Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации"
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.ВЛомоносова Биологический факультет
Абрамов Сергей Маркович
Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации
03.02.03 - Микробиология 03.01,06'Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 2 г?ч 2011
Москва-2011
4853551
Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Нетрусов Александр Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Ножевникова Алла Николаевна
кандидат химических наук Скляр Владимир Ильич
Ведущая организация: Институт биохимической физики
имени Н.МЭмануэля, г.Москва
Защита состоится «-Н »О/ЛЗКрЗ- 2011 г. в на заседании диссертационного
совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корпус 12, биологический факультет, аудитория М-1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова
Автореферат разослан <0 » С<5Ц2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.и.
Пискункова Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Развитие методов переработки органических отходов и поиск новых перспективных энергоносителей - одни из основных задач стоящих перед современным обществом.
Эффективная переработка органического сырья (в том числе отходов деревообрабатывающей, пищевой, сельскохозяйственной промышленности, муниципальных отходов) - чрезвычайно сложная научно-техническая и социально-экономическая задача Утилизация отходов путем захоронения на сватках, рециклинга и сжигания повышает удельную нагрузку па почву, приводит к сокращению природных площадей, значительному загрязнению окружающей среды токсичными веществами и невозможности обеспечить окупаемость экологических мероприятий. Несмотря на это количество отходов, антропогенного происхождения, постоянно увеличивается.
Усилия современных исследователей сосредоточены на решении задачи, переработки широкого спектра отходов в целом и органических отходов в частности. Целлюлозосодержащее сырье занимает здесь особое место, поскольку представляет собой субстрат тяжелый для биодеструкции. Многие микроорганизмы всё же способны вполне активно гидролизовать целлюлозу. В тоже время одним из основных продуктов микробной переработки целлюлозы является водород. Водород можно использовать в качестве топлива, так например теплота сгорания водорода в несколько раз превышает теплоту сгорания бензина. Примерно половина водорода, производимого в мире сегодня, извлекается из природного газа в ходе его переработки, методом парового риформинга (Раско е1 а1.,1999). Этот метод имеет два недостатка. Во-первых, в качестве побочного продукта выделяется углекислый газ, загрязняющий атмосферу и, во-вторых, сырье для производства водорода является исчерпаемым ресурсом. Поэтому развитие технологий получения микробного водорода носит первостепенный характер в секторе биотопливной энергетики. Однако на сегодняшний день, пока еще не существует ни одной коммерчески эффективной технологии производства водорода из возобновляемого сырья. До сих пор не решены проблемы хранения, транспортировки и очистки водорода.
Большинство этих проблем можно было бы решить путем использования технологии водород-кислородных топливных элементов (ТЭ). Окисление водорода в ТЭ происходит на платиновом кататизаторе. Платина, в свою очередь, необратимо ингибируется серосодержащими соединениями, которые в значительной степени присутствуют в водороде микробиологического происхождения
Группой учёных химического факультета МГУ был разработан водородный электрод, который осуществляет реакцию окисления водорода с помощью фермента
гидрогеназы иммобилизованной на графитовом носителе (Могогоу й а!., 2002). Применение этой технологии для конструирования водород-кислородных ТЭ работающих в среде ферментации микроорганизмов позволило бы в значительной степени продвинуться на пути развития водородной энергетики.
Исследования проведены при финансовой поддержке федеральной целевой программы Министерства образования и науки Российской Федерации «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы в рамках реализации проекта «Проведение поисковых научно-исследовательских работ по направлению «Производство топлив и энергии из органического сырья» ГК № 558, а также при поддержке европейского гранта РР6 «НУУОЫШОМ» ЗЕЭ-б 019825.
Цель работы. Микробная переработка целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию через промежуточное образование водорода с использованием ферментного электрода, погружённого в среду ферментации.
Достижение данной пел» предполагало решение следующих задач:
- выделение и отбор анаэробных термофильных целлюлозолитических водородобразующих сообществ микроорганизмов из природных биотопов;
- оптимизация условий культивирования отобранных сообществ микроорганизмов;
- определение таксономического состава отобранных сообществ микроорганизмов;
- изучение электрохимических характеристик ферментного электрода в среде ферментации;
- разработка технологии переработки целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию.
Научная новизна.
В работе;
- впервые было предложено использование ферментного электрода на основе гидрогеназы для окисления водорода, выделяемого термофильным целлюлозолитическим сообществом микроорганизмов;
- впервые была создана установка, предназначенная для переработки целлюлозы анаэробными термофильными микроорганизмами в электроэнергию.
Прастическая значимость работы.
Полученные в рамках проведённых исследований результаты, могут быть применены в дальнейшем для разработки промышленных установок предназначенных для
переработки органических отходов в топливный водород, который может быть окислен непосредственно в среде ферментации с образованием электроэнергии, в системе ферментного ТЭ.
Предложенная в работе технология биореакторного ТЭ может найти широкое применение для производства электроэнергии в процессе микробной утилизации органических отходов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены па международных научных конференциях: Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009 г.), 11-ой научной конференции «Экосистемы, организмы, инновации - 11» (Москва, 2009 г.), 3-ей международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2009 г.), 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009 г.), международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010 г.), международных конференциях ЕигА81аВт-2010 (Москва, 2010 г.), «Регтеа-2010» (Словакия, 2010 г.), Всероссийском симпозиуме с международным участ ием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 8 тезисов докладов на международных и российских конференциях.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литерагуры (214 литературных источников, из которых 31 отечественный и 183 иностранных). Работа изложена на 136 страницах, содерясит 5 таблиц и 53 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отбор образцов. Целлюлозолитические водородобразукмцне сообщества выделяли из различных биотопов, в которых теоретически и визуально происходил процесс разложения целлюлозы. Были отобраны образцы из следующих ниш: налет на растениях приволоченной части пресноводного водоема, ил закрытого пресного водоема,
разложившиеся образцы камыша (прикорневая часть, корни), опад полуразложившейся листвы из лесного водоема, содержимое кишечника различных видов тараканов (американского, мадагаскарского, черного, туркестанского), содержимое кишечника термитов, дождевой червь (целиком, включая содержимое кишечника), образцы компостированного жома красного и белого винограда (из различных резервуаров винодельческого завода), образцы экскрементов антилопы гну, зебры, жирафа, черной антилопы, пони, слона, смешанные пробы экскрементов коров. Кроме того исследовали образцы содержимого горячих гейзеров из Долины гейзеров на полуострове Камчатка и из горячих гейзеров на острове Исландия. Пробы отбирали из ниш характеризующихся различными температурными условиями. Отбор проб производили в стерильные герметичные пластиковые флаконы. Всего было отобрано более 50-ти образцов.
Культивирование микроорганизмов. Выделение сообществ и чистых культур водородобразующих целлюлозслитиков проводили на среде Имшенецкого следующего состава (г/л): КаШ4Р04-1,5; К2НР04- 0,5; КН2Р04 - 0,5; \lgS04 * 7Н;0 - 0,4; №С1 -0,1; МпБ04 * 4Н20 - следы; Ре80„ * 7Н20 - следы; СаСОз - 2,0; пептон - 5,0. рК среды - 7,0 -7,2 до стерилизации.
Изолированные колонии целлюлозолитиков получали, выращивая культуры в толще агаризованной среды в трубках Бурри и в чашках Петри, помещая последние в анаэробный эксикатор. В качестве источников углерода и энергии использовали фильтровальную хроматографическую и папиросную бумагу, карбоксиметилцеллюлозу и микрокристаллическую целлюлозу в количестве 15,0 г/л или целлобиозу в количестве 7,5 г/л.
Выделение сообществ и чистых культур сахаролитических микроорганизмов, активно образующих водород проводили на среде для термофильных анаэробных сахаролитических микроорганизмов (модифицированная среда Имшенецкого) следующего состава (г/л): КН2Р04 - 2,000; К2НР04 - 3,000; (1МН4)25 04 - 2,000, М§С12 * 6И20 - 0,200; СаСЬ 4 2Н20 - 0,050; РеЭ04 * 7Н20 - 0,011; дрожжевой экстракт - 1,000, пептон - 5,000; цистеин (в виде 25%-го раствора) - 0,150; микроэлементы ЭЫО - 1 мл/л. Раствор микроэлементов БЫО следующего состава (мг/л): РеС12 * 4 Н20 - 1,5; гпСЬ -70,0; МпС12 * 4НгО - 100,0; Н3ВО3 - 6,0; СоС12 * 6Н20 - 190,0; СиС!2 * 2Н20 - 2,0; №С12 * 6Н20 - 24,0; №2Мо04 * 2Н20 - 36,0; \та2\У04- 15,0; Иа^еОз * 5Н20 -15,0. рН среды-7,0 -7,2 до стерилизации.
Изолированные колонии водородобразующих сахаролитиков получали, выращивая культуры на агаризованной среде в трубках Бурри. В качестве источников углерода и энергии использовали глюкозу в количестве 10 г/л. Растворы глюкозы, цистеина и
микроэлементов готовили отдельно и добавляли непосредственно перед внесением инокулята.
Для контроля анаэробности в среды добавляли раствор резазурина (0,15 г/л) в количестве 1 мл/л. Среды стерилизовали при 0,5 ати в герметично закрытых флаконах объёмом 450 мл (объем среды 100 мл). Выбор флаконов обусловлен необходимостью создания достаточного объема газовой фазы над средой культивирования во избежание ингибирования процесса, образующимися газовыми продуктами. Для культивирования применяли модифицированную технику Хангейта (Митрофанова, 1995). Газовую фазу во флаконах заменяли на инертный газ - аргон.
Первичный посев образцов производили вместе с кусочками разложившегося материала, присутствующего в пробах, в постоянном потоке аргона. Культивирование образцов вели при двух температурных режимах - 60°С и 70°С в условиях перемешивания на качалках (фирмы New Brunswick, США) с частотами вращения 35 и 50 об/мин. После засева остатки образцов природного материала помещали в морозильный ларь (-20°С) для хранения.
За динамикой роста культур следили по изменению оптической плотности среды при длине волны 550 им, по степени деструкции субстрата, по динамике накопления продуктов культивирования (как жидких, так и газообразных) и снижению рН среды. При максимально возможном разложении субстрата и низком значении рН (до 4,0 - 4,5) осуществляли пересев культур на свежую среду. Качественный и количественный анализы продуктов культивирования проводили с помощью методов хроматографии.
Изучение морфологии клеток. Морфологию клеток изучали методами световой и электронной микроскопии. Окраску по Граму проводили согласно общепринятой методике (Нетрусов, 2005). Электронную микроскопию проводили на микроскопе JEOL -JSM-6380LA (Япония). Препараты для электронной микроскопии фиксировали по стандартной методике. В качестве материала напыления использовали золото и платину.
Разработка биореакторной топливной ячейки для процесса конверсии микробного водорода в электрический ток. Схематическое изображение разработанной конструкции представлено на рисунке 15. В качестве биореактора использовали толстостенный стеклянный сосуд с широким горлом (диаметр горла 80 мм). Объём сосуда составлял 500 мл. Сверху сосуд закрывали крышкой, изготовленной из полиэтилена. Для герметизации внутреннего объёма ячейки между верхним фланцем горла сосуда и крышкой помещали силиконовую прокладку. В таком состоянии ячейку устанавливали на дюралевую пластину, которую посредством 4-х осей, имеющих резьбу с каждой стороны, соединяли сверху с дюралевым кольцом, прижимающем крышку к горлу сосуда. На
верхний участок резьбы металлических осей, над дюралевым кольцом, навинчивали гайки. Все 4 оси крепили сходным образом. Завинчивание 4-х гаек позволяло герметизировать ячейку.
