Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы иммунодиагностики бруцеллеза на основе моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Методы иммунодиагностики бруцеллеза на основе моноклональных антител"

РГб од

^ у ^Р.ОССЗ^ОШ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕНШ Н№

ВСЕРОССИЙСКИЙ НЛУЧНО-ИССЛЕДОВЛГЕЛЬСКИй ИНСТИТУТ ЗКСПЕРИМЕНТАДЬНШ ВЕТЕРИНАРИИ им .Я. Р. КОВАЛЕНКО

На правах рукописи

БСРОБИКОВ Сергей Школаевич

МЕТОДЫ ИМЫУНОДИЯТЮСШИ БРУЦЕЛЛЕЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в проблемной лаборатории по сельскохозяйственной биотехнологии .Акмолинского сельскохозяйственного института, в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко, на опытной базе Вышне-володеого отдела ВДЭВ и в группе иммунохимии Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина.

Научные руководи?ели: Доктор ветеринарных наук, с.н.с. В.А.Ромахов Кандидат ветеринарных наук, доцент А.К.Булашев

Социальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук,профессор К.В.Шумилов Кандидат биологических наук Г.А.Надточей

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных

Защита диссертации состоится " "_ 1993 г. в

" " часов на заседании специализированного Совета К 020.28.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.Бруцеллез сельскохозяйственных животных наносит большой экономический ущерб животноводству Республики Казахстан. Кроме того, высока заболеваемость людей, так или иначе связанных с животноводством. Своевременное выявление и изоляция больного скота является одним из главныхв факторов в системе ветеринар-но-санитарных мероприятий, направленных на оздоровление хозяйств от этой инфекции.

Наиболее достоверным методом диагностики остается бактериологический анализ. Выделение культуры бруцелл является бесспорным доказательством наличия бруцеллезной инфекции, но в тоже время отрицательные результаты бактериологических исследований не могут слузгать достаточным основанием для исключения заболевания. К тому же, этот метод не применяется для массовых исследований животных в связи с большой трудоемкостью, высокой стоимость», длительностью опытов и наблюдений, пр^пествувщих получению результатов.

Разработка эффективных экспресс-методов обнаружения антигенов бруцелл в биологическом материале и объектах внешней среды требует наличия однородных, высокоаффинных антител, имеющих специфичность к определенней детерминанте возбудивеля (.I.Grelser-Wilke et al. ( I98S; V.limet et al. , I9ö7 ). Возможность получения *аких антител доказана в 1975 году G.Köhler and C.Milstein . Моноклональ-ные антитела С МКА ), синтезируемые клетками одного и того же клона С штамма ) клеток, полученные методом гибрвдомной техники, имеют одинаковые физико-химические свойства и равную специфичность к определенной детерминанте антигена.. Другими словами, МКА, это достаточно чистое химическое вещество, а не гетерогенная смесь, изменяющаяся о каждым иммунизированным животным или с каждой порцией крови одного и того же организма. МКА гомологичны, поэтому пробле-

- ц -

ма перекрестных реакций становится менее острой, чем в иммунологических тестах с обычной поликлональной сывороткой.

В этой связи МКА могут служить идеальным "инструментом'' в разработке новых и совершенствовании суцествуищих методов диагностики бруцеллеза.

Цель- работы.Получение гибридных клеток,продуцирующих МКА к детерминантам бактерий рода Brucella и разработка на их основе экспресс-методов обнаружения антигенов бруцелл в биологическом материале.

Задачи исследования:

1.Получить штаммы гибрид-ом-продуцентов ЫКА против полисахарид-ных антигенов бактерий рода Brucella .

2.Изучить иммунохимические свойства полученных ЫКА.

3.Разработать методы обнаружения бруцеллезных антигенов в твердофазном иммуноферментном анализе ( ИФА ) и реакции латекс-агглютинации ( PJIA ) на основе использования ЫКА.

4.Определить эффективность предлагаемых экспресс-методов диагностики бруцеллеза на материале, полученном от экспериментально и спонтанно зараженных животных.

Научная новизна.Получены два штамма гибридом,продуцирующих МКА к полисахаридным антигенам бактерии рода Бруцелла и дана характеристика их свойств.

Разработаны и испытаны экспресс-методы индикации антигенов бруцелл в ИФА и РДА на основе использования МКА, позволяпцие получить результаты за 3 - 3,5 часа. Создан "Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител".

Практическая значимость.По материалам исследований разработаны Технические условия ( ТУлгт 10.05.4000.326-92 ) на "Набор для

Uli.

диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе\моноклональных антител" и Наставление по постановке и учету ИФА для экспресс-обнару-

жения антигенов бруцелл в патологическом материале методом Й$А на основе моноклинальных антител, которые утверждены Главным управлением ветеринарии Республики Казахстан от 8 декабря 1992 года.

