Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические и иммунологические аспекты влияния хрома на организм

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические и иммунологические аспекты влияния хрома на организм"

/дк 616-093/-098:546.76

На правах рукописи

РЛМ АЗАНОВ А РАЙГУЛЬ МУХАНБЕТОВНА

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ ХРОМА НА ОРГАНИЗМ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации па соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Республика Казахстан Алматы 1999 год

Работа выполнена в Актюбинском Государственно{ медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Ордабаев Ж.К.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Котова А.Л. доктор медицинских наук, профессор Укбаева Т.Д.

Ведущая организация Карагандинская государственна) медицинская академия

Защита состоится "14" октября 1999 г. в 14 часов на заседанш диссертационного совета Д.09.01.01 при Казахском государственной медицинском университете им. С.Д.Асфендиярова.

Автореферат разослан сентября 1999 года

/)

Учёный секретарь / /

диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент

Султанова Т.А.

1 Общая характеристика работы

Микробиологическими исследованиями изучены особенности микробиоценозов кишечника у детей раннего возраста, проживавших вблизи заводов по переработке хромовой руды. При исследовании содержания хрома в кишечном содержимом и в крови выявлена зависимость изменении в кишечной микрофлоре от концентрации хрома в исследуемых субстратах. Выявленные изменения в кишечной микрофлоре, мы обозначаем как экозависимый дисбактериоз.

Установлены токсические и субтоксические дозы шестивалентного хрома для облигатной кишечной микрофлоры и иммунокомпетентных клеток.

Иммунологическими исследованиями обнаружена высокая частота скрытой сенсибилизации к хрому и снижение показателей иммунного ответа у детей, проживавших в промышленной зоне.

Испытания сочетанного назначения фитопрепаратов и пробиотика «Primadofilus» показали возможность коррекции нарушенного микробиоценоза у детей.

В работе обобщены результаты бактериологических исследований 61 ребёнка (в том числе 14 контрольных), данные по изучению прямого влияния хрома на бактерий и иммунокомпетентные клетки. Иммунологические исследования проведены у 146 детей. Скрининг-анкетированием охвачено 240 детей.

2 Актуальность проблемы

Республика Казахстан является одной из крупных стран производителей хрома. На территории Актюбинской области находится первое в странах СНГ и третье в мире месторождение хромовых руд. В г. Актюбинске и вблизи него расположены горно-обогатительный комбинат, заводы хромовых соединений (АЗХС) и хромовых ферросплавов (АО «Феррохром»), Они являются источниками выбросов в окружающую среду соединений хрома. Так, содержание хрома в почве, воде и растениях на расстоянии до нескольких километров от АЗХС в десятки раз превышает ПДК /Ган С.Ш., Сабырахметова В.М., Абдуллаева К.А., 1994; Иманбеков A.A., Коваленко В.А., 1994/.

Многолетние изыскания специалистов различного профиля убедительно свидетельствуют о многообразном и многофакторном влиянии соединений хрома на организм в эксперименте и клинике. Хромовая интоксикация приобрела характер региональной патологии. При этом показано воздействие хрома не только в

профессиональных условиях, но и на жителей, не занятых в его производстве / Молдашев Ж.А., 1989; Засорин Б.В., с соавт., 1993 /.

При изучении хромовой патологии, на наш взгляд, несправедливо «забытыми» оказались детский организм и его естественная (нормальная) микрофлора. Между тем известна особая уязвимость детей к разнообразным воздействиям, в частности, химическим. Важную роль в обеспечении гомеостаза детского организма играют его естественная микрофлора и иммунная система, которые тесно взаимосвязаны.

Единичные исследования о влиянии соединений хрома на естественную микрофлору в клинике (у взрослых) и в эксперименте свидетельствуют о возможности развития изменений в микробиоценозах / Стародубова А.Т., 1977; Ордабаев Ж.К., с соавт., 1989; Бондаренко В.В., с соавт., 1998 /. Эти противоречивые данные основаны на изучении действия хрома в производственных условиях или в экспериментах с использованием высоких концентраций хрома, тогда как жители региона, в том числе и дети, очевидно, имеют контакт преимущественно с небольшими дозами хрома.

Ещё более скудны, отрывочны и противоречивы данные о влиянии хрома на иммунный статус организма / Стародубова А.Т., 1974; Будчанов Ю.И., с соавт., 1990; Варзина Н.В., Тюшнякова Н.В., 1990/, а на детский и вовсе отсутствуют.

Учитывая высокую чувствительность иммунной системы к изменениям среды обитания, изучение влияния химических факторов на организм особенно актуально на том этапе, когда они ещё не привели к развитию заболеваний, но уже вызвали какие-либо иммунные повреждения. Сложный процесс становления и функционирования иммунной системы у детей раннего возраста тесно связан с микробиоценозом, а именно, с состоянием колонизационной резистентности.

Исследование влияния химических агентов, в частности, хрома на такие важные составляющие гомеостаза как естественная микрофлора и иммунная система актуальны не только для бактериологии и прикладной иммунологии, но и для

микроэкологической токсикологии и педиатрии. Изменения в микробиоценозах и иммунном статусе детей под влиянием хрома, по нашему мнению, во многом могут определять патологию взрослых.