Полиэтиленовую крышку оборудовали пятью технологическими отверстиями для интеграции в нее водородного и кислородного электродов, рН-метра, барботёра и пробоотборника Все элементы конструкции герметизировали с помощью резиновых и силиконовых прокладок различного диаметра (рис. 15).
Соотношение объемов жидкости к газовой фазе составляло 1:4,5-5. Это соотношение обусловлено необходимостью создания достаточного объема газовой фазы над средой культивирования для предотвращения ингибирования процесса образованными газовыми продуктами.
Разработка прототипа проточной системы. Разработанный прототип проточной системы представлен на рисунке 18. Он был собран на базе ферментационной установки Liflus GX (Biotron, Южная Корея), к которой подключали водородный и кислородный блоки ТЭ. Всю систему заполняли средой культивирования микроорганизмов или буферным раствором следующего состава: 0,1 М KCl, 0,05 М КН2Р04. Состав буфера был выбран таким образом, чтобы его проводимость и буферная ёмкость значительно превосходили максимально требуемые значения. Замену газовой фазы осуществляли путём барботирования всей системы аргоном. Для имитации продукции водорода буферный раствор барботировали водородом с помощью генератора водорода (Хроматэк, Россия),. Кислородный и водородный полуэлементы были сконструированы в виде отдельных блоков таким образом, чтобы возможно было проводить быструю замену водородного и кислородного электродов. Блоки были герметично закрыты резиновыми пробками и соединены между собой и с биореакгором силиконовыми шлангами. Проток раствора через полуэлементы контролировачи при помощи перистальтического насоса. Для разделения пространства между кислородным и водородным электродами использован! мембрану "Nafion". Через пространство кислородного электрода пропускали воздух, нагнетаемый аквариумным компрессором.
Методы аналитического определения продуктов ферментации. Состав газовой фазы определяли с помощью метода газовой хроматографии на хроматографе Кристалл 2000 М (Хроматэк, Россия) с катарометрическим детектором, оснащённым угольной колонкой 1000 х 2,5 мм, газ-носитель - аргон, температура термостата колонок - 150°С. Данные, полученные при проведении хроматографического анализа обрабатывали на компьютере с помощью программного обеспечения Chromatec Analytic 2.5 (Хроматэк, Россия).
Концентрацию газа измеряли при атмосферном давлении. Избыточное давление во флаконах, образовавшееся во время культивирования, измеряли манометром и учитывали при подсчете конечной концентрации продукта.
Состав летучих жирных кислот (ЛЖК - ацетата, пропионата, бутирата и др.) в культуралыгай жидкости определяли методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Для этого отбирали 1 мл культуральной жидкости, центрифугировали 10 мин при скорости 13000 g, после чего отбирали супернатант, рН суперпатанта доводили до значения 2 концентрированной серной кислотой (чда). Ввод проб осуществляли хроматографическим шприцом фирмы «Hamilton», объем пробы составлял 1 мкл.
Газожидкостную хроматографию проводили на приборе Кристалл 2000 М (Хроматэк, Россия), оснащённом микрокапилярной колонкой ZB-FFAP (Zebron, США; 15 м х 0,32 мм х 0,50 мкм). Газ-носитель — аргон, расход газа - 15 мл/мин, детектор - ПИД, температура детектора - 200°С. Измерения проводили в условиях температурного градиента в термостате от 70 до 160°С. Результаты хроматографии были обработаны при помощи программного обеспечения Chromatec Analytic 2.5 (Хроматэк, Россия).
Для определения концентрации молочной кислоты в супернатанте использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Измерения проводили на приборе «Стайер» с УФ-детектором (Аквилон, Россия). В качестве подвижной фазы использовали бидистиллироваиную воду, рН которой доводили до значения 3,5 концентрированной серной кислотой (чда). Скорость потока элюента - 0,5 мл/мин. Разделение вели на колонке С18 (250 х 4,6 мм) Luna (PHENOMENEX, USA). Для каждого анализа объем вводимой пробы составил 10 мкл. Идентификацию молочной кислоты проводили по времени выхода стандартов (чистых веществ), расчет концентрации вели по площади под пиками стандартов. Отобранную пробу перед измерением центрифугировали 10 мин. при 13000 g.
Концентрацию глюкозы в среде оценивали глюкозоксидазным методом. Отобранные образцы разбавляли фосфатным буфером (0,1 М КС1, 0,05 М КН2РО4, рН 7,0) сообразно их предполагаемой концентрации (от 2 до 200 раз). Анализ проводили в проточно-инжекционном режиме при потенциале рабочего электрода 0 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения. Скорость потока составляла 0,65 мл/мин. В качестве отклика биосенсора на данное содержание глюкозы принимали среднее значение по результатам 2-3 измерений (в связи с дестабилизирующим действием веществ, содержищихся в образцах). Перекалибровку соответствующих участков кривой проводили после измерений 1-3 образцов. Концентрацию глюкозы в образцах определяли по предварительно построенному калибровочному графику Построение калибровочного
графика осуществляли по результатам детекции глюкозы в проточно-инжекционном режиме в фосфатном буфере. Среднюю величину отклика вычисляли по результатам 3 единичных измерений.
Электрохимические измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием универсальных электрохимических приборов, сопряженных с компьютером, Solartron Shlumberger Model 1286 (Великобритания) и Autolab micro3 (Нидерланды). В качестве потенциометра использовали двухканальный USB-осцшюграф Disco (Россия). Поляризационные кривые записывали гальваностатическим и потенциодинамическим методом с подключением по двухэлектродной схеме. Для исследования генерируемой мощности использовали магазин сопротивлений.
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью приложения Microsoft Office Excel. Эксперименты проводили в нескольких повторностях. Для полученных значений каждого эксперимента определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ
1. Разработка процесса микробной переработ ки целлюлозы с образованием волорода
Как было показано нашими коллегами (Воронин, 2011), температурный оптимум работы ферментного электрода на базе гидрогеназы Т. гозеоректпи достаточно высок и составляет 80°С (рис. 1). Поэтому наиболее эффективно инта-рировать такой электрод в среду ферментации термофильных целлюлозолитических водородобразующих микроорганизмов. В начале работы было отобрано 9 сообществ, способных к разложению целлюлозы и выделению водорода в термофильных условиях (рис. 2). Наиболее продуктивными оказались сообщества № 4, 8, и 9, то есть симбионтная микробиота пищеварительного тракта животных (коровы и пони) и образцы донных осадков пресного водоема, культивируемые при температуре 60°С. Поэтому дальнейшее культивирование вели только при этой температуре.
Позже, было выделено ещё несколько сообществ образующих водород при росте на целлюлозе. Большинство отобранных сообществ пересевали на протяжении нескольких лет (пересев осуществляли каждые 7 суток), при этом важным параметром являлась стабильность отобранных сообществ.
зао
360 -
340 320 300
80
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Температура, °С
Рис. 1. Стабильность ферментных электродов в буферном растворе при различных температурах (0,05 М КН,Р04, ОД М КС1, рН 7, 25°С; Воронин, 20! 1).
123456789 № сообщества ; Я 60*С В 70*С
Рис. 2. Диаграмма образования водорода отобранными сообществами при 60 и 70°С (субстрат - целлюлоза; кумулятивные данные за 168 часов культивирования). 1-3 -образцы лиственного опада; 4 - образцы из экскрементов коровы; 5 - образцы из экскрементов слона; 6 - образцы из экскрементов чёрной антилопы; 7 - образцы из экскрементов пони; 8 - образцы из экскрементов антилопы гну; 9 - образцы почвы.
В конечном итоге в термофильных условиях было отобрано 5 сообществ целлюлозолитичеких водородобразукжшх микроорганизмов (рис. 3). Сообщества 1 и 3 были выделены из образцов зоны компостирования растительных остатков (время существования компостных куч: 3 месяца и 1 год соответственно). Сообщество 4 из экскрементов антилопы гну, сообщество 5 из экскрементов коровы, а сообщество 2 - это модифицированное сообщество 5, в результате работы с которым были утеряны некоторые микробные компоненты исходного сообщества, но высокая гидролитическая активность и высокая продуктивность по водороду сохранились.
Исследование сообществ методами электронной и световой микроскопии показало, что в сообществах преобладают палочкообразные формы микроорганизмов со спорами, имеются подвижные клетки. Часто микроорганизмы образуют небольшие скопления клеток вокруг частиц целлюлозы. Эти скопления погружены в экзополисахаридный матрикс. Такой матрикс способствует лучшей агрегации микроорганизмов, на поверхности целлюлозных волокон и более тесной кооперации целлюлозолитиков и сахаролитиков. Так образующиеся в процессе гидролиза целлюлозы сахара сразу потребляются сахаролитическими микроорганизмами. При таком взаимодействие целлюлозолитическая активность не иигибируются продуктами гидролиза целлюлозы, поскольку не происходит их локального накопления в области прикрепления цедлюлозолитика к субстрату.
№ сообщества
Рис. 3. Диаграмма образования водорода отобранными сообществами при 60°С (субстрат - целлюлоза; кумулятивные данные за 168 часов культивирования). 1 - зона компостирования растительных остатков (компостная куча - 3 месяца), 2 -модифицированное сообщество 5, 3 - зона компостирования растительных остатков (компостная куча - 1 год), 4 - экскременты антилопы гну, 5 - экскременты коровы.
Для понимания механизмов взаимоотношений между микроорганизмами в микробном сообществе необходимо знать его состав. Полученные нами сообщества теоретически могли включать различные виды микроорганизмов, в том числе строгих или факультативных анаэробов, таких как: Thermoanaerobacterium sp, Clostridium sp., Thermotoga neapolitana, Enterobacter aerogens, Thermotoga elfii, Caldanaerobacter subterraneus и др. Перечисленные микроорганизмы способны в процессе своего |
метаболизма потреблять растворенные сахара и выделять водород. Кроме того, там могут присутствовать микроорганизмы, разрушающие сложные биополимеры (гидролитики) такие как: С. thermocellum, С. cellulosi, С. therm olacticum, С. thermocopriae, Caldicellulosiruptor saccharolyticus и др.
Определение таксономического состава пяти отобранных сообществ методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) показало, что большинство микроорганизмов, принадлежачо одному роду, который очевидно является преобладающим в сообществах. Это род Thermoanaerobacterium. В том числе микроорганизмы, близкие к видам Т. thermosaccharolyticum, Т. aotearoense. Гакже были идентифицированы представители рода Clostridium и в частности микроорганизм близкий к Clostridium cellulosi. Полученный результат был ожидаем и полностью соответствовал ¡.
теоретическим представлениям о термофильном целлюлозолитическом сообществе. Так многие представители рода Clostridium обладают мощными целлюлозояитическими i
ферментными системами, в то время как, виды рода Thermoanaerobacter, как правило, растут на легко усваиваемых сахарах и являются хорошими продуцентами водорода.
I
11 I
Различные представители обоих родов способны расти при высоких температурах. Так, оптимум роста С. celiulosi 55"С, а Т. thermosaccharolylicum 55-60°С (Ruyet et al., 1985; Cato et al., 1986; Jin et a!., 1988, Yanling et al., 1991; Giazer and Nikado, 1995).
На следующем этапе работы было проведено выделение чистых культур микроорганизмов, присутствующих в отобранных сообществах. Из сообщества № 2, на среде Имшенецкого с глюкозой в качестве субстрата, была выделена чистая сахаролитическая культура (ЧК 1). Микроорганизм имел удлиненную палачковидную форму. В основном он был представлен попарносоединёнными или одиночными клетками. В клетках присутствовали споры. При росте на глюкозе основными продуктами метаболизма были ацетат, бутират, водород и ССЬ (рис. 4).
