Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Почвенные алкалофильные и ацидофильные актиномицеты

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Почвенные алкалофильные и ацидофильные актиномицеты"

На правах рукописи

Селянин Вадим Валерьевич

Почвенные алкалофильные и ацидофильные актиномицеты

Специальность 03.00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук Г.М. Зенова

доктор биологических наук Л.П. Терехова доктор биологических наук"" А.Н. Лихачев

Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится "_"_2005 года в 15ч

ЗОмин в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета К5О1.ОО1.О5 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан "_"_2005 г.

Приглашаем вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах просим направлять по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Г.М. Зенова

Актуальность темы

Почвенная кислотность является важным физико-химическим свойством почвы и зависит от многих факторов. Она может влиять на почвенные микроорганизмы двояко: непосредственно на внутреннюю среду клетки или косвенно, путем изменений во внешней среде. Разграничить эти две формы влияния удается редко. Долгое время полагали (Стейниер и др., 1979), что из основных групп почвенных микробов устойчивостью по отношению к кислотности обладают грибы, в то время как большинство бактерий (кроме экстремально ацидофильных) и актиномицетов чувствительны к кислым условиям (Alexander, 1964).

В 70-е годы группе американских исследователей удалось выделить и изучить коллекцию культур актиномицетов, способных расти в кислой среде (Williams etal., 1971).

В настоящее время возможность существования актиномицетов, способных расти в кислой или щелочной среде, уже не вызывает сомнений (Yallop et al., 1997), изучены их свойства и особенности (Mikami et al., 1986; Wang, Ruan, 1994; Groth et al., 1997; Horrein et al., 2004), однако об экологии этих мицелиальных прокариот по-прежнему известно немного.

Вопрос о месте и роли актиномицетов в почве весьма актуален. Изучение почв на территории России (многие из которых по естественным или антропогенным причинам являются кислыми или щелочными) должно предполагать рассмотрение характерных представителей микробоценоза данных местообитаний.

С другой стороны, изучение почвенных ацидофильных и алкалофильных актиномицетов несомненно представляет интерес для биотехнологии. Поиск продуцентов новых антибиотиков и ферментов с особыми рН-оптимумами действия, применение популяций актиномицетов для биоконтроля и биоремедиации, борьба с фитопатогенными грибами-практические задачи, для решения которых знания об ацидофильных и алкалофильных актиномицетах могут быть весьма ценными.

Целью работы явилось исследование экологических особенностей ацидофильных и алкалофильных актиномицетов и их места в комплексе почвенных мицелиальных прокариот. Задачи исследования

1. Разработка селективных методов выделения и учета ацидофильных и алкалофильных актиномицетов в кислых, щелочных и нейтральных почвах,

2. Сравнительный анализ актиномицетных комплексов, выделяемых на подкисленных, нейтральных и подщелаченных средах из почв и антропогенных субстратов с разной актуальной кислотностью.

3. Оценка радиальной скорости роста выделенных из почв ацидофильных, нейтрофильных и алкалофильных актиномицетов при различных значениях рН среды и построение на основе данных о радиальной скорости роста кривых толерантности исследуемых культур актиномицетов в отношении кислотности среды.

4. Изучение особенностей дифференцировки мицелия нейтрофильных и алкалофильных актиномицетов на нейтральной, кислой и щелочной средах.

Научная новизна. Впервые установлены закономерности распространения ацидофильных и алкалофильных актиномицетов в широком ряду почв и определена таксономическая структура их комплексов. Установлено присутствие значительного комплекса алкалофильных актиномицетов в щелочных почвах, подтверждена приуроченность ацидофильных актиномицетов к кислым почвам. Алкалофильные актиномицеты представлены в почве родами 8(гвр(отусв$ и М1сготопо8рога. Установлен диапазон значений рН среды, пригодных для роста почвенных алкалофильных, ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов. Впервые выявлены особенности дифференцировки мицелия алкалофильных актиномицетов на щелочной среде: высокая скорость освоения субстрата (высокая радиальная скорость роста) наряду с ускоренным спорообразованием, уменьшение значения рН среды культурой алкалофильного актиномицета до нейтрального при росте на щелочной среде.

Практическая значимость. Установление экологической ниши алкалофильных актиномицетов важно для расширения наших представлений о биоразнообразии микробного комплекса почв. Знания об особенностях распространения и жизнедеятельности алкалофильных актиномицетов могут представлять существенный интерес для биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ по проекту 03-0448324

Апробация работы. Основные положения работы доложены на пяти конференциях: Докучаевских молодежных чтениях "Сохранение почвенного разнообразия в естественных ландшафтах" в 2002 г., 6 Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука 21 века"в 2002 г., на. VII Докучаевских молодежных чтениях "Человек и почва в XXI веке"в 2004 г., на 3-ем съезде Докучаевского общества почвоведов России в 2004 г., на XI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2004", на заседании Ш комиссии Докучаевского Общества Почвоведов, 2004 г.

Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 8 печатных работах (5-ти тезисах и 3-х статьях).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах текста, содержит рис., табл. Список литературы включает наименований, в том числе на иностранных языках.

Объекты и методы исследования

В работе использованы почвы разных почвенно-климатических зон; интразональные почвы, почвы агроэкосистем и антропогенные субстраты (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика объектов исследования

Экосистемы Название почвы, горизонт и глубина взятия образцов, см рНюо Район взятия образцов

Лесотундровые дерновая примитивная на красноцветном алеврите, 0,0-5 Т.5-40 4,5 5,0 Архангельская обл.. Пинежский р-н

сульфорендзнна грубогумусная, 031, 0-15 В, 5-40 6.0 6,3 Архангельская обл., Пинежский р-н

низинная торфяная, Т, 0-10 5,3 Кировская обл.. Оричевский р-он. Кировская .туго-болотная станция

На осушенных торфяниках низинная торфяная, Тпах, 0-20 5,5 Рязанская обл.. Спас-Клепиковский р-н, совхоз "Макеевский"

Лесные дерново-подзолистая, А4 0-10 А, 10-15 6,0 5.6 Кировская обл.. Кировский р-н. д. Федяново,

горная мерзлотно-таежная, А0А1,0-5 АВ, 10-20 4,1 5,4 Монголия, бассейн р. Селенга, г. Эрденэт, Халганажский р-н

чернозем обыкновенный, А, 0-21 6,8 Воронежская обл., Талловский р-н

каштановая солонцеватая, А1г 2-10 8.0 Волгоградская обл.. Камышинский рчэн.

