Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов

Жуков, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов"

На правах рукописи

ЖУКОВ Владимир Александрович

МЕТОДОЛОГИЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВОСПРИИМЧИВОСТИ ХОЗЯИНА К ВИРУСНЫМ ИНФЕКЦИЯМ И ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ВЫБОРА ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.01.06 - биотехнология (в т.ч. бнонапотехнологин)

4854610

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 4 СЕВ 2011

Кольцово - 2010

4854610

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович

доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович

доктор биологических наук, доцент Лихошвай Виталий Александрович

Ведущая организация

Учреждение Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, г. Москва

Защита диссертации состоится «22» апреля 2011 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора по адресу: 630559, р.п. Кольцове, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.(8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « » 20года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук У'^уг-а^/х/"-- Г.П. Трошкова

Посвящается памяти моих родителей Жуковой Т.В. и Жукова A.C. и академика Воробьева A.A., внесшего неоценимый вклад в развитие и выполнение данной работы.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Важным аспектом предотвращения неблагоприятных последствий эпизоотий и эпидемий инфекционных заболеваний, появления новых (вновь возникающих) инфекций является своевременный прогноз восприимчивости животных или человека к патогенам, а также подбор и создание наиболее эффективных противовирусных средств. Решение данных задач основано на использовании модельных биологических систем - культур клеток и модельных животных с последующим испытанием безвредности и оценки эффективности на животных и человеке. Однако, широкое использование биологических моделей и биотехнологий не сопровождалось столь же интенсивной разработкой методов или моделей экстраполяции (масштабирования) количественных параметров, характеризующих свойства вирусов, с одной модельной системы на другую и в конечном итоге на организм хозяина (животного и/или человека), как, например, в радиобиологии, фармакологии и токсикологии - дисциплинах, где также используются живые модельные системы. Использование для микробов методов экстраполяции, разработанных для химических и физических факторов, невозможно, т.к. в отличие от последних микробы являются размножающимися (инфекционными) объектами. Разные виды животных, вообще говоря, не являются равно чувствительными к одному и тому же виду микробов, поэтому прямой перенос результатов экспериментов по определению показателей инфекционности патогенов или защитного уровня противовирусных препаратов (ПВП) на модельных животных на другие виды животных и человека неправомочен. Наиболее важным показателем вирусов является 50% инфицирующая доза (Ю50), характеризующая главное свойство микробов - способность инфицировать и образовывать инфекционный процесс. Важность этого показателя определяется и тем, что вероятность инфицирования организма хозяина является дозо-зависимой, при этом величина IDS0 является характеристическим параметром функциональной зависимости вероятности инфицирования от дозы заражения. Это означает, что ¡Dso определяет долю заболевших в группе инфицированных объектов, т.е. заболеваемость в коллективе. Определение Ю50 экспериментальным путем требует заражение групп

макроорганизмов известными дозами патогена. Очевидно, что для вирусов, вызывающих инфекции с летальным исходом, в применении к человеку такая возможность отсутствует. Что касается оценок, сделанных на основании моделирования аварийных случаев, то согласно многим исследователям эти данные являются приблизительными, требуют уточнения и дополнительного обоснования.

Более пятидесяти лет в вирусологических исследованиях используются первичные культуры клеток, выделенные из органов-мишеней хозяина. В многочисленных исследованиях с первичными культурами макрофагов показано наличие корреляции способности макрофагов продуцировать вирус в экспериментах in vitro с восприимчивостью организма хозяина к различным макрофаготропным вирусам. Эти данные свидетельствуют о потенциальной пригодности первичных культур клеток органов-мишеней для оценки восприимчивости их хозяина к вирусам.

В свете вышеизложенного работы по изучению межвидовой взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на клеточном и организменном уровнях хозяина, в том числе при изучении свойств вируса с использованием первичных культур клеток органов-мишеней являются актуальными. Следует признать актуальным проведение таких исследований для социально-значимых и особо-опасных инфекций. Представителем первой группы является вирус гриппа (ВГ), второй -вирус Марбург (ВМ).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка метода экстраполяции (прогнозирования) 50% инфицирующей дозы вируса (Ш50) с модельного (лабораторного) животного на хозяина (в том числе человека), а также разработка на базе предложенного метода новых подходов к выбору кандидатных препаратов и модельных животных для оценки эффективности потенциальных противовирусных препаратов в отношении защиты хозяина (в том числе человека).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Построение математической модели взаимосвязи/Ds0 вируса для хозяина и параметров взаимодействия вируса с восприимчивыми клетками хозяина на фоне действия факторов врожденного иммунитета (далее - уравнение инфекционности).

2. Построение алгоритма экстраполяции Ю50 с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток.

3. Построение алгоритмов оценки параметров модели

прогнозирования ID5Q в экспериментах in vitro.

4. Разработка методов получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток легких и трахеи лабораторных животных.

5. Экспериментальное определение ID50 вируса гриппа при аэрогенном инфицировании экспериментальных животных.

6. Экспериментальное изучение особенностей взаимодействия вируса гриппа с восприимчивыми клетками (альвеолоцитами I и II типа, реснитчатыми клетками), макрофагами и нейтрофилами в суспензионной первичной культуре клеток легких и трахеи экспериментальных животных.

7. Оценка вклада внеклеточных защитных (барьерных) факторов выстилки респираторных органов экспериментальных животных в формирование их восприимчивости к вирусу гриппа.

8. Проверка работоспособности алгоритма прогнозирования Ю50 на примере прогноза Ю50 вируса Марбург для обезьян и ID50 вируса гриппа для крыс и мышей.

9. Применение метода для прогнозирования IDS0 вируса Марбург для человека. Разработка новых подходов к выбору кандидатных препаратов и экспериментальных животных, моделирующих заданную инфекцию и пригодных для оценки противовирусной активности кандидатных препаратов, перспективных в отношении защиты человека от данной инфекции.

Научная новизна н практическая значимость. В данной работе впервые проведено комплексное теоретико-экспериментальное исследование взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на организменном и клеточном уровнях хозяина с использованием методов математического и экспериментального моделирования. В ходе исследования получены следующие новые результаты.

1. На основании обобщенной схемы развития инфекционного процесса для патогенов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания, разработано уравнение инфекционности. Данное уравнение связывает параметры вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) с вероятностью инфицирования хозяина одним вирионом, которая связана с IDS0 обратной зависимостью.

2. На основании анализа уравнения инфекционности разработаны два варианта алгоритма экстраполяции Ш50 с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и

данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток: частный вариант предназначен для случая, когда отличия в активности факторов врожденного иммунитета у хозяина и модельного животного не существенны и модифицированный вариант - когда отличия существенны.

3. Разработаны алгоритмы оценки параметров модели прогнозирования ID50 в экспериментах in vitro с использованием суспензионных и монослойных первичных культур клеток, в том числе алгоритмы оценки вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета без прямого подсчета количества инфицированных клеток и алгоритмы оценки средней урожайности вируса в клетке.

4. Адекватность уравнения инфекционности, алгоритма оценки параметров модели прогнозирования Ю50, частного и модифицированного алгоритмов прогнозирования показана на примерах прогнозирования /D50 вируса Марбург для обезьяны (зеленая африканская мартышка) и IDS0 вируса гриппа для мыши ICR и крысы Wistar.

5. Показано, что для прогнозирования восприимчивости обезьяны к вирусу Марбург, используя морскую свинку в качестве модельного животного, достаточно учитывать только отличие в восприимчивости макрофагов.

6. Проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток мыши CD-I и крысы Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro. Показано, что восприимчивость и вируспродуцирующая способность альвеолоцитов I и II типов при их инфицировании вирусом гриппа in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток.

7. Показано, что для прогнозирования восприимчивости трахеи и легких мыши ICR и трахеи крысы Wistar к вирусу гриппа при использовании мыши CD-I в качестве модельного животного достаточно использовать только первичные культуры клеток соответствующего органа, а для легких крысы Wistar необходимо также использовать данные по вируснейтрализующему действию секреторных факторов бронхоальвеолярной эпителиальной выстилки крысы. Это свидетельствует, что первичные культуры клеток адекватно моделируют свойства клеток (при взаимодействии с вирусом) in vivo и позволяют адекватно оценивать «базовую» (клеточно-опосредованную и без учета факторов врожденного иммунитета) восприимчивость хозяина к вирусу гриппа. При незначимом проявлении иммунных факторов «базовая»

соответствует реальной восприимчивости.

8. На основании анализа уравнения инфекционности обоснованы количественные критерии восприимчивости и резистентности хозяина к инфекции в зависимости от величин параметров вирус-клеточного взаимодействия (вероятности инфицирования клетки одним вирионом и средней урожайности вируса в клетке), критерий оптимального выбора ПВП, определяющий критическую степень снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия, при достижении которой вероятность образования инфекционного процесса при любой дозе инфицирования становится равной нулю, т.е. когда макроорганизм становится резистентным к инфекции. Показано, что для обеспечения невосприимчивости хозяина нет необходимости достигать полной невосприимчивости клеток, когда вероятность инфицирования клеток и/или урожайность клеток равна нулю, необходимо, чтобы величина произведения параметров вирус-клеточного произведения была меньше либо равна 1. Данный критерий можно использовать для выбора кандидатных ПВП при их испытании в клеточных системах.

9. Математическими методами показано, чтобы перевести макроорганизм с помощью противовирусных средств в невосприимчивое к вирусу состояние, достаточно с одной и той же (критической) кратностью уменьшить один из следующих параметров - вероятность инфицирования клетки (интегрально характеризующую стадии прикрепления и проникновения вируса в клетку) или среднюю урожайность вируса в клетке (интегрально характеризующую стадии репродукции, сборки и выхода вируса).

10. Математическими методами обосновано условие, выполнение которого необходимо для проявления эффекта синергизма при сочетанном применении двух ПВП, т.е. когда два неоптимальных ПВП, примененные совместно, переводят макроорганизм в невосприимчивое состояние. Для проверки выполнения условия достаточно оценить уровни снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия для каждого из тестируемых ПВП в отдельности. Условие может быть использовано для выбора кандидатных пар ПВП, когда индивидуальное применение средств не обеспечивает перевода хозяина в состояние полной резистентности.

11. Выведен критерий выбора модельного животного для тестирования ПВП. Выполнение критерия обеспечивает, что ПВП, являющийся оптимальным для модельного животного, будет оптимальным и для моделируемого хозяина.

12. С применением разработанного метода оценено, что вероятность (аэрогенного) инфицирования человека одним вирионом

вируса Марбург равняется 0,014 (-0,004;+0,005). Полученное значение может быть использовано для оценивания риска заражения человека при моделировании различных ситуаций чрезвычайного характера. В частности, данная оценка была использована в исследовании, выполненном с участием автора в Center for Security Studies and Research, East Carolina University, Greenville, North Carolina, USA и посвященном оценке эффективности современных средств обнаружения микроорганизмов в воздушной среде (основанных на методах ИФА, ПЦР, масс-спектрометрии) в сравнении с вероятностью инфицирования человека, находящегося в контаминированной зоне.

13. С использованием разработанных алгоритмов оценена восприимчивость к вирусу Марбург и вируспродуцирующая способность клеток макрофагов морских свинок, обезьян и человека in vitro. На основании этих данных оценены величины критического уровня критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к животным и человеку. Прогнозируется, что оптимальный для человека ПВП должен снижать вероятность инфицирования клетки или урожайность вируса или их произведение не менее чем в 187 раз. На основании анализа критических уровней критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к человеку, морской свинке и обезьяне (зеленой африканской мартышке) показано, что для выбора эффективного ПВП против вируса Марбург морская свинка являются более подходящей моделью человека, чем обезьяна. Оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия могут быть использованы в математических моделях развития инфекции Марбург указанных хозяев, а критические уровни - при подборе ПВП для борьбы с указанной инфекцией.

14. Разработана лабораторная технология получения и культивирования первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи, сохраняющих жизнеспособность и способных продуцировать вирус гриппа в течение 54 часов.

15. Для вируса гриппа разработаны методики оценки параметров модели прогнозирования IDS0 (а именно вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средней урожайности вируса в клетке) в экспериментах in vitro с суспензионными первичными культурами клеток легкого и трахеи лабораторных животных.

16. Построена и проверена на литературных данных формула для оценки коэффициента эпидемиологической эффективности противовирусных средств через дозы /О50 этиологического вируса, измеренные для интактного и обработанного препаратом

макроорганизма. В совокупности с моделью прогнозирования ID50 формула позволяет прогнозировать возможную эпидемиологическую эффективность кандидатных препаратов, основываясь на данных лабораторных экспериментов.

17. По результатам исследования изданы методические рекомендации по проблеме прогнозирования 50% инфицирующей дозы вируса для хозяина и оценке параметров моделей прогнозирования.

Полученные данные существенно углубляют и дополняют представления о методических подходах, которые следует использовать при изучении и характеризации вирусов, разработке и оценке потенциальной эффективности противовирусных средств. Разработанные модели, уравнения, методы, алгоритмы и критерии могут быть использованы для количественной оценки потенциальной опасности существующих и вновь возникающих вирусов для человека, оценивания значимости участия различных типов клеток и факторов врожденного иммунитета в формирование восприимчивости хозяина к инфекции, что позволит более надежно и обоснованно выбирать кандидатные противовирусные средства на стадиях лабораторных исследований.

