Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование хитин-глюканового комплекса в процессе онтогенеза Aspergillus nigir V. Nieghem

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Немцев, Дмитрий Викторович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 582.288.4:577.114.7

НЕМЦЕВ ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ

ОБРАЗОВАНИЕ ХИТИН-ГЛЮКАНОВОГО КОМПЛЕКСА В ПРОЦЕССЕ ОНТОГЕНЕЗА ASPERGILLUS NIGER V. Tieghem

03.00.24 - микология 03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

проф., докт. биол. наук. Елена Петровна Феофилова

МОСКВА - 1998 г.

Оглавление

Введение.......................................................................................5

Глава I. Обзор литературы.....................................................9

1 Структурные полисахариды клеточной стенки грибов.................9

1.1. Строение и состав клеточной стенки мицелиальных грибов............9

1.2. Хитин грибов: биосинтез и основные отличия в физико-химических свойствах от хитина ракообразных................................................ 12

1.3. Хитозан грибов.......................................................................15

1.4. Глюканы грибов......................................................................18

1.5. Хитин- и хитозанглюкановые комплексы грибов........................ 20

1.6. Использование хитина, хитозана, хитозанглюканового комплекса

и глюканов в практике...................................................................21

2. Изменения в составе липидов в процессе онтогенеза мицелиальных грибов.................................................................23

2.1. Состав липидов грибов: отличия и сходства с прокариотами и высшими эукариотами..................................................................24

2.2. Изменение в составе липидов грибов в процессе их роста и онтогенеза..................................................................................28

2.2.1.Изменения в составе липидов в процессе прорастания спор......28

2.2.2. Изменения в составе липидов в процессе роста мицелия и

при переходе мицелиальной формы в дрожжевую..........................29

3. Изменения в углеводном составе цитозоля клеток грибов в

процессе онтогенеза...................................................................31

Экспериментальная часть...... ....................................34

Глава II. Материалы и методы исследования.......................34

1. Объекты исследования...........................................................34

2. Методы культивирования микроорганизмов............................34

3. Методы исследования.............................................................35

3.1. Методы электронной микроскопии.......................................... 35

3.2. Биохимические методы анализа................................................35

3.2.1. Исследование липидного состава грибов.................................35

3.2.2. Определение углеводного состава цитозоля клеток грибов...... 36

3.2.3. Получение ХГК и анализ его химического состава........................37

Глава III. Результаты исследования и их обсуждение...............38

1. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования...............38

1.1. Изучение морфологии поверхности мицелия A. niger и строение его клеточной стенки..............................................................................39

1.2. Разработка метода получения ХГК из биомассы A. niger, полученной целевым назначением....................................................43

1.3. Разработка метода определения степени деацетилирования полиаминосахаридных комплексов.....................................................44

1.3.1. Условия гидролиза ХГК.............................................................45

1.3.2. Определение ацетата в гидролизатах ХГК методом ГЖХ..............45

1.3.3. Определение содержания N-глюкозамина..................................47

1.3.4.0пределение степени деацетилирования ХГК..............................47

2. Изменения в содержании хитина и глюкана в ХГК в зависимости от состава питательных сред..........................................................51

3. Образование ХГК и изменения в углеводном и липидном

составе клеток A. niger в процессе онтогенеза...............................55

3. 1. Прорастание конидий и факторы, влияющие на этот процесс..........56

3.2. Изменения в составе опорных полисахаридов КС и углеводов цитозоля мицелия в динамике роста A.niger........................................58

3.3. Изменения в углеводном составе цитозоля клеток в I и II фазе спорогенеза в связи с образованием ХГК.............................................61

3.4. Углеводный состав цитозоля зрелых спор в связи с образованием ХГК...........................................................................63

3.5. Состав липидов клеток A. niger в процессе онтогенеза в связи с образованием ХГК............................................................................64

3.5.1. Липидный состав спорА. niger, находящихся в состоянии экзогенного покоя.............................................................................65

3.5.2. Состав липидов мицелия A. niger...............................................67

3.6. Корреляции между образованием структурных полисахаридов КС и составом липидов клеток и углеводов цитозоля в процессе

онтогенеза А. тдег.........................................................................68