Степные такыровиляыи солончак корка солей, Кб, 0-1 9,0 Бурятия, р-н озера Оронгойское

такыровидный солончак, Кй, 0-2 9.5 Бурятия, р-н озера Сульфатное

Пойменные аллювиальная луговая карбонатная засоленная на аллювиальных отложениях. АсЦ 0-10 А. 10-40 7.4 7.4 Волгоградская обл.. Иловлинский р-н.1,7 км на север от станции Качалнно

аллювиальная луговая на карбонатных отложениях, МО-Ю А, 10^0 7.7 8,1 Калужская обл., Боровский р-он. пос. Сатино, полигон учебно-научной станции МГУ

хемотехнозем грунтово-оглеенный, ТГ1,5-22 ТГ2,22-29 ТГЗ, 29-53 в, 53-70 8.2 8.2 8.3 8.2 Московская станция под земного хранения газа

Антропогенные пирогенное образование, отобранное вскоре после пожара, образец №1 ТЕр1Г, 0-6 8,4 Рязанская обл., Спас-Клепиковский р-н, совхоз "Макеевский"

пирогенное образование, отобранное через год после пожара, образец №2 ТЕрп, 0-6 7.7 Рязанская обл., Спас-Клепиковский р-н. совхоз "Макеевский"

Для учета и выделения алкалофильных и ацидофильных актиномицетов проводили посев из почвы на агаризованные среды Гаузе 1 (Гаузе и др., 1983) и среду с пропионатом натрия (Зенова, 2002). Значения рН (9,0; 8,4; 7,0; 5,3) в средах создавали и поддерживали с помощью фосфатной (рН 9,0; 8,4;7,0) и фосфатно-цитратной (рН 5,3) буферной смеси (Методы общей бактериологии, 1983).

В среду добавляли нистатин (50 мкг/мл) для подавления роста грибов и налидиксовую кислоту (1,5-3 мкг/мл) для подавления роста немицелиальных бактерий. Инкубацию посевов проводили в течение 7-10 суток при 28° С, а на среде с пропионатом натрия затем при комнатной температуре до 21 суток. Подсчитывали общее число колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г почвы. Дифференцированный учет актиномицетов проводили при микроскопировании колоний в оптическом микроскопе Биолам Р-П, при увеличениях х120 и х600. Выделяли несколько морфотипов, подсчитывали число колоний, относящихся к определенному морфотипу, выделяли в чистую культуру представителей каждого морфотипа. Для выделения актиномицетов в чистую культуру и дальнейшего культивирования использовали овсяный агар (Гаузе и др., 1983).

Предварительную родовую идентификацию проводили по определителям Берджи (Bergeys Mannual, 1989, 1994; Определитель бактерий Берджи, 1997), используя морфологические (наличие фрагментации мицелия, расположение и число спор на воздушном и/или субстратном мицелии, наличие спорангиев, подвижность спор) и хемотаксономические характеристики (наличие LL- или мезо-изомера диаминопимелиновой кислоты (ДАПк) и дифференцирующих Сахаров в гидролизатах целых клеток). Для определения морфологических характеристик использовали метод "желобка" (Прокофьева-Бельговская, 1964) и метод стекол обрастания (Определитель бактерий Берджи, 1997). Присутствие изомеров диаминопимелиновой кислоты (ДАПк) и диагностических Сахаров в гидролизатах целых клеток определяли методом восходящей хроматографии на силуфолевых пластинках Merck (Hasegawa et al.,

1983 в модификации Института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН).

Принадлежность к роду Streptomyces определяли по следующим свойствам культур: на воздушном мицелии присутствуют цепочки спор (от 3 до 50), на разветвленном нераспадающемся субстратном мицелии споры не обнаруживаются, в гидролизатах целых клеток присутствует LL-ДАПк и отсутствуют диагностические сахара.

Принадлежность актиномицетов к роду Micromonospora проводили по следующим показаниям: на нераспадающемся субстратном мицелии наличествуют неподвижные одиночные споры, воздушный мицелий либо отсутствует, либо в виде слабого сероватого налета, стерильный, в гидролизатах целых клеток присутствует мезо-ДАПк, ксилоза, арабиноза.

Идентификацию видов рода Streptomyces проводили согласно определителя Гаузе с соавторами (Гаузе и др., 1983).

Диапазон значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, определяли используя значения радиальной скорости роста колоний на средах с разными значениями рН. Для определения радиальной скорости роста стрептомицетов использовали метод посева уколом на среду Гаузе-1 со значениями рН 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 9,5, 10,0 в десятитикратной повторности. Для создания значений рН среды 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, использовали фосфатно-цитратную буферную смесь. Для создания рН среды 8,0, 9,0, 9,5 и 10,0 использовали фосфатную и боратную буферные смеси.

Чашки Петри с посевом инкубировали при 28° С. Определение размеров колоний проводили с помощью измерения двухигловым циркулем и линейкой двух перпендикулярных диаметров каждой колонии с точностью до десятых долей миллиметра при появлении видимых колоний. А' затем через каждые 2-3 суток.

Расчет радиальной скорости роста колоний проводили по формуле (1): Кг = (dz-d])/(ti - ti) (i), где и - диаметр колонии (мм) в начальный и конечный момент времени измерения соответственно. Наблюдение за развитием алкалофильного

стрептомицета Я^ерЮтусея ттЮтусгАет (штамм 8402) и нейтрофильного стрептомицета Я1гер1атусея сапеясепя (штамм 7402) проводили на средах с различными значениями рН, исследуя под микроскопом мицелий и споры, на покровном стекле, которое помещали под углом к поверхности агаризованной среды с растущей культурой (Определитель бактерий Берджи, 1997). После инкубации покровные стекла вынимали и рассматривали в оптическом микроскопе (х900). Описание проводили на 5-е, 10-е и 15-е сутки роста. Использовали среду Гаузе-1 со значениями рН 6.0; 7,0; 8,4.

Для выяснения влияния температуры на диапазоны значений рН, оптимальных для роста культур стрептомицетов использовали скорость роста культур Я(гер(атусея сктта/шсш (штамм 5,30) и Я(гер(атусея Шая(а(аскгата§епея (штамм 5,3С), определяли скорость роста культур при температурах 21; 24; 27; 30° С и значениях рН среды 5,0; 6,0; 7,0; 8,0.

Результаты и обсуждение Численность актиномицетов в различных почвах, выявляемая на кислых, щелочных и нейтральных средах

Выявлена тенденция к преобладанию численности стрептомицетов, выделенных из почвы на подкисленной среде над численностью мицелиальных прокариот на нейтральной среде. Эта тенденция проявляется в наибольшей степени в почвах, имеющих низкую актуальную кислотность - дерновой примитивной (рН 4,5), горной мерзл отно-таежной (рН 4,5), низинной торфяной (рН 5,3) (рис. 1). В почвах, имеющих актуальную кислотность близкую к нейтральной (дерново-подзолистая (рН 6,0), чернозем (рН 6,8)), различия в численности стрептомицетов, выросших на подкисленной и нейтральной среде, невелики или практически отсутсвуют (рис. 1).

В почвах, имеющих значения рН более 7,0 численность стрептомицетов на подкисленной среде была меньшей, чем на нейтральной (рис. 1)

Рис. 1 Численность актиномицетов вразныхпочвах, выявляемая на нейтральной и

подкисленной средах

Можно предположить, что увеличение численности стрептомицетов на подкисленной среде по сравнению с численностью на нейтральной, обнаруживаемое в почвах кислого ряда, обусловлено присутствием в этих почвах некоего комплекса кислотолюбивых актиномицетов.

Для выражения соотношения численности актиномицетов, выявляемых при посеве из почв с разной актуальной кислотностью на нейтральную и подкисленную среды использовали условный коэффициент ацидофильности актиномицетного комплекса который рассчитывали как отношение

количества актиномицетов, выделяемых из почвы на подкисленной среде (рН 5,3) к численности актиномицетов, выделяемых на нейтральной среде (рН 7,0). Коэффициент отражает тенденцию к увеличению (Кае1"!) или снижению численности почвенных актиномицетов на подкисленной среде, по сравнению с нейтральной. В случаях, когда эти значения близки, близок к единице.