Положения, выносимые на защиту. Предметом защиты диссертации является комплекс математических моделей и алгоритмов, позволяющих прогнозировать Ю50 вируса для хозяина (в том числе человека) на основе параметров вирус-клеточных взаимодействий, полученных в экспериментах in vitro, обеспечивать оптимальный выбор противовирусных препаратов, обладающих заданными свойствами, и оценивать их эпидемиологическую эффективность, подбирать адекватных модельных животных, а также оценивать степень подобия восприимчивости клеток к вирусам in vitro относительно in vivo. Используя технологию математического и экспериментального моделирования, в работе получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.

1. Уравнение инфекционности адекватно связывает параметр восприимчивости организма хозяина к вирусу (вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) с параметрами вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) для вирусов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания.

2. Частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования ¡D50 с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней позволяют адекватно прогнозировать

восприимчивость хозяина к вирусам, вызывающим инфекцию во входных воротах, в условиях соответственно незначительных и выраженных отличий факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина.

3. Разработанные алгоритмы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия позволяют адекватно оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия.

4. Первичные культуры клеток макрофагов адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусу Марбург. Первичные культуры клеток трахеи и легкого адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость соответствующего органа хозяина к вирусу гриппа in vivo.

5. Величина произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия может быть использована в качестве критерия восприимчивости/резистентности хозяина к инфекции, а также критерия выбора оптимального ПВП и выбора модельного животного для выбора ПВП оптимального для хозяина.

6. Величина коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП может быть оценена сверху величиной 1- ED50u/ED50v, где EDSOu и EDS0V - 50% эффективная доза патогенна (IDS0 или LD50), определенная для хозяина, получившего и не получившего препарат.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 33 всесоюзных, всероссийских и международных научных конференциях: Всесоюз. конф. «Математическое моделирование иммунитета и инфекционного процесса», Кольцово, Новосибирская обл., 1989; Всесоюз. конф. «Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ», Москва, 1990; Intern. Conf. on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, USSR, 1991; Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии», Томск, 1991; Fourth Intern. Aerosol Conf., Los Angeles, California, 1994; Всерос. конф. "Экология и здоровье", Новосибирск, 1996; 3rd Intern. Conf. on Medical B-Protection, München, 1996; Russian-German colloq. on Filo viruses: The modern state of problem, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997; Всерос. конф. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера», Новосибирск, 1998; Всерос. вторая научн. конф. 'Томеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1998; Intern. SB Medical Treatment Symp. Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without chemical and biological weapons,

Zagreb-Dubrovnik, Croatia, 1998; 18th Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Tacoma, Washington, USA, 1999; Intern. Congress on Circumpolar Health, Harstad, Norway, 2000; Intern. Conf. on Bacterial and Viral Virulence Factors, Smolenice, Slovakia, 2000; 19th Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), St. Louis, Missouri, 2000; 3-rd Intern. Conf. on Emerging Zoonoses 2001, Noordwijkerhout, Holland, 2001; Intern. Conf. On Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, 2002; X междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине экологии», Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2002; Intern. Biological Medical Conf. 2003, Prophylaxis and treatment of BW health disorders, Munich, Germany, 2003; 22nd Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Anaheim, California, USA, 2003; Intern. Conf. On Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, 2004; Междун. конф. «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» - Сосновка, Новосибирская обл., 2004; 23rd Conference of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Atlanta, Georgia, 2004; Intern. Biological Medical Defense Conf. 2004, Munich, Germany, 2004; Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 2004; European Aerosol Conference, Budapest, Hungary, 2004; 2-й Междун. конф. «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда», Пущино, Московская обл., 2005; XIII Intern. Cong, of Virology, San Francisco, California, USA, 2005; Intern. Biological Medical Defense Conf. 2005, Munich, Germany, 2005; III Рос. Научн. конф. с междун. участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2006, Новосибирск; 9th World Conf. on Biosensors, Toronto, Canada, 2006; Междун. конф.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07», Гурзуф, Украина, 2007; 11-th Intern. Biological Medical Defense Conf. 2007, Munich, Germany, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ, в т.ч. 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертационной работы, списка цитируемой литературы (511 ссылок), раздела с благодарностями и приложения. Работа изложена на 324 страницах, включая 14 рисунков и 29 таблиц.

Личный вклад соискателя. Благодарности. Выполнены лично: разделы 1-6, 7.2-7.4, 8.8, 9, 10, под руководством автора в соавторстве с

к.б.н. Шишкиной JI.H. (разделы 8.1-8.7), к.м.н. Сергеевым A.A. (разделы 8.1, 8.2, 8.4-8.7); Петрищенко В.А. (разделы 8.1, 8.2, 8.4-8.6); к.б.н. Плясуновым И.В. (раздел 8.6); Фанкиным И.В. (разделы 8.1, 8.5); д.м.н. Сергеевым А.Н. (разделы 8.1-8.7); к.ф.-м.н. Сафатовым A.C. (разделы 8.3, 8.4, 8.7); к.б.н. Пьянковым О.В. (разделы 8.3, 8.4, 8.6); д.м.н. Несвижским Ю.В. (раздел 8.6); к.т.н. Топорковым B.C. (разделы 8.3, 8.4); к.т.н. Яшиным В.А. (разделы 8.3, 8.4); Беляевым Н.М. (разделы 8.3, 8.4), Киселевым С.А. (раздел 8.6); под руководством автора: д.б.н. Рябчиковой Е.И. (изучение тканей трахей и легких инфицированных животных методом электронной микроскопии в разделе 8.1); д.м.н. Малковой Е.И. (изучение клеточного состава экспериментальных суспензий методом световой микроскопии в разделах 8.1, 8.5); к.ф.-м.н. Зайцевым Б.Н. (определение физического титра вируса гриппа методом атомной силовой микроскопии в разделе 8.8). Результаты, полученные совместно с: д.м.н. Сергеевым А.Н., Пьянковой О.Г., к.б.н. Булычевым Л.Е., Петрищенко В.А., к.б.н. Пьянковым О.В., к.б.н. Рыжиковым А.Б., к.б.н. Шишкиной JI.H., к.ф.-м.н. Сафатовым A.C. (данные по восприимчивости мышей ICR при инфицировании вирусом, гомологичным использованному в исследовании; метод прямого определения наличия инфекционного процесса гриппа у мышей и крыс - в раделе 8.4). Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность всем коллегам за плодотворное сотрудничество, а также к.ф.-м.н. Сафатову A.C., д.м.н. Сергееву А.Н., к.б.н. Пьянкову О.В., к.т.н. Субханкулову Г.Ф., д.б.н. Рябчиковой Е.И., Ярославцевой O.A. за предоставленные данные.

Автор сохранил признательность и память о своем научном консультанте академике A.A. Воробьеве и первом руководителе профессоре В.М. Чермашенцеве, бывшем генеральном директоре ГНЦ ВБ «Вектор» академике JI.C. Сандахчиеве, бывшем заместителе генерального директора профессоре А.П. Садовском, бывшем директоре института аэробиологии ГНЦ ВБ «Вектор» к.т.н. B.C. Топоркове, оказывавшим поддержку в проведении исследований.

Автор искренне благодарит за сотрудничество, помощь в организации и проведении работ Генералову Т.Н., Копылову Е.О., Окулову JIM., Кириченко Т.Б., Прудникову Н.В., Соловей И.М., к.х.н. Котлярова Л.А., Грехову Г.П., Евтина Н.К., Колесникову Н.Г., к.вет.н. Бондаренко В.Н., д.м.н. Ставского Е.А., к.б.н. Мартынюк P.A., Фомичеву И.В., к.б.н. Прыткову О.В., Лобанову Т.П., Николаеву А.И. и Речкину О.Л.; за доставку животных из питомника г. Пущино - Юркина А. и Оробея Д.; за полезные и продуктивные обсуждения при проведении работ и помощь при оформлении работы - к.ф.-м.н. Марьясова А.Г., к.х.н. Зайцева С.А., Красникову О.М., Наумочкина А.Н., д.б.н.

Офицерова В.И., д.б.н. Сабельникова А.Г., к.б.н. Скрипченко A.A.,

Сучкова С.И., Терещенко А.Ю., к.б.н. Фролова В.Г., Хлопцеву Н.П., к.т.н. Шабанова A.B., Юрченко В.В.; за участие в планировании и обсуждение результатов исследования в рамках проекта ISTC/DARPA №450р, результаты которого вошли в данную диссертацию - Morse S. (Columbia University, New York, USA, со-директор (1996-2000) программы Pathogen Countermeasures, DARPA, USA), Anderson G.W. (MRI, Frederick, USA, представитель (1999-2002) DARPA, USA), Finke E.J. (Bundeswehr Institute of Microbiology, Munich, Germany, коллаборатор проекта).

Автор выражает отдельную благодарность за дружескую поддержку, обсуждения, полезные советы при проведении работ и помощь при написании рукописи, понимание важности для автора выполнения данного исследования к.х.н. Гусеву Ю.М., Хусаинову М.Д., а также за помощь, поддержку, терпение жене Луговской Л.Я и всей семье.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штамм вируса гриппа (ВГ) A/Aichi/2/68 (H3N2), свободных от патогенной флоры мышей CD-I и крыс Wistar, а также конвенциональных мышей ICR.

Для определения IDS0 ВГ для легких и трахеи животных инфицировали (5-10 голов на дозу, 4-5 доз инфицирования) аэрозолем с аэродинамическим диаметром 3,5 мкм (а2 = 0,78). Наличие инфекционного процесса в органе определяли прямым методом по наличию вируса в органе через 48 ч после заражения. IDS0 вируса гриппа для трахеи или легких вычисляли по формуле ID50 = AID50 ■ ка, где AIDS0 - 50% инфицирующая доза, рассчитанная исходя из значений концентрации ВГ в аэрозоле, ка - коэффициент осаждения аэрозоля 3,5 мкм (величины ка для животных определены в разделе 8.3). Дозы A!D50 и их дисперсии вычисляли по методу Ван дер Вардена. Зависимости доза-эффект определяли однократно для трахеи мыши ICR и дважды во всех остальных случаях. В случае повторов дозы IDS0 усредняли. Сравнение доз IDS0 проводили по Z-критерию. В качестве дисперсии lgIDS0 для трахеи мышей ICR использовали среднюю величину дисперсий всех определенных 1дЮ50 - 5|=0,044, в остальных случаях в качестве дисперсии средних (по двум повторам) lgIDsa использовали величину равную 0,55^=0,023.

Первичные культуры клеток получали методом дезагрегации легочной и трахеальной ткани с помощью трипсина. Для изменения соотношений реснитчатых клеток, альвеолоцитов I и II типов, а также макрофагов и нейтрофилов использовали метод адгезии клеток в

пластиковых флаконах в присутствии 10% эмбриональной сыворотки, а также метод фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/см3. Инфицировали исходные культуры клеток легкого и трахеи, суспензии неадгезированных клеток и клеток, собранных в верхней и нижней фракциях. Для каждого типа культуры в 3 повторах определяли C/Dso, урожайность N, а также процентное содержание вышеприведенных типов клеток. Дозы СЮ50 нормировали на 1 млн. клеток по формуле из раздела 5.2. Урожайность N вычисляли по формулам, выведенным в разделе 5.3. Инкубацию вируса во всех случаях проводили при 37°С.

Цитологическое исследование проводили при увеличении 1000 в световом микроскопе Axiovert-40 (Цейс, Германия) в препаратах, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову. Идентификацию клеток осуществляли на основе характерных для них морфологических признаков. Репродукцию вируса гриппа в суспензионных первичных клеточных культурах легких и трахеи подтверждали методом ультратонких срезов. Срезы изучали в электронном микроскопе Н-600 (Хитачи, Япония) при увеличениях 5000-30000.

Жидкость, содержащую внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки (ИФСЭВ) крыс получали из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), которую диализировали с целью максимального освобождения полученной жидкости от хлорида натрия и лиофилизировали, с последующим разведением продукта лиофилизации в изотоническом растворе NaCl. Изучение вирус-нейтрализующего действия жидкости, содержащей ИФСЭВ, проводили в контактных опытах in vitro с последующим определением инфекционности вируса гриппа при заражении РКЭ.

Величины констант скорости нейтрализации вируса гриппа ИФСЭВ крыс, термоинактивации вируса kTV и скорости инфицирования клеток, k[CV определяли по формулам, выведенным в разделе 5.1.

Для прогнозирования ID50 использовали частный и модифицированный алгоритмы, вывод которых приводится в разделах 3 и 4. Для решения уравнения инфекционности при прогнозировании дозы Ш50 частным алгоритмом использовали метод перебора, а при прогнозировании модифицированным алгоритмом использовали программу поиска решения уравнения из MS Excel 2007.

Проверка адекватности алгоритмов прогнозирования проведена на примере экстраполяции IDso вируса Марбург с морской свинки на обезьяну (зеленая африканская мартышка) и IDso вируса гриппа для легких и трахеи с мыши CD-I на мышь ICR и крысу Wistar, а также с мыши ICR на крысу Wistar с последующим сравнением прогнозируемых

с экспериментально измеренными величинами Ю$о.