4. Разработка способа получения ХГК из мицелия А. тдег, являющегося отходом при производстве лимонной кислоты.........70

5. Обсуждение результатов исследований.....................................73

ВЫВОДЫ...................................................................................-78

Список литературы.........................................................................80

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Клеточная стенка грибов(КС) является поверхностной структурой клетки, выполняющей важную роль в ряде общебиологических процессов ( морфогенез , репродукция, межклеточные взаимодействия, трансдукция сигналов , анабиоз и др.). ( Феофилова, 1974; Lezica, Quesada-Allue, 1990 ) Основными соединениями КС грибов являются полисахариды, которые разделяют на две группы : I -структурные компоненты и И- соединения , заполняющие пространство между ними ( Cabib, et. al., 1988 ; Farkas, 1990 ; Gooday, 1990)

Структурные полисахариды (СП) представлены у высших грибов разветвленными глюканами, имеющими ß-(1 3), ß-(1 ->• 6) -связи , и поли-аминосахаридом хитином. В клетке грибов СП образуют хитин-глюкановый комплекс (ХГК). Не так давно этим биополимерам приписывали только опорную функцию. Позже установили, что СП контролируют процессы морфогенеза, в частности форму клеток грибов, участвуют в регуляции осмотического давления, иммунного ответа, устойчивости к лекарственным веществам, гидрофобности мицелия, фототропизме и даже функционировании липидного бислоя (Феофилова, 1983; Farkas, 1990; Ruiz-Herrera, 1991; Gooday, 1994). В КС грибов СП связаны также ионными и ковалентными связями с липидами, участвуют в регуляции синтеза ряда фосфолипидов ( Machida et.al., 1994) и, возможно, влияют на состав углеводов цитозоля, в частности на уровень трегалозы (Borgia et.al., 1996). Поэтому исследование изменений в содержании и составе ХГК может дать необходимую информацию для понимания процессов морфогенеза, липидообразования и состава углеводов цитозоля мицелия при действии стрессовых факторов.

ХГК заинтересовал в последние годы исследователей и с практических позиций , особенно у представителей порядка Eurotiales ( род Aspergillus ). Из этих грибов получают комплексы глюканов с полиаминоса-харидами , которые представляют интерес для медицины, сельского хозяйства , являются адгезивами и высокоактивными сорбентами ионов радиоактивных и тяжелых металлов (Pennesi, 1993; Maeda et.al., 1995).

Несмотря на важное теоретическое и практическое значение исследования структурных полисахаридов КС аскомицетных грибов, очень мало данных об условиях их культивирования, позволяющих интенсифицировать синтез ХГК, динамике образования этого комплекса и о коррелятивных связях с другими клеточными компонентами в процессе онтогенеза микроми-цетов. В этом плане наибольший интерес представляет исследование взаимосвязи между образованием ХГК, липидным и углеводным составом клеток грибов в связи с новыми данными о том, что активность хитинсинта-зы [Е.С.2.4.1.16] регулируется фосфатидилинозитом (Machida et.al., 1994) и некоторыми углеводами цитозоля грибов. Поэтому в настоящем исследовании были поставлены следующие задачи.

Цель и задачи работы. Основной целью работы было получить новые данные об изменении в составе и содержании структурных компонентов КС Aspergillus niger в процессе онтогенеза. Помимо вклада в наши представления о поверхностной структуре клетки грибов, полученные результаты будут также иметь и практическую значимость, так как позволят контролировать состав полисахаридных комплексов аспергиллов и интенсифицировать синтез этих соединений. Для этого необходимо было :

1) разработать способы получения ХГК из A. niger, выращенного целевым назначением , а также способ определения степени деацети-лирования полисахаридных комплексов;

2) изучить влияние условий культивирования , а именно, различных ингредиентов питательных сред на образование и состав ХГК и степень его деацетилирования;

3) исследовать изменения в составе и количестве ХГК в процессе онтогенеза A. niger. Выявить зависимость между накоплением полисахаридных комплексов и углеводным и липидным составом мицелия (составом углеводов цитозоля , мембранных и нейтральных липидов , а так же их жирно-кислотным составом ) в процессе онтогенеза гриба;

4) разработать способ получения ХГК из мицелия А.тдег, получаемого как отход при производстве лимонной кислоты на Белгородском заводе АО "Цитробел".