В кислых почвах на подкисленной среде выделялось большее по сравнению с нейтральной средой количество актиномицетов Коэффициент ацидофильности в этих почвах выше единицы (рис. 2), в почвах с нейтральной реакцией среды близок к единице. При посеве из почв со слабощелочной реакцией среды (аллювиальной луговой на карбонатных отложениях и каштановой солонцеватой) выявленное на кислой среде количество актиномицетов было ниже, чем на нейтральной, и соответсвенно коэффициент ацидофильности был ниже единицы (рис. 2)

Рис 2 Значения коэффициентов ацидофильности (К1С) и величин рН горизонтов почв

Так как в щелочных почвах локусы с пониженной кислотностью весьма редки, обнаружение в пуле мицелиальных прокариот кислотолюбивых форм носит случайный характер.

Наиболее контрастные соотношения численности актиномицетов на кислой и нейтральной средах наблюдались в двух контрастных по актуальной кислотности среды почвах (рис. 3). В этих почвах отмечены и наиболее контрастные значения коэффициента ацидофильности: для кислой

низинной торфяной почвы (рН 5,3) равен 3,5; Кас для горизонта Ad (рН 7,7)

аллювиальной луговой почвы на карбонатных отложениях равен 0,71, для горизонта А (рН 8,1)-0,18. Таким образом, в целом с возрастанием величины рН почвы наблюдается тенденция к снижению коэффициента ацидофильности (рис. 2). Чем выше коэффициент ацидофильности в почве, тем с большей уверенностью можно говорить о высокой численности в ней ацидофильных актиномицетов.

При рассмотрении почв с высоким значением актуальной кислотности (аллювиальная луговая карбонатная засоленная, каштановая солонцеватая, такыровидные солончаки) выявлено превышение численности актиномицетов, выделяемых на среде с высоким значением рН по сравнению с количеством актиномицетов, выделяемых из этих почв на нейтральной и особенно подкисленной среде (рис. 4).

9 3 рН среды выделения 7

Рис. 3 Численность актиномицетов в аллювиальнойлуговой и низинной торфяной почвахна нейтральной и подкисленной средах Исследование щелочного антропогенного субстрата хемотехнозема грунтово-оглееного (рН 8,2), отобранного на территории Московской станции подземного хранения газа, показало увеличение численности стрептомицетов на нейтральной среде, по сравнению с количеством мицелиальных прокариот на подкисленной среде. Количество стрептомицетов, выделяемых на щелочной

среде из разных горизонтов хемотехнозема варьировало, но обычно оказывалось большим, чем на кислой среде (рис. 5). В этом щелочном субстрате актиномицетный комплекс представлен преимущественно нейтрофильными и алкалофильными формами.

По аналогии с коэффициентом ацидофильности, рассчитывали коэффициент алкалофильности как соотношение численности

актиномицетов, выделяемых из почвы на среде с повышенным значением рН, к численности актиномицетов, выделяемых при посеве из той же почвы на нейтральной среде.

Рис 4 Численность актиномиуетовваллювиальнойлуговой карбонатнойзасоченнои почве, выявляемая на средах сразличными значениямирН

Рис 5 Численность актиномицетов в хемотехноземе грунтово-оглееном, выявляемая на средахсразличными значениямирН Для щелочных почв и антропогенного субстрата хемотехнозема грунтово-оглеенного коэффициент алкалофильности актиномицетного комплекса был, как правило, близок к единице или больше единицы (рис 6)

Рис. 6 Значения коэффициентовалкалофилъности (К„|С) и величинрНпочв

Таксономическая принадлежность актиномицетов, выделенных из различных почв на кислых, щелочных и нейтральных средах

В ходе исследования было установлено, что таксономический состав актиномицетного комплекса на средах с различными значеними рН различен. Установлено, что в почвах разных типов в составе ацидофильных и алкалофильных актиномицетов преобладают представители рода Streptomyces.

[ ^wiim^itiflMt^ifliMrttjtM^

О Oto»r«us Crtromog*n«s Sa Gineraus Achromogenea I ■ Holvolo-flavua Helvolus

горизонт

Рис. 7 Разнообразие стрептомицетного комплекса в аллювиальнойлуговой карбонатной

почве на щелочной среде Видовой спектр ацидофильных и алкалофильных стрептомицетов во всех исследованных почвах менее широк по сравнению со спектром нейтрофильных стрептомицетов. Среди ацидофильных стрептомицетов преобладают виды, относящиеся к секции Imperfectus (Закалюкина и др., 2001). Среди алкалофильных актиномицетов в разных почвах доминируют виды

относящиеся к секции Cinereus (рис. 7). При этом среди нейтрофильных стрептомицетов в разных почвах могут доминировать виды, относящиеся к различным секциям.

Актиномицетный комплекс, выявляемый на нейтральной среде в антропогенном субстрате хемотехноземе грунтово-оглеенном, представлен видами стрептомицетов, принадлежащих к 3-м секциям и 4-м сериям. На щелочной среде увеличивается доля стрептомицетов, принадлежащих к секции Cinereus, и эти виды доминируют в актиномицетном комплексе. Кроме стрептомицетов в комплексе обнаружены представители рода Micromonospora, причем их доля в комплексе на щелочной среде достигает 30%, что выше, чем на других средах.

Сравнительное исследование актиномицетных комплексов осушенной низинной торфяной почвы и пирогенных образований, формирующихся при пожарах на торфяниках

Систематические пожары на осушенных торфяных массивах, получившие широкое распространение на территориях таежной и лесостепной зон, особенно опасны и разрушительны в условиях полесских ландшафтов, где относительно маломощная торфяная залежь (1-2 м) подстилается на небольшой глубине мощной толщей оглеенного практически бесплодного мелко- и среднезернистого водоносного песка. После пожаров на поверхности сгоревших болот формируются вторичные пирогенные образования и пирогенноизмененные почвы. Пирогенные образования обладают низким плодородием и подвержены интенсивному вторичному заболачиванию.

Численность актиномицетов как в поверхностных, так и в глубоких слоях низинной торфяной почвы составила сотни тысяч колониеобразующих единиц (КОЕ)/г почвы (рис. 8). Актиномицетный комплекс осушенной низинной торфяной почвы, выявляемый на среде с пропионатом натрия, представлен родами Streptomyces и Micromonospora. Численность стрептомицетов и микромоноспор, выделяемых на подкисленной среде (рН 5,3) из осушенной низинной торфяной почвы, превышает численность мицелиальных прокариот,

выделяемых на нейтральной и щелочной (рН 8,4) средах. Особенно это заметно для стрептомицетов. Численность стрептомицетов, выделяемых на подкисленной и нейтральной средах из осушенной низинной торфяной почвы, превышала в 2-4 раза численность микромоноспор, выделяемых на средах с такими же значениями рН.

гмс. КОЕ/Г почвы

О 2 ОО АОО ООО аоо 1ООО

ом а э I

с.<-< 7 г> ;

ш р иг .-з ^ !!