Основные положения.выносимые на защиту:

-Антигены бруцелл, находящиеся в прижизненном и посмертном биологическом материале могут быть идентифицированы с помощью МКА.

-Экспресс-методы обнаружения бруцеллезных антигенов в биологическом материале с помощью И#А и PIA на основе МКА.

Апробация. Основные результаты доложены на Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (. Целиноград, 1991г.); научно-производственной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Целиноградского ( ныне Акмолинского ) СХИ, 1991 - 1992 г.г.; конференции "Научные достижения молодых ученых я специалистов - животноводству" С Семипалатинск , 1991 г.); расширенном заседании сотрудников ветеринарного факультета и биотехнологического центра Акмолинского СХИ, 1993 г.

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Обьем и 'структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, результатов, обсуждения, выводов,практических предложений, списка литературы и приложения. Работа содержит 12 таблиц, 3 фотографии. Список литературы включает Г/8 источников, в том числе 93 иностранных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Работа выполнена в проблемной лаборатории по сельскохозяйственной биотехнологии Целиноградского ( ныне Акмолинского ) СХИ, в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза Всесоюзного ( ныне Всероссийского ) института экспериментальной вете-

ринарии ( ШЭВ ) им.Я.Р.Коваленко, на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЗВ и в группе иммунохимии Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина в период с 1988 по 1992 годы.

Ьактериальные антигены. •

В работе были использованы следующие виды и штаммы микроорганизмов: Brucella abortus 19, 54 ; Brucella melitensis 237 , 16M,Невский, 498, EEV-1, B115 ; Brucella suis 61, 1000, 1330 ; Brucella ovis 428 ; Yersinia enterocolitica 09, 389 ; Salmonella godesberg 632 , Salmonella urbana 122/41 , Salmonella landau 556 ; Escherichia coli 565 , а также1 коммерческий ди-

зентерийный диагностикум Ташкентского HMJ3C (. Shigella flexneri , Shigella newcastle , Shigella soimai ) и вибриозный антиген Витебской биофабрики.

Ноли-Б антиген выделяли методом экстрагирования трихлоруксус-ной кислотой (, E.Diaz et al.,1979 ) и методом ступенчатого осаждения этанолом С R.Diaz et al.,1981 ).

Подопытные тавотные. '1'елки, b-6-месячного возраста в количестве 10 голов, отобранные по методу аналогов, содержались во время опыта на опытной базе ВИЭВ. Из общего числа животных 5 голов были заражены конъюнктивалвно культурой Brucella abortus 54 в дозе 14,0 - 16,0 х Ю^м.к. да голову. Остальные служили контролем.

Через 30 дней после заражения телки были убиты с целью отбора проб патологического материала и проведения бактериологического анализа. Одновременно образцы патологического материала были исследованы на наличие антигенов бруцелл в предлагаемых нами экспресс-методах, основанных на использовании моноклональных антител в имму-ноферментном анализе и реакции латекс-агглютинации.

Кроме того, исследованию подвергались образцы патологического материала от 30 коров и б аборт-плодов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств Целиноградской С ныне Акмолинской ) области.

От телок и коров для исследования были взяты образцы печени, селезенки, сердца, а также лимфатических узлов (, паховых, надвымен-ных, подчелюстных, заглоточных, парааортальных, гипогастральных , подколенной складки, предлопаточных, околоушных, тазовых ), а от аборт-плодов - пробы содержимого желудка и паренхиматозных органов.

Мышей линии BAIB/с иммунизировали поли-5^гисе11а mslitensia В115 внутрибрюпганно по схеме, описанной И.й.Фридлянской ( 1988 ).

Гибридизации клеток миеломн X63-Ag 8.653 со спленоцитами иммунных мышей проводили по методу V.Oi ana A.Heraenberg С 1980 ). В качестве сливающего агента использовали Ь5% раствор полиэтиленгли-коля С 11ЭГ-4000 Селекцию гибридных клеток проводили на среде, содержащей гипоксангин, ашноптерин, тимидин С ГАТ ). Миеломные и гибридные клетки выращивали в среде ВР1Л-164Ю о добавлением 10$ сыворотки плода коровы, 0,05мг/мл пирувата натрия, З.'шкл/л 2-мер-каптоэтанола, ЗООмг/л -Г-глютамина.

Антительнув активность гибридных клеток определяли путем исследования культуральной жидкости в реакциях микроагглютинации и твердофазном иммуноферментном анализе.В качестве антигенов при тестировании гибридом использовали растворимые и корпускулярные антигены бруцелл разных видов и штаммов, а также аналогичные препараты гетерологичных бактерий.

Клонирование гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений.

МКА в виде асцитной жидкости получали путем культивирования гибридных клеток в брюшной полости сингенных мышей, которым предварительно вводили пристав. Антитела из аоцитной жидкости выделяли методом высаливания 50$ раствором сульфата аммония.