Сравнение прогнозируемых с экспериментально определенными /£>50 проводили но двустороннему г-критерию [Закс Л., 1976] г -

прогнозируемой или экспериментально определенной дозе ID50, a S?-оценка дисперсии соответствующей величины 1дЮ50„. Дисперсию прогнозируемой величины lglDSOpre(l полагали равной дисперсии экспериментально определенной величины lgIDs0, соответствующей тому животному, которое использовалось как модельное. В случае прогнозирования 1дЮ50 вируса Марбург для обезьяны дисперсию прогноза полагали равной дисперсии IglD50 для морской свинки, определенной по экспериментальным данным. Дозу ID5Q вируса гриппа для трахеи мышей ICR определяли в одном эксперименте, в то время как во всех остальных случаях (легкие мышей ICR, трахеи и легкие мышей CD-I и крыс Wistar) - в двух независимых повторах. Поэтому в качестве дисперсии lglDS0 для трахеи мышей ICR использовали среднюю величину дисперсий всех (для вируса гриппа) экспериментально определенных 1дЮ50 - 5^=0,044, в остальных случаях в качестве дисперсии средних (по двум повторам) 1дЮ50 использовали величину равную 0,55^=0,023. Дисперсию прогноза lglDs0 для трахеи крысы при экстраполяции с мышей ICR полагали равной Sa2 =0,044, во всех остальных случаях прогноза - равной О.б^ЧЗДОЗ.

В работе также использовали однофакторный дисперсионный анализ и t- критерий. Достоверным принимался уровень значимости а<0,05. Данные представлены как среднее значение (М) ± стандартное отклонение среднего (SM), количество повторов (и). Параметр п не приводится для доз ID50 и концентраций ВМ, выраженных в БОЕ.

При выводе уравнения инфекционности рассматривали вероятностную модель формирования инфекционного процесса, а также использовали формулу полной вероятности и аппарат производящих функций. При выводе модифицированного алгоритма прогнозирования Ю50 вируса для хозяина с учетом факторов врожденного иммунитета анализировали простейшую кинетическую модель инфекционного процесса, согласно которой полагали, что на начальных стадиях инфекционного процесса скорости снижения концентрации свободного вируса, обусловленные процессами инфицирования клеток и нейтрализации фактором иммунитета, следуют кинетике реакции псевдовторого порядка с константами скоростей к, (характеризует восприимчивость клеток к вирусу) и kN (характеризует восприимчивость вируса к фактору иммунитета), соответственно, а скорость спонтанной

I'flfPsQpred-toiPsoexpl

•, где индекс «pred» или «ехр» относит параметр к

инактивации (термоинактивации) следует реакции псевдопервого порядка с константой скорости и кт (характеризует общую устойчивость вируса), т.е. описываются соответственно уравнениями

где К (С) - концентрация активного свободного вируса, С(<:) -концентрация неинфицированных клеток, - концентрация фактора иммунитета, £0 =0 - время инфицирования организма или культуры клеток или внесения вируса в среду культивирования с или без фактора иммунитета.

Сформулируем основные предположения, в рамках которых решается задача разработки метода прогнозирования Ю50 вируса для хозяина.

Гипотеза независимого действия, согласно которой каждый вирион, попавший в организм хозяина, независимо от других может с некоторой вероятностью, р, вызвать инфекционный процесс (условие 1).

Популяция хозяина. Рассматривается гомогенная популяция хозяина по восприимчивости к вирусу (условие 2).

Модель инфекционного процесса. Рассматривается обобщенная модель образования инфекционного процесса заболеваний, у которых место первичной репликации одновременно является органом-мишенью, или, когда место первичной репликации не является органом-мишенью, но наработка вируса в месте первичной репликации непременно приводит к поражению органа-мишени, т.е. ассоциируется с полноценным инфекционным заболеванием, а также выход вируса из первично-инфицированных клеток происходит до значимого изменения активности неспецифических факторов и иммунного ответа (условие 3). Для упрощения изложения орган, являющийся воротами инфекции, будем называть органом-мишенью. Уточним условие 3. На первом этапе считаем, что только один тип клеток является восприимчивым к вирусу. В соответствии с гипотезой независимого действия поведение вириона в органе-мишени является вероятностным процессом. Обозначим Р/с вероятность инфицирования одной из восприимчивых клеток, соответственно с вероятностью 1—Р1С вирион может подвергнуться спонтанной инактивации (термоинактивации) и инактивации или нейтрализации факторами неспецифической защиты (в интактном

(1) (2) (3)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Основные предположения

организме). Считаем, что количество вируса, произведенного инфицированной клеткой, может варьировать от клетки к клетке и является случайной величиной распределенной по закону Пуассона относительно среднего количества (средней урожайности вируса в клетке) равного N. Параметры Р1С (вероятность инфицирования клетки) и N (средняя урожайность вируса в клетке) будем называть параметрами вирус-клеточного взаимодействия.

50% инфицирующая доза. Считаем, что инфекционный процесс не образовался, если процесс наработки вируса в клетках и последующего инфицирования клеток прекращается до того, как произойдет значимое изменение эффективной восприимчивости клеток вследствие активации факторов защиты и иммунного ответа.

Подобие условий in vitro и in vivo. Считаем, что урожайности вируса в клетке in vitro и in vivo равны, а удельная восприимчивость клеток в условиях in vitro изменяется относительно условий in vivo; при этом степень изменения не зависит от вида клеток и хозяина; удельная противовирусная активность неклеточных факторов врожденного иммунитета (неспецифических ингибиторов) в условиях in vitro не изменяется по отношению к условиям in vivo; скорость термоинактивации вируса при равных температурах in vivo и in vitro одинакова (условие 4).

2. Уравнение инфекционности

Как показано в работе (Peto S.A. Dose-response Equation for the Invasion of Microorganism // Biometrics. 1953. 9(9). P. 320-335), из гипотезы независимого действия для гомогенной популяции справедлива экспоненциальная зависимость доза-эффект

где P(D) - вероятность инфицирования организма при попадании в него некоторого количества вирионов со средним значением равным D, р -вероятность инфицирования хозяина одним вирионом. Там же показано, что

где /1>50 выражается в физическом количестве вирионов. Отсюда следует, что задача прогнозирования Ш50 равносильна прогнозированию вероятности р.

Способность вириона, попавшего в организм, вызвать инфекционный процесс, обусловлена способностью «дочерних» вирионов, появившихся в результате первого цикла репродукции вируса в инфицированной клетке, поддерживать многораундную репликацию. Использование формулы полной вероятности и аппарата производящих функций позволило связать вероятность р с параметрами вирус-

P(D) = 1 - e~p D,

(4)

р = In2/IDS0,

(5)

клеточного взаимодействия уравнением

р = Р1С ■ (1 - е(6) называемому далее уравнением инфекционности. Уравнение относительно неизвестного р относится к классу трансцендентных уравнений, что означает невозможность выражения р через параметры вирус-клеточного взаимодействия. Решение таких уравнений может быть найдено только численными методами. Тем не менее, некоторые свойства уравнения можно проиллюстрировать, основываясь на общих свойствах функций, входящих в уравнение инфекционности.

Для восприимчивого хозяина доза Ю50 является конечной величиной, которой в соответствии с (5) будет соответствовать некоторое значение вероятности р 0 < р < 1, верна и обратная связь. Поэтому при решении уравнения инфекционности следует определять значение неизвестного р из интервала 0 < р < 1 и только в случае отсутствия такого решения, следует принять решение р = 0, которое формально всегда существует и которому соответствует бесконечное значение дозы /£)50, означающее полную резистентность хозяина к инфекции.

Рассмотрим графическую интерпретацию уравнения инфекционности (рис. 1).

Рис. 1. Графическая интерпретация вероятностного уравнения инфекционности

A. Случай существования решения, соответствующего конечной дозе IDS0.

B. При Р/с ■ N< 1 касательная к графику У2(р) прир>0 проходит под У^Ср).

Представим левую и правую части уравнения как функции от переменной р: Уг{р) ~ р и У2(р) = Р1С • (1 - е'р М). Графиком функции (р) является прямая линия, исходящая из начала координат под углом 45° к оси абсцисс, а графиком функции (р) ~ экспонента, обращенная выпуклостью вверх, исходящая также из начала координат и асимптотически приближающаяся снизу к прямой, идущей параллельно оси абсцисс на уровне У(р) = Р,с. Решению уравнения будет соответствовать абсцисса точки пересечения графиков У1 и К2, значение которой всегда меньше Р,с. При уменьшении Р[С или N кривая У2 становится соответственно целиком ниже или положе исходной кривой, при этом точка пересечения графиков приближается к началу

координат, т.е. значение вероятности р становится ближе к 0. Легко убедиться, что при урожайности вируса в клетке всего лишь в 7 раз больше дозы Ю50, N/IDS0 >7, величина выражения 1 — e~p'N из правой части уравнения инфекционности становится меньше 0,01. Это означает, что р становится практически равной Р!С.

Условие отсутствия положительного решения уравнения инфекционности (т.е. когда р = 0) следует из свойств строго вогнутых функций, к которым относится функция Y2(p). При P,c'N< 1, (7)

график строго вогнутой функции целиком, за исключением точки касания, находится под касательной, исходящей из начала координат под углом < 45°, что и означает существование только нулевого решения уравнения. В противном случае, когда

PIC-N> 1, (8)

уравнение инфекционности будет иметь положительное решение, р > 0, когда доза IDS0 конечна. Отсюда, условие (7) является критерием невосприимчивости или резистентности хозяина, а условие (8) -критерием восприимчивости хозяина к инфекции.

Согласно условию 4 урожайности вируса в клетке in vivo (N) и in vitro (Nv, индекс «К» у параметра означает соответствие его условиям in vitro) равны, а восприимчивость клеток может изменяться. Поэтому при использовании параметров вирус-клеточного взаимодействия, измеренных в экспериментах с первичными культурами клеток, в уравнение инфекционности следует ввести дополнительный параметр -масштабный коэффициент, k~P¡c/Picv учитывающий отличия восприимчивости клеток in vitro и in vivo, что приводит к уравнению p=A-Plcv-( 1-е-Р^). (9)

Вероятность P¡cv является аналогом вероятности инфицирования вирусом всего организма или органа-мишени - р, отличаясь от последней тем, что определяется для культуры восприимчивых клеток, при этом культура считается инфицированной если произошло заражение хотя бы одной клетки-мишени с образованием в ней инфекционного вирусного потомства. В этом случае по аналогии с (5) справедливо, что

= ж (10)

Подстановка в (9) вместо вероятностей р и PICV выражений (5) и

(10) позволяет получить уравнение, связывающее ID5Q вируса для

хозяина с параметрами вирус-клеточного взаимодействия

-i- = Я ■ — ■ (1 - е-ъа-пуПвso). (11)

/ds0 e/oso v j v '

Уравнения (9) и (11) наряду с (6) будем также называть уравнением инфекционности, при этом уравнения, в которые входят

вероятности, будем называть вероятностными уравнениями инфекционности. Следует отметить, что в вероятностном уравнении урожайность должна быть выражена в количестве вирионов, а в (не вероятностном) уравнении инфекционности урожайность и дозы Ю50 и CIDsa можно выражать в биологических единицах.

Если у хозяина восприимчивыми к вирусу являются клетки R типов, то уравнение инфекционности принимает вид P = HrP,cr-( l-e-r-»'), (12)

где Р1Сг и Nr — параметры вирус-клеточного взаимодействия для клеток г-го (г = 1, ...,R) типа. Для отсутствия положительного решения этого уравнения необходимо и достаточно, чтобы Р1Сг • Nr <1.

3. Частный алгоритм прогнозирования ID50 вируса для

хозяина

Считаем, что существует модельное животное, при инфицировании у которого развивается инфекционный процесс подобный процессу в организме хозяина. Рассмотрим случай, когда отличия в активности факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина несущественны.

Для модельного животного возможно определение не только параметров вирус-клеточного взаимодействия, но и инфицирующей дозы, что позволяет по уравнению инфекционности вычислить величину коэффициента L Согласно условию 4 восприимчивость клеток к вирусу (Р1С или CID50) in vitro относительно восприимчивости этих клеток in vivo изменяется одинаково для хозяина и модельного животного. Если при этом отличия в активности факторов врожденного иммунитета несущественны и в экспериментах in vitro концентрации клеток, полученных от различных хозяев, соответствует в одинаковой степени концентрациям in vivo, то величины масштабного коэффициента X для различных хозяев должны быть одинаковыми. Это следствие позволяет сформулировать приводимый ниже алгоритм экстраполяции Ю50 с модельного животного на хозяина. Нижний индекс «т» при параметре будет означать, что параметр измерен для модельного животного или его клеток.

1. Определяется ¡DSOm для модельного животного.

2. В экспериментах in vitro определяются P¡cv и Nv для клеток модельного животного и хозяина.

3. Вычисляется величина коэффициента Я при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для модельного

, in 2 животного Я = -;--—77—г.

"550m''>/CVm'(l-e m Vm)

4. Вычисляется величина вероятности р при подстановке в уравнение инфекционности р = Я ■ P¡cv • (1 — e~p Nv) параметров,

измеренных для хозяина и вычисленной величины Я, после чего для хозяина определяется доза Ю50 = Ы2/р.

