Межмолекулярные взаимодействия компонентов природных липидов в процессе окисления

Сторожок, Надежда Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Межмолекулярные взаимодействия компонентов природных липидов в процессе окисления
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Межмолекулярные взаимодействия компонентов природных липидов в процессе окисления"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им.. Н.М. Эмануэля

7 1

На правах рукописи

СТОРОЖОК НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА

МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ ПРИРОДНЫХ ЛИПИДОВ В ПРОЦЕССЕ ОКИСЛЕНИЯ

03.00.02.-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва, 1996

Работа выполнена в Тюменской медицинской академии и Институте химической физики им. H.H. Семенова

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Бурлакова Е.Б., доктор химических наук Храпова Н.Г.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент АТН доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАЕН доктор химических наук Ведущая организация:

Спиричев В.Б.

Розанцев Э.Г. Касаикина О.Т.

Московская химическая академия им. М.В. Ломоносова

Защита состоится " СОРОМЯ " 1996 г. в " /7 "часов

на заседании диссертационного Совета Д200 .55.01. в институте биохимической физики РАН по адресугг. Москва, ул. Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики РАН

Автореферат разослан " " " "1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук М.А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате многочисленных работ сложились представления об уникальной роли регуляторных механизмов, обеспечивающих стационарность процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран. Показано, что защита от окисления мембранных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), являющихся основным субстратом окисления (МсСау et al., 1971), осуществляется с участием ферментативной системы (Fridovich, 1974-1979, Chance et al.1979, Flohe, 1982) и относительно низкомолекулярных биоантиоксидантов, выполняющих роль ловушек свободных радикалов (Кудряшов, 1964, Эмануэль, Бурлакова, Храпова, 1964, Tappel, 1968). Развитие данного направления в 70-90 годы позволило получить доказательства, что нарушение регуляции ПОЛ можно рассматривать в качестве неспецифического патогенетического маркера целого ряда заболеваний. Перспективы, обусловленные возможностью коррекции ПОЛ, вызвали повышенный интерес к проблеме биоантиоксидантов. Было установлено, что систему неферментативной антиоксидантной защиты составляют токоферолы (ТФ) (Tappel, 1970, Аристархова, Бурлакова Храпова, 1972, Ingold, 1982), убихиноны или коэнзим Q) (Наумов, Храпова, 1984), филлохинон (витамин К]) (Бурлакова, 1975), которые существуют в фенольной и хинонной форме, а также ß- каротин, его аналоги (Касаикина, Гагарина, Эмануэль, 1975, Burton, Ingold, 1984, Krinski, 1989, Terao, 1989) и витамин А (Конь, Горгошидзе, 1987). При этом было показано, что антиоксидантная и биологическая роль данных веществ взаимосвязаны. Дискуссионным остается механизм воздействия природных ингибиторов на интенсивность ПОЛ биомембран. Известно мнение, что влияние биоантиоксидантов осуществляется за счет изменения активности антиоксидантных ферментных систем (Ланкин, 1986), другие исследователи, не исключая возможностей опосредованного участия, рассматривают все же в качестве ключевой способность прямого взаимодействия антиоксидантов (АО) с пероксильными радикалами, ведущими процесс неферментативного окисления (Бурлакова, 19841994). Было показано, что природным АО, в частности а-ТФ как основному липидному АО, присуще чрезвычайно высокое сродство к пероксильным радикалам (Бурлакова, Храпова, 1972, Burton, Ingold, 1981), причем активность фенольных форм в 1000 раз выше по сравнению с хинонной формой (Бурлакова, 1975, Наумов, Храпова, 1984) .Для высоких концентраций а-ТФ обнаружено прооксидантное действие (Аристархова, Бурлакова, Храпова, 1972, Кухтина, 1982),

которое, по всей вероятности, связано с его способностью образовывать достаточно активные феноксильные радикалы, участвующие в реакциях продолжения цепей. К началу настоящей работы не были получены прямые экспериментальные данные о значимости данной реакции в кинетике окисления. Между тем знание механизма действия АО является залогом надежности критериев скрининга высокоэффективных ингибиторов среди веществ природного происхождения, отбора среди модифицированных структур биоантиоксидантов и их синтетических аналогов. Важно иметь представления о возможности взаимодействия АО в составе сложных смесей. Следует отметить, что система природных АО до настоящего времени воспринимается как совокупность взаимонезависимых компонентов биомембран, однонаправленно воздействующих на окисление фосфолипидов (ФЛ), которые рассматриваются большинством исследователей исключительно как субстрат пероксидации. К началу данной работы не был изучен характер взаимосвязей между важнейшими составляющими липидов биомембран, отмечались лишь первые шаги на пути выявления возможностей межмолекулярных взаимодействий компонентов в сложной природной системе. Между тем исследование кинетики и механизма взаимоотношений между индивидуальными биоантиоксидантами, а также ингибиторами и ФЛ весьма актуально, поскольку позволяет вскрыть новые элементы первичных механизмов регуляции ПОЛ, обеспечивающих антиоксидантный гомеостаз организма, и может послужить теоретической основой прогнозирования результатов направленных модификаций состава липидов биологических мембран.

Целью настоящей работы являлось установление общих кинетических закономерностей окисления многокомпонентных липидных систем возрастающей сложности, выяснение системного характера взаимосвязей между индивидуальными составляющими липидов природного происхождения, обоснование модели организации и механизмов взаимодействия звеньев неферментативной системы защиты липидов от окисления.

Задачи исследования. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности кинетики и механизма неферментативного окисления модельных липидов,

межмолекулярные взаимодействия и механизм образования связей в системах, содержащих а-ТФ, хиноны или каротиноиды.

2. Установить возможность образования комплексов между молекулами а-ТФ и ФЛ, определить константы и энтальпии образования связей.

3. Исследовать закономерности окисления природных липидных систем, включающих биоантиоксиданты и ФЛ различного строения и установить роль различных фрагментов молекулы ФЛ в действии их как синергистов ингибиторов окисления.

4. Количественно оценить константы элементарных реакций взаимодействия феноксильных радикалов а-ТФ и его аналога хромана С; с субстратами разной степени ненасыщенности и ФЛ различного строения и состава.

5. Получить химическую и кинетическую информацию о путях превращений ФЛ в ходе окислительного процесса. Изучить кинетику накопления гидропероксидов и расходования а-ТФ в присутствии ФЛ.

6. Изучить ингибирующую способность группы новых АО ряда модифицированных нафтохинонов и показать возможности увеличения их эффективности в сочетании с ФЛ. Разработать новые способы стабилизации окисления полиенов и высоконенасыщенных липидов природного происхождения.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые показаны и систематически изучены эффекты синергизма в совместном ангиоксидантном действии природных и синтетических хинонов с ФЛ различного строения, установлена взаимосвязь состава ФЛ и их эффективности как синергистов в смеси с а-ТФ, хроманом Сх, кверцетином, дибунолом, фенозан-кислотой, показана роль различных фрагментов химической структуры ФЛ в проявлении ими синергической активности. Показаны эффекты синергизма а-ТФ с азотистыми основаниями (этаноламином и ацетилхолином). Установлено, что ингибирующая способность а-ТФ в присутствии ФХ или азотистых оснований в зависимости от условий окисления может возрастать на 10-350%. Получены экспериментальные подтверждения возможности элиминирования азотистого основания в процессе окислительных превращений ФЛ. Определены константы скорости реакции (10) взаимодействия феноксильных радикалов а-ТФ с соевым и яичным (ФХ),соевым фосфатидилэтаноамином (ФЭА), кардиолипином (КЛ)(из бычьего сердца). Найдены абсолютные значения Кщ при взаимодействии 2,2,5,7,8-пентаметил-6-гидроксихромана (хромана С]) с метилолеатом (МО), метиллинолеатом, аллоцименом, арахидоновой кислотой и соевым ФХ. Установлена возможность восстановления

феноксильных радикалов а-ТФ при их взаимодействии с арахидоновой кислотой (20:4) и яичным ФЭА. Впервые показаны эффекты антагонизма между важнейшими природными АО липидов: а-ТФ и убихиноном (коэнзимом О), филлохиноном (витамином К1), менадионом, а-токоферилхиноном, а-токотриенолом, Р-каротином и ретинола пальмитатом (витамином А). Обоснован и экспериментально подтвержден механизм образования комплексов с межмолекулярной водородной связью в системах, содержащих а-ТФ и природные хиноны. Установлен механизм взаимодействия а-ТФ с продуктами превращения (3-каротина, обосновывающий впервые выявленный антагонизм в совместном действии данных АО.

Изучены закономерности эффекта синергизма ФЛ с группой синтетических аналогов менадиона и М-производными 2-метил-З-ариламинометил-1,4-нафтохинона.

Впервые показано, что антиоксидантная активность природных липидов на (60-70)% обусловлена эффектом синергизма биоантиоксидантов и ФЛ.

Разработан новый способ стабилизации окисления эфиров ПНЖК и высоконенасыщенных природных липидов, заключающийся в использовании смеси а-ТФ, бензафлавина, яичного ФХ Найден новый источник биологически активных липидов, содержащих высшие жирные кислоты семейства "омега-3", показана перспективность их использования в качестве натуропатического продукта и основы лечебно-косметических средств: крема, геля.

Научно-практическая значимость результатов работы

Результаты настоящей работы позволили установить характер системных взаимосвязей между важнейшими компонентами липидов, а также выявить роль и возможность реализации эффектов антагонизма в совместном действии природных АО (а-ТФ и хинонов, а-ТФ и (3-карогина или витамина А), роль эффектов синергизма в системах, содержащих биоантиоксиданты и и ФЛ, что создало основу для понимания не известных ранее первичных механизмов регуляции ПОЛ. Полученные данные дают возможность прогнозировать последствия применения исследуемых веществ с целью направленных модификаций антиоксидантного статуса организма.

Кинетическая и химическая информация представляет научную основу обоснованного применения смесей двух природных АО, и их композиций с ФЛ с целью эффективной стабилизации

пищевых липидов и фармпрепаратов применительно к конкретным условиям и субстратам окисления.

Результаты работы могут служить теоретическим обоснованием химического синтеза нового класса биологически активных веществ- потенциальных мембранопротекторов.

Исследованы новые высокоэффективные антиоксиданты класса ГТ-производных 2-мегил-3-ариламинометил-1,4-нафтохинона и показаны пути увеличения их эффективности.

Разработан новый способ, позволяющий увеличить в (1,3-2,0) раза продолжительность ингибирования полиенов и природных высоконенасыщенных липидов (Патент 95102928, дата поступления 28.02.1995 приоритет от 9.03. 1995г.)

Разработан способ извлечения (Патент. 95103108, дата поступления 28.02.1995 г. приоритет от 16.03. 1995г.), подробно изучен состав, химико-токсикологические характеристики натурального рыбного жира сиговых, лососевых и осетровых рыб Обского бассейна, внедренного в качестве лечебно-профилактического продукта: масла (ТУ 9281-004-34458166-95) и капсул ( ТУ 9281-00534458166-95), рекомендованных при гиперхолестеринемии, ишемической болезни, атеросклерозе, в качестве основы лечебно-косметических средств (ТУ 9151-003-34458166-95).

Разработаны (Патент 95105026, дата поступления 3.04.1995, приоритет от 12.04.1995.) и внедрены новые лечебно-косметические препараты на основе полиненасыщенных природных липидов сиговых рыб: лечебно-косметический крем (ТУ 9158-002-3445816695) и лечебно-косметический гель (ТУ 9158-001-34458166-95).

Предложена модификация конструкции прибора для изучения процессов окисления и дыхания (рационализаторское предложение N 277 Тюменского медицинского института (ТМИ) от 15.11.1980 г.), использованная в собственных экспериментах, а также на ряде кафедр ТМА, Тюменском филиале института кардиологии.

Отдельные разделы работы включены в учебный спецкурс"Биофизические механизмы регулирования интенсивности пероксидации липидов", читаемый студентам врачебного факультета ТМА, использованы в "Руководстве по гиперхолестеринемии", подготовленном для студентов врачебного факультета, вошли в пособие "Липидные лекарственные препараты", написанное автором для студентов фармацевтического факультета.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 1 - 4 Всесоюзных совещаниях "Еиоантиоксидант" (Москва, 1983, 1986, 1989, 1992), Всесоюзном совещании "комплексные гигиенические исследования здоровья жителей

Сибири",Новокузнецк, 1981,Всесоюзной конференции", Всесоюзном совещании "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", Ташкент, 1986, Всесоюзном совещании по хемилюминесценции, Рига, 1990, Всесоюзной школе-семинаре по био-термо-хемилюминесценции, Суздаль, 1990, Международном симпозиуме по биохимии липидов, Санкт Петербург, 1994, Международном симпозиуме по хронобиологии, Тюмень, 1982, 2 и 3 Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1995, 1996, 1 и 2 Международных симпозиумах "Питание и здоровье: биологически активные добавки к пище", Тюмень, 1995, Москва, 1996, 2 Международном симпозиуме по окислению, Казань, 1995, 2 международной конференции "Проблемы охраны здоровья и социальные аспекты освоения газовых и нефтяных месторождений в Арктических регионах", 12 областных конференциях по актульным проблемам химии, биологии и медицины,Тюмень, 1980- 1985, 19881994, 4 зональных конференциях "Патология и антиоксидангты", Тюмень, 1987, Свердловск, 1989, 1990, 1992.

Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 39 работах (20 статьях и 19 тезисах докладов), получены 3 патента.