Отсутствие данных о состоянии микробиоценозов кишечника у детей раннего возраста, проживавших в неблагоприятной по хрому биогеохимической зоне и о влиянии этого агента на иммунную систему послужило поводом для проведения комплексных исследований.

3 Цель работы

Изучение влияния шестивалентного хрома на состояние кишечной микрофлоры детей раннего возраста и на некоторые иммунологические показатели.

4 Задачи работы

-изучить аэробную и анаэробную микрофлору кишечника у детей раннего возраста, проживавших в промышленной зоне;

-сопоставить бактериологические, химические и клинические данные;

-исследовать прямое влияние шестивалентного хрома на микробов и иммунокомпетентные клетки;

-выявить возможность скрытой сенсибилизации к хрому у детей и изучить некоторые показатели гуморального иммунитета;

-осуществить поиск и испытание средств коррекции гомеостаза.

5 Научная новизна

-комплексными клинико-бактериологическими и химическими исследованиями выявлено влияние хрома на состояние микробиоценозов кишечника у детей раннего возраста, проживавших в биогеохимической зоне, неблагоприятной по хрому;

- комплекс обнаруженных изменений со стороны желудочно-кишечного тракта у детей предлагается обозначить как экозависимый дисбактериоз кишечника, являющийся проявлением субинтоксикации хромом;

- в опытах in vitro установлены токсические и субтоксические дозы бихромата калия для кишечной микрофлоры и иммунокомпетентных клеток;

-выявлено наличие скрытой сенсибилизации к шестивалентному хрому у большинства детей промышленной зоны;

-обнаружено влияние хрома на некоторые показатели иммунного статуса;

-показана перспективность коррекции нарушенного гомеостаза при субинтоксикации хромом назначением фитопрепаратов и примадофилуса

6 Практическая значимость работы

у детей региона с повышенным содержанием хрома необходимо учитывать высокую вероятность наличия экозависимого

дисбактсриоза и экологически обусловленного

иммунокомпромисного статуса, что имеет существенное значение для оценки развития и состояния здоровья;

в микробиологической и иммунологической диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний, имеет значение возможность изменений биологических свойств бактерий и иммунного статуса под влиянием хрома;

в коррекции нарушенного под влиянием хрома гомеостаза детского организма, в частности микробиоценоза, перспективно использование фитопрепаратов и новых пробиотиков.

7 Основные положения выносимые на защиту:

-у детей раннего возраста, проживавших в биогеохимической зоне, неблагополучной по содержанию шестивалентного хрома, развивается комплекс клинико-микробиологических изменений, соответствующих экозависимому дисбактериозу кишечника;

-непосредственное (прямое) действие бихромата калия на микробов и иммунокомпетентные клетки носит дозозависимый характер;

-влияние хрома на иммунный статус проявляется в развитии скрытой сенсибилизации к хрому и изменением показателей местного и общего иммунного ответа;

- одним из способов коррекции нарушенного микробиоценоза при субинтоксикации детей хромом является использование фитопрепаратов и новых пробиотиков.

8 Внедрение в практику

Результаты исследований и практические рекомендации используются в работе бактериологических и иммунологические лабораторий Г.Г.Актюбинска, Атырау, Актау, а также I педиатрических клиниках.

9 Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы

10 Апробация диссертации

Основные положения работы доложены и обсуждены ш конференции молодых учёных Киргизской медицинской академш (1998), конференции иммунологов России в Саратовско! медицинской академии (1997), научной конференции и заседания;

проблемной комиссии по экологии Актюбинском медицинской академии (1996, 1997).

10 Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 84 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 разделов основной части, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованных источников, содержащих 92 отечественных и 69 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 12 рисунками.

11 Описание существа диссертации 12.1 Материалы и методы

Для выявления возможной связи между районами проживания и изменениями со стороны пищеварительной системы проведено анкетирование родителей 240 детей раннего возраста, проживавших вблизи предприятий по переработке хромовой руды. Скрининг-анкета включала вопросы для выявления причин и характера диспептических явлений у детей.

Микробиологические исследования фекалий проведены у 61 ребёнка раннего возраста, в т.ч. у 14 детей контрольной группы. 47 детей основной группы разделены на две группы в зависимости от отдалённости проживания от завода хромовых соединений. В 1 группе обследовано 26 детей, родившихся и проживавших на расстоянии от 1,5 км до 3,5 км от завода. В опытах in vitro изучали прямое непосредственное влияние различных концентраций бихромата калия на отдельных представителей кишечной микрофлоры детей, проживавших вдали от завода.

С целью учёта возможного влияния характера питания детей на микробиологические показатели группы разделены на подгруппы. В 1а и 2а подгруппы отнесены 12 и 10 детей (соответственно), получавшие пищу по основным ингредиентам покрывавшую физиологическую потребность ребёнка данного возраста. В 16 и 26 подгруппы включено 14 и 11 детей, находившихся на нерациональном питании, т.е. их рацион был беден полноценными белками, витаминами, жирами и другими пищевыми ингредиентами.

У 20 детей исследуемых групп проводили испытания фитопрепаратов и корригирующего кишечный микробиоценоз препарата «Primadofilus». После окончания курса у этого контингента детей проводили повторные микробиологические исследования фекалий.

Аэробную микрофлору (собственно аэробы и факультативные анаэробы) исследовали общепринятыми методами. Выделение и идентификацию облигатных анаэробных бактерий проводили по методикам лабораторий г. Москвы.

Резистентность бактерий к действию хрома изучали путём добавления в питательную среду различных доз бихромата калия, содержащего 35,4% шестивалентного хрома, из расчёта 0,62; 1,25; 2,5; 5; 10 мг/л. Проводили посев шести представителей облигатной кишечной микрофлоры. Каждый штамм исследовали при пятикратном воздействии каждой концентрации бихромата калия. Изучали культуральные, тинкториальные и морфологические свойства выросших бактерий.

Химическими методами исследовали содержание хрома в фекалиях и в крови (О.Г. Архипова, 1988).

Иммунологическими методами изучали содержание SIg А и Ig А и Ig G в ротоглоточном секрете у детей 1 группы (Manchini et all., 1965).

С целью выявления скрытой сенсибилизации к шестивалентному хрому совместно с сотрудниками лаборатории иммунологии ЦНИЛ обследовано 146 детей с дисбактериозом и острой кишечной инфекцией. Дети в возрасте от 7 месяцев до 14 лет проживали в радиусе до 8 км от заводов.

Скрытую сенсибилизацию к хрому выявляли с помощью аллергодиагностических тестов in vitro: реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) по К.Н. Гетмансц и Л.Д. Резенкиной (1977), реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) по методике И.Б.Сосонкина (1968), реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК) по методике Т.Ф.Полковниковой и М.П. Бакулина ( 1973).

Для изучения влияния хрома на отдельные звенья иммунного ответа и иммунокомпетентные клетки исследовано влияние бихромата калия на лейкоциты периферической крови. Исследовали влияние различных концентраций бихромата калия на жизнеспособность лейкоцитов периферической крови, проводили определение лимфоцитов различных (суб)популяций (Т-,В-,0-) в реакциях Е и М - розеткообразования, оценнивали функциональную активность нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия, анализировали концентрацию иммуноглобулинов.

Статистическую обработку результатов проводили методом корреляционной и регрессионной статистики с использованием прикладных программ "Statgraphics" ( версия 2.3) на персональном компьютере Pentium 166-ММХ.

12.2 Результаты клннико-бактериологических и химических исследовании

Этот раздел работы выполнен совместно с ассистентом кафедры госпитальной педиатрии Ш.Б.Насухиным и сотрудниками кафедры общей и биологической химии. Обследование детей было направлено на выявление симптомов возможного дисбактериоза кишечника и установление его причины.

Методом скрининг-анкетирования пытались установить возможные пути поступления исследуемого химического агента в организм детей и выявить роль косвенных факторов в изучаемой ситуации (характер питания, удалённость от источника загрязнения, перенесенные заболевания и др.).

По результатам скрининг анкетирования и клинического обследования диспептические явления выявлены у 72% детей.

Отдельный симптом или симптомокомплекс, характерный для дисфункции кишечника, возникал у большинства детей без видимых на это алиментарных причин.

При микробиологическом исследовании аэробные

микроорганизмы высевались во всех пробах, взятых от обеих групп детей. Факультативные анаэробы в основном были представлены кишечными палочками, клебсиеллами, стафилококками, энтерококками, протеями и другими энтеробактериями. При сравнении роста микробов необходимо отметить, что в целом рост микробов в условиях анаэробиоза был существенно обильнее, чем при культивировании на общепринятых средах в обычных условиях.

Кишечные палочки в количестве до Ю3 КОЕ/г выделены у 36 детей (76,5%). Эшерихии с нормальной ферментативной активностью выделены в 69,4+2,7% случаев, с измененной ферментативной активностью в 25+2,1% случаев. Содержание типичных форм кишечных палочек в «а» подгруппе, т.е. при полноценном питании в 2 и более раз превосходило их содержание в «б» подгруппах. Напротив, атипичных форм эшерихий существенно (р<0,01) больше в «б» подгруппах. Следовательно, фактор питания заметно влияет на биологические свойства кишечных палочек в микробиоценозах и в меньшей степени зависит от дальности источника загрязнения. В целом разница между 1 и 2 группой по числу атипичных форм кишечных палочек составляла около 50%.

Эшерихии с гемолитической активностью выделены только у детей, относящихся к «б» подгруппам. Следует отметить, что выделение кишечных палочек с изменённой ферментативной активностью нередко сочеталось с изменением характера стула.

В микробиоценозах кишечника детей раннего возраста довольно часто выделялись энтерококки (51+4,2%). Они были

представлены преимущественно Б^.ГаесаНв в концентрации от 10^ до 104 КОЕ/г.

Стафилококки выделены у 11 детей (23,4^5,6%) в средней концентрации 102-103 КОЕ/г.

Другие условно-патогенные бактерии ( клебсиеллы, серрации, протеи и др.) чаще выявлялись в исследуемых группах, чем в контрольной (р<0,05).

Средняя концентрация наиболее часто встречающихся аэробнных бактерий в микробиоценозах кишечника у детей раннего возраста, проживавших в промышленной зоне, представлена на рисунке 1.

Сравнительное содержание (% от числа выделенных штаммов) эшерихий и фекального стрептококка у детей в зависимости от удалённости источника хрома и характера питания

Контроль

Контроль

E.coli

S.faecalis

бактерии

Рисунок 1

Таким образом, у детей, проживавших вблизи заводов, имеет место уменьшение содержания аэробных облигатных бактерий с

увеличением частоты выделения и концентрации условно-патогенной флоры по сравнению с контролем.

Анаэробные неспорообразугащие бактерии были выделены у всех детей обеих групп. Содержание неспорообразующих анаэробных микроорганизмов отражено в таблице 1.

Таблица I

Содержание анаэробных неспорообразующих микроорганизмов в фекалиях детей 1 и 2 групп и подгруппах (абс.ч.шт)

икроорганизмы 1 гр. /п=26/ 2гр. /п=21/ 1а гр. /п=12/ 16 гр. /п=12/ 2 а гр. /п=1 0/ 2 б гр. /п = 11/ Контр /п=14/

-1фидобактерии 15 17 9 6 9 8 13

актобактерии 13 10 6 7 4 б 14

1ктероиды 14 14 5 9 6 8 10

наэробные грам- .рнцатсльные жкн 6 2 3 3 0 2

наэробные грам- эложительные жки 8 7 з 5 2 5 3

едиференциро-щпые грамотри-1тедьные палочки 2 1 0 2 0 1 1

СЕГО 58 51 26 32 21 28 43

По суммарной частоте выделения анаэробов не представлялось возможным судить о роли фактора питания.

Бифидобактерни выделены у 32 детей (68±7,2%). 15 штаммов в 1 группе, 17 - во 2 группе. Концентрация их достигала верхних границ нормы (1О]0-1Оп КОЕ/г) лишь у 4 детей , относящихся к «а» подгруппам. Выделение бифидобактерий сочеталось с низким содержанием в микробиоценозах бактероидов и других анаэробных бактерий. Лактобактерин выделены у 13 детей в 1 группе и у 10 детей во 2 группе. При этом их концентрация была близка к нижней границе нормы (106 КОЕ/г). Между содержанием лактобактерий и других (кроме бифидобактерий) анаэробных неспорообразующих микроорганизмов не отмечено какой-либо зависимости. Только 5 случаев выделения бифидобактерий сочеталось с одновременным обнаружением лактофлоры в 1 группе и у б детей во 2 группе.

В целом, несмотря на общий дефицит основных компонентов анаэробной флоры, один из названных представителей всегда присутствовал и компенсировал отсутствие другого.

Средняя концентрация наиболее часто выделявшихся анаэробных микроорганизмов у детей, проживавших до 1,5 км от завод ( 1 гр) и от 1,5 до 3,5 км (2гр) отражена на рисунке 2.При сравнении числа аэробно-анаэробных микробных ассоциантов в фекалиях установлено некоторое увеличение числа ассоциантов во второй группе за счёт аэробного компонента микрофлоры, а также за счёт более частого сочетания бифидо- и лактобактерий. В контрольной группе число ассоциантов было в 1,5 раза больше, чем среднее число ассоциантов в опытных группах в основном за счёт анаэробного компонента.

При сравнении соотношения аэробов и анаэробов ( включая бифидо- и лактофлору) оказалось, что в целом анаэробный компонент на 50% превосходил аэробный от общего числа выделенных штаммов в 1 группе и на 60% во 2 группе, на 70% в «а» подгруппе и на 50% в «б» подгруппе, соответственно.

Концентрация наиболее часто выделяемых анаэробных бактерий в фекалиях детей в 1 и 2 группах

□ 1 группа В 2 группа

Рисунок 2

Анализируя анаэробную микрофлору фекалий детей раннего возраста, проживавших в промышленной зоне, необходимо отметить общую, более низкую концентрацию ( в среднем 105 КОЕ/г б ез учета бифидо- и лактофлоры). Ни у одного ребёнка концентрация бифидобактерий не достигала верхней границы общепринятой нормы (I010 КОЕ/г- 10" КОЕ/г).

Микробиологические данные свидетельствуют о том, что в микробиоценозах кишечника у исследуемых детей относительное количество представителей естественной микрофлоры было небольшим. Дефицит количества и родового представительства микробов в кишечнике компенсировался более частым наличием и повышением количества условно-патогенной флоры. Соотношение грамотрицательных и грамположительных бактерий было в пользу последних, преимущественно за счёт большего количества энтерококков и анаэробных кокков.

В целом результаты существенно отличаются от данных М.Э.Микельсаар (1990), А.Л.Котовой (1996) и других авторитетов микробиологии по исследованию нормальной кишечной микрофлоры. На основании этого, можно говорить о развитии дисбактериоза кишечника. Для решения вопроса о причинах развития дисбактериоза необходимо обратиться лишь к некоторым ежеквартальным данным управления экологии и биоресурсов.

Так, при ПДК 20 мг% содержание шестивалентного хрома в почве в 2,5 км от завода хромовых соединений составляет 204 мг%, а в трёх километрах - 41 мг%. В промышленной зоне города содержание шестивалентного хрома в питьевой воде достигает 0,2 мг/л при ПДК 0,02 мг/л. К этому следует добавить высокое содержание хрома в растительных продуктах (С.III. Ган, В.М.Сабырахметова, 1994).

В такой экологически неблагополучной по содержанию шестивалентного хрома ситуации естественным было предположение о возможности попадания его в организм человека, в частности, детей. Действительно, химические исследования крови и фекалий выявили достаточно высокую концентрацию хрома. Так, если по данным ряда авторов (Zober А. et all., 1984, Kumpulainen I.Т., 1992) концентрация хрома в крови составляет 0,11- 2,8 мкг/л, то в наших исследованиях содержание хрома в крови колебалось от 8,2 до 27 мкг/л, что в среднем составило 17,6 мкг/л. В содержимом кишечника концентрация хрома составила 14 мкг/кг.

Повышение концентрации хрома в фекалиях у детей первой группы сопровождалось ингибированием грамотрицательной аэробной и грамположительной анаэробной микрофлоры. Большей устойчивостью к хрому отличалась аэробная грамположительная кокковая флора. То есть, изменения в кишечной микрофлоре у детей

зависели от количественного содержания хрома в фекалиях и дальности проживания от источника загрязнения.

Таким образом, высокое содержание шестивалентного хрома в окружающей среде, превышающее в десятки раз ПДК, повышенная по сравнению с контролем концентрация в биосубстратах детей (кровь, фекалии) и зависящее от этого количество микробов, позволяет говорить об экологической обусловленности выявленных изменений в микробиоценозах кишечника. Комплекс клинико-бактериологических данных мы обозначаем как экозависимый дисбактериоз кишечника, прямо связанный с экзогенным поступлением хрома в организм. Кроме того, нельзя исключать и внутриутробное поступление хрома, вероятность которого основывается на данных о высоком содержании его в ретроплацентарной крови у женщин, занятых в производстве хрома (Дощанова A.M., 1997; Укибасова Т.М., 1998; Matsumoto Н., Sengupta J., 1993).

Отсутствие достоверных различий в микрофлоре у детей в зависимости от дальности проживания от источника загрязнения хромом побудили нас исследовать прямое влияние различных концентраций бихромата калия на отдельных представителей кишечной микрофлоры.

Тесты проведены на наиболее типичных представителях естественной микрофлоры. Каждый штамм подвергался пятикратному воздействию одной из доз бихромата калия. Чувствительность бактерий к бихромату калия зависела от его концентрации ( таблица 2).

Как видно из таблицы, грамположителыше бактерии были более резистентны, чем грамотрицательные. Единичные колонии стафилококков, энтерококков и анаэробных грамположительных палочек появлялись при воздействии 5мг/л бихромата. Колонии имели уродливые карликовые формы, изменялось

пигментообразование. По сравнению с контролем был замедлен рост колоний, некотороые из них появлялись на 2-3 дня позже, чем в контроле.

Изменения тинкториальных и морфологических свойств характеризовались неравномерным окрашиванием, уменьшением или увеличением размеров клеток бактерий, утрате типичного взаимного расположения. Так, в мазках из культур бифидобактерий преобладали прямые палочки различных размеров, энтерококки и стафилококки располагались беспорядочно.

По нашим данным для грамположительных бактерий дозу 5мг/л бихромата калия можно считать субтоксической.

Для грамотрицательных бактерий субтоксичной считаем концентрацию бихромата 2,5 мг/л.

Таблица 2

Влияние различных концентраций бихромата калия на рост бактерий

Лоза К2Сг207 (мг/л) Микроорганизмы""— 10 5 2.5 1.25 0.62 Контроль (без K2Cr707)

S. epidermidis - + + 4- 4- +

Str. faecalis - + + 4- + +-

В. bifidum - + + + 4- +

L. acidophilus - + + + -1- +

E. coli - - + 4- + 4-

К. pneumoniae - - 4- 4-

Примечание: «+» - наличие роста; «-» - отсутствие роста; «+» - едва заметный рост.

Однако наличие изменений культуральных, тинкториальных и морфологических свойств свидетельствует о ещё большей чувствительности их к влиянию хрома по сравнению с грамположительными микроорганизмами.

Результаты изучения непосредственного прямого действия хрома на представителей естественной кишечной микрофлоры детей свидетельствуют о существенно большей резистентности грамположителных бактерий, чем грамотрицательных. Эти данные согласуются с бактериологическими находками при изучении фекалий детей, проживавших вблизи заводов хромовых соединений. Такая закономерность косвенно подтверждает возможность влияния именно хрома на состояние микробиоценозов кишечника.

Экозависимый дисбактериоз кишечника, обусловленный влиянием хрома на детский организм, по нашему мнению, является проявлением кумуляции хрома в микрофлоре и кишечной стенке с элиминацией облигатной флоры и снижением колонизационной резистентности. Последняя, как известно, играет значительную роль в становлении и функционировании иммунной системы.

12.3 Сенсибилнзированность детей к хрому н некоторые показатели гуморального иммунитета

Для выявления скрытой сенсибилизации к шестивалентному хрому у детей, проживавших в промышленной зоне г.Актюбинска, обследовано 146 детей с диареями в возрасте от 7 месяцев до 10 лет. Из них у 87 детей диагностирована острая кишечная инфекция и у 59 дисбактериоз средней тяжести, преимущественно с субкомпенсированными формами. Среди детей с дисбактериозом было 47 детей в возрасте до трёх лет, у которых проводили бактериологические и химические исследования фекалий.

В группе детей с острой кишечной инфекцией в 31 случае был положительным один аллерготест ( 35,6+2,3%), 24 обследованных (27,5+2,75) имели два или три позитивных теста.

У детей с дисбактериозом в 36 случаях (57,6+3,1%) выявлен один положительный тест, а у 14 детей - по 2-3 позитивных аллерготеста. То есть, 81,3% детей этой группы имели скрытую сенсибилизацию к хрому в отличие от детей с острой кишечной инфекцией, где она выявлена у 63,1%. При этом следует подчеркнуть, что аллерготесты были положительными у 38 детей из 47 (80,8%), у которых проводились бактериологические и химические исследования фекалий.

Вопреки ожиданию, нам не удалось установить корреляций между показателями аллергологических тестов и

бактериологическими находками, а также с данными по изучению содержания хрома в кишечном содержимом. Тем не менее, результаты позволяют судить о частоте и уровне скрытой сенсибилизации к хрому у различных категорий детей.

Выявлены различия в частоте положительных аллерготестов в зависимости от возраста детей (рисунок 3).

У детей раннего возраста кроме высокой частоты были высоки показатели реакций дегрануляции тучных клеток (РДТЛ) - 8,00+ 2,20 и специфического лизиса лейкоцитов (PCJIJI) - 9,8+1,10. По мере взросления детей увеличивалась частота РСЛЛ и РСАЛ (реакция спонтанной агломерации лейкоцитов).

Высокая частота и уровень скрытой сенсибилизации к хрому у детей позволяют говорить о достаточно высокой чувствительности аллергологических тестов, с помощью которых можно судить о загрязнённости окружающей среды хромом. Исходя из наших данных контакт детей с хромом весьма широкий.

Подтверждением этого, а также частоты сенсибилизации к хрому являются сведения об аллергии у 21% детей с экземой (Zachariae С.О. ct all., 1996), у 17,9% у взрослых больных с экземой и дерматитами (Zang Х.М. et all., 1991). Авторы этих исследований и другие прямо относят хром к аллергенам.

Частота позитивных аллерготестов у детей в зависимости от возраста

До 1 года

□ РСЛЛ ЕРСАЛ ОРДТК

Рисунок 3.

Наличие скрытой сенсибилизации к хрому у детей было не единственным признаком участия иммунной системы в развитии хромовой субинтоксикации. При определении А, А и в ротоглоточном секрете детей с ОКЗ и дисбактериозом установлено достоверное снижение содержания иммуноглобулинов А и Б 1ц А.

Более выраженным снижение концентрации этих иммуноглобулинов было у детей с дисбактериозом, проживавших вблизи заводов, однако из-за недостоверности этих различий можно говорить лишь о тенденции. В сыворотке крови выявлено достоверное снижение содержания ^ А и ^ М у детей с ОКЗ и дисбактериозом но сравнению с контролем (р<0,05).

Выявленные факты, на наш взгляд, следует учитывать при оценке иммунного статуса детей, проживавших в зоне с повышенным содержанием хрома. Для изучения вопросов влияния хрома на иммунную систему, на наш взгляд, логичным было исследовать его прямое действие на иммунокомпетентные клетки.

12.4 Влияние клетки

бихромата калия на нммунокомпетентные

При определении жизнеспособности лейкоцитов оказалось, что субтоксическис дозы для лейкоцитов составляют 0,05-0,5 мМ, а более высокие концентрации полностью подавляют их жизнеспособность.

При сравнении резистентности к шестивалснтному хрому микроорганизмов и лейкоцитов выяснилось, что последние намного устойчивее микробов. Так, доза 10 мг/л, соответствующая 0,03 мМ была абсолютно токсичной для всех изучаемых бактерий. В отношении лейкоцитов эта концентрация была почти в 2 раза меньше минимальной субтоксической дозы (0,05мМ).

Этот факт можно объяснить данными Coogan Т. (1991) о том, что клетки белой крови аккумулируют шсстивалентный хром. Добавим, что накопление больших доз хрома лейкоцитами может осуществляться и ценой их гибели. С этим, вероятно, связана лейкопения у исследуемых нами детей и установленная Н.И.Смирновым (1987) лейкопения у экспериментальных животных при энтеральной затравке хромом.

В этой связи в проведенных нами экспериментах определение функционально-метаболической активности при внутрибрюшинном введении мышам 2,5 и 10 мг/кг бихромата калия показало ее снижение с 5,285+0,52% до 3,625+0.12%. Из этого следует, что функционально-метаболическая активность нейтрофильных гранулоцитов достаточно чувствительна к действию хрома и может служить одним из признаков интоксикации хромом. Еще более чувствительным НСТ-тест оказался при исследовании перитонеальных макрофагов, т.е. функциональная активность тканевых макрофагов является более чувствительным критерием интоксикации хромом, чем изменения функционально-метаболической активности полиморфноядерных лейкоцитов.

Изучение прямого влияния бихромата калия на показатели НСТ-теста при воздействии на лейкокнцентрат выявило резкое снижение его функционально-метаболической активности даже при минимальной дозе (0,05мМ) (рисунок 4).

Нами установлено достоверное снижение процентного числа Т и В- лимфоцитов и увеличение О-лимфоцитов по мере увеличения дозы бихромата калия (рисунок 5). В связи с этим шестивалснтный хром также как и некоторые другие металлы (свинец, ртуть, никель, кадмий), очевидно, следует относить к веществам, обладающим иммунотоксическими свойствами. Увеличение содержания О-лимфоцитов наблюдалось (Варунина Н.В., 1990) в начальной стадии хромовой интоксикации у рабочих хромового производства.

Изменение показателей НСТ-теста (%) лейкоконцентрата в зависимости от дозы бихромата калия

П%

Рисунок 4.

Изменение количества Т, В и О-лимфоцитов в зависимости от концентрации бихромата калия.

доза бихромата калия

Е-РОК-"-М-ГОК ---*--- О-лимфоциты |

Рисунок 5.

Поскольку хроническая хромовая интоксикация у детей в литературе не описана, применительно к нашим данным с иммунологической точки зрения возможен следующий её вариант: накопление хрома в иммунокомпетентных клетках, лейкопения, снижение функционально-метаболической активности фагоцитов, снижение содержания Т и В- лимфоцитов, увеличение количества О-лимфоцитов, развитие сенсибилизации к хрому, подавление факторов местного и общего гуморального иммунитета (Б^ А, ^ А, ^ М), снижение колонизационной резистентности кишечника.

Таким образом, в наших исследованиях установлена экологическая обусловленность дисбактериоза и связь его развития с нарушениями в иммунной системе детей. Учитывая эти факторы, а также уязвимость детского организма к воздействию лекарственных препаратов мы провели испытания фитопрепаратов (тысячелистник, эвкалипт, календула, поливитаминный чай) и современного пробиотика «Рпта<1оШиз». Оказалось, что их раздельное применение требует времени, а эффект не столь выражен, как ири их сочетанном использовании.

Корригирующее действие сочетанной терапии на гомеостаз документировалось нормализацией бактериологических и некоторых иммунологических показателей. Считаем, что стартовая терапия фитопрепаратами оказывает детоксицирующее действие, повышает неспецифическую резистентность к хрому, стимулирует ферментные системы кишечника и иммунный ответ, способствует гипосенсибилизации к хрому и витаминизации. Дополнительное включение в эти механизмы пробиотика примадофилуса, содержащего по два вида лактобактерий и бифидобактерий, преследовало цель заместительной коррекции дефицита облигатной микрофлоры, сопутсвующей регуляции метаболизма кишечной стенки и опосредованной через микрофлору иммуномодуляции и иммуностимуляции. Как мы подчёркивали, назначение указанных препаратов было не единственной причиной нормализации гомеостаза. Существенное значение имеет полноценное сбалансированное питание. Стратегией профилактики и лечения хромовой субинтоксикации должны быть мероприятия по оздоровлению окружающей среды.

Проведённые нами исследования по изучению влияния хрома и литературные данные по воздействию на микрофлору и иммунную систему других химических агентов свидетельствуют об актуальности развития микроэкологической токсикологии и экологической иммунологии.

ВЫВОДЫ

1. Результаты комплексных микробиологических, клинических и химических исследований свидетельствует о развитии у детей, проживающих в неблагоприятной биогеохимической зоне, субинтоксикации хромом, одним из проявлений которой является экозависимый дисбактериоз кишечника.

2. Микробиологическими показателями дисбактероза являются дефицит облигатной аэробной и анаэробной микрофлоры и заселение условно-патогенными бактериями, степень выраженности которых зависят от концентрации хрома в кишечнике и характер питания детей.

3. Установлены токсические и субтоксические дозы шестивалентного хрома для основных представителей облигатной кишечной микрофлоры и иммунокомпетентных клеток.

4. Высокая частота (81,3%) скрытой сенсибилизации к хрому и снижение показателей местного и общего иммунного ответа (Б^ А, ^ А и ^ М) у детей, проживавших в промышленной зоне, свидетельствуют об иммунотропном действии хрома.

5. Некоторые иммунологические показатели (тесты на выявление скрытой сенсибилизации, НСТ-тест) являются чувствительными индикаторами контакта организма с хромом и могут служить одним из ранних диагностических и прогностических маркёров хромовой интоксикации.

6. Коррекция нарушенного микробиоценоза кишечника и иммунного статуса у детей может осуществляться сочетанпым использованием фитопрепаратов и новых пробиотиков.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В патогенезе заболеваний региона с повышенным содержанием хрома в окружающей среде необходимо учитывать высокую вероятность развития экозависимого днебактериоза кишечника и экологически обусловленного иммунокомпромисного статуса детей.

2. При микробиологической и иммунологической диагностике патологии региона следует иметь в виду возможность изменений биологических свойств бактерий, клеточных и гуморальных факторов иммунного ответа.

3. Дети, проживающие в экологически неблагополучном по хрому биогеохимическом регионе, нуждаются в полноценном питании, назначении пробиотиков и средств детоксикации.

4. В комплексном лечении детей с соматическими заболеваниями, проживающих в промышленной зоне с высоким содержанием хрома, необходима иммунокоррекция и иммуностимуляция.

5. Для коррекции нарушенного под влиянием хрома гомеостаза детского организма перспективно использование фитопрепаратов и новых пробиотиков.

6. Для профилактики экозависимых дисбактериоза и иммунных нарушений требуется комплекс социально-экономических мероприятий по предупреждению загрязнения окружающей среды хромом,

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Будчанов Ю.И., Рамазанова P.M. Влияние бихромата калия на фагоцитарно-макрофагальные клетки // Экологическое состояние г. Актюбинска и меры по его оздоровлению// Материалы городской научно-практической конференции. - Актюбинск, 1997.с. 18-19.

2. Будчанов Ю.И., Жумагалиева Г.Д., Тенизбаева Р.К., Рамазанова P.M. Сенсибилизированность детей г. Актюбинска к хрому. //Экологическое состояние г. Актюбинска и меры по его оздоровлению// Материалы городской научно-практической конференции. - Актюбинск, 1997. с.19-20.

3. Ордабаев Ж.К., Жарасов М.Ж., Рамазанова P.M., Насухин Ш.Б. Микрофлора кишечника у детей в неблагоприятной по хрому биогеохимической зоне // Материалы научной конференции Оренбургской Государственной медицинской академии // Оренбург.-199 8.-е.41-43.

4. Рамазанова P.M., Ордабаев Ж.К. Состояние микробиоценозов кишечника и иммунного статуса у жителей неблагоприятной по хрому биогеохимической зоны //Акмолинский медицинский журнал,- Акмола.-1999.№1 .-с. 109.

РЛМАЗАНОВЛ РАЙГУЛ МУХАНБЕТК.ЫЗЫ

Хромныц организмге асершщ микробиологиялык; жене иммунологиялык жайлары

03.00.07 — микробиология

ТУЖЫРЫМ

Жагымсыз биогеохимиялык аймакта туратын ерте жастагы балаларда кешеши микробиологиялык, клиникалык жэне химиялык эдктермен, байкалу белгшершщ 0]рг ¡шектщ экологиялык тоуелд! дисбактериоз болып келетп!, хромдык субинтоксикация аныкталган.

Ол шектеп хромныц концентрациясына жэне балалардъщ тамацтану сипатына тоуелд1 болып келетш, облигатгы аэробты жене анаэробты микрофлоралардьщ же-пспеушшшмен, шартты патогенд1- бактериалардыц кебекнмен сипатгалады.

1шектеп облигатгы микрофлораньщ жэне иммунитетке жауапты клеткалардыц окшдер1 уппн ал™ валентп хромныц токсикалык жане субтоксикаггык мелшер1 аныкталган.

Баланьщ хромга жасырын сенсабилизациясыныц жогары корсе™штер1 (81,3%) мен жергшкп (81£>А) жане жалпы (1^жене ^М) иммундык; жауаптын темендеу! хромнъщ иммунотроптык, есер ететш дэлел1 больш келдь Иммунологиялык корсепаштер хроммен уланудын диагностикалык жэне болжамдык маркерлершщ ерте белгшершщ б!р! бола алады.

Балаларда ¡шектщ бузылган микробиоценозын жзне иммундык; статусын калыпгастырудьг шогпж дэрЬдэрмектермен жаца пробиотиктер пайдалану аркылы журпзуге болады.

Крргаура шыгарылатын непзп жагдайлар:

- алты валентп хром молшер> бойынша жаилмсыз биогеохимиялык аймакта туратын ерте жастагы балаларда экотэуедгцк ппек дисбактериозына сэйкес клиникнлык-микробиологиялык озгер1'стер кешеш дамиды.

калий бихроматыньщ микробтарра жэне иммунокомпонентп клеткаларга Т1келей асер1 дозатэуелда болып келедь

- хромныц иммундык статусна эсер1 хромга жасырын сенсибилизациянын дамуы мен жерггш'к-л жане жалпы иммундык жауаптын корсетюштернпц епгсруЫен сипатгалады.

- фитопрепараттар мен жана пробиотнктерд1 пайдалану балалар хром субинтоксикациясында байкалатын микробиоценоз бузылыстарын калыптас-тыратын адютердп[ б]'р! болып келедй

Summary Ramazanova Raigul Muhanbctovna Microbiologic and immunology aspects influence chromium to organizr

03.00.07- microbiology

Early aged children, have been lived in the biochemical zone, nc good by chromium, complex microbiologic, clinical and chemic; methods was reveal subintocsication by chromium, display of whic show up ekodepcndent disbakterious of intestines. It was reve: connection its development with concentration of chromium int intestines and character of children's food; its displays show up defic of aerobic and anaerobic microflora.

It was determine tocsic and subtocsic of six-valent chromium to th main representatives obligatory microflora and immune compromis cells.

High exponents of hidden destabilization children to chromiui (81,3%) and lowering of exponents local (SIg A) and common (Ig A an Ig M ) immune answer testify about immunotropic influence c chromium. Immune exponents can be one of the earliest diagnostic an prognostic marcets of chromium intocsication.

Correction of violated microbiocenoz of intestines and immun status with children can be carried out by combination in usin biomedicine and new probiotics.

Main positions going to defense of a thesis

early aged children have been lived in biogeochemical zone, nc good in chromium usually develop complex microbiologic changes according to ecodependence disbacterious of intestines direct action of bichromium calcium for microbes and immun competent cells have doze dependent charactcr

influence of chromium for immune status show up in developmer hidden sensibilization for chromium and changes exponents of loci and common immune answer

one of the ways of correction damage microbiocenoze wit subintocsication of children by chromium can be carricd out b combination in using biomedicine and new probiotics.