Научная новизна. Впервые установлено ,что количество ХГК и его состав , т.е. соотношение в нем глюкана и хитина меняются в процессе онтогенеза А. шдег. Наибольшее количество ХГК определяется в спороносцах и погружено растущем мицелии, находящемся в стадии идиофазы. Обнаружены изменения и в составе структурных полисахаридов КС: наиболее богат глюканами мицелий А. гндег, больше хитина определяется в спороносцах и спорах. Получены новые данные, показывающие , что ингредиенты среды определяют количественный выход ХГК и его состав .Так, наибольшее содержание ХГК можно получить на среде с сахарозой и неорганическим азотом; на этой же среде А.шдег образует больше хитина (0.6 г/л). Напротив, ХГК, обогащенный глюканом, образуется на богатой азотом мучной среде ( выход глюкана -1.13 г/л).

Впервые установлено существование определенной зависимости между составом ХГК и морфологией колоний грибов: если в ХГК содержится больше хитина, то образуются более крупные пеллеты, а увеличение доли глюкана приводит к образованию более рыхлых колоний. Впервые показано, что наибольшее количество полисахаридов определяется в КС клеток, имеющих определенный углеводный и липидный состав , т.е. содержащих больше трегалозы, насыщенных и легкоокисляемых фосфолипидов и триа-цилглицеринов. Исследование коррелятивных связей между составом клетки гриба и накоплением ХГК в процессе онтогенеза показывает, таким образом ,что накопление в КС структурных полисахаридов связано не с активно метаболизирующими клетками грибов, а с таковыми, переходящими в покоящуюся стадию.

Практическое значение. Разработаны оригинальные методы выделения ХГК , являющиеся экологически более безопасными, чем существующие. Методы позволяют получать ХГК из мицелия А. тдег, выращенного как целевым назначением , так и непосредственно в условиях завода ,

как отход при получении лимонной кислоты. Разработан также метод определения степени деацетилирования ХГК. Выявлены условия культивирования А. тдег, позволяющие получать наибольшие выходы ХГК и контролировать его состав . Получено решение на выдачу патента "Способ получения ХГК" ( N 95110112/13(01784).

Апробация работы. По материалам диссертации сделаны доклады: 1) на IV Всероссийской конференции "Производство и применение хитина и хитозана"; 2) на заседании лаборатории "Экспериментальной микологии" Института микробиологии РАН; 3) на заседании кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В. Ломоносова; 4) на научной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 1996 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы. Получено решение на выдачу патента 95110112/13(01784).

Глава I. Обзор литературы.

I. Структурные полисахариды клеточной стенки грибов.

1.1. Строение и состав клеточной стенки мицелиальных грибов.

Клетки грибов отличаются значительным разнообразием формы - это, например, мицелий (цилиндрические клетки), зиготы, конидии, аскоспоры, хламидоспоры, спрорангиоспоры. Морфология грибных клеток, в частности их цилиндрическая или сферическая форма определяется их полисахарид-ным скелетом, образование которого зависит от ориентации ростовых процессов. Другими словами от того, как идет отложение вновь синтезируемых полисахаридов, зависит сферическая или цилиндрическая форма клеток. У последних основная синтетическая активность сосредоточена в кончике гифы (апикальной части). Превращение относительно пластичной, образованной на кончике гифы клеточной стенки (КС), в устойчивую прочную структуру с латеральной стенкой является градиентным процессом, скорость которого определяется диаметром гифы. Если синтез клеточного материала идет быстро, растущие гифы имеют меньший диаметр. Как отмечалось выше, углеводы являются основными компонентами КС, они представлены полисахаридами и связаны с белками,, образуя гликопротеины (Wessels, Sietsma, 1981).

Полисахаридный состав у различных представителей грибов может сильно отличаться, но все же компоненты КС можно разделить на две группы. Это - структурные компоненты (1) и компоненты, заполняющие пространство между ними (2) (Cabib et.al., 1988).