Краткая характеристика объектов и методов исследования.

Объектами исследования служили АО: а-ТФ, убихинон, (Serva, Германия), филлохинон (витамин Kj), синтезированный в химической академии им. М.В. Ломоносова, p-каротин, витамин А (ретинола пальмитат), синтезированные в НПО "Витамины", а-токоферилхинон, а-токотриенол, a также кверцетин, менадион (Sigma, США). Использовали синтетические ингибиторы: дибунол, фенозан-кислота синтезированные в ИХФ РАН, группа N-производных 2-метил-3-ариламинометил-1,4-нафтохинона, условно названные как автокомплексы (АК): АК-40, АК-49, АК-135, АК-174, синтезированные в Латвийском государственном университете.

Изучали ФЛ различного строения: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, сфингомиелин (Serva, Германия), а также соединения, моделирующие отдельные фрагменты их химической структуры: этаноламин, ацетилхолин, 1,2-диацетилглицерофосфат натрия (Ferak, Германия).

В качестве субстратов окисления использовали метилолеат и метиллинолеат Львовского химфармзавода, дважды перегнанные под вакуумом при остаточном давлении 5-10 мм рт. ст. Применяли смесь этиловых эфиров ПНЖК микробиологического происхождения ("биен") содержащий до 30% арахидоновой кислоты, полученный с

экспериментального производства объединения "Белмедпрепараты", г. Минска. Были использованы также линолевая, арахидоновая кислоты, аллоцимен (8:3) (Serva, Германия). Липиды выделяли из органов и тканей рыбы Coregonus peled (Gmelin) (белые и красные мышцы, печень, мозг, икра, внутренние жировые ткани, целая тушка). Экстракцию липидов проводили по методу (Bligh, Dyer, 1959). Общие липиды разделяли на нейтральные и ФЛ по методу Кейтса, 1975. Количественный и качественный анализ состава липидов проводили методом ТСХ. Анализ ФЛ осуществляли по методу Светашева и Васьковского, 1973. Анализ состава жирных кислот проводили методом ГЖХ на хроматографе Chrom-5 (Чехия) с применением пламенно-ионизационного детектора. МЭЖК получали по методу (Reichvald et al., 1973). Содержание ТФ определяли по методу (Emmerie, Engel, 1938). Содержание убихинона и убихроменола устанавливали методом Донченко и др., 1979). Спектры поглощения и кинетику гибели токофероксилов регистрировали методом импульсного фотолиза (Кузмин и др., 1976).

Для изучения антирадикальной активности липидов использовали хемилюминесцентный метод (Шляпинтох и др., 1965), по методике (Храпова, Бурлакова, 1972). Изучали кинетику поглощения кислорода (Цепалов, Шляпинтох, 1959) в манометрических в установках типа Варбурга. Положения, выносимые на защиту:

1. Антирадикальная активность и количественные соотношения компонентов в системе АО липидов природного происхождения.

2. Проявление эффектов синергизма в совместном ингибирующем действии природных АО и ФЛ.

3. Образование комплексов между молекулами а-ТФ и ФЛ.

4. Возможность проявления эффекта антагонизма АО в процессе окисления, ингибируемого смесями а-ТФ и ß-каротина или витамина А, а-ТФ и хинонов (убихинона, витамина Kj, a-токотриенолхинона, менадиона).

5. Кинетика и константы скорости реакции феноксильных радикалов а-ТФ с высшими жирными кислотами разной степени ненасышенности и ФЛ. Возможность регенерации а-ТФ при взаимодействии с субстратом.

6. Особенности состава нового источника липидов, содержащих высшие жирные кислоты семейства "омега-3" и способ увеличения их устойчивости к окислению.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 Природные антиоксиданты

Кинетические особенности поведения природных АО были описаны для а-ТФ и каротиноидов, однако сравнительное исследование характера взаимосвязи между ингибирующим действием и концентрацией в субстрате ряда биоАО: а-ТФ, хромана С1, а-ортотокоферилхинона, кверцетина, менадиона, филлохинона (витамина Кх, убихинона (коэнзима О), (3-каротина, ретинола пальмитата (витамина А) в сравнении с действием синтетических АО: дибунолом и фенозан-кислотой (при значительном масштабе изменений концентрации ингибиторов) отсутствуют.

Ингибирующая способность суммы АО, присутствующих в липидах биологических мембран, проявляется в процессе окисления ФЛ, включающих в своем составе остатки ПНЖК. В связи с этим действие индивидуальных ингибиторов и их смесей оценено при окислении модельных ненасыщенных соединений близкой с липидами природы [метилолеата (МО), метиллинолеата (МЛ), смеси этиловых эфиров, среди которых преобладали эфиры арахидоновой кислоты (до 30%) (биен)].

Сравнительное изучение периодов индукции в зависимости от концентрации АО разного химического строения показало, что для хиноидных ингибиторов (менадиона, а-ортотокоферилхинона, убихинона и филлохинона) выполняется прямо пропорциональная зависимость (рис. 1), а для [5-каротина (рис. 2а) и ретинола пальмитата (рис.2 б) кривые как и для а-ТФ (рис. 2 а) носят экстремальный характер. Области концентраций, при которых проявляется максимальный ингибирующий эффект, для каждого из исследуемых АО ограничены. Диапазон эффективности (3-каротина характеризуется концентрациями (1,0-5,0)х10"^М, максимум соответствует 2,5х10"^М. В этой области действие а-ТФ как АО незначительно. Его ингибирующая способность наиболее ярко выражена в другом интервале концентраций (0,5-5,0)х10~Зм, максимум соответствует 2,5х 10"^ М. В области, в которой эффективен а-ТФ, действие (З-каротина сведено к минимуму. Витамин А имеет широкий размытый максимум в диапазоне (рис. 16). По абсолютной величине

ингибирующие эффекты, сопоставленные между собой в точках экстремума кривых, также существенно отличаются и соотносятся между собой в ряду а-ТФ, Р-каротин, витамин А как 5:3:1.

Таким образом, эффективность природных АО максимально проявляется в определенных концентрационных интервалах, каждый из АО вносит определенный вклад в процесс ингибирования окисления, обеспечивая более эффективное функционирование неферментативной антиоксидантной системы в целом.

Поскольку в природных липидах представлена сумма АО, то немаловажное значение имеет вопрос о характере взаимоотношений между индивидуальными компонентами системы, способны ли они дополнять либо нивелировать действие других составляющих. АО, присутствующие в липидах биомембран, в процессе окисления могут быть либо индифферентны друг к другу, либо взаимодействовать между собой, усиливая (синергизм) или подавляя (антагонизм) ингибирующую способность всей композиции. Наличие взаимодействий между природными АО может существенно изменить антиоксидантный статус всей системы в целом, придать ей качественно новые свойства. В связи с этим представляло интерес изучить закономерности окисления ненасыщенных соединений при сочетанном использовании ингибиторов.

Изучение кинетики окисления МО в присутствии бинарных смесей а-ТФ с менадионом, а-ортотокоферилхиноном, убихиноном и филлохиноном показало, что их совместное действие в большинстве композиций неаддитивно. Было показано, что простая сумма эффектов, производимых индивидуальными АО порознь (&]) (аддитивное действие), значительно выше, чем их действие в смеси (ту). Эффекты, близкие к аддитивное™ фиксировались лишь при достаточно низких концентрациях каждого из АО (10~5-ю-6)м. С ростом концентрации компоненты смеси действовали как антагонисты. Данная закономерность прослеживалась в совместном действии а-ТФ со всеми исследованными хинонами. Количественно абсолютное значение эффекта антагонизма оценивали как (Дт = - Тг), либо выражали его в относительных единицах (Дт/^д^хЮО. Отрицательное значение Дт характеризовало убыль эффективности при совместном действии АО.

Исследование характера взаимосвязи величины антагонизма от концентрации хинона в смесях с равными добавками а-ТФ, носит для всех исследуемых соединений однотипный характер (рис. 3): эффект антагонизма возрастает прямо пропорционально росту количества хинона до 5х10~4М, достигая (50-60)%, при дальнейшем увеличении концентрации кривая выходит на плато, практически не изменяясь в широком интервале концентраций. При постоянном уровне а-ТФ увеличение количества хинона в смеси приводит к усилению антагонизма (рис. 4). Таким образом, в системе а-ТФ-хинон в широком

я 160

20 30 САОх104, М

Рис. 1 Зависимость величины периодов индукции окисления МО от концентрации АО: а-ТФ{о); токотриенолхинона (»); убихинока (Л); витамина К1 (х); менадиона (•); Т=60°С, САИЕН=Зх10-3 М.

схинонах104, М

Ю 20 30

О $ЁПб

сао*Ю*, М

Рис. 2 а) Концентрационная зависимость изменения периодов индукции при окислении смеси ПНЖК в присутствии р-каротина (1); а-ТФ (2); 7=60-0, САИен= 9x10'3 М; б) То же в присутствии ретинола пальмитата

0 20 40 СТФ*ю<,м

Рис. 3 Уменьшение периодов торможения при совместном действии смеси АО от концентрации хинона:1-<х-токотриенолхинона, 2-убихинона (<3ю); 3-менадиона;4-витамива К^; субстрат -МО; СТФ=сопз1=2,5х10"4 М; Т=60"С. СЛИСН=Зх1[)-:1 м.

Рис. 4 Уменьшение периодов торможения от концентрации а-ТФ в смеси с постоянными концентрациями убихинока 1-5,1x10-* М; 2-11,5хЮ"4 М. Т=60°С,

СдиБН-ЗхЮ-3 М.

1 о'-'В -каротина/

4 6 8

4 ^ 6 8

/ 10ё 1 о'-р-каротипи/

Рис. 5 а) Полулогарифмическая анаморфоза зависимости изменения величины антагонизма при совместном действии а-ТФ (I) и (З-каротина (II) от концентрации при содержании I равном соответственно: 2,5х10"3 М (Д); 1,75х)0'4 М (•);!,75*10'5 М (0);1,25х10-5 М < 4);1,75х10"6 М (о);

б) Полулогарифмическая анаморфоза зависимости изменения величины периодов индукции при окислении смеси ЛЛЖК в присутствии 1 и II. Обозначения соответствую) рис. 5а. Т=60°С, САИЕН= 9х10"3 М;

диапазоне (за исключением очень низких) концентраций проявляется эффект антагонизма, что необходимо учитывать при терапии некоторых заболеваний (в частности лечении опухолей), предполагающей использование производных бензо- и нафтохинонов.

С целью выяснения причин антагонизма была изучена возможность взаимодействия в системе а-ТФ-хинон (методом ИК-спектроскопии). Исследования проводили как на полосе колебаний v (-ОН) группы сх-ТФ, так и на полосе у(-С=0) хинона. ПРИ изучении смесей установлено появление новой полосы, свидетельствующей об образовании комплекса между а-ТФ и хиноном. Известно, что с увеличением температуры комплексы с межмолекулярной водородной связью разрушаются и интенсивность полосы V (-ОН) должна возрастать. В наших экспериментах повышение температры раствора приводило к уменьшению интенсивности полосы, отнесенной к межмолекулярной водородной связи, однако, при этом не происходило увеличения интенсивности полосы и (-ОН) фенола, напротив, она уменьшилась. Эти факты по всей вероятности связаны с тем, что в системе (а-ТФ-хинон) наряду с образованием комплексов с межмолекулярной водородной связью протекают другие процессы, по-видимому, окислительно-восстановительные. для подтверждения этого предположения провели исследования на полосе V (С=0) (1675 см"1) хинона. Изучение температурной зависимости индивидуального филлохинона показало, что повышение температуры с (24 до 54)°С приводит к уменьшению интенсивности полосы (1675 см"1). При добавлении в растворы хинона а-ТФ (в концентрации в 5 раз превышающую концентрацию филлохинона), интенсивность полосы V (С=0) значительно увеличивалась, что свидетельствует об увеличении количества хинона, что возможно только вследствие окислительно-восстановительных реакций. Повышение температуры раствора приводит к небольшому уменьшению интенсивности полосы V (С=0). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при взаимодействии а-ТФ с хиноном протекают два конкурирующих процесса, а именно: образование комплексов с межмолекулярнох! водородной связью и реакции межмолекулярного окисления-восстановления, приводящие, по всей вероятности, к образованию семихинонов и токофероксилов (схема 1).

Суммируя изложенное необходимо подчеркнуть, что в системе, содержащей а-ТФ и хинон, часть молекул фенола не может выполнять роль ловушки радикалов, поскольку при образовании комплекса происходит связывание гидроксильной группы, а затем превращение

СХЕМА 1

а-ТФ в токофероксил и затем в токоферилхинон. Необратимые превращения активной формы а-ТФ позволяют объяснить эффекты антагонизма, возникающие при сочетанном использовании двух АО (фенолов и хинонов).

Различия в химической структуре а-ТФ и Р-каротина побудили нас более подробно изучить кинетические эффекты совместного ингибирования окисления смесями данных АО.

При изучении кинетики окисления высоконенасыщенного субстрата (биена) при сочетанном антиоксидантном действии а-ТФ с Р-каротином и витамином А были установлены как области аддитивности, так и области антагонизма. Показано, что совместное действие компонентов аддитивно при низком содержании Р-каротина (7х10"7 - 7х10"6) М и высоком уровне а-ТФ (2,5хЮ-3)М.