Подстановка в уравнение п.4 алгоритма выражения вероятности р через Ю50 и выражения для коэффициента X п. 3 алгоритма, логарифмирование обеих частей уравнения позволяет получить интегральное уравнение для прогнозирования 1дЮ50 = lgID50m + IgPjcvm ~ lg?icv +

+lg( 1 - e-'"*iWH>Som) _ ig(i _ g-tnz-Wv/'Dso). (13)

Подстановка в равнение выражения P,cv через CIDS0 приводит к другой форме интегрального уравнения lgID50 = 1дШ50т - lgCID50m + 1дСЮ50 +

+ lg(l - e-!n2Nym/lDsomJ _ lg(l _ e-ln2-Ny/IDsoJ_ ^

Как будет показано ниже, вероятность PICV может быть оценена через количество инфицированных клеток и инфицирующую дозу, в этом случае возможно выражение дозы и следовательно вероятности в условных единицах.

Т.к. при N/1D50 >1 величина e""In2'w/,Ds°<0,01, то можно в уравнении (13) или (14) опустить члены с экспонентами и полученное упрощенное уравнение, например,

lglDsо = lg!DSOm + lgP,cvm - lgP,cv = lg'DSOm - lgCIDSOm + lgCIDS0, (15) использовать для приближенного вычисления величины lgIDS0.

4. Модифицированный алгоритм прогнозирования ¡D50 вируса для хозяина с учетом нейтрализующих факторов врожденного иммунитета

Модифицированный алгоритм прогнозирования с учетом факторов врожденного иммунитета получен на основе рассмотрения кинетической модели инфекционного процесса, представленной тремя уравнениями (1) - (3), которые описывают убыль концентрации активного вируса при инфицировании восприимчивых клеток, нейтрализации фактором иммунитета и в процессе спонтанной (термо) инактивации. Так как нас интересует вероятность образования инфекционного процесса, то естественно предположить, что на начальных стадиях формирования инфекционного процесса, когда концентрация свободного вируса (in vivo) не достигает своих максимальных значений, справедливо, что концентрации неинфицированных клеток, C(t), и фактора иммунитета, F(t), в результате взаимодействия с вирусом меняются незначительно, т.е. C(t) « С(0) = С0, F(t) « F(0) = F0. В этом случае уравнения (1) и (2) могут рассматриваться как уравнения псевдопервого порядка с константами k¡c = k¡ • С0 и kNF = kN • F0. Так как в организме все процессы снижения концентрации свободного вируса протекают

параллельно, то общее снижение концентрации вируса вследствие инфицирования клеток, нейтрализации факторами иммунитета и термоинактивации будет описываться интегральным уравнением

^m=-(klc + kNF+kT).víti (16)

Используя формулы для выражения количества продукта параллельных реакций первого порядка на момент времени t через начальное количество субстрата и константы скоростей соответствующих (параллельных) процессов были получены выражения для определения вероятности того, что к моменту времени t вирусная частица либо инфицирует клетку, P/C(t), либо окажется нейтрализованной фактором иммунитета, PNF(t), либо подвергнется термоинактивации, PT(t),

р. (С) = ^ =-5:--h - «*» _ jс MF, T. (17)

' v(0) k,c+knf+kt 1 j' v '

a также для определения абсолютной вероятности того, что вирион инфицирует клетку

Р,с=-—-. (18)

k,c+kNF+kT

Согласно условию 4 величины коэффициентов нейтрализации и термоинактивации, измеренные in vivo и in vitro не отличаются kN = kNV и кт = kTV, а восприимчивость клеток in vitro относительно in vivo изменяется. Введем коэффициент Д = k¡/k¡v. который характеризует степень изменения восприимчивости клеток в культуре клеток по отношению к их восприимчивости в живом макроорганизме. Отсюда и согласно (18)

р _ k¡c __P-kiyCo___ц-kicv_

ÍC k¡c+kNF+kT pkivC0+kNyF0+kTv fkicv+OfkNFV+kTV' где // = /?■ С0/Cov - масштабный коэффициент, учитывающий отличие и концентраций, и восприимчивости клеток in vivo и in vitro; kicv = kIV • Cov и kNFV = kNV ■ Fov - соответственно константы скоростей инфицирования клеток с концентрацией равной Cqy и нейтрализации вируса фактором иммунитета с концентрацией равной F0K; коэффициент Dp — Fo/Fqv учитывает отличие концентраций фактора иммунитета in vivo и in vitro.

Подстановка в (7) выражения (19) вместо P¡c приводит к кинетической форме уравнения инфекционности р=---(1-е-^У). (20)

nk,cv+DF-kNFv+kTv

Данное уравнение является линейным относительно коэффициента ц, откуда следует формула для вычисления р. _ p-(Df-ícNpv+krv) DF-kNFV+kTV DF-kNFV+kTv

fc,cv[(l-e-pwv)-p]

kicv

~p-Nv

kicv

m-z-т- (21)

(1-е '"50 ').ip50 t

Согласно условию 4 степень изменения восприимчивости клеток, полученных от различных хозяев, одинаковая, поэтому величина масштабного коэффициента ц для модельного животного и хозяина будет одинаковая, если при проведении экспериментов in vitro соотношение концентраций клеток модельного животного относительно хозяина будет как в условиях in vivo. Отсюда следует модифицированный алгоритм прогнозирования ¡D50 вируса с учетом нейтрализующего фактора врожденного иммунитета.

1. Определяется/D50m для модельного животного.

2. В экспериментах in vitro определяются Nv и k¡cv для клеток хозяина и модельного животного, DF и kNFV для фактора иммунитета хозяина и модельного животного и kTV при культивировании вируса при температуре равной температуре тела хозяина и модельного животного.

3. Вычисляется величина коэффициента ц по формуле (21) при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для модельного животного.

4. Вычисляется величина вероятности инфицирования хозяина одним вирионом р при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для хозяина и полученного значения ц, после

m ¡n2

чего определяется доза 1D5Q = —.

Интегральное уравнение, связывающее вероятность р с другими параметрами, ввиду громоздкости не приводится.

Важной особенностью модифицированного алгоритма является необходимость использования в вычислениях величин IDS0, CID50 и N, выраженных в количестве вирионов в отличие от частного алгоритма прогнозирования, в котором возможно использования параметров, выраженных в условных единицах.

5. Теоретическое обоснование способов оценки in vitro параметров моделей прогнозирования

5.1. Определение вероятности инфицирования клеток, констант скоростей термоинактивации, нейтрализации вируса и инфицирования клеток

Рассмотрены три типа экспериментов по культивированию вируса in vitro: в первом случае вирус инкубируется в бесклеточной среде и без фактора иммунитета, во втором - вирус инкубируется в бесклеточной среде с (нейтрализующим) фактором иммунитета и в третьем - вирус инкубируется в присутствии чувствительных клеток и в отсутствие фактора иммунитета. Убыль вируса обусловлена: в первом эксперименте - термоинактивацией, во втором - нейтрализацией фактором и термоинактивацией, в третьем - инфицированием клеток и термоинактивацией. Пусть V¡(t),i = 1,2,3 - концентрация вируса в

каждом из трех экспериментов с одинаковой начальной концентрацией при изучении термоинактивации и нейтрализующих факторов, т.е. VM = К2(0). Если во всех случаях убыль концентрации вируса соответствует кинетике псевдопервого порядка, то справедливы следующие формулы для определения in vitro констант скоростей: для константы скорости спонтанной инактивации вируса

ктг в (22)

для константы нейтрализации вируса фактором нейтрализации , _ inv2(t)-lny2(0) , _ lnV1{t)-lnV2(,t)

KNFV — I KTV — l > vZJ;

для константы скорости инфицирования клеток

kICV = inv^-;^-kTV. (24)

Если скорость взаимодействия вируса с клетками много меньше скорости инактивации, то из-за экспериментальной погрешности определения концентрации вируса величины klcv + kTV и kTV могут оказаться статистически неразличимы, из-за чего величина klcv по формуле (24) будет оценена 0. Для этого случая выведены формулы для оценки k,cv и Pjcv через дозу CID5Q вируса для культуры первичных клеток-мишеней и количество инфицированных клеток. В первом случае величина ktcv может быть вычислена путем численного решения уравнения

ЛИ. = - -. [i _ e-(.i<icv+i<tvH] (25)

cids0 k,cv+ktv 1 j' v 7

где t - длительность времени инкубации вируса с клетками при определении дозы С/О50. Во втором случае

Picv=yo, (26)

где С+ - концентрация инфицированных клеток (может быть определена методом инфекционных центров) в среде сокультивирования клеток и вируса, V0 - концентрация вируса в инфицирующей дозе. В этом случае величина k!CV может быть вычислена путем численного решения уравнения

£+ = k'cv . Г-l _ e-(fc/c+fc7v) t] С274)

Vo k,cv+kT v I J' v >

5.2. Нормирование вероятности инфицирования клеток и дозы C/D50 на количество клеток

Для корректного сопоставления вероятностей инфицирования клеток или доз СЮ50 для клеток от различных видов хозяина и использования их в алгоритме прогнозирования необходимо, чтобы эти параметры были измерены для определенного количества клеток, что бывает трудно выполнить в эксперименте. Так как в экспериментах in vitro используются концентрации клеток много меньше, чем в условиях

in vivo, то величина константы скорости инфицирования культуры клеток может стать меньше константы скорости термоинактивацил. В этом случае возможно нормирование вероятности P¡cv и дозы CIDS0, измеренных для концентрации клеток C1Vi на концентрацию клеток CQV:

= (28) с IV

C/Dso = C/Dsocl-^. (29)

5.3. Определение урожайности вируса в клетке (N)

Формула оценки урожайности вируса в клетке выведена исходя из предположений, что термоинактивация вируса, вышедшего из клетки в среду культивирования, соответствует кинетике нсевдопервого порядка и, что кинетика продукции вируса в клеточной культуре состоит из 3-х фаз: эклипса и созревания вируса; стационарной фазы продукции вируса и фазы инактивации вируса. ; Vs - максимальная стабильная концентрация вируса для всей стационарной фазы продукции вируса. Показано, что N может быть оценена по формуле

N = ns + kTV-ns-{t2-tl), (30)

где ns - количество вирионов, произведенных одной клеткой и неинактивировавшихся к моменту времени из интервала t2], в котором наблюдается стационарная фаза продукции вируса. В свою очередь

Щ=——, (31)

s VoPicv к '

где V0 - концентрация внесенного вируса в среде культивирования при инфицировании клеток; Vs - концентрация не инактивированных вирусных частиц во время стационарной фазы продукции вируса. Если

вероятность P¡cv определяется через C7D50 согласно (10), то vscid5 v0im

6. Вывод упрощенной модели прогнозирования с учетом нейтрализующего фактора и частного алгоритма прогнозирования из модифицированного алгоритма прогнозирования

Если величины константы скорости инфицирования клеток меньше константы скорости термоинактивации, тогда k¡cv + kTV ~ kTV и И-' k¡cv + 0F ' kNFV + kTV ~ Df ■ kNFV + kTV. Подстановка этих выражений в выражения для вероятности инфицирования клетки in vitro и in vivo и в уравнение инфекционности приводит к упрощенному интегральному уравнению прогнозирования lg IDS0 = lg IDSOm - lgCIDSOm +

+ lgC¡D50 + lg (Dp • kNFV + kTV) - lg(DFm ■ kNFVm + kTV) +

ns = (32)

+lg(l-e~'°soNv^-lg(i-e loZn'^y (33)

Полученное интегральное уравнение в отличие от уравнений, входящих в исходный модифицированный алгоритм, позволяет использовать дозы IDS0, C1DS0 и N, выраженные в условных (биологических) единицах. При равенстве противовирусной активности факторов иммунитета у обоих видов хозяина будет выполняться равенство DP ■ kNFV + kTV = DFm ■ kNFVm + kTV, из чего следует уравнение прогнозирования (14) частного алгоритма.

Математически показано, что если константа скорости инфицирования клетки in vivo не превышает величину константы скорости термоинактивации, т.е. fi ■ klcv < kTV¡ и если в экспериментах in vitro происходит разбавлении концентрации клеток, то величина прогноза IglDso по упрощенному уравнению будет отличаться от прогноза по полному уравнению не более, чем на величину 0,3, которая сопоставима со статистической погрешностью изменения при экспериментальном определении Ш50. Так как уже при

/ 2_.лЛ

N/ID50>6 величина Igil — e /Dso 1 становится меньше 0,007, то в

качестве приближенного решения уравнения (33) можно использовать выражение, стоящее в его правой части за исключением последних двух слагаемых с экспонентами, что приводит к уравнению lg JDS0 = lg Ю50т - lgClDSOm + lgC!DS0 +

+ lg (df ■ kNFV + kTV) - lg(dfm • kNFVm + kTV). (34)

7. Проверка адекватности частного алгоритма прогнозирования ID50 на примере вируса Марбург

В разделе приводятся результаты проверки адекватности частного алгоритма прогнозирования idsq на примере экстраполяции /Dso ВМ с морской свинки на обезьяну (зеленая африканская мартышка), а также прогноза восприимчивости человека к ВМ. Из литературных данных следует, что при аэрогенном заражении ВМ первично инфицируемыми клетками являются макрофаги, а также что ВМ способен подавлять антигенпрезентирующую функцию дендритных клеток. В литературе не отмечается подверженности этого вируса воздействию каких-либо факторов врожденного иммунитета. Отсюда следует, что для данного вируса будет достаточно учесть при прогнозировании только клетки макрофагов. Параметры вирус-клеточного взаимодействия оценивали, используя литературные данные по эффективности инфицирования и кинетикам репродукции вируса в первичных культурах макрофагов животных и человека. По формуле (26) с последующей нормировкой на 1 млн. клеток были определены

величины вероятности инфицирования макрофагов, Р,Су: 0,45±0,30 (п=3), 0,18±0,09 (и=2) и 0,020±0,007 (и=2) Ю"3/(БОЕ/мл) для морской свинки, обезьяны и человека соответственно. Урожайность N оценивали количеством вирусных частиц, не инактивированных к моменту времени достижения максимальных концентраций вируса по формуле (31): 53±22, 117±33 и 440±118 БОЕ/клетка для макрофагов морской свинки, обезьяны и человека соответственно.