Первые представлены полиаминосахаридами (хитином, хитозаном) и глюканами, имеющими ß—(1—>3), ß-(l-»4), ß-(l-»6) связи. Вторые являются маннопротеинами, галактоманнопротеинами, ксиломаннопротеинами, глю-курономаннопротеинами, и а-(1-»3) глюканами. Кроме этих биополимеров в зависимости от видовой принадлежности этих грибов в их КС могут присутствовать специфические соединения. Например, в КС высших грибов, в частности Shizophyllum commune обнаружен гидрофобный белок (гидрофобии), богатый цистеином (De Vries et.al., 1993). Интересно, что гидрофобии

присутствует только в воздушных гифах, и его нет в гифах плодовых тел и в мицелии, растущем в погруженных условиях. Наиболее существенной химической характеристикой этого белка является способность экстрагироваться из КС холодной муравьиной кислотой. В КС мукоровых грибов присутствует уникальный гетерополисахарид, в состав которого входят в основном уроновые кислоты, фукоза, галактоза, манноза, получивший название мукорана (Феофилова, 1983). У S. commune присутствует полисахарид шизофиллин, обладающей выраженной противораковой активностью (Sietsma, Wessels, 1977).

Отдельные компоненты КС могут быть связаны друг с другом кова-лентными связями, например, ß- глюкан с хитином, или ß- глюкан с манно-протеином (Zlotnic et.al,, 1984). У дрожжей S. cerevisiae терминальный остаток прикреплен восстановленной хитиновой ß—(1—>4) связью к не восстановленному концу молекулы ß—(1—>3) глюкана (Kollar et.al., 1995).

У дрожжей 40-50% хитиновых цепей связаны с глюканом, а соотношение хитина и глюкана составляет 1:10. Возникает интересный вопрос, который связан со свойствами хитиновых цепей. Каким образом такое небольшое количество хитина влияет на солюбилизацию 70% глюкана в горячей щелочи? Оказалось, что это зависит от различной длины цепей хитина и глюкана, у последнего длина цепи около 1500, а у первого - около 100. Таким образом, относительно небольшое содержание хитина может влиять на свойства глюкана, который в дрожжевой клетке превышает содержание хитина почти в 10 раз (Kollar et.al., 1995). Интересно, что в процессе образования ковалентной связи между хитином и ß-(lH>3)-mraKaHOM принимает участие фермент Chs3, что молекула хитина первоначально связана с растворимым глюканом, который является предшественником нерастворимого глюкана, и что хитиновая цепь растет с восстановленной части полимера, и эта только что синтезированная цепь переносится на глюкан (Kollar et.al., 1995).

Кроме ковалентной связи между хитином и глюканом, последний через более слабую связь (ионную) может быть связан с белком, образуя про-теинглюкановый комплекс (Hunt, Hixon, 1981). Интересно, что у насекомых и

других беспозвоночных хитин всегда связан с белком либо ковалентными, либо нековалентными связями, образуя упорядоченную структуру (Aruchami et.al., 1986). Единственное исключение составляет в этом отношении (3-хитин диатомовых водорослей (Gooday, 1990).

Хитин может быть минерализован, в частности кальцинирован, или склеротизирован, благодаря связям с фенильными (в белке склеротине), а также с липидными молекулами (Peter, 1986). Отметим, что наиболее высокое содержание Са2+ - в панцире краба Cancer magister, наименьшее - в КС мукоровых грибов (Феофилова с соавт., 1994).

Хитин связан так же с пигментами, присутствующими в КС грибов - с каротиноидами (¡3-каротином, ликопином) и меланином. Этот черный пигмент расположен большей частью на поверхности КС. Он соприкасается с наружной частью хитинового слоя, образуя своеобразные вкрапления, наиболее глубоко проникающие в КС (Феофилова, 1983).

У мукоровых грибов внутренний слой КС содержит хитин и хитозан (полностью деацетилированный хитин). В связи с этим интересен состав КС оомицетных грибов. У этих организмов хитин присутствует в очень незначительном количестве. Поэтому в более старых работах можно прочитать, что у Oomycetes вообще нет хитина (Yamada, Miyazaki, 1976). У этих грибов основную часть структурных полисахаридов составляет целлюлоза, а (3-(1->3) и р—(1—>6) глюканы составляют аморфный слой КС.

Помимо эти