию при 70" С, по этой причине дальнейшее культивирование вели при 60" С. Следует отметить, что сообщество 4, являющееся симбионтной микробиотой пищеварительного тракта коровы, предпочтительнее для процесса, вследствие большего выхода водорода. Одновременно накопительная культура проявила себя более устойчивой. Она характеризуется хорошим ростом на подобранной среде и отличается более активным разложением субстрата.

Температура культивирования 60°С

240 220 200 180 1 160 « 140

Э 120 | 100 § во | 60 40 20 О

и

1

1

и

1

I

1 t

_ г-

Г Г-ЙЯ 1

5 6

Сообщества

Температура культивирования 70°С

| ЕН2 DC02 |

Сообщества

IBH2DC02]

Рисунок 1. Сводные диаграммы образования газов наиболее активными выделенными сообществами на среде Имшенецкого с целлюлозой в качестве субстрата при 60°С и 70°С. Сообщества 1-3 - образцы целлюлозосодержащих органических отходов, сообщества 4-8 -симбионтная микробиота пищеварительного тракта жвачных животных и насекомых, сообщество 9 - донные осадки пресного водоема.

Параллельно были изучены продукты брожения целлюлозы в культуральной жидкости двух наиболее активных сообществ (№4 и №9) с учетом разницы мест отбора исходных образцов и двух различных сред культивирования при 60°С (Имшенецкого с целлюлозой и DSM 680 с целлобиозой, табл. 1).

Таблица 1.

Продукты разложения целлюлозы сообществами при культивировании в течение 168 ч (в мМ).

Сообщества Субстрат Лактат Ацетат Пропионат Глюкоза н2

4 Целлюлоза 30,4 8,2 0,2 0,1 51,6

9 Целлюлоза 23,1 13,6 0,0 0,6 46,7

4 Целлобиоза 29,9 21,3 0,0 26,4 65,6

9 Целлобиоза 36,8 16,9 0,0 10,3 47,2

При анализе продуктов разложения целлюлозы консорциумами анаэробных термофильных микроорганизмов было установлено, что основными продуктами гидролиза и переработки целлюлозы сообществами, помимо водорода, являются уксусная и молочная кислоты. Следует также отметить высокий уровень образованной в результате действия анаэробных целлюлаз глюкозы, накапливаемой анаэробными и термофильными консорциумами на среде 2 (таблица 1).

Подобный состав продуктов брожения (таблица 1) является предпочтительным в процессе производства водорода из органического сырья, так как уксусная и молочная кислоты являются прекрасным субстратом для Нг-образующих аноксигенных пурпурных фототрофных бактерий.

В работе также была исследована способность использования в качестве единственного источника углерода не только чистой целлюлозы, но и различных органических целлюлозосодержащих субстратов, и образования из них водорода выделенными консорциумами (рис. 2 и 3).

15 10 5 1

Концентрация субстрата, г/л

Рисунок 2. Образование водорода сообществом 4 при росте на пшеничных отрубях (при 60°С за 24 ч). На диаграмме столбцами обозначено общее количество образованного водорода, а линейной зависимостью отображено отношение образованного водорода к концентрации субстрата в каждой точке, то есть продуктивность сообщества.

Отмечено, что наиболее эффективная конверсия происходит при росте сообщества на отрубях с концентрацией субстрата в среде 5 г/л. Также изучали сравнительную продуктивность данного сообщества при росте на фильтровальной бумаге и древесных опилках (рис. 3). Опилки перед использованием не подвергали специальной обработке для увеличения доступности субстрата микроорганизмам.

15 10 5 1

Концентрация субстратов, г/л | »фильтровальная бумага □ опилки |

Рисунок 3. Сравнение образования водорода сообществом 4 при росте на разных субстратах (при 60°С за 168 ч). Опилки вишневого дерева (размер частиц опилок 0,1 -3 мм).

Установлено, что при повышении концентрации фильтровальной бумаги образование водорода также увеличивается, однако на древесных опилках при увеличении концентрации субстрата выше 10 г/л выход водорода не растет. В результате сравнения продуктивности водорода сообществами на фильтровальной бумаге и опилках показано, что образование водорода на бумаге в 5 раз превосходит образование водорода на опилках. Однако показательно, что при всей сложности естественного субстрата, полученное активное сообщество способно его разлагать и при этом образовывать водород.

При росте сообщества 4 на целлюлозосодержащей печатной продукции (рис. 4) было показано, что наибольшее выделение водорода наблюдается при росте на журнальной мелованной бумаге.

8й' Е 25 * 20 к 1 15 <0 £ 10-X £ 51 о-

-

газетная бумага журнальная бумага Тип бумаги

□ белая бумага 0 черно-белая печать В цветная печать

Рисунок 4. Образование водорода сообществом 4 при росте на разных типах бумаги (при 60"С за 336 ч)

Для наиболее активных сообществ также показано стабильное образование водорода при длительном культивировании консорциумов (рис 5).

Рисунок 5. Динамики образования водорода наиболее активньми накопительными культурами на целлюлозе в течении длительного времени (более 4000 часов) при периодическом режиме культивирования. Сообщество 3 - образец слоновьего навоза, сообщество 4 - образец коровьего навоза, сообщество 6 - образец коровьего навоза (другой экземпляр), сообщество 7 - образец навоза черной антилопы, сообщество 8 - образец навоза пони, сообщество 9 - образец донных осадков пресного водоема.

Помимо продуктивности, крайне интересным является вопрос о составе полученных сообществ и определении групп микроорганизмов, образующих данные консорциумы. Проведенный ОООЕ-анализ сообщества 4 позволил определить видовой состав последнего (рис. 6)

Я/та'си.'ез

ШгтсзпэяиЬзйейит г/зг!0>/!к:ип]^Щ172 (67с|0№;)

ПетоапаегоЬас1ет1а РагпПу III

_ж

к'СЬУгк/щг?; N11026105

СЫШсеае

-СМкйа 5айет К54-1_АГ4К7и -1 ОШдгоир

Рисунок 6. Результат секвенирования наиболее доминирующих групп микроорганизмов в сообществе 4. Масштаб - 5 нуклеотидных замен на 100 оснований.

Как видно на рис. 6, большинство различных фрагментов ДНК были идентифицированы с одним родом микроорганизмов, который очевидно является сильно преобладающим в сообществах. Этим родом является Thermoanaerobacterium. Микроорганизмы преоболадающего рода, идентифицированные по участкам ДНК, очевидно несколько различаются на уровне штаммов или видов. Точнее анализ может быть сделан с помощью клонирования, хотя его применение позволит лишь детализировать картину и получить некоторые уточнения. Очевидно, что преобладающие формы уже выявлены.

Помимо указанного рода, в сообществах значительное место занимали представители рода Clostridium.

2. Фототрофная мезофильная стадия ферментации продуктов анаэробного разложения целлюлозы. На втором этапе работы были проведены исследования по способности фототрофных микроорганизмов использовать продукты темновой стадии разложения целлюлозы для образования водорода. Для этого была выбрана культура Rb. capsulatus В10, как самый эффективный продуцент водорода. В качестве субстрата в работе использовали лактат. Выбранная культура по производительности, количеству накопленного водорода на единицу объема среды и по удельной продуктивности процесса заметно опережала другие культуры из числа исследованных пурпурных фототрофных бактерий (Зотова, 2004). Для стабилизации клеток в стационарной фазе развития, а также с целью упрощения процедуры замены питательной среды в реакторе, была проведена иммобилизация клеток в криогель ПВС.

Культивирование иммобилизованных клеток продолжали на протяжении более чем 360 суток (рис. 7).

Установлено, что биокатализатор не теряет своих свойств на протяжении длительного периода культивирования (рис. 7). Клетки сохраняют способность к быстрому образованию водорода, что важно с биотехнологической точки зрения по дальнейшему применению метода. Более того, процесс характеризуется стабильностью и увеличением производственных параметров на протяжении времени. Была получена максимальная скорость образования водорода иммобилизованными клетками при периодическом культивировании в 247 мМ/ч*л матрицы иммобилизующего носителя (что соответствует 5528мл/ч*л*матрицы, патент РФ на изобретение № 2323975).