При экстраполяции Ю50 с морской свинки на обезьяну использовали уравнение (13), значения параметров, определенные выше, а также величину дозы 1дЮ50т для морской свинки = -0,67 1д(у.е.). Дозу Ю50т для морской свинки и пробные значения /£>50 для обезьяны выражали в количестве вирионов исходя из соотношения 1 у.е. = 10 вирионов. Урожайность N выражали в количестве вирионов в двух вариантах: исходя из очевидного соотношения 1 БОЕ > 1 вирион и исходя из оценки 1 БОЕ = 30 вирионов, приведенной в литературе. В обоих случаях прогнозная величина 1дЮ50 равняется -0,26 1д(у.е.), которая незначимо (а=0,05) отличается от нижней и верхней оценок 1дЮ50 для обезьяны, -0,57±0,38< 1дЮ5Оо6< -0,16±0,38 1д{у.е.). Это свидетельствует об адекватности частного алгоритма прогнозирования Ш50, а также свидетельствует об адекватности уравнения инфекционности и возможности использования первичных культур макрофагов для адекватного прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусу Марбург. Прогноз Ю50 вируса Марбург для человека произведен путем экстраполяции с морской свинки аналогично тому, как это делалось для обезьяны. Для обоих вариантов выражения БОЕ в количестве вирионов прогнозируемая величина 1дЮ50 для человека равняется 0,69±0,14 1д(у.е.) или 49±2 вириона. Отсюда можно оценить вероятность инфицирования человека одним вирионом р = 1п2/Ю50 =0,014 (-0,004;+0,005). Т.о., при аэрогенном инфицировании человек восприимчив к ВМ примерно в 20 раз меньше, чем морская свинка, и в 7-17 раз меньше, чем обезьяна.

8. Проверка адекватности частного н

модифицированного алгоритмов прогнозирования Ю50 на примере вируса гриппа

8.1. Оптимизация условий культивирования первичной суспензионной культуры клеток, выделенной из легочной ткани мышей

В качестве клеточной системы для изучения параметров взаимодействия вируса гриппа с клетками широко используют первичные культуры клеток, полученные из органов дыхания, в виде монослоя, сформированного на специальных подложках, например, на

коллагене. Однако клеточный состав таких первичных клеточных культур не соответствует естественному соотношению клеток в органе, поскольку там присутствуют клетки, которые обладают слабой адгезивной способностью и, соответственно, не «приживаются» в монослое. На первом этапе работы были разработаны методы получения первичной суспензионной культуры легочных клеток и оценки ее восприимчивости к вирусу гриппа. Показано, что полученная с помощью ферментативной дезагрегации первичная суспензионная культура легочных клеток мышей, содержит все основные клеточные тины: реснитчатые клетки - 0,7+0,5 %; бокаловидные клетки - 0,5+0,4 %; альвеолоциты I типа - 0,9+0,4 %; альвеолоциты II типа - 3,8±1,2 %; недифференцированные эпителиальные клетки - 5,2±1,5 %; макрофаги -12,8±2,6 %; нейтрофилы - 10,3±2,0 %; эозинофилы - 1,1±0,6 %; лимфоциты - 51,4±6,8 % ; прочие - 13,3+1,4 % (во всех случаях н=3). С помощью электронной микроскопии было показано, что клетки в суспензионных первичных культурах продуцируют вирус гриппа при культивировании в течение 30 ч после инфицирования in vitro.

Для культивирования инфицированных вирусом гриппа первичных культур клеток в суспензии по результатам серии экспериментов была выбрана среда DMEM/F12 с добавлением 0,5 % эмбриональной сыворотки Gold (ICN Biomedicals Inc).

8.2. Оптимизация условий определения С/£>50 вируса гриппа для суспензионных культур клеток

Для определения CID50 необходимо определить момент времени для измерения концентрации вируса, при котором несвязавшийся вирус инактивируется, а вероятность наличия в суспензии неинактивированного вновь наработанного вируса максимальная. Для этого были изучены кинетики наработки ВГ в суспензиях первичных культур клеток ткани легкого мышей и крыс при разной множественности заражения и кинетики инактивации вируса в суспензиях дебриса клеток. Использовали три различные дозы вируса, при этом концентрации ВГ в суспензии клеток и дебрисе клеток на 0 часов инкубации сопоставимы. Вирус начинает выходить из клеток через 6-12 ч после их инфицирования. Концентрация ВГ достигает максимальных значений к 18-24 часам после инфицирования, после чего остается на стационарном или близком к нему уровне до 42-48 часов для клеток мышей и 36-42 часов для клеток крыс. При этом, после 24 часов инкубации ВГ в дебрисе клеток не обнаруживается. Средняя продолжительность стационарной фазы продукции вируса для легочных клеток мышей равняется 26,0+2,0 ч (и=3) и для легочных клеток крыс -18,0±3,5 ч («=3). Исходя из полученных данных, мы выбрали 30 ч как

время отбора биопроб для определения наличия наработки вируса в первичных суспензионных культурах легочных клеток экспериментальных животных, т.е. установления факта продуктивной адсорбции ВГ на первичных клетках и определения урожайности вируса в клетках.

Величины потери инфекционной вирусной активности, за первые и последующие 3 ч инкубации в дебрисе легочных клеток мышей (0,6±0,3 (/i=3) и 0,6±0,2 («=2) lg соответственно) и крыс (0,5±0,3 (и=3) и 0,3±0,3 (п=2) lg, соответственно) не отличаются (а>0,05) друг от друга, что подтверждает возможность использования экспоненциальной зависимости для описания инактивации вируса в среде культивирования. Среднее значение константы термоинактивации Сравняется 0,4±0,1 час" 1 (/1=10). Это значение и величины средней длительности стационарной фазы продукции вируса в дальнейшем были использованы для определения урожайности ВГ в первичных клетках.

8.3. Определение коэффициентов осаждения экспериментального аэрозоля в респираторных органах мышей и крыс

Четыре мыши CD-I и 4 крысы были экспонированы жидким аэрозолем (3,5 мкм), содержащим латексные частицы диаметром 3 мкм. Из трахеи и легких готовили гомогенаты с последующим приготовлением мазков на покровных стеклах и подсчетом в них количества частиц латекса в люминесцентном микроскопе Olympus СК-40, Япония при 280 кратном увеличении. На основании оценок количества латексных частиц, попавших в трахею и легкие, и находящегося во вдыхаемом объеме воздуха были определены величины ка экспериментального аэрозоля для трахеи и легких у мышей - 1,2±0,1 и 2,6±0,2 %, у крыс - 3,2±0,2 и 11,8±0,9 % соответственно (во всех случаях п=4).

8.4. Определение Я>50 вируса гриппа для респираторных органов-мишеней у экспериментальных животных при аэрогенном заражении

IDS0 вируса гриппа определяли отдельно для легких и трахеи, т.к. в этих органах восприимчивые клетки представлены различными типами: в трахее - реснитчатыми клетками, а в легком реснитчатыми и альвеолоцитами I и II типов.

Определено (таблица 1), что у мышей CD-I и ICR отличия между восприимчивостью к ВГ легких и трахеи незначимы, а у крыс трахея более восприимчива, чем легкие (а<0,05).

Отличия по восприимчивости трахеи к вирусу гриппа у крыс Wistar и мышей CD-I незначимы (а>0,05), но обе эти характеристики

достоверно ниже, чем восприимчивость к вирусу гриппа трахеи у мышей ICR. Восприимчивость к ВГ легких у крыс Wistar значительно ниже, чем у мышей CD-I и ICR (а<0,05). Восприимчивость легких у мышей CD-I достоверно ниже, чем у мышей ICR (а<0,05).

Таблица 1

Дозы Ш50 ВГ для органов дыхания экспериментальных животных при _аэрогенном заражении_

Вид животных Средние значения lglDsа для органов дыхания, гяэид,0

Трахея Легкие

Крыса Wistar -0,1 ±0,2** 1,3±0,2*

Мышь CD-I -0,4±0,2** -0,5±0,2**

Мышь ICR -1,1±0,2 -1,2±0,2

Примечание: * - показатель достоверно отличается (а>0,05) от показателя для легких у мышей и от показателей для трахеи у мышей и крыс; ** - показатель достоверно отличается (а>0,05) от аналогичного показателя у мышей ICR

8.5. Определение параметров вирус-клеточного взаимодействия для клеток легких и трахеи экспериментальных животных в первичной суспензионной клеточной культуре

Был оценен вклад различных клеток эпителия респираторных органов в развитие инфекции. В экспериментах использовали первичные суспензионные культуры клеток, полученных из ткани легкого и трахеи животных, а также суспензии неадгезированных клеток после инкубации в пластиковых пробирках и клеток, собранных в верхней и нижней фракциях после центрифугирования. Для смесей определяли процентное содержание клеток - реснитчатых, альвеолоцитов I и И типов, макрофагов, нейтрофилов, и других - (таблица 2), а также величины C/ö50 и N (таблица 3). Значимость варьирования CID50 и N, а также содержания каждого типа клеток в клеточных суспензиях в зависимости от способа их получения для мышей CD-I и крыс проверялась методом однофакторного дисперсионного анализа. Согласно результатам, для обоих видов животных концентрация реснитчатых клеток во всех первичных клеточных суспензиях менялась несущественно, а остальных клеток значимо (а<0,035). В таблице 2 приводятся также результаты попарного сравнения по критерию Стьюдента концентраций различных типов клеток в изучаемых смесях. При этом изменение CIDS0 и N вируса было незначимым (а=0,05). Из полученных данных следует, что восприимчивость к вирусу гриппа клеток легких и трахеи одинакова у мышей CD-I и крыс Wistar и меньше чем у мышей ICR, при этом восприимчивость и вирус-продуцирующая способность реснитчатых клеток существенно выше, чем альвеолоцитов I и II типов.

Таблица 2

Процентное содержание различных типов клеток в первичных культурах респираторных органов мышей и крыс после их разделения разными способами

Вид животных Вид культуры клеток Процентное содержание (%) различных типов клеток

РК АI АН Мф Нф Все другие клетки

Мышь СО-1 Суспензия дезагрегированных клеток легких 1,3±0,3 1,2±0,5 в 0,9±0,4 ни 9,8±1,1 в 15,0±1,3 н,в,ни,т 72,8±2,5

Неадгезированные клетки легких 2,3±0,2 0,1 ±0,1 в 0,0±0,0 ни 8,1±1,7 3,3±0,7 л,в 85,2±1,9

Клетки легких, собранные в верхней фракции ' 3,3±1,6 10,6±1,5 л,н,ни,т 1,6±0,8 2,3±2,3 л,ни 0,0±0,0 л,н,ни 82,2±4,0

Клетки легких, собранные в нижней фракции 1 3,2±0,6 3,9±1,6 в 3,8±0,9 л,н,т П,9±1,6 в 6,2±2,0 л, в 70,9±3,9

Суспензия клеток трахеи 1,2±0,1 0,0±0,0 в 0,0±0,0 ни 8,0±2,0 2,3±1,0 л 88,5±1,3

Крыса \Vistar Суспензия дезагрегированных клеток легких 2,4±0,6 0,9±0,3 в,ни,т 0,3 ±0,2 11,0±0,5 в 4,2±1,6 в 81,2±1,7

Неадгезированные клетки легких 2,1±0,5 1,0±0,3 в,ни,т 1,0±0,б 7,5±1,4 в 2,6±0,5 в 85,8±2,9

Клетки легких, собранные в верхней фракции I 0,7±0,7 19,9±2,6 л,н,ни,т 0,4±0,4 0,8±0,8 л,н,ни 0,0±0,0 л,н,ни,т 80,5±4,1

Клетки легких, собранные в нижней фракции * 1,7*0,1 2,7±0,1 л,н,в,т 3,6±1,2 т 10,б±1,8 в 2,8±0,4 в,т 78,5±2,0

Суспензия клеток трахеи 1,9±0,4 0,0±0,0 л,в,н,ни 0,0±0,0 ни 6,2±1,8 1,4±0,3 в,ни 90,5±1,5

Мышь 1СЯ Суспензия дезагрегированных клеток легких 0,7±0,5 0,9±0,4 3,8±1,2 т 12,8±2,6 10,3±2,0 т 71,5 3,1

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 1,1±0,2 0,0±0,0 0,0±0,0 л 9,3±2,3 2,8±1,0 л 86,8±2,5

Примечание: РК - реснитчатые клетки, А I (II) - альвеолоциты I (II) типа, Мф -макрофаги, Нф - нейтрофилы; ^ - клетки, полученные методом фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/см3; т - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток трахеи (а<0,05); ни - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток, собранных в нижней фракции (а<0,05); в - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток, собранных в верхней фракции (а<0,05); н -содержание клеток достоверно отличается от их содержания в суспензии неадгезированных клеток легких (а<0,05); л - содержание клеток достоверно отличается от содержания в исходной суспензии клеток легких (а<0,05); во всех случаях и=3.

Таблица 3

Значения 50% клеточных инфицирующих доз вируса гриппа (КИД50) и урожайности вируса гриппа (И) в суспензиях первичных культур клеток _легких и трахеи мышей и крыс_

Вид животных Виды полученных первичных суспензионных клеточных культур легких и трахеи Параметры вирус-клеточного взаимодействия в суспензионных первичных

Ш50,1д ЭИД50 N, 1дЭЩ50

Мышь CD-I Суспензия дезагрегированных клеток легких 4,0±0,5 3,1±0,3#

Неадгезированные клетки легких 4,0±0,6 2,7±0,3

Клетки легких, собранные в верхней фракции ' 4,3±0,3 2,5±0,1

Клетки легких, собранные в нижней фракции I 4,0±0,4 2,3±0,2

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 3,8±0,2 * 3,2±0,2 $

Крыса Wistar Суспензия дезагрегированных клеток легких 4,0±0,4 2,0±0,2

Неадгезированные клетки легких 3,9±0,2 2,0±0,2

Клетки легких, собранные в верхней фракции ^ 4,0±0,6 1,8±0,1

Клетки легких, собранные в нижней фракции * 3,7±0,3 1,1±0,6

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 3,7±0,3 * 2,1 ±0,5

Мышь ICR Суспензия дезагрегированных клеток легких 3,1±0,1 3,2±0,3 #

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 2,8±0,2 3,3±0,3

Примечание: СЮ50 - 50% клеточная инфицирующая доза вируса гриппа, нормированная на 1 млн. клеток; N - урожайность вируса гриппа для 1 клетки, через 30 часов культивирования в смеси клеток; 1 - клетки, полученные методом фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/см3; * - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток трахеи мышей ICR (а<0,05); $ - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток трахеи крыс Wistar (а<0,05); # - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток легких крыс Wistar (а<0,05); во всех случаях п~3.

Отсюда следует возможность использования математической модели (2) для «одноклеточного» случая. Кроме того, значимое изменение численности фагоцитов (макрофагов и нейтрофилов) в

исследованных интервалах незначимо влияет на восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа в суспензионных первичных культурах легочных клеток у мышей и крыс. Тем не менее, как показано выше, восприимчивость легких к ВГ у крыс оказалась достоверно ниже, чем восприимчивость трахеи крыс, а также легких и трахеи мышей CD-I. Согласно литературным данным, внеклеточные факторы, входящие в состав секреторной эпителиальной выстилки легких у крыс в отличие от мышей, способны в значительной степени нейтрализовать вирус гриппа. В связи с этим, на следующем этапе работы была оценена противовирусная активность указанных факторов крыс.

8.6. Изучение вируснейтрализующен активности внеклеточных ингибирующнх факторов, входящих в состав секреторной эпителиальной выстилки, в легких у крыс

Использованный в работе метод получения внеклеточных факторов, входящих в состав секреторной эпителиальной выстилки, не позволяет получать внеклеточные факторы отдельно от компонентов сурфактанта, находящихся совместно в секреторной выстилке, покрывающей поверхность воздухоносных путей и альвеол. Поэтому была оценена вируснейтрализующая активность, как компонентов сурфактанта, так и сопутствующих факторов неспецифического иммунитета, обозначаемых далее как «внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки» (ИФСЭВ) легких. Естественно ожидать, что все собственные компоненты сурфактанта, а также факторы иммунитета и альвеолярные макрофаги, находящиеся в слое сурфактанта, в одинаковой степени вымываются с лаважной жидкостью. Степень разведения компонентов сурфактанта в экспериментах in vitro относительно их концентраций в легких, которые приняты за 100%, охарактеризовали одним коэффициентом D = 1/DF. Коэффициент D оценили величиной 9,1±0,7% для легких и 101,1±7,8% для трахеи, исходя из оценки по литературным данным объема, занимаемого сурфактантом в легких, степени вымывания альвеолярных макрофагов с лаважной жидкостью (оцененной по результатам подсчета макрофагов в БАЛЖ и литературными данными по исходному количеству макрофагов в легких крыс), а также степени разведения лиофилизата при подготовке культуральной среды для экспериментального изучения нейтрализующей активности факторов. Обнаружено (таблица 4), что инфекционность ВГ после его соинкубации с ИФСЭВ достоверно (а<0,05) снижалась по сравнению с контролем. По формулам (22) и (23) были оценены величины соответственно константы скорости термоинактивации при 37 °С kTV,.= 0,6±0,2 (и=3) 1/час и константы скорости нейтрализации вируса ИФСЭВ kNFV = 1,8±0,3 (/¡=3)

1/час. Полученная здесь оценка константы скорости термоинактивации соответствует приводимой в разделе 8.2 величине константы скорости термоинактивации вируса в дебрисе клеток легкого мышей и крыс равной 0,4±0,1 1/час. На основании полученных данных константа скорости нейтрализации вируса в легком оценивается величиной 19,8±3,7 1/час - в 34 раза больше (а<0,05) константы скорости термоинактивации, а в трахее - величиной 1,8±0,3 1/час.

Таблица 4

Биологическая активность вируса гриппа до и после инкубации вируса с _ИФСЭВ крыс и в 0,9% растворе №С1_

Условия инкубации вируса гриппа до внесения в РКЭ Концентрация вируса гриппа, /(?ЭИД50/мл

1 2 3 М±5м

До инкубации 8,2 8,0 8,3 8,2±0,1

Вирус гршша+ИФСЭВ 7,3 6,8 7,4 7,2±0,2 *#

Вирус гриппа+0,9% раствор ЫаС1 (контроль) 7,8 7,8 8,3 8,0±0,2

Примечание: 1, 2, 3 - повторы эксперимента; * - количество ЭИД50 вируса гриппа достоверно отличается от контроля (р=0,04); # - количество ЭИД50 вируса гриппа достоверно отличается от количества вируса в ВАЖ до инкубации (р=0,01); М ± SM- среднее значение ± стандартное отклонение среднего.

8.7. Прогнозирование восприимчивости животных к вирусу гриппа с помощью частного и модифицированного алгоритмов экстраполяции

Проверка адекватности методов прогнозирования восприимчивости организма-хозяина к вирусу гриппа проведена на примере экстраполяции определенных выше данных по восприимчивости легких и трахеи с мышей CD-I и ICR на легкие и трахею крысы Wistar. Также проведена экстраполяция аналогичных данных с мыши CD-I на мышь ICR (таблица 5). Прогнозирование /Dso по частному алгоритму осуществлялось по уравнению (14), по модифицированному алгоритму -по полной модели (уравнение (20)) и упрощенной модели (уравнение (33)). При прогнозе по полной модели для перевода доз и урожайности вируса в количество вирионов использовали соотношение 1 ЭИД5о = 22,8±2,6 (определенное методом атомной силовой микроскопии, п-3).

Во всех вариантах прогнозирования по частному алгоритму восприимчивости трахеи прогнозные величины с высокой точностью и достоверностью (а=0,05) соответствуют экспериментально определенным величинам Ю50. Также наблюдается соответствие прогнозируемой и экспериментальной величин Ю50 для легких мыши

ICR. Как и ожидалось, для легких крысы в обоих случаях при использовании в качестве модельных животных мышей CD-I или ICR прогнозируется существенно более высокий уровень восприимчивости к вирусу гриппа, чем наблюдается в действительности при аэрогенном заражении крыс Wistar вирусом гриппа (а<0,001).

Таблица 5

Прогнозы /О50 ВГ по частному алгоритму без учета ИФСЭВ, полному и

упрощенному уравнению прогнозирования по модифицированному __алгоритму с учетом ИФСЭВ_

Модельное животное Хозяин 1DS0, /.дЭИДяо

Прогноз Эксперимент

Модифицированный алгоритм с учетом ИФСЭВ Частный алгоритм без учета ИФСЭВ

Полное уравнение Упрощенное уравнение

прогноз для трахеи

Лышь CD-I Крыса Wistar 0,2 0,2 -0,5 -0,1

Лышь CD-I Мышь ICR -1,2 -1,4 -1,4 -1,1

Иышь ICR Крыса Wistar 0,3 0,5* -0,2 -0,1

1рогноз для легких

Лышь CD-1 Крыса Wistar 1,1 1,1 -0,5** 1,3

4ышь CD-I Мышь ICR -1,2 -1,4 -1,2 -1,2

4ышь ICR Крыса Wistar 1,0 1.3 -0,3** 1,3

Примечание: * - прогнозная доза /О50 отличается от экспериментально измеренной при а=0,037; ** - прогнозная доза Ш50 отличается от экспериментально измеренной (<х<0,001); в остальных случаях - прогнозная величина IDB0 не отличается от экспериментально измеренной (а>0,05)

Во всех случаях прогнозирования по полному уравнению модифицированного алгоритма, в том числе для легких крысы, прогнозные величины соответствуют (а=0,05) значениям экспериментально определенным /О50. Это свидетельствует о значимости влияния ИФСЭВ легких крыс и об адекватности модифицированного метода прогнозирования, позволяющего учитывать нейтрализующие факторы иммунитета.

При использовании упрощенной модели модифицированного алгоритма во всех случаях кроме прогнозирования восприимчивости трахеи крыс при экстраполяции с мышей ICR результаты прогнозирования не отличаются достоверно (а=0,05) от экспериментально измеренных доз. При этом достоверность отличий (а=0,037) в отмеченном выше случае не является высоко достоверной. Это подтверждается и величиной разности между прогнозируемой и

измеренной дозами равной 0,6 /дЭИД50. Некоторое ухудшение прогностических свойств компенсируются упрощением вычисления величины прогноза дозы. Стоит отметить, что величины прогнозов по полной модели и упрощенной друг от друга отличаются незначимо. Как было оценено в разделе 6 при теоретическом анализе упрощенной модели, отклонения прогноза по упрощенной формуле должны отличаться от прогноза по полной модели не более, чем на 0,3 1д, что и наблюдается во всех случаях прогнозирования. Основываясь на вышеприведенных результатах упрощенный способ оценки можно рекомендовать для экспресс-прогнозирования восприимчивости хозяина.

Проведенное исследование также позволяет заключить, что данные о восприимчивости к вирусу гриппа только легочных клеток животного, для которого осуществляется прогноз Ю50, позволяют прогнозировать потенциальную или базовую (клеточную) его восприимчивость к вирусу, которая совпадает с реальной восприимчивостью в случае несущественных отличий влияния факторов врожденного иммунитета у модельных животных и хозяина. При наличии отличий для прогнозирования реальной восприимчивости хозяина необходимо учитывать активность барьерных факторов неспецифического иммунитета.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об адекватности частного алгоритма прогнозирования, когда не требуется учитывать нейтрализующие факторы врожденного иммунитета, и об адекватности модифицированного алгоритма, когда требуется учитывать нейтрализующие факторы врожденного иммунитета. Также показана возможность использования упрощенного варианта модифицированного алгоритма для экспресс-прогнозирования Ш50.

9. Следствия из уравнения инфекционности

Положительные результаты, полученные в предыдущих разделах, свидетельствуют как об адекватности разработанных алгоритмов, так и уравнения инфекционности, которое является основой алгоритмов. В данном разделе на основании анализа уравнения инфекционности дается формализованное описание и решение задач, связанных с изучением выбором оптимальных средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

9.1. Прогноз потенциальной эффективности

противовирусных препаратов для хозяина. Теоретическое обоснование критерия оптимальности противовирусных средств

Все ПВП можно условно разделить на 2 класса: препараты, снижающие вероятность инфицирования клетки и снижающие урожайность вируса в клетке, - не исключая возможности

принадлежности средства обоим классам. Отсюда следует возможность использования разработанных методов для прогнозирования потенциальной степени защиты человека различными ПВП. Для этого необходимо оценить исходный уровень параметров вирус-клеточного взаимодействия для интактных клеток-мишеней, а затем для клеток, обработанных ПВП. Для иммуноглобулинов схема оценки может быть аналогична схеме, использованной в настоящей работе для ИСФЭВ крыс. Естественно понимать под оптимальным противовирусным препаратом такой, после применения которого вероятность инфицирования хозяина станет равной 0 при любой дозе инфицирования (для терапевтических препаратов под дозой инфицирования можно понимать количество вируса, которое содержит хозяин на момент применения средства). Такое возможно только когда вероятность инфицирования хозяина одним вирионом, р, равняется 0. Как было доказано выше, уравнение инфекционности имеет нулевое решение (р > 0) тогда и только тогда, если Р1С ■ N < 1, т.е. реализуется критерий невосприимчивости хозяина. Таким образом, если чувствительность клеток интактного организма характеризуется параметрами Р1С0 и N0, то для перевода организма в невосприимчивое состояние необходимо, чтобы под действием ПВП средняя урожайность вируса в клетке или вероятность инфицирования клетки или их произведение уменьшилось, по крайней мере, в 1С = Pico' ^о Раз (критерий оптимальности ПВП, /с - критический уровень критерия оптимальности ПВП). Важно отметить, что величина 1С одна и та же для средств разной направленности действия: ингибиторов свободного вируса и репродукции, сборки и высвобождения вируса. Выведенный критерий справедлив и для профилактических, и для терапевтических препаратов.