Рис 8 Численность актиномицетов, выделенных из низинной торфяной почвы на подкисленной, нейтральной и щелочной средах

Численность стрептомицетов и микромоноспор, выделяемых на щелочной среде, была примерно одинаковой.

Увеличение численности актиномицетов, выделяющихся на подкисленной среде из кислой осушенной низинной торфяной почвы, по сравнению с количеством мицелиальных прокариот, выделяющихся на нейтральной и щелочной средах, свидетельствует о присутствии в исследуемой почве комплекса ацидофильных актиномицетов (стрептомицетов и микромоноспор). Наличие комплекса ацидофильных актиномицетов было отмечено и в зональных кислых почвах (Звягинцев, Зенова, 2001).

Пирогенные образования, в отличии от кислой осушенной низинной торфяной почвы, представляют собой слабощелочные субстраты, и численность актиномицетов, выделяемых из пирогенных образований на щелочную среду оказывается значительно более высокой, чем количество актиномицетов, выделяемое из этих субстратов на нейтральную и особенно подкисленную среду (рис. 9). Очевидно, актиномицетный комплекс представлен здесь в основном алкалофильными актиномицетами, приспособленными к щелочной среде и вытесняющими ацидофильные и

нейтрофильные актиномицеты из комплекса почвенных мицелиальных прокариот

Актиномицетный комплекс пирогенных образований, формирующихся на сгоревшей осушенной низинной торфяной почве, выявляемый на среде с пропионатом натрия, так же, как и в почве, представлен родами Streptomyces и Micromonospora Численность стрептомицетов, выделенных из пирогенных образований, как правило, превышает численность микромоноспор (рис 10)

В пирогенно-перегнойном образовании обнаружено присутствие стрептомицетов - представителей секции Cinereus как на средах с нейтральным и щелочным значением рН, так и на подкисленной среде (рис 10) Однако на кислой среде эти виды стрептомицетов доминируют, в то время как на нейтральной и щелочной средах они составляют лишь вторую часть от стрептомицетного комплекса и примерно третью часть от всего комплекса мицелиальных прокариот.

Рис 9 Численность актиномицетов, выделенных из пирогенно-перегнойных образовании на подкисленной, нейтральной и щелочной средах

Таким образом, сравнивая актиномицетные комплексы, выделяемые на среды с различными значениями рН из осушенной низинной торфяной почвы и из пирогенных образований, сформированных на сгоревшей торфяной почве, можно отметить следующие особенности-

1 Численность актиномицетов, выделенных из осушенной низинной торфяной почвы на подкисленную среду, превышает численность актиномицетов, выделенных из этой почвы на нейтральную и щелочную среды

Считаем, что в низинной осушенной торфяной почве присутствует комплекс ацидофильных актиномицетов.

Рис 10 Разнообразие актиномицетного комплекса, выявляемого в пирогенно-перегнойном образовании на подкисленной (а), нейтральной (б) и щелочной (в) средах

2. Количество актиномицетов, выделенное на щелочную среду из пирогенных образований, превосходит число мицелиальных прокариот, выделенное из этих щелочных субстратов на нейтральную и подкисленную среды. В пирогенных образованиях формируется комплекс алкалофильных актиномицетов, выдерживающих щелочные условия среды, созданные повышенным содержанием углекислых солей щелочно-земельных металлов в золе.

3. Комплекс актиномицетов, формирующийся в пирогенных образованиях после сгорания торфяной почвы, может служить показателем изменений, которые происходят в микробном комплексе почвы под влиянием пожаров. Эти изменения сохраняются в комплексе в течение длительного времени (в течение года) после промывки паводковыми и атмосферными водами.

Диапазон значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, выделенных из почвы на среды с различными значениями рН

В ходе исследований была собрана коллекция культур актиномицетов, выделенных из разных почв на подкисленной, нейтральной и щелочной средах.

Поскольку стрептомицеты реализуют так называемую "стратегию поиска" (сочетание олиготрофии с быстрым освоением пространства) их рост подчиняется линейному закону (Кожевин, 1989), и скорость роста колоний практически постоянна. Эта особенность роста позволяет установить кардинальные для роста стрептомицетов значения рН по величине радиальной скорости роста колоний на плотной питательной среде.

Исследование радиальной скорости роста колоний на плотных средах с различными значениями рН позволяет получить классическую колоколообразную зависимость параметров роста популяции от кислотности среды - кривую толерантности. На основании этого можно статистически значимо судить о ширине диапазона толерантности, оптимальных и лимитирующих значениях рН, и тем самым вполне корректно классифицировать актиномицеты по их рН-потребностям (Кожевин, 1989).

Культуры, выделенные из почв на питательной среде с рН 5,3, характеризуются общим свойством: оптимум роста наблюдается при рН 5,0 (рис. 11). Диапазон пригодных для роста культур значений рН лежит в пределах рН 3,0-7,0. Эта группа штаммов определяется нами как почвенные ацидофильные актиномицеты, т.к. их оптимум роста лежит в пределах рН 5,0. Широкий диапазон значений рН, пригодных для роста этой группы штаммов, связан, очевидно, с гетерогенностью почвенной среды, в которой присутствуют микрозоны с различной актуальной кислотностью. Штаммы, выделенные при рН 7,0, имеют оптимум роста при рН 7,0 и границы роста-в диапазоне значений рН от 5,0 до 8,0. Это- нейтрофильные актиномицеты. У штаммов, выделенных на среде с рН 8,4, отмечали оптимум роста при значении рН 8,0, границы роста, расположенные в диапазоне значений рН 5,5-9,5. Эта группа штаммов определяется нами как почвенные алкалофильные (рис. 11).

Рис11 Диапазон значенийрН, пригодныхдляроста актиномицетов, выделенныхиз

разныхпочв

Таким образом, отмечается корреляция между значениями рН, оптимальными для роста почвенных актиномицетов, значениями рН среды выделения и значениями рН почвы, если почва имеет значения рН такие же, как среда выделения.

В литературе отмечалось, что ацидофилия актиномицетов может сопутствовать их термофилии (УаПор et а1., 1997). Для выяснения влияния температуры выращивания актиномицета на отношение мицелиальных прокариот к кислотности среды определяли радиальную скорость роста актиномицетов на средах с различными значениями рН при различных температурах. Было выявлено смещение оптимума роста в область низких значений рН при более высокой температуре инкубирования у 8(гер(атуее$ diastatochromogenes штамм 5,3 О, выделенной из аллювиальной луговой почвы на подкисленной среде. У Streptomyces с^ото/шсш штамм 5,3 С, выделенного из той же почвы на нейтральной среде, подобного смещения оптимума роста не наблюдалось. Таким образом, было установлено, что повышение температуры инкубирования культуры смешает оптимум роста ацидофильного актиномицета

в область низких занчений рН, увеличение температуры инкубирования культуры нейтрофильного актиномицета подобного смещения оптимума рН не вызывает.

Известно, что многие алкалофильные микроорганизмы в связи с особенностями их местообитаний являются галотолерантными или галофильными. Для проверки этого положения определяли радиальную скорость роста алкалофильных стрептомицетов, выделенных из такыровидных солончаков, на средах с различной концентрацией соли (№аС1). В среде создавали и поддерживали значения рН, оптимальные для роста штаммов.