Рисунок 7. Динамика изменения скорости образования водорода иммобилизованными клетками Rb. capsulatus BIO в течение 360 суток периодического культивирования.

Помимо свойств непосредственно иммобилизованного биокатализатора, важную роль в реализации технологических и экономических преимуществ играет выбор условий культивирования иммобилизованных клеток, осуществляющих биокаталитические процессы. В связи с этим в работе проведено сравнение процесса образования водорода иммобилизованными клетками пурпурных бактерий Rb. capsulatus BIO в условиях периодического и проточного культивирования. Для этого был сконструирован двублочный фотобиореактор с различными способами закрепления биокатализатора внутри его блоков и проведена новая иммобилизация клеток в криогель поливинилового спирта.

Биореактор представляет собой 2 цилиндра, объемом по 2,5 л, содержащих по 2 л среды (рис. 8, а). Гранулы иммобилизованных клеток в первом цилиндре в количестве 330 штук находятся в карманах полипропиленовой сети, зафиксированной на рамке из органического стекла (рис.8, б). Второй цилиндр представляет собой систему, в которой на такой же рамке закреплены нити с нанизанными на них гранулами иммобилизованных леток в том же количестве (рис.8, в). Концентрация клеток в каждом блоке реактора составила 1,34 г/л.

При исследовании динамики накопления водорода иммобилизованными клетками после каждого количественного выхода водорода на постоянные значения производили смену питательной среды на свежую.

а б в

Рисунок 8. Двублочный водородный фототрофный биореактор: а) общий вид; б) иммобилизованные клетки в первом цилиндре; в) иммобилизованные клетки во втором цилиндре.

Были рассчитаны величины максимальной продуктивности процесса накопления водорода иммобилизованными клетками в обоих блоках реактора для сравнения продуктивностей по водороду в зависимости от расположения гранул в реакторе. В качестве органического субстрата была использована молочная кислота. Результаты эксперимента отражены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели, характеризующие динамику накопления водорода иммобилизованными клетками Rb. capsulatus BIO в условиях периодического культивирования в реакторе (на объем одного блока реактора - 2 л).

Блоки реактора Максимальная продуктивность процесса накопления водорода, мМ/ч Максимальная продуктивность клеток, мМ Н2/г(белка) Максимальная удельная продуктивность клеток, мМ Нг/ч* г(белка)

1 0,19 281 11,70

2 0,05 74 3,06

Можно заключить, что продуктивнее оказались иммобилизованные клетки, зафиксированные в карманах полипропиленовой сети, по сравнению с таковой у клеток, нанизанных на полиэтиленовые нити.

3. Разработка мембранных систем сепарации газов. Третям этапом работы являлось создание системы двухстадийной переработки целлюлозы в водород с непрерывным удалением водорода из ферментационной среды при помощи уникальной мембранной технологии (рис 9).

С02

Н2

С02

Целлюлоза \

Термофильный анаэробный биореактор

Н20

Рисунок 9. Схема работы системы двухстадийной переработки целлюлозосодержащего органического сырья в водород.

Помимо подбора субстратов и условий культивирования для термофильной стадии переработки целлюлозосодержащего органического сырья, существует также проблема ингибирования процесса накопленным водородом. Для решения данной проблемы провели разработку системы непрерывного удаления водорода из культуральной жидкости на основе полимерных мембран и мембранных контакторов. Принцип работы системы может быть описан при помощи следующей схемы (рис. 10):

нг + со,

А

Целлюлоза шШШ

/ \ I;

Орг, кислоты На * СОг

(Пйктл!, ацетат)

н, + оо,

мембрана

Рисунок 10. Принципиальная схема работы системы непрерывного удаления водорода из среды культивирования.

Система представляет собой ферментер, в который интегрирована полимерная мембрана, контактирующая непосредственно со средой культивирования. Через мембрану происходит отделение газов из жидкой фазы ферментера. Технология использования

мембран в подобных целях на границе раздела газ/жидкость является уникальной и не встречается в мировой практике (Ыйгизоу е1 а1., 2010).

В работе использовали поливинилтриметилсилановые (ПВТМС) мембраны, обладающие следующими характеристиками (табл. 3):

Таблица 3.

Характеристики высокопроницаемых мембран ПВТМС-типа

Полимер Толщина селективного слоя, мкм Проницаемость (3, л/м2 ч бар

н2 С02 НгБ Ш3 Н20

ПВТМС 0,2 2700 2600 400 6400 1,5-105

Полимерная асимметричная мембрана ПВТМС не только имеет высокую газопроницаемость по исследуемым газам (Н2 и С02), но так же обладает физико-химической стабильностью. Непористая структура мембран позволяет успешно использовать их в биологических системах, так как они не подвержены механическому засорению сторонними агентами. Была показана устойчивость мембран к обрастанию микроорганизмами, а также неизменность свойств при высоких (60-70 °С) температурах (рис 11).

\

\

Рисунок 11. Микрофотографии СЭМ поверхности полимерных мембран ПВТМС после выдерживания их в ферментационной среде в течении 30 дней при 60 °С.

По истечении 30 дней пребывания мембран в среде культивирования в термофильных условиях на их поверхности не наблюдали каких-либо скоплений клеток или образования биопленок. Кроме того мембраны не изменили своих газоразделительных свойств.

На основе исследованных мембран были созданы несколько разновидностей мембранных модулей, подключаемых к установке переработки целлюлозы для получения водорода (рис. 12).

(ферментер)

Рисунок 12. Принципиальная схема работы установки разделения. Мембранный модуль, подключен к ферментеру.

В результате работы сконструированного мембранного модуля подключенного к ферментеру (рис. 12), в котором вели культивирование полученного ранее сообщества микроорганизмов №4 на среде с целлюлозой была достигнута скорость образования водорода 68 мМ/ч (что соответствует 1,52 л/ч ) при температуре культивирования 60°С в сравнении с максимальной скоростью в 20 мМ/ч, полученной при периодическом культивировании в стандартных условиях без барботирования (рис 13).

Рисунок 13. Общий вид мембранной биореакторной системы: 1 - анаэробный водородный биореактор, 2 - мембранный блок сепарации, 3 - перистальтический насос, 4 - вакуумный насос, 5 - программный контроль процесса ферментации.

Данные результаты подтверждают целесообразность применения мембранных технологий сепарации газов непосредственно из культуральной жидкости. Предложенная технология позволяет увеличить продукцию водорода, а также облегчает дальнейшую очистку газовой смеси, поступающей из реактора (отсутствует разбавление газовой смеси дополнительными компонентами, как при использовании стандартной технологии сдувки водорода инертными газами аргоном или азотом).

На основании полученных выше данных и с учетом особенностей сочетания термофильного и мезофильного анаэробных биореакторов была смоделирована лабораторная система, состоящая из двух последовательно соединенных биореакторов с узлом мембранной сепарации водорода из культуральной жидкости.

Расчетное масштабирование полученной модели до уровня энерговыделения требуемого для потребления средней семьей из трех человек, показало, что для получения энергии в 195 кВ/месяц, требуется общий объем реакторов 1,14 м3, что по площади может занимать около 3 м2. Такое количество энергоносителя затрачивается средней семьей в месяц, а анаэробный фототрофный биореактор можно использовать в качестве элемента ландшафтного дизайна.

Проведенная работа показала, что технологически возможно создание термофильной анаэробной установки разложения целлюлозы с образованием и непрерывным извлечением водорода из культуральной жидкости. Образованные в темновом процессе брожения кислоты могут быть с высокой эффективностью преобразованы в водород и углекислоту фототрофными аноксигенными пурпурными бактериями, иммобилизованными в матрице ПВС. Полученная в результате энергия в виде водорода может быть использована для целей локальной энергетики.

выводы

1. Выделены активные микробные консорциумы микроорганизмов, разлагающие целлюлозу в термофильных условиях (60-70° С) с образованием водорода и жирных кислот, в основном лактата и ацетата.

2. Показана возможность использования иммобилизованных клеток несерных пурпурных фототрофных бактерий для активной переработки продуктов разложения целлюлозы (смеси лактата и ацетата), образованных в темновой стадии, в водород и диоксид углерода.