Все сообщества целлюлозолитических микроорганизмов, пересевали каждые 7 суток. Однако фильтровальная бумага в количестве 15 г/л среды, разрушалась за это время не полностью. По результатам взвешивания, в процессе первых семи суток культивирования наиболее активные сообщества потребляли 1/3 всего субстрата (5 г/л).
ВС02 ВН2 и.Ацетат аБутират Продукты метаболизма
Рис. 4. Состав продуктов метаболизма образуемых сахаролитической культурой (ЧК 1; после 24 часов культивирования при 60°С, субстрат глюкоза).
Следовательно, узким местом разрабатываемого процесса переработки целлюлозы, очевидно, является время её разложения сообществом целлюлозолитических микроорганизмов. Современная практика работы с целлюлозосодержащими материалами, как правило, предусматривает предварительную обработку сырья. В частности популярен гидролиз сырья различными агентами (ферменты, кислоты, щёлочи). Используют также предобработку паром, механическое измельчение и др. Особенно эффективен и экономичен в этом отношении, процесс гидролиза слабыми растворами кислот и щелочей.
Однако, целлюлозное сырьё обработанное кислотой или щёлочью, может быть токсично для цел люлозоли гических микроорганизмов. Чтобы изучить возможность эффективного гидролиза предобработанного сырья целлюлозолитическими микроорганизмами был проведён мягкий кислотный и щелочной гидролизы фильтровальной бумаги. После чего гидролизаты были промыты в воде, высушены и взвешены. Потери по массе во всех случаях составили менее 7%. Фильтровальная бумага Iидролизованная растворами серной кислоты приняла порошкообразную форму, аналогичную МКЦ. Значит гидролиз серной кислотой способствовал в основном разрыву аморфных участков целлюлозных волокон без высвобождения значительного количества глюкозы. Фильтровальная бумага гидролизованная растворами щелочей, отчасти сохранила свою форму. Затем гидролизаты были использованы в качестве субстрата для сообщества микроорганизмов X» 2.
Время, ч
-е- контроль чУ-КОН 8% -*-МаОН 6%
-*-КОН12% -*-Н28042% -»-Н2в0412%
Рис. 5. Динамика накопления водорода целлюлозолмтическим сообществом № 2 при росте на фильтровальной бумаге предобработанной различными способами (кислотный и щелочной гидролиз, мМ Нг/1 л среды).
Было показано (рис. 5), что при использовании кислотного гидролизата в качестве субстрата, микроорганизмы образовывали максимальное количество водорода за меньшее время культивирования. В этом случае стационарная фаза роста начиналась к 192 часам культивирования (В суток). После этого времени в культивационных флаконах не наблюдали оформленного субстрата, культуральная жидкость была однородной. Избыточное давление газов и концентрация образовавшегося водорода были низкими. Важно также подчеркнуть, что различия в продуктивности при культивировании
сообщества на фильтровальной бумаге обработанной 2% H2SO4 и 12% H2SO4 были незначительными.
В контрольных флаконах с субстратом для микроорганизмов в виде негидролизованной фильтровальной бумаги к этому времени количество водорода было в два раза меньше, чем в опытных, с кислотным гидролизатом фильтровальной бумаги. Тестируемое сообщество № 2, показало значительно более низкую продуктивность при росте на субстратах предобработанных растворами щелочей. Вероятно, растворы щелочей в большей степени ингибировали процесс микробной переработки целлюлозы, чем растворы кислот (рис. 5).
Таким образом, предобработка целлюлозного субстрата раствором 2% H2SO4 - это перспективный способ уменьшения времени, затрачиваемого на процесс гидролиза целлюлозы и получения водорода. Выход водорода составил 45 и 73 мМ Нг/л за 200 час культивирования в контроле и при использовании 2% H2SO4 соответственно. Следует, однако, подчеркнуть, что в крупномасштабных процессах неизбежно возникновение проблем, связанных с утилизацией сульфатных солей (гипса, в случае использования мела для нейтрализации кислоты перед культивированием).
Использование для процесса микробного получения водорода необработанной фильтровальной бумаги в сравнении с предгидролизованной фильтровальной бумагой в присутствии 2% H2SO4 не намного снижает потенциал образования Нг испытанным сообществом (62 мМ по сравнению с 75 мМ за 300 часов). Кроме того применение кислотного гидролиза для обработки целлюлозы ведет к ощутимым экологическим проблемам, перед которыми увеличение выхода продукта (Нг) на 20% теряет свою выгоду.
Для сообществ № 1 и № 2 изучат возможность переработки широкого спектра органических целлюлозосодержащих отходов, таких как: отходы пищевой промышленности (отруби, дрожжи, силикагель с остатками дрожжевой биомассы, зерновая дробина), пищевые отходы (продукция компании McDonalds), отходы сельского хозяйства и деревопереработки (сено, древесные опилки), бытовой мусор (различные виды макулатуры).
Для производителей пива большую проблему представляют отходы пивоваренного производства, среди которых: дробина, кизельгур (силикагель с остатками дрожжевой биомассы) и дрожжи. Эти материалы были добавлены в среды инокулированные сообществами № 1 и № 2 (рис. 6, 7).
Дрожжевую биомассу добавили в среду в количестве 40 г/л, кизельгур в количестве 100 г/л (основная масса кизельгура была представлена минеральным компонентом) и
дробину в количестве 8 г/л. Во всех случаях сообщества № 1 и № 2 росли на используемых субстратах. В случае роста на дрожжевой биомассе и на кизельгуре визуально не наблюдали уменьшения количества субстрата в культивационных флаконах. Это объясняется тем, что кизельгур представлен в основном минеральным компонентом. В то же время дрожжевая биомасса состоит из мёртвых, но не разрушенных клеток, которые являются трудноразлагаемым субстратом для анаэробной микробной переработки.
Фигътр овальная бумага
Дробина Дрожжи
Основной субстрат
Кизельгур
Рис. 6. Образование газообразных продуктов сообществом № 1 при росте на отходах пивоваренного предприятия (ЗАО МПБК "Очаково", г.Москва) при 60°С в течение 168 часов.
140
120 | 100
Фильтровальная бумага
Дробина Дрожжи
Основной субстрат
] Ф •
;
.
| X .1 н
1
1 иш<
ШН2 | ВС02
кизельгур
Рис. 7. Образование газообразных продуктов сообществом № 2 при росте на отходах пивоваренного предприятия (ЗАО МПБК "Очаково", г.Москва) при 60°С в течение 168 часов
Также изучали возможность роста сообществ № 1 и № 2 на пищевых отходах, которые отличались большим разнообразием своего состава. В качестве модели был использован коммерчески доступный продукт - «Чикенбургер» (МакДонаэдс, Москва),
который содержал в своем составе компоненты растительного и животного происхождения. Несколько таких продуктов гомогенизировали, высушивали в лиофильной сушке и добавляли в среды в различных концентрациях. Результаты эксперимента представлены на рисунках 8, 9.
15 35 50
Концентрация субстрата, г/л
Рис. 8. Продуктивность сообщества Лга 1 при росте на пищевых отходах при 60°С в течение 64 часов.
„„-Ли,,,.. ОН2 !ВСО2
—
--
1 1
15 36 50
Концентрация субстрата, г/л
Рис. 9. Продуктивность сообщества № 2 при росте на пищевых отходах при 60°С в течение 64 часов.
После 64 часов культивирования рост давления во флаконах не фиксировали. Было показано, что нри увеличении концентрации гомогенезата «Чикенбург ера» в среде повышается содержание образовавшихся газообразных продуктов. По результатам данного эксперимента можно с уверенностью сказать, что сырьё такого типа - это удобный субстрат для получения водорода. Вероятно, это связано с тем, что в данном продукте содержится большое количество разнообразных легкодоступных для потребления компонентов, что способствует быстрому подключению к переработке субстрата всех видов микроорганизмов в сообществе. При этом рН не успевает упасть
настолько, чтобы остановить процесс активного потребления субстрата и выделения водорода.
Также была показана возможность роста сообществ № 1 и № 2 на сене, скошенном шестью месяцами ранее (рис. 10). По количеству образованного водорода, этот субстрат заметно уступал фильтровальной бумаге. По-видимому, это происходило из-за высокого содержания трудно расщепляемых веществ в составе стеблей и листьев сена.
0№ 1 и№ 2;
Сообщество
Рис. ¡0. Продуктивность сообщества № 1 и № 2 при росте на отходах сельского хозяйства, при 60°С в течение 168 часов.
На рисунке 11, представлен график образования водорода сообществом № 2 при росте на различных концентрациях отрубей в среде. Видно, что наиболее эффективная конверсия происходит при росте на субстрате с концентрацией 5 г/л.
ф
[Йй 1
15 10 5 1
концентрация субстрата, г/л
Рис. 11. Образование водорода сообществом № 2 при росте на пшеничных отрубях (при 60°С за 24 ч).
Для сообщества № 2 было проведено сравнение продуктивности по водороду при росте на фильтровальной бумаге и древесных опилках (рис. 12).
¡Ё 1
Концентрация субстратов
1 фильтровальная бумага 0 опилки
Рис. 12. Образование водорода сообществом № 2 при росте на опилках вишневого дерева (размер частиц опилок 0,1-3 мм) и на фильтровальной бумаге при 60°С в течение 168 часов культивирования.
На рисунке 12 видно, что при повышении концентрации фильтровальной бумаги количество образованного водорода также увеличивается, однако, на древесных опилках при увеличении концентрации субстрата выше 10 г/л, продукция водорода не растет. Это может быть обусловлено как недоступностью свободных волокон целлюлозы для целлюлозолитиков, так и наличием ингибирующих факторов присутствующих в подобном субстрате. Речь идет о смолах, эфирных маслах и других бактерицидных веществах, входящих в состав древесины. Кроме того, помимо целлюлозы, опилки содержат в своем составе также некоторое количество гемицеллюлоз и лигнина, который является трудно расщепляемым субстратом для микроорганизмов. Сравнивая продуктивности по водороду сообществами на фильтровальной бумаге и опилках, можно заключить, что образование водорода на бумаге в 5 раз превосходит образование водорода на опилках. Однако при всей сложности субстрата, полученное активное сообщество способно его разлагать и при этом образовывать водород.
Следующий эксперимент был проведен с сообществом № 2 на целлюлозосодержащей печатной продукции. Сообщество выращивали на среде с газетной бумагой с цветной, черно-белой печатью, а также без печати при 60°С. Тот же
эксперимент проводили с использованием журнальной бумаги тех же параметров в таких же условиях.
газетная бумага журнальная бумага
Тип бумаги
□ белая бумага й черно-белая печать И цветная печать
Рис. 13. Образование водорода сообществом № 2 при росте на разных типах бумаги при 60°С в течение 336 часов.
Результаты экспериментов (рис. 13) указывают на то, что наибольшее образование водорода наблюдается при росте на журнальной мелованной бумаге. Это может быть обусловлено наличием факторов роста, содержащихся в составе этого типа печатной продукции, таких например как лизин и крахмал (входящих в состав клея бумаги), различных микроэлементов входящих в состав красителей, а также увеличением буферной емкости среды культивирования за счет минеральных компонентов мелованной бумаги (мел).
Таким образом, в результате описанной серии экспериментов была показана возможность роста полученных активных сообществ микроорганизмов на различных целлюлозосодержащих органических отходах. Несмотря на ряд факторов, препятствующих разложению перечисленных субстратов полученными сообществами, была показана возможность использования этих субстратов в качестве источника углерода, а также возможность активного образования водорода.