Установлено, что алкалофильный стрептомицет varsoviensis штамм Б9 имеет оптимум роста при 6% №аС1 в среде, диапазон концентраций соли, пригодных для роста лежит в пределах от 1 до 9% №а0 в среде. Согласно классификации Ларсена (Звягинцева, 1983) этот алкалофильный актиномицет является умеренным галлофилом. Нейтрофильный стрептомицет gnzeus штамм С7 имеет оптимум роста при 4% №аС1 в среде и диапазон пригодных для роста концентраций соли в области от 1 до 9% №аС1 в среде, он является слабым галофилом. Оптимумы роста нейтрофильных стрептомицетов 5. globisporus штамм Б и S.gnseorubiginosus штамм С5 находились при 0,05% №аС1 в среде. Эти две культуры являются негалофильными стрептомицетами.

При многократных пересевах алкалофильных стрептомицетов на нейтральную среду и последующем определении их радиальной скорости роста при разных значениях рН среды, было выявлено изменение скоростей роста штаммов как в сторону повышения так и в сторону снижения, однако существенного смещения оптимальных для роста значений рН выявлено не было. Очевидно, способность к максимальному росту на щелочной среде не утрачивается при пересеве культур алкалофильных актиномицетов на нейтральную среду, является генетически закрепленной и свидетельствует об адаптации актиномицетов к условиям щелочных почв, а не только о "выживании " за счет сохранения в почве покоящихся спор.

Особенности дифференцировки мицелия алкало- и нейтрофильных стрептомицетов на средах с разными значениями рН

Сравнительное исследование дифференцировки мицелия алкалофильных и нейтрофильных актиномицетов в процессе их роста на щелочной, подкисленной и нейтральной среде показало, что стрептомицеты двух групп имеют свои особенности.

Как алкалофильные, так и нейтрофильные стрептомицеты оказались либо не способными расти на кислой среде, либо их рост был значительно более слабым по сравнению с ростом на нейтральной питательной среде. Эта особенность оказалась наиболее ярко выражена у алкалофильных стрептомицетов. Так, образование воздушного мицелия у нейтрофильного стрептомицета Streptomyces canescens штамм 7402 при росте на подкисленной среде наблюдалось уже к 5-м суткам роста, тогда как у алкалофильного S. resistomycificus штамм 8402 - только к 10-м суткам роста (рис. 12).

У нейтрофильного стрептомицета на нейтральной среде отмечен максимальный размер колоний по сравнению с колониями на подкисленной и щелочной средах во все сроки наблюдения. На подкисленной и щелочной среде эти стрептомицеты росли медленнее.

Размер колоний алкалофильного стрептомицета на среде с рН 8 оказался большим, чем размер колоний на подкисленной и нейтральной средах, во все сроки наблюдения (рис. 12). На щелочной среде у этого стрептомицета отмечены более интенсивная коричневая окраска субстратного мицелия и питательной среды по сравнению с нейтральной и подкисленной средой.

У нейтрофильного стрептомицета & canescens штамм 7402 на подкисленной среде на 5-е сутки роста наблюдается колония с плохо развитым воздушным мицелием, гладкие споры на прямых спороносцах формируются к 10-м суткам роста и на 15-е сутки отмечено их освобождение из цепочек. На нейтральной среде формируются более крупные колонии, чем на подкисленной и подщелаченой среде, созревание и освобождение спор отмечено уже к 10-м суткам роста. На среде со значением рН 8,0 к 5-м суткам роста наблюдается

образование коротких прямых спороносцев, спорообразование заканчивается к 10-м суткам роста, к 15-м суткам отмечается освобождение спор.

Алкалофильный штамм resistomydfims штамм 8402 при росте на подкисленной среде формирует голые колонии, лишенные воздушного мицелия. Только к 10-м суткам роста отмечено образование воздушного мицелия, гладких спор в коротких спиральных цепочках, (спираль 1-3 оборота). Формирование более длинных спиральных цепочек спор (6-8 оборотов) и освобождение спор из цепочек отмечено к 15-м суткам роста. На нейтральной среде к 5-м суткам роста полностью формируется колония с субстратным и воздушным мицелием, короткими спороносцами на воздушном мицелии (1-3 оборота). К 10-м суткам заканчивается процесс спорообразования и начинается освобождение спор. На щелочной среде уже к 5-м суткам роста на воздушном мицелии формируются длинные спиральные цепочки спор (6-8 оборотов), освобождение спор отмечено к 10-м суткам роста. У алкалофильного штамма на 10-е сутки роста на щелочной среде отмечено снижение рН среды в процессе роста (с рН 8 до рН 7).

Таким образом, особенностью нейтрофильного стрептомицета является меньшая скорость роста колоний и замедление скорости спорообразования на подкисленной и щелочной средах по сравнению с ростом и развитием этого стрептомицета на нейтральной среде.

Особенностью алкалофильного стрептомицета является удлинение стадий жизненного цикла, которое выражается в задержке образования воздушного мицелия и спор на подкисленной среде по сравнению со скоростью образования воздушного мицелия и спор на нейтральной и щелочной среде и по сравнению с ростом нейтрофильного стрептомицета на подкисленной среде. Алкалофильный стрептомицет характеризуется высокой радиальной скоростью роста колоний (скоростью колонизации субстрата) и ускоренным спорообразованием, при росте на щелочной среде по сравнению с этими показателями на нейтральной и подкисленной средой.

Можно предположить с достаточной степенью вероятности, что алкалофильные стрептомицеты обладают особым механизмом адаптации к

условиям повышенного рН, проявляющимся в их способности интенсивнее колонизировать щелочную среду, чем нейтральную. Обладание этим механизмом позволяет алкалофильным формам снижать конкуренцию нейтрофильных стрептомицетов и развиваться в условиях щелочных почв.

Рис. 12 Схема формирования колоний алкалофильного актиномщета Streptomyces ге$1$1ошус1Аст (штамм 8402); 1-колония, 2-субстратный мицелий, 3-спороносцы, 4-споры.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено присутствие специфического комплекса почвенных алкалофильных актиномицетов, доминирующих в щелочных почвах.

2. Подтверждено, что в актиномицетном комплексе кислых почв доминируют ацидофильные актиномицеты.

3. Установлено, что видовой состав нейтрофильного стрептомицетного комплекса специфичен для различных почв. Видовой состав алкалофильного стрептомицетного комплекса во всех почвах представлен в основном видами секции Стегеш.

4. Установлена корреляция между значениями рН, оптимальными для роста актиномицетов, рН среды выделения и рН исходного субстрата.

5. Особенностями роста алкалофильных актиномицетов на щелочной среде по сравнению с нейтральной и кислой средами являются наибольшая скорость освоения субстрата и ускоренное наступление репродуктивной стадии.

РАБОТЫ ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лихачева А.А., Закалюкина Ю.В,, Селянин В.В., Смирнова М.М. Актиномицетный комплекс аллювиальных почв// Тезисы докладов Докучаевских молодежных чтений "Сохранение почвенного разнообразия в естественных ландшафтах". Изд-во СП6ТУ, 2002, с 121

2. Селянин В. В. Кислотолюбивые актиномицеты//Тезисы докладов 6 Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология-наука 21 века".Пущино, изд-во ТПГУ, 2002, т 3 с149

3. Селянин В. В. Ацидофильные и алкалофильные актиномицеты в почвах Московской Станции Подземного Хранения Газа//Тезисы докладов Всероссийской конферкнции. VII Докучаевские молодежные чтения"Человек и почва в XXI веке". В рамках Международного форума "Сохраним Планету Земля". Изд-во СП6ТУ, 2004, с 102

4. Зенова Г.М., Лихачева А.А., Селянин В.В., Грядунова А. А, Почвенные экстремофильные актиномицеты. Тезисы докладов 3-его съезда Докучаевского общества почвоведов России. Новосибирск, 2004, Комиссия Ш: Биология почв, стр. 626

5. Селянин В. В. Актиномицеты в кислых и щелочных почвах. Тезисы докладов XI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2004", М.-2004 с. 136

6. Зенова Г.М., Закалюкина Ю.В., Селянин В.В., Звягинцев Д. Г. Выделение и рост ацидофильных актиномицетов рода Micromonospora.ll Почвоведение, 2004, №7, с. 847-852

7. Селянин В.В., Зенова Т.М., Звягинцев Д.Т., Шваров А.П. Актиномицетные комплексы низинной торфяной почвы и пирогенных образований на сгоревших осушенных торфяных почвах Полесий// Вестник МГУ, 2005, №2 с. 169-175

8. Селянин В.В., Зенова Г.М., МожароваН. В. Закалюкина Г.М., Звягинцев Д.Г. Выявление в кислых, нейтральных и щелочных почвах ацидофильных и алкалофильных почвенных актиномицетов// Почвоведение, 2005, № 5, с. 590-593

Подписано в печать 200*5"года. Заказ № ££

Формат 60х90/16. Усл. печ. л. 5. Тираж /ОО экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

2267

19 МАЙ 7005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Селянин, Вадим Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Почвенная кислотность как средообразующий фактор для микроорганизмов.

1.2 Алкалофилия и ацидофилия - свойства микроорганизмов.

1.3 Экологическая ниша актиномицетов.

1.4 Ацидофильные актиномицеты.

1.4.1 Распространение и численность ацидофильных актиномицетов почвах.

1.4.2 Таксономическое разнообразие ацидофильных актиномицетов.

1.5 Особенности ацидофильных актиномицетов по сравнению с нейтрофи льными.

1.5.1 Изучение рН-требований ацидофильных актиномицетов.

1.5.2 Морфологические признаки ацидофильных актиномицетов.

1.5.3 Физиологические признаки ацидофильных актиномицетов.

1.5.4 Генетические отличия ацидофильных актиномицетов.

1.5.5 Антибиотическая активность ацидофильных актиномицетов.

1.6 Термофилия и ацидофилия у прокариот.

1.7 Алкал офильные актиномицеты.

1.7.1 Выделение алкалофильных актиномицетов из почв, их таксономическая принадлежность.

1.7.2 Алкалофильные актиномицеты как продуценты ферментов и метаболитов.

1.7.3 Место ацидофильных и алкалофильных актиномицетов в системе современных научных знаний.

Глава 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования.

2.2 Методы исследования.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Численность актиномицетов в различных почвах при выделении на кислых, щелочных и нейтральных средах.

3.2 Таксономическая принадлежность актиномицетов, выделенных из различных почв на кислых, щелочных и нейтральных средах.

3.3 Сравнительное исследование актиномицетных комплексов низинной торфяной почвы и пирогенных образований, формирующихся при пожарах на торфянниках.

3.4 Диапазон значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, выделенных из почвы на средах с различными значениями рН.

3.5 Особенности морфологической дифференцировки мицелия алкало- и нейтрофильных стрептомицетов.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Почвенные алкалофильные и ацидофильные актиномицеты"

Почвенная кислотность является важным физико-химическим показателем свойств почв и зависит от многих факторов. Она может влиять на почвенные микроорганизмы двояко: или непосредственно на внутреннюю среду клетки, или косвенно, путем изменений во внешней среде. Разграничить эти две формы влияния удается редко. Долгое время полагали (Стейниер и др., 1979), что из основных групп почвенных микробов устойчивостью по отношению к кислотности обладают грибы, в то время как большинство бактерий и актиномицетов неустойчивы(Alexander, 1964).

В 70-е годы группе американских исследователей удалось выделить и изучить коллекцию культур актиномицетов, способных расти в кислой среде.

В настоящее время возможность существования актиномицетов, способных расти в кислой или щелочной среде, уже не вызывает сомнений, изучены их свойства и особенности, однако об экологии этих мицелиальных прокариот по-прежнему известно немного.

Вопрос о месте и роли актиномицетов в почве весьма актуален. Изучение почв на территории России (многие из которых по естественным или антропогенным причинам являются кислыми или щелочными) должно предполагать рассмотрение характерных представителей микробоценоза данных местообитаний.

С другой стороны, изучение почвенных ацидофильных и алкалофильных актиномицетов несомненно представляет интерес для биотехнологии. Поиск продуцентов новых антибиотиков и ферментов с особыми рН-оптимумами действия, применение популяций актиномицетов для биоконтроля и биоремедиации, борьба с фитопатогенными грибами-практические задачи, для решения которых знания об ацидофильных и алкалофильных актиномицетах могут быть весьма ценными.

Целью работы явилось исследование экологических особенностей ацидофильных и алкалофильных актиномицетов и их места в комплексе почвенных мицелиальных. Задачи исследования

1. Разработка селективных методов выделения и учета ацидофильных и алкалофильных актиномицетов из кислых, щелочных и нейтральных почв.

2. Сравнительный анализ актиномицетных комплексов, выявляемых на подкисленных, нейтральных и подщелаченных средах из почв и антропогенных субстратов с разной актуальной кислотностью.

3. Оценка радиальной скорости роста выделенных из почв ацидофильных, нейтрофильных и алкалофильных актиномицетов при различных значениях рН среды и построение на основе данных о радиальной скорости роста кривых толерантности исследуемых культур актиномицетов в отношении кислотности среды.

4. Изучение особенностей дифференцировки мицелия нейтрофильных и алкалофильных актиномицетов на нейтральных и щелочных средах.

Научная новизна. Впервые установлено распространение алкалофильных актиномицетов в широком ряду почв и определена таксономическая структура их комплексов. Отмечена приуроченность алкалофильных актиномицетов к щелочным почвам, подтверждена установленная ранее приуроченность ацидофильных актиномицетов к кислым почвам.

Впервые рассмотрены особенности жизненного цикла алкалофильных актиномицетов на щелочной среде:

-высокая скорость освоения субстрата (высокая радиальная скорость роста) наряду с ускоренным спорообразованием,

-уменьшение значения рН среды культурой алкалофильного актиномицета до нейтрального при росте на щелочной среде.

Практическая значимость. Установление экологической ниши алкалофильных актиномицетов важно для расширения наших представлений о биоразнообразии микробного комплекса почв.