Специфичность, моноклональных антител определяли в реакциях микроагглютинации, непрямом и сэндвич вариантах ТИ$А, латекс-агглютинации и в иммуноблотинге.

Константу связывания полученных МКА установили по методу l.Be-atty et al. (. 1987 ). Класс и подкласс иммуноглобулинов определили с помощью двойной иммунодиффузии по О.Оухтерлони (. 196Ь ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты гибридизации клеток и характеристика ионоклональ-

кых антител.

Схема иммунизации мышей линии ЬКШ/с поли-Ь антигеном Brucella melitensis В115 , использованная нами в этой работе, оказалась вполне пригодной для перестройки иммунной системы животных на выработку достаточного количества специфических антител. Так, по данным ИФА титры антител в сыворотке крови иммунизированных мышей находились в пределах от 1:800 до 1:1600.

На 10-16 сутки после гибридизации ( слияния ) иммунных сплено-цитов с миеломными клетками отмечен рост единичных клонов гибридом в 205 лунках из 768 засеянных, т.е. процент слияния клеток был довольно высок - 26,7%.Из числа гибридом, исследованных на антительную активность, только два клона гибридных клеток ( 0,98$ ) продуцировали МКА, реагирующие с использованным иммуногеном в ИФА и цельными клетками Бруцелла абортус в РИА. Зги клоны С штаммы ) гибридом получили авторские названия БАМА и БИМА и были дважды клонированы методом лимитирующих разведений. При втором клонировании С реклониро-вании ) все субклоны обоих штаммов показали IOO^-ную антительную активность в ИМ и РМА. Штаммы клеток культивировались ин витро и ин виво для наработки моноклональных антител с последующим изучением их активности и специфичности в различных иммунологических реакциях .

Результаты исследований специфичности МКА в культуральной среде и асцитной жидкости штаммов гдбридом БАМА и БИМА в твердофазном иммуноферментном анализе представлены в табл.1.

Таблица I.

Специфичность МКА в непрямом варианте ТИФА

Антигены

Титры антител

МКА шт.БАМА ! МКА шт.БЛМА

б™куль*у- '|б аецимея! в кулму-

ральной ; жидкости ! ральной

среде j_! среде

в асцитной жидкости

Поли-БВг«шв1-1-*впв18 В115 Г: 8 I 12800 I 128 I 819200

Поли-Б®г«ивШ;вП81в 16Ы 0 I 100 I 64 I 204800

ЛПС Br. abortus 19 1:4 I 6400 I 64 I 204800

ЛПС Br.abortus 54 1:4 I 6400 I 64 I 204800

ЛПС Br.melitensis 16М 0 I 100 I 64 I 409600

ЛПС Y.enterooolitica 09 0 I 200 I 64 I 204800

Примечание: О - отсутствие реакции.

Из таблицы I следует,что МКА шт.БИМА реагируют со: всеми антигенными препаратами, полученными из бактерий рода Brucella, включая и ЛПС T.enterocolitica 09.

МКА шт.БАМА имеют высокую активность по отношению к вышеупомянутым антигенам, за исключением ЛПС и поли-Б Br.melitensis 16М и ЛПС X.enterocolitica 09 .

Специфичность полученных МКА изучалась и в реакции микроагглютинации ( РИА ).

Таблица 2.

Титры МКА в РМА

Бактериальные антигены Титры антител

1 МКА шт.БИМА j МКА шт.БАМА

в культу-ральной среде в асцитной | |в асцитной жидкости | среде | жидкости

1 '1 > ! 4 ! 5

Br. abortus 54- 1:16 1:25600 1:16 1:25600

I I 2 ! з ! 4 ! 5

Br.melitensis 237 1:32 I:102400 1:2 1:1600

Вг. suis 61 1:32 1:102400 1:16 1:25600

Y.enterocolitica 09 1:32 1:51200 0 1:400

Примечание^ - отсутствие реакции.

Данные таблицы 2 свидетельствуют о высокой активности и специфичности МКА штамма БАМА к Br.abortus и Br.suis . МКА БймА лучше всего реагировали с Br.melitensis 237 С 1:102400 ) и Br.suis 61 С 1:102400).

Изучение специфичности МКА штамма БИМА в сэндвич варианте ТИ§А показало, что антитела этой гибридомы реагируют только с ЛПС Вг. abortus и поли-Б Br.melitensis В115 , тогда как в непрямом ТИ§А они взаимодействовали как с Br.melitensis 16М , так и Y.enterocoli-tica 09 С табл.3 ).

Таблица 3.

Результаты сэндвич ТИ#А с использованием МКА штамма БИМА

Антигены

Значение оптической плотности в зависимости от концентрации антигена С нг/мл )

fOOO 250 62 31 15 7

I^H-BBr.melitensis Б115 0,96 0,86 0,62 0,37 0,25 0,17

l^H-EBr.melitensis 16M 0,27 0,14 0,13 0,12 0,12 0,12

ЛПС ^.abortus 54- 1,0 0,96 0,90 0,70 0,61 0,54

ЛПС Br.melitensis 16M 0,26 0,13 0,13 0,12 0,10 0,08

ЛПС Br.abortus 19 0,90 0,68 0,45 0,33 0,25 0,24

ЛИС X.enterocolitica 09 0,13 0,10 0,13 0,10 0,14 0,10

Примечание^ таблице приведены средние показатели оптической плотности 3-х опытов.

Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о возможности использования МКА штамма ШМА для обнаружения антигенов Вг. abortus в сэндвич ТИМ. Этот же вариант иммуноферментного анализа, поставленный по схеме МКА штамма БАМА + антиген + МКА штамма БИМА, меченые пероксидазой,также позволял дифференцировать Br.abortus от Y.enterocolitica 09 , однако имел более низкую чувствительность

с

- 15 нг/мл или 5 х 10 кл/мл, чем сэндвич ТМА, где в качестве как

первых С "захватывающих" ), так и вторых антител были использованы

5

МКА штамма БИМА - I нг/мл или 1,5 х 10 кл/мл.

Изучена чувствительность и специфичность сэндвич варианта точечного ТИФА (, ГТИЗД ) на нитроцеллюлозной мембране в случае использования в качестве первых и вторых антител МКА штамма БИМА. Раотво-«

римые антигены бруцелл С поли-Б и ЛПС ) обнаруживались в концентрации I нг/мл и выше, а чувствительность данного варианта ТТИЗД по отношению к корпускулярным антигенам С Br.abortus 19,5^ ) была равна 2,0 х Ю^кл/мл.

Для определения специфичности сэндвич ТТМА на основе МКА штамма БИМА в качестве гомологичшх и гетерологичнгс бактерий были использованы ЛПС Br.abortus 19 HY.enterocolitica 09 . Специфичность этого варианта иммуноферментного анализа по отношению к бру-целлам былй довольно высока. Гак, если ЛПС Br.abortus обнаруживались в концентрации 1-3 нг/мл, то аналогичный антиген Y.enterocolitica 09 выявлялся в концентрации не менее 250-500 нг/мл.

В сэндвич ТТИ?А были исследованы также интактные клетки микроорганизмов (. Yersinia enterocolitica 09 шт. 389 ¡Salmonella urbana 122/41 .Salmonella godesberg 632 .Salmonella landau 556 , Escherichia coli 565 ; дизентерийный диагностикум С Shigella sormai , Shigella flexneri , Shigella newoastle ) и вибриозный антиген Витебской биофабрики ), относящиеся к 5 различным видам в различных кон-

i ¿г О

центрациях - от 5 х 10 до 8 х 10 м.к./мл. Результаты опыта пока-

зали, что использованные бактерии не дают положительной реакции даже в максимальной концентрации. Исключение составили клетки Y.

enteroeolitica 09, которые показали слабоположительную реакцию в

у

концентрации 0,5 - 1,0 х 10 м.к./мл и выше.

МКА обоих штаммов гибридом относятся к классу IgG, подклассу 2а. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата натрия (. 11ААГ - ДСН ) МКА, очищенные из асцитной жидкости методом высаливания в 40$-ном растворе сульфата аммония, разделяются на Н- и L- цепи иммуноглобулинов с молекулярной массой соответственно бОКДа и 20КДа. Константа связывания у МКА штамма БИМА

О Q

была равна 7,7 х 10" М, а у гибридомы БАМА - 0,6 х Ю~°М.

Специфичность МКА обеих гибридом по отношении к полисахаридным антигенам ( поли-Б и 1ПС ) Brucella abortus , Brucella melitensis и I.enterocolitica была исследована и с помощью метода иммунобло-тинга. Результаты иммуноблотинга подтверждают высокое сродство MÍA штаммов БАМА и БИМА к полисахаридным эпитопам бактерии рода Brucella.

Таким образом, МКА штаммов гибридом БАМА и БИМА , полученные нами методом гибридомной техники, проявляют специфичность к бруцел-лам и могут быть использованы в разработке методов и средств диагностики бруцеллеза.

Обнаружение антигенов бруцелл в пат, мате риале с помощью МКА в различных вариантах ТИФА на полистироловом планшете. После убоя 25 коров, реагирующих на бруцеллез по. РА, РСК, были отобраны образцы пат.материала и исследованы на наличие антигенов бруцелл в непрямом и сэндвич вариантах ТИМ с использованием МКА БАМА и БИМА. В качестве твердой фазы был .использован полистироловый планшет для иммунологических реакций ( "Нунк", Дания ).

В результате исследований установлено, что наибольшее количес-

тво животных ( 9 голов или 36$ ) в паренхиматозных органах которых выявлен бруцеллезный антиген, отмечено по данным сэндвич ТИФА, поставленного по схеме МКА БАМА + образец пат.материала + МКА БИМА, меченые пброксидазой хрена. Причем эти результаты хорошо коррелировали с данными непрямого ТИ§А. Так, во всех образцах паренхиматозных органов, показавших положительную реакцию в непрямом ТИФА, антигены бруцелл обнаружены и в его сэндвич варианте.

Диагностическая ценность точечного ТИМ на основе МКА

при бруцеллезе животных.

Непрямой вариант точечного ТИФА на нитроцеллюлозной мембране был испытан в сравнении с бактериологическим анализом на 35 пробах материала, взятого от 5 реагирующих на бруцеллез коров. Для обнаружения бруцеллезных антигенов в ТТИФА были использованы МКА штамма БАМА. В качестве контроля были использованы суспензии аналогичных паренхиматозных органов и лимфатических узлов от здоровых животных.

Бруцеллез у исследованных животных подтвержден как по результатам бактериологического анализа, так и ТТИФА. Однако эффективность обнаружения бруцелл ( или их антигенов ) в патологическом материале у сравниваемых методов была различной. Так, культура бруцелл выделена из 10 проб, чти составляет 28,5% от общего количества исследованных, тогда как испытуемым методом не только подтверждены данные данные бактериологического анализа, но и дополнительно выявлено наличие бруцеллезного антигена в других образцах пат.материала С 17 проб или 48,). В двух случаях, несмотря на положительные результаты бактериологического анализа, методом ТТИФА не удалось выявить антигена бруцелл.

Диагностическая ценность сэндвич точечного ТИ$А на основе МКА штамма БИМА была определена на образцах пат.материала, полученных

от телок, инфицированных экспериментально культурой Вг.аЪогЪив 54 в дозе И - 16 млн.м.к. ( табл.4. ). *

Таблица 4.

Сравнение эффективности точечного ТИФА и бактериологического анализа при исследовании пат.материала на бруцеллез.

К п/п ■ ; Бактериоло-i ' 1 Совпадения

¡Ивдв¡Кол-во i Е ! проб гический ! 1 анализ ; i ТТИФА + в бак. анализе и ГГМА ! - в бак. 1 ; анализе и j ТТИФА

i ! + I . 1 + -

I 18 14 5 9 6 8 4 8

2 20 9 2 7 4 5 2 5

3 30 7 I 6 2 5 I 5

4 32 II 4 7 5 6 2 б

5 33 14 I 13 9 5 I 5

Итого: 55 13 42 26 29 10 29

Примечания; С + ) - положительный результат ( - ) - отрицательный результат Из таблицы 4 следует, что с помощь» МКА ШМА в сэндвич ТТИФА наличие бруцеллезного антигена выявлено в 26 пробах из 55 исследованных С 47,2# ). В 10 пробах из 13, и-з которых была выделена исходная культура Br. abortus 54 , антигены бруцелл обнаружены и в ТТИФА. Остальные три образца показали отрицательный результат по данным испытуемого метода. Однако, ТТИФА позволил дополнительно обнаружить бруцеллезный антиген еще в 16 пробах.

В ТТИФА были анализированы и образцы патологического материала, полученные от абортированных плодов неблагополучного по бруцеллезу стада. Было исследовано 22 пробы паренхиматозных органов и содержи» мого желудка от б абортированных телят. Одновременно каждый образец

патологического материала подвергался бактериологическому анализу.

Культура бруцелл была выделена у всех аборт-плодов, за исключением одного плода. Использованный вариант И1$А также не выявил антигенов бруцелл в образцах пат.материала упомянутого плода, однако показал положительную реакцию при исследовании тех проб, из которых была выделена культура возбудителя бруцеллеза. Всего при исследовании 22 проб в ТТМА положительные результаты были получены в 12 случаях ( 54,3% ), а в бактериологическом анализе в 8-ми (. 36,4% ). Отметим, что полное совпадение результатов двух методов наблюдалось при исследовании 4 образцов содержимого желудка. Инфи-цированность 4 проб паренхиматозных органов аборт-плодов доказана только по данным Г1И$А.

Чувствительность и специфичность реакции латекс-агглстина-ции С РЛА ) на основе ИКА.

Чувствительность латексного диагностикума, изготовленного путем сенсибилизации латексных частиц серии А15Е МКА штамма БИМА определяли путем постановки развернутого варианта РЛА на 96-луночном планшете с и-образными лунками. Результаты проведенного эксперимента представлены в табл.5. С каждой микробной культурой опыты поставлены в 5 повторах.

Таблица 5.

Чувствительность латексного бруцеллезного диагностикума С ЛЕД )

№ J n/ni Виды антигенов j Чувствительность ! ЛБД тыс.м.к./мл

^ | ? ! 3

I Brucella abortus 19 . 51,15 17,44

2 Brucella abortus 54 144.0*9,6

3 Brucella melitensis HEV-1 4800/0 i320,0

4 Brucella malltensis 16Ы 5700,0*360,0

и_2_:_

5 Brucella melitensis "Невский

6 Brucella melitenais 498

7 Brucella suis 1330

8 Brucella suis 1000

9 Brucella ovis 428

10 Поли-Б Brucella melitansis B115

98oo,и 1240,0 21(00,0 ±160,0 310,0 r16,0 155,0 48,0 140,0 t16,0 2 нг С 2 x Ю~9г/мл

Как видно из таблицы 5, латексный бруцеллезный диагностикум по разному реагирует с различными штаммами бруцелл. Так, например, он выявляет растворимый бруцеллезный антиген (. поли-Б ) в концентрации 2 нг ( 2 х 10~^г/мл ), а цельные клетки бруцелл в количестве от 51,15 47,44 тыс.м.к./мл ( Вг.аЪохииа 19 /до 9,8*0,24 млн.к./мл С Вг.те1^еав1в "Невский"). Можно заметить, что чувствительность диагностикума ко всем интактным клеткам штаммов Вг.те11Ъепз18 значительно ниже, нежели к другим видам бруцелл.

Известно, что показателем специфичности серологических реакций, основанных на феномене агглютинации, является соотношение минимальных доз гегерологичных С близкородственных ) и гомологичных бактерий, вызывавших агглютинацию носителя. Чем больше это соотношение, тем выше специфичность.

При использовании в качестве сенситина МКА БАМА, ни один итамм гегерологичных бактерий не агглютинировал диагностикум даже в дозе 875 млн.м.к./кл. МКА штамма БйМА, использованные в качестве сенситина латексных частиц, давали перекрестную реакции с У.егЛе-Еосо11М.са од в дозе 218,? млн.м.к./мл и выше. Чувствительность ла-тексного диагностикума, изготовленного на основе МКА данного штамма гибридомы, по отношению к цельным клеткам бруцелл, как было указано ваше, находилась в пределах 51,15*7,^4 тыс. - 9,810,24 млн.

м.к./мл. Следовательно, показатели специфичности этого диагностикума к бруцеллам были довольно высокими ^ соответственно от 4275,6 до '¿'¿,'5 ). Таким образом, доказана высокая специфичность латексно-го диагностикума на основе моноклональных антител штаммов БАМА и БИМА в реакциях с гетерологичными бактериями, которые могут быть причиной ложноположительных результатов при использовании иммуно-сорбентов сенсибилизированных противобруцеллезными поликлональны-ми антителами.

Нами определен срок годности латексного диагностикума, при хранении его в жидком состоянии без консерванта, в жидком состоянии с консервантами С мертиолят, азид натрия ) и в лиофилизирован-ном виде в условиях при 4°С.

Латекеный диагяостикум без какого-либо консерванта уже на 3-й сутки начал терять активность, а на 4-е сутки хранения давал спонтанную агглютинации. Лиагносгикумы, консервированные азидом натрия и мертиолягом, сохраняли активность до 4-х месяцев. Лучше всего хранился латекеный диагностикум в лиофилизированном виде, который после хранения в течение 12 месяцев лишь незначительно снизил свою исходную активность.

Испытание эффективности латексного бруцеллезного диагностикума.

С помощью латексного диагностикума, ТМФА и бактериологического метода проводили исследование патологического материала (, паренхиматозных органов и лимфатических узлов ), взятого от Ь телок, экспериментально зараженных бруцеллезом.

При бактериологическом анализе ЬЬ образцов патологического материала, от экспериментально инфицированных животных, была выделена культура возбудителя бруцеллеза ъ 13 пробах С 23,6^ ;/табл.6/.

Таблица 6.

Серологические и бактериологические исследования патологического материала

Индв. * Кол-во проб I Совпадения

Результаты ¡гэзультаты бис.анализа! ТТИФА | ¡*езультатн;+ЬаК.А8а .Бак.ана_ 5 !»3'И1Нлиэ.ГгИ-

+ - | + 1 - ! £ - | «А ирла; $а и ?м

18 14 5 9 б 8 6 8 4 8

20 9 2 7 4 5 4 5 2 5

30 7 1 6 2 5 2 5 I 5

32 II 4 7 5 б 6 5 2 5

33 14 I 13 9 Ь 10 4 I 4

Итого 55 13 42 ■¿6 29 28 27 10 27

Примечание: (. + ) - положительный результат - ) - отрицательный результат Из данных таблицы б следует^ что с поиощьо латексного диагнос-тикума » РЛА на»чие антигенов бруцелл установлено в 28, а в ТТИФА в 26 образцах из 55 исследованных, что составляет соответственно Ь0,9 и 47,В 13 пробах пат.материала, из которых изолирована культура возбудителя бруцеллеза, специфический антиген был выявлен как латексным диагностикумом, так и 1'ТКФА ъ 10 случаях. Однако, присутствие антигенов бруцелл в 18 образцах установлено только с по-мощьо латексного иммуносорбента.

В качестве отрицательного контроля в РЛА были использованы суспензии лимфатических узлов и паренхиматозных органов коров благополучного стада, не реагирующих иа бруцеллез по РА, РСК и ИФА. Отметим, что все 35 контрольных образцов показал* отрицательный результат в РЛА с изготовленным инмунореагентом.

Таким образом, РЛА на основе ЯКА штаммов ШМА и ВАМА является

легко выполнимым иммунологическим тестом, ооладает высокой чувствительность!), специфичностью и может оыть использован для экспресс-оонаружения бруцеллезных антигенов в образцах патологического материала.

Результаты производственной апробации иммуноФериентного анализа и реакции латекс-агглютинации при диагностике бруцеллеза.

Компоненты, неооходимыа для постановки сэндвич т1Мк и РЛА для экспресс-обнаружения бруцеллезных антигенов, были укомплектованы нами в диагностические наборы и переданы ветеринарным лабораториям, а также научно-исследовательским институтам для комиссионного испытания.

Результаты апробации наборов показали высокую чувствительность и специфичность как иммуноферментного, так и латексного диагности-кума при определении антигенов бруцелл. Кроме того, отмечена простота постановки и учета результатов ТТИ§А и РЛА с использованием упомянутых наборов, а также большое преимущество их перед бактериологическим методом диагностики бруцеллеза во времени. Наличие или отсутствие бруцелл (, или их антигенов ) в пат. материале с помощью предлагаемых диагносгикумов определяется за 3-3,5 часа, тогда как бактериологический анализ требует для этой цели гораздо больше времени из-за медленного роста бруцелл при первом выделении.

Основные результаты по разработке и испытанию экспресс-метода обнаружения бруцеллезных антигенов в пат.материале, основанного на использовании МКА в иммуноферменгном анализе, были одобрены Научно-техническим советом секции ветеринарии МСХ Республики Казахстан С протокол №18 от 21.11.92г. ) и рекомендована для широкого производственного испытания. Разработанные нами Технические условия С ТУ оп>10.05.4000.326-92 ) на "Набор для диагностики бруцеллеза методов И§А на основе МКА" и Наставление по применению И§А для ди-

экспресс-выявления бруцелл в пат.материале утверждены Главным управлением ветеринарии МСХ Республики Казахстан.

"Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе МКА" был экспонирован на ВДНХ СССР ( апрель,1991г. ) по тематике:"От фундаментальных исследований до практического внедрения" и удостоен серебряной медали.

ВЫВОДЫ:

1.Получены два штамма гибридных культивируемых клеток ( гибридом )Mus urascul-us L - продуцентов МКА против бактерий рода Brucella.

2.МКА обоих штаммов гибридом (, авторское название БАМА и Бй-МА ) относятся к классуIgG 2а и специфичны к разным эпитопам по-лисахаридного антигена бруцелл.

3.МКА штамма гибридомн БАМА позволяют дифференцироватв бруцел-лы от других ^рамогрицательных микроорганизмов, имеющих общие антигенные детерминанты с ними, в реакции агглютинацииг реакции латекс-агглютинации, непрямом и сэндвич вариантах иммуноферментного анализа.

МКА штамма гибридомн БША в непрямом ТИФА реагируют как с с липополисахаридами Br.abortus 19, 5^!Er.melltenBi8 15М , так и с аналогичным антигеном T.enterocclttica 09 , однако в сэндвич ТИФА они взаимодействуют только с 1ПС Br.abortus 19, 54.

5.МКА обоих штаммов гибридом в испытанных вариантах иммуноферментного анализа выявляют бруцеллы или -их антигены в патологическом материале с большей эффективность», чем бактериологический анализ.

6.Высокая чувствительность и специфичность сэндвич ТТИФА при определении бруцеллезного антигена достигается при использовании в этом тесте в качестве первых и вторых антител МКА штамма БИМА,

- 21 -

что объясняется их высокой аффинностью.

7.Отработаны оптимальные условия коньюгирования латексных частиц с МКА и техника постановки РЛА.

Э.Латексный диагностикум в РЛА показал более высокую чувствительность при обнаружении бруцелл или их антигенов в патологическом материале, чем бактериологический метод.

9.Иммуноферментиый анализ и РЛА с латексным диагностикумом

на основе МКА позволяют обнаружить бруцеллезный антиген в патологическом материале за 3-3,5 часа и, следовательно, имеют большое преимущество перед бактериологическим методом во времени.

10.Набор для диагностики бруцеллеза методом И$А и ЛЕД на основе МКА испытана в производственных ветеринарных лабораториях и научно-исследовательских институтах.

11.Разработанные нами методы диагностики бруцеллеза могут быть использованы для экспресс-обнаружения антигенов возбудителя в содержимом желудка аборт-плодов, в лимфатических узлах, паренхиматозных органах плодов, а также животных, убитых с целью установления латентной формы инфекции и в других объектах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1.Наставление по постановке и учету МА для Экспресс-обнаружения антигенов бруцелл в патологическом материале ( утверждено. Главным управлением ветеринарии с государственной ветеринарной инспекцией МСХ Республики Казахстан от 8 декабря 1992г. ).

2.Технические условия ТГ0[Ь 10,05.4000.326-92 ) на "Набор для диагностики бруцеллеза методом И ФА на основе МКА" Л утверэданы Главным управлением ветеринарии с государственной ветеринарной инспекцией МСХ Республики Казахстан от 8 декабря 1992г. ).

- 22 -

Описок опубликованных работ

1.Булашев А.К..Шенжанов К.Т..Бскендирова С. 3. .Боровиков U.H. Иммунологическая реактивность новорожденных телят в бруцеллезном стаде//Тез.докл."Актуальные проблемы интенсификации животноводства в исследованиях молодых ученых Южного Урала",Троицк,1989.-С.20--21.

2.Ескендирова С.З.,Булашев А.К..Боровиков С.Н..Барамова I.A. Получение моноклональных антител к бактериям рода Brucella //Вестник с.-х. науки Казахстана.-1990.-НО.-С.68-71.

3.Булашев А.К..Боровиков С.Н..Лукин Ю.В..Зубов В.П..Несмеянов В.А..Ромахов В.А. Латекеный бруцеллезный диагностикум из моноклональных антител//Вестник с.-х. науки Казахстана.-1991.-М.-С.76-79.

^.Дмитриев А.Ф. .Булашев А.К..Шенжанов К.f. .Боровиков С.Н. Диагностика бруцеллеза у новорожденных животных//Материалы Всесоюзной научной конференции по с.-х. биотехнологии,Целиноград,1991.--C.I36.

Ь.Боровидов С.Н. Использование полимерных носителей в разработке методов диагностики бруцеллеза//'Гез. докл."Научные достижения молодых ученых и специалистов - животноводству",Семипалатинск,

iyyi.-U.Y-8»

6.Булалев А.К..Ахметвин F.3. .Боровиков С.Н..Бскендирова U.S. Лоноклоиальные антитела в диагностике антропозоонозов//Материалы

5 объединенного съезда гигиенистов,эпидемиологов,микробиологов,паразитологов и инфекционистов Казахстана, Алма-АтаДУУХ Дом 6.-ОМУ.

7.Булааев А.К..Боровиков С.В..Бскендирова С.З.,Сабираянова Моиоклоналыше антитела в диагностике бруцеллеза животных//

К&терх&лы йсвсоввной научной конференции по с.<-х. биотехнологии , Целиноград,1991,-С.124-126.

8.Боровиков С.Н..Булааев А.К..Лукин D.H..Несмеянов В.А. Инну-«слатвхсноадсорбфгоняый метод обнаружения возбудителя бруцеллеза

на основе использования моноклональных антител//Материалы Всесовз-ной научной конференции по с.-х. биотехнологии, Целиноград ДУУ1.--0.127-12«.

У.Студенцова U.R. .Каральниж Ь.Ь. .Груиина 'Г.А.,Булатев А.К., Боровиков С.Н..Абдирасилова А. Сравнительная экспериментальная оценка различных сорбированных реагентов из моноклональных антител в индикации антигенов бруцелл//Материалы Всесоюзной научной конфе- -ренции по с.-х. биотехнологии,Целиноград, 1УУ1.-С.132-133.

Ю.Булашев А.К.,Боровиков С.Н.,?омахов В.А.,Несмеянов В.А. Набор для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота//Биотех-нология.Приложение к экспресс-информации "Новости науки КазахстанаГ Алма-Ата,1УУ1.-С.103-104.

11.Боровиков С.Н.,Булатев А.К. Инмунофермеитная тест-система для диагностики бруцеллеза кивотннх//Вестник с.-х. науки Казахстана. -1УУ1. -»10. -С.У4-УУ.

12.1зулашев А.К..Боровиков U.H..Каральник Б.В..Студенцова В.К. Использование методов иммунобиотехнологии в экспресс-диагностике бруцеллеза животных//Вестник с.-х. наухи Казахе тана.-1УУ^.-М-2.--О.ВУ-УУ.

13.Ьулашев А.К. .Дмитриев А.Ф. .Йенжанов К.'Г. .Боровиков С.Н., Ескендирова С.У. Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом//11оложительное решение ВНИИГПЭ на выдачу авторского свидетельства. Заявка »4062905/13 093364 ) от Об.ОУ.УОг.

14.Булапев А.Н.,Ескендирова С.3.,Дмитриев А.Ф..Боровиков С.Н., Шенжанов К.Т. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Husums cuius L-продуцент моаеыональных антител к бактериям роде Brucella //Положительное рэиевд* ЬШШГИЭ на выдачу авторского свидетельства. Заявка М0«ЙЭ0/1Э-1ШП1 от 16.11.У0г.