3. Впервые показана возможность использования полимерных мембран на границе раздела фаз (газ/жидкость) для непрерывного извлечения водорода из термофильной среды ферментации.

4. Показана принципиальная возможность объединения процесса термофильного разложения целлюлозы водородобразующими сообществами с узлом мембранной сепарации водорода из культуральной жидкости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Патент

1. Садраддинова Э.Р.. Зотова Н.А., Ефременко Е.Н., Нетрусов А.И. "Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий для получения водорода" Патент РФ на изобретение № 2323975 (10.05.2008), Бюл. № 13, приоритет от 28.08.2006.

Статьи в рецензируемых журналах

1. Гасанова Л.Г., Садраддинова Э.Р.. Нетрусов А.И., Тепляков В.В., Зенькевич В.Б., Модигель М. Мембранные биореакторы для получения горючих газов. Мембраны, 2007, № 1 (33), с. 32-42.

2. Netrusov A., Sadraddinova Е.. Abramov S., Shestakov A., Shalygin М., Teplyakov V. Membrane-assisted separation of microbial gaseous fuels from renewable sources. Desalination and Water Treatment, Volume 14,2010, p. 252 - 257.

3. Абрамов C.M., Садраддинова Э.Р.. Шестаков А.И., Нетрусов А.И., Шалыгин М.Г., Тепляков В.В. Превращение органических отходов сельского хозяйства в топливо для альтернативной энергетики. Хранение и переработка сельхозсырья, 2010, (1) с. 8-12.

4. Нетрусов А.И., Карякин А.А., Тепляков В.В., Шалыгин М.Г., Воронин О.Г., Абрамов С.М., Садраддинова Э.Р.. Митрофанова Т.Н., Шестаков А.И. Основы технологии микробиологической конверсии органических целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию через промежуточное образование биоводорода. Катализ в промышленности, 2010, 77-83.

Тезисы докладов

1. Садраддинова Э.Р.. Кочеткова Н.А., Ефременко Е.Н., Нетрусов А.И. Биокаталитическая система на основе иммобилизованных клеток Rhodobacter capsulatus для получения молекулярного водорода, 3-й Московский международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2006, с. 209.

2. Sadraddinova E.R.. Gasanova L.G., Teplyakov V.V., Netrusov A.I. The study of the process of hydrogen formation by free and immobilized cells of phototrophic and chemotrophic bacteria in batch and continuous mode of fermentation. Proceedings of 3nd French-Russian seminar PICS, Moscow, 2006, TIPS RAS, p. 102.

3. Sadraddinova E.R.. Gasanova L.G., Tcplyakov V.V., Netrusov A.I. The process of hydrogen formation by free and immobilized cells of phototrophic and chemotrophic bacteria in batch and continuous mode of fermentation suitable for gas phase membrane separation Proceedings of «Membrane science and technology conference of Visegrad countries PERMEA 2007» Hungary, 2007, p. 138.

4. Садраддинова Э.Р.. Митрофанова Т.И., Нетрусов А.И. Изучение проблемы разложения целлюлозы и получения водорода с помощью микробных технологий. Тезисы конференции "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-техиологического комплекса России на 2007-2012 годы" Россия, Москва, 2007, с. 58.

5. Садраддинова Э.Р.. Абрамов С.М., Шестаков А.И., Митрофанова Т.И., Глазунова Е.В., Шалыгин М.Г., Нетрусов А.И., Тепляков В.В. Термофильная микробная конверсия целлюлозосодержащего органического сырья и отходов в водород с использованием мембраных технологий газоразделения. Сборник материалов Всеросийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» Москва, МГУ, Макс-Пресс, 2009 с. 159.

6. Netrusov A., Shestakov A., Voronin О., Sadraddinova Е.. Abramov S., Shalygin М., Teplyakov V, Karyakin A. Green energy from organic raw materials and wastes. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (14-17 марта2010 г., Москва), с. 293-294.

7. Нетрусов А.И., Шестаков А.И., Воронин О.Г., Садраддинова Э.Р.. Абрамов С.М., Шалыгин М.Г., Тепляков В.В., Карякин А.А. Устойчивая система получения водорода и электротока при термофильной переработке целлюлозы и отходов. Сборник тезисов докладов межд. конфер. EurAsiaBio-2010 (Москва, 13-15 апреля 2010 г.), с. 136-137.

8. Netrusov A., Abramov S., Sadraddinova Е.. Shestakov A., Mitrofanova Т., Glazunova Е., Shalygin М., Teplyakov V. Thermophilic microbial conversion of cellulose-containing organic waste to hydrogen using membrane-assisted gas separation technology. Abstract book of PERMEA-2010 conference: Membrane science and technology conference of Visegrid Countries, Tatranski Matliare, Slovakia September 4-8,2010, c.97.

Подписано в печать:

13.10.2010

Заказ № 4285 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Садраддинова, Эльмира Рамиз-кызы

ВВЕДЕНИЕ.:.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Сравнение современных технологий получения водорода.

1.2 Сырье, используемое при биологическом пути получения водорода.

1.3 Структура и свойства целлюлозы.

1.4 Образование водорода фототрофными микроорганизмами.

1.5 Биореакторы, мембранные системы сепарации газов.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Разработка процесса термофильного сбраживания целлюлозы с образованием водорода.

3.1.1 Поиск и выделение микроорганизмов-продуцентов водорода, способных эффективно разлагать целлюлозо содержащее органическое сырье в анаэробных термофильных условиях.

3.1.2 Изучение морфологии выделенных сообществ.

3.1.3 Изучение роста и образования водорода выделенными сообществами при различных условиях культивирования.

3.1.4 Исследование состава выделенных сообществ с помощью метода DGGE.

3.1.5 Выделение чистых культур водород образующих микроорганизмов.

3.2 Фототрофная мезофильная стадия ферментации продуктов анаэробного разложения целлюлозы.

3.2.1 Изучение свойств биокатализатора на основе иммобилизованных клеток пурпурных бактерий Rb. capsulatus BIO.

3.2.2 Изучение процесса образования водорода иммобилизованными клетками пурпурных бактерий Rb. capsulatus В10 в условиях периодического и проточного культивирования.

3.3 Разработка мембранных систем сепарации газов.

3.3.1 Подбор и изучение свойств мембран.

3.3.2 Мембранная биореакторная система удаления водорода из среды ферментации.

4 ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробная переработка целлюлозосодержащего органического сырья в водород"

На сегодняшний день одной из глобальных проблем для человечества является поиск новых альтернативных источников энергии, так как современные способы получения необходимой энергии путем переработки горючих полезных ископаемых (нефть, газ, каменный уголь) становятся все более неэкономичными и приводят к серьезному загрязнению окружающей среды, а цены на топливо неизбежно растут. Следовательно, становятся актуальными исследования, связанные с поиском и разработкой новых энергетических технологий, таких, как получение энергии с помощью возобновляемых источников (солнечная, энергия ветра, воды и т.д.). Одним из перспективных направлений в этой области является получение энергии путем сжигания водорода.

По оценкам экспертов, водород является весьма перспективным экологически чистым топливом будущего. Выбор водорода как энергоносителя определяется не только его исключительно высокой теплотой сгорания, но и практически неисчерпаемыми запасами сырья (нефть, природный газ, сахара растительного происхождения, вода). Но реализация водородной энергетики связана, в первую очередь, с поиском экономичных способов получения водорода. Многообещающими методами получения водорода становятся микробиологические. В связи с этим появился даже специальный термин — «биоводород», которым называют водород, полученный биологическим путем (т.е. с помощью микроорганизмов, например, бактерий). Исследования, посвященные получению' биоводорода, направлены на использование в качестве исходного сырья целлюлозосодержащих отходов (опилок, стружки, травяных остатков), которые легко превращаются в сахара. В этом случае также решается проблема утилизации отходов, количество которых неизбежно возрастает.

В последние 10 — 15 лет биоэнергетика стала самостоятельной отраслью Большой энергетики, и во всем мире, включая Россию, ведутся активные исследования в области получения альтернативных источников энергии, в частности водорода, с помощью микроорганизмов. Исходя из вышеизложенного, исследования, посвященные поискам и разработкам систем получения топливного водорода с помощью микроорганизмов из возобновляемых растительных отходов (целлюлозы), следует считать крайне актуальными и своевременными.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сравнение технологий получения водорода.

1.1.1. Производство водорода из ископаемого сырья.

Основное производство водорода в настоящее время осуществляется путем парового реформинга природного газа. К примеру, в США таким способом получают 90% от общего объема производства водорода. Паровой реформинг часто используют при получении водорода из лёгких фракций углеводородов и сырой нефти. Для переработки более тяжёлых фракций, к примеру, тяжёлой нефти, наиболее часто используется метод частичного окисления (Рас1го et а1.,1999).

Процесс парового реформинга включает эндотермичную реакцию реформинга, которая представляет собой конверсию углеводородов в водород и моноокись углерода, и следующую за ней экзотермичную реакцию водно-газового замещения в течение которой, монооксид углерода обрабатывается паром, образуя при этом ещё водород и превращаясь в диоксид углерода (Ве^тап, 2007).

Реакции реформинга (Аншиц и Воскресенская 1999):

СН4 + Н20 ->СО + ЗН2 ДНг = + 205 кДж/моль

СО + Н20 С02 + Н2 ДНг = - 41 кДж/моль

Суммарная реакция

СН4 + 2 Н20 С02 + 4 Н2 ДНг = - 197 кДж/моль

Кроме того, необходимы и вспомогательные процессы, которые обычно включают возврат тепла и производство пара, извлечение получаемого водорода. Катализаторы, используемые в процессе парового реформинга очень чувствительны к содержанию серных примесей в газах. Для предотвращения отравления катализатора, предварительно должен быть проведён процесс десульфуризации сырья (Аншиц и Воскресенская 1999).

Кроме метана, и другие лёгкие углеводороды могут быть также использованы как сырьё для парового реформинга. В этом случае, как и в случае использования природного газа с высоким содержанием тяжёлых фракций углеводородов и сырой нефти, рекомендуется проводить процесс пре-реформинга, для улучшения производительности завода и экономически целесообразного использования ресурсов:

С2Н6 + Н20 —> СН4 + СО + 2 Н2 ДНг = +265 кДж/моль Одним из распространенных промышленных процессов • получения водорода также является и частичное окисление углеводородов. Оно идёт по пути некаталитического эндотермичного превращения тяжёлых фракций (например, остаточных углеводородов после 4 обработки сырой нефти) посредством' окисления кислородом в синтез-газ с высоким содержанием СО. Общая реакция, включающая несколько подреакций, приведена в виде уравнения (Гамбург и Семенов, 1989):

СпНт + п/2 02 —> п СО + т/2 Н2

В случае использования метана:

СН4 + 'Л 02 СО + 2 Н2 ДНГ = -36 кДж/моль

Для частичного окисления можно использовать разное сырьё. Десульфуризация и пре-реформинг в этом случае не требуются. Частичное окисление следует применять, когда используется дешёвый кислород и тяжелые фракции углеводородов (отходы нефтеперегонных заводов). Реакции проходят при температурах 1300-1400°С (Раёго е1 а1.,1999).

Крупномасштабное производство водорода посредством технологии парового реформинга заметно дешевле и привлекательнее из-за своей эффективности и стоимости. Типичный завод, использующий этот метод производит свыше 100 ООО м3/ч водорода. Однако, если применяются устаревшие низкоэффективные технологии, то производство будет много меньше, при этом стоимость водорода увеличится, а эффективность производства уменьшится (На^^ет, 2003).

Небольшие производства отвечают требованиям рынка, который зачастую заинтересован в малых количествах водорода.

1. Электролиз используется довольно часто, если требуется высокая чистота л водорода. Это процесс при котором производится водород с мощностью до 1 м /ч. Эффективность процесса колеблется в пределах от 65 до 75%.

С технической точки зрения различают 3 вида электролиза:

• щелочной электролиз (раствор щелочного электролита, 80°С);

• мембранный электролиз (протон-проницаемая мембрана, 80°С);

• паровой электролиз (керамическая мембрана содержащая ион кислорода, 650-1000°С).Наиболее часто применяют щелочной электролиз (ОаИисы, 2006).

Обычно электролиз проводят при нормальных внешних условиях. Но процесс может быть проведён и при высоком давлении (до 30 бар), это даёт преимущество, когда получаемый водород нужно сохранять под давлением. Получаемые газы собирают раздельно, однако они не являются полностью свободными от примесей. Кроме того, они насыщены парами воды. Большинство электролитических систем уже включают модули, которые позволяют удалять йз водорода пары воды. Как правило, электролиз воды позволяет получать водород с чистотой между 99,9 — 99,9998 объёмных %, в зависимости от использованных электролитических систем (ваИиссь 2006).

2. Водород может быть получен и путём разложения метанола. Эндотермичное разложении происходит при температуре более 700°С без катализатора, или при 350 - 450°С на сплавах, медно-никелевом или цинк-хромовом (Рас1го е! а1.,1999).

Высокий выход водорода достигается путём каталитического парового реформинга метанола. Применение катализатора и низкая температура процесса даёт ряд преимуществ, в сравнение с реформингом метана. Процесс начинается с разложения метанола, затем следует реакция водно-газового замещения. Процесс парового реформинга метанола проходит при температуре 250 - 300 °С и давлении приблизительно в 25 бар. СНзОН —> СО + 2 Н2 АНГ - + 91 кДж/моль

СО + Н20 -> С02 + Н2 ДНГ = - 41 кДж/моль

Суммарная реакция

СНзОН + Н20 С02 + 3 Н2 ДНГ= + 50 кДж/моль Автотермальный реформинг (АР) метанола совершается в схожих условиях с паровым реформингом. В течение АР, метанол преобразуется в водород в присутствии катализатора с кислородом и паром при температуре 250 - 330 °С и давлении 20 бар. Реакция водно-газового замещения используется для понижения концентрации СО и увеличения выхода Н2 (Рас1го ег а!.,1999):

СНзОН + 0,5 02 -> 2 Н2 + СО + СН4 СНзОН + Н20 -> С02 + 3 н2 СН4 + 0,5 02 -»• н2 + СО Процесс реформинга метанола постоянно совершенствуется. В дальнейшем планируется применять его в интеграции с топливными элементами.

Различия между крупномасштабными и малыми производствами водорода приведены в таблице 1. Несмотря на то, что основную долю производств на сегодняшний день составляют крупномасштабные производства, в процессе развития данной отрасли промышленности всё более интересными становятся небольшие производства (Раёго е1 а1.,1999).

Основной проблемой при использовании водорода является его транспортировка от крупномасштабных производств к потребителям. В ЕС и в США существуют сети трубопроводов. Подобные трубопроводы, как правило, объединяют небольшое число крупных заводов со всеми потребителями водорода. Обычно длина их составляет несколько сотен километров. Например, сеть трубопроводов в Руре объединяет север Франции, Бельгию и Нидерланды (www.abengoabioenergy.com, 2008).

Таблица 1.

Производственные мощности продукции водорода.

Мощность, млн. м /день

Технология

Паровой реформинг природного газа (крупномасштабное производство)

Частичное окисление нефти

Газификация угля

Паровой реформинг природного газа (маломасштабное производство)

Плазменный реформинг

Улучшенный сорбционный реформинг

Мембранный реформинг

Крекинг природного газа

Потребители могут получать водород и при помощи грузового автотранспорта. Грузовики, транспортирующие жидкий водород, могут перемещать достаточно большое количество водорода. Однако, для производства жидкого водорода затрачивается много энергии и средств, что объясняет дороговизну продукта. Газообразный водород транспортируется только в небольших количествах. Даже при высоком давлении, плотность водорода будет столь низка, что его вес будет составлять только 2% от веса транспортного средства, при этом стоимость транспортировки резко повышается (www.abengoabioenergy.com, 2008). 1.1.2 Производство водорода из биомассы

Биохимическое превращение биомассы в природе в основном описывается сложной системой биохимических реакций. Примерами могут являться суммарные реакции процессов: окисления воды: 2 НгО + свет —* 2 Н2 + О2 (1) фотосинтеза: 6 С02 + 6 Н20 + свет С6Н1206 + 6 02 (2) темнового брожения: С6Н1206 + 2 Н20 2 СН3СООН + 4 Н2 + 2 С02 (3) фотоброжения: СН3СООН + 2 Н20 + свет 4 Н2 + 2 С02 (4) метаногенеза: СН3СООН —> СН4 + С02 (5)

Зеленые водоросли могут разделить воду на водород и кислород с помощью световой энергии по реакции [1] (Levin et al., 2004) Они осуществляют так называемый оксигенный фотосинтез (рис. 1). Он может быть охарактеризован двумя различными фазами. Первая фаза - реакция на свету. Результат световой фазы реакции — трансмембранный градиент протонов и выделение кислорода. Для этого существует две фотосинтетические системы -фотосистема I и фотосистема И. Реакционный центр фотосистемы II (ФС II), Р680 поглощает свет. Это вызывает расщепление воды на кислород, протоны и электроны. Электроны перемещаются в фотосистему I (ФС1). Реакционный центр системы, Р700, является акцептором электронов. Вторая фаза - темновая реакция. Электроны, высвободившиеся в результате световой фазы реакции, используются при образовании водорода. Ферментами, отвечающими за катализ реакции образования водорода, выступают гидрогеназы (Akkerman et al., 2002).

Рисунок 1. Схема биофотолиза для фототрофных микроорганизмов.

Существенным недостатком процесса является высокая чувствительность гидрогеназ к кислороду. Эффективность преобразования световой энергии в водород очень низка, всего 1,5%. Однако, этот показатель можно увеличить до 3-10% при непрерывном удалении кислорода из среды (Akkerman et al., 2002, Hallenbeck and Benemann, 2002)

Непрямой биофотолиз является вариантом прямого процесса. Этот процесс разделяет стадии выделения кислорода и водорода, как в пространстве, так и во времени, во избежание кислородного ингибирования. Непрямой биофотолиз осуществляют цианобактерии, фототрофные прокариоты. Они являются предпочтительными для производства водорода, так как характеризуются минимальными требованиями к субстрату (Hallenbeck and 8

Benemann, 2002, Levin et al., 2004).

Общий пространственно разделенный механизм производства водорода может быть отражен в виде следующих реакций:

2 Н2О + 6 С02 + световая энергия —> Н^Об + б О2 СбН12Об + 12Н20 + энергия света 12 Н2 + б С02

Таким образом, непрямой биофотолиз включает в себя два этапа. На первом этапе диоксид углерода в процессе фотосинтеза трансформируется в углеводы. Второй этап представляет собой сочетание темнового брожения и фото-ферментации. При темновом брожения углеводы преобразуются в ацетат и двуокись углерода в анаэробных условиях в темноте (СбН]20б + 2Н20 -> 4Н2 + 2СН3 СООН + 2С02). После этого, уксусная кислота полностью превращается в водород и углекислый газ в анаэробных условиях фотоброжением (Akkerman et al., 2002, Hallenbeck and Benemann, 2002, Levin et al., 2004).:

2CH3COOH + 4H20 + энергия света 8H2 + 4C02

Цианобактерии обладют несколькими ферментами, непосредственно участвующими в метаболизме и синтезе водорода. К ним относятся нитрогеназы, которые катализируют образование водорода восстановлением азота до аммиака и гидрогеназы, которые обладают способностью обратимо катализировать окисление водорода (Levin et al., 2004, Yu and Takahashi, 2007).

Фото-ферментация. Фото синтезирующие бактерии, такие как пурпурные серные бактерии, способны осуществлять аноксигенный фотосинтез (рис. 2). Эти бактерии образуют водород при помощи нитрогеназы с использованием энергии света из простых органических кислот. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий состоит только из одной фотосистемы, реакционный центр которой похож на таковой в фотосистеме И. Однако, эта фотосистема не является достаточно мощной для расщепления молекулы воды и потому, пурпурные бактерии не образуют кислород (Reith et al., 2003). Реакционный центр фотосистемы (Р 870), поглощает свет и облегчает перенос электронов через серию электронных переносчиков, таких как хиноны (Q) и цитохромный комплекс (Cyt). Электроны высвобождаются в результате окисления органических кислот, которые попадают в цикл лимонной кислоты, где окисляются до двуокиси углерода, протонов и электронов. Параллельно при электронном переносе на мембранах создается градиент протонов, который используется АТФ-синтазой для образования АТФ. Далее электроны с АТФ перебрасываются через ферредоскин на нитрогеназу. В отсутствии азота нитрогенана способна восстанавливать протоны до водорода за счет энергии АТФ.

Рисунок 2. Схема механизма фотоброжения фотосинтезирующих бактерий (Akkerman et al„ 2002).

Широкий спектр бактерий (облигатных или факультативных анаэробов) способен конвертировать органические вещества в водород, диоксид углерода и метаболиты, такие как ацетат, лактат, этанол и др. Этот процесс не требует энергии света. Разложение комплексных соединений получается неполным, и в результате образуются органические кислоты и спирты (Hallenbeck and Benemann, 2002).

Для большинства анаэробных водородобразующих микроорганизмов характерно сбраживание Сахаров, приводящее практически к образованию только одного конечного продукта — уксусной кислоты (гомоацетатное брожение); из 1 молекулы сбраживаемой гексозы синтезируется 3 молекулы ацетата. Процесс начинается с превращения глюкозы в пируват и АТФ. Электроны с ферредоксина могут переноситься далее на НАД+ или на Н+, что приводит в последнем случае к выделению Н2 (Redwood, 2008).

Глюкоза — легко расщепляемый биологический источник углерода, присутствующий в большинстве промышленных сточных вод. Она может быть получена из избытка отходов сельскохозяйственного производства. Биоконверсия 1 моля глюкозы в ацетат позволяет получить до 4 моль водорода/моль глюкозы. Как правило, количество образованного водорода получается ниже максимальных значений в связи с образованием биомассы. На самом деле, производство водорода путем брожения - трата энергии на бактериальный

10 метаболизм, потому разработаны механизмы для утилизации выделяющегося водорода в клетках. Теоретически, до 33% электронов, содержащихся в сахарах может пойти на производство водорода, при этом, по меньшей мере 66% электронов из субстрата тратятся на образование промежуточных продуктов (органических кислот, Redwood, 2008).

Процесс темнового брожения имеет несколько преимуществ. Бактерии «бродилыцики» имеют очень высокий потенциал к образованию водорода. Кроме того, процесс не требует освещения и может проходить непрерывно, в течение длительного времени. В результате образуется не только водород, но и промежуточные метаболиты, такие как уксусная кислота, также находящие широкое применение. Для процесса могут быть использованы различные субстраты, такие как отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности, сточные воды и т.д. Ферментативное выделение водорода является выгодным, по сравнению с фотохимическим выделением водорода микроорганизмами. Однако по мере увеличения парциального давления водорода, количество образованного водорода уменьшается и происходит сдвиг в сторону получения промежуточных продуктов, таких как молочная кислота, этиловый спирт, ацетон, бутанол и др. Другим недостатком является выделение С02, который должен быть удален из полученной газовой смеси (Claassen and de Vrije, 2006; Redwood, 2008)

Мощность. Диапазон мощностей для различных технологий производства водорода приведён в таблице 2 (Hemmes et al., 2003; Schnitzhofer et al., 2008).

Таблица 2.

Сравнение производственных мощностей образования водорода

----Мощность, млн. м3/день Технология ------- 0,01-0,03 0,03-0,1 0,1-0,3 0,3-1 1-3

Газификация биомассы

Пиролиз нефти шшшш

Суперкритичная газификация воды ШШШ

Анаэробное сбраживание a s - " - - . V . - ■- ■•'-Д

Темновая ферментация + метаногенез - г.,:;.

Темновая ферментация + фотоферментация -у- . ,4„ ш^шшш

Фотоферментация .

Прямой биофотолиз

Непрямой биофотолиз t. ^ШШШЯШшШШШт

Очевидно, что термохимические процессы обычно пригодны для крупномасштабного производства водорода, в то время как биохимические технологии желательно применять для небольших производств, за исключением прямого/непрямого биофотолизов. Существует перспектива внедрения биофотолиза на заводах большой мощности, но процесс был отработан только на лабораторных установках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Садраддинова, Эльмира Рамиз-кызы

выводы

1. Выделены активные микробные консорциумы и чистые культуры микроорганизмов, разлагающие целлюлозу в термофильных условиях (65-70° С) с образованием водорода и жирных кислот, в основном лактата и ацетата.

2. Показана возможность использования иммобилизованных клеток несерных пурпурных фототрофных бактерий для активной переработки продуктов разложения целлюлозы (смеси лактата и ацетата), образованных в темновой стадии, в водород и диоксид углерода.

3. Впервые показана возможность использования полимерных мембран на границе раздела фаз (газ/жидкость) для непрерывного извлечения водорода из термофильной среды ферментации.

4. Показана принципиальная возможность объединения процесса термофильного разложения целлюлозы водородобразующими сообществами с участием фототрофных несерных бактерий с узлом мембранной сепарации водорода из культуралыюй жидкости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Садраддинова, Эльмира Рамиз-кызы, Москва

1. Аншиц А. Г., Воскресенская Е. Н., 1999. Окислительная конденсация метана новый процесс переработки природного газа. Соросовский Образовательный Журнал 2: 15-21

2. Будаева В.В., Митрофанов Р.Ю., Золотухин В.Н., 2008. Исследование ферментативного гидролиза отходов переработки злаков. Ползуновский вестник №3.

3. Варфоломеев С.Д., Гоготов И.Н., Тоай Ч.Д., Бачурин С.О., 1978. Исследование стационарной кинетики катализа гидрогеназой из Thiocapsa го^еорегл'/сша.-Молекулярная биология. 12:63-71.

4. Волков В.В., Фадеев А.Г., Хотимский B.C., Бузин О.И., Цодиков М.В., Яндиева Ф.А., Моисеев И.И., 2003. Экологически чистое топливо из биомассы. Рос. хим. ж.,, t.XLVII, № 6, с. 71-82.

5. Гасанова Л.Г., 2007. Интегрированные мембранные биореакторные системы для получения горючих газов. Автореферат кандидатской диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. ИНХС РАН, с. 184.

6. Гамбург Д.Ю., Семенов В.П.,1989. Водород. Свойства, получение, хранение, транспортирование, применение. М.: Химия.

7. Гребенчикова И.А., Ручай Н.С., Маркевич P.M., Гриц Н.В., 2002. Очистка сточной воды гидролизного производства в анаэробных биореакторах. Биотехнология. 4:70-79.

8. Гурвич В.И., Лифшиц А.Б., 1994. Добыча и утилизация свалочного газа (СГ) -самостоятельная отрасль мировой индустрии. 8 с.

9. Дытнерский Ю.И., Брыков В.П., Каграманов Г.Г.,1991. Мембранное разделение газов. М.: Химия, 344 с.

10. Зотова H.A., 2004. Образование водорода свободными и иммобилизованными клетками пурпурных бактерий. Дипломная работа. М.: МГУ. 56 с.

11. Заварзин Г.А., Колотилова H.H., 2001. Введение в природоведческую микробиологию. М.: Книжный дом «Университет», с. 192-210.

12. Заварзин Г.А., 2002. Роль комбинаторных событий в развитии биоразнообразия. Природа 1: 12-19.

13. Имшнецкий A.A., 1953. Микробиология целлюлозы. Академия наук СССР. с. 170-222.

14. Клесов A.A., 1983. Ферментативное превращение целлюлозы. М;: Итоги науки и техники. Сер. Биотехнол. с. 63-150.

15. Клесов A.A., 1986. Ферменты превращения целлюлозы. М.: Проблемы биоконверсии растительного сырья, с. 95-136.

16. Кондратьева E.H., Гоготов И.Н., 1981. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. М.: Наука. 344 с.

17. Кондратьева E.H., Максимова И.В., Самуилов В.Д., 1989. Фототрофные микроорганизмы. М.: МГУ. 376 с.

18. Кондратьева E.H., 1996. Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ. с. 16-159.

19. Кощеенко К.А., 1989. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение. В кн.: Промышленная микробиология (под ред. Егорова Н.С.), М., Высшая школа, с.216-236.

20. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н., 1988. Микробный синтез на основе целлюлозы. Минск: Изд-во Наука и техника, с. 3-54.

21. Митрофанова Т.И., 1995. Свойства новых штаммов термофильных анаэробных бактерий. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. МГУ. с. 115.

22. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М., Иванов М.В., Каравайко Г.И., Кожевин П.А., Колотилова H.H., Котова И.Б., Максимов В.Н., Ножевникова А.Н., Семенов A.M., Турова Т.П., Юдина Т.Г., 2004. Экология микроорганизмов. Изд. Академия 272 с.

23. Нетрусов А.И., Котова И.Б., 2006. Микробиология. Академия, с. 102-115.

24. Панцхава Е.С., 1989. Получение газообразного и жидкого топлива ( под ред. Егорова Н.С.), М., Высшая школа, с. 617-634.

25. Перевалова Т. М., Комарова JI. Ф., 1998. Изучение свойств нового полимера для создания экологически чистой технологии обезвреживания производственных сточных вод. Химия растительного сырья. 1998. № 3: 65-74.

26. Пинчук Л.С., 1998. Многофункциональные фильтры на основе полимеров. Технологическое оборудование и материалы. 3:30-34,

27. Рабинович М.Л., Мельник М.С., 2000. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. Успехи биологической химии, т. 40, с. 205—266

28. Роджерс К., 1968. Растворимость и диффузия, в сб. Проблемы физики и химии твердого состояния органических соединений. — М.: Мир, с.229.

29. Самуилов В.Д., Олескин A.B., 1994. Получение водорода и биофотолиз воды. В кн.: Технологическая биоэнергетика. М., Изд-во МГУ. с. 93-101.

30. Садраддинова Э.Р., Зотова Н.А., Ефременко Е.Н., Нетрусов А.И. "Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий-для получения водорода" Патент РФ на изобретение № 2323975 (10.05.2008), Бюл. № 13, приоритет от 28.08.2006.

31. Скляр В.И., 1987. Биокаталитические системы получения водорода и метана. Автореферат кандидатской диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. МГУ. 145 с.

32. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М., 1995. Биоконсервация лигноцеллюлозных материалов. М.: Издательство Московского университета, с. 7-91.

33. Федоров А.С., 2002. Регуляция нитрогеназной активности и фотообразование водорода у пурпурных несерных бактерий. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. МГУ. 158 с.

34. Хорлин А.Я., 1974. Активные центры карбогидраз. М.: Структура и функции активных центров ферментов, с. 39-69

35. Швыдкий B.C., Ладыгичев М.Г., 2002. Очистка газов. Справочное издание. М.: Теплоэнергетик, с. 640

36. Шереметьева М.Е., 2003. Метаболизм молекулярного водорода у одноклеточных цианобактерий. Автореферат диссертации на соискании ученой степени кандидата биологических наук. МГУ. 141 с.

37. Шлегель Г., 1987. Общая микробиология. М., Мир. 512 с.

38. Abengoa Bioenergy, 2008. http://www.abengoabioenergy.com

39. Akkerman I, Janssen M, Rocha J, Wijffels RH, 2002. Photobiological hydrogen production: photochemical efficiency and bioreactor design. International Journal of Hydrogen Energy. 27:1195-1208.

40. Appel J., Phunpruch S., Steinmiiller K., Schulz R., 2000. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis. Arch. Microbiol., 173:333-338.

41. Avgerinos G. C., Wang D. I. C., 1983. Selective solvent delignification for fermentation enhancement. Biotechnol. Bioeng. 25:67-83.

42. Ballantine, S., Boxer. D., 1985. Nickel-containing hydrogenase isoenzymes from anaerobically grown Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 163:454-459.

43. Bergmair, J.; Weran, N.; Oberschachtsiek, B.; Roes, J., 2007. Development of aBiogas Reformer for Production of Hydrogen for PEM Fuel Cells, EU Hydrogen and Fuel Cell Technical Review Days, Brussels

44. Bothun G. D., Berberich J. A., Knutson B. L., Strobel H. J., Nokes S. E., 2004. Metabolic selectivity and growth of Clostridium thermocellum in continuous culture under elevated hydrostatic pressure. Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 149-157

45. Bounaceur R., Lape N., Roizard D., Vallieres C., Favre E., 2006. Membrane processes for post-combustion carbon dioxide capture: A parametric study. Energy. 31(14):2556-2570

46. Bredholt S., Sonne-Hansen J., Nielsen P., Mathrani I. M., Ahring B. K., 1999. Caldicellulosiruptor kristjanssonii sp. nov., a cellulolytic, extremely thermophilic, anaerobic bacterium, Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 991-996.

47. Cammack R., Fernandez V.M., Hatchikian E., 1994. Nickel-iron hydrogenases. Methods Enzymol. 243:43-68.

48. Cassidy M., Lee H., Trevors J., 1996. Environmental applications of immobilized microbial cells: review. J. Industrial Microbial. 16:79-101.

49. Claassen P. A.M., de Vrije T.,2006. Non-thermal production of pure hydrogen from biomass: H YVOLUTION. International Journal of Hydrogen Energy, 2006. 31: p. 1416-1423.

50. Crank J., Park H. Diffusion in polymers, 1968. Acad. Press., p. 414, p. 568.

51. Das D., Veziroglu N., 2001. Hydrogen production by biological processes: a survey of literature. Int. J. Hydrogen Energy, 26: 13-28.

52. Erbes D., King D. 1979. Inactivation of hydrogenase in cell-free extracts and whole cells of Chlamydomonas reinhardii by oxygen. Plant Physiol. 63:1138-1147.

53. Eroglu E.; Eroglu, I.; Giindiiz, U.; Turker, L.; Yucel, M., 2006 . Biological hydrogen production from olive mill wastewater with two-stage processes. International Journal of Hydrogen Energy 31: 1527-1535

54. Gallucci F.; Comite A.; Capannelli G.; Basile A. Ind. Eng. Chem. Res., 45 (2006) 2994-3000

55. Gelhaye E., Petitdemange H., Gay R., 1993. Adhesion and growth rate of Clostridium cellulolyticum ATCC 35319 on crystalline cellulose. J. Bacteriol. 175:3452-3458.

56. Gogotov I., 1978. Relationships in hydrogen metabolism between hydrogenase and nitrogenase in phototrophic bacteria. Biochimie. 60:267-75.

57. Gogotov I., 1986. Hydrogenases of phototrophic microorganisms. Biochimie. 68:181-7.

58. Gottschalk G., Andreesen I., 1979. Energy metabolism in anaerobes. In: Microbial Biochemistry. Ed. J. R. Quayle. Baltimore: Univ. park press. 85 p.

59. Guedon E., S. Payot, M. Desvaux, H. Petitdemange. 1999. Carbon and electron flow in Clostridium cellulolyticum grown in chemostat culture on synthetic medium. J. Bacteriol. 181:3262-3269.

60. Hallenbeck P. C., Benemann J.R., 2002. Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes. International Journal of Hydrogen Energy. 27:1185-1193

61. Hartstein, A. Hydrogen Production from Natural Gas. June 2, 2003 at the Hydrogen Coordination Meeting.

62. He D., Bultel Y., Magnin J., Willison J., 2006. Kinetic analysis of photosynthetic growth and photohydrogen production of two strains of Rhodobacter capsulatus. Enzyme and Microbial Technol. 38: 253-259.

63. Horvath R., Orosz T., Balint B., Wessling M., Koops G.H. Kapantaidakis G.C., Belafi-Bako K., 2004. Application of gas separation to recover biohydrogen produced by Thiocapsa roseopersicina. Desalination, 163, p. 261-265.

64. Islam R., Cicek N., Sparling R., Levin D., 2006. Effect of substrate loading on hydrogen production during anaerobic fermentation by Clostridium thermocellum 27405, Appl. Microbiol. Biotechnol., 72, 576-83.

65. Jacobi A., Rossmann R., Bock A., 1992. The hyp operon gene products are required for the maturation of catalytically active hydrogenase isoenzymes in Escherichia coli. Arch. Microbiol. 158:444-451.

66. Karin G., Wierzba I., Al-Alousi Y., 1996. Methane-hydrogen mixtures as fuels. Int. J. Hydrogen Energy, 21:625-631.

67. Kars, G.; Gunduz, U.; Rakhely, G.; Yiicel, M.; Eroglu, I.; Kovacs, K.L, 2008. Improved hydrogen production by uptake hydrogenase deficient mutant strain of Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. Int. J. Hydrogen Energy 33: 3056 3060

68. Kataoka N., Miya A., Kiriyama K., 1997. Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen producing anaerobic bacteria. Water. Sci. Technol. 36:41-47.

69. Kengen S, Heleen M., Goorissen P., Verhaart M., Stams A., 2009. Biological Hydrogen Production by Anaerobic Microorganisms. John Wiley & Sons Ltd. p. 198-214.

70. Kim J., Rees D., 1992. Structural models for the metal centers in the nitrogenase molybdenum-iron protein. Science. 257:1677-82.

71. Kumar N., Das D., 2000. Enhancement of hydrogen production by Enterobacter cloacae IIT-BT 08. Process. Biochem. 35:589-593.

72. Kumar N., Ghosh A., Das D., 2001. Redirection of biochemical pathways for the enhancement of H2production by Enterobacter cloacae. Biotechnol. Lett. 23:537-541.

73. Kujawski W., 2000. Application of Pervaporation and Vapor Permeation in Environmental Protection. Polish Journal of Environmental Studies, 9 (1): 13-26

74. Lamed R., Zeikus G., 1980. Ethanol production by thermophilic bacteria: relationship between fermentation product yields of catabolic enzyme activities in Clostridium thermocellum, J. Bacteriol. p. 144, 569-578.

75. Lamed R. J., Lobos J. H., Su T. M., 1988. Effects of stirring and hydrogen on fermentation products of Clostridium thermocellum, Appl. Environ. Microbiol., 54, 1216-1221.

76. Lee K., Wu J., Lo Y., Lo Y-C., Lin P., Chang J., 2004. Anaerobic hydrogen production with an efficient carrier-induced granular sludge bed bioreactor. Biotechnol. and Bioeng. 87(5): 129-138

77. Lee S.C., Choi B.Y., Lee T.J., Ryu C.K., Ahn Y.S., Kim J.C., 2006. C02 absorption and regeneration of alkali metal-based solid sorbents. Catalysis Today. lll(3-4):385-390

78. Levin D., Pitt L, Love M., 2004. Biohydrogen production: prospects and limitations to practical Biohydrogen application. Int. J. Hydrogen Energy. 29:173-185.

79. Liang T.-M., Cheng S.-S., Wu K.-L., 2002. Behavioral study on hydrogen fermentation reactor installed with silicone rubber membrane. Int. J. Hydrogen Energy 27: 1157-1165.

80. Ludden P., Roberts G., 1995. The biochemistry and genetics of nitrogen fixation by photosynthetic bacteria. In Blankenship, Madigan, Bauer (eds): Anoxygenic photosynthetic bacteria. Kluwer Academic publishers. Netherlands.p.921-947.

81. Lutz, S., Jacobi A., Schlensog V., Bolim R., Sawers G., Bock A., 1991. Molecular characterization of an operon (hyp) necessary for the activity of the three hydrogenase isoenzymes in Escherichia coli. Mol. Microbiol.5:123-135.

82. Lynd, L. R., Wyman C. E., Gerngross T. U., 1999. Biocommodity engineering. Biotechnol. Prog. 15:777-793

83. Magalon A., and Bock A., 2000. Analysis of the HypC-HycE complex, a key intermediate in the assembly of the metal center of the Escherichia coli hydrogenase 3. J. Biol. Chem. 275:2111421120.

84. Maier T. Bock. A., 1996. Nickel incorporation into hydrogenases. Appl. Env. Microbiol. 65:173-192.

85. Maroti G., Fodor B., Rakhely G., Kovacs A., Arvani S., Kovacs K., 2003. Accessory proteins functioning selectively and pleiotropically in the biosynthesis of NiFe. hydrogenases in Thiocapsa roseopersicina. Eur J Biochem 270: 2218-2227.

86. Mahyudin A., Furutani Y., Nakashimada Y., Kakizono T., Nishio, 1997. Enhanced hydrogen production in altered mixed acid fermentation of glucose by Enterobacter aerogenes. J Ferm. Bioeng. 83(4):358-363.

87. Miller, T. L. 1978. The pathway of formation of acetate and succinate from pyruvate by Bacteroides succinogenes. Arch. Microbiol. 117:145-152.

88. Mizuno O., Dinsdale R., Hawkes F., Hawkes D., Noike T., 2000. Enhancement of hydrogen production from glucose by nitrogen gas sparging. Bioresour. Technol. 73:59-65.

89. Nath K., Das D., 2004. Improvement of fermentative hydrogen production: various approaches. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 520-529.

90. Nandi R., Sengupta S., 1998. Microbial production of hydrogen: an overview. Crit. Rev. Microbiol. 24:61-84.

91. Netrusov A., Sadraddinova E., Abramov S., Shestakov A., Shalygin M., Teplyakov V. Membrane-assisted separation of microbial gaseous fuels from renewable sources. Desalination and Water Treatment, Volume 14, 2010, p. 252 257.

92. O'Brien D.J., Senske G.E., Kurantz M.J., Craig J. C. Jr., 2004. Ethanol recovery from corn fiber hydrolysate fermentations by pervaporation. Bioresourse technology, v. 92, pp. 15-19.

93. Oh Y., Seol E., Yeol Lee E., Park S., 2002. Fermentative hydrogen production by new chemolithotrophic bacterium Rhodopseudomonas palustri's P4. Int. J. Hydrogen Energy, 27:13731379.

94. Oh Y-K., Seol E-H., Kim J., Park S., 2003. Fermentative biohydrogen production by new chemoheterotrophic bacterium Citrobacter sp. Y19. Int J Hydrogen Energy 28:1353-1359.

95. Oh S.-E., Iyer P., Bruns M.A. Logan B.E., 2004. Biological hydrogen production using a membrane reactor. Biotechnology and bioengineering, v. 87, №1: 119-127

96. Oh Y., Kim S., Kim M., Park S., 2004. Thermophilic biohydrogen production from glucose with trickling biofilter. Biotechnol. and Bioeng. 88: 348-356.

97. Onyenwoke U., Lee Y.-J., Dabrowski S., Ahring B. K., Wiegel J., 2006. Reclassification of Thermoanaerobium acetigenum as Caldicellulosiruptor acetigenus comb. nov. and emendation of the genus description, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 56, 1391-1395.

98. Padro C.E.G., Putsche V., 1999. Survey of the Economics of Hydrogen Technologies. National renewable energy laboratory.

99. Panagiotopoulos, I.A.; Bakker, R.R.; Budde, M.A.W.; Vrije, T. de; Glaassen, P.Ä.M. ; Koukios, E.G., 2009. Fermentative hydrogen production from pretreated biomass: a comparative study. Bioresource Technology 100: 6331-6338

100. Park G.S., 1951. Diffusion of some organic substances in polystyrene. Trans. Faraday Soc., v. 47, No. 9, p. 1007-1013.

101. Park W., Hyun S., Eunoh S., Logan B., Kim I., 2005. Removal of headspace CO2 increases biological hydrogen production. Env. Science andTechnol. 39:412-420.

102. Pavlostathis S. G., Miller T. L., Wolin M. J., 1988. Fermentation of insoluble cellulose by continuous cultures of Ruminococcus albus. Appl. Environ. Microbiol. 54:2655-2659.

103. Pavlostathis S. G., Miller T. L., Wolin M. J., 1990. Cellulose fermentation by continuous cultures of Ruminococcus albus and Methanobrevibacter smithii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:109-116.

104. Penfold D., Forster C., Macaskie L., 2003. Increased hydrogen production by Escherihia coli strain HD701 in comprasision with wild-type parent strain MC4100. Enzyme and Microbial. Technol. 33:185-189

105. Redwood M.D., 2008. Integrating dark and light bio-hydrogen production strategies: towards the hydrogen economy. Rev. Environ. Sei. Biotechnol.

106. Reith JH, Wijffels RH, Barten H., 2003. Bio-methane & Bio-hydrogen, status and perspectives of biological methane and hydrogen production.

107. Schnitzhofer W., Herzer S., Wukovits W., Ahrer W., Friedl A., de Vrije T., Claassen P.A.M., 2008. Non-thermal production of pure hydrogen from biomass: A sustainable pathway to biological hydrogen. Energy 25: 115-123.

108. Schmitz O., Boison G., Salzmann H., Bothe H., Schutz K. ,Wang Sh„ Happe T., 2002. HoxE' a subunit specific for the pentameric bidirectional hidrogenase complex (Hox EFUYH) of cyanobacteria. Biochim. Biophys. Acta., 98:67-74.

109. Schwartz E., Buhrke T., Gerischer U., Friedrich B., 1999. Positive transcriptional feedback controls hydrogenase expression in Alcaligenes eutrophus HI 6. J. Bacteriol. 181:5684-5692.

110. Shi Y., Weimer P. J., Ralph J., 1997. Formation of formate and hydrogen, and flux of reducing equivalents and carbon in Ruminococcus flavefaciens FD-1. Antonie Leeuwenhoek 72:101-109.

111. Soetaert W., Vandamme E., 2009. Bioiuels. West Sussex, UK: John Wiley & Sons. pp. 223.

112. Tam-Anh D. Nguyen, Se Jong Han, Jun Pyo Kim, Mi Sun Kim, You Kwan Oh, Sang Jun Sim, 2008. Hydrogen production by the hyperthermophilic eubacterium, Thermotoga neapolitana, using cellulose pretreated by ionic liquid. Elsevier Ltd. p. 2-6.

113. Tanisho S., Kuromoto M., Kadokura N., 1998. Effect of CO2 removal on hydrogen production by fermentation. Int. J. Hydrogen Energy. 23:559-563.

114. Weimer P. J., 1993. Effects of dilution rate and pH on the ruminal celluloytic bacterium Fibrobacter succinogenes S85 in cellulose fed continuous culture. Arch. Microbiol. 160:288-294.

115. Wolf I., Buhrke T., Dernedde J., Pohlmann A., Friedrich B., 1998. Duplication of hyp genes involved in maturation of NiFe. hydrogenases in Alcaligenes eutrophus HI6. Arch. Microbiol. 170:415-419.

116. Wolin M.J., Miller T.L., 1985. Methanogenes. Biology of industrial microorganisms, p. 189221.

117. Ueno Y., Kavai T., Sato S., Otsuka S., Morimoto M., 1994. Biological production of hydrogen from cellulose by natural anaerobic microflora. J. Ferment. Bioeng. 79(4): 395-397.

118. Uyar, B.; Eroglu, I.; Yucel, M.; Gunduz, U.; Turker, L., 2007. Effect of light intensity, wavelength and illumination protocol on hydrogen production in photobioreactors. Int. J. Hydrogen Energy 32: 4670-4677

119. Yu J., Takahashi H., 2007. Biophotolysis-based Hydrogen Production by Cyanobacteria and Green Microalgae. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology.

120. Zhu I-L, Suzuki T., Tsygankov A., Asada Y., Miyake J., 1999. Hydrogen prodyction from tofu wastewater by Rhodobacter sphaeroides immobilized in agar gels. Int. J. Hydrogen Energy. 24:305-310.

121. Zurrer H., Bachofen R., 1982. Aspects of growth and hydrogen production- of the photosynthetic bacterium Rho do spirillum rubrum in continuous culture. Biomass. 2:165-174.131. www.epp.eurostat.ec.europa.eu