Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТОДЫ АКТИНОМИЦЕТОВ - СТИМУЛЯТОРЫ ЗИГОТООБРАЗОВАНИЯ МУКОРОВЫХ ГРИБОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "МЕТОДЫ АКТИНОМИЦЕТОВ - СТИМУЛЯТОРЫ ЗИГОТООБРАЗОВАНИЯ МУКОРОВЫХ ГРИБОВ"

АКАДЕМИЯ. НАУК СССР

и'-тпут шкровюлогии

, На правах рукописи

КОЗЛОВА Ляха Николаевна

ШТАШШТи АКТИНОИЩЕТ® - СТИМУЛЯТОРЫ ЭДГОТОО^АЗОЙАНИЯ МУКОРСШХ ГО1Б0В .

( '/3,00,0? - микробиология )

"я

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени-кандидата биологвчеоких наук

Москва - 1983 г.

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук В,И.Дуда

Офшдшльаыэ оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Л.В.Калакуцкий

доктор биологических наук 3.Д.Кузнецов Веду и» в учреждение - Московский государственный универ-

на заседании Специализированного совета Д.002.64.01 а Институте

-летня Октября, д. 7, корп. 2. Учений совет ШЛ1 АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

\

микробиологии АК СССР. Адрес: ІІ73І2. г. Москва, сросік :т 60-

Ученый секретарь специализированного совета

к.б.н. Л.К.Москаленко

ВВЕДЕНИЕ

^остановка ь^юблемн и ее актуальность* Поиски новых типов физиологически активных соединений представляют большой теоретический в практический интерес и относятся к актуальной проблематика современной микробиологии» Одкой из наиболее интересных задач в етой области исследований является, но нашему мкешто, поиск дакробных метаболитов» отиыуларуюцих реиро-^ дуктивяыа процессы авкарвотных организмов» в частности* нро-цеооы полового воспрсиЗЕвдекия. Развитие исследований в этсы направлении выеет большое значение»; с одной стороны, для выяснения новых» ранее неизвестных механизмов регуляции роста и развития микроорганизмов, о другой - для'шяалеиэя тонких механизмов саморегуляции развития микробных популяций и познавая взаимоотношений микроорганизмов в природных данозэх. Озз в алогически активные вещества, влияющие на репродуктивные процесс« эшараот, представляют, кроме того, и практический ватере о в связи с их возмешшм использованием в народном хозяйстве и медицине. Начало исследованиям было положено Красальниковым (1945)* Кореняко о сотр. (1363), Лавриловой (1063), ХохлоеоЙ (1967). N . '

Цель я задачи исследований. Целью настоящего исследова-вия являлось изучение специфического влияния метаболитов вктиномицетов на процессы половой репродукции низших грибов Яорядкз Цисога1вв. ■ ,

В задачи исследования входило; .

X. Отбор, актвномпдохов-продуцентов метаболитов, влиявших на подовой процесс низших грибов порядка 'Kucoraj.es. - .

2. Ёыбор, тест-культура в разработка метода определения биологической активности стимуляторов звготообразевания гои-бов Порязз» * lfu.coral.es.

* 3. Характеристика физиологического действия матаболл-тов, влияющих на половой процесс низших грибов.

4. Выделение стимуляторов звготоскЗразования» '■' 5. Изучение химической природы выделенных метаболитов. .Научная яоедзня. В настоящей работе впервые покааано, что некоторые вяди акхявомяцетов о. ¡адают способноетм) си::те звреветь вешесва, ствмулирувдаа'процесса половой репродуксав ■низших грибов на стадиях развития, у« индуцяроваш™-т дейст-

Ц~ Л РЛЛЬНАЯ 1

НАУЧНА]» Б'-^БЛИОТЕНА-Мое (. евл^^ ^хоа. вкад^ч1; ! им. К; А.

И ив. № -

меы ладовых гормонов» .......

Стимулятору ясдобного типа дейст^я впервые подучена ь ишвческа чистом в аде я идевтифпцэровайы как коваяамвв-ввптвд--Шв кОАШ-СвкСЫ.

Вьуно доказано, что изучаемые ооедвнеазя являются »торвч-цшг уетеболитамв, биосинтез которых вэвисат от количества хобам&таа среде* . ■ ■.

ДеПотопе Евделаннах стямулеторов яа «укоротив грийн прг-вОДвт в уэвлэчеюш члела Солвоцевкых эигот на 2С0-30ОД и -сокрасенао р 2-3 раза сроков их созревания. При изучена» -физиологического дейстрля даинш: соединений уотакоглепо, что . ояи стмгулируот процессы ывтаСолйзма, вротекэшшо на отвали завершения формирования гамотеагЕ^Е а, возможя О» плазмогамия.

Практическая кеняоеть. Практическая Ценность данной работа . определяется скЗ пару гением у екТйййкзыетов физиологически вкт'евкш: веществ. нового тава хайетгия, ОвадогзчасявЗ Эффект которых шрзжеётся г стимуляции отдельная стгдвй полового аро-двсоа «зкоров^кс гркОсв.

Установление звзшдаостя СйосиагвБз кэгабмптов подоск вого мпа дзйагвия от с вате за к&залемйновкожет двнтьоя основой для дальиеЕшх целепаззраЕЛЭЕных Полслов рсдаскЗяш: сэдшв-КйЬ. ^

Воъюс&нботь получения в короткие сроки значительного ко-Л£че01'ра ПдДВО№ШЫХ эйгот мукоровых грабов мохвт »меть и рек-то ческу» ценность при покдерЕапаа в селекции грйбпнх. гатеротад-личнлх ©рганкакои* применяем шс в ряде «икр отологических про- . из воде тв, в часта оотя» получении ;з-каротмш ври культивировании грййз В1акез1еа гг!зрога.

" Вэйого ставят вопрос о неойходэмости дельяейенх поясков мшробяхх ыэта бататов с шльв возможного практического всполь-аовоная для регуляции половой репродукции еивотяых.

АпроАацкя работы. тсриалы диссертации бшщ доложена на аасвдакиа Всесоюзного Йакробв ологаче с кого общества {Москва, «арт 1971 г.) я Всесоюзном симпозиуме до Взгуляцря йвохшячве-яих процессов у йшерооргавазмов (Пуавво-кв-<&ч, Ноябрь 1972 г.), • Публккашн. По тема двоссргацви опубликовано 6 отзтей.

Объем работы. Латеряал диссертация излокзк на 143 страницах, аллойтр'лров.ан 15 ряезккаыв я XI таблицами. Сшасок литера-

тура включает 55 ре<5от на руосксы в 170 на иностранных языка*.

ffoygpftanu a T^eTflgы. Объектом исследования слуквлв 7С8 культур s-ти.груш (Красельников, 1970) рода streptomyces, взятые из коллекции культур ИНМИ АН СССР в левое редо тей пно выделе кные аз пота* ¿ктвноквдаты выращивала на среде следующего состава (г/д): мука пшеничная - 20, глюкоза - 10, оухве корковые дроьжи - 0,05, СаСОд - 2 в условия* погруженного культивирования в колбах на 250 ыл о 50 ил вреди на круговой качалке о 240 об/шн при вышературв 20°С ¿ .течение 3-х'оуток. strepteaycea' olivecoua вырвзшвали в>а тех же условиях да свите ги ческой среде следующего состава it/л): глюкозе,- 20» 1ГаС1 - 5, янтарноквелый ьшонай - 5,4, рвзо„, ГлЗО^ и *znso4 во 10 мл 0,ЦС растворе* ВЛ2РО4 - 12,6, К^ЙР04 - 24. Полупрояэ-водствешшЗ ражим культивирования продуцентов физиологически активных иотайолитов был отработав на средах выиаприведенаого соотава в ферментёрах на 100 л {эа'полневве 30 л) при скорости ыекадкв 400 об/ымн и водаче воздуха - 2 объема/мда. Время культивирования - 60 часов. , -

При идентификации культуры streptomye'es ер.' шт. 217 были ЮЕсльзовакы руководства Ibysc о ооавт. (1957), ВаксыешГ (vofceman, 1961), Шрдвяга в 1Ъттлаба < Shilling »7 Gottlieb, 1968, 1969, 1972), Краенльвикова (1970).

■ При выборе тест-объекте, чувствительного к действию метаболитов актиноыицетов-стимуляторов зиготообразовзния, были испытаны организмы родов t Zygorincbue, ibsidia, EUkeslea, liucor, Рауоодусев, Sbizopas сивningfaaaella , которые выраалва-,ли на вгаразовашшх'средах Чапека а сусло-агаре. Лрв подборе УСЛОВИЙ культивирования Ri.ble4eale«8nua В качестве асточни-ков азота использовали: HaKOj, ггаК02, с«(Ж>5)г, щ^о^н^о^ -, иопэвгну, вспарагив, гистидия, штвонав, лепт он, в качестве факторов роота - ввтаиикы, ашшокислоты, дрожжевой евтолазвт.

Очястну физиологически активных соединений осуществляла штодавя препаративной коловочной хршатогрзфии ка ДЭАЭ-тал-- ЛЕЛоэв, катионообыенной смола Даувко 5CkI (Ганодиэа, 1964; Бейдя, 1965; Бенеон а Патерсон, 1974), методой гель-фальтра-цои черев'Сефедекс,(Летерман, 1970). а также методом диск-электрофора за г подвекраламидиом геле (t!sypep, ^1971). В влоатах определяли белок с реактивом Д^рв-фалква, виииокр"л'v- ■

та го реакцзп с кингидрвнш, углеводы с андлиндвфениламин- , фосфатный реактивом.

Молекулярный вес подученного вещества,определяли методом гелъ-фильтрзцид в тонком слое Сефадекса G -25. Аминокислотный состав в препаратах скндулятора бал установлен .после кислотного гидролиза (20£ неї вря 120° в течение 24 часов) па автоматическом анализаторе аминокислот ні-tachi кьі. 5В. Содержание хобаламянов определяли микробиологическим методом с мутантом Е. соїіІІЗ-З-(Иерусалимский с соавт., 1961). Для определения количества кобальта и других металлов был:првиенен метод ятемко-еÛсорсідвойного анализа ва анализаторе "Спектр I*.

РЕЗУЛЬТАТЫ КССЛЕДСВАШЯ И ИХ СЁСГЛДЗНИЕ .

I. Разработка метода тестирования г . * ,

В результата ссдытзний мукоровых грабов, относяадася к 7 различным родам, тест-оЗъектоы был избран гетеротэдличкыЯ, .Езогаиаый іштіро^ил Kç/coiayceo W al: 9 si ее anus. Посев его (+") в (-) вариантов на плотные среди методом встречного роста дэвал возможность, веоти статистически достоверней количественный, . .учет результативности полевого процесса путем подсчета числа зигот на контактной л«дссе. - /

При подборе среда, обеояечпЕазячей полноценное развитее гргйа о относительно растянутама сроками подового споронош-гал,' основное видланпе было обращено на кенцзитрацвы азсте и его ( и.йлреХ,1Э57), Оптямалышм для полового оперовоко-ішя содержанием орга лесного с з ота (аопэрзгш) было 0,032 г,-ко 100 ьд среда (ряс. I),-Дальнейшее поьыаекве концентрации ■130ТЭ в срода приводило к угнетению аиготообразования. В результате проведенных исследований била вибрала среда следуипе-го состава (г/л): KgSO^ -0,5, HlgPO^ - 0,4, глшеоза - 0,25, агар-агар - 15, пептон,- 5, с «тарагав - 1,5, сусло І7% Балг) * - 200 яд. tía данной сред« Еобдедади коротай вегетатїи&няї рост. гриба, интенсивную пигментацию млделил, полноценное-развитие; обильное беоЕолое споронокмнке на 3-4 сутки роста и хорошее з и г от ооб]?а э оЕзнве на Э-ÏO сутки роста при ширина контактной полоси 3-6 км. '

і . П0Л025Я аідивнос'ть грвйов определяется не только гене- : тачсскоЗ конституцией организмов, но и их физиологическим

состоянием, которое зависит* от условий культяіяроваявя органиэ-ш, в тем числе от наличия в среде такюс факторов роста, как- -витамины, змвнеяаюлот«,-микроэлементы и т.д. (табл.'; X). Было наказано», что на среда вышеприведенного состава внесение этих, веществ нэоокрвщэло сроки и.не повышалоинтенсивность подового опорояошения. | .

Активность метаболитов, отшулирущпх зяготообразовавие И», ьіаквзіевапііз определяли ври внесении их на букагяые диски или агаровые блоки (з« I си,) и наложении последних на кон- . тактную волосу: с уже сформироганншуа половыми оргааоидвии ■ (3 сутки роста при т = 18-22°С).

Дрепарата отшуляторов. приготовленные в виде ОД? растворов наносили в коллчестга 20ккл на I си^. Результаты опыта учитывали путей подочеті, количества зигот на І см^ контактної' полосы,контрольного (9 сутки роста) в опитного (6 оутки роста) вариантов. * ч ■.

Условно за I единицу биологической активности принимали увеличение количества зигот в опытном варианте ва 1005» зо от-

Рво. I. . Зависимость зигэдообадзованяя-у гьусоигсва

і ьі&кезіевагша от количества доступного азота а среда.

(

1 ' ' ХаЛиица І

Влияние 'нвспеквфэческих ростовых факторов яа водовоз -спороношанвз рьусошусеа bletoslseanus »'' ■ " ■

■ Сектори

.Время Половое

полового ■ свороношниэ

гпороношания

■ сворої (ДНИ)

Контроль (среда Чапека)

~Смесь Еитешяоз (deз разведения)

Смесь витаминов (о разведакяями) 1/2

1/4

і

Смеоь ^HT()M|ÎJOâ ( о ^в зве де ИЙЯКИ )

Твэыгн (мкг/щ): I; 0,5; 0,25; 0,125;^О,0525

Дронхевой автадлзэт: йез разведения, 1/2, 1/4 . '

©ir^r^r^îôfl/lfl^r'

Пептон (г/100 кя): 0,5; 0,25; 0,125 ГСиогенат оуостраїаого кгг-лал ■

(рост па оусла 7° Еалг) . Гомогенат воздуЕіііого мацзлвя -. .

(рост.па сусле 7° Еалг) .Гомогенат зигот

.(рост ко сусла 7° Баяг)

4

4

4

4

4

4 2

4

4

Единичные,

несозревшие

зиготы

Слабое,

рзвномернсо - - —н—

Хороше ; рагномерноэ

" Слабое,,

рБВЕО^ерКОО

03илья от

Единичная 5кг0ты

слабое,-решоыеркое

Хорошее

Слабое, га вн шерл оо

, . - Исіадзвшіе Ee'^êcTsâ шоовдь методом ков на сшианныЗ газон.бь. blaicesloeanus на Чапогв.

хх _ ЕдхаіййШ) а бывнокислоты добавляла в указанных » глаге ."Материала в'методы".

налоїеция дио-фо!» среди

конце нтрацрях,

- 7 -

■ * t

Разработанный метод тестирования позволял проводить во-ютаявя соединения, влиявших на стадия двфферевдшзш гриба, yze ивидзироваянав действием и словах гормонов» Достовнотзэ метода состоят в тем; что оа разрешал: I. Получать в контролировать so временя цикл искового воспроизведения». Лостягать, во ьозыожноота ¿ максимально коротких сроков тестирования (6 суток).-3. Строго ставдартиз! хгоать условия тестирования я одновременно проводить большое число опытов, что обеспечивало стзтвстаческую достоверность полученных результатов в пределах 35£ доварительного интервала. 4. Исключить возыокность использования грибом- азучаекнх стимуляторов в качества дополнительных: источников углерода, азота или факторов ростд. 5. Регистрировать во Кремона разводив последовательных стадий зиготообразования, что позволяло дифференцировать процэссы, СЬЙЭбЯЯИв с действием, с одной стороны, половых гормонов йЛ2 индукторов горыонообрзэования,.с другой - специфических экзогенных стимуляторов;-всследуеишс в настоящей работе.

. U. Отбор в идентификация актиаоизц^тов-ВЕтавких . ..'. .продудентов иетаболатов, стамулирувдах

зиготообразованйа граб ста порядка uucoralea. .

' Способность стимулвровать зяготообразованле гркбов была изучена у 788 культур актин ошщатов,, как ыуэейнцг, тек в ви-деленнше из почв. Из них выраженной физиологической активно- -сты> изучаемого твда обладали 24 шташа. 7 всех организмов вепества-стиыуллтори бшш локализованы в ¿идалда. Наибольшее -число активних продуцентов было обнаружено среда актаномаце- , тов эеленоИ группы; Определение биологической активности пока' зэло, что наибольший стшулирушум действием обладала культура 'streptooyo в a api от. 217. Этот штамм по некоторых морфологическим в фязиодого-биохшичеемш свойствам отличался от ранее описанных видов раде streptomjces. Для него было характерно образование серого воздушного, зеленого субстратного инвалид ' в спиральных фпочек спор, поверхность которых покрыта длвтш-ыв шипами. Сходешя свойствами обладала з. maiacbitofuscua .(Преображенская, I9S4), s.táiyrus, S.aaleehltitV3 (Гоуьц ь соевт.» 1957), однако лзучае1ая культуре, в отличав от названных, не синтезировала келаяоядныа пягьл ít;j в образовывала rt-лешл пигмент ферровердин, ответеtl^hhuí за окраску субстрат-

• кого млселил. Тйк пак взучаемый нами штамм отличался от вше-

■ приведенных близких ввдов еозщьми дяаглоствчйсюшл признаками, МЫ СОЧЛВ ВОЗМОЖНЫМ выделить его В НОВЫЙ. BSW - Streptomyces Bala chi.toapi.nus spi nov. ■

Ш. Вцделение в очистка стимулятора згготообраэованвя^ синтезируемого Strepto«yces malacbitoaplnufi ВТ. 2Г7

Все этапа работы do выделению и очвотяе стимулятора вв-готообраэовандя ыуксровнХ гробов контролировала определением биологической активности выделяемых препаратов ишюсписашшм кетсдом.

После предглрятельнсй экстрацяи ацетоном патентов, ля-вадов я других соединений» на обладающая искоысЛ биологической' активностью, трехкратная обработка клеточных гомогенатов 6G& этвловш «шртои обеспечивала полно, извлечение активного па-чада. Свартовый экстракт концантрароваля до вязкой массы н

• после обработки абсолютным этиловым спиртш, абсолютным бфи--

, ром в высушивании получали коричневый акорфяый порошок. Хромо-, тогрзфпческое s электрофореtzчесиоэ рззделанае аа бумаге скстехах н-бутэыол - уксусная кислота - вода (4:1:5) а " н-дрешанол - этклэигтат * вода (6il;3) выявило кяегокогглбнейт--кость сслученного Cüpip. Биологической активность» сбладала ■фракция, довдая пиюзнтельнцэ реакции с шшгпдргном, реактивом Лоури-Фолгна. Hpñ электрофоретической разгонке 2 ауравьи- , ко-угвдонозаслсм буфере ipil 1,8) она двигалась.к кагоду в одэла иг « 0,37. Согласно этгм-дзшшм, актявяое начало было , отнесено к паягпевтэдзм и его дальпейпая'. очистка проводилась -мочифедарогакшаш кетодезии .'фракционирования пептидов.

Дктавиое веоество очвщалв от примесей с помощью ряда последовательных операций: ... ., ,

1. ХрсаатографироваЕЕв' на ДЙАЭ нелдшозе.

2. Хпо&атогра£йрование на лоняообиечноЗ смоле Sowese'50x1.

3.- Гэлъ-фальтр£ц?я через Софадекс 0-15;

4. Здектрофоретаческое'раэдедеме на бумага з муравьвно-уисуспоклслои- (рИ.Л,8) в этдлаце?атнам(рН6,5) буферах, . ,

5. Хрсюэтогра^ироганве в тонком слое Сефадекса 0-25.

6. Рвзделевае '1-етодом двек-электрофореза в слое'поли-зкрилэыядвого геля в алавез-ацэтатвоы буфере {рй 4,5). ■ -

Схема счистки препарата-сырца представлена на рво'. 2,.

Рис, 2. Схема очистки'стимулятора эиготообразове1шя

Сырец I

Аде очарованные вещества ;

1. Адсорбция на ДЗАЭ-целлплозэ

2. Зйюпяя водой, каоьвдэнноЗ СО^

Не аде орби ¡5ова якая фракция, сод. стимулятор

Концентрир. вакууью .

Сырец 2

Сахара, ароыетич. аминокислоты

Цоягех

1. Адсорбция на 50x1 -

2. Элшция сахароз

3. Злюция агшааком ■ пептидов

Фракдая ~~ оод. стимулятор

Концентрир. в вакуума

Сырец 3

Гвлъ-фидьтрация ва сефадекса б -15

сод. стимулятор

. Внсокомолек. * соединения и некот. аминокислоты

Кондантрир. вакууме

Сырец 4

Препаративный ал. ииридия-едетатном

орез на бумаге в буфере рЦ 6,5

Нвапявям фракция

Активна^ фракция

Злбцйя о бумаги д2стял. вод02

-то-.

Использованные"нэмз метода очистка позволили получить, соединение, стгмулврушее зэгстообразование. мукарОЕых грибов, в химически чистом воде. Вещество .представляло с об ей прозрач- ; ■ ' нас, плзстлЕпетиз крг тэллы, очень гигроскопичнее, легко груп-п::руловеся в кокглокератн.. Лрл баалогическом тестировала вы- ' деланного создвгеипя o6n3pj^ana его высокая ^ездслогичсскзя пктгвнэоть, которое проявлялась icaK в у^едЕчекка1количества ■ зигот, так 2 з сокрзцеш;!! сроков их созревания в 2-2,5 раза, I г поделенного препарата обладал биологической зкпшнсстыэ 110.000 условиях еданкц. Молекулярный гее поделенного пептида, -определенный кетодом сравнительной'тснкослоайой хрсмзтсгрефаи ' на Сефздексе с-25, был равон 3CGQ-3I20. Абсорбцпошше мзксЕиу-зш воглоссная выделенного соединения - 228 и 546 нм. '

После кислотного гидролиза (6 н HCl) в составе стимулятора было обнаружено II ам2нога: слот: лизап., ггетпдин, оргвкин, кетяопя;!, треония," серин, еланзн, валян, лайскн, тирозин,; > глутзкиновая кислота. ', ■ ' -

Расчет количественного содержания ашнохпелот позволил ...обнаружить несоответствий мевду величиной гргммолекулы и суммой ПОЛЯРНЫХ весов ВХОДЯЩИХ-В него аминокислот.; Дополнятель-ные исследования, провоженные методом атомпо-обсорбцлонного

анализа, выявила в состава стимулятор©,колачке кобальта в количестве 20 иг/г препарата'(рас. 3). Полный атойно-збсорбцяон-ныйшшдвз доказал отсутствае в составе ерапарата других кетал-лов^ КякроОкологвческяа ызтодсм било установлено, что кобальт прасутстЕОзал в стшуллторо зиготообразоваавя в состава Еобала.чзнз.

Результати дальнейших дссдедогаклй показали, что кобзла-]вин,.в частности 5,6-ДЕмзтЕДббнзашдозсд дазшсобала:.'.кн, внда-ввдуадъные аихиозхолотні а так їй яшнохяслоты в сі.:єси о яобала-мипсм, взятые с соотнесениях,, экЕЭвадентних их содержание в ¡аыделеннсм полйлептад-кобэламзноэом комплексе, кз обладала биологической оїсткеисстья (табл. 2).

° . ч . • Таблйцэ 2: . •

■ Зляялеє аминокислот и вктакипа В12 иа зяготообразозсяае Кїусопусва ЬІеївБІееолиз. ' ^

BapDoiiTu опта Чхало зкгот кз І си4 Зиготообоазозагіие Kffi'TfKTKo^ в од оо я_(г % к

Контроль ■ - '37,6 > 1.6 .. . ЮС

Ь.;зсв аманонислог 45,0 + 1.8 . ■119,63 -

?І2 " ■ ' ■ 44,0 £ 1,73 ^ ' 117,С2

Cwecfc спас лот

■ 43 ,¿1 + 1.4 122,37

Стдаулятор 3,3 . *

120,3 4І. 319,05

Получений да:::шс сгпдєтольстеоїїулз о їси, что, ао-пзр-гих, сах кетабоянт.предотаЕдпзт-собса ксбакзд, то єсіь ito:a-лзкс лсиишептидз с кобакаыпно:; е, ре-вторах*. функциональней активностью обладает перагрусекшзл молекула в.чдсдэ::яого метаболита,- '■■■■■,".'

■ 17. Сравнительное изучение стЕмулкторсэ■гвготсоОразоза-■.■-.:.' нал,синтезируемых Stroptoa'yccs ^iilachitoJjiii-Auj СТ. 2X7} Stieptoayces olivacaus З V

. ■ Kaie известно, июгае окткноцкцзть*, ссобвшго актинах::: цз-

tu оляековоя груші«, квл.51л-0я сі!іггсткка«3 кобйдііиииов, xx

кознземнііх форм я других кабакидных всияпексов,- обладаоэдх Се од отческой йктиеностьп. Учитывал вто. обстогйельгтас/-. пред-

\J

JÜIaJ

K'Z

' ■ о --7-- П * 5 6

Pío. 3* Количественное содержание кобальта (Со) в

■ . Ывтабодятах ИЗ , StreptQBjcee malachítoaplous ШТ. 217 (3) я Streptbœycc3 olivsceuc шт. 3 (2), полученные на етомяоабоорбцвокяом спектрофого-. метре "Спектр I". Для анализа был взят 0,1% р~р . стимуляторов, а также растворы 5 шг/мд (X; 4); X мкг/мл (5); 0,1 икг/мл (6).

TÍX

Рве. 4* Абсорбционные максимума поглощения метаболитов ^ 13 Streptofflyeee malachltosplmia ВТ. 217 ti), Stre¡-toicyees о 11 vece us ОТ. 3 (2).,

ставлялось ЛОГИЧНЫМ проверять способность S.olivaceus ЕГТ. 3 - синтетика кобаламинов, продуцировать метаболита, влкяшде на ввготообразование грибов. Яри биологическом тестировании бало обнаружено, что данный организм при росте как на простых синтетических, так в на сложных органических средах синтезировал метаболит, действие которого аналогично действию изученного намя ропсе ооединения, выделенного ИЗ z'. maleehj.t03pln.un.

Пэтаболит S.olivaceus был выделен, очевдн по разработанной наыя ранее для S¿malachitospinus cxeue в получен в хд-ыячесыг чистом виде. Сравнительный анализ ыатьбслитоэ, выделенных ИЗ S^ olivaceus » S. mal achitospiD.ua Показал, ЧТО сэу-чбеше соедаЛнея аналогичны по зсвтческшу строена» л представляют собой"комплексы полипептида с кобаламином, обладавшие

ОДВН0КОВЫМЛ Х^МІЧеОКИМа 2 ^ИЗВКО-ХИИВЧеСКИКИ CBOÜCTtJMB

(ігайл. 3; ряс. 4).

' Тайлвда 3 Фгзяко-хеьзчєскеє свойства сгпцудяторов знготообразова-Ш)Я* выделенных Ba Streptomycea ttelachitoapiima st. 217 а Streptonjcfta oliveceua тт. З

Характеристика > ■ - заболит, Метаболит, ■

виделенЕша из . ІИДЙЛЕЯНЦЙ КЗ є -■ SVaolachfco - СТоіїтґйСввд . splnua -

ЗЕ0-ЗІ20

228,546 .

19,9 иг/г

0,39 г/г

вояз, свярт , до'705

0,37

0,4-і

II оіі;шокпог.от

гя грсс к она ч ішЙ

устойчив Dpa иагрсренвя до £0° .

1. КолекулдрнкЙ ЕЄС 3CQ0-CI20

2. Л або. .. 22ü, 54С

3. Содержание кобальта <Со)- 20 иг/г

4. Содержание коСавдда • 0,36 г/г

5. Растворимость - вода, спирт

до TOS

6. Kf на электрофореграоде

в пиридин-ецетатком буфере 0,37 , , .

7. Ef прк диск-электрофореза • ■" в алгяпп-ацетотном öyfepe 0,44

' 6. Лыинскиелотный состав

полипептида 'II оииноотслот

9. Пігроскопичноотв гигроскопичней

10. ТермостоСкльнооть ' устойчаз при

' V :. наггеевїЗЦ .

Такгм образом, по овочм хкми ч о с ким, физпко-хкмическзыи- / биологическим свойствам стимулятор юзз^ ■ оііузсвиа оказался ' идентичном с табулятору зиготообразоваЕзя мукорових грабов, вы- • ■деленному ИЗ 3. ваІвсЬНюврід-аз. ' .■'"""*.""

У." Динамика накопления стимуляторов зиготообрззования, синтезируемых 3 ігер-Ьовус в з паїасЬіЛозрітіе шїі 217 ■ а" Stгëpt;oшэ'cвз оііїасетіз ыт."3

При Ее следовании данемпка развития шаіасіїіїозріїта и ■ , ЗІоІЗлгасеиз . в синтеза кмв стимуляторов зпготооброзоваявя му- , корових грабов било установлюноі что физиологически активний метаболит свяГезвруется культурой в Фазе максимального накоп- -' ленвя 'биомассы в мошт быть отнесен ко вторичным метаболитам, согласно терошологва Булохка £ воьоск, 1965) (рис, 5, 6).

■Изучение роста З^ипіасьі^озрілиз ікс. 217 и з. оіітгасвиз аі. З яа соответствующих,средах без дополнительного внесенні кобальта я с внесением его в,виде СоСі^ -бИ^О (15 мг/л) показало, чти колкчесті.о_ биомассы и уровень накопления кобалаии-яов бал выпе на средах, обогащении* кобальтом (ряс, 5, 6), Из рис.-5 и 6 видно, что биосинтез.ондулятора был сопряжчн-. во времена о синтезом кобалаивнов, причем макссыу» накопления последках опережал-изковвди накопления стимулятора, Ыицелий культура, выроае.чкойна среде, обогащенной кобаїчітш и харак-. торазовавяийся повышенный уровне» синтеза кобаламішов, содержал большее количество «етабодита,. чей иицзлвй культуры, растущей ка среде без* добавки кобальта..

Таким сбпззом, полученные данные с е аде те лье тв овали: о; т оы ,. • что скнтоз стимуляторов;звготообразования имел не только вре-. ценную, но причинную,зависимость от синтеза.добалаывнов у обеих изученных культур.1 .... : • . ■ . .

УІ; Биологическое действие стимуляторов звготообразова-. ния мукорових грибов, синтезируемых актидомадатами ■

Исходя вэ того, что половые процессы-у различных ыухоро-. вше грибов аналогичны как по смене половых реакций, т?ж и по ' -* , природе'гормональных факторов их контроляр^ідах, мохно было''1ч-' предположат!-, что выделенные нами соединения могла обладать ■ РислогіічсскоЯ активность» ые только в отнопениэ осноеного тсст-^б-гёкта Иіу»5оісус*й ЫакезХеоализ, :но а в.. отношена 2 других

ст» 2X7 »a среде без Co Ipso. 5) а о Co ■ 'ipse. 6) п синтез ву ^аггшюгдчаокя активна . соедакэш;Я:

'I. Sec оухей ¿и ока ecu, r/IOC ил. . 2. Содержание когалэыинов в культур«, -

tau71C0 на, среди. ■ ' .3. Содержание кобалйыанов в кицслкя,

,}■. ккг/г сухой спсмзсса. '.- 4. Сод орган:; о ^зтэЗсллта в шдадзя, . : , усл. сл./г сухой (Зясиавск. '

s - Для - ¿цуасвчг-ролучека. бкалогзчная зэгиоггпостк,.

' , i . -16- Л.

- представителей мукоровых грибов. -Эксперкм нальяыё данные, подученные нади,. подтвердили это положение Стабл! 4). .

, Таблица 4 Влияние, изучаемых, полипептяд-кобгиидных комплексов» . £цделея:щх ИЗ Streptcruyoes malachitOSpiBUS шт. 2X7 b 1 • . wíreptomyces olivecfus - их. 3 на зиготообрезоззние некоторых представителей порядка ifttcorale3.

i

Испытуемые Число зигот^, сформировавшихся под воздействием организмы ■ стпмтлятсрор. р оделенных. из

- Контроль S.n«1achitospiaus S. olivaceus'

'" . ... ,,. 200 Л'кг 20 ratr gQO ьжг 20 ь-кг ,

blalceslftsaiiua 32 . 107 60 100 71

líucor nacido- 18 v 40 . ' . ,28 48 23

Absidia bublerl 262 489 372 499 . 419

JLbsldla . ©rebidis 634 ЭЭ6 793 '1263 ; 706 '991

Blakeslea trispoi-a 392 . 688 578 G79

ж - Число ЗИГОТ у культур . Р^усоэусёа .и ¡Jucoг -подсчитывали по разработанному пами методу, у юльтур

A.cutleri, ' A.orchidis, В.trisрога - ВО Методу, предложенному С. М.Боб Не coít (Бобнева и др., 1972).

Ьйкроакопичесхим анализом было установлено, что морфологически действие выделенных нами метеболитов проявлялось только на стадиях дифференциации гаметапгвев - плазмогамии, не затрагивая более ранних стадий полового' процесса муроровых гра боз. Внесение метаболитов на более ранних стадиях развития тост-объекта, определяющих возможность и активность синтеза ¿олоЕых гораоков,-а ^именно: вмест"1 с. посевнш материалом: (.споровый инокулят), на стадиях образования вегетативного-мвделвя ' в образования вторичного розеточного ыипычя не двла> заметного физиологического аффекта. С другой сторона, проверка.физиологи ■ ческого действия метаболитов на стадиях формирования: а созре-ьання плодовых тел также не дала цолскительких результатов. ,

Внесение яг В0 контактную полосу (+) м ■(-) вариантов Fhycot^ces blakesieeanus ■ в интервале временя от нэчала ¿ор?.п!рованля зигоспор до их окончательного созревания не выявило стимуляции'v зиготообразования ни в количественном относенап, нв по сокращении ■ сроков. , , ,,

4 Таким образом, выделенное из актзіномиштов'¡«таболмы не являлись ни гормонами, нв индукторами синтеза гормонов. Их ста- . ыулирувцее действие проявлялось только на стадиях, начавсахся ■ после действия половах гормонов в связанных с кардапальника . биохимическими перестройками ядерного f,:a терзал?, а именно,- на стадиях дифференциации гем^тангиев к, возможно, пла змога (¿пи. -

Согласно гипотезе Хепдсл ( Hepdsn,I9GI); при дифференциации гзметзпгяев грибов родайм. гopus повышенный синтез в них аШС сопряжен ^перестройкой нуклеотидов РНК в нуклеот-чды J5K (кедаїиіз:^ процессов которой достаточно хорсіо известны) дли. о процессами образования нуклеотидов ДНК a« r.ovo при участии кетилтранс^ераз и доноров ыетзлышх групп. Пнгибвруюшее деіїот- ■ вив холодных температур на дз^ферелциадао гакетавгиев*в проводнице Хепдон опытах объяснялось авторсм как урмокеипе инициация процессов перестроят; пуклеотидов. Предпг .агая участие изучаемых нами метаболитов в этих ресчцдях, ш иолучкла некоторое денкцє, на' нйш взгляд, гпдтьар?д ащие гипотезу Хевден.

ЗырагаеЕяие на плотнкх средах методом, встречного роста 1 культура иукорогнх грибев гри переносе ex па стадии дилере к цноцги гз;*етанг^нь (3 сут::е) в кизкотемпсуотуркае услсрпя (I и Ю°С), настолько резко ммздляли дальнейшее развитие, что образование единичное нелкгыгктировзшых незрелых зигот нгбли-* -далось только через I3-IS дней. При переводе этих культур б условия нормальной физиологической те гелера тура процесса половой ре продукта воэЕрэсалЕоь к норме. В:іесензе изучаемых, метс-болатов на стадии формирования гаметапгкев снимало Енгибсруж- . две дайствио "низких теїтератур. В варианта о впасене:; ста'у-■лятора дэг® при температура Ю° нэ'5 сука роотзхнаблюдалось. зн-'чатвлънов количество' образовавшихся, но неіжгідентчрсв&шіух -зигот. Количество их бнло такту «е, как в вариантах роото грл-68 при нормальной фазислсшческоЗ температуре (20е), _ сО-40 зигот/см^.. Однако но-с роки окончательного согревания гигст з данных условиях сткл'улятор не оказывал влкян^я., Исходя из ,

r ю . _

собствешшх експе ргмецтальяцх я литературных дапйых, мы сочли возможным выдвинуть гипотезу о вероятном учэотии КОбеЫЕДПЫХ4 ' комплексов изучаемого типа действия в процессах биохлмичеокой

ТрВЕСфОриЗЦЗЗ ЯУКЛв Е КОВЫХ КЙОЛОТ, ООВрОВОВДЙЕЩДС ДВффврвШрВ-

вдо гематангаав или плазмогамию. •

' . ВЫВОДЫ

I. Разработан метод биологической видиками микробных метабодитов-стЕмуляторов эиготообразования мукорових грибов* • Метод позволяет де$$вреяцзедьво виявлять соединения гормонального типа дейотввд или ицдуцаруадие гормонообразование гриба в соединения.на гормональной' природы, специфически стимулирующие подовоЗ процесо мукорових грибов на отадвях, начавшихся после дейотввя гормонов;

2» При отборе актикомицетов-продудентов специфических. стимуляторов зи г от ообрэ э овэ газя было обследовано 780 пташов Накбсдее активный продуцент отнесен к новому виду streptomyc«ß

malacbltospluus ер. i)ov.

З» Пра изучения динамики роста «.развития продуцента-streptoojrcea malachltoapiaua шяоноио, что изучаемый метаболит образуется в фазе максимального накопления биомассы.и его синтез- сопрваен с синтезом культурой кобаламинов. Способность - вроду шроЕЗХь. метаболиты, стимулирусщие э и г от оог^аэ ованве мукорових гргйоэ» была обнаружена также у streptomyces oiivaceus активного» сзктетжса кобаламанов.

. 4. Стимуляторы зиготообразования мукорових грибов, синтезируемые культурами Streptongrces malachitoapimia В ßtrepto-. tnycöii oiivaceus - бала выделена в химически чиотш виде* . Цдентифаяаіля выделенных соединений, проведенная на основании химических и фазвко-хнмвчеoKidx характеристик» п<жазале их -идентичность и Позволила отнеотв вти метабсли: і к классу кобамидов.

5. Биологическая активность изучаемых стимуляторов ввго-. тообразования мукоровых грибов проявлялась ври действия их на стадии образования ирогаметакгиев и вырасвлась в увеличении количества зигот на 200-3002 при одновременном оокраиепяв в 2-3 разе сроков их созревания.

По матерпедаы диссвртеЯви опубликована следующие работы: L. Козлова А.а.»-КсмарОЕ8 ГЗ., Эль-Рвгдотзв Г.!?., Кра-свльндков H.A. Изучение метабсишто» аят^вомиоэтов, влияших 0а подовую функций гьусотусос blelcealeesniie. ДАН, 1971, 1. 2UO« « I« О. 230-233.

• 2. Комарова Г.В., Козлова А.Н», Оль-Пэгистэн Г.И., Егорова С.А., Красальшжов H.A. Культивирование гъусоиуоед Ыа~ ieoleeaßua - при изучения долевого процесса. Кинробволопзя, 1972, т* 41, вып. X, о. 93-96.

3. Эль-Регветан Г,И.» Козлова А.Н., Коноза Ю., Комарова Г.В., Духа М.В. и Красильнаков, Н.д. Биохимические фэкторн, влияющие на сексуальный процгео рьувотусеа blaS«eleeanus.

Т Всесоюзная конференция по регуляции биохимическая процессов у микроорганизме® (Дувшяо-на-Оке, 10-23 декабря •

Тезисы докладов, 1976, о. 192-194,

4. Козлова A.B., Ясяоад И.В.Эл^-Ввгасгак Г. И., Комэро-Дуга М.В.» Кислова Л.М., Храсидькиков H.A. Метаболит

Actinomyoeo olivaceua, стимулирусщий эиготообраэовоялв {Здоо-аусез MmWesleeanus. . Кдкробисиогия, 1973, в, 42, Л 3,. О. 550-552, •

5. Преображенская Т.П., Терехова Л.П., Козлова А.Н., Егорога С.А. Образование с A«tinonorcee malecbi-tosiii.n'us ср. nov. §щэзслоггчэскя активного вещества, отвиулируидего формирование зигот у micoralesu Шкробаологая» 1975, т. 44, вши 4, о. -544. ' ■ ■ .

6* Эль-Рагистан Г,И., Козлова А.Н., Комарова Г.Е., Дуга М.В., Комарова Г,В., Копова И.В., Красильнсков H.A. ■Вкгянже метаболитов актвноывхдатяого врои^хогдения на некоторые стадия всиового Процесса «укоровкх грибов. - В сб.: Биология Лучистых грибков. U.i Наука, 1Э75| о.ХЗО-151»

т-шза от 15.0.&1. Заказ ä-Нв Тире* ISO Формат COxBWlQ

Тшюгрвфия ВАОХНИЛ Б. Хлгияшьеюквй в*р л 2>