На следующем этапе изучили процесс культивирования отобранных сообществ в режиме рН-статирования (рН 6,5). В этом случае удалось определить, что в экспоненциальной фазе роста, сообщество ЧК 1 образует до 7,2 мМ Нг/ч*л среды при росте на глюкозе. Сообщество № 1, в экспоненциальной фазе роста гидролизовало целлюлозу со скоростью 1,5 г/сутки*л среды (0,2 мМ/'ч*л среды) и образовывало до 1 мМ Нг/ч*л среды. В конце культивирования, в ферментёре не наблюдали оформленного
19
субстрата, культуральная жидкость была однородной. Скорость образования продуктов метаболизма значительно снизилась.
Таким образом, было показано, что выделенная чистая культура (ЧК 1), является активным продуцентов водорода при росте на легкодоступном субстрате (глюкоза). Скорость образования водорода для ЧК 1 составила 7,2 мМ Нг/ч*л среды. В свою очередь и тестируемое сообщество целлюлозолитических водородобразующих микроорганизмов № 1, также отличалась достаточно высокой продуктивностью по образованию водорода, но уже при росте на фильтровальной бумаге. Скорость образования водорода для сообщества № 1 составила 1 мМ Нг/ч*л среды.
2. Создание технологии окисления микробного водорода с образованием электрического тока в системе ТЭ
Электроды на основе фермента гидрогеназы были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории электрохимических методов анализа кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Электроды представляли собой кусочки графитовой ткани (1 см2), на которых был иммобилизован фермент.
При непрерывном испытании ферментных электродов в модельной системе имитирующей среду ферментации было показало, что они сохраняют около 80?/о активности в течение 28 дней (более 670 часов).
Этот значительный результат позволил перейти к следующему этапу определения параметров работы водородных электродов, к инкубации электродов непосредственно в среде культивирования микроорганизмов. Для испытания в среде ферментации целлюлозолитического сообщества № 2 и чистой сахаролитической культуры ЧК 1 были использованы ферментные электроды, сделанные на базе тканевой основы (ЛШГ) и на базе войлока.
Ферментные электроды, изготовленные на основе войлока, показали себя с лучшей стороны в сравнение с тканевыми электродами. Этот материал имел толщину до 0,5 мм, при этом значительная часть фермента при иммобилизации оказывается погруженной во внутренний объем материала. Электрохимические характеристики ферментных электродов на основе войлока при пересчете на геометрическую площадь аналогичны электродам на основе ЛШГ. При инкубации в топливной ячейке электроды на основе войлока демонстрировали аналогичную тканевым электродам динамику падения активности, но нижний предел был более чем на 30% выше, чем для тканевых электродов. По-видимому, это связано с тем, что модификация поверхности электрода полипирол-виологеном и последующая иммобилизация фермента в случае использования войлока
позволила в большей степени защитить фермент от негативного влияния метаболитов, гидролитических ферментов и снижения рН, а также, позволила более крепко иммобилизовать фермент на поверхности электрода в сравнение с использованием ЛШГ.
На рисунке 14 представлены данные непрерывного измерения электрохимической активности электродов при постоянной нагрузке после максимальной активации ферментного электрода (через 15 часов после внесения инокулята) в течение 70 часов. Нагрузка бьиа подобрана таким образом, чтобы перенапряжение достигало 200 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи. Данные снимали в непрерывном режиме каждые 0,1 сек., на графике представлены усреднённые данные за каждые два часа.
50-
10 15 20 25 30 35 40
Время.
45 50 55 «30 65 70 75
Рис. 14. Стабильность ферментного ТЭ при поглощении водорода, образуемого ЧК 1 в течение 70 часов (конценграция водорода в газовой фазе 21,5%, субстрат глюкоза, температура 60°С, электродный материал - войлок).
В течение первых шести часов после активации электрода наблюдали рост активности, вызванный продолжающейся стадией выделения газа микроорганизмами, затем падение активности до уровня в 70% от начального из-за снижения рН и, предположительно, удаления плохо связанного и легкодоступного дня разрушения фермента с поверхности электрода. К 10-му часу значение тока стабилизируется на уровне 70% от первоначальной активности и остаётся практически без изменений. Небольшие колебания на 25-том и 50-том часах, объясняются снижением окружающей температуры, поскольку раз в сутки реактор вынимали из термостата для проведения процедур контроля рН, давления, состава газовой фазы к т.д. В эти отрезки времени температура среды культивирования опускалась до комнатной, а избыточное давление газов в реакторе уменьшалось.
В ходе работы, была разработана биореакторная топливная ячейка, совмещающая в себе биореакгор и ферментыный ТЭ (рис. 15).
Рис. 15. Схематическое изображение и фотография биореакторной топливной ячейки: 1 -контакг ферментного электрода, 2 - кислородный электрод, 3 - воздушный шланг, 4 -мембрана для отбора проб в процессе эксперимента, 5 - система сброса избыточного давления, 6 - ферментный электрод.
В биореакторной топливной ячейке проводили эксперименты по периодическому культивированию как целлюлозолитичеекого сообщества микроорганизмов (сообщество № 2), используя в качестве субстрата фильтровальную бумагу, так и сахаролитического микроорганизма (ЧК 1) используя в качестве субстрата глюкозу.
После внесения инокулята в среду ферментации проводили измерение потенциала разомкнутой цепи. Снижение этого значения является показателем появления в среде водорода. Заметное падение потенциала наблюдали при содержании водорода в газовой фазе менее 0,1 %. Практически полная активация происходила в среднем через 12-16 часов после внесения инокулята.
Вольтамперная характеристика для электрода погружённого в среду ферментации микроорганизмов представлена на рисунке 16. Отличие потенциала разомкнутой цепи от теоретического объясняется снижением рН среды до значения 4,5 - 5,0, что значительно влияет на активность гидрогеназы. Максимадьная мощность, которую способен поддерживать гидрогеназный электрод площадью 1 см2 составила 220 мкВт. Она достигается при перенапряжении 400 мВ относительно разомкнутой цепи. Зависимость мощности от потенциала представлена на рисунке 17.
1000 п
5 400-
200 -
У
—I— -600
Е, мб
Рис. 16. Вольтамперная характеристика топливной ячейки в процессе культивирования ЧК 1 (содержание водорода в газовой фазе 24%, температура 60°С, рН 4,5).
Однако электрод площадью 1 см2 не способен окислить весь образованный водород, так как, активность фермента по поглощению водорода составляет 100 мкМ/мин*1 мг белка (Воронин, 2011). На одном графитовом электроде площадью 1 см2 иммобилизуется 4,5-6,5 мкг фермента. Отсюда можно рассчитать, что 1 электрод площадью 1 см2 способен окислить в среднем всего около 30 мкМ Нг/час. Однако при увеличении площади водородного и кислородного электродов теоретически мощность должна возрасти.
На следующем этапе разработали технологическую схему, позволяющую объединить ферментный топливный элемент и ферментёр, который позволял вести полностью контролируемый и управляемый процесс культивирования водородобразующих микроорганизмов.
О- ■
|-,-т-,-|-1-!-,-1-. |
-1000 -И» -600 -400 -200 0
Е, мВ
Рис. 17. Зависимость мощности электрического тока от перенапряжения топливной ячейки в процессе культивирования ЧК 1 (содержание водорода в газовой фазе 24%, температура 60°С, рН 4,5).
Таким образом была сконструирована лабораторная установка для переработки органических отходов в водород и электроэнергию, совмещающая в себе технологии микробного биореактора и ферментного топливного элемента (рис. 18). Была показана возможность образования водорода из целлюлозы и окисления образующегося водорода в электроэнергию непосредственно в среде культивирования целлюлозолитического сообщества № 1. Стабильность работы установки составила не менее 5 суток. Максимальная мощность электрического тока достигла 40 мкВт/см2 ферментного электрода. Это в 5 раз меньше чем значение, полученное при работе с биореакторной топливной ячейкой. Такая разница связана с влиянием избыточного давления водорода на работу ферментного электрода. Высокое избыточное давление способствовало увеличению количества растворённого водорода в среде ферментации. Так в биореакторной ячейке избыточное давление газов достигало 1,5 атм, в то время как в проточной системе образующиеся газы сразу стравливали.
г
Рис. 18. Разработанный прототип проточной системы. 1 - ферментёр Liflus ОХ, 2- ТЭ, 3 -перистальтический насос. 4 - универсальный амперметр, 5 - универсальный вольтметр, 6 - магазин сопротивлений.
Попытки объединить биореактор и ТЭ, работающий на водородном топливе, предпринимались и ранее (Dante, 2005; Не et al., 2005; García-Peña et al, 2009). В этих работах водород образуемый фототрофными микроорганизмами окисляли на платиновых электродах. Лучшие образцы ферментных ТЭ (не на основе гидрогеназы) достигают мощности 500-700 мкВт/см2 (Paimore et al., 1998; K.atz et al., 2003; Yuhashi et al., 2005). В работе (Katz et al., 2003) описан ферментный ТЭ на основе глкжозоксидазы (анод) и цитохромоксидазы (катод), мощность которого составила 550 мкВт/см2. Однако в данных работах не проводили интеграцию ферментных ТЭ с микробным биореактором.
Операционная стабильность ферментных ТЭ исчисляется, как правило, часами, реже 1-2 днями. Но встречаются и исключения - например, у Yuhashi et al., (2005) описан ТЭ на основе глюкозодегидрогеназы/бшшрубиноксидазы, непрерывно функционировавший в течение 152 часов. В представленной работе стабильность системы составила не менее 120-ти часов и это далеко не предел для разработанной установки. Поскольку после извлечения из среды культивирования микроорганизмов электрод восстанавливал до 90% первоначальной активности.
Итак, нами впервые были разработаны системы, совмещающие ферментный ТЭ на основе гидрогеназы и термофильный анаэробный микробный биореактор. Мы показали, что разработанные системы стабильны в присутствии всех групп соединений, выделяемых используемыми сообществами микроорганизмов. Максимальная мощность, которая была достигнута, составила 220 мкВт/см2 ферментного электрода
выводы
1. Из более чем 50-ти природных биотопов выделены активные анаэробные микробные сообщества и чистые культуры микроорганизмов, разлагающие целлюлозу в термофильных условиях (60°С) с образованием значительного количества водорода и жирных кислот. Из них отобрано 5 наиболее продуктивных сообществ, для которых определена таксономическая принадлежность основных микробных компонентов.
2. Показана возможность переработки выделенными сообществами различных целлюлозосодержащих отходов.
3. Впервые доказана возможность использования гидрогеназных электродов в среде культивирования анаэробного термофильного целлюлозолитического сообщества и чистой сахаролитической культуры. Разработана технология объединения анаэробного термофильного микробного биореактора и ферментного топливного элемента. На основе технологии сконструировано несколько прототипов биореакторной топливной ячейки: Максимальная мощность генерируемого тока в процессе работы ячейки составила 220 мкВт/см2 при перенапряжение 400 мВ.
4. Разработана лабораторная установка по переработке целлюлозы в водород и электроэнергию термофильным микробным сообществом. Максимальная скорость разложения целлюлозы и образования водорода целлюлозолитическим сообществом № 1 составила 1,5 г/сугки*л среды (0,2 мМ/ч*л среды) и 1 мМ Н2/ч*л среды соответственно, а максимальная мощность электрического тока - 40 мкВт/см2 при перенапряжении 400 мВ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи в рецензируемых журналах
1. Netrusov A., Abramov S.. Sadraddinova £., Shestakov A., Shalygin М„ Teplyakov V,. Membrane-assisted separation of microbial gaseous fuels from renewable sources // Desalination and Water Treatment, 2010. 14: 252-258.
2. Абрамов C.A/.. Садраддчнова Э.Р., Шестаков A.M., Шалыгин М.Г., Нетрусов А.И., Тепляков В.В. Превращение органических отходов сельского хозяйства в топливо для альтернативной энергетики // Хранение и переработка сельхозсырья, 2010. 1:8-11.