9.2. Критерий выбора модельных животных для хозяина

Задача решается в предположении, что степень снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия под действием ПВП не зависит от вида хозяина. Определим также, что оптимальность ПВП для хозяина означает, что после применения ПВП вероятность инфицирования хозяина одним вирионом, р, становится равным 0. Будем считать животное модельным для хозяина, если ПВП, являющийся оптимальным для животного, будет оптимальным и для хозяина. Пусть для хозяина определена величина критического уровня критерия /Ci при этом существует два вида животных с критическими уровнями li > 1С и /2 < /с. Тогда в качестве модельного животного для хозяина (для предварительного выбора ПВП) следует выбрать животное с критическим уровнем > /с, так как средство, будучи оптимальным для этого животного будет снижать произведение параметров вирус-

клеточного взаимодействия в > 1С, т.е. будет оптимальным и для хозяина. В противном случае - при тестировании ПВП на втором виде модельного животного - может оказаться, что реальная степень снижения, /д, больше /2 , но меньше 1С. В этом случае средство переведет животное в невосприимчивое состояние, и будет признано эффективным и для хозяина, не являясь таковым на самом деле.

9.3. Влияние параметров вирус-клеточного взаимодействия на вероятность инфицирования хозяина

Математически доказывается, что при одной и той же степени снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия меньше критической - /с снижение вероятности инфицирования эффективнее снижает восприимчивость хозяина, чем снижение урожайности. Это происходит, потому что в первом случае в уравнении инфекционности изменяется параметр, стоящий перед экспонентой, а во втором -параметр, стоящий в показателе степени экспоненты. Соответствующие графики, построенные на примере ВМ приводятся ниже (рис.2).

9.4. Резистентность хозяина при восприимчивых клетках

Действительно, при Р,с > 0 и N > 0, а также при выполнении

выше сформулированного критерия резистентности Р1С • N < 1 заражение отдельных клеток не приведет к образованию инфекционного процесса. В этом случае возможно инфицирование клеток, но инфекционный процесс будет самозатухающим, т.е. через некоторое время с вероятностью 1 ни один из вирионов потомства не инфицирует новые клетки, т.е. процесс прервется.

9.5. Объяснение эффекта синергизма

Будем называть ПВП слабо-эффективным, если он снижает вероятность инфицирования и/или урожайность, но не переводит организм в состояние невосприимчивости, когда р = 0. Допустим, существует два таких средства. Пусть первое средство при индивидуальном применении приводит к уменьшению вероятности Р1С в h < ¡с раз, а второе средство приводит к уменьшению уровня репродукции вируса в клетке N в /2 < /с раз. Если выполняется условие ¡i • 12 =5 1с >то ПРИ сочетанном применении таких средств будет достигнут критический уровень уменьшения произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия и соответственно перевод организма в невосприимчивое состояние.

9.6. Схема оптимального выбора кандидатных ПВП в клеточных культурах

Считаем, что степени снижения вероятности адсорбции вируса на клетке и урожайности in vitro и in vivo равняются. Пусть определен критический уровень /с для хозяина. Можно сформулировать

следующую схему выбора ПВП. Для каждого ПВП в экспериментах с клетками определяется отдельно степень снижения вероятности инфицирования, 1Ск и степень ингибирования урожайности, 1ык, к = 1,2,... К - номер ПВП. Согласно критерию оптимального выбора ПВП в кандидатные следует отобрать препараты, для которых выполняется условие ¡ск'^мк^-^с- Если таковых не существует, то определяются пары ПВП, для которых 1ск • 1!Яг > 1С (к и г - номера препаратов). Такая схема требует 2К экспериментов, в отличие от К2 при полном переборе.

9.7. Оценка критического уровня для ПВП против вируса Марбург и выбор модельного животного для человека

Использовали полученные в разделе 7. оценки дозы Ю50 = 49 вирионов, урожайности N =13200 вирионов и соответствующую им величину Р1С = 0,014, которые были приняты за начальные значения данных параметров (Ю50о, и Р/Со). На основании этого величина критерия /с =187. Это означает, что оптимальный для человека ПВП должен в конечном итоге снижать вероятность инфицирования клетки и/или урожайность вируса не менее чем в 187 раз.

На рис. 2 приводятся графики изменения восприимчивости человека при изменении степени снижения вероятности инфицирования клетки или урожайности вируса в клетке в интервале от 1 до 187 раз.

0,016

1 2 5 10 25 125 187

Степень снижения, I

Рис. 2. Изменение восприимчивости человека к вирусу Марбург при снижении вероятности инфицирования клетки (Ряд 1) и урожайности вируса в клетке (Ряд 2).

В случае использования ингибиторов различных стадий репродукции, сборки и почкования вируса при степени снижения до 10 раз восприимчивость хозяина останется практически на исходном уровне и только при больших степенях восприимчивость начинает быстро

снижаться, после чего медленно выходит на нулевой уровень при достижении критического уровня равного 187. Напротив, при использовании препаратов, снижающих вероятность адсорбции быстрое снижение восприимчивости хозяина происходит на начальной стадии уменьшения вероятности инфицирования клетки.

Величины критических уровней /с для морской свинки - 1138 и для обезьяны - 414 (159) для нижней (верхней) границы дозы /О50. Отсюда следует, что из рассмотренных животных на роль модельного животного для человека подходит морская свинка (/смев = 1138). Обезьяна менее подходящее животное, т.к. величина критического уровня /Соб для верхней границы инфицирующей дозы для обезьяны равняется 159, что меньше требуемой величины (187).

9.8. Критерий подобия восприимчивости клеток in vitro и

in vivo

Константы скорости инфицирования клеток вирусом in vivo, k¡c — k¡ ■ CQ и к, характеризуют интегральную и удельную восприимчивость клеток in vivo. Соответственно k¡cv = k,v • CQV и k¡v характеризуют интегральную и удельную восприимчивость культуры клеток in vitro. В разделе 4 был введен коэффициент, характеризующий степень изменения интегральной восприимчивости клеток in vitro относительно in vivo ц = k¡/k¡v ■ C0/C0V = ß- CQ/C0V. Коэффициент ß = ki/k/v характеризует степень изменения удельной восприимчивости клеток in vitro относительно in vivo. Пусть имеется два вида хозяина. Если соотношение концентраций клеток in vivo и in vitro C$/Cw для обоих видов одинаково, то равенство значений коэффициента ц = ß • C0/C0V возможно при равенстве величин коэффициента ß = k,/klv для клеток обоих видов хозяина, т.е. когда клетки, полученные от разных хозяев, изменяют свои свойства in vitro в одинаковой степени. Это означает, что коэффициент р. может характеризовать стандартность проведения операций по получению первичных культур клеток и созданию условий культивирования клеток, подобных таковым in vivo, т.е. быть критерием подобия восприимчивости клеток от разных видов хозяина in vitro относительно in vivo. Величина критерия р может быть вычислена с помощью выражения (21).

Для случая, когда не требуется учитывать факторы врожденного иммунитета, критерием подобия является другой безразмерный коэффициент - Я = P¡c/Picv• который может быть выражен через Ю50 и СЮ50 по формуле Я — С/°50 Равенство критериев подобия -

коэффициента ц или Я - для нескольких видов хозяина можно установить двумя способами; путем вычисления величины критерия для клеток

одного вида хозяина и прогнозирования с его помощью восприимчивости другого вида хозяина (как это было продемонстрировано выше для ВМ и ВГ), а также традиционным сравнением величин критерия, вычисленных для клеток нескольких видов хозяина.

Для иллюстрации второго способа можно воспользоваться результатами вычисления величин коэффициентов ц и Л (таблица 6), которые были использованы при прогнозировании восприимчивости к ВГ трахеи и легких мышей ICR и крыс Wistar при экстраполяции с мышей CD-I.

Таблица 6

Величины критериев подобия восприимчивости клеток in vitro и in vivo в __экспериментах с вирусом гриппа__

Вид животного Орган Критерий подобия /1 Критерий подобия Л ш

Мышь CD-I Легкие 12940 32734 2,5

Мышь ICR Легкие 15010 20893 1,4

Крыса Wistar Легкие 8499 -*

Среднее для Легкие 12150±1921 26814±5921 2,0±0,6

всех животных

Мышь CD-I Трахея 6584 16982 2,6

Мышь ICR Трахея 4780 8128 1,7

Крыса Wistar Трахея 12662 6761 0,5

Среднее для Трахея 8008±2384 10623±3204 1,6±0,6

всех животных

Среднее для Легкие, 10079±1653 17100±4723 1,7±0,4

всех животных трахея

Примечание: * - данные не приводятся, т.к. для легких крыс необходимо учитывать факторы врожденного иммунитета.

Средние величины коэффициента ц = 12150±1921 и 8009±2384, соответствующие клеткам легких и трахеи, отличаются друг от друга незначимо (а=0,05). Также незначимо (а=0,05) отличаются и средние величины коэффициента Л - 26814±5921 для клеток легких и 10623±3204 для клеток трахеи. Следует добавить, что степень отличия двух критериев - Х/ц - для клеток трахеи и легких одинакова и в среднем равняется 1,7±0,4. Совокупность этих данных показывают, что коэффициенты ¡i и Я могут быть использованы в качестве критериев подобия восприимчивости клеток in vitro и in vivo, а также (наравне с результатами экстраполяции) свидетельствует о стандартности использованных методик по получению первичных культур клеток ткани трахеи и легких и об одинаковой степени изменения данных клеток легкого и трахей экспериментальных животных к вирусу гриппа in vitro

относительно m vivo.

10. Прогнозирование эффективности

эпидемиологической защиты хозяина противовирусными средствами

В разделе теоретически обосновывается оценка максимально-возможной ожидаемой величины коэффициента эпидемиологической эффективности препарата для произвольной вспышки. Считаем, что выполнены следующие положения.

1) Эпидемиологическая эффективность препарата оценивается критерием (коэффициентом эпидемиологической эффективности)

где Cv и Си- заболеваемость (смертность) в экспериментальной и контрольной группах (т.е. получавших и не получавших препарат) соответственно, аМ^и Ми - количество индивидуумов (особей) в каждой из групп.

2) Справедлива гипотеза независимого действия вирионов против хозяина, согласно которой каждый активный вирион независимо от других, попавших в организм хозяина, может с некоторой вероятностью -р - вызвать инфекционный процесс, заканчивающийся заболеванием (летальным исходом).

3) В каждой группе подобраны индивидуумы однородные по чувствительности к патогену. Это предположение отражает требования к организации полевого эксперимента.

4) Доза патогена, попавшая в организм, является случайной величиной. Вид распределения - произвольный. Считаем, что данное распределение справедливо для всех людей, попавших в очаг вспышки. Это предположение также отражает требования к организации полевого эксперимента.

Используя аппарат производящих функций математически доказывается, что справедлива оценка сверху для величины коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП ЕЕС< (36)

PU ED sov

где EDS0, - это IDS0 или LD50. Справедливость данной оценки подтверждена результатами статистического анализа некоторых литературных данных по смертности мышей различных возрастов при инфицировании последовательными десятикратными разведениями вирусов возбудителей некоторых нейротропных инфекций: лихорадки Бвамбы, простого герпеса, восточного энцефаломиелита лошадей. Вследствие различной чувствительности мышей различных возрастов к некоторым из вирусов эти данные позволили смоделировать ситуацию

эпидемиологического эксперимента, рассматривая группу менее чувствительных животных как группу, обработанных препаратом, а более чувствительных - как контрольную группу.

ВЫВОДЫ

Впервые проведено теоретико-экспериментальное исследование взаимодействия «вирус-хозяин» для установления взаимосвязи параметров инфекционности вирусов для хозяина на уровнях: клетка, организм и популяция с целью разработки методов экстраполяции результатов изучения инфекционное™ вирусов с модельных животных на хозяина. Теоретическое исследование проведено с использованием системного подхода и математических моделей, описывающих процессы инфицирования клеток и целого организма хозяина, размножения и нейтрализации вируса для инфекций, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции ассоциируется с полноценным инфекционным заболеванием. Для оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия, используемых в разработанных моделях проведен теоретический анализ инфекционных свойств вирусов в культурах клеток и в бесклеточной среде культивирования. На основании полученных результатов сделаны следующие выводы.

1) Получено уравнение инфекционное™, которое адекватно связывает восприимчивость организма хозяина к вирусу (вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) и параметры вирус-клеточного взаимодействия (вероятности инфицирования клетки на фоне нейтрализующих факторов врожденного иммунитета и средней урожайности вируса в клетке).

2) Построены частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования IDS0. Частный алгоритм позволяет адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней при условии, когда нейтрализующие факторы врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина отличаются незначительно. Модифицированный алгоритм позволяет адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам при выраженных отличиях нейтрализующих факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина. Для экспресс-прогноза восприимчивости хозяина к вирусной инфекции можно использовать упрощенную модель модифицированного алгоритма прогнозирования, которая также позволяет учесть факторы иммунитета.

3) Разработаны алгоритмы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro, которые позволяют адекватно оценивать вероятность инфицирования клетки и урожайность вируса в клетке в

первичных культурах клеток.

4) Разработаны критерии: (а) восприимчивости/резистентности хозяина к инфекции, (б) выбора оптимального ПВП и (в) выбора модельного животного, которое можно использовать для идентификации ПВП, оптимального для хозяина). Показано, что основой этих критериев является величина произведения вероятности инфицирования клетки одним вирионом и средней урожайности вируса в клетке.

5) Математически обоснована и проверена на литературных данных формула, позволяющая оценивать максимально возможную величину коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП, используя только величину отношения 50% эффективных доз (Ю50 или LD50) этиологического патогена, определенных для получавших и неполучавших препарат индивидуумов.

6) Показано, что данные по размножению вируса Марбург в первичных культурах макрофагов, полученные in vitro, могут быть использованы для прогнозирования с помощью частного и модифицированного алгоритмов восприимчивости хозяина к вирусу Марбург in vivo. Это свидетельствует об адекватности разработанных методов оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro и алгоритмов прогнозирования. Рассчитанная доза Ш50 вируса Марбург для человека при аэрогенном инфицировании составила ~0,7±0,14 lg(y-e.)

7) Показано, что данные по размножению вируса гриппа в первичных культурах трахеи и легких, полученные in vitro, могут быть использованы для прогнозирования с помощью частного и модифицированного алгоритмов восприимчивости in vivo трахеи и легких хозяина к вирусам гриппа.

8) Разработанные методики получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток трахеи и легких позволяют получать культуры клеток, содержащие основные типичные для этих органов клетки, в том числе - восприимчивые к вирусу гриппа и способные продуцировать вирус гриппа при культивировании не менее 54 часов и позволяющие оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи животных.

9) Показано, что восприимчивость и вируспродуцирующая способность альвеолоцитов I и II типов при их инфицировании вирусом гриппа in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток у мышей CD-I и ICR, а также крыс Wistar. Определено, что секреторные факторы бронхоальвеолярной выстилки у крыс Wistar могут

существенно снижать восприимчивость легких к ВГ при аэрогенном заражении и инфекционность ВГ для восприимчивых клеток in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жуков В.А. Экстраполяция Ш50 вируса с модельного животного на хозяина. Методическое пособие. ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск. 2010. 22 с.

2. Жуков В.А. Уравнение инфекционности и его использование для прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и в других задачах. В: Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты (сборник научных трудов). Выпуск 17. М.: РАЕН; 2007. С. 159-167.

3. Чермашенцев В.М., Жуков В.А., Марьясов А.Г., Сафатов А.С. Некоторые теоретические подходы к оценке эффективности противовирусных препаратов // Вестник РАМН. 1993. № 9. С. 4-7.

4. Жуков В.А., Чермашенцев В.М., Воробьев А.А. Теоретическое обоснование критериев оптимального конструирования противовирусных препаратов // Вестник РАМН. 1993. № 9. С. 7-9.

5. Zhukov V.A., Chermashentsev V.M. Theoretical Foundation of Optimal Design Criteria of Antiviral Preparations// Antiviral Research. 1994. 23(S1). P. 144.

6. Жуков B.A., Пьянкова О.Г., Рыжиков А.Б., Воробьев А.А. Прогнозирование коэффициента эпидемиологической эффективности профилактических препаратов по данным лабораторных исследований // Вестник РАМН. 1996. № 10. С. 36-40.

7. Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Пьянков О.В., Жуков В.А., Рыжиков А.Б., Колесникова Н.Г., Евтин Н.К., Шишкина Л.Н. Изучение некоторых патогенетических характеристик гриппозной инфекции у белых мышей. Вопросы вирусологии. 1997. № 5. С. 216-218.

8. Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Пьянков О.В., Жуков В.А., Рыжиков А.Б., Шишкина Л.Н., Котляров Л.А., Порываев В.Д. Изучение Чувствительности белых мышей к вирусу гриппа (А/АИЧИ/2/68) при аэрогенном заражении с учетом осаждения аэрозоля в их дыхательном тракте // Вопросы вирусологии. 1999. № 2. С. 69-71.

9. Sergeyev A.N., Pyankova O.G., Bulichev L.E., Petrischenko V.A., Pyankov O.V., Zhukov V.A., Ryzhikov A.B., Shishkina L.N., Yevtin N.K., Safatov A.S. Study of mice susceptibility to influenza vims (A/Aichi/2/68) under aerosol challenge considering the aerosol deposition in respiratory tract // J. Aerosol. Science. 1999. 30(1). P. 721-722.

10. Zhukov V.A., Shishkina L.N., Sergeev A.N., Safatov A.S., Piankova O.G., Petrishenko V.A., Piankov O.V., Chermashentsev V.M. The method of extrapolation of virus ID5o from one mammalian species to another // The Infectious Disease Review. 2001. S3. P. 124-126.

11. Sergeev A.N., Safatov A.S., Zhukov V.A., P'yankov O.V., Shishkina L.N., Petrishchenko V.A., P'yankova O.G., Buryak G.A., Sergeev A.A. The study of infectious activity of influenza virus aerosol taking into account its deposition in laboratory animal's organism//J. Aerosol Sci. 2001. 33(S1). P. S793-S794.

12. Сергеев A.H., Жуков B.A., Порываев В.Д., Пьянков О.В., Шишкина Л.Н., Петрищенко В.А., Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Сафатов А.С. Разработка

простого метода прямой оценки наличия инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа // Вопросы вирусологии. 2002. № 4. С. 44-46.

13. Сергеев A.A., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Малкова Б.М., Смоленцев М.Н. Получение и культивирование первичных культур клеток легкого экспериментальных животных для изучения продуктивных свойств вируса гриппа // Успехи современного естествознания. 2004. Т 1. № 6. С.137-138.

14. Жуков В.А., Сафатов A.C., Пьянков О.В., Топорков B.C., Сергеев A.A., Киселев С.А., Яшин В.А., Беляев Н.М., Рябчикова Е.И., Жуков A.B., Шишкина Л.Н., Медведев A.A., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Новый комплекс для получения и изучения монодисперсных микробиологических аэрозолей в медико-биологических исследованиях // Вестник РАМН. 2004. № 3. С. 11-15.

15. Сергеев A.A., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Рябчикова Е.И., Малкова Е.М., Воробьев A.A. Изучение восприимчивости клеток легких у мышей и крыс к вирусу гриппа при инфицировании in vivo и in vitro // Вестник РАМН. 2004. № 8. С. 15-18.

16. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Фанкин И.В., Сметанникова М.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Проверка возможности прогнозирования восприимчивости хозяина к инфекции гриппа используя данные экспериментов с первичными клетками // Medline.ru: сетевой журн. 2006. № 7. С. 195-204. URL: http://www.medline.ru/public/last/ (дата обращения: 03.01.2010).

17. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Малкова Е.М., Рябчикова Е.И., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Устюжанина Н.В., Воробьев A.A. Изучение восприимчивости и продуктивности реснитчатых клеток и альвеолоцитов 1 -го и 2-го типов мышей при заражении вирусом гриппа in vitro // Medline.ru: сетевой журн. 2006. № 7. С. 205-213. URL: http://www.medline.ru/public/last/ (дата обращения: 03.01.2010).

18. Сметанникова М.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Фанкин И.В., Булычев Л.Г., Колесникова Л.В., Омигов В.В., Малкова Е.М., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Жуков В.А. Влияние глюкокортикоидной иммуносупрессии на течение экспериментальной гриппозной инфекции // Вестник РАМН. 2006. № 6. С. 22-27.

19. Сметанникова М.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Фанкин И.В., Сергеев A.A., Скарнович М.О., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Бондаренко В.Н., Сергеев А.Н., Восприимчивость клеток-мишеней и активность фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии // Вестник РАМН. 2007. № 1. С. 3-8.

20. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Фанкин И.В., Сметанникова М.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Изучение возможности прогнозирования чувствительности к гриппу различных отделов респираторного тракта хозяина // Вестник РАМН. 2007. № 5. С. 32-7.

21. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Малкова Е.М., Рябчикова Е.И., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Устюжанина Н.В., Воробьев A.A. Сравнительный анализ восприимчивости клеток-мишеней респираторного тракта

мышей и крыс при заражении вирусом гриппа in vitro // Вестник РАМН. 2008. № 2. С.12-16.

22. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев А.А., Плясунов И.В., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Зайцев Б.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А. Количественная оценка in vitro вирус-гриппа нейтрализующей активности секреторных факторов легких крыс // Вестник РАМН. 2009. № 11. С. 46-49.

23. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сафатов А.С., Сергеев А.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Зайцев Б.Н., Топорков B.C., Сергеев А.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А. Валидация модифицированного алгоритма прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусам с учетом параметров восприимчивости первичных культур клеток-мишеней и факторов врожденного иммунитета // Вестник РАМН. 2010. № 5. С. 24-29.

24. Zhukov V.A., Safatov A.S., Subkhankulov G.F., Chermashentsev V.M. A mathematically based model for the development of vaccine requirements: proceedings of the Int. Conf. on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. Leningrad, 1991. P.4-6.

25. Жуков B.A., Чермашенцев B.M., Сафатов A.C. Системный подход к проблеме конструирования биопрепаратов: материалы Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. С. 78.

26. Жуков В.А., Чермашенцев В.М., Сафатов А.С., Субханкулов Г.Ф. Подход к прогнозированию воздействия на человека различных неблагоприятных факторов: матер. Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. С. 79.

27. Жуков В.А., Чермашенцев В.М. Подход к оценке противовирусных препаратов (ПВП) с использованием животных и экспериментов ин витро: матер. Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. С. 80.

28. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г. Теоретические основания системы прогнозирования влияния неблагоприятных факторов внешней среды на здоровье человека: матер. Всерос. конф. "Экология и здоровье". Новосибирск, 1996. С. 72-73.

29. Zhukov V.A., Shishkina L.N., Ryzhikov А.В., Safatov A.S., Sandakhchiev L.S. Shift of virus infectivity for human: proceedings of the International SB Medical Treatment Symposium Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without chemical and biological weapons. Zagreb-Dubrovnik, Croatia, 1998. P. 350352.

30. Жуков B.A., Шишкина JI.H., Сергеев A.H., Сафатов A.C., Пьянкова О.Г., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Рябчикова Е.И., Малкова Е.М., Морзе С., Воробьев А.А. Метод экстраполяции ГО50 с одного вида млекопитающих на другой. Перспективы применения в медицине: тр. X Юбил. междун. конф. и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине экологии». Ялта-Гурзуф, Украина, 2002. С. 237-239.

31. Сергеев А.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Смоленцев М.Н., Малкова Е.М. Разработка клеточной системы для изучения способов и средств коррекции инфекционного воспаления: матер. Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные

процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск, 2004. С. 70 - 71.

32. Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Сергеев A.A., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Омигов В.В., Колесникова Л.В., Малкова Е.М. Изучение влияния глюкокортикоидного гормона кеналога на резистентность мышей к вирусу гриппа: матер. Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск, 2004. С. 181 -182.

33. Жуков В.А. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации: теоретическое обоснование алгоритма прогнозирования: тр. междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07». Гурзуф, Украина, 2007. С. 190-192.

34. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Плясунов И.В., Сергеев А.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев A.A. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации: определение вирус нейтрализующей активности сурфактанта крысиных легких: тр. междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07». Гурзуф, Украина, 2007. С. 192-194.

35. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Зайцев Б.Н., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации: проверка адекватности алгоритма прогнозирования для вируса гриппа и крыс: тр. междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07». Гурзуф, Украина, 2007. С. 194-196.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВГ - вирус гриппа

ВМ - вирус Марбург

ИФСЭВ - ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки

респираторных органов

ПВП - противовирусный препарат

Жуков Владимир Александрович Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и её использование для выбора противовирусных препаратов. Автореф. дис. на соиск. учен. степ, д-ра биол. наук Подписано в печать 24.12.2010. Заказ № 73 Формат 60x84/16. Печ. л. 2,7. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии ЗАО «Вектор-Бест» 630128, г. Новосибирск, ул. Пасечная, д.З

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов"

В диссертационной работе изложены ^ результаты торетических и экспериментальных исследований автора, посвященных разработке теоретических методов количественного прогнозирования инфекционных свойств вирусов для хозяина на» основе данных лабораторного изучения^ вирусов в модельных системах (лабораторных животных и первичных культурах клеток-мишеней), а также результаты использования этих методов: для решения, задач, связанных с разработкой- эффективных противовирусных препаратов.

Актуальность проблемы. Для выделения и изучения свойств вирусов, вызываемых ими заболеваний; разработки, и первичной оценки противовирусных средств1 используются различные лабораторные животные, культуры тканей и клеток. Однако, широкое использование биологических моделей и биотехнологий не сопровождалось столь же интенсивной^ разработкой' методов или моделей экстраполяции (масштабирования) количественных параметров, характеризующих свойства вирусов; с одной модельной системы на другую и в конечном итоге на организм хозяина (животного и/или человека), как, например, в радиобиологии [137, 138, 443], фармакологии [208, 263, 283, 323, 484] и токсикологии [169, 189, 306, 375, 481, 483] -дисциплинах, где также используются живые модельные системы.

Использование для микробов методов экстраполяции, разработанных для