Знания об особенностях распространения и жизнедеятельности алкалофильных актиномицетов могут представлять существенный интерес для биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ по проекту 03-0448324

Апробация работы. Основные положения работы доложены на пяти конференциях, в том числе двух международных, на заседании кафедры биологии почв совместно заседанием ВОП (Всероссийского Общества Почвоведов)

Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 8 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 108 страницах текста, содержит 28 иллюстраций, 10 таблиц. Список литературы включает 111 наименований, в том числе 73 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Селянин, Вадим Валерьевич

выводы

1. Впервые установлено присутствие специфического комплекса почвенных алкалофильных актиномицетов, доминирующих в щелочных почвах.

2. Подтверждено, что в актиномицетном комплексе кислых почв доминируют ацидофильные актиномицеты.

3. Установлено, что видовой состав нейтрофильного стрептомицетного комплекса специфичен для различных почв. Видовой состав алкалофильного стрептомицетного комплекса во всех почвах представлен в основном видами секции Cinereus.

4. Установлена корреляция между значениями рН, оптимальными для роста актиномицетов, рН среды выделения и рН исходного субстрата.

5. Особенностями роста алкалофильных актиномицетов на щелочной среде по сравнению с нейтральной и кислой средами являются наибольшая скорость освоения субстрата и ускоренное наступление репродуктивной стадии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Селянин, Вадим Валерьевич, Москва

1. Агре Н. С. Систематика термофильных актиномицетов. — Пущино. 1986. 126 с.

2. Броун И. И., Р.Р.Иишухаметов, СТ.Каракис, Д.И.Погорелов, Ю.Л. Чабан Особенности адаптации к щелочной среде цианобактерий из различных гидроценозов. // Экология моря. 2001. Вып.55. С.53-58

3. Буга С. Ф., Ушкевич Л.А., Боярчук В.Е., Лобань С.В., Радына А.А. Видовой состав грибов рода Fusarium, встречающихся в агрофитоценозах озимых зерновых культур.// Весщ акадэми навук Беларуси Серыя б'шлапчных навук. 1996. №2. С.76-79.

4. А. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М. Наука. 1983. 245с.

5. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М. Академия. 2003. 464 с.

6. Жизнь микробов в экстремальных условиях/ Под ред. Д. Кашнера. М. Изд-во Мир. 1981.520 с.

7. Заварзин Г. А. Становление биосферы// Вестник Российской Академии наук. 2001. Т. 7. №11.

8. Зайдельман Ф.Р.,Банников М.В.,Шваров А.П. Структура и экологическая оценка пироге иных образований на сгоревших осушенных торфяных почвах// Вестник Московского университета. 1998. № 2. С.26-31.

9. Закалюкина Ю. В. Почвенные ацидофильные актиномицеты.//Автореф. дисс. канд. биол. наук М. МГУ 2003.С. 14

10. Ю.Закалюкина Ю. В., Зенова Г. М., Звягинцев Д. Г. Почвенные ацидофильные актиномицеты// Микробиология. 2002. №3 С. 399-403

11. Закалюкина Ю. В., Зенова Г. М, Звягинцев Д. Г. Особенности роста и морфологической дифференцировки мицелия ацидофильных актиномицетов// Микробиология 2004. Т. 73 №1 С.89-93

12. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М. Геос. 2001.256с.

13. Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Экологический статус актиномицетов рода Micromonospora.!I Почвоведение. 1997. №3. С. 376-383.

14. Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Разнообразие актиномицетов в наземных экосистемах. М. Изд-во МГУ. 2002. 131с.

15. Калакуцкий JI.B., Агре Н.С. Развитие актиномицетов, М. Наука. 1977. 450с.

16. Калакуцкий Л.В., Зенова Г.М. Экология актиномицетов.// Успехи микробиологии. 1984. Т.19. С.203-223.

17. Красильников Н.А. Лучистые грибки. М. Наука. 1970. 780с.

18. Ъ.Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М. Изд-во МГУ. 1989. 173с.

19. Лихачев АЛ. Грибы рода Botrytis Micheli автореферат дисс. док. биол. наук. М. МГУ им. М.В. Ломоносова. 2000. 38 с.

20. Методы общей бактериологии/ под ред. Ф. Герхарда и др. в 3-х т. М. Мир. 1983. 535 с.

21. Минеев В.Г. Агрохимия. М. Изд-во МГУ. 1990. 600 с.2А.Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоформные и нокардиоподобные бактерии. Киев. Наукова думка. 1985. 334 с.

22. Одум Ю. Экология. М. Мир. 1986. Т.1. 326 с.26,Определитель бактерий Берджи/ под ред. Дж.Хоула и др. в 2-ух т. М. Мир. 1997. 800 с.

23. Биогеосистемы лесов и вод России. Новосибирск. Наука. 1993. 344с. ЪХ.Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов в 3-х томах. М. Мир. 1979.

24. Ъ2.Терехоеа JIJI. Таксономия актиномицетов и поиск продуцентов новыхантибиотиков автореферат дисс. док. биол. наук. М. РАМН. 1992. 45 с. 33Abd-Allah Е. F. Streptomyces plicatus as a model biocontrol agent.// Folia

25. Bockle, В., В. Galunsky, and R. Muller. Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530. //Appl. Environ. Microbiol. 1995. 61 P. 3705-3710

26. Brown /./., Fadeyev S.I. Light-dependent D m Na+-generation and utilization in the marine cyanobacterium Oscilatoria brevis // FEBS Lett.1990. 270. P. 203 -206.

27. Cross T. Aquatic actinomycetes.// Journal of Applied Bacteriology. 1981. V.50. P.397-423.

28. Dobrovolskaya Т., Lysak L., Evtushenko L. И ISBA'94 :Int. Symp. Biol. Actinomycetes, Moscow, July 20-25,1994

29. Damude, H. G., N. R. Gilkes, D. G. Kilburn, R. C. Miller, R. Antony, J. Warren. Endoglucanase CasA from alkalophilic Streptomyces strain KSM-9 is a typical member of family В of B-l,4-glucanases.// Gene 1993.123 P. 105-107

30. Els on MK., Kelly J.F., Nair M.G. Influence of antifungal compounds from a soil-borne actinomycete on Fusarium spp. in asparagus.// Journal of chemical ecology. 1994. V.20. P.2835-2846.

31. Ensign J.C., Normand P., Burden J.P., Yallop C.A. Physiology of some actinomycete genera.// Research in microbiology. 1993. Oct. 144(8). P. 657-660.

32. Goodfellow M., Mordarski M., Williams S.^.//Actinomycetes in biotechnology. SanDiego. 1988. P. 340-341.

33. Goodfellow M., Lacey J., Todd C. Numerical classification of thermophilic Streptomyces.il Journal of General Microbiology. 1987. V.133. P. 3135-3149.

34. Goodfellow M., Williams S.T. Ecology of actinomycetes.// Annual reviews of microbiology. 1983. V. 37. P.189-216.

35. Groth I, Schumann P, Rajney FA, Martin K, Schuetze B, Augsten K. Bogoriella caseilytica gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic actinomycete from a soda lake in Africa.// Int J Syst Bacteriol. 1997 Jul;47(3) P.788-794.

36. Sb.Hagedorn C. Influence of soil acidity in Streptomyces populations inhabiting forest soil.// Appl. Environ. Microbiology. 1976. V.32. P.368-375.

37. Hasegawa Т., Takizawa M., Takida S. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes II Journal General Applied Microbiology. 1983.V29. P. 319322

38. Hiroshi T, Kubota Т., Yamamoto M., Miyamoto K., Inamori Y. Characterization of Chitinase Genes from an Alkaliphilic Actinomycete, Nocardiopsis prasina OPC131 //Applied and Environmental Microbiology, February 2003, Vol. 69. No. 2. P. 894-900

39. Horikoshi K. Alkaliphiles: Some applications of their products for biotechnology // Microbiology and Molecular Biology Reviews, December 1999.63.4. P. 735-750

40. Jiang, C. L. Xu . Actinomycetes of lakes on the Yunnan Plateau. The Actinomycetes, 1985/6 19 P. 211-222

41. Jiang C., Xu L. Actinomycetes diversity in unusual habitats// Actinomycetes. 1993. V.4. №2. P. 47-57.

42. Kim S.B., Goodfellow M. Streptomyces thermospinisporus sp. nov., a moderately thermophilic carboxydotrophic streptomycete isolated from soil.// International

43. Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 2002. July. 52(Pt 4). P. 12251228.

44. Lechevalier M. P., Lechevalier H. A. Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes. Internation Journal of Systematic Bacteriology 1970 20, P. 435-443.

45. Loc/cwood J.L. Streptomyces spp. as a cause of natural fungitoxicity in soils// Phytopathology. 1959. V. 49. P. 327-331.

46. Lonsdale J. Aspects of biology of acidophilic actinomycetes/ Ph.D. Thesis. University of Newcastle upon Tyne. 1985.48 p.

47. McCarthy A.J., Cross T. A taxonomic study of Thermomonospora and other monosporic actinomycetes.// Journal of General Microbiology. 1984. V. 130. P.525.

48. Mikami Y., Miyashita K., Arai T. Alkalophilic actinomycetes.// Actinomycetes. 1986. V.19. P. 176-191.

49. Ming-Gang Li, Wen-Jun Li, Ping Xu, Xiao-Long Cui, Li-Hua Xu Cheng-Lin Jian Nocardiopsis xinjiangensis sp. nov., a halophilic actinomycete isolated from a saline soil sample in China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 317-321

50. Nioh I., Osada M., Yamamura Г., Muramatsu K. Acidophilic and acid-tolerant actinomycetes in a acid tea field soil.// Journal of General and Applied Microbiology. 1995. V.41. Iss.2. P.175-180.

51. Park J.O., El-Tarabily K.A., Ghisalberti E.L., Sivasithamparam K. Pathogenesis of Streptoverticillium albireticuli on Caenorhabditis elegans and its antagonism to soil-borne fungal pathogens.// Lett Applied Microbiology. 2002.V.35. P.361-365.

52. Park J. S.f Horinouchi S., Beppu T. Characterization of leader peptide of an endo-type cellulase produced by an alkalophilic Streptomyces strain. //Agric. Biol. Chem. 1991. 55 P. 1745-1750

53. Prauser H. New nocardioform organisms and their relationship. Actinomycetes: boundary microorganisms, Edited by T. Arai. Tokyo: Toppan Co. 1976. P. 193-207

54. Sato, M, Т. Beppu, K. Arima. Properties and structure of a novel peptide antibiotic no. 1970. //Agric. Biol. Chem. 1980.44 P. 3037-3040

55. Skulachev V.P. Chemiosmotic systems and the basic principles of cell energetics // Molecular Mechanisms in Bioenergetics. Amsterdam: Elsevir. 1992. P. 37 - 73.

56. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classic nov.// International journal of systematic bacteriology. 1997. V.47. N.2. P .479-491.

57. Taher W.A. Identification of alkaline-dependent Streptomyces as Streptomyces caeruleus Baldacci and characterizatoin of the species under controlled conditions.// Canadian Journal of Microbiology. 1959. V.5. P. 335-344.

58. Taber W.A. Evidence for the existence of acid sensitive actinomycetes in soil.// Canadian Journal of Microbiology. 1960. V.6. P.503-509.

59. Tandeau de Marsac N., Houmard J. Complementary chromatic adaptation: physiological conditions and action spectra // Methods in Enzymology. Packer L., Glazer N, edit. - San Diego: Acad. Press. 1988. - P. 318 - 328.

60. Tsujibo, H., T. Sato, M. Inui, H. Yamamoto, and Y. Inamori. Intracellular accumulation of phenazine antibiotics production by an alkalophilic actinomycete// Agric. Biol. Chem. 1988. 52 . P. 301-306.

61. Tsujibo, H., Y. Yoshida, К. Miyamoto, Т. Hasegawa,Y. Inamori. Purification and properties of two types of chitinases produced by an alkalophilic actinomycete. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. 56. P. 1304-1305

62. Tsuchiya, К., I. Ikeda, T. Tsuchiya, and T. Kimura Cloning and expression of an intracellular alkaline protease gene from alkalophilic Thermoactinomyces sp. HS682. //Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997.61. P. 298-303

63. Waksman S.A. The actinomycetes. Classification, identificatoin and description of genera and species. Vol.2. The Williams & Wilkins Co. Baltimore. 1961. 363 p.

64. Wang Laiju, Ruan Ji-Sheng Classification of actinomycetes isolated from saline-alkali soils// ISBA 94: Int. Symp. Biol. Actinomycet., Moscow, July 10-15, 1994. Thes.-M. 1994.238

65. Waldon C.R., Eveleigh D.E. Saccharification of cellulosics by Microbispora bispora.4 Applied Microbiological Biotechnology. 1986. V.24. P.487^92.

66. Ward A.C., Nam C., Goodfellow M., Seong C.N, Hah Y.C. Numerical classification of acidophilic actinomycetes isolated from acid soil in Korea.// Korean Journal of Microbiology. 1993. Oct. V.31(5). P.355-363.

67. Williams S.T., Davies F.L., Mayfield СЛ., Khan M.R. Studies on the ecology of actinomyces in soils.II. The pH-equirenments of streptomyces from two acid soils// Soil Biology and Biochemistry 1971. V.3. P. 187-199.

68. Williams S.T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M., Sneath P.H., Sackin M.J. Numerial classification of Streptomyces and related genera.// Journal of General Microbiology. 1983. June. V.129. P. 1743-1813.

69. Yallop С. A, Edwards С, Williams S.T. Isolation and growth physiology of novel thermoactinomycetes// Journal of Applied Microbiology. 1997. Dec. 83(6). P. 685692.

70. Yang, L.L., Haug A. Purification and partial characterization of a procaryotic glycoprotein from the plasma membrane of Thermoplasma acidophilum// Biochim. Biophys. Acta 1979. 556.265-277.

71. Yoshida K., Iguchi A., Mukaisaka M., Aoki H., Imanaka H. Japan patent 151196, November 28.

72. Yuan W.M., Crawford D.L. Characterization of Streptomyces lydicus WYEC108 as a potential biocontrol agent against fungal root and seed rots 7/ Applied Environmental Microbiology. 1995. Aug. V.61.P. 3119-3128.

73. Yum, D. Y, N. C. Chung, D. N. Bai, D. N. OK and J. N. Yu. Purification and characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomyces sp. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. 58 P. 470-474