3. Нетрусов А.И., Карякин A.A., Тепляков В.В., Шалыгин М.Г., Воронин О.Г., Абрамов СМ., Садраддчнова Э.Р., Митрофанова Т.И., Глазунова Е.В., Шестаков А.И. Основы технологии микробиологической конверсии органических целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию через промежуточное образование биоводорода // Катализ в промышленности, 2010. 5:78-84.
Тезисы докладов
1. Абрамов СМ., Садраддинсва Э.Р.. Шестаков А.И., Митрофанова Т.Н., Глазунова Е.В., Воронин О.Г., Корякин A.A., Нетрусов А.И. Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в водород и использование ферментного топливного элемента для преобразования водорода в электроэнергию. Сборник материалов Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (2009 г., Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова), с. 15.
2. Абрамов СМ.. Садраддинова Э.Р. Переработка органического сырья и отходов в электроэнергию консорциумом гетеротрофных микроорганизмов через промежуточное образование биоводорода. Тезисы докладов третьей международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (16-18 июня 2009 г., Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова), с. 9-10.
3. Садраддинова Э.Р., Абрамов СМ., Шестаков А.И., Митрофанова Т.Н., Глазунова Е.В., Шалыгин М.Г., Нетрусов А.И., Тепляков В.В. Термофильная микробная конверсия целлюлозосодержащего органического сырья и отходов в водород с использованием мембранных технологий газоразделения. Сборник материалов Всеросийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (2009 г., Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова), с. 159.
4. Netrusov A., Shestakov A., Voronin О., Sadraddinova Е., Abramov S.. Shalygin М„ Teplyakov V., Kaiyakin A. Green energy from organic raw materials and wastes. Материалы
международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (14-17 марта 2010 г., Москва), с. 293-294.
5. Воронин ОТ., Абрамов СМ., Корякин А.А. Высокоактивные ферментные электроды для утилизации биоводорода, полученного при микробиологической переработке органических отходов. Сборник тезисов 5-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (16-20 марта 2009 г., Москва), с. 316.
6. Нетрусов А.И., Шестаков А.И., Воронин О.Г., Садраддинова Э.Р., Абрамов С.М., Шалыгин М.Г., Тепляков В.В., Корякин А.А. Устойчивая система получения водорода и электротока при термофильной переработке целлюлозы и отходов. Сборник тезисов докладов международной конференции EurAsiaBio-2010 (13-15 апреля 2010 г., Москва), с. 136-137.
7. Netrusov A., Abramov S., Sadraddinova Е., Shestakov A., Mitrofanova Т., Glazunova Е., Shalygin М„ Teplyakov V. Thermophilic microbial conversion of cellulose-containing organic waste to hydrogen using membrane-assisted gas separation technology. Abstract book of PHRMEA-2010 conference: Membrane science and technology conference of Visegrad Countries, Tatranske Matliare, (September 4-8,2010, Slovakia), p. 97.
8. Абрамов СМ.. Садраддинова Э.Р., Шестаков А.И., Митрофанова Т.И., Глазунова Е.В., Воронин ОТ. Корякин А.А., Нетрусов А.И. Микробная конверсия неллюлозосодержащих отходов в водород и использование ферментного топливного элемента для преобразования водорода в электроэнергию. Сборник материалов Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (2010 г., Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова), с. 13.
Подписано в печать:
29.08.2011
Заказ № 5819 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абрамов, Сергей Маркович
Введение.
1. Обзор литературы.
1.1. Образование водорода микроорганизмами в природе.
1.2. Целлюлоза и целлюлозолитические микроорганизмы.
1.2.1. Разложение целлюлозы в природе.
1.2.2. Целлюлозолитические ферментные системы.
1.2.3. Регуляция синтеза целлюлазных комплексов.
1.3. Получение водорода из различных видов целлюлозосодержащего сырья.
1.4. Предобработка целлюлозосодержащего сырья.
1.5. Микроорганизмы применяемые для получения водорода.
1.6. Конверсия микробного водорода в электроэнергию.
1.6.1. Топливные элементы.
1.6.2. Биологические топливные элементы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации"
Одним из определяющих факторов развития любого общества является его энерго -обеспеченность, причем энергетические потребности человечества удваиваются каждые 10-15 лет. Потребление энергии (в расчете на одного человека) за историю развития человечества возросло более чем в 100 раз (Kovacs et al., 2000). Об исчерпаемости запасов нефти и необходимости перехода на другие виды топлива учёные задумывались уже в те времена, которые сейчас мы относим, чуть ли не к началу развития нефтехимического синтеза и нефтепереработки. В.Е. Тищенко в монографии «Химическая промышленность и война», опубликованной в 1923 г., писал: «Каменный уголь дорожает, запасы его' истощаются и это обязывает соблюдать величайшую экономию в его использовании, высказываются опасения за полное истощение нефтяных запасов в течение ближайших 30 лет» (Данилов, 2003). С тех пор прошли десятилетия, из недр земли извлечены десятки миллиардов тон нефти, ежегодные её добычи возросли в сотни раз, а потенциал добычи нефти оценивается всё теми же 30-ю годами. Нефтяное изобилие действовало расслабляющим образом, и к альтернативным топливам обращались только в крайнем случае, главным образом, те страны, которые были обделены нефтяными ресурсами.
За время индустриального периода развития цивилизации, заметно повысилась концентрация парниковых газов в атмосфере Земли. При современных темпах развития энергетики, изменение климата Земли может наступить уже в ближайшие 40-60 лет (Балашев, 1998; Teplyakov et al., 2002). Эти последствия, заставляют передовые умы человечества искать выход из ситуации неэффективного использования ограниченных ресурсов и зависимости от них. Кроме того, разведанных запасов нефти и газа; учитывая современные темпы их потребления, хватит примерно на 50 лет, а запасов угля хватит примерно на 150 лет (Chen et al., 2001). Переход к биоэнергетике позволит отчасти устранить ряд проблем связанных с использованием ископаемых источников энергии.
На данном этапе развития нашей цивилизации перед энергетикой возникают новые серьёзные задачи, решение которых обещает качественно изменить жизнь будущих поколений.
Получение энергии из биомассы - одно из направлений биотехнологии, связанное с эффективным использованием энергии, запасаемой при фотосинтезе. Это достигается путем:
1) превращения биомассы, накопленной в результате фотосинтеза в дешевое и высококалорийное топливо - биогаз, этанол, водород и т. д.;
2) модификации самого процесса фотосинтеза, в результате которых энергия света с максимальной эффективностью используется на образование водорода или другого 4 топлива, минуя стадию фотоассимиляции СОг и синтеза компонентов клетки.(Мулява, 2001).
В последнее время большое количество работ посвящено разработке процесса прлучения водорода из возобновляемого сырья. Этому виду "вечного" топлива, использование которого было описано ещё романах Жюля Верна, пророчат колоссальные будущее, способное в корне изменить нынешнюю энергетическую систему. Теплота сгорания водорода в несколько раз превышает теплоту сгорания бензина. Хотя газ водород известен людям с 1766 года, началом водородной энергетики можно считать 1974 г, когда после энергетического кризиса 1973 г, была создана Мировая ассоциация' водородной энергии (Бутаев, 2004).
В свободном состоянии водород (Н2) на Земле встречается крайне редко. Примерно половина водорода, производимого в мире сегодня, извлекается из природного газа в ходе его переработки методом парового реформинга (Алексеев, 2005; Ве^танг, 2007). Этот метод имеет два недостатка. Во-первых, в качестве побочного продукта выделяется углекислый газ, загрязняющий атмосферу и, во-вторых, сырьё для производства водорода является исчерпаемым ресурсом. Интересным для химической промышленности способом получения чистого водорода, считается разложение воды (2Н2О —» 2Нг + О2) в электролизерах с затратой электроэнергии. Однако на данный момент при производстве водорода как горючего, к примеру, для топливных элементов (ТЭ), отдача энергии не превышает 25% от энергии потребляемой теплоэлектростанцией (ТЭС). Для получения водорода путём электролиза воды можно использовать электроэнергию, генерируемую на атомных электростанциях (АЭС) или получаемую с помощью возобновляемых источников гидроэлектростанции, энергия ветра, Солнца, гидротермальная энергия, энергия приливов и отливов, энергия, заключённая в биомассе (Алексеев, 2005).
Одним из факторов, ограничивающих применение водорода как энергоносителя, является отсутствие конструкционных материалов, способных работать в газообразном водороде при температуре горения и в жидком водороде при очень низких температурах. Другой сдерживающий фактор - высокий уровень взрыво- и пожароопасности водородного топлива. Остаются нерешенными проблемы хранения, транспортировки и использования водорода. Сейчас водород, как правило, хранят в металлических баллонах, в которых удельная запасаемая энергия со сжатым до 200 атм газом составляет 1,4 МДж/кг. Активно обсуждаются идея хранения водорода в виде металлогидридов. Предполагается, что в будущем удельная запасаемая энергия в таких накопителях составит 2-10 МДж/кг (Алексеев, 2005).
Аналитики утверждают, что на первом этапе "водородной эры" в энергетике будут преобладать стационарные топливные элементы (ТЭ), позволяющие преобразовывать энергию химической связи водорода в электричество (Данилов, 2003; Бутаев, 2004; Карякин и Морозов, 2006). В результате работы водородных ТЭ помимо электроэнергии производятся только тепло и вода (в небольших количествах). ТЭ не содержат подвижных деталей и абсолютно бесшумны. Уже сегодня большинство ведущих автомобильных компаний имеют прототипы автомобилей на ТЭ. Кроме автомобильного транспорта, областью применения ТЭ может стать децентрализованное энергоснабжение. По оценкам специалистов, в Германии в ближайшее время доля использования энергии, получаемой за счёт работы ТЭ в системе отопления и электроснабжения составит 10 - 30%. Энергоустановки на основе ТЭ электрической мощностью 1,5 кВт и тепловой мощностью 2,9 кВт будут использоваться в коттеджах и многоквартирных домах. ТЭ находят своё применение и в более специализированных областях. Например, их использование в качестве энергоустановок может сделать подводные лодки бесшумными и свести к минимуму тепловые выбросы, что позволит им быть более незаметными для гидроакустических систем противника. В космосе ТЭ используют начиная с 60-х годов прошлого века (Бутаев, 2004; Карякин и Морозов, 2006).
Решить проблему получения водорода можно с помощью водородобразующих микроорганизмов (Desvaux, 2005; Mitsuyoshi et al., 2006; Hawkes et al. 2007; Li, Fang, 2007). Водород микробного происхождения можно преобразовывать в электроэнергию путём окисления в ТЭ. или путём сжигания в двигателях внутреннего сгорания, особенно перспективен в этом отношении роторный двигатель, которым уже сейчас оснащён ряд серийных моделей автомобилей (Yokoyama et al., 2007; Alei et al., 2010).
В то же время, водородобразующие микроорганизмы могут быть источником и других полезных продуктов, включая различные спирты и жирные кислоты. При этом, в качестве субстрата для образования водорода и поддержания жизнедеятельности микроорганизмов могут использоваться органические отходы и сточные воды, что в свою очередь решает проблему утилизации органических отходов (Bagi et al., 2007; Datar et al., 2007; Tao et al. 2007; Saratale et al., 2008; Argun et al., 2009; Vrije et al., 2009; Argun, Kargi, 2010).