При постоянном уровне а-ТФ в смеси антагонизм проявляется в широкой области концентраций Р-каротина, зависимость носит II-образный характер (рис. 5): в области низких (Ю'^-Ю-®) М и высоких (Ю'^М) концентраций роль антагонизма может быть относительно невелика (3,5-4,0)%, а в диапазоне (10-3-10 ~6)М эффект достигает (50-

90)%., т.е. существует определенная концентрационная "яма". Для семейства кривых отмечается точка экстремума, соответствующая концентрации Р-каротина, равной 1,25х10"^М. При этом площадь под кривой, ограничивающей область антагонизма, "ширина и глубина ямы" уменьшается по мере роста концентрации а-ТФ в смеси, при этом возрастает и суммарный ингибирующий эффект (т^) (рис. 56).

Для смесей с разным уровнем р-каротина величина антагонизма связана с концентрацией а-ТФ линейной зависимостью.

Сравнительное изучение ИК-спектров индивидуальных веществ и их смесей показало отсутствие непосредственного взаимодействия а-ТФ и р-каротина. Установлено, что эффект антагонизма указанной смеси носит кинетический характер и связан с ускоренным расходованием а-ТФ в присутствии Р-каротина. Таким образом, при сочетанном использовании а-ТФ и Р-каротина в широком диапазоне концентраций (за исключением очень низких) данные соединения действуют как антагонисты.

Результаты настоящего исследования позволяют пересмотреть принципиальные подходы и тактику стабилизации полиненасыщенных субстратов данными АО. Эффекты антагонизма биоАО показывают, что при сочетанном использовании действие индивидуальных компонентов смеси может не только не дополняться но, напротив, значительно уменьшаться. Система приобретает свойства, непосредственно не складывающиеся из свойств отдельных составляющих, межмолекулярные взаимодействия компонентов придают системе как целому качественно новые свойства, которые необходимо учитывать при направленных модификациях с помощью ингибиторов антиоксидантного статуса организма.

В связи с тем, что в модельных субстратах установлен эффект антагонизма природных АО, то немаловажным представлялся вопрос о характере эффектов в естественных композициях ингибиторов, представленных в реальных липидных системах. Для выяснения этого вопроса из природных липидов (красных мышц Coregonus ре1е<3 СтеКп) выделили с помощью методов препаративной ТСХ сумму АО, разделили и идентифицировали индивидуальные компоненты природной смеси. В смеси АО липидов присутствовали а-ТФ, убихинон (<3ю), убихроменол, витамин К^. Концентрации первых трех веществ в липидах составляли: 7x10"^ М, 4,6x10"^ М, 1,4x10"^ М соответственно. Было оценено действие каждого из составляющих порознь и ингибирующая способность суммы АО. Показано, что действие индивидуальных АО (в тех концентрациях, в которых они представлены в липидах) практически аддитивно. Этот факт не

противоречит приведенным выше результатам, поскольку в модельных системах действие подобных концентраций АО также было аддитивным. Между тем, на основании приведенных выше данных следует учитывать возможность правления антагонизма в системе АО вследствии увеличения количеств каких-либо компонентов в результате попыток модификации антиоксидантного статуса организма в целом. Было установлено, что суммарное действие всех минорных компонентов антиоксидантной системы по сравнению с активностью общих липидов не превышает (15-33)%. Показано, что извлечение АО из общих липидов приводит к резкому снижению ингибирующей способности системы (в 14 раз), действие же АО, привносимых в иативные липиды возрастает в 2,5-3,5 раза. Эти факты указывают на то, что система антиокидантной защиты не исчерпывается собственно АО, существуют несколько звеньев целостной системы, обеспечивающей устойчивость к окислению полиненасыщенных липидных субстратов. Исходя из этого представлялось необходимым экспериментально обосновать модель организации и механизмы взаимодействия составляющих неферментативной системы защиты липидов от окисления.

Глава II. Регуляция эффективности природных антиокеидантов

Имелись основания считать, что ряд соединений, традиционно относимых к субстратам окисления , способны усиливать действие биоАО. В этом плане наибольший интерес могли представлять ФЛ.

По химической структуре ФЛ представляют собой сложный эфир трехатомного спирта глицерола, этерифицированного двумя молекулами высших жирных, преимущественно полиненасыщенных кислот и одной молекулой фосфорной кисоты, которая в свою очередь замещена в большинстве ФЛ одним из азотистых оснований (холином, этаноламином) или аминокислотой (серином) либо циклическим спиртом инозитом (см. формулы).

Было установлено, что индивидуальные ФЛ в модельных субстратах (МО, этилбензол) не проявляют антиоксидантной и антирадикальной активности, а при относительно высоких концентрациях (>1х10~2)м увеличивают начальную скорость окисления. Однако, в присутствии ФЛ наблюдали значительное увеличение ингибирующей способности как а-ТФ (табл. 2), так и всех других исследуемых АО (табл. 3). Такой способностью обладали отдельные фракции ФЛ, выделенные из различных источников: яичный и соевый фосфатидилхолин (ФХ), яичный фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилсерин (ФС), кардиолипин

(КЛ) (из сердца быка), сфингомиелин (СМ) , фосфатидилинозитол (ФИ) (табл.2). Для смесей АО и ФЛ выполнялись соотношения, свидетельствующие о синергизме (Денисов, 1978):

>Д^ТФ + 1фл ) о2<2(\У О2ФЛ)

Наблюдалось увеличение периодов индукции и уменьшение максимальной скорости окисления( \¥о2П,ах). Эти факты доказывали синергическую активность ФЛ. Следовательно, систему неферментативной защиты липидов от окисления представляют не только собственно АО, но и синергисты АО, роль которых в липидах выполняют ФЛ. Сопоставление синергических эффектов различных АО в присутствии!! ФЛ различного строения показало, что наибольшая активность присуща ФЭА, далее в порядке убывания следуют ФХ яичный, КЛ, ФХ соевый, ФС, дипальмитоилФХ, СМ и ФИ. В сочетании с одним и тем же ФЛ ингибирующий эффект АО различного строения существенно отличался между собой. Синергизм смесей ФЛ с ингибиторами фенольной природы был в 5-8 раз более значительным, чем с хинонами. Наибольшую эффективность проявлял синтетический аналог а-ТФ, лишенный длинноцепочечного заместителя (хроман С^), эффект синергизма которого с разными ФЛ по сравнению с а-ТФ был в 2-3 раза выше. Обращает на себя внимание факт, что в МЛ по сравнению с МО эффективность одних и тех же смесей выше в 1,5-2,0 раза (табл. 2). В ароматических углеводородах по сравнению с алкенами синергизм в совместном действии а-ТФ с ФХ менее выражен (табл. 3), а при окислении кумола активность ФЛ как синергистов совершенно не проявляется. Таким образом, ингибирующая способность синергических смесей зависит от природы АО, химического строения ФЛ, степени ненасыщенности субстратов окисления.

Химическая структура ФЛ достаточно сложна, включает остатки высоконенасыщенных ЖК, азотистое основание, фосфорил-группировку. Представляло интерес установить, какой из фрагментов в молекуле определяет их действие как синергистов окисления. Для этого в ^работе была изучена кинетика совместного действия смесей основного липидного АО-а-ТФ с ФЛ и моделирующими их соединениями. Если предположить, что синергизм ФЛ связан с присутствием в их молекулах аминогрупп, то следовало изучить совместное действие ТФ и ФЛ, как содержащих, так и не содержащих аминогруппы. К первым относились яичный ФХ, ДПФХ, различающиеся ненасыщенностью жирнокислотных остатков, ФЛ, лишенные азотистого основания, представляли КЛ

Формулы фосфолипидов и модельных соединений о о

II II

СН2.СН-СН2-0-Р-0-СН2-СН-СН2-0-Р-0-СН2-СН-СН2

II I I I II

о о о- ОН О-

с=о с=о I I

Й! л2 Кардиолипин

О СНз

» {

III \

0 О о- СНз

1 I

с=о с=о Фосфатидилхголин

0 о

1 I с=о с=о 1 I

Из к.

СНз

СНз-С-0-СН2-СН2-М+-СН3

II \

О СНз

Аыетилхолин

к2

Н1=К2=С15Н31- ДипальмитоилФосфатидилхолин

СН2.СН-СН2-0-Р-0-СН2-СН2-НН 2

I I I

0 о

1 I с=о с=о

о-

н-о-сн2сн2-кн2 Этаноламив

Фосфатидилэтаноламин

1*2

сн2.сн-сн2-о-р-о-сн2-сн-1га3+

II I I

0 о о- соо-

1 I с=о с=о I I

Фосфатидилсерин

он I

СН2-СН-СН-СН=СН-(СН2)12-СН3

I I

Н!

СНз

0=Р-0-СН.2-СН2->1+~СНЗ

о-

сн.

Сфингомиелии

сн2-сн-сн2 I I I

0 он он

О=р-Ош

ОЫа

Фосфатидилглицерол натрия

сн2-сн-сн2

I I I

0 О О-

1 I

Нг

о- НО ОН

-Р -о

О он

он

Фосфатидилинозитол

(дифосфатидилглицерол), ФИ, 1,2-диацетилглицерофосфат натрия. Поскольку в состав ФЛ входит остаток фосфорной кислоты нами было изучено совместное действие а-ТФ с ацетилхолином, этаноламином, в молекулах которых отсутствует фосфорилгруппировка (см. формулы). Такой подбор исследуемых соединений позволял оценить влияние "фосфорной головки" и азотистого основания холинов порознь и вместе, установить роль жирнокислотных остатков в обеспечении синергического действия в присутствии АО.

Было показано, что в сравнимых концентрация ФХ более эффективен, чем ацетилхолин (рис. б). Эти данные свидетельствуют о том, что синергическая активность ФЛ обусловнена не только присутствием азотистого основания, но связана с наличием в структуре ПНЖК. Изучение взаимосвязи величины эффекта и концентрации ФЛ в смеси показало, что для КЛ зависимость носит линейный характер, а ФХ, ДПФХ, ацетилхолина периоды индукции прямо пропорционально увеличиваются до концентрации 2мМ, начиная с которой на указанных кривых наблюдается предел или максимум (рис. 7а). Сопоставление прямолинейных участков зависимости для смесей ТФ с ФХ и ацетилхолином позволило установить, что синергическое действие ФХ на 50-80% может быть обусловлено присутствием азотистого основания. ДПФХ, включающий в своем составе два остатка насыщенной пальмитиновой кислоты, уступает на 15-20% яичному ФХ, содержащему то же основание, но в отличие от ДПФХ -непредельные ЖК. Следовательно, синергическая активность ФЛ зависит от степени ненасыщенности составляющих их ЖК. Для подтверждения этого тезиса изучили активность КЛ, имеющего в своем составе два остатка фосфорной кислоты, но не содержащего азотистого основания. Установлено, что КЛ также проявляет синергическую активность, однако она примерно в 3 раза ниже активности ацетилхолина и в 4 раза уступает активности яичного ФХ. Синергическое действие КЛ можно было связать как с присутствием двух фосфорилгруппировок, так и с наличием в его структуре 4 остатков ПНЖК. Было необходимо установить роль остатков фосфорной кислоты. Для этого изучили кинетику окисления МО с бинарными смесями а-ТФ с 1,2-диацетилглицеролом. Было показано, что при окислении МО данное соединение активности в качестве синергиста окисления не проявляет. Эти результаты предоставляли еще одно доказательство важной роли ПНЖК в обеспечении синергической активности ФЛ, в частности КЛ, в состав которого, как известно, входят наиболее высоконенасыщенные ЖК. Приведенные даные позволяют заключить, что действие ФЛ как синергистов окисления обусловлено присутствием азотистого основания и остатков ПНЖК.

Таблица 1

Кинетические характеристики окисления метилолеата в

присутствии смесей а-ТФ и ФЛ СТФ=0,25 мМ, Сфд=1,5 мМ, У7;—4,0х10~в Мхе'1, Т=60°С

Наименование Период индукции, Максимальная

фосфолипида мин скорость окисления,

10"6 Мхе"1

X Дт

- 33 - 1,0 -

Фосфатидилхолин 85 52 0,8 0,2

ДПФХ 73 40 0,9 од

Кардиолипин 68 25 0,9 од

Таблица 2

Эффективность смесей природных АО с ФЛ различного строения,

% синергизма

Т=60°С, САИБН=Зх10-Зм, СФЛ=1,5х10-3М, Са.тф>ХРоМАНА с1=2,5х _Ю'4М, Су6ихинона =1х10-3м, С вигамина К1=2х1Р-Зм

НАИМЕНОВАНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ

N п / п Название АО ФХ (соевый) ФХ (яичный) ДПФХ ФЭА (яичный) ФС КЛ ФИ СМ

МЕТИЛОЛЕАТ

1 а-ТФ 18 26 17 31 19 21 0 6

2 хроман С1 58 46 - 68 - 20 11 11

3 витамин К] - 6 - 6 13 6 5 -

4 убихинон - 0 0 0 - - 0 -

МЕТИЛЛИНОЛЕАТ

1 а-ТФ - 42 - 65 44 40 57 26

2 хроман С! - 54 - 95 50 50 84 32

3 витамин К! - - - 17 45 34 61 -

4 убихинон - - - 10 40 25 25 -

Л, чин

К««

о и »

- 1 „ г

1 1 1

Ш> ш

мим

Рис. 6 Кинетические кривые поглощения кислорода при окислении МО в отсутствии и в присутствии ФХ и ацетилхолина (1-3), в присутствии 2,Ь*10~4 М а-ТФ (4); смеси 2,5х10"4 М а-ТФ и 1,5х10"3 М ацетилхолина (5); смеси 2,5x10' 4 М а-ТФ и 1,5х10"3 М ФХ (6).

I I 1 I 1 I И [ФофотиЗгшмык], ыН [¿цетипалии], мМ

2 I [«б«], «Н

Рис. 7 Зависимость эффективности действия 2,5х10"4 М а-ТФ от концентрации синергиста: а) ФХ (1); дипальмитоилФХ (2); ацетилхолина (3); кардиолипина

6) ацетилхолина при разных концентрациях инициатора (АИБН):[3 (X), 5 (2). 15 (З)]х10-3 М; в) Взаимосвязь между концентрацией АИБН в модельной системе и концентрацией синергиста, необходимой для обеспечения максимальной эффективности смесей: ФХ (•), ацетилхолина (0).

н §

1 1

• 2 3

-.-} 1

Время фотолиза, мин.

Рис. 8 Зависимость количественных изменений а-ТФ от времени фотолиза (1); приращение количества а-ТФ при добавлении к раствору, подвергнутому фотовозбужденшо: (2)- арахидоновой кислоты (С=4,0х1(И М); (З)-яичного фосфатидилэтаноламина (С=3,9х1СИ М);

Рис. 9 Кинетика расходования а-ТФ при окислении МО в отсутствии (1) и в присутствии 1,5х10"3 М яичного ФХ (2).

Рис. 10 Кинетика выделения азотсодержащ продуктов, активных с реактивом Неслера, в проце окисления МО в присутствии синергических смесей ТФ с яичным ФЭА (а); с яичным ФХ (б). СТФ= 2,5х Ю-4 М, СФХ=1,2х10-г М; Т=60°С, САИБН=Зх10-3 М.

Таблица 3

Зависимость величины синергизма смесей а-ТФ и яичного фосфатидилхолина от природы субстрата окисления

Т=60°С, САИБн=Зх10-3М, СФЛ=1,5х10-3М, Са.тф=2,5х10-4М,

_Ссубстрата=1;2х10 ^М_

Ып/п Субстрат окисления % синергизма

1 Метиллинолеат 42

2 Метилолеат 26

3 Этилбензол 10

4 Кумол 0

Считали немаловажным изучить возможности регуляции эффективности синергических смесей за счет количественных вариаций их состава. Для смесей ФХ с а-ТФ была исследована зависимость величины эффекта от количества АО и показано, что Дт увеличивается прямо пропорционально росту концентрации а-ТФ (в изученном интервале 0,0-0,7 мМ). Для композиций, содержащих одинаковое количество а-ТФ, характер зависимости величины эффекта от концентрации холинсодержащих ФЛ и ацетилхолина описывался однотипными кривыми (рис. 7 а,б). Для всех холинсодержащих ФЛ можно указать концентрации (Стах), при которых в присутствии одного и того же количества а-ТФ достигается максимальное тормозящее действие. Величина (Стах) прямо пропорциональна скорости инициирования (рис. 7в). С ростом

скорости инициирования (\У{) снижаются величины ХИНд и увеличивается скорость окисления ^о2тах.)> ПРИ постоянной концентрации инициатора изменения ^^о2тах обратно пропорциональны концентрации ФХ в смеси. Выло установлено, что количество синергиста, необходимого для достижения максимального эффекта (Стах), также связано со скоростью инициирования (рис. 76) и возрастает прямо пропорционально увеличению последней (рис. 7в). После достижения (Стах) дальнейшее увеличение концентрации холинсодержащих синергистов (в случае с ДПФХ и ацетилхолином) не приводит к изменению величины эффекта (рис. 7а), а для яичного ФХ происходит постепенное уменьшение тормозящего действия вплоть до его полного исчезновения (при концентрации 20 мМ) (рис 7а). Снижение тормозящего действия смеси при больших концентрациях ФЛ связано, по всей вероятности, с присутствием значительного количества ПНЖК, которые принято считать легко окисляемым субстратом. Вовлечение в окисление остатков ПНЖК может приводить к дополнительному инициированию процесса, а

следовательно, к уменьшению периодов индукции. Оказалось, что по мере увеличения скорости инициирования происходит значительное снижение величины эффекта (табл. 4), связанное с более высоким уровнем свободных радикалов. Таким образом, повышение в системе концентрации как инициатора, так и яичного ФХ приводит к однонаправленному воздействию. Обобщая приведенные данные, можно сказать, что эффективность синергизма смесей природных АО и ФЛ существенно зависит от условий окисления, концентрации синергиста. Это позволяет предположить, что исследуемый эффект согласно известной классификации /Карпухина, Эмануэль, 1985/ может быть отнесен к кинетическому синергизму.

Вопрос о роли химического строения АО в составе синергических смесей имеет принципиальное значение, поскольку может послужить ключом к пониманию механизмов проявления синергизма в совместном действии природных ингибиторов и ФЛ. Изучение смесей ФХ с разными АО: фенольной и хинонной природы показало существенные различия в их эффективности (табл.5). Из табл. видно, что хроман С1 в присутствии ФХ в 1,5 раза эффективнее а-ТФ при окислении как МО, так и МЛ. К этой же группе фенольных АО относится и кверцетин.

Таблица 4

Кинетические характеристики окисления МО со смесями 0,25 мМ а-ТФ и синергистов при разных концентрациях инициатора

САЛЕН, мМ \Yixl08 Мхе"1 Период индукции в, минутах тинд мах Д^мах С мах, мМ

(МО+ТФ) (МО+ТФ) +ФЛ Ах мин

Ацетилхолин

3,0 2,9 40 75 35 80 40 25,0

5,0 4,9 27 41 14 64 37 5,0

15,0 14,7 16 22 6 40 24 12,0

20,0 19,6 , 4 4 0 - - , -

Фосфатидилхолин

3,0 2,9 40 82 42 82 42 2,0

5,0 4,9 27 45 18 67 40 5,0

Дипальмитоилфосфатидилхолин

3,0 2,9 | 40 | 86 46 86 46 2,0

Кардиолипин

3,0 | 2,9 40 64 24 - " 1 -

Таблица 5

Эффективность смесей различных АО с ФХ СфХ= 1,5хЮ"3М, САО =2,5x10'^М, Т=60°С, САИБН=ЗхЮ-3М

Метилолеат Метиллинолеат

индекс (18:1) индекс (18:2)

№ Название (Дт), мин Величина (Дт), Величина

п/ антиокси- синергизма, мин синергизма,

п данта % %

1 а-ТФ 40,0 26,0 15,5 42,0

2 Хроман С1 60,0 46,0 20,0 54,0

3 Кверцетин 50,0 21,0 52,0 40,0

4 Витамин Кх 9,0 16,0 - -

5 убихинон 0,0 0,0 - -

6 дибунол 8,0 4,0 8,0 6,0

7 фенозан-кислота 10,0 4,0 14,0 9,0

В сравнении с этими ингибиторами действие синтетических экранированных фенолов (дибунола и фенозан-кислоты) в сочетании с ФХ увеличивается незначительно, уступает эффекту ФХ с филлохиноном. При окислении МЛ эффект синергизма по сравнению с МО возрастает для всех фенольных АО в 1,2-1,5 раза. Приведенные данные свидетельствуют, что в субстратах разной степени ненасыщенности эффективность синергической смеси с одним и тем же ФЛ определяется химическим строением АО. Можно полагать, что

данная взаимосвязь отражает способность феноксильных радикалов, образующихся в процессе окисления АО, восстанавливаться в присутствии ПНЖК, входящих в состав ФЛ, с образованием активной формы ингибитора, обрывающей новые цепи окисления.

Глава 3 К механизму эффектов синергизма природных АО и ФЛ.

Элементарные процессы, протекающие с участием а-токоферола (ТосН) и токофероксильного радикала приведены в следующей схеме: К7

ТосН + R02*-»Toc* + ROOH (7)

К8

Toc* + R02'-> молекулярные продукты (8)

Toc* + Toc* <======> молекулярные продукты (9)

К'g (длмеры)

Kio, °2

-vTocH + R02* (10)

Toc* + RH

->TocOOH+ R,02*

Из приведенной схемы следует, что образующиеся в процессе окисления феноксильные радикалы могут участвовать не только в реакциях диспропорционирования, но и взаимодействовать с субстратом окисления или веществом-синергистом (реакция 10). Данная реакция может сопровождаться восстановлением активной формы АО и способствовать увеличению его эффективности, если в присутствии синергиста образуются менее активные радикалы.

Методом импульсного фотолиза определены константы взаимодействия феноксильных радикалов а-ТФ и хромана Су с высшими ЖК разной степени ненасыщенности и ФЛ различного происхождения и состава (Кю)- Данные приведены в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что величина эффективной Кю возрастает по мере увеличения степени ненасыщенности высших ЖК. Значения констант для соединений, включающих в своем составе от 1 до 4 кратных связей, с индексами 18:0 ; 18:2 ; 8:3 ; 20:4 соотносятся между собой как 1 : 9,0 : З,6х103 : 0,7х104 : З.бхЮ5. Наиболее существенные отличия в реакционной способности отмечаются между моноенами и диенами (в 400 раз) и соединениями с числом двойных связей от 3 до 4 ( в 50 раз). Значение константы Кю также зависит от природы полярных липидов. Среди исследуемых ФЛ наиболее высокие значения установлены для яичного ФХ и КЛ. Как

и для индивидуальных непредельных соединений показана корреляция между интегральным

Таблица 6

Константы скорости реакции феноксильных радикалов а-ТФ с субстратами разной степени ненасыщенности и ФЛ

№ п/ п Состав смеси Кэф.(20°С) М-1хс"1

1 а-ТосН + Этклбензол (0,05±0,01)х10-1

Высшие жирные кислоты

2 а-ТосН + Стеариновая кислота (0,28±0,15)х10"1

3 а-ТосН + Метилолеат (2,5±1,э)х10-1

4 а-ТосН + Линолевая кислота (1,00±0,25)х102

5 а-ТосН + Аллоцимен (1,94±0,01)х102

6 а-ТосН + Арахидоновая кислота (1,0±0,6)х104

Фосфолипиды

7 Хроман Сх + фосфатидилхолин (ФХ) соевый (0,51+0,10) хЮ1

8 а-ТосН + ФХ соевый (0,29+0,10) хЮ1

9 а-ТосН ■+ ФХ яичный (3,80+0,10) хЮ2

10 а-ТосН ■+ фосфатидилэтаноламин (ФЭА) соевый (0,36+0,05) хЮ2

11 а-ТосН + кардиолипин (из бычьего сердца) (3,00±0,020)х102

12 а-ТосН + ФЛ*

*для фосфатидилсерина, фосфатидшшнозитола и сфингомиелина активность в реакции фенокеильными радикалами показана качественно, но константа не определена, поскольку в силу низкой растворимости в гептане не были получены истинные растворы.

показателем, характеризующим реакционную способность данных ФЛ, и присутствием в составе ФЛ наиболее ненасыщенных ЖК. Следует отметить, что прослеживается взаимосвязь между активностью а-токофероксила в реакции 10 с ФЛ различной природы и эффективностью их синергических смесей с а-ТФ (табл. 2). Совпадение упомянутых рядов является Еажным аргументом в пользу гипотезы о значимости степени ненасыщенности остатков ЖК в обеспечении синергической эффективности ФЛ.

Таким образом, приведенные результаты являются подтверждением высокой активности ФЛ в реакции с токофероксилами. В совокупности приведенные выше факты, а также данные о увеличении эффективности синергических смесей в более ненасыщенном субстрате, являются аргументами в пользу сформулированной выше гипотезы о том, что в основе одного из механизмов эффекта синергизма в совместном действии природных АО и ФЛ лежит реакция восстановления ингибитора.

Возможность восстановления а-ТФ была зафиксирована непосредственно при изучении кинетики изменения ИК-спектров при взаимодействии токофероксилов, полученных методом стационарного фотолиза, с арахидоновой кислотой (20:4) и яичным ФЭА (рис. 8). Показано, что указанные соединения регенерируют большую часть фотолизированного АО, ФЭА в этом отношении при сравнимых концентрациях более активен. Восстановленный в ходе реакции 10 а-ТФ, вновь включается в процесс окисления в качестве ловушки наиболее активных пероксильных радикалов.

Существование взаимосвязи между величиной синергизма и степенью ненасыщенности субстрата (табл. 5) служит кинетическим подтверждением данных о том, что наиболее лабильные ЖК в составе ФЛ способствуют регенерации активной формы АО. Известно, что возможность восстановления экранированных феноксильных радикалов в силу их низкой активности в реакции 10 /Bichel, Koojman, 1956, Mukai, 1986, 1988/ ограничена, что объясняет наши данные о низкой синергической эффективности ФЛ в паре с экранированными фенолами (дибунолом, фенозан-кислотой) по сравнению с их смесями с а-ТФ и его аналогом хроманом Cj. Совокупность приведенных данных свидетельствует о возможности частичной регенерации а-ТФ по ходу окисления при взаимодействии феноксилов с остатками ПНЖК.

Восстановление активной формы АО должно приводить к изменению кинетики расходования а-ТФ. Действительно, как показано двумя независимыми методами (ИК-спектроскопии и колориметрическим методом Эммери-Энгеля (рис. 9) в присутствии ФЛ происходит снижение скорости расходования а-ТФ с 9,3х10~8 Мх с"1 до 3,8x10~8Мхс-1, т. е. снижается в 2,5 раза. Следует отметить, что выход процесса из периода индукции происходит на фоне сохранения до 30% а-ТФ в отсутствии ФЛ и до 50% в их присутствии. Таким образом, кинетика расходования АО отражает синергизм в совместном ингибирующем действии а-ТФ и ФЛ. Из приведенных данных видно, что и после выхода реакции из периода индукции остаются достаточные ресурсы а-ТФ и любые факторы, способствующие снижению скорости его расходования или восстановления активной формы АО (реакция 10) будут приводить к эффекту синергизма.

Было показано, синергическая активность ФЛ обусловлена не только присутствием в их составе ПНЖК, но и азотистых оснований (холина, этаноламина), которые не только в структуре ФЛ, но и самостоятельно действуют как синергисты ингибиторов окисления. Механизм воздействия азотистых оснований как фрагментов ФЛ на процесс окисления не ясен и теоретически может сводиться к возможности образования гидроксиламинов, являющихся восстановителями. Из литературы известны сведения /Чалтыкян и др,

1969/ о способности индивидуальных аминоспиртов (этаноламина, холина) разрушать пероксиды с образованием молекулярных продуктов. Представляло интерес изучить высвобождаются ли в ходе окислительной деструкции ФЛ соединения, представляющие собой остатки аминоспиртов. Полагалось, что если при окислении ФЛ выделяются аминосодержащие продукты, то они могут быть зафиксированы по классической реакции с реактивом Несслера.

Было установлено, что в реакционной смеси сразу после начала окисления быстро нарастает содержание аминосодержащего продукта, концентрация которого проходит через максимум и затем поддерживается на некотором стационарном уровне (рис. 10). Характер кривых одинаков для смесей а-ТФ как с ФХ, так и с ФЭА. Исходные ФЛ не содержат тестируемого реактивом Несслера продукта. Следует отметить, что все описанные превращения происходят на стадии латентного периода окисления. На основании этих экспериментов можно предположить, что в ходе окисления ФЛ претерпевают деструкцию, сопровождающуюся выделением соединений аминной природы. Данные о свободно радикальной деструкции (фрагментации) ФЛ, вызванной импульсным радиолизом их растворов /Ахрем и др., 1991/ подтверждает полученные нами результаты. Можно было полагать, что аминосодержащие соединения, образующиеся в результате окислительной деструкции ФЛ, влияют на кинетику образования и разрушения гидропероксидов.

Получить сведения о характере воздействия указанных продуктов деструкции ФЛ на пероксиды представлялось возможным при сопоставлении кинетики поглощения кислорода и накопления гидропероксидов в системах, содержащих а-ТФ и смесь а-ТФ и ФЛ. Установлено, что в процессе окисления МО в присутствии а-ТФ практически весь поглощенный кислород расходуется на образование пероксидов, тогда как в присутствии смеси а-ТФ и ФХ на начальных стадиях происходит накопление пероксидов, а затем начинают преобладать процессы разрушения и их уровень остается низким в течении всей реакции, включая стадии максимальной скорости поглощения кислорода (рис. 11). С учетом этого можно полагать, что кинетика накопления пероксидов может быть обусловлена динамикой высвобождения азотсодержащих продуктов в процессе окислительных превращений ФЛ.

Исследование особенностей синергической активности ФЛ показывает, что в их химической структуре заложены возможности регулирования интенсивности окисления как за счет восстановления токофероксильных радикалов при взаимодействии с остатками ПНЖК, так и за счет индуцированного разрушения пероксидов. Амины, являющиеся продуктами окислительной деструкции ФЛ, по всей вероятности, служат источником образования в ходе окисления

80 100 t, мин

180

120 "

60 -

ъ X 0 ^

«Э 1,6

X 0,8--

ÍS 0

1,0, 2,0" 3,0 f СФЛхЮ=, M

Рис. 11 Кинетические кривые поглощения кислорода (о) и накопления пероксидов (х) при

совпадают); в присутствии смеси а-ТФ (2,5x10"' М) и ФЛ (1,5х10_3 М)

а)

2,0 3,0

СФЛх10й, М

Зависимость Дт синергизма

Рис. 12

концентрации ФЛ в сисмемах различной сложноти: 1,, „ (МО+а-ТФ+ФХ): 2- (МО+ОД2 М липидов из разных окислении МО в присутствии а-ТФ (1,3- . _ , «г

' 4 органов пеляди); 3-(МО+ разные количества липидов

красных мьпцц);

б) Изменения \\'о2 от концентрации ФЛ. Обозначения соответствуют рис. 11а. Т=60°С, СА11С1]=6х10'3 М

2-4 6 СФлх 1 О IVI

X О

Рис. 13 Зависимость изменения величины синегизма (Г, 2, 3), скорости окисления (4) от концентрации ФЛ в смесях с равными концентрациями (8х10"5 М) АО: 1-менадиона; 2-АК-40, З-АК-49.

5 800-§ 640.

а 480-Л 160

о [/____

10 20 30 40 50 60 СтфхЮ4, М

Рис. 14 Зависимость периодов индукции от концентрации а-ТФ при инициированном окислении субстрата (биена) (1); окислении биена в присутствии смеси а-ТФ и бензафлавина (0,5%); (l.SxlO"0, М)(2); в присутствии тройной смеси а-ТФ + бензафлавина (0,5%) + яичного фосфатидллхолина (0,2%) (3); в присутствии тройной смеси а-ТФ + бензафлавина (0,5%) + яичного фосфатидилхолина (2,5%) (4);

'-•лецитина' части

Рис. 15 Зависимость величины эффект синергизма от концентрации фосфолипидов смеси, включающей а-ТФ + бензафлавин соотношении' 1- (1:2); 2- (1:4); 3-(1:6/ Слибн=9х10"3 М; Т=60сС.

гидроксиламинов, способствующих разрушению гидропероксидов и, вероятно, восстанавливающих фенольную форму а-ТФ.

Исследование различных сторон проявления эффектов синергизма являлось кинетическим доказательством системного характера взаимосвязей между природными АО и ФЛ, в совокупности обретающих способность более эффективно ингибировать окисление. Однако немаловажным представлялся вопрос о том, осуществляется ли взаимодействие между ними только в ходе окисления либо АО и ФЛ способны связываться химически. Для решения данного вопроса было изучено взаимодействие а-ТФ с яичным ФХ методом ЯМР высокого разрешения. Были получены спектры индивидуальных веществ и исследованы их смеси при соотношениях а-ТФ : ФХ (или хроман С^ФХ) = 2:1. Было установлено, что в смеси а-ТФ с ФХ исчезает сигнал, принадлежащий ОН-группе фенола (5=4,15 ррМ), т.е. данные соединения взаимодействуют между собой, образуя комплексы с водородной связью. Взаимодействия подобного рода установлены и для смеси синтетического аналога а-ТФ (хромана С^) с ФХ. Попытки охарактеризовать образующие структуры показали, что комплексы имеют по крайней мере два центра связывания, определена константа взаимодействия по одному из них, составившая 7,4х102 М"1. Данные о наличии нескольких центров связывания в структуре, образованной а-ТФ и ФХ были подтверждены методом ИК-спектроскопии. Использование соединений, моделирующих отдельные фрагменты структуры ФЛ, показано, что взаимодействие ОН-группы токола осуществляется с карбонильными, аминогруппами, однако, наиболее прочные комплексы образуются, по всей вероятности, с фосфорилгруппировками. Таким образом, данные независимых методов показывают возможность межмолекулярных взаимодействий в системе а-ТФ - ФЛ.

Совокупность приведенных результатов позволяет заключить, что важнейшие составляющие липидов биомембран образуют единую систему взаимосвязаных как химически, так и кинетически соединений, способных эффективно осуществлять неферментативную защиту липидов от окисления.

Глава 4 О значении эффектов синергизма в антиоксидантном

действии составляющих липидов природного происхождения

Организация липидов как природной системы достаточно сложна, многочисленные индивидуальные соединения,

присутствующие в липидах, могут действовать как АО, синергисты или инициаторы окисления. Однако, как можно полагать на основании приведенных выше данных, сочетание этих веществ в природной

системе настолько целесообразно, что эффекты, обусловленные взаимным влиянием компонентов в процессе окисления липидов могут иметь определяющее значение. Получить экспериментальные доказательства этого положения представлялось достаточно трудной задачей поскольку брутто окисление подобной системы в связи с многокомпонентностью ее состава не позволяло получить сколь либо значимую информацию о характере взаимоотношений между составляющими. Решение данного вопроса требовало применения комплекса методических средств, позволяющих в системах различной сложности вычленить и охарактеризовать роль и эффективность суммы природных АО, общих ФЛ, жирнокислотных компонентов. Важным доказательством значимости эффектов синергизма в процессе окисления липидов могли послужить эксперименты по разложению липидов на составляющие с последующей реконструкцией их состава. Выбор для исследования липидов идентичного качественного, но различного количественного состава, выделенных из разных органов и тканей одного биологического объекта рыбы Соге§опив ре!ес! (СшеНп), несколько ограничивал набор природных ингридиентов, что при достаточной изученности их состава позволяло установить взаимосвязи между количеством отдельных компонентов и параметрами процесса окисления липидов в целом.

Разными кинетическими методами изучена активность суммы АО. Показано, что в составе липидов присутствуют АО двух типов, эффективное значение константы скорости взаимодействия с ЛОг'ингибиторов I типа составляет (2,4-3,2)х106 М^хс"1, а для АО II типа- (3,5-5,0) х104 М^хс"1 (табл. 7), т.е. в 100 раз ниже, чем активность АО I типа. Методами препаративной ТСХ из липидов были выделены и идентифицированы а-ТФ, О, убихроменол, витамин Кх витамин А, холестерол, определено количество а-ТФ и веществ группы убихинона. Сопоставление активности индивидуальных АО и эффективных констант ингибиторов, присутствующих в липидах, позволило а-ТФ отнести к АО I типа. Уменьшение значения К7 липидных АО (в 1,5 раза) по сравнению с а-ТФ (К7=3,3х10бм~1хс"1) связано с наличием в липидах менее активных ингибиторов, таких как убихинон и витамин К. В ходе окисления происходит изменение соотношения между концентрациями АО разной активности. После превращения большей части наиболее активных АО изменение интенсивности свечения, по всей вероятности, определяется преимущественным расходованием убихинона и витамина К, но величина Куэф. ингибиторов II типа завышена из-за присутстви непрореагировавших АО I типа.

В липидах методом ХЛ определено количество активных АО, которое для разных липидов составило (2,5-17)х10~4 М, среди них до

85% приходится на долю а-ТФ. По сравнению с а-ТФ количество О в тех же липидах в 12 раз ниже и находится в интервале (24-240)х 10~6 М. Содержание убихроменола в тех же субстратах по сравнению с количеством а-ТФ в 10-50 раз меньше и в 2,5-10 раз меньше, чем <3.

Таблица 7

Кинетические характеристики антирадикальной активности липидов _Coregonus ре!есЗ (СтеПп)_

N п / п Место локализации липидов Ктэф.М^хс"1 х10~6 хЮ"4 (I тип АО) (II тип АО) [<х]х 104, м [ТФ] хЮ4, М Вклад ТФ, % Окисляемость*

1 Мозг 2,8 3,5 2,5 1,0 60 0.33

2 Внутренности зд 4,4 - 1,3 - 0,13

3 Белые мышцы теши 3,2 3,5 3,6 ЗД 86 0,43

4 Белые мышцы спинки 2,7 3,5 5,9 4,9 82 0,48

о Красные мышцы спинки 2,5 5,0 14,8 7,0 47 0,56

6 Икра 2,4 4,4 - 5,8 - 0,45

7 Печень 2,7 4,2 17,1 10,7 63 0,87

окисляемость, оцениваемая ХЛ методом, является интегральным кинетическим показателем (101в\\^2/Ьмах), характеризующим склонность липидного субстрата к окислению, измеряется в моль2хл/гхс2

Из приведенных данных следует, что в природных липидах присутствует сумма АО, последовательность расходования которых в процессе окисления преимущественно определяется присущей им активностью в реакциях с пероксидными радикалами, отличающейся для разных ингибиторов в 100 раз.По своей эффективности {К7х[1пН]) а-ТФ значительно (более чем в 1000 раз) превосходит все остальные природные АО, в связи с этим при достаточном количестве О2, когда [К.02°]»[К°] а-ТФ определяет антирадикальную активность липидов. В условиях дефицита О2 АО хинонной природы, которые как известно, более активны в реакции с алкильными радикалами, могут проявлять эффективность, величина которой более значима по сравнению с таковой для а-ТФ, т.е. в разных условиях наиболее эффективными будут разные группы АО. Приведенные данные показывают универсальность действия системы природных АО, способной в

различных условиях регулировать процесс свободно радикального окисления липидов.

Для оценки ингибирующей способности суммы природных АО липидов необходимы сведения о свойствах липидов как субстратов окисления. Потенциальную окисляемость липидов изучали ХЛ методом. Для тех же липидов методом ГЖХ установлен состав ЖК. Сопоставление интегрального показателя окисляемости и ЖК состава показало, что существует положительная корреляционная взаимосвязь между окисляемостью и количеством в липидах наиболее лабильных пента- и гексаеновых ЖК, тогда как между окисляемостью и общим уровнем полиенов подобая зависимость не выполняется. Следовательно, подверженность липидов окислению определяется преимущественно количеством наиболее ненасыщенных ЖК.

В работе был проведен анализ взаимосвязи окисляемости липидов и количества АО. Полученные результаты подтвердили высказанный ранее тезис о существовании корреляции между окисляемостью липидов и уровнем АО /Бурлакова и др., 1982/. Действительно, в группе исследованных липидов как общее количество активных АО (действующая доля), так и уровень индивидуальных компонентов системы АО защиты были тем больше, чем выше потенциальная подверженность окислению ЖК нейтральных и полярных фракций.

С использованием липидов известного состава при анализе кинетических параметров окисления могла быть выявлена возможность проявлений эффектов синергизма в совместном действии составляющих. Сопоставление ингибирующего действия всей совокупности липидных компонентов, привносимых в модельную систему, и эффективности сравнимого количества индивидуальных АО, суммы природных АО, выделенных из природной смеси, могло дать ответ об эффектах, обусловленных сочетанным действием важнейших составляющих природной композиции. Исследовали кинетику инициированного окисления МО в присутствии постепенно возрастающего количества липидов одного вида и окисление в растворе инертного растворителя (хлорбензола) равных количеств 8 липидов, характеризующихся различным (но известным) набором компонентов (табл. 8). Было установлено, что при окислении как МО с липидами, так и собственно липидов величина кинетического параметра [1пН] в 8 - 9 раз выше, чем действительное количество АО, определенное в липидах аналитическими методами (табл. 8).

Объяснение этого факта связано с возможностью усиления действия природных АО в присутствии других составляющих, по всей вероятности, ФЛ.

О значении эффектов, связанных с взаимным влиянием компонентов природных липидов, можно было судить на основании данных сопоставления кинетики окисления модельного субстрата с общими липидами и их модифицированной субстанцией. Суть модификации заключалась в удалении из общих липидов (методами препаративной ТСХ) суммы биоАО. Было показано, что удаление ингибиторов приводит к уменьшению периодов индукции по сравнению с целостной системой в 14 раз, тогда как извлеченная из липидов сумма АО способствует увеличению периодов индукции МО лишь в 3,5 раза, а индивидуальный а-ТФ - в 2,5 раза. Попытки реконструкции исходной липидной системы путем соединения суммы АО с ФЛ и компонентами субстрата приводили практически к полному восстановлению ингибирующей способности смеси. Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют, что АОА липидов обусловлена не только активностью присутствующих в них АО, но связана с проявлением эффектов синергизма в совместном действии важнейших составляющих природной системы. Количественно эффект синергизма оценивается в 250-350

Выше были приведены данные о закономерности изменения периодов индукции и величины максимальной скорости окисления (иг02Мах) в зависимости от концентрации ФЛ в модельной синергической смеси. Был показан антибатный характер направленности данных показателей, свидетельствующий о проявлении синергизма при сочетанном действии компонентов (АО и ФЛ). Для исследуемых липидов также была проанализирована взаимосвязь между кинетическими параметрами и количеством ФЛ в системе окисления. Анализ показал, что форма приведенных зависимостей однотипна, как для модельных синергических смесей, составленных индивидуальными АО и ФЛ, так и сложных природных липидов (рис. 12), при этом сохраняется разнонаправленность изменения периодов индукции и величины мах)- Таким образом,

используя принцип подобия, на основании однотипности характера обсуждаемых зависимостей можно заключить, что в процессе окислительных превращений природных липидных систем реализуется возможность синергизма в совместном действии АО и ФЛ.

Следовательно, модель организации неферментативной защиты липидов от окисления включает как сумму природных АО, так и ФЛ. Результаты настоящей работы показывают, что действие компонентов сложной липидной системы взаимосвязано, в ходе окислительного процесса природные АО и ФЛ способны взаимодействововать между собой, что приводит к усилению действия ингибиторов и обеспечению высокой устойчивости легкоокисляемых жирнокислотных составляющих липидов.

Таблица 8

Кинетические параметры окисления МО в присутствии различных липидов Coregonus ре1ес1 (СшеИп) СЛИПИДОВ=0,12 М, ^=1,3x10-7 Мхе-1, Т=60°С_

N п / п Субстрат окисления Период индукции, мин АОА, М'1 \¥о2х 10е, Мхе"1 Ко/ %'К6х ю2,* [НН] =0,35 М Длина цепи и [1пЩ х104, м [1пН]х 104, М £=1,4 V природных АО хЮ4, М

0 Метллолеат (МО) 6 0 2,3 1,82 18,0 - - -

1 МО+липиды мозга 26 27,8 2,0 1,58 15,0 2,0 1,4 0,2

2 МО+липиды внутренностей 40 47,2 2,2 1,75 17,0 3,10 2,2 0,2

3 МО+липиды белых мышц теши 54 66,7 2,2 1,75 17,0 4,2 3,0 0,4

4 МО+липиды белых мышц спинки 62 77,8 2,2 1,75 17,0 4,8 3,4 0,6

5 МО+липиды красных мышц 88 114,0 1,8 1,43 10,5 6,8 4,8 0,8

6 МО+липиды икры 160 214,0 0,73 0,58 5,6 12,4 8,9 0,9

7 МО+липиды печени 190 255,5 одо 0,08 1,0 14,8 10,6 1,3

8 МО+липиды из целой тушки 45 54,2 2,2 1,75 17,0 3,5 2,5 0,3

'-размерность (М_1хс 1)1/'2

5. Изучение антиоксидантной активности нового класса ингибигров - синтетических аналогов витамина К

Исследования в области скрининга и направленного синтеза потенциальных ингибиторов, близких по строению к природным АО привлекает значительное внимание благодаря их низкой токсичности и перспективности практического использования в медицине. В последние годы найден новый класс биологически активных веществ аналогов витамина К - 2-алкил-З-ариламинометил-1,4-нафтохиноны (см. формулы). Установлено противовоспалительное действие, антиагрегирующая,

липолитическая активность веществ данного класса. Представляло

Трабааланое

название соединения

<Ро1

эамула соединения

МенаЗиан

У&лхинон

С^и/гпсхсинон

(витамин /<, )

АК- /Л5"

АК~ Г74

АК-40

АН-49

оС- тонод>ерсхп (Зига/иин £)

Ионал

Г I

Н5С0,

н3со

О О

СЯ}

СН5

(снг-сн=с-снг),0н

снэ сн3

ся^-с^с-сн^- ^н^-сы^-си-сн^

о СН^СН^-СН^- СН-СН^з н

он

-(СН^з

СВп,

интерес изучить антиокислительную активность новых соединений в сравнении с их природными аналогами и биоАО, синтетическими хинонами и фенолами, известными реперными ингибиторами. Было показано, что все вещества проявляют антиоксидантное действие (табл 9). Наиболее низкая активность присуща природным хинонам: филлохинону (витамину К1) и убихинону (коэнзиму О). Природный фенол - а-ТФ при окислении в МО проявляет в 1,5 раза более высокую АОА. Следует отметить, что в липидах биологических мембран содержание хинонов сопоставимо, а уровень а-ТФ в 2-10 раз выше концентраций, использованных в приведенных экспериментах, а, следовательно, более значителен и ингибирующий эффект. С учетом высокой антирадикальной активности а-ТФ по сравнению с хинонами можно считать, что в

Таблица 9

Антиоксидантная активность природных и синтетических

хинонов

САО=8х10-5 М, САНБН=Зх10-3 М, Т=60°С, МО:хлорбензол=1:4

N п/п Травиальное название соединения Период индукции, 10 2,с АОА (т!-т0)/то

1 Менадион 16,0 2,1

2 Убихинон (коэнзим <310) 5,4 0,8

3 Филлохинон (витамин К1) 3,6 0,5

4 АК-135 8,4 1,2

5 АК-174 3,0 0,4

6 АК-40 24,0 3,3

7 АК-49 24,6 3,4

8 а-токоферол (витамин Е) 21,6 3,0

9 Дибунол 58,8 8,2

условиях избытка 0г, когда К02с»Кс эффективность хинонов значительно уступает а-ТФ, природные хиноны могут конкурировать с ним лишь при гипоксических состояниях, в случае преобладания 11°.

Сопоставление ингибирующего действия эквимолекулярных концентраций природных хинонов, имеющих в положении 3 длинноцепочечные заместители, и менадиона как незамещенного аналога показывает, что АОА первых существенно уступает активности нафтохинона, не содержащего фитильного заместителя (табл. 10). Природа этого эффекта не ясна. Считают, что в присутствии хинона алкильные или пероксидные радикалы, ведущие цепь окисления, могут присоединяться к карбонильной группе или по двойной связи в кольце хинона (Шляпникова, Рогинский, Миллер,1978). Исходя из этих представлений можно

полагать, что длинноцепочечные алкильные заместители, находящиеся при двойной связи и в соседнем положении с оксо-группой выполняет роль стерического фактора, создавая пространственные затруднения для присоединения достаточно громоздких радикалов. В силу этого менадион, не имеющий заместителей в положении 3 проявляет в 1,5 - 2,0 раза более высокую АОА.

Среди исследуемых веществ имелись синтетические аналоги 1,4-нафтохинона, имеющие в положении 3 заместители другой структуры. Изучение их АОА показало, что два соединения (АК-135 и АК-174) по своей активности непосредственно примыкают к группе природных хинонов, уступая, как и природные хиноны, действию менадиона в той же концентрации. Отдельной группой выделяются АК-40 и АК-49, АОА которых в 2,6 раза превосходит действие убихинона и витамина Кх и в 1,4 раза активность менадиона. Следует отметить, что действие указанных наиболее активных производных 1,4-нафтохинона почти в 2 раза уступает ингибирующей способности ионола (дибунола).

Считают, что хиноны преимущественно взаимодействуют с алкильными радикалами (Рогинский, 1988) и эффективны в условиях низких парциальных давлений Ог, их антирадикальная активность при взаимодействии с пероксильными радикалами невелика (Наумов, Храпова, 1985), более того, полагают, что это эффект опосредованный. Хиноны склонны к одноэлектронному восстанавлению, образующиеся при этом семихиноны быстро диспропорционирует с образованием гидрохинона и хинона (Прайор,1979). В безводных средах (подобной той, которую можно ожидать внутри биологических мембран) семихиноны достаточно стабильны (Прайор, 1979).

Для различных синтетических производных витамина К совокупность элементарных реакций, лежащих в основе ингибирования может различаться. Для соединения АК-135, содержащего в молекуле протонированную третичную аминогруппу, наблюдается АОА, сопоставимая по величине с активностью убихинона и филлохинона. По-видимому, механизм действия данного соединения не отличается от обсуждавшегося выше, заместитель в положении 3 как достаточно громоздкий фрагмент выполняет роль стерического фактора, снижая потенциальную АОА соединения.

Синтетические аналоги витамина К, содержащие в молекуле фрагмент ариламина претерпевают в ходе окисления дополнительно ряд превращений. Согласно этого механизма при окислении образуется катионрадикал, который в дальнейшем превращается в смесь разных продуктов (схема 3), среди которых присутствует алифатический амин, способный выполнять роль синергиста

окисления (МагиШатиШи е1 а1., 1986) и усиливать ингибирующее действие других составляющих смеси. Соединение АК-174, содержащее в молекуле одну третичную аминогруппу, образует соответствующий катионрадикал гораздо труднее и поэтому АОА проявляется, по-видимому, в связи с возможностью присоединения как радикалов 1Г, так и ГЮг", т. е. механизм аналогичен описанному для природных хинонов.

Ингибитор АК-40 в электродонорной части молекулы содержит вторичную аминогруппу и действует по механизму, суть которого сводится к следующему. Вначале КСЬ* отрывает атом водорода от вторичной аминогруппы и образует аминильный радикал, который в реакции с ШЭг" окисляется в нитроксильный радикал. Последний вновь взаимодействует с Ш1>2*, образуя производное гидроксиламина, ненасыщенные продукты и молекулу кислорода. В свою очередь, нигроксильньгй радикал с участием нафтохинонового фрагмента молекулы вновь регенерируется из производного гидроксиламина. При этом хиноновый фрагмент восстанавливается в семихинон, который диспропорционирует с образованием хинона и двухатомного фенола, достаточно активного в реакциях с ЛОг*. Вышесказанное представлено на схеме 2:

Было показано (Дрегерис, 1983), что в соединениях АК-40, АК-49 и АК-174 имеет место внутримолекулярный перенос заряда от донорной части (Д) (ариламина) к акцептору (А) (хинону). Метиленовая группа расматривается как мостиковый фрагмент (М). Образование равновесной системы для донорно-акцепторного автокомплекса (АК) может быть представлена следующим образом:

Д-М-А <=> [ Д+" -М- А* '' ]

открытая форма комплексно-связанная форма

Полагают (Друлле, Логин, Дрегерис, 1989), что проявление высокой АОА у мостиковых соединений связано с внутримолекулярным переносом заряда. Вышесказанное согласуется с механизмом ингибируюгцего действия указанных выше соединений. Таким образом, можно полагать, что исследуемые азотсодержащие производные 1,4-нафтохинона бифункциональны. Они могут реагировать с радикалами, ведущими цепи окисления как за счет хиноидной структуры, так и за счет фрагмента ариламина. Более высокая АОА группы синтетических нафтохинонов по сравнению с природными хинонами и менадионом указывает и пути совершенствования химической структуры синтетических ингибиторов, близких по своему строению к природным АО. Перспективность практического использования изучаемых производных 1,4-нафтохинона обусловлена тем, что они могут быть активны в реакциях как алкильными, так и пероксидными

СХЕМА 2

СХЕМА 3

.СИ)

СВу

[о]

радикалами, тормозить окисление как при избыточных, так и низких парциальных давлениях Ог, в частности, как и природные хиноны (Лукьянова, 1989), служить для защиты липидов при гипоксии, опасности возникновения инфаркта.

Было показано, что АОА группы новых ингибиторов - аналогов витамина К уступает действию наиболее широко применяемого синтетического АО - ионола (табл. 9). В связи с этим представляло интерес исследовать возможности повышения ингибирующей способности И-производных 1,4-нафтохинона в присутствии ФЛ.

Как было показано в главе 2, использование эффекта синергизма природных АО и ФЛ позволяло значительно увеличить действие ингибиторов. В связи с этим было изучено совместное антиоксидантное действие смесей яичного ФХ с природными и синтетическими хинонами: витамином К1 (филлохиноном), менадионом, рядом новых биологически активных веществ-аналогов витамина К- К-производных 2-метил-З-аминометил-1,4-нафтохинона, обладающих среди ряда изученных аналогов наиболее высокой АОА (табл. 9). Показано, что в присутствии ФХ происходит увеличение периодов индукции (в 2,0-2,4 раза), обусловленное эффектом синергизма, проявляющимся в совместном действии смесей ФХ с исследуемыми нафтохинонами. Установлено, что величина синергизма для разных соединений может существенно отличаться. Наибольший . эффект установлен для смесей ФХ с АК-49, составляющий 240%. По-видимому, особое отношение АК-49 к синергисту (ФХ) связано с некоторыми особенностями его химического строения. Анализ взаимосвязи между строением изучаемых соединений и величиной эффекта синергизма позволил вычленить те фрагменты структуры АК-49, которые определили его исключительность. Установлено, что более высокий синергический эффект этого соединения связан с присутствием в пара- положении бензольного кольца третичной аминогруппы (см. формулы). Согласно механизму, предложенному для объяснения ингибирующей активности И-производных 1,4-нафтохинона, в процессе окисления происходит образование катионрадикала, подвергающегося далее окислению и элиминированию с образованием смеси алифатического амина и двух хинонов (схема 3).

Выше обсуждалось, что активность ФЛ как синергистов окисления связана с присутствием в их химической структуре аминогруппы и остатков фосфорной кислоты. Очевидно, что при использовании смесей АК-49 с ФХ образуется достаточно сложная смесь, в процессе окисления которой и ФЛ и продукты превращения АО выполняют роль синергистов. Именно благодаря особенностям своего строения АК-49 в присутствии ФЛ вдвое эффективнее других исследуемых нафтохинонов. Приведенные сведения о высокой эффективности соединения, включающего в своем составе

аминогруппу, служат дополнительным хотя и косвенным аргументом в пользу того, что азотистое основание в структуре ФЛ является фрагментом, в значительной степени определяющим их синергическую активность.

Изучение закономерностей изменения величины эффекта от концентрации исследуемых нафтохинонов и ФЛ (рис. 13) в смеси показало однотипность зависимостей, характер которых не зависел от природы хинона и повторял кривые, описанные ранее для смесей а-ТФ с рядом холин- и этаноламинсодержащих ФЛ и моделирующих их соединений (рис. 7а). В связи с этим становится очевидным, что характер зависимостей изменения эффекта синергизма определяется не АО, а природой ФЛ.

Сравнение между собой величины синергизма смесей ФХ с рядом природных и синтетических АО показало, что абсолютные значения синергического эффекта для витамина К^, менадиона, АК-40 сопоставимы не только между собой, но и со смесью ФХ с а-ТФ, что расширяет выбор АО в случае практического использования исследуемого эффекта. Смеси ФХ с АК-49 в 2 раза эффективнее, чем аналогичные смеси с а-ТФ. С учетом того, что синтетические аналоги 1,4-нафтохинона обладают умеренной токсичностью, очевидна перспективность дальнейшего изучения их свойств с целью внедрения их в медицинскую и фармацевтическую практику.

Глава 6 Новые аспекты практического использования липидов и способы их стабилизации

Поиск новых перспективных источников эйкозапентаеновой и докозагексаеновой жирных кислот, являющихся предшественниками класса эйкозаноидов, обладающих широким спектром фармакологической активности, представляет несомненный научный и практический интерес. Разработка путей комплексного использования отходов рыбопереработки сиговых рыб Обского бассейна, среди которых пелядь в объеме промысла занимает наибольший удельный вес, позволяет получать значимые количества высокоценных липидов (до 20 тонн в год). Детальное исследование липидов пеляди показало уникальность их фракционного и жирнокислотного состава. Установлена отличительная особенность, связанная с относительно невысоким содержанием ФЛ (не более 8%), что является определяющим фактором удовлетворительных органолептических качеств рыбных липидов. Выявлено, что уровень наиболее ненасыщенных пента- и гексаенов среди жирнокислотных компонентов достигает 12 и 3%, что соответствует аналогичному показателю для липидов морских рыб - традиционных источников

зарубежных и отечественных препаратов ПНЖК семейства "омега-3". Сравнительное изучение жирнокислотного состава внутреннего жира сиговых и лекарственных препаратов: МаксЭпа, тресковый жир (США), биокапс (Словения), полиен, порярис, эйконол (Россия) подтвердило идентичность качественного и близость количественного состава. Как было показано выше липиды пеляди включают ряд соединений: а-ТФ, убихинон, убихроменол. каротиноиды, проявляющих антиоксидантное действие. Содержание основного природного ингибитора окисления - а-ТФ составляет 0,10-0,15 мМ. Определены основные физико-химические показатели липидов, составившие соответственно для йодного числа, числа омыления, пероксидного и кислотного числа значения: 127,6 % 183,7 мг КОН/г; 0,01 % 12; 2,7 мг КОН/г соответственно. Изучены химико-токсикологические характеристики и констатирована экологическая чистота липидного препарата. Исследована кинетика и механизм окислительных превращений внутреннего жира, извлекаемого из отходов переработки пеляди, разработаны способы повышения устойчивости лабильного субстрата к окислению, что создает необходимые условия для длительного сохранения нативности и фармакологической активности липидов. На экспериментальной модели полнослойных кожных ран выявлено, что под действием исследуемых липидов активируется репаративная способность кожных покровов. Все фазы раневого процесса во времени опережают таковые в контроле, что приводит к ускорению сроков полного закрытия ран на 12,8 %. Совокупность приведенных даных свидетельствует о возможности и перспективности использования липидов пеляди в качестве биологически активных компонентов косметической продукции и лекарств.

Высокая окисляемость полиненасыщенных липидов предопределяет поиск эффективных способов антиоксидантной защиты, предпочтительно АО природного происхождения. Однако, действие природных АО, проявляющих высокую антирадикальную активность, зачастую осложнено побочными реакциями, снижающими эффективность ингибирования.

В связи с этим была изучена потенциальная ингибирующая способность тройной смеси, сочетающей в себе а-ТФ, новый АО -бензафлавин /Пименова и др.,1990/ и ФЛ (яичный ФХ). ТФ, как известно, проявляет высокую активность в реакции с пероксильными радикалами /Бурлакова, Храпова, 1972, Ингольд, 1984/, бензафлавин в реакции с токофероксильными радикалами способен восстанавливать активную фенольную форму ТФ,

разрушать гидропероксиды /Пименова и др.,1990/, ФЛ выполняют роль синергистов.

Бензафлавин (аналог витамина В2)

Эффективность стабилизаторов оценивалась несколькими независимыми методами: изучалась кинетика поглощения кислорода при инициированном окислении липидов в присутствии предлагаемого состава и прототипа; при аутоокислении липидов в тонком слое при повышенных температурах (40±0,2°С) - в условиях "ускоренного старения" тестировалась кинетика накопления гидропероксидов методом иодометрического титрования (ПЧ). Одновременно по ходу окисления через равные промежутки времени в образцах методом газожидкостной хроматографии контролировались количественные изменения содержания наиболее ненасыщенных и склонных к окислению компонентов липидного субстрата - эфиров арахидоновой (ЭАР) и эйкозапентаеновой кислот (ЭЭП). Контролем служили образцы липидов без добавок антиоксидантов.

В качестве субстратов окисления использовали как природные липиды (рыб), так и смесь этиловых эфиров, полученных в результате переэтерификации липидов микробиологического происхождения.

Изучали ингибирующую способность смесей по мере их усложнения. Было показано, что бинарные смеси а-токоферола с бензафлавином и а-токоферола с лецитином обеспечивали большие периоды индукции (тЕ ), чем те, что могли быть получены при простом сложении ингибирующих эффектов их индивидуальных составляющих (Цт; ), таким образом, в совместном действии указанных компонентов проявлялся синергизм.

Было установлено, что эффективность синергизма бинарных смесей а-ТФ с бензафлавином или с лецитином в разных субстратах составляет (5,6 21,0)%. Изучение эффективности усложненной композиции, представленной комбинацией компонентов вышеописанных бинарных синергических смесей показало, что

К1=СН2-(СНОСОС6Н5)з-СН2ОСОС6Н5 (рибитил); И=Н.

сочетание в одной системе а-токоферола, бензафлавина и лецитина позволяет дополнительно получить выигрыш в эффективности ингибирования, поскольку синергизм в тройной смеси еще более усиливается, в среднем в 1,3-2,0 раза по сравнению с бинарными смесями и в 1,9-2,6 раза по сравнению с индивидуальным а-ТФ (рис. 14). Зависимость величины синергизма от концентрации ФХ для смеси АО (рис. 15) по форме практически воспроизводила кривые, установленные для одного а-ТФ (рис. 7). Эффективность указанных выше смесей в идентичных условиях окисления была сопоставлена с действием известной ранее смеси (прототипа): а-ТФ ацетата, ионола, цистеина). Анализ действия составов с различными соотношениями компонентов-стабилизаторов позволил выбрать среди них наиболее эффективные. Диапазоны изменения концентрации каждого из компонентов, составляющих в целом наиболее высокоэффективные смеси, представлены следующими значениями, в % от массы липидов:

Суммарная концентрация компонентов высокоэффективных смесей составляет 0,4 -5,2 % от массы липидов.

Полученные нами впервые эффекты синергизма в смеси а-ТФ, бензафлавина и лецитина могут быть объяснены, исходя из представлений о механизме АО действия используемых соединений. Так, присутствие в смеси а-ТФ определяет чрезвычайно высокую активность в реакции с пероксильными радикалами, ведущими окисление. Бензафлавин- обладает как антирадикальной активностью так и способностью непосредственно взаимодействовать с гидропероксидами, а также регенерировать токофероксильные радикалы, восстанавливая активную фенольную форму основного АО (а-ТФ)/Пименова и др. 1990/. Лецитин действует за счет различных фрагментов своей структуры. ФЛ благодаря способности образовывать в процессе окисления аминосодержащие продукты (по всей вероятности, нитроксилы, гидроксиламины), способствуют многократному обрыву цепей окисления, вызывают индуцированное разрушение гидропероксидов. Синергическая активность остатков ПНЖК, фрагмента структуры ФЛ связана, по всей вероятности, с их способностью регенерировать наиболее эффективный АО. Вышеизложенное объясняет полученные авторами эффекты

а-токоферол бензафлавин лецитин

0,1 - 1,2 0,1 - 1,0 0,2 - 3,0.

значительного усиления ингибирующего действия указанных веществ в смеси. Сочетание в одной композиции данных веществ позволяет им, воздействуя на различные элементарные стадии сложного процесса окисления, снизить роль побочных реакций, приводящих к уменьшению эффективности АО, и в совокупности значительно увеличить их потенциальную ингибирующую способность. Благодаря использованию веществ исключительно природного происхождения предложенный способ имеет перспективы практического использования в фармации, медицине, косметологии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ФЛ являются важным компонентом неферментативной антиоксидантной системы природных липидов. В присутствии ФЛ усиливается ингибирующее действие АО фенольной природы: а-токоферола, хромана Cj, кверцетина (в 1,52,0 раза), ингибиторов хиноидного строения: убихинона (коэнзима Q), филлохинона (витамина Kj), а-токоферилхинона; и каротиноидов: p-каротина, витамина А (ретинола пальмитата). Синергизм смесей ФЛ с ингибиторами фенольной природы в 5-8 раз более значителен, чем с хинонами. С использованием модельных соединений показано, что синергическая активность ФЛ обусловлена присутствием в их структуре как азотистого основания, так и остатков ПНЖК, действие которых сравнимо по величине и взаимонезависимо. Наибольшая синергическая активность присуща ФЭА, далее в порядке убывания следуют яичный ФХ, КЛ, соевый ФХ, ФС, дипальмитоилФХ, СИ и ФИ.

Эффект синергизма прямо пропорционален концентрации АО в смеси и обратно пропорционален скорости инициирования, установлены концентрации инициатора (АИБН), при которых эффект сводится к нулю. С увеличением степени ненасыщенности субстратов окисления величина синергизма повышается (в 2 раза при переходе от моно- к диенам). На основании совокупности приведенных данных эффект отнесен к кинетическому синергизму.

2. Показано, что а-токоферол и ФЛ образуют комплексы с межмолекулярной водородной связью, имеющие два основных центра связывания: по карбонильной и фосфорилгруппировке. Определены константы связывания и энтальпии образования комплексов по каждой из указанных характеристических групп.

Установлено, что наиболее прочные комплексы а-ТФ образует по фосфорилгруппировке молекулы ФЛ.

3. Методом импульсного фотолиза определены константы (Кю)-взаимодействия феноксильных радикалов а-токоферола и хромана С} с высшими ЖК разной степени ненасыщенности и ФЛ различного строения. Установлено, что величина эффективной Кю возрастает по мере увеличения степени ненасыщенности высших ЖК. Для ФЛ разного строения: соевого ФХ и ФЭА, яичного ФХ, КЛ (из бычьего сердца) величина эффективной константы Кю при взаимодействии с а-токофероксильными радикалами составила 2,88+1,00; 36,0±5,0; 380,0±10,0; 300,0±20,0 М^хс"1 соответственно (20°С). Для незамещенного аналога ТФ (хромана С^) значение константы Кю в 1,5 раза выше, чем для ТФ, что указывает на значительное влияние на эту константу боковой фитильной цепи. Показано, что в присутствии как ФЛ, так и ПНЖК (арахидоновой) происходит восстановление феноксилов токоферола до активной фенольной формы АО.

4. Совместное действие смеси а-токоферола с низкими концентрациями природных хинонов (10~5-10~6)М аддитивно, при более высоких концентрациях компонентов проявляется антагонизм. Тормозящее действие снижается (на 50-80%) пропорционально росту количества а-ТФ или хинона в смеси. В системе а-ТФ -хинон протекают два конкурирующих процесса, а именно: образование комплексов с межмолекулярной водородной связью и реакции межмолекулярного окисления-восстановления.

5. В процессе окисления смеси ПНЖК, ингибируемых бинарными смесями а-ТФ с (3-каротином или ретинола пальмитатом, установлено проявление антагонизма. Величина антагонизма от концентрации Р-каротина при постоянном уровне а-ТФ описывается и~образной зависимостью. В области как низких (10~8 -10"7) М, так и высоких (10"2) М концентраций Р-каротина роль антагонизма относительно невелика (3,5-4,0)%, в диапазоне (10~6 - 10~5) М существует концентрационная "яма", в точке экстремума которой (1,25х10~6) М антагонизм достигает 90%. С ростом количества а-ТФ в смеси область антагонизма существенно сужается. Установлено, что непосредственного связывания молекул а-токоферола и Р-каротина не происходит. Эффект антагонизма АО носит кинетический

характер и обусловлен ускоренным расходованием а-ТФ в присутствии лабильного (3-каротина.

6. Установлено, что в составе природных липидов присутствуют АО двух типов. Методом хемилюминесценции показано, что эффективное значение константы скорости взаимодействия АО I типа составляет (2,4-3,2)х106 М"1 хс"1, а для ингибиторов II типа-(3,5-5,0) хЮ4 М"1хс"1, т.е. в 100 раз ниже, чем активность АО I типа. К АО I типа относятся токоферолы, к АО II типа- каротиноиды, убихинон, витамин Кх.

7. Ингибирующая способность ряда соединений нового класса АО -аналогов витамина Кх М-производных 2-метил-3-аминометил-1,4-нафтохинона (АК-135 и АК-174) сравнима с природными хинонами. Тормозящее действие АК-40 и АК-49 в 2,6 раза превосходит активность убихинона и витамина Кх и в 1,4 раза активность менадиона. Высокая активность этих веществ, содержащих в молекуле фрагмент ариламина, обусловлена образованием интермедиатов (катионрадикалов, семихинонов), превращающихся в ходе окисления в синергист окисления (алифатический амин) и двухатомный фенол, способствующих дополнительному увеличению ингибирующего действия. Показано, что с ФЛ все изученные соединения образуют синергические смеси, по сравнению с индивидуальным ингибитором тормозящее действие их композиций с яичным ФХ возрастает в 1,2-2,4 раза и превосходит по своей активности действие синтетического АО-дибунола.

8. Биологически активные липиды, получаемые из отходов переработки сиговых, лососевых, осетровых рыб Обского бассейна являются новым экологически чистым источником высших жирных кислот семейства "омега-3"(патеит), имеющих перспективы использования в качестве лечебно-профилактического продукта при лечении гиперхолестеринемии, а также основы лечебно-косметических средств: геля, крема (патент).

9. Новый способ увеличения окислительной устойчивости смесей сложных эфиров ПНЖК и природных липидов заключается в использовании тройной синергической смеси : а-ТФ , бензафлавина, яичного ФХ, добавляемых в количестве 0,1 - 1,2; 0,1 - 1,0; 0,2 - 3,0 % от массы липидов соответственно (патент). Применение данной композиции позволяет увеличивать ингибирующую способность га-токоферола в 1,3-2,6 раза.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Ушкалова В.Н., Зеленская Э.К., Сторожок Н.М. Исследование окисления липидов методом моделирования//Известия вузов,-1975,-N6.-c. 40-43.

2. Ушкалова В.Н., Артамонова НА., Сторожок Н.М., Горяев М.И. Жирнокислотный состав общих и нейтральных липидов сиговых Обского бассейна.//Химия природ, соед.- 1981- N 5,- с. 555-558.

3. Ушкалова В.Н., Артамонова H.A., Сторожок Н.М., Горяев М.И. Влияние локализации на состав общих и нейтральных липидов.-Химия природ, соедин. //1982- N 4- с. 428-430.

4. Ушкалова В.Н., Сторожок Н.М. Исследование механизма антиоксидантной активности липидов.//Бюллетень эксперим. биол. и медицины.-1984- N 8,- с. 179-181.

5. Сторожок Н.М., Сторожок С.А. Состав липидов сига Coregonus peled (Gmelin) различной локализации.//Химия природ, соедин.-1985.- N1.- с. 24-27.

6. Сторожок Н.М. Содержание токоферола в пеляди и продуктах из нее.-//Вопросы питания.-1985.-N 1.- с. 73-74.

7. Храпова Н.Г., Сторожок Н.М. Использование хемилюминесценции при исследовании многокомпонентных систем природного происхождения.-В сб.: Теоретические и методические основы биохемилюминесценции. М,- МОИП.-1986 - с. 40-43.

8. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Изучение совместного действия токоферола и фосфолипидов при окислении многокомпонентных липидных систем природного происхождения. В сб.: Виоантиоксидант.-Черноголовка.- 1986.- с. 23-24.

9. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Кинетическое исследование системы природных антиоксидантов и окисляемости липидов разных тканей хемилюминесцентным методом.- В сб. Антиоксидантные системы при экспериментальной и клинической патологии.- Свердловск. -1987.-е. 28-39.

10. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Изучение природных смесей антиоксидантов липидов методом хемилюминесценции.// Биофизика. 1988.- т. ЗЗ.-вып. 4- с. 584-589.

11. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. О взаимосвязи активности антиоксидантов и окисляемости субстратов в липидах природного происхождения.//Биофизика.-1988.-т. ЗЗ.-вып 6.-с. 181185.

12. Сторожок Н.М., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Исследование синергизма природных антиоксидантов и фосфолипидов в

модельных системах возрастающей сложности,- В сб.: Биоантиоксидант.- М.-1989.- с. 7-8.

13. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Эффект синергизма в системе токоферол-фосфолипид. В сб.: Биоантиоксидант,- М.-1989.- с. 279280.

14. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Использование метода хемилюминесценции для одновременного определения окисляемости субстрата и активности антиоксидантов липидов природного происхождения. В сб.: III Всесоюзное совещание по хемилюминесценции,- Рига,-1990.-е. 72.

15. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Особенности совместного действия смесей природных антиоксидантов и фосфолипидов. В сб.: Био-термо-хемилюминесценция.-М.-1990.-с. 23-24.

16. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Изучение роли функциональных групп в действии фосфолипидов как синергистов окисления. //Биологические мембраны. -1990.- вып. 7.-е. 612- 618.

17. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Наумов В.В., Кухтина E.H., Храпова Н.Г. Изучение аддитивного антиокислительного действия суммы природных антиоксидантов липидов.//Вопросы мед. химии.-1990.- т. 36,- вып. 4,- с. 72-74.

18. Сторожок Н.М., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Синергический эффект антиоксидантов и фосфолипидов при окислении природных липидов. //Вопросы питания.- 1990.- N4,- с. 53-58.

19. Сторожок Н.М. К вопросу о механизме эффектов синергизма биоантиоксидангов и фосфолипидов. В сб.: Обмен веществ в норме и патологии,- Тюмень,- 1992.- с. 94.

20. Сторожок Н.М. , Храпова Н.Г. Взаимосвязь между строением и активностью фосфолипидов как синергистов окисления в системах, содержащих природные фенолы, хиноны и их синтетические аналоги. В сб.: Биоантиоксидант. -М..- 1993.- с. 9-10.

21. Сторожок Н.М., Пирогов Н.О., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. О константе скорости феноксильных радикалов токоферола с высшими жирными кислотами и фосфолипидами. В сб.: Биоантиоксидант.-М.- 1993.- с. 221.

22. Сторожок Н.М., Друлле А.Я., Логин Я.Я., Дрегерис Я.Я., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Эффекты синергизма при совместном антиоксидантном действии фосфатидилхолина с природными и синтетическими хинонами. //Вопросы мед. химии.-1994.-T. 40.-N 1.-с. 10-14.

23. Сторожок Н.М., Друлле А.Я., Логин Я.Я., Дрегерис Я.Я., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Антиоксидантная активность

природных и синтетических хинонов.// Вопросы мед. химии.- 1995.т. 41.- N 1.- с. 21-24.

24. Сторожок Н.М. Роль азотистого основания и степени ненасыщенности фосфолипидов в их действии как синергистов окисления В сб. VI симпозиума по биохимии липидов.-М,- 1995.-c.99.

25. Сторожок Н.М., Пирогов Н.О., Крашаков С.А., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Кинетика и константы скорости реакций феноксильных радикалов а-токоферола и хромана С] с ненасыщенными жирными кислотами и фосфолипидами. //Кинетика и катализ.-1995.-т. 36,- N 6.-е. 818-824. .

26. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Исследование межмолекулярных взаимодействий компонентов природных липидов в процессе окисления//Химическая кинетика.-1995.-т. 14.-N.- 11.-е. 29-46.

27. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Липиды Coregonus peled (Gmelin) -перспективный источник полиненасыщенных жирных кислот семейства "омега-3". В сб.: Человек и лекарство. М.- 1995.- с. 245. .

28. Кутузова И.В., Сторожок Н.М. Ингибирование окисления полиенов смесями токоферола и каротиноидов. В сб.: материалов III международного симпозиума по окислению. Казань.- 1995.- с. 40-41.

29. Сторожок Н.М. Взаимосвязь величины константы Кю и эффективности синергических смесей токоферола и фосфолипидов В сб.: материалов III международного симпозиума по окислению. Казань,- 1995.- с. 41-42.

30. Кутузова И.В., Сторожок Н.М. Полиненасыщенные липиды-фармацевтические и медицинские аспекты. В сб. Формирование приоритетов лекарственной политики.-М.- 1995.-е. 65-67.

31. Storozhok N.M. New concept of phospholipids as indispensable components of the non-enzymatic system. In.:Materiais second international scientific practical conference.-Nadym.-1995.-P. 107.

32. Сторожок H.M., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Изучение роли фосфолипидов в качестве важнейшего звена неферментативной антиоксидантной системы В сб.:Биологически активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической целью при наиболее распространенных заболеваниях,- 1995.-Тюмень.-с.102-104.

33. Сто рожок Н.М., Кутузова И.В. Исследование проявлений эффектов антагонизма при сочетанном использовании а-токоферола и (3-каротина В сб.:Биологически активные добавки к пище-нутрицевтики - и их использование с профилактической целью при наиболее распространенных заболеваниях.- 1995.-Тюмень.-с.102-104.

34. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Исследование проявлений антагонизма в совместном антиоксидантном действии [5-каротина и витамина А с а-токоферолом. //Хим. фарм. журнал.-1995.- N 12.-е. 37-41. .

35. Сторожок Н.М. О роли и механизме действия фосфолипидов в процессе окисления природных систем, содержащих антиоксиданты//Вопросы питания.- 1996.-N 2.- с. 25-28 .

36. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Ингибирующие эффекты смесей а-токоферола с (З-каротином или витамином А при окислении эфиров полиненасыщенных жирных кислот. //Вопросы мед. химии-1996,- т. 42,- N 1.-е. 15-21 .

37. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Способ получения комплекса биологически активных липидов из отходов рыбоперерабатывающей промышленности. Патент. 95103108, дата поступления 28.02.1995 г. приоритет от 16.03. 1995г.

38. Кутузова И.В., Сторожок Н.М. Состав для стабилизации липидов. Патент 95102928, дата поступления 28.02.1995 приоритет от 9.03. 1995г.

39. Кутузова И.В., Сторожок Н.М. Состав для лечения ран, ожогов, дерматологических нарушений. Патент 95105026, дата поступления 3.04.1995, приоритет от 12.04.1995.

40. Сторожок Н.М., Борисенко В.Е., Кутузова И.В., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Кинетика и механизм эффекта антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола и Р-каротина.-В сб.: Питание и здоровье.: биологически активные добавки к пище.-М.-1996.-С. 159-160.

41. Сторожок Н.М., Левачев М.М., Кутузова И.В. Особенности жирнокислотного состава нового лечебно-профилактического средства "Эйковит" .- В сб.: Человек и лекарство".-М.-1996.-с. 50.

42. Кутузова И.В., Сторожок Н.М. "Эйковит" (масло, крем, гель, капсулы)-новое парафармацевтическое средство с полиненасыщенными жирными кислотами семейства "омега-3".- В сб.: Человек и лекарство.-М.-1996.-С. 31.

Информация о работе

Сторожок, Надежда Михайловна
доктора химических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы