Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая характеристика вибрионов и организационно-методические подходы к ее практическому использованию

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая характеристика вибрионов и организационно-методические подходы к ее практическому использованию"

Г Г Ü V. д

1 ;/:т с.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени A.A. БОГОМОЛЬЦА

ХАЙТОВИЧ АЛЕКСАНДР БОРИСОВИЧ

УДК 576.851.315-093:576.8.073.3:57.0.83.3:578.087.9

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИБРИОНОВ И ОРГАНИЗАЦИОННО-

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЕЕ ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

03. 00. 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Jv

Г

Киев-1998

Диссертация - рукопись

Работа выполнена в Крымском государственном медицинском университете им. С.И. Георгиевского и Крымской противочумной станции Минздрава Украины.

Научный консультант:

доктор медицинский наук, профессор Кривошеин Юрий Семенович

Крымский государственный медицинский университет, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук Сельникова Ольга Петровна

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского, директор института, заведующая отделом общей микробиологии

доктор биологических наук, профессор Руденко Адель Викторовна

Научно-исследовательский институт урологии и нефрологии АМН Украины, заведующая отделом микробиологии и вирусологии

доктор медицинских наук, профессор Палий Гордей Кондратьевич

Винницкий Государственный медицинский университет им.М.И. Пирогова, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии

Ведущая организация: Киевская медицинская академия последипломного обучения Минздрава Украины, кафедра микробиологии, г. Киев

специализированного ученого совета Д Z6.UJ.UI при Национальном медицинском университете им. A.A. Богомольца (252057, Киев-57, проспект Победы, 34, мсдико-профилактический корпус, аул № 2).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Национального медицинского университета им. A.A. Богомольца по адресу: г. Киев, ул. Зоологическая, 3.

Защита состоится

заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного ученого совета, д.м.н., профессор

А.П. Яворовский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Холера, 1-я пандемия которой продолжается более 35 лет, дала толчок к изучению биологических особенностей возбудителя, разработке, совершенствованию и внедрению методов лабораторной диагностики не только холеры, но и заболеваний, вызываемых другими видами вибрионов, поскольку эти исследования по рекомендации ВОЗ входят в глобальную программу борьбы с диареями (Хроника ВОЗ, 1978; D. Taylor, 1993). Пандемия прошла несколько периодов и распространялась в различных регионах в виде заносных вспышек и (или) формирования природных очагов (A.C. Марамович, М.И. Наркевич, 1993). В системе эпиднадзора за холерой значительная роль принадлежит лабораторной диагностике, поскольку только выделение и идентификация возбудителя дает возможность своевременно проводить противоэпидемические мероприятия, а изучение биологических свойств - использовать фенотипичес-кне и гснотипические признаки в качестве маркеров эпидемического процесса. Сложности лабораторной диагностики диарей, вызванных вибрионами, в значительной степени обусловлены сходством их биологических свойств, что нашло отражение в классификации и выделении семейства Vibrionaceae, включающего в настоящее время 34 вида (М. Veron, 1974; Р. Baumann et al., 1984; J.G. Holt et al., 1994). Исследовались биологические свойства V. cholerae non OI, V. albensis, V. parahaemolyticus, V. alginolyti-cus, V. fluvialis, V. anguiliarum, V. aesturianus и др. ( A.E. Либинзон, Г.В. Гальцсва, 1985;А.Б. Хайтович, 1986; Е.Б. Данилкнна, 1995;Л.Г. Воронежская, 1995, A. Fui-niss ct.al., 1977; D. Brenner ct.al., 1978, 1986; F. Hickman et.al., 1982; С. Tackct ct.al., 1982; D.Tison, R. Seidler, 1983; M. Schieweet.al., 1987 и др.). Среди различных видов рода Vibrio наиболее изучены холерные вибрионы 01 и парагемолитические вибрионы. Однако, некоторые проблемы, касающиеся биологии возбудителей, их идентификации, требуют уточнения и углубленного изучения в соответствии с современным методическим уровнем естествознания.

Изменчивость биологических свойств V. cholerae Ol касается различных фспошличсских при знаков, происходи г под влиянием разнообразных факторов внешней среды и затрагивает разные таксономические уровни. Более подробно оппсана изменчивость морфологических признаков (Е.И. Коробкова, 1959). Выявление других фспотиническнх признаков (биохимических, серологических, фагочувствитсльности и т.д.) в значительной степени за труднено, поскольку в ходе бактериологического исследования из выросших субкультур для дальнейшего изучения отбираются наиболее типичные (М.С. Дрожевкина, В.Н. Милютин, 1975).

Вирулентность, одно из важнейших биологических свойств V. cholerae 01, является стержневой проблемой в эпидемиологии холеры, поскольку

в зависимости от наличия или отсутствия у них ус^гена, осуществляется дифференцированный комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий. Использование молекулярно-биологических методов позволяет проводить детекцию участков ДНК, детерминирующих синтез холерного токсина, в штаммах V. сЬокгае 01 (Е.В. Четина и др., 1993). Генотипические признаки, в отличие от фенотипических, в меньшей степени подвержены влиянию условий внешней среды и поэтому более стабильны (И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, 1975). Применение метода молекулярного зондирования и ПЦР является способом реального выявления потенциальной способности V. сИокгае 01 к токсинообразованию и выявлению некультивируемых форм возбудителя.

Антибиотикочувствительность холерных вибрионов 01 - важный маркер, позволяющий своевременно установить антибиотикорезистентность с целыо выбора наиболее эффективных препаратов для лечения и профилактики вибриогенных диарей.

Фаготипировапие холерных вибрионов 01 также имеет определенное эпидемиологическое значение. Однообразие фаговаров позволяет выявлять групповые заболевания, объединенные общим источником инфекции, пути распространения инфекции, выяснять возможности сохранения холерной инфекции в эндемических, очагах (Ю.М. Ломов и др., 1990).

Для идентификации холерных вибрионов перспективны фаговые методы, позволяющие определить вид, бмовар, фаговар, серогруппу, серо-вар, вирулентность. Изучение биологических свойств парагемолитических вибрионов (Г;М. Шикалов, 1978; А.Б. Хайтович, 1986) показало, что для идентификации этих микробов перспективным направлением является использование диагностического фага. Однако недостаточный набор фагов затрудняет создание фаговых препаратов для выявления V. рагаЬ.ас-то1уИсиз и V. а^то1у11си5 (N1. №кашзЫ е1 а!., 1966; Г.М. Голковскнй и др., 1984; Т.А. Кудряковаи др., 1992).

Биологическая характеристика возбудителя холеры является основой для разработки новых и усовершенствования существующих методических и организационных подходов к лабораторной диагностике вибрионов разных видов.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Выбранное направление исследований осуществлялось в соответствии с государственными темами по проблеме "Холера", тематикой отраслевых научно-исследовательских работ по микробиологии и диагностике патогенных вибрионов, а также с планом НИР кафедры микробиологии и ЦНИЛ Крымского медицинского института, регистрационный номер 01.91.0009707.

Цель и задачи исследования. Цель - характеристика биологических свойств вибрионов, в первую очередь, холерных 01 разного происхождения, выделенных в 7-ю пандемию в Украине, создание банка данных и

оценка их фенотипических и генотипических признаков, разработка новых и усовершенствование существующих методических и организационных подходов в диагностике заболеваний, вызванных вибрионами разных видов.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

- анализ эколого-географического распространения холерных вибрионов 01, обнаруженных в 7-ю пандемию холеры в Украине от людей и из окружающей среды;

- создание банка данных и разработка системы мониторинга биологической характеристики холерных вибрионов 01 (БХВ), циркулирующих в Украине по результатам определения признаков штаммов, выделенных из разных экосистем, в различные годы и в различных регионах;

- установление диапазона изменчивости у холерных вибрионов 01 разного происхождения по основным фенотипическим признакам, а также вирулентности, фаговаров, чувствительности к антибиотикам;

- сравнительная оценка результатов изучения вирулентности методами in vitro;

- создание препаратов из выделенных фагов для идентификации и фаго-гппирования галофильных вибрионов на основе изучения их биологических свойств;

- разработка новых методических подходов по созданию микрообъемных способов идентификации вибрионов;

- оценка эпидемической значимости водоемов на основании изучения возможности циркуляции в них нскультивируемых форм холерных вибрионов 01;

- разработка организационных принципов идентификации и проведение массовых исследований на холеру.

Научная новизна полученных результатов.

- Впервые выявлены особенности биологических свойств V. cholerae 01, циркулирующих в Украине в 7-ю пандемию, по фенотипическим свойствам, вирулентности, антибиотикочувствительности, циркуляции различных фаговаров.

- Впервые создан функционирующий компьютерный банк данных, обеспечивающий накопление, хранение, возможность анализа информации по 90 признакам, и на этой основе разработана система мониторинга биологической характеристики возбудителя на примере холерного вибриона 01.

- Впервые приведена систематическая оценка динамики изменчивости биологических свойств возбудителя, циркулирующего в Украине, и установлено, что подавляющее число фенотипических признаков изменчивы, особенно чувствительность к холерным фагам и способность агглютинироваться холерными сыворотками.

- Впервые в Украине молекулярным зондированием в ПЦР проанали-

зирована вирулентность штаммов V. cholerae Ol, выделенных из разных источников; признак потенциальной эпидемиологической опасности использован для районирования территории; выявлены некулыивируемые токсигенные формы в водных системах и оценена их эпидемическая значимость.

- Показано, что наиболее достоверный метод in vitro определения ток-сигенных свойств у холерных вибрионов 01 - обнаружение- vct-гена, другие методы имеют ограничения в использовании. .....

- Впервые выявлена динамика изменения чувствительности холерных вибрионов 01, выделенных от людей и из окружающей среды: повышение резистентности к некоторым антибиотикам (стрептомицину, левомицети-ну) и формирование полирезистентности у большинства циркулирующих в 90-е годы культур.

- Впервые разработано устройство для идентификации микроорганизмов микрометодом, защищенное патентом на изобретение.

- Впервые сформулированы организационные принципы проведения массовых исследований на холеру, получила дальнейшее развитие система идентификации возбудителя, обеспечивающая своевременную постановку бактериологического диагноза и определение важнейших биологических свойств V. cholerae 01.

- Сконструирован диагностический поливалентный фаг и составлен набор фагов для типирования галофильных вибрионов.

Практическое значение полученных результатов.

1. Выявлена изменчивость биологических свойств холерных вибрионов Ol разного происхождения во времени, в разных экосистемах и различных регионах в 7-ю пандемию холеры в Украине. Установлена фе-нотипическая изменчивость холерных вибрионов 01 по способности агглютинироваться холерными видо- и типоспецифическими сыворотками, лизироваться холерными биовароспецифическими фагами, по биохимическим свойствам.

2. Обнаружена неоднородность популяции холерных вибрионов Ol по потенциальной способности продуцировать холерный токсин, а также временная, экосистемная и региональная зависимости в выявлении токсиген-ных штаммов, выделенных от людей и из окружающей среды, что позволяет использовать эти результаты для районирования территории по типам эпидемической опасности. Обнаружение в водоемах Украины некуль-тивируемых форм токсигенных холерных вибрионов 01 позволяет оцепить происхождение циркулирующих культур, эпидемическое значение водоемов и прогнозировать ситуацию.

3. Выявлена коррелятивная связь между наличием vct-гена, отсутствием гемолитической активности по Грейгу и способностью окисления ман-нита более чем через 5 часов. Последние два метода целесообразно испо-

льзовать в качестве ориентировочных, а применение комплексного метода определения вирулентности - только для культур, чувствительных к холерному фагу eltor.

4. Установлены временные, экосистемные и региональные особенности в антибиотикочувствительности V. cholerae OI, проявляющиеся в увеличении резистентности, числа устойчивых культур и в формировании полирезистентности, что можно использовать для эпидемиологических и клинических целей.

5. Разработана система мониторинга за биологической характеристикой V. cholerae 01 для отслеживания и оценки динамических процессов в изменчивости фенотипических и генотипических свойств, для проведения адекватных и своевременных профилактических, противоэпидемических мероприятий, лечения выделителей, для прогнозирования эпидситуации. Показано, что в качестве маркеров эпидемического процесса могут использоваться биологические свойства возбудителя и некультивируемые формы.

6. Создана коллекция фагов галофильных вибрионов и отобраны штаммы для конструирования препаратов. Из семи фагов, переданных в коллекцию Ростовского НИПЧИ, №№ 227,507 и 536 депонированы соответственно под №№ ФК-47, ФК-48, ФК-49, а тест-штамм V. parahaemolyticus 13 - в музее Российского НИПЧИ "Микроб" № КМ-97 и в Ростовском НИПЧИ № Р-14706. Лабораторно-экспериментальные серии поливалентного диагностического фага и типирующие галофильных вибрионов использованы в лабораториях, проводящих исследования на эти микроорганизмы.

7. На основании патента № 2070932, выданного Роспатентом "Устройство для идентификации микроорганизмов", разработана система Micro Identification Vibrio, включающая микрообъемные тесты для биохимической идентификации патогенных вибрионов. Лабораторно-экспериментальные серии изготовлены по оригинальной технологии и использованы в практических лабораториях Украины. Для выделения патогенных вибрионов разработана унифицированная схема бактериологического исследования.

8. Разработаны система организационно-методических подходов к идентификации патогенных вибрионов по уровням лабораторий Украины и принципы проведения массовых исследований на холеру, обеспечивающие своевременную постановку бактериологического диагноза и определение важнейших биологических свойств возбудителя.

Внедрение результатов исследования:

- "Методические рекомендации по выделению фагов парагемолити-ческих вибрионов", утвержденные Ростовским НИИПЧИ (1991);

- "Ведомственная инструкция по микрообъемному методу серологического типирования холерных вибрионов не OI ", утвержденная МОЗ Украины (1991);

' ' " 6 . . ,

- "Ведомственная инструкция по организации идентификации патогенных вибрионов и использованию микрометодов", утвержденная МОЗ Украины (1992);

- "Ведомственная инструкция по микрообъемной биохимической идентификации патогенных вибрионов", утвержденная МОЗ Украины (1992);

- "Временные методические рекомендации по взятию материала от людей для исследования на холеру", утвержденные МЗ Крыма (1995);

- "Методические рекомендации по созданию, ведению и пользованию компьютерными базами данных по характеристике возбудителей холеры Vibrio cholerae 01", утвержденные Начальником Крымской противочумной станции (1996).

- "1нструкшя по оргашзацп та проведению протихолерних заход1в, xni-шщ та лаборатории! д1агностищ холери" (роздшн: "Лабораторна д1агно-стика" та "Оргашзащя лабораторних дослщжень на холеру"), утвержденная МОЗ Украины (1997),

Результаты исследования представлены на семинарах, циклах подготовки для врачей-бактериологов и эпидемиологов, проводимых в областях Украины. .

По результатам изучения фенотипичсских свойств, вирулентности, ан-тибиотикочувствительиости, определения фаговаров у культур, прошедших идентификацию в Крымской ПЧС, составлены информационные письма "Характеристика холерных вибрионов 01, циркулирующих в Украине" в 1990, 1991,1992, 1993,1995 гг.", направленные в различные регионы.

Разработанные методические подходы по использованию биохимической идентификации и единой схемы лабораторной диагностики патогенных вибрионов позволяют качественно улучшить диагностику: стандартизировать, ускорить, увеличить достоверность, уменьшить материальные затраты. Предложенные методические и организационные приемы, новые диагностические препараты внедрены рядом лабораторий научно-исследовательских и учебных институтов, противочумных учреждений и санитарно-эпидемиологических станций.

Личный вклад соискателя.

Основной объем исследований был выполнен лично автором и заключался в исследованиях всех культур холерных вибрионов 01 (2429 штаммов), поступавших на Крымскую противочумную станцию, начиная с 1974 года, по комплексу биологических свойств; автором самостоятельно проведена разработка системы мониторинга биологической характеристики возбудителя холеры, создание компьютерной базы данных и анализ всего фактического материала, его статистическая обработка. Автором выделено 57 фагов галофильных вибрионов, у семи из которых совместно с другими специалистами подробно изучены свойства и сконструированы фаговые препараты для диагностики. Определение vcí-гена у культивиру-

емых и некультивируемых холерних вибрионов проводили в последние годы самостоятельно. Автором разработаны и внедрены в практику методические и организационные подходы к проведению лабораторных работ в повседневной практике, а также в период массовых исследований; разработаны микрообъемные методы биохимической и серологической идентификации вибрионов разных видов, устройство для идентификации вибрионов. Автор провел сравнительное изучение разнообразных методов определения вирулентности холерных вибрионов 01 in vitro и на основе корреляционного анализа дает их оценку. Все положения и выводы диссертационной работы принадлежат автору. Автор написал все печатные материалы и принимал непосредственное участие в их оформлении.

Апробация результатов диссертации.

Доклады по материалам диссертации были сделаны на Республиканском совещании-семинаре бактериологов Украины, г. Тернополь, 1987; Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры", г. Ростов-на-Дону, 1988; Всероссийской научной конференции по проблеме "Холера", г. Ростов-на-Дону, 1992; Республиканском совещании врачей-бактериологов и зоологов Украины, г. Симферополь, 1992, Международной научной конференции "Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней", г. Харьков, 1993; Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера", г. Ростов-на-Дону, 1995; Украинской научно-практической конференции по вопросам диагностики, лечению, эпидемиологии и профилактики холеры, г. Одесса, 1995; Международной научной конференции, посвященной 150 летию И.И. Мечникова "Идеи Мечникова и развитие современного естествознания", г. Харьков, 1995; Украинском семинаре бактериологов, г.Львов, 1995; заседании Крымского республиканского филиала Украинского научного общесгва микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, г. Симферополь, 1996; совещании-семинаре врачей-бактериологов отделов ООИ Украины по актуальным проблемам организации и проведения лабораторной диагностики холеры и других особо опасных инфекций, г. Донецк, 1997; научно-практической конференции "Санитарная охрана территории Украины и профилактика особо опасных инфекций", г. Одесса, 1997; юбилейной конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной эпидемиологии", посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии ХИУВ, г. Харьков, 1997.

Публикации, По теме диссертации опубликована 40 работ, в том числе: 1 монография, 20 статей в научных журналах, 18 публикаций в материалах и тезисах конференций и 1 патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; десяти глав, включающих обзор литературы по теме и выбора направлений исследований, описания методики и основных методов, результатов про-

веденных теоретических и экспериментальных собственных исследований, анализа, обобщений и их обсуждения; выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 355 страницах компьютерного текста, содержит 69 таблиц и 14 рисунков. Библиографический указатель включает 361 источник литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовано 2429 штаммов V. cho-lerae Ol от людей и из окружающей среды, выделенных за период 1974 -1995 гг. в разных регионах Украины. Для выделения фагов галофильных вибрионов и изучения лизогении, фагочувствитсльности использовано 527 штаммов V.parahaemolylicus и V. alginolyticus. Специфичность фагов галофильных вибрионов изучали на 326 штаммах микроорганизмов близкородственных семейств, родов, видов. Штаммы бактерий и фагов, выделенные и идентифицированные по общепринятым методикам, в основном сотрудниками Крымской ПЧС, в том числе и автором, а также присланы для идентификации из областей Украины. При выделении и идентификации использовали сертифицированные питательные среды и коммерческие бакпрспараты.

У V. cholerae 01 изучали биохимические, культуральные, серологические, гемолитические свойства, чувствительность к холерным фагам, гем-агглютинацию, диастатическую и протеолитическую активность, наличие ацетилмегилкарбинола, чувствительность к полимиксину. Способность агглютинироваться оценивалась по реакциям с холерными видо- и типоспе-цифическими сыворотками в разведениях, где за диагностические значения принималась агглютинация до титра или полтитра. Чувствительными к фагам считались только те штаммы, которые лизировались в дозе рабочего титра (ДРТ).

Вирулентность холерных вибрионов Ol in vitro определяли комплексным методом по способности лизироваться разными сочетаниями фагов ХДФ-3, 4, 5 в ДРТ и по гёмолй^ической активности, экспресс-методом по скорости расщепления маннита, гемолитической активности по Грейгу, потенциальной эпидемической значимости - по наличию vct-гена в блот-гибридизации или ПЦР (Т! Маниатис и др., 1984; А.Л. Гинцбург и др., 1987; Е.В. Четина и др., 1992; J. Kaper et а!., 1991).

Определение антйбиотикочувствительности проводили методом серийных разведений на плотной питательной среде к тетрациклину (доксицик-лину), хлорамфеииколу (левомицетину), аминогликозидам (стрептомицину, мономицину, канамицину, генгамицину), макролидам (эритромицину), рифампицину, беталакгамным препаратам (ампициллину, карбени-циллину, цефазолину), полимиксину. Использовали только чистые порош-

ковые препараты. Ипокулят (3-4 час. культуру на пептонной среде) наносили па агар с помощью игольчатого штампа-репликатора. Результаты учитывали после 18 час. инкубирования в термостате при 37°С. Уровень чувствительности определяли по МПК антибиотика - полной видимой задержке роста. Оценка результатов проводилась по диапазону чувствительности к антибиотиками вычисляли значения МПК50, МПК90(Н.И. Гивен-таль и др., 1978).

Методы обнаружения и выделения фагов галофильных вибрионов и способы их идентификации изложены в Методических рекомендациях, подготовленных при участии автора. У фагов изучали морфологию негативных колоний, морфологию фаговых частиц, спектр литической активности, специфичность, серологические свойства, одиночный цикл развития, чувствительности фага к инактивирующим факторам: температуре, мочевине и цитрату натрия (Е. Ellis, М. Delbrück, 1939; М. Adams, 1947).

Для создания баз данных по результатам изучения фенотипической и генотипической характеристик холерных вибрионов 01 использовался компьютер IBM PC AT (386). Полученные результаты обработаны статистически (И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962; Г.Ф. Лакин, 1980).

Эколого-географическое распространенние V. cholerae Ol в 7-ю пандемию холеры в Украине.

В 7-ю пандемию V. cholerae 01 биовара eltor различного происхождения широко распространены в Украине. Увеличение числа выделителей холеры в начале 70-х и 90-х гг. коррелирует, с одной стороны, с интенсификацией распространения холеры и увеличением числа заболевших в мире (Ю.М. Ломов и др. 1995), ас другой - с одновременным увеличением количества выделяемых из окружающей среды культур. Можно предположить взаимовлияние процессов расширения пандемии холеры, появления выделителей в Украине и увеличения количества циркулирующих в окружающей среде штаммов (рис.1). Результаты обнаружения V. cholerae 01 в Украине показали, что культуры от людей выделялись во всех регионах, за исключением Тернопольской и Хмельницкой областей, а из окружающей среды - только в 15-ти, то есть распространение происходило как путем заноса, так и с участием природного фактора (рис.2).

Холерные вибрионы 01 выделяются из окружающей среды в Украине ежегодно в связи с заносом возбудителя, о чем свидетельствует обнаружение культивируемых и некультивируемых холерных вибрионов 01, содержащих vct-ген, а также с формированием природных очагов. В ряде регионов Украины в период 7-й пандемии на протяжении многих лет V. cholerae Ol обнаруживались в окружающей среде без выделения возбудителя от людей (Харьковская, Черниговская области), но неоднократно это сопровождалось и эпидемическими осложнениями (Крым, Донецкая, Херсонская, Запорожская и Днепропетровская области). Обнаруже-

1д п

Рисунок 1. Динамика выделения холерных вибрионов 01 в 1970-1995 гг. в мире и Украине от людей (верхняя часть) и из окружающей среды (нижняя часть). Тонкой линией указана заболеваемость в мире.

Условные обозначения: п - число выделенных за год культур.

ние холерных вибрионов 01 в окружающей среде происходило в годы эпид-осложнений (Херсонская область) или в виде "шлейфа" в течение ряда лет после них (Крым, Запорожская, Днепропетровская). Эколого-гсографический анализ распространения холеры показывает, что Украина - одна из территорий риска для проникновения возбудителя и развития эпидемических проявлений различной интенсивности.

Фенотипическая характеристика основных свойств холерных вибрионов 01.

Разработка и осуществление эпиднадзора за холерой предполагают использование не только данных о результатах выделения культур, но и дифференциации разных вариантов в пределах одного вида возбудителей, позволяющих понять природу естественного развития и экологию инфекции (В.И. Покровский и др., 1995). Биологическая характеристика возбудителя холеры - объективный признак степени его распространения, позволяет проводить

-¡дао

Условные обозначения:

] - культуры не выделялись;

[_| - культуры выделялись от людей;

[ л | - культуры выделялись от людей и из окружающей среды.

Рисунок 2. Распространение холерных вибрионов 01 от людей и из окружающей среды на разных административных территориях Украины в 1970-1995 гг.

эпиднадзор и выявлять изменения в характере развития эпидемического процесса различной интенсивности, в том числе и формирование природных очагов холеры, что в значительной степени зависит от свойств возбудителя, его фенотипической и геиотипической характеристик.

Измененные по фенотипической характеристике холерные вибрионы • 01, выделенные от людей, выявляются значительно чаще типичных, в разные годы, в разных регионах и различных экосистемах. Изменчивость холерных вибрионов 01 от людей и из окружающей среды характерна для всех исследованных нами фенотипических признаков, у культур из окружающей среды - с более широкими диапазоном и частотой.

Изменчивость холерных вибрионов 01 по способности агглютинироваться холерными сыворотками и лизироваться холерными фагами более выражена, что, вероятно, связано с большим влиянием различных

биотических и абиотических факторов на химический состав клеточной стенки, который генетически не детерминирован (И.Я. Черепахина, 1979). Появление V. сЬо1егае Я О связано с диссоциацией, которая возникает после встраивания умеренных фагов в бактериальную хромосому и, вероятно, происходит по пути диссоциации О - IIО без реверсии. При этом у вибрионов происходит утрата генов, контролирующих образование детерми-нантных полисахаридных звеньев ЛПС, что приводит к изменению антигенных свойств и возникновению V. сЬокгаеЯО (Л.Б. Борисов, 1976). Причины фагоустойчивости микробных клеток могут быть связаны с изменением микробной стенки, что препятствует адсорбции фагов, с репродукцией фаговых корпускул и лизогенизацией. Исследование лизогенных культур, выделенных в 1991-1994 гг., показало, что циркулировали фаги одного типа, принадлежащего к умеренным фагам II серовара, III категории (Т.А. Кудрякова, 1996).

Диапазон и структура изменчивости изученных V. сЬокгае 01 показывают, что атипичные признаки биовара выявляются с достаточно большой частотой, но с меньшей, чем серологические свойства и фагочувстви-тельность. Идентификация биовара выделенной культуры представляет в ряде случаев значительные сложности. Учитывая полученные результаты по циркуляции культур, выделенных от людей и из окружающей среды, не лизирующихся фагом С в ДРТ, высокую частоту изменчивости возбудителя, охватывающей комплекс фенотипических свойств, в том числе и по признакам биовара, а также эпидемиологические закономерности и клинические особенности заболеваний в период 7-й пандемии холеры, следует отметить, что в Украине выделялись V. сЬо1егае 01 биовара еког. Выделенные в 1992 г. культуры, изолированные из окружающей среды, лизиру-ющиеся фагом С в ДРТ, свидетельствуют скорее о глубокой антигёной изменчивости циркулирующих культур под влиянием экологических факторов, чем о заносе возбудителя классической холеры.

В сравнении с другими фенотипическими признаками наиболее стабильными оказались биохимические свойства, зависящие, вероятно, от различных метаболических процессов, происходящих в организме микроба, детерминированных генетически и менее подверженных влиянию условий существования. Анализ фенотипических свойств показал, что имеются как общие закономерности, характеризующие таксономическое положение микроба, присущие всем культурам независимо от их происхождения, так и особенности, обнаруженные у отдельных популяцияй холерных вибрионов 01, отражающие изменчивость, которые в определенной степени коррелируют с экосистемой, временем и географическим происхождением выделенной культуры.

Изменчивость по фенотипическим свойствам у холерных вибрионов 01 от людей проявляется постоянно, но частота встречаемости атипичных признаков в 70-е и 80-е гг. меньше, чем в 90-е годы (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика изменчивости холерных вибрионов 01 от людей в разные годы

Пятилетия и годы Удельный вес измененных фенотипических признаков,в процентах

Количество атипичных параметров Способность агглютинироваться Фаго-чувст-витель-ность GA отриц. S Pol F-P отриц.

I 1974-1978 7 5.0 90.0 0 0 5.0

11 1979 - 1983 8 57.1 100.0 0 14.3 0

III 1984-1988 3 0 ЮО.О 0 0 0

IV 1989-1993 13 40.6 56.2 5.2 2.1 6.2

V 1994-1995 18 16.7 98.4 0.6 0.2 24.6

Условные обозначения: "GA отриц. " - отрицательная гемагглютинацня с куриными эритроцитами; "S Pol" - отсутствие роста на среде с поли-миксином (30 единиц); "F-P отриц." - отсутствие способности к образованию ацетилметилкарбинола.

До начала 90-х годов не обнаруживались холерные вибрионы 01, выделенные от людей, изменчивые по способности агглютинироваться холерными видо- и типоспецифическими сыворотками, по признакам биовара, а по чувствительности к холерным диагностическим фагам, биохимическим свойствам - выявлялись редко. Количество культур с измененными фенотипическими свойствами нарастает с 1992г. и в последующие годы достигло 100%. Одновременно с изменчивостью во времени наблюдалась и территориальная экспансия холерных вибрионов Ol, выделенных от людей: в 70-е и 80-е годы культуры выделялись в одном-двух, в 90-е -в двух-десяги регионах. На всех территориях выделялись V. cholerae 01 от людей, относящиеся к серовару Ogava, достаточно устойчивые к холерным фагам eltor. Среди территориальных особенностей в биологической характеристике культур следует отметить, что в Крыму, Запорожской, Херсонской, Николаевской областях выявляются V. cholerae 01-RO варианта, и в этом же регионе циркулируют культуры сероваров Inaba, Hikoshima с измененной биологической характеристикой биовара и биохимическими свойствами.

Структура изменчивости культур из окружающей среды во времени также касалась различных фенотипических признаков (габл. 2). В 70-е годы культур со сниженной способностью агглютинироваться холерными сыворотками не выявлено, в 80-е- их обнаружение стало эпизодическим, а в 90-е - регулярным.

Таблица 2

Характеристика изменчивости холерных вибрионов 01 из окружающей среды в разные годы

Пятилетия и годы Удельный вес измененных фенотипических признаков,в процентах

Количество атипичных параметров Способность агглютинироваться Фаго-чувст-витель-ность GA отриц. S Pol F-P отриц.

I 1974- 1978 10 13.7 50.8 0.3 0 0.08

II 1979 -1983 9 25.0 75.9 35.7 17.8 2.6

Ш 1984-1988 14 34.4 88.1 55.7 13.1 0.6

IV 1989- 1993 15 37.6 82.1 57.7 4.5 1.9

V 1994-1995 16 48.7 91.8 6.7 9.3 23.6

Условные обозначения приведены в таблице I.

Количество обнаруженных в объектах окружающей среды V. с!ю1егае 01 на протяжении первых Шлет было стабильным. С середины 80-х годов число выделенных культур растет с одновременным увеличением доли измененных культур, достигающей в 90-е годы почти 100%. Во все годы выявляются атипичные культуры, но частота и структура их изменчивости неодинаковы. По серологическим свойствам, фагочувствительности, признакам биовара количество измененных культур постоянно увеличивается, а по биохимическим параметрам, в связи с эпидемическими проявлениями холеры в последние годы уменьшается. На фоне ежегодного увеличения количества выделяемых из окружающей среды культур обнаруживается, что ежегодно растет и число измененных по основным биологическим характеристикам параметров. Одновременно имеют место особенности регионального распространения и различный характер изменчивости циркулирующих в окружающей среде холерных вибрионов 01. По серологическим свойствам наиболее изменчивы культуры из Николаевской, Черниговской областей, а наименее - из Крыма и Херсонской области. Снижение чувствительности к фагам более выражено у холерных вибрионов 01, выделенных в Николаевской, Луганской, Донецкой, Днепропетровской, Запорожской, Херсонской, Харьковской областях, менее - в Крыму. Наибольшая изменчивость по биохимическим свойствам и признакам биовара отмечена у культур, изолированных в Крыму, Днепропетровской, Запорожской, Харьковской областях, меньше - в Донецкой, Херсонской, Николаевской, Луганской, Полтавской, Черниг овской областях и в г. Севастополе. То есть, в регионах циркулируют культуры, изменен-. ные по комплексу биологических свойств, при этом частота встречаемости

и уровень изменчивости биологических характеристик у культур из окружающей среды разных территорий неодинаковы, что, вероятно, зависит от своеобразия экологических условий каждого региона и разных экосистем.

Таким образом, изучение основных фенотипических свойств культур, выделенных от людей и из окружающей среды, показало, что в период 7-й пандемии холеры в Украине выделялись V. сЬо!егае 01 биовара сНог, изменчивые по одному или комплексу признаков, в том числе таких диагностически важных, как способность агглютинироваться холерными видо-и типоспецифическими сыворотками, лизироваться холерными диагностическими фагами. Эти изменения обнаруживались значительно чаще, чем другие, что создает определенные трудности при идентификации микроба по основным таксономическим прйзнакам, определяющим род, вид, био-вар, серовар и т.д. Широкий диапазон изменчивости в значительной степени затрудняет выделение культур, быструю и своевременную постановку бактериологического диагноза. Изменчивость фенотипических свойств холерных вибрионов ОI свидетельствует об их экологической толерантности и является адаптационным процессом, благодаря которому культуры с селективными преимуществами, выражающимися в более высокой устойчивости к факторам окружающей среды, могут в ней длительно существовать и формировать вторичные эндемические или природные очаги холеры.

Вирулентность холерных вибрионов 01.

Изучение вирулентности V. сЬо1егае 01 разного происхождения, выделенных в Украине.в 7-ю пандемию, по наличию уй-гена показало, что определяются токсигенные (у людей во время эпидемических проявлений) и атоксигенные штаммы (у людей при спорадических и групповых случаях заболевания или при вибриононосительстве), распределение которых имеет временную, экологическую и территориальную приуроченность. Наличие усигена не зависит от особенностей фенотипической характеристики V. сИо1егае 01 разного происхождения. Токсигенные штаммы в значительном проценте случаев выявлялись в годы эпидемических осложнений как от людей, так и из окружающей среды. Реже они выделялись из окружающей среды на территориях, где редко регистрируются заболевания, вызванные усИ- штаммами, или заболевания холерой вообще не регистрировались, что свидетельствует о вероятности обсеменения окружающей среды токсигенными штаммами и (или) о потенциальной опасности объектов, в которых они циркулируют. По результатам определения учтена у V. сЬо1егае 01 разного происхождения в Украине можно выделить следующие регионы:

- Николаевская, Одесская, Херсонская области - штаммы выявлены с высокой частотой от людей и из окружающей среды;

- Крым, Донецкая обл. - vcl+ штаммы чаще выявляются среди людей, чем в окружающей среде;

- Запорожская, Днепропетровская области - обнаруживаются единичные vct+ штаммы от людей и из окружающей среды;

- Харьковская обл. - vct+ штаммы в незначительном количестве обнаруживаются в окружающей среде;

- Киевская обл. - vct+ штаммы выделяются только от людей;.

- территории, где не выявлены vct+ штаммы.

В окружающей среде частота обнаружения vct-гена V. cholerae 01 достаточно высока в экосистемах, связанных с жизнедеятельностью людей -в сточной, морской воде и в открытых водоемах с непроточной или слабопроточной водой.

Таким образом, у V. cholerae Ol ведущим фактором вирулентности является наличие vct-гена, определяющее их потенциальную эпидемическую опасность, и это подтверждается коррелятивной связью между его наличием и эпидемической ситуацией. Различия в распространении vct-гена у холерных вибрионов 01 указывают на то, что районирование территории по типам эпидемических проявлений обязательно должно учитывать частоту выявления токсигенных и атоксигенных штаммов с периодической корректировкой. Учитывая, что vct+ штаммы у V. cholerae Ol, независимо от способа культивирования, времени выделения, места и объекта обнаружения, имеют идентичный профиль гибридизации в отличие от штаммов, не содержащих его (А.Ф. Брюханов, 1991; C.Salles, 1993), полученные данные позволяют высказать мнение о том, что эпидемически опасные vct+ штаммы распространены в мире и заносятся на разные территории, в том числе и в Украину. Попадание vct+ штаммов в открытые водоемы в климатогеографических условиях Украины может инициировать формирование природных очагов, что эпидемически потенциально опасно, так как при благоприятных для пускового механизма условиях может произойти развитие эпидемического процесса. Обнаружение vct+ штаммов в окружающей среде по разным причинам не всегда связано с регистрацией эпидемических проявлений, в числе которых нельзя не учитывать возможность влияния внешнего сигнала па координируемую экспрессию генов, кодирующих основные факторы патогенности, в том числе и токсинообразование (Y. Muller, 1984; J. Mekalanos, 1992; К. Kobay-ashi, 1993). При попадании в объекты окружающей среды штаммы могут утрачивать как vct-ген, так и способность к экспрессии токсигенности. Такие штаммы за счет других генетически контролируемых и регулируемых факторов патогенности могут вызывать спорадические или групповые вспышки и еще длительное время выявляться в окружающей среде. Гетерогенность профилей, отсутствие генетической связи между эпидемически опасными и неэпидемическими штаммами, разная клональность у vct+

и vct-, направленность реверсии vct+ к vet- и невозможность обратного процесса (A.J1. Гинцбурги др., 1989; И.А. Шагинян, 1996; S. Goldberg, S. Marphi, 1983; J. Kaperet al., 1991) показывают, что при попадании в разные экосистемы штаммы могут утрачивать токсигенные свойства, поскольку синтез фактора вирулентности не является жизненно важным для бактериальной клетки (В.Г. Петровская, 1967).

Для определения вирулентности используются методы in vivo и in vitro. Методы изучения вирулентности на животных достаточно сложны и не могут широко использоваться, поэтому более широкое применение получили методы in vitro, наиболее достоверный из которых - обнаружение vct-гена. Определение vct-гена в сравнении с другими показало отсутствие корреляции с результатами, полученными комплексным методом (табл. 3 и 4).

Таблица 3

Определение вирулентности vct+ холерных вибрионов 01 методами in vitro

Штаммы, выделенные:

Методы Свойства от людей из окр.среды Всего

абс. % абс. % абс. %

Гемолиз + 3 3.1 9 28.1 12 9.4

- 92 96.8 23 71.9 115 90.5

Комплексньй вирулентные 2 2.1 0 0 2 1.6

слабовирулентньк : 21 22.1 8 25.0 29 22.8

авирулентные 67 70.5 19 59.4 86 67.1

нет данных 5 5.3 5 15.6 10 7.8

Экспресс холерогенные 68 71.6 14 43.7 82 64.6

нехолергенные 22 23.1 13 40.6 35 27.5

нет данных 5 5.3 5 15.6 10 7.8

В связи с нарастающей фагорезистентностыо комплексный метод должен корректироваться в направлении поиска активных фагов и пересмотра схемы оценки их действия. В настоящее время использование комплексного метода должно быть ограничено, и его целесообразно применять лишь при выявлении чувствительных к фагу еког в ДРТ штаммов холерных вибрионов 01. Применение его для оценки эпидемических мероприятий допустимо лишь на территориях, где не выявляются фагорезистентные холерные вибрионы 01 и обнаруживаются нелизогенные культуры.

Сравнительный анализ других методов изучения вирулентности холерных вибрионов 01 с использованием математического подхода, показал, что гемолитическую активность по Грейгу и скорость окисления ман-нита целесообразно применять лишь в качестве ориентировочных, но в первом случае необходимо использовать стандартный метод, контроли-

Таблица 4

Определение вирулентности у vet- холерных вибрионов 01 методами in vitro

Методы Свойства Штаммы, выделенные:

от людей из окр.среды Всего

абс. % абс. % абс. %

Гемолиз + 16 69.6 88 38.4 104 41.3

7 30.4 141 61.6 148 58.7

Комплексньп вирулентные 0 0 1 0.4 1 0.4

слабовирулентньи 14 60.8 17 7.4 31 12.3

авирулентные 7 30.4 208 90.8 215 85.3

нет данных 2 8.7 3 1.3 5 2.0

Экспресс холерогенные 3 13.0 11 4.8 14 5.6

нехолергенные 18 78.3 209 91.3 227 90.1

нет данных 2 8.7 9 3.9 11 4.4

ровать его референс-штаммами и проверять среду, во втором - учитывать, что метод пригоден только для маннитпозитивных штаммов, поэтому необходимо четкое знание биохимической активности возбудителя и контроль результатов. Более достоверны результаты ориентировочного определения вирулентности V. сЬо1егае 01 при одновременном использовании обоих методов. Однако обнаружение уй-гена V. сЬокгае 01 возможно не только у культивируемых микробов, но и в исследуемых субстратах - у некультивируемых форм. Результаты по исследованию проб из окружающей среды и по обнаружению в них некультивируемых форм возбудителя показывают, что природные экосистемы имеют неодинаковое эпидемиологическое значение и по этому критерию можно выделить как минимум две группы.

Первая группа - эпидемически опасные поверхностные водоемы, в которых находятся уй-гены у V. сЬо1егае 01, способные персистировать в не культивируемое состояние до наступления благоприятных для размножения условий и являются природным компонентом этой экосистемы.

Вторая группа - менее эпидемически опасные водоемы - Уй-гены выявляются эпизодически. Вероятно, в такие водоемы токсигенные холерные вибрионы 01 не только вносятся сточными водами, но и присутствуют в них в некультивируемой форме, как это имеет место в реках Водопадная (Крым) и Уда (Харьков).

Таким образом, наиболее объективным методом выявления вирулентности холерного вибриона 01 является обнаружение уй-гена у культивируемых возбудителей и некультивируемых форм, позволяющее использовать этот маркер для оценки степени потенциальной эпидемической опасное-

ти различных водоемов, в качестве одного из критериев эпидемиологической типизации территорий по холере и для прогнозирования ситуации.

Антибиотикочувствительность холерных вибрионов 01.

Важное значение имеет чувствительность V. сЬо!егае 01 к различным антибиотикам, которая представляет интерес как с точки зрения выбора препаратов для лечения и профилактики, так и использования этих данных для оценки эпидемической ситуации.

По чувствительности V. сЬо1егае 01 разного происхождения к антибиотикам культуры подразделяются на группы: с высокой - к тетрацикли-нам, гентамицину, эритромицину, рифампицину и цефазолину; с умеренной - к мономицину, канамицину, ампициллину, карбенициллину, левоми-цетину и с низкой - к стрептомицину и полимиксину. Вместе с тем, среди чувствительных и умеренно-чувствительных культур выявляются штаммы устойчивые, а среди устойчивых - чувствительные к большинству препаратов с разной частотой.

Чувствительность V. с1ю1егае 01 разного происхождения к некоторым антибиотикам (тетрациклинам, левомицетину, стрептомицину) меняется в зависимости от времени, объекта выделения и географического местоположения. Связи антибиотикочувствителыюсти с фенотипическими свойствами и вирулентностью не обнаружено.

Колебания МПК у V. сЬо1егае 01 разного происхождения к антибиотикам в 1986-1995 гг. носили разный характер. Прослеживаются три типа антибиотикочувствительности: постепенное снижение ее уровня в пределах устойчивости (левомицетин) и увеличение количества устойчивых культур (карбенициллин, ампициллин, цефазолин); колебания уровней МПК в пределах чувствительности (тетрациклины, рифампицин) и устойчивости (стрептомицин) культур; относительно стабильный уровень чувствительности, определяемый в пределах чувствительных (гентамицин, эритромицин, мономицин, канамицин) и устойчивых(полимиксин) культур. Выявлены определенные закономерности в антибиотикограммах V. сЬо!егае01, связанные с циркуляцией на различных территориях. В некоторых регионах циркулируют культуры, выделенные от людей, с однотипной чувствительностью к антибиотикам, что, вероятно, зависит от использования различных препаратов для лечения. Различия чувствительности У.сЬо1егае01 из окружающей среды в разных регионах отражают экологические условия существования возбудителя и уровень чувствительности тех культур, которые от людей попадают в окружающую среду.

Определены существенные различия в чувствительности V. сЬокгае 01 из окружающей среды и от людей к левомицетину и стрептомицину. Различия по чувствительности к мономицину, эритромицину, рифампицину, карбенициллину связаны, в основном, с циркуляцией среди людей или в окружающей среде устойчивых единичных штаммов. Антибиотикограммы

у V. сЬо1егае 01, выделенных от людей и из окружающей среды (по диапазону колебаний, МПК5{), МПК90), к тетрациклинам, мономицину, ка-намицину, гентамицину, эритромицину, ампициллину, карбенициллину и цефазолину почти не отличаются. Однако, по сравнению с показателями V. сЬо1егае 01 из окружающей среды, выделенными до 1990 г., произошли выраженные изменения от чувствительности^ резистентности - к левоми-цетину, стрептомицину, незначительные - к канамицину, эритромицину, ампициллину. Если среди ранее изученныхштаммов устойчивость не превышала 80%^¡выявлялась только к трем препаратам, детерминанты обна-руживались.у 6.3%, то среди штаммов, выделенных позже, резистентными оказались все от людей и 96.1 % - из окружающей среды. Полирезистентность штаммов .из окружающей среды превысила 40%, то есть возросла более чем в 6 раз* Наиболее часто выявлялись детерминанты устойчивости к левомицетину и стрептомицину. Полирезистентность штаммов от людей составила 88%, то есть в 2 раза выше, чем у культур из окружающей среды, но наиболее часто выявлялась та же детерминанта устойчивости к левомицетину и стрептомицину. Уменьшение чувствительности культур в 90-е годы связано с эпидемической обстановкой: на эпидблагополучных территориях культуры более чувствительны, с ухудшением эпидобстанов-ки их чувствительность снижается. Вероятно, это связано с использованием препарата для лечебных целей, что подтверждается выявленными особенностями в антибиотикограммах у культур, изолированных на различных территориях. В,качестве примера можно привести Харьковскую область, где, в отличие от других регионов, не выявлялись холерные вибрионы 01 от людей, а среди изолированных из окружающей среды не обнаружено культур, устойчивых к левомицетину. Из объектов, связанных с деятельностью человека, выделяются культуры более устойчивые, чем из воды открытых водоемов.

До вспышки в 1994 г. в окружающей среде циркулировали V. сЬо1егае 01, отличающиеся по антибиотикочувствительности от культур из окружающей среды и от людей, выделенных в период вспышки (табл.5). Различия заключались в том, что до вспышки не было выявлено ни одной культуры, устойчивой к левомицетину, чувствительных к стрептомицину - было в 2.5 раза меньше; для штаммов не характерна полирезистентность. В период вспышки в окружающей среде и среди людей циркулировали близкие по чувствительности и устойчивости к антибиотикам культуры. Полученные результаты позволяют предположить, что эпидемические вспышки вызваны штаммами, которые не циркулировали на данной территории до ее начала. На это указывают и результаты изучения антибиотикочувствительности холерных вибрионов 01, выделенных до 1994 г., среди которых не выявлена устойчивость по характеру, частоте обнаружения подобные тем, которые определялись среди культур из окружающей среды и от людей в период вспышки.

Таблица 5

Чувствительность к антибиотикам холерных вибрионов 01, выделенных в 1994 г. от людей и из окружающей среды

Антибиотики Чувствительность культур, выделенных

из окружающей среды от людей (1270 штаммов)

до вспышки (35 штаммов) в период вспышки (93 штамма)

Пределы колебали МПК МПКЯ (90) Пределы колебаний МПК мпк50 (90) Пределы колебаний МПК мпкя (90)

в мкг/мл

ТЕТ 0.25 0.25 0.25-1 1 0.125-8 0.5(1)

LEV 8 8 32->128 64(128) 4->128 64(128)

STR 8->128 16 16->128 >128 128->128 >128

MON 16 16 16 16 8-32 16

CAN 16 16 8-16 16 4-16 16

GEN 1-2 1(2) 1-4 1(4) 1-8 4

ERY 2-4 4 1-4 2(4) 0.5-16 2(4)

RIF 0.5-2 1(2) 0.5-4 0.5(1) 0.5-1 0.5(1)

AMP 2-64 4(16) 2-8 4(8) 2->128 4(8)

CAR 4->128 4(64) 2-4 4 2->128 4(8)

CEF 8 8 8 8 4-8 4

POL >128 >128 128->128 >128 32-> 128 >128

Условные обозначения: ТЕТ-тетрациклиновая группа, LEV - левомице-пиш, STR - стрептомицин, MON - мономицин, CAN - канамицин, GEN -гентамицин, ER Y - эритромицин, RIF - рифампицин, A MP - ампициллин, CAR - карбенициллин, СЕР - цефазолин, POL - полимиксин.

По признаку антибиотикочувствительности холерных вибрионов 01, выделенных в разных регионах мира, имеется тенденция увеличения количества устойчивых штаммов (F. O'Grady et al., 1976; G. Garrigueet al., 1986; Y. Richard, 1986). Аналогичная тенденция прослеживается и в наших наблюдениях, поэтому можно считать, что эпидемические осложнения в Украине в 1994 г. имели заносной характер. Об этом же может свидетельствовать и тот факт, что обычно устойчивость к некоторым антибиотикам связана с использованием препаратов для лечебных и профилактических целей, то есть циркулирующие в период вспышек штаммы с высокой резистентностью появляются вследствие применения антибиотиков.

Изучение антибиотикочувствительности V. cholerae 01, выделенных в Украине, дает возможность не только оценить существующие тенденции в

закономерностях изменения их характера, но предположить вероятную циркуляцию микроба и пути его заноса, что позволяет использовать эти данные как маркер в эпиднадзоре за холерой.

Фаговары холерных вибрионов 01.

Определение фаговара как признака внутривидовой дифференциации V. сЬо1егае 01, представляет важное значение для эпиднадзора. Типиро-ванием холерных вибрионов 01 от людей определены фаговары: 14-й - у 69.6%, 15-й - у 22.9%, 16-й - у 2.8%, 17-й - у 0.2%; 4.5% - метилировалось. В течение наибольшего времени выявляли 15-й и 14-й фаговары. Среди культур, выделенных в период групповой и вспышечной заболеваемости, в подавляющем числе случаев обнаруживается один фаговар.

При изучение фаговаров холерных вибрионов 01, выделенных из окружающей среды, выявлено девять фаговаров (8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17 и 19); нетипируемых культур - 52.4%. Выявлялись 15-й фаговар (22.8%), 14-й (9.2%), 16-й (7.8%), 19-й(4.3%), 10-й(1.9%),остальных-менее Г/о.Фаготи-пированные культуры из окружающей среды распространены по регионам мозаично.

Особенности распространения фаговаров проявляются во времени, по экосистемам и месту происхождения культуры. Важным результатом внутривидовой дифференциации холерных вибрионов 01 является выявление некоторых закономерностей в распространении фаговаров, характеризующих как общие тенденции происходящего процесса, так и его локальные особенности. В разных регионах фаговары холерных вибрионов 01 из окружающей среды распространены более широко, чем от людей. Среди культур от людей наиболее частр выявлялся 14-й фаговар, с которым связаны эпидемические осложнения 1994-1995 гг. Так же часто, но не во всех регионах, обнаруживался в окружающей среде и более длительно встречавшийся у людей 15-й фаговар, которым определялись частично эпидемические осложнения и спорадическая заболеваемость в 80-х-начале 90-х годов. Среди холерных вибрионов 01 в Донецкой и Днепропетровской областях доминировали культуры 14-го фаговара; на других территориях частота различных фаговаров мало различалась. Выявление V. с1ю1егае 01 16-го фаговара при групповом случае заболевания в 1991 г. в г. Бердянске и большей, по сравнению с другими фаговарами, частоте обнаружения его у культур из открытых водоемов в Запорожской области, показало отсутствие связи со вспышками, происшедшими в том же году в Украине*, вызванными, в основном, 15-м фаговаром. Заболевания на территории Крыма, Донецкой, Днепропетровской, Николаевской, Запорожской, Херсонской областей связаны с циркуляцией культур 14-го фаговара, который в объектах окружающей среды начал выявляться с 1991 г. Культуры 10-го фаговара обнаруживались только в 1977 г. в речной воде Днепропетровской области. Число культур неопределенного фаговара довольно

значительно и больше среди культур из окружающей среды, что, вероятно, связано с длительной их циркуляцией, утратой стабильности фаговара и фенотипической изменчивостью культур, происходящей под влиянием среды обитания. Идентичность фаговаров у культур холерных вибрионов 01 разного происхождения дает возможность оценить причины, пути развития и распространения эпидемического процесса в регионе, за его пределами, что позволяет использовать эту биологическую характеристику для эпидемиологических целей.

Исследования таких биологических свойств V. с!ю1егае 01 как фено-типические признаки, вирулентность, антибиотикочувствительность, фа-говаропейзаж представляют важное значение для диагностики и выявляют динамические тенденции, происходящие во времени, в экосистемах и на территориях. Однако только комплексная оценка всех биологических свойств V. с1ю1егае 01 позволяет применить полученные данные для диагностики, решения таких важных эпидемиологических задач как использование признаков в качестве маркера эпидемического процесса, прогнозирования, дифференцированного подхода к проведению противоэпидемических мероприятий, выявления путей распространения и циркуляции возбудителя, эпидемиологического анализа.

Фаги галофильных вибрионов.

Наряду с V. с!ю1егае 01 наиболее изучены из вибрионов V. рагаЬаето-1у Пси5 и V. а1дто1уиси$, широко распространенные в окружающей среде и вызывающие групповые и спорадические заболевания (Г.Л. Карбышев, 1988; Е.В. Доброштан, 1992). За последние 20 лет достаточно полно описаны биологические свойства этих возбудителей и методы диагностики, но вопросы выделения фагов V. рага11аето1уиси5 и изучения их свойств, конструирования новых диагностических препаратов, имеют важное практическое значение. По авторской методике выделено 57 фагов из морской воды, гидробионтов, лизогенных штаммов галофильных вибрионов. По биологическим свойствам галофильные фаги представлены III, IV и V морфогруппами, среди которых обнаружен новый IV серовар. Фаг, выделенный из лизогенной культуры, обладал свойствами, позволяющими предполагать его более длительное сохранение и участие в под держании циркуляции галофильных вибрионов в окружающей среде. Созданная и охарактеризованная коллекция фагов галофильных вибрионов открыла возможность конструирования фаговых диагностических препаратов, а также выработки критериев их отбора: отличительный спектр литической активности, широкий диапазон их действия па штаммы галофильных вибрионов различных К-сероваров, выделенных на разных территориях. Сконструирован поливалентный диагностический фаг (ДГФ) в двух модификациях ДГФ-1 и ДГФ-2 для идентификации галофильных вибрионов видов V. рагаЬаето1уисш и V. а^по^юш. В состав ДГФ-1 отобраны три

i.-,:-.-- > /:.24у,, , .,..,-., . ... . фага, два из которых (616 и 227) нами выделены, и изучены. Испытания препарата показали, что чувствительными к нему были 82.3% сероги-пированных штаммов, 75.2%,- несеротипированных V. parahaemolyticus и 61.8%- V. alginolyticiis,. Использование фагов различного спектра действия обеспечило препарату, ДГФ-! широкий спектр литической активности. Созданный для лабораторной диагностики галофильных вибрионов препарат фага лизировал 70% штаммов при 17.7% резистентных серотипиро-ванных и 28.8% - нетипируемых культур. Дальнейшие исследования привели к созданию ДГФ-2, в который включены новые 3256 и 154 фаги, а также 227 и 1154 фаги из ДГФ-1. Среди серотипированных штаммов галофильных вибрионов от людей чувствительных к этому препарату оказалось 52%. По спектру литической активности ДГФ-2 уступает ДГФг1, но к фагу ДГФ-2 выявлено шесть чувствительных штаммов, устойчивых к ДГФ-1, то есть диапазон препарата иной.

Следующий этап конструирования препаратов - создание набора фагов для внутривидового типирования галофильных вибрионов. Для этой цели подобрано четыре монофага: фаг № 109 и авторские - №№ 507,536 и 3256. Для фагогипирования разработаны оригинальная методика постановки и учета полученных результатов и определены наиболее часто встречающиеся 4 сочетания фагов, вызывающие лизис культур. Фаготипирова-нием галофильных вибрионов разного происхождения фаговар определен у 77.1% культур: 1-й - у 31.9%, 4-й - у 15.8%, 3-й- у 6% и 2-й - у 3.7%; 11 других сочетаний фагов, вызывающих лизис у культур, составили 16.1%, не типировалось 22.9% культур, что указывает на существование других фаговаров. Наиболее часто.из различных экосистем выявляется 1-й фаговар. 2-й фаговар V. parahaemolyticus от людей не обнаружен, в окружающей среде- 10.9%. Особенности циркуляции фаговаров временные: 1-й-наиболее часто выявлялся от людей в 1979 и 1984 гг., 4-й - в 1984 г.; территориальные: на Азовском побережье чаще выявляется - 1-й, на Черноморском - 4-й. В г. Керчи, находящемся на берегу обоих морей, обнаружены с высокой частотой оба фаговара. Фаготипируются более 60% штаммов галофильных вибрионов - значительно больше, чем наборами монофагов для других вибрионов. Предложенная схема фаготипирования позволяет выявить временные, региональные, экосистемные особенности циркуляции галофильных вибрионов, что представляет интерес для эпид-анализа.

Методические и организационные подходы к диагностике заболевании, вызванных вибрионами, и их роль в эпиднадзоре за холерой.

Научные результаты, полученные в процессе углубленного изучения фенотипических и генотипических свойств вибрионов разных видов, показали необходимость совершенствования методов лабораторной диагностики. Наибольшую актуальность среди микроорганизмов рода Vibrio

представляет V. cholerae Ol. Однако другие виды: V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. alginolyticus, V. damsella, V. furnissii, V, hollisae, V. mimicus, V. metschnikovii, V. cincinatiensis, V. anguillarum, V. ordallii, V. sal-monicida, V. carchariae также вызывают различные патологические процессы как кишечной, так и внекишечной локализации. Сведения по биологической характеристике большинства этих видов ограничены. Специалисты Ростовского НИПЧИ с нашим участием впервые разработали схему бактериологической диагностики заболеваний, обусловленных условно-патогенными вибрионами, материалы которой включены в методические документы. Разработаны оригинальные методы для диагностики в микрообъемах: биохимической идентификации разных видов вибрионов, ускоренного определения основных фенотипических свойств, серотипи-рования V. cholerae не 01, а также создано устройство для идентификации микроорганизмов, которые могут широко применяться в практике. Они экономичны, ускоряют процесс диагностики и облегчают труд. Устройство для идентификации микроорганизмов запатентовано и представляет собой полистироловый планшет с лунками, на поверхность которых нанесена оригинальная питательно-индикаторная среда. На его базе разработаны: тест-система для определения биолог ических признаков чистых культур на принадлежность к семейству Vibrionaceae - Micro Identification Vibrio, состоящая из трех вариантов -1 -го, 2-го и 3-го уровней идентификации, в соответствии с тремя уровнями исследований и широтой изучения биологических свойств различными лабораториями; создана принципиальная-технологическая схема производства.

Методические и организационные подходы должны применяться параллельно. Реализация их возможна только с применением современных способов обработки полученных данных, для чего нами разработан мониторинг БХВ - система слежения за фенотигшческими и генотипически-ми свойствами V. cholerae 01 - маркерами эпидемического процесса, отражающими взаимодействия возбудителя со средой обитания и человеком во временном, экологическом и территориально-географическом аспектах. В его задачу входят своевоевременное выявление динамических процессов и тенденций, выражающихся в многообразии биологических характеристик; особенностей основных фенотипических свойств - признаков идентификации вида, серогруппы, биовара, серовара, фаговара; характера и структуры изменчивости; токсигенности возбудителей культивируемых и некультивируемых форм; уровня и характера антибиотикочувствительно-сти и ацтибиотикорезистентности; чувствительности к набору холерных фагов. Структура мониторинга БХВ должна включать организацию сети сбора проб, их отбора, лабораторных исследований материала, комплектование баз данных, создание банка данных, анализ информации. Исполнение работ по первым трем звеньям осуществляется согласно прика-

зам МЗ Украины территориальными органами здравоохранения. Структура остальных трех звеньев представляет информационно-аналитическую систему, состоящую из методической, информационной и аналитической подсистем. Методическая подсистема оперирует качественными результатами лабораторной диагностики, информационная - включает базу данных и вспомогательный текстовый файл, аналитическая - содержит стандартные формы базовых таблиц, которые являются исходным материалом для анализа.

Важные организационные и методические проблемы возникают не только при проведении текущих, но и при массовых исследованиях, что связано с выполнением большого объема работ, в связи с чем лабораторная база должна перестраиваться с повседневного ритма на интенсивный в соответствии со сформулированными принципами (этапность, синхронность, соразмерность, профилизация, модульная организация, параллельность, соответствие, материальная оснащенность, централизация обеспечения, укомплектованность кадрами, ритмичность, координация, методо-логичность, централизация лабораторных исследований), что позволит создать необходимые условия для выполнения задач по быстрой, своевременной, качественной и достоверной диагностике холеры, открывающие возможность для проведения эффективных противоэпидемических мероприятий, направленных на локализацию и ликвидацию очагов холеры.

Внедрение новых организационных и методических подходов по уровню исследований необходимо для экономии материальных затрат, исключения дублирования в исследованиях, использования стандартных способов биохимической идентификации вибрионов разных видов. Все это значительно улучшает качество лабораторной диагностики холеры.

Таким образом, в результате изучения распространения V. сЬо1егае 01 в Украине, их фенотипической и генотипической характеристик, биологических свойств других видов вибрионов, выделения и определения свойств фагов галофильных вибрионов и конструирования новых диагностических препаратов разработаны организационные подходы и принципы проведения лабораторной диагностики в повседневной работе и в периоды массовых исследований; новые методические подходы для создания стандартных тест-систем; методы индикации и идентификации патогенных для человека вибрионов; оценены различные методы определения вирулентности и выявлены наиболее достоверные из них; определено эпидемическое значение поверхностных водоемов на основании обнаружения не-культивируемых форм холерных вибрионов 01, что представляет научное и практическое значение.

27

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в период 7 пандемии холеры в Украине циркулировали холерные вибрионы 01: во всех регионах, за исключением двух, явились причиной заболеваний людей; в 15 - выявлялись в окружающей среде. Показано, что длительная циркуляция штаммов холерных вибрионов 01 в Украине связана как с заносом инфекции из других регионов, так и с возможным наличием местных природных очагов.

2. Изучены биологические свойства 2429 культур холерных вибрионов 01 за 20-летний период наблюдения. Установлена тенденция увеличения удельного веса холерных вибрионов 01 с измененными свойствами, в первую очередь со сниженной чувствительностью к действию фагов (около 90%), способностью агглютинироваться видо- и типоспецифическими сыворотками (до 50%), что существенно усложняет постановку бактериологического диагноза.

3. Впервые с помощью полимеразной цепной реакции и ДНК-ДНК-гибридизациивыявлена неоднородность холерных вибрионов 01, циркулирующих в Украине, по способности продуцировать холерный токсин. Доказано, что в период вспышек холеры значимо увеличивается циркуляция штаммов с усьгеном в окружающей среде и среди изолятов от людей. Мониторинг за циркуляцией холерных вибрионов 01, имеющих Уй-ген, позволяет контролировать распространение эпидемически опасных штаммов.

4. Доказана возможность использования показателя наличия усЬгена у холерных вибрионов 01, выделенных от людей, из различных объектов окружающей среды, в том числе у некультивируемых форм в воде, для оценки эпидемической опасности. Произведено картирование территории Украины по удельному весу циркулирующих V. с!ю1егае 01, имеющих уй-ген, и таким образом, создана возможность прогнозирования эпидемической ситуации.

5. Систематическое определение чувствительности у 1349 штаммов холерных вибрионов 01 к антибиотикам за 10-летний период (с 1986 по 1995 гг.) позволило выявить увеличение количества циркулирующих резистентных штаммов. В последние годы резко возросла устойчивость холерных вибрионов 01 к хлорамфениколу и стрептомицину независимо от экологической ниши изолятов. Такие штаммы имеют селективное преимущество при циркуляции в эпидемических очагах. Полученные данные использованы для корректировки схем санации носителей холерных вибрионов 01, лечения больных холерой и эпидемиологического анализа.

6. Внутривидовое типирование 424 штаммов холерных вибрионов 01, выделенных от людей, показало преимущественную циркуляцию 14 и 15 фаговаров; во время вспышки в очагах холеры циркулировал как правило один фаговар. Типирование 372 штаммов холерных вибрионов 01 из окружающей среды выявило фагомозаичность в их распределении.

7. Впервые в Украине выделены галофильные фаги, на основе которых созданы и внедрены в практику поливалентный фаг для идентификации и оригинальная схема фаготипирования галофильных вибрионов (V. parahaemolyticus и V. alginolyticus), что позволило осуществлять мониторинг за циркуляцией этих вибрионов.

8. Усовершенствована методика лабораторной диагностики вибрионов разных видов, реализованная в создании тест-системы Micro Identification Vibrio, защищенная патентом № 2070932 на изобретение "Устройство для идентификации микроорганизмов" от 27.12.96 г.

9. Обосновано, что наиболее достоверный признак для доказательства потенциальной эпидемической опасности V. cholerae Ol - выявление vct-гена; дополнительными данными являются результаты определения гемолитической активности культур и скорости окисления маннита. Установлено, что наличие vct-гена не коррелирует с признаками вирулентности холерных вибрионов Ol, определяемыми комплексным методом, что связано с фагоустойчивостью, поэтому его использование целесообразно при выявлении культур, чувствительных к фагу eltor в дозе рабочего титра.

10. Научно обоснована и дополнена система мониторинга за биологической характеристикой вибрионов как составной частью эпиднад-зора за холерой, в основу которой положена накопленная информация об избирательной изменчивости холерных вибрионов 01, изолированных из различных экониш, по фенотипическим признакам, токсигенности, антибиотикочувствительности, отношению к фагам.

11. Разработаны принципы и схема организации лабораторной службы в очаге холеры, что отражено в приказах Минздрава Украины, инструкциях и методических рекомендациях, утвержденных Минздравом Украины.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Хайтович А.Б., Дорофеев Ю.А. Холера в Крыму. - Симферополь, 1996. -28 с.

2. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А. Чувствительность вибрионов и аэромонад к вибриостатику О 129 // Антибиотики и медицинская биотехнология. - 1987. - Т. 32. - № 6. - С. 446-449.

3. Хайтович А.Б., Ильичев Ю.А. Использование микрометодов для идентификации вибрионов // Лабораторное дело. - 1991. - № 5. - С. 57-59.

4. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А. Чувствительность к антибиотикам холерных вибрионов 01, выделенных из объектов внешней среды // Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37. - № 2 - С. 20-23.

5. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А., Власова И.В. Чувствительность к

an гибиотикам вибрионов и аэромонад // Там же. - 1992. - Т. 37. - № 3. - С. 10-13.

6. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Дудкина О.В., Хайтович А.Б., Савченко Б.И., Дегтярев Б.М. Лизогения парагемолигических вибрионов серовара04:К12// Мшробюл. журнал. - 1992. - Т. 54. -№6. - С. 45-49.

7. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Дудкина О.С., Дегтярев Б.М., Хайтович А.Б., Савченко Б.И., Рябчинская Г. А., Ус З.И., Серова П.А. Фаги галофильных вибрионов и нх применение // Ж. микробиол. - 1992. - № 9-10. - С. 5-7.

8. Шендерович В. А., Горелов А.Л., Столярова Л.Г., Власова И.В., Соловьева В.Е., Хайтович А.Б. Сравнительная характеристика антибиоти-кочувствительности психрофильных и мезофильных аэромонад // Антибиотики и химиотерапия . - 1993. - Т. 38.-№ 10-11. - С. 20-22.

9. Ведьмина Е.А., Хайтович А.Б. Микробиология галофильных вибрионов// Антибиотики и химиотерапия. -1993. -Т. 38. -№ 10-11. - С. 60-66.

10. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф., Хайтович А.Б., Курбанов Ш.Х., Гинцбург А.Л. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae Ol) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1993. - №6. - С. 18-23.

11. Хайтович А.Б. Изменчивость биологических характеристик Vibrio cholerae, выделенных из объектов окружающей среды // Ж. микробиол. -1996.

- № 4. - С. 23-24.

12. Короленко Е.С., Хайтович А.Б., Леженцев Б.Н., Михайлова Г.П., Кровякова М.Т. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры в Крыму // Там же. - С. 115-118.

13. Хайтович А.Б. Основные принципы организации лабораторной службы в очаге холеры // Там же. - С. 118-120.

14. Хайтович А.Б., Шикулов В. А. Определение длительности сохранения Vibrio parahaemolyticus в продуктах моря //Там же. - 1996. - № 5. - С. 87-88.

15. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А., Шендерович В. А., Власова И.В. Ан-тибиотикочувствительность холерных вибрионов ОI, выделенных на Украине в 1994 г. // Антибиотики и химиотерапия. - 1996. - Т. 41. - № 6. - С. 25-28.

16. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А., Шендерович В.А., Горелов А.Л. Динамика изменений антибиотикочувствительности холерных вибрионов 01, выделенных из объектов окружающей среды //Там же. - С. 29-33.

17. Хайтович А.Б., Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Пидченко H.H., Качкина Г.В. Фаговары галофильных вибрионов//Ж. микробиол. -1997.

- № 2 - С. 11-14.

18. Хайтович А.Б., Подосинникова Л.С., Ильичев Ю.А., Власов В.П., Кудрякова Т. А., Монахова Е.В., Михась Н.К. Оценка вирулентных свойств

Vibrio cholcrae Ol с помощью методов in vitro // Ж. микробиол. - 1997. - N° 3. - С. 7-10.

19. Хайтович А.Б. Распространение фаговаров холерных вибрионов 01 в Украине//Вест ник проблем биологии и медицины. - 1997. - № 26. - С. 157-162.

20. Хайтович А.Б. Микробиологическая характеристика холерных вибрионов 01, выделенных в VII пандемию холеры в Украине // Вестник проблем биологии и медицины. - 1997. - № 27. - С. 55-62.

21. Хайтович А.Б. Чувствительность V. cholerae Ol антибиотикам // Вестник проблем биологии и медицины. - 1997. -№ 27. - С. 63-70.

22. Пат. 2070932 Россия, С 12 Q 1/04, G 01 N 33/535. Устройство для идентификации микроорганизмов /Хайтович А.Б., Кривошеин Ю.С., Ильичев Ю.А. (Украина). - Заявл. 6.03.92; Опубл. 27.12.96; Бюл. № 36 . -117 с.

23. Хайтович А.Б., Ильичев Ю.А. Фаговары холерных вибрионов Ol / / Мжробюл. журнал. - 1994. - Т. 56. - № 4. - С. 99.

24. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А., Власова И. В. Определение апти-биотикочувствительности как метода изучения природных популяций микроорганизмов //IV Всесоюзное совещание "Фенетика природных популяций". - Борок-М. - 1990. - С. 293-294.

25. Хайтович О.Б., 1лл1чов Ю.О. Мжрооб'емш методи ¡дентиф1каци BÍ6pionÍB // XII УкраТнсьюй Республ1канськш з'Узд мжробюлопв, ешдемюлопвiпаразитолопв. Тез. допов. -Харшв-КиУв. - 1991. - Ч. 1.-С. 167.

26. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Хайтович А.Б., Савченко Б.И., Дудкина О.В., Евтеева Е.И., Дегтярев Б.М. Биологические свойства фагов галофильных вибрионов, выделенных из воды прибрежной зоны Азовского и Черного морей // Рос. науч. конф. "Холера" (Вопросы эпидемиол, микробиол. им лабораторной диагностики). - Ростов-на-Дону. - 1992. - С. 151-155.

27. Македонова Л. Д., Кудрякова Т. А., Евтеева Е.И., Качкина Г.В., Савченко Б.И,, Хайтович А.Б., Ус З.М. Значение бактериофагов в идентификации парагемолитических вибрионов // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний. - Ставрополь. -1994. - С. 143-144

28. Хайтович А.Б., Ильичев Ю.А. Биологическая характеристика холерных вибрионов, выделенных на территории Украины в 1994 г. // Международная научная конференция, посвященная 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова. - Харьков. - 1995. - С. 325-326.

29. Хайтович А.Б. Проблемы эпидемиологии и диагностики Vibrio cholerae 0139 серогруппы // Материалы юбилейной конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной эпидемиологии, посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии ХИУВ. - Харьков. - 1997. - С. 51-59.

31

АНОТАЦ1Я

Хайтович О.Б. М1кробюлопчна характеристика в1брюшв 1 ор-гатзацшно-мегодичш шдходи до 11 практичного використання.

- Рукопис.

Дисертащя на здобуття паукового ступеня доктора медичних наук за спсщальшстю 03,00.07 - м^робюлопя. - Нацюнальний медичний ушвер-ситет ¡м. О.О. Богомольця, КиТв, 1998.

Дисертацто присвячено питаниям комплексноУ оцшки р1зних мжроб1-олопчних властивостей V. сЬо1егае 01. В дисертацн розроблено новий на-прямок в м1кробюлогн, який грунтуеться на комплекснш оцшц] бюлопч-них характеристик V. с!ю1егае 01 в аспектах часу, еколопчному 1 тери-тор1альному, використання цих даних для мошторингу. Встановлено: роз-повсюдження V. сЬо1егае 01 в УкраТж, IX фенотипна 1 генотипна характеристики; ешдемюлопчне значения водоймищ на пщстав1 виявлення форм, яких не можна культивувати; властивост1 фаг1в галофшьних ¡»¡брюжв; оцшки р>зних метод1в визначення в1рулентност1. Запропоноваш: нов1 ме-тодичш шдходи до створення стандартних тест-систем для ¡дентиф1кацп в1брюш'в; д1агностичш препарати; принципи оргашзацн лабораторно1 служби у повсякденшй робот1 та пщ час масових дошджень, високу ефек-тившсть яких обгрунтованотеоретичо 1 пщтверджено практично. Основш наслщки роботи знайшли застосування в пракгичних 1 наукових лабора-тор1ях для дтгностики р1зних вид1в патогених в^брюшв.

Ключов1 слова: паюгснш в1брюни, мжробюлопчш властивост'1, лабо-раторна д1агностика, ¡дентифжашя, в1рулснтшсгь.

Хайтович А.Б. Микробиологическая характеристика вибрионов и организационно-методические подходы к ее практическому использованию.

- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Национальный медицинский университет. Киев, 1998.

Диссертация посвящена вопросам комплексной оценки различных микробиологических свойств V. с1ю1егае 01. В работе развивается новое направление в микробиологии, основанное на комплексной оценке биологических характеристик V. сЬо!егае ОI во временном, экологическом и территориальном аспектах, использование этих данных для мониторинга. Установлены: распространение V. сЬо1егае 01 в Украине, их фенотипическая и генотипическая характеристики; эпидемиологическое значение водоемов на основании обнаружения некультивируемых форм; свойства фагов га-

лофильных вибрионов; оценки различных методов определения вирулентности. Предложены: новые методические подходы к созданию стандартных тест-систем для идентификации вибрионов; диагностические препараты; принципы организации лабораторной службы в повседневной работе н при массовых исследованиях, высокая эффективность которых обоснована теоретически и подтверждена практически. Основные результаты работы нашли применение в практических и научных лабораториях для диагностики различных видов патогенных вибрионов.

Ключевые слова: патогенныевибрионы, микробиологические свойства, лабораторная диагностика, идентификация, вирулентность.

Khaitovich А.В. Microbiologycal characteristic of vibrions, organized and methodical approaches for its practical using. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree by speciality 03.00.07 - Microbyology -Microbyology National medical University, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to design of complex estimation of V. cholerae's Ol different microbyological properties. A new direction in microbyology is elaborated which based on the complex estimation of V. cholerae's 01 biological characteristics in time, ecologycal and territorial aspects, use this facts for monitoring. The spread of Ukraine, their phcnotypic and genotypic characteristics, separation and determination of V. choleraeOl in Ukraine, their phcnotypic and genotypic characteristics, epidciniologyca! importance of reservoirs based on detection of uncultural forms, properties of halophilic vibrion's phag's, estimation of different methods of detection the virulence arc established. The new methods for creation of the standart test-systems for vibrions' identification, diagnostic preparations, priciplcs of laboratories' organization in routine work and for mass investigations are proposed. Their high effectiveness is stated by using of theoretical investigations and reinforced by illustrative examples. The main results of work have found the practical and scicntific utility in laboratories for diagnostic of different kings of pathogenic vibrions.

Key words: pathogenic vibrions, microbyological properties, laboratory diagnostic, identification, virulcncc.