Исходя из вышеизложенного, исследования, посвященные разработке системы получения водорода с помощью микроорганизмов из органических отходов, и использованию водорода в качестве топлива для ТЭ следует считать крайне актуальными и своевременными. Поэтому для настоящей работы были выбраны следующие основные цели:
1. Выделение микробных сообществ утилизирующих целлюлозосодержащие отходы с образованием Н2;
2. Создание лабораторной установки для нерерывной конверсии микробного Н2 в электроэнергию.
1. Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Абрамов, Сергей Маркович
5. Выводы
1. Из более чем 50-ти природных биотопов выделены активные анаэробные микробные сообщества и чистая культура микроорганизмов, разлагающие целлюлозу в термофильных условиях (60°С) с образованием значительного количества водорода и жирных кислот. Из них отобрано 5 наиболее продуктивных сообществ, для которых определена таксономическая принадлежность основных микробных компонентов.
2. Показана возможность переработки выделенными сообществами различных целлюлозосодержащих отходов (опилки, газетная и журнальная бумага, сено, дрожжи, дробина, отруби и пищевые продукты и др.).
3. Впервые доказана возможность использования гидрогеназных электродов в среде культивирования анаэробного термофильного целлюлозолитического сообщества и чистой сахаролитической культуры. Разработана технология объединения анаэробного термофильного микробного биореактора и ферментного топливного элемента. На основе технологии сконструировано несколько прототипов биореакторной топливной ячейки. Максимальная мощность генерируемого тока в процессе работы ячейки составила 220 мкВт/см при перенапряжение 400 мВ.
4. Разработана лабораторная установка по переработке целлюлозосодержащего материала в водород и электроэнергию термофильными микробными сообществами. Максимальная скорость разложения целлюлозы и образования водорода целлюлозолитическим сообществом № 1 составила 1,5 г/сутки*л среды (0,2 мМ/ч*л среды) и 1 мМ Н2/ч*л среды соответственно, а максимальная мощность электрического тока - 40 мкВт/см2 при перенапряжении 400 мВ.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абрамов, Сергей Маркович, Москва
1. Абрамов С.М., Садраддинова Э.Р., Шестаков А.И., Шалыгин М.Г., Нетрусов А.К, Тепляков В. В. Превращение органических отходов сельского хозяйства в топливо для альтернативной энергетики // Хранение и переработка сельхозсырья. 2010. № 1. С. 811.
2. Алексеев Б.А. Применение накопителей энергии в электроэнергетике // Электро. 2005. № 1.С. 42-48.
3. Баграмян К, Трчуняп А. Особенности структуры и функционирования формиат-водород-лиазы-фермента смешанного брожения у Escherichia coli. II Биохимия, 2003. т. 68. № 11. с. 1445-1458.
4. Балашев К.П.,. Фотокаталетическое преобразование солнечной энергии // Соровский образовательный журнал. 1998. V. 8. Р. 58-64.
5. Верезин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов А.И. Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы // Докл. АН СССР. 1978. Т. 240. № 3. С. 615-617.
6. Бутаев A.M. Каспий: зачем он Западу. М.: МГУ, 2004. 595 с.
7. Данилов A.M. Альтернативные топлива: достоинства и недостатки. Проблемы применения // Рос. хим. ж. 2003. Т. 47. № 6. С. 4-11.
8. Заварзин Г.А. Роль комбинаторных событий в развитии биоразнообразия // Природа 2002. № 1: 12-19.
9. Корякин А., Морозов С. Топливо XXI века // В мире науки. 2006. № 1:82-86.
10. И. Клесов A.A. Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: МГУ, 1986. С. 95-136
11. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: Белок и другие ценные продукты. Минск,: Наука и техника, 1988. 261 с.
12. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. Молекулярное клонирование:14. методы генетической инженерии // Пер. с англ. М.: Мир, 1984.
13. Ленглер Й. Древе Г. Шлегель Г. (под ред.) Прокариоты // Пер. с англ. М.: Мир, 2005. 656 с.
14. Майерс Р., Шеффилд В., Кокс Д. Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез. Анализ генома: Методы. М.: Мир, 1990. С. 123-175.120
15. Митрофанова Т. И. 1995. Свойства новых штаммов термофильных анаэробных бактерий. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. МГУ. с. 115.
16. Морозов С.В., Воронин О.Г., Корякина Е.Е., Карякин A.A. Водородные топливные электроды на основе ферментов. // Нано- и микросистемная техника. 2006. №. 5. С. 913.
17. Мулява В. В. Биотехнология. СГТУ. Реферат. Кафедра физиологии. 2001.
18. Нетрусов А.К, Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др.; Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений Под ред. Нетрусова А.И. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.
19. Нетрусов А.К, Котова И.Б. Микробиология. М.: Академия, 2006. С. 102-115.
20. Осетрова Я. В., Скундин А. М. Термостойкие мембраны для топливных элементов // Электрохимическая энергетика. 2007. Т. 7. № 1. С. 3-16.
21. Перевалова A.A., 2007. Молекулярная детекция разнообразия Crenarchaeota в наземных горячих источниках. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ИНМИ РАН. С. 171.
22. Пиневич A.B. Биология прокариотов. С.-Петерб. ун-та, 2007. 31 с.
23. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биологической химии. 2000. № 40. С. 205—266.
24. Раздолъская Н.В., Гаврилова О.В., Теличко И.Н., Иванов A.M., Криворучко А.Б. Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis //Микробиология. 2007. №8. С. 283-291.
25. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое В.М. Биоконсервация лигноцеллюлозных материалов. М.: МГУ, 1995. С. 7-91.
26. Славянский A.A. Сахар и основы его производства. М., МГУПП-Пищепромэнергоналадка, 2005. С. 72-74.
27. Тернера Э., Краубе И., Уилсона Д. М. (Под ред.) Биосенсоры. Мир, 1992. 615 с.
28. Уминский A.A. Технологии комплексной переработки древесины лиственницы и свойства конечных продуктов. Тез. докл. международной науч. конф. «Международное сотрудничество в биотехнологии: Ожидания и реальность» 2006. Пущино.
29. Шерман М.Б., Орлова Е.В., Смирнова Е.А., Зорин H.A., Тагунова КВ., Куранова Td.H> Гоготов И.Н. Структура микрокристаллов гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicinct I I Биофизика. 1987. Т. 295 № 2. С. 509-512.121
30. Adams M. W. W. The Structure and mechanism of iron-hydrogenases // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1020. № 2. P. 115-145.
31. Albracht S.P.J. Nickel hydrogenases: in search of the active site // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1188. P. 167-204.
32. Alei G., Yanling H., Changli 0., Xing Y., Zhihua Z. Effect of key factors on hydrogen production from cellulose in a co-culture of Clostridium thermocellum and Clostridium thermopalmarium // Bioresource Technology. 2010. V. 101. P. 4029-4033.
33. Alfons J. M. Stams and Caroline M. Plugge. Electron transfer in syntrophic communities of anaerobic bacteria and archaea // Microbiology. 2009. V. 7. P. 568-577
34. Allcock E.R., Woods D.R. Carboxymethyl cellulase and cellobiase production by Clostridium acetobutylicum in an industrial fermentation medium. Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.41. №2. P. 539-541.
35. Angelidaki I., Ellegaard L., Ahring B. Applications of the anaerobic digestion process // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2003. № 82 P. 1-34.
36. Argun H., Kargi F„ Kaplan I.K. Effects of the substrate and cell concentration on biohydrogen production from ground wheat by combined dark and photo-fermentation // Int. J. Hydrogen Energy. 2009. V. 34. №15. C. 6181-6189.
37. Argun II., Kargi F. Effects of light source, intensity and lighting regime on bio-hydrogen production from ground wheat starch by combined dark and photo-fermentations // Int. J. Hydrogen Energy. 2010. V. 35. № 4. P. 1604-1612.
38. Armstrong F.A. Hydrogenases: active site puzzles and progress // Current Opinion in Chemical Biology. 2004. № 8. P. 133-140.
39. Asada Y., Tokumoto M, Aihara Y. Hydrogen production by co-coltures of Lactobacillus a photosynthetic bacterium, Rhodobacter sphaeroides RV. Int. J. Hydrogen Energy, 2006. V. 31. № 11. P. 1509-1513.
40. Bagi Z, Acs K, Balint B., Horvath L., Dobo K, Perei K, Rakhely G., Kovacs K. Biotechnological intensification of biogas production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 76. № 2. P. 473—482.
41. Bartlett P.N., Pratt K.F.E. Theoretical treatment of diffusion and kinetics in amperometric immobilized enzyme electrodes Part I: Redox mediator entrapped within the film // J. Electroanal. Chem. 1995. V. 397. № 1-2. P. 61-78.
42. Barton S., Gallaway J., Atanassov P. Enzymatic Biofuel Cells for Implantable and Microscale Devices // Chem. Rev. 2004. № 104. P. 4867-4886.
43. Berlin A., Gilkes N., Kilburn D„ BuraR., Markov A., Skomarovsky A., Okunev O., Gusakov A., Maximenko V., Gregg D., Sinitsyn A., Saddler J. Evaluation of novel fungal cellulase122
44. Desvaux M. Clostridium cellulolyticum: model organism of mesophilic cellulolytic Clostridia// Ferns Microbiol. 2005. V. 29. P. 741-764
45. Ditzig J., Liu II., Bruce E. Logan. Production of hydrogen from domestic wastewater using a bioelectrochemically assisted microbial reactor (BEAMR) // International Journal of Hydrogen Energy. 2007. V. 32. P. 2296 2304.
46. Du Z, Li H., Gu T. A state of the art review on microbial fuel cells: A promising technology for wastewater treatment and bioenergy // Biotechnology Advances, 2007. 25:464-482.
47. Duche O., Elsen S., Cournac L., Colbeau A. FEBS J, 2005. 272: 3899.
48. Fan Y-T., Zhang Y-H., Zhang S-F., Hou H-W., Ren B-Z. Efficient conversion of wheat straw wastes into biohydrogen gas by cow dung compost // Bioresource Technol. 2006. V. 97. № 3. P. 500-505.
49. Fan Y., Li G„ Wu L., Yang W„ Dong C., Xu K, Fan W. Treatment and reuse of toilet wastewater by an airlift external circulation membrane bioreactor // Process. Biochemistry. 2006. V. 41. P. 1364-1370.
50. Foersler S. Single crystal EPR studies of the reduced active site of NiFe. hydrogenase from Desulfiovibrio vulgaris 11 J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125 P. 83-93.
51. Garcin E., Vernede X., Hatchikian E.C., Volbeda A., Frey M., Fonticilla-Camps J.C. The crystal structure of a reduced NiFeSe. hydrogenase provides an image of the activated catalytic center// Structure. 1999. V. 7 P. 557-566.
52. García-Peña E.I., Guerrero-Barajas C., Ramirez D., Arriaga-Hurtado L.G. Semi-continuous biohydrogen production as an approach to generate electricity // Bioresource Technology. 2009. V. 100. P. 6369-6377.
53. Gasanova L.G., Sadraddinova E.R., Netrusov A.I., Teplyakov V.V., Zenkevich KB., Modigell M.,. Membrane bioreactors for fuel gases obtaining // Membranes (Rus.). 2007. V. 1 № 33, P. 32-42.
54. Glazer A., Nikado H. Biomass. In: Microbial Biotechnology. Freeman and Co, 1995. 62:327-356.
55. Gorton L., Lindgren A., Larsson T., Munteanu F.D., Ruzgas T., Gazaryan I. Anal Chim Acta, 1999.400: 91.
56. Grishutin S.G., Gusakov A.V., Markov A. V., Ustinov B.B., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. V. 1674. P. 268- 281.
57. Groenestijn J., Hazewinkel J., Nienoord M., Bussmann P. Energy aspects of biological hydrogen production in high rate bioreactors operated in the thermophilic temperature range // Int. J. Hydrogen Energy. 2002. V. 27. №11. P. 1141-1147.
58. Grotenhuis J. T. Bacteriological composition and structure of granular sludge adapted to different substrates // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 1942-1949.
59. Hall M,, Bansal P., Lee J.H., Realff M.J., Bommarius A.S. Biological pretreatment of cellulose: enhancing enzymatic hydrolysis rate using cellulose-binding domains from cellulases // Bioresour. Technol. 2011. V. 102. № 3. 2910-2915.
60. Hawkes F.R., Dinsdale R., Hawkes D.L., Hussy I. Sustainable fermentation hydrogen production: challenges for process optimization // Int. J. Hydrogen Energy. 2002. V. 27. P. 1339-1347.
61. Hawkes F., Hussy I., Kyazze G., Dinsdale R„ Hawkes D. Continuous dark fermentative hydrogen production by mesophilic microflora: Principles and progress // Int. J. Hydrogen Energy. 2007. V. 32. № 2. P. 172-184.
62. He D., Bultel Y., Magnin J.-P., Roux C„ Willison J.C. Hydrogen photosynthesis by Rhodobacter capsulatus and its coupling to a PEM fuel cell // Journal of Power Sources, 2005. V. 141. P. 19-23.
63. HeadJ.M., Saunders J.R., Pickup R.W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms // Microbial Ecology. 1998. V. 35 P. 1-21.
64. Holzman D.C. Microbe power. Environ // Health Persp. 2005. V. 113. P. 754-757.
65. Hussy /., Hawkes F.R., Dinsdale R.M., Hawkes D.L. Continuous fermentative hydrogen production from sucrose and sugarbeet // Int. J. Hydrogen Energy. 2005. V. 30. P. 471483.
66. Ishikawa M., Yamamura S., Takamura Y„ Sode K., Tamiya E., Tomiyama M. Development of a compact high-density microbial hydrogen reactor for portable bio-fuel cell system // Int. J. Hydrogen. Energy, 2006. P. 31:14
67. Jkeda T., Takagi K„ Tatsumi H., Kano K. Electrochemical control of hydrogenase action of Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) // Chem Lett. 1997. V. 3. P. 5-6.
68. Ivanovo G., Rakhely G., Kovacs K. Hydrogen production from biopolymers by Caldicellulosiruptor saccharolyticus and stabilization of the system by immobilization // Int. J. Hydrogen Energy. 2008. V. 33. P. 6953-6961.
69. Tin F., Yamasato K., Toda K. Clostridium thermocopriae sp. nov., a cellulolytic thermophile from animal feces, compost, soil, and a hot spring in Japan // Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 279-281.
70. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Schuhmann W., Schmidt H.L. Electropolymerized Azines: Part II. In a Search of the Best Electrocatalyst of NADH Oxidation // Electroanalysis. 1999. V. 11. №8. 553-557.
71. Katz E., Willner L, Kotlyar A.B. A non-compartmentalized glucose 02 biofuel cell by bioengineered electrode surfaces//J. Electroanal. Chem. 1999. V. 479. №1. 64-68.
72. Katz E., Shipway A.N., Willner I. Handbook of Fuel Cells Fundamentals // Technology and Applications. 2003. № 1. P. 355.
73. Kim B.H., Kim H.J., Hyun M.S., Park D.H. Direct electrode reaction of Fe(III)-reducing bacterium, Shewanellaputrifaciens. J. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 9. P. 127-131.
74. Kjeanga E„ Djilali N. Sintona D. Microfluidic fuel cells: A review // J. Power Sour. 2009. V. 186. P. 353-369.
75. Kleerebezem R., Loosdrecht M. Mixed culture biotechnology for bioenergy production. Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. № 3. P. 207-212.
76. Kondratieva, E.N., Gogotov I.N. Molecular Hydrogen in microbial Metabolism. M.: Nauka 1981.
77. Kondratieva E. N. Gogotov IN. Production of Molecular Hydrogen in Microorganisms // Advances in Biochemical Engineering Bioltechnology. 1983. V. 28. P. 139-151.
78. Kongjan P., Min B., Angelidaki I. Biohydrogen production from xylose at extreme thermophilic temperatures (70°C) by mixed culture fermentation II Water Res. 2009. V. 43. №2. P. 1414-1424.
79. Korbas M, Vogt S., Meyer-Klaucke W., Bill E., Lyon E.J., Thauer R.K., Shima S. J Biol Chem, 2006. 281: 30804-30813.
80. Kotsopoulos T., Zeng R., Angelidaki I. Biohydrogen production in granular up-flow anaerobic sludge blanket (UASB) reactors with mixed cultures under hyper-thermophilic temperature (70°C) // Biotechnol Bioeng. 2006. V. 94. № 2. P. 296-302.127
81. Kovacs K.L., Bagyinka C., Bodrossy L., Csaki R., Fodor B., Gyorfi K., Hanczar T., Kalman M., Osz J., Perei K., Polyak B., Rakhely G., Takacs M., Toth A., Tusz J,. Recent advances in biohydrogen research // Pflugers Arch. 2000. V. 439. P. 81-83.
82. Leschine, S. B. Cellulose degradation in anaerobic environments // Annu. Rev. Microbiol. 1995. V. 49. P. 399-426.
83. Lettinga G., Redac S., Parshina S., Nozhevnikova A., van Lier J.B., Stams A.J.M. High-rate anaerobic treatment of wastwater at low temperatures // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. №4. P. 1696-1702.
84. Levin D.B., Islam R., Cicek N. Sparling R. Hydrogen production by Clostridium thermocellum 27405 from cellulosic biomass substrates // Int. J". Hydrogen Energy. 2006. V. 31. P. 1496-1503.
85. Liao B-Q., Kraemer J.T., Bagley D.M. Anaerobic Membrane Bioreactors: Applications and Research Directions //Environ. Sci. Technol. 2006. V. 36. P. 489-530.
86. Li C.L., Fang H.H.P. Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by mixed cultures. Crit. Rev. Env. Sci. Trchnol. 2007. V. 37. № 1. P. 1-39.
87. Lin C-Y., Lay C.H. A nutrient formulation for fermentative hydrogen production using anaerobic sewage sludge microflora// Int. J. Hydrogen Energy, 2005. V. 30. P. 285-292.
88. Lin C-Y., Lee C-Y., Tseng I-C., Shaio IZ. Biohydrogen production from sucrose using base-enriched anaerobic mixed microflora// Process. Biochem. 2006. V. 41. P. 915-919.
89. Lin C.-Y., Hung C-H., Chen C-H., Chung W-T., Cheng L-H. Effects of initial cultivation pH on fermentative hydrogen production from xylose using natural mixed cultures // Proc. Biochem. V. 41. P. 1383-1390.
90. Liu D„ Zeng R., Angelidaki I. Enrichment and adaptation of extremethermophilic (70°C) hydrogen producing bacteria to organic household solid waste by repeated batch cultivation // Int. J. Hydrogen Energy. 2008. V. 33. № 22. P. 6492-6497.
91. Liu Y, Yu P., SongX., Ou Y.B. Hydrogen production from cellulose by coculture121. of Clostridium thermocellum JN4 and Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum GD17 // Int. J. Hydrogen Energy. 2008. V. 33. P. 2927-2933.
92. Logan B.E. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. № 85. P. 1665-1671.
93. Lovely D.R. Microbe, 2006. 1: 323.
94. Lynd L.R., Wyman C.E., Gerngross T.U. Biocommodity engineering // Biotechnol. Prog. 1999. V. 15. P. 777-793.
95. LyndL.R., Laser M.S., Bransby D., Dale B.E., Davison B., Hamilton R., Himmel M., Keller M„ McMillan J.D., Sheehan J., Wyman C.E. How biotech can transform biofuels // Nature Biotechnol. V. 2008. V. 26. P. 169-172.
96. Lyon E., Shima S., Buurman G., Chowdhuri S., Batschauer A„ Steinbach K., Thauer R. UV-A/blue-light inactivation of the 'metal-free' hydrogenase (Hmd) from methanogenic archaea 11 Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 195-204.
97. Madden R. H. Isolation and characterization of Clostridium stercorarium sp. nov., cellulolytic thermophile // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. V. 33. P. 837-840.
98. Makarova K.S., Wolf Y.I., Koonin E.V. Potential genomic determinants of hyperthermophily // TRENDS in Genetics. 2003. V. 19. P. 172-176.
99. Mao F., Mano N. Heller A. Long Tethers Binding Redox Centers to Polymer Backbones Enhance Electron Transport in Enzyme "Wiring" Hydrogels // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. № 16. P. 4951-4957.
100. Marcus R.A., Sutin N. Electron transfers in chemistry and biology // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 811. P. 265-322.
101. Miyake J., Mao X-Y., Kawamura S. Hudrogen photoproduction from glucose by a co-culture of a photosynthetic bacteria and Clostridium butyricum II J. Ferment. Technol. 1984. V. 62. №6. P. 531-535.
102. Mori M.I., Herrick J.B., Silva M.C., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V 60. № 5. 1572-1580.
103. Morozov S.V., Vignais P.M., Cournac L., Zorin N.A., Karyakina E.E., Karyakin A.A., Cosnier S. Bioelectrocatalytic hydrogen production by hydrogenase electrodes // Int. J. Hydrogen Energy. 2002. V. 27: P. 1501- 1505.
104. Morozov S.V., Voronin O.G., Karyakina E.E., Zorin N.A., Cosnier S., Karyakin A.A. Tolerance to oxygen of hydrogen enzyme electrodes // Electrochemistry Communications. 2006. № 8. 851-854.
105. Mosier N., Wyman C.E., Dale B., Elander R„ Lee Y.Y., Holtzapple M., Ladisch M. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass // Bioresource Technology. 2005. V. 96 P. 673-686.
106. Muyzerl G., Smalla K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology // Antonie van1 Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 127-141.
107. Netrusov A., Abramov S., Sadraddinova E., Shestakov A., Shalygin M., Teplyakov V. Membrane-assisted separation of microbial gaseous fuels from renewable sources // Desalination and Water Treatment. 2010. V. 14. P. 252-258.
108. Nicolet Y., Cavazza C., Fontecilla-Camps J.C. Fe-only hydrogenases: structure, function and evolutioa Journal of Inorganic Biochemistry. 2002. V. 91. P. 1-8.
109. NikiK., Yagi T„ Inokuchi H, Kimura K. J Am Chem Soc, 1979. 101: 3335.
110. Odom J.M., Wall J. Photoproduction of H2 from cellulose by an anaerobic bacterial culture // Appl. Env. Microbiol. 1983. V. 45. № 4. P. 1300-1305.
111. Ozgur E., Mars A.E., Peksel B. Biohydrogen production from beet molasses by sequential dark and photophermentation // Int. L. Hydrogen Energy. 2010. V. 35. № 2. P. 511-517.
112. Palmore G.T.R., Kim H.-H. J Electroanal Chem, 1999. 464: 110.
113. Panagiotopoulos I.A.; Bakker R.R. Comparative Study of Different Lignocellulosic Feedstocks Enzymatic Hydrolysis for Fermentable Substrate Production (Proceedings of the 16th European Biomass Conference, 2-6 June 2008, Valencia, Spain) P. 1749-1752.
114. Panagiotopoulos I.A., Bakker R.R., Budde M.A.W., Vrije T., Claassen P.A.M., Koukios, E.G. Fermentative hydrogen production from pretreated biomass: a comparative study // Bioresource Technology. 2009. V. 100. P. 6331-6338.
115. Plowman J., Peck M.W. Use of a novel method to characterize the response of spores of non-proteolytic Clostridium botulinum types B, E and F to a wide range of germinants and conditions. J. Appl. Microbiol. 2002." V. 92. P. 681-694.
116. Potter M.C. Electrical effects accompanying the decomposition of organic compounds. Proc. R. Soc. Ser. B, 1912. 84:260-276.
117. Prasad D., Sivaram T.K., Berchmans S., Yegnaraman V. Microbial fuel cell constructed with a micro-organism isolated from sugar industry effluent //. J Power. Sources. 2006. V. 160. P. 991-996.
118. Reddy C.A., Bryant M. P., Wolin M. J. Characteristics of S Organism Isolated from Methanobacillus omelianskii // J Bacteriol. 1972. V. 109. № 2. P. 539-545.
119. Redwood M.D., Macaskie L.E. A two-stage, two-organism process for biohydrogen from glucose // Int. J. Hydrogen Energy. 2006. V. 31. № 11. P. 1514-1521.
120. Ren, Z., Ward, T.E., Logan, B.E., Regan, J.M. Characterization of the cellulolytic and hydrogen-producing activities of six mesophilic Clostridium species // J. Appl .Microbiol. 2007. V. 103. P. 2258-2266. •
121. Ren N„ ¡Vang A., Gao L., Xin L„ Lee D-J., SuA. Bioaugmented hydrogen production from carboxymethyl cellulose and partially delignified corn stalks using isolated cultures // Int. J. Hydrogen Energy. 2008. V. 33. P. 5250-5255.
122. Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry // TRENDS in Biotechnology. 2006. V. 24: P. 219-226.
123. Rosenbaum M., Aulenta F., Villano M., Angenent L.T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved? // Bioresource Technology. 2011. V 102. № 1, P. 324-333.
124. Rumana I., Sparling R., David I. Effect of substrate loading on hydrogen production during anaerobic fermentation by Clostridium thermocellum 27405 // Appl. Microbial Biotech. 2006. V. 72. P. 576-583.
125. Russell J.B., Muck R.E., Weimer P.J. Quantitative analysis of cellulose degradation and growth of cellulolytic bacteria in the rumen // FEMS Microbiol. Ecol. 2009. V. 67. № 2. P. 183-197.
126. RuyetP. L., Dubourguier H. C., Albagnac G., Prensier G. Characterization of Clostridium thermolaticum sp. nov., ahydrolytic thermophilic anaerobe producing high amounts of lactate // Syst. Appl. Microbiol. 1985. V. 6. P. 196-202.
127. Saratale G.D., Chen S-D., Lo Y-C., Saratale R.G., Chang J-S. Outlook of biohydrogen production from lignocellulosic feedstock using dark fermentation a review // J. Sci. Ind. Res. 2008. V. 67. P. 962-979.
128. Schink B., Thauer R. K. in Granular Anaerobic Sludge: Microbiology and Technology (eds Lettinga, G., Zehnder, A. J. B., Grotenhuis, J. T. C. & Hulshoff, L. W.) 5-17 (Pudoc, Wageningen, The Netherlands, 1988).
129. Schmidt J. E. Ahring B. K. Effects of hydrogen and formate on the degradation of propionate and butyrate in thermophilic granules from an upflow anaerobic sludge blanket reactor // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 2546-2551.
130. Shleev S., Kasmi A.E., Ruzgas T., Gorton L. Electrochem. Commun. 2004. Y. 6. P. 934939.
131. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas T., Yaropolov A.I., Whittaker J.W., L Gorton Biosens. Bioelectron. 2005. V. 20. P. 2517.
132. Spiegelman D., Whissell G., Greer C.W. A survey of the methods for the characterization of microbial consortia and communities // Can. Journal Microbiology. 2005. V. 51. P. 355386.
133. Stahl D.A., Amann R., 1991. Development and application of nucleic acid probes in bacterial systematics. In: Stackebrandt, E., Goodfellow, M. (Eds.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics, John Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK.132
134. Stetter KO. Diversity of extremely thermophilic archaebacteria. Thermophiles. General, molecular, and applied microbiology, edited by T. D. Brock, 1996.
135. Tao Y, Chen Y., Wu Y. High hydrogen yield from a two-step process of dark- and photofermentation of sucrose // Int. J. Hydrogen Energy. 2007. V. 32. № 2. P. 200-206.
136. Thareja A., Puniya AK., Goel G., Nagpal R., Sehgal J.P., Singh P.K., Singh K. In vitro degradation of wheat straw by anaerobic fungi from small ruminants // Arch. Anim. Nutr. 2006. V 60. №5. 412-417.
137. Thauer R. K, Jungermann K, Decker K Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria// Bacteriol. Rev. 1977. V. 41. P. 100-180.
138. Thauer R. K, Raster A. K, Seedorf H., Buckel W., Hedderich R. Methanogenic archaea: ecologically relevant differences in energy conservation // Nature Rev. Microbiol. 2008. V.6. 579-591.
139. Triverdi S., Rama S., Hukam R., Gehlot S. Nucleic acid stability in thermophilic prokaryotes: a review // Journal of Cell and Molecular Biology. 2005. V. 4. P. 61-69.
140. Tsai Y-L, Olson B.H. Rapid Method for Direct Extraction of DNA from Soil and Sediments // Appl. Env. Microbiol. 1991. V. 57. № 4. P. 1070-1074.
141. Tsujimura S., Fujita M., Tatsumi H., Kano K, Ikeda T. Bioelectrocatalysis-based dihydrogen/dioxygen fuel cell operating at physiological pH // Phys. Chem. 2001. V. 3. №7. P. 1331-1335.
142. Ueno Y., Sasaki D„ Fukui H., Haruta S., Ishii M., Igarashi Y. Changes in bacterial community during fermentative hydrogen and acid production from organic waste by thermophilic anaerobic microflora // J. Appl. Microbiol. 2006. V. 101. P. 331-343
143. Uyar B., Schumacher M., Gebicki J. Photoproduction of hydrogen by Rhodobacter capsulatus from thermoplilie fermentation effluent // Bioprocess. Biosistems Eng. 2009. V. 32. № 5. P. 603-606.
144. Valdez-Vazquez L, Sparling R, Risbey D., Rinderknecht-Seijas N., Poggi-Varaldo M. Hydrogen generation via anaerobic fermentation of paper mill wastes // Bioresource Techno1. 2005. V. 96. P. 1907-1913
145. Vignais P.M., Colbeau A. Molecular Biology of Microbial Hydrogenases // Curr. Issues Mol. Biol. 2004. V. 6. P.159-188.
146. Vignais P.M. H/D exchange reactions and mechanistic aspects of the hydrogenases // Coordination Chemistry Reviews. 2005. V. 249. P. 1677.
147. Vignais P.M., Billoud B. Occurrence, Classification, and Biological Function of Hydrogenases: An Overview// Chem. Rev. 2007. V. 107. P. 4206-4272.
148. Vincent K.A., Parkin A., Armstrong F.A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases // Chem. Rev. 2007. V. 107. P. 4366-4413.
149. Volbeda A., Charon M.H., Piras C., Hatchikian E.C., Frey M„ Fontecilla-Camps J.C. Crystal-Structure of the Nickel-Iron Hydrogenase From Desulfovibrio-Gigas II Nature. 1995. V. 373. № 6515. P. 580-587.
150. Volbeda A., Montet Y, Vernede X., Hatchikian E.C., Fontecilla-Camps J.C. Highresolution crystallographic analysis of Desulfovibrio fructosovorans NiFe. hydrogenase // Int. J. Hydrogen Energy. 2002. V. 27. № 11-12. P. 1449-1461.
151. Volbeda A. The active site and catalytic mechanism of NiFe hydrogenases // Dalton Transactions. 2003. P. 4030-4038.
152. Volbeda A., Fontecilla-Camps J.C. Structure-function relationships of nickel-iron sites in hydrogenase and a comparison with the active sites of other nickel—iron enzymes // Coordination Chemistry Reviews. 2005. V. 249. P. 1609.
153. Voronin O.G., van Haaster D.J., Karyakina E.E., Hagen W.R, Karyakin A.A. Direct Bioelectrocatalysis by NADP-Reducing Hydrogenase from Pyrococcus furiosus II Electroanalysis. 2007. V. 19. № 21. 2264-2266.
154. Vrije T„ de Haas G.G., Tan G.B., Keijsers E.R.P., Claassen P.A.M. Pretreatment of Miscanthus for hydrogen production by Thermotoga eljii II Int. J. Hydrogen Energy. 2002. V. 27. P. 1381-1390.
155. WibergN., Inorganic Chemistry. 2001, London: Academic Press.
156. Wolf-Watz M., Thai V., Henzler-Wildman K., Hadjipavlou G., Eisenmesser E.Z., Kern D. Linkage between dynamics and catalysis in a thermophilic-mesophilic enzyme pair // Nature structural and molecular biology. 2004. V. 11. № 10. P. 945-949
157. Yahiro A.T., Lee S.M., Kimble D.O. Biochim Biophys Acta. 1964. V. 88. P. 375.
158. Yagi T., Goto M., Nakano K., Kimura K, Inokuchi H. New Assay Method For Hydrogenase Based On an Enzymic Electrode-Reaction Enzymic Electric Cell Method // J. Biochem. 1975. V. 78. № 3. P. 443-454.
159. Yang Z.H., Xiao Y., Zeng G.M., Xu Z.Y., Liu Y.S. Comparison of methods for total community DNA extraction and purification from compost // Appl. Microbiol'. Biotechnol. 2007. V. 74. P. 918-925.
160. Yanling He, Youfang Ding, Yanquan Long. Two Cellulolytic Clostridium' Species: Clostridium cellulosi sp. nov. and Clostridium cellulofermentans sp. nov. Int J Syst Bact, 1991. 41(2):306-309.
161. Yeh P., Kuwana r. Chem. Lett. 1977. V. 6. P. 1145.
162. Yokoi II, Mori S., Hirose J. H2 production from starch by mixed culture of Clostridium butiricum and Rhodobacter sp M-19 // Biotechnol: Lett. 1998. V. 20. P. 895-899.
163. Yokoi II., Saitsu A., Uchida H. Microbial hydrogen production from sweet potato starch residue // J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 91. № 1. P. 58-63.
164. Yokoyama H., Ohmori K, Waki M., Ogino A., Tanaka Y. Continuous hydrogen production from glucose by using extreme thermophilic anaerobic microflora // J. Biosci. Bioeng.2009. V. 107. № l.P. 64-66.
165. Yongzhen T., Yang C., Yongqiang W„ Yanling H., Zhihua Z., High hydrogen yield from a two-step process of dark- and photo-fermentation of sucrose // Int. J. Hydrogen Energy. 2007. V. 32. P. 200-206.
166. Yuhashi N., Tomiyama M., Okuda J., Igarashi S., Ikebukuro K., Sode K. Biosens. Bioelectron. 2005. V. 20. P. 2145.
167. Zhang Y, Shen J. Effect of temperature and iron concentration on the growth and hydrogen production of mixed bacteria. Int. J. Hydrogen Energy. 2006. V. 31. P. 441-446.
168. Zhao C., O-Thong S., Karakashev D„ Angelidaki L, Lu W„ Wang H. High yield simultaneous hydrogen and ethanol production under extreme thermophilic (70°C) mixed culture environment // Int. J. Hydrogen Energy. 2009. V. 34. № 14. P. 5657-5665.135
-
Абрамов, Сергей Маркович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.02.03
- Функционирование гидрогеназного электрода в биореакторе с водородвыделяющими микроорганизмами
- Прямая биоконверсия целлюлозосодержащих материалов термофильными анаэробами
- Биотехнологическая переработка радиоактивных целлюлозосодержащих отходов
- Разработка биотехнологии кормового белка из растительного сырья
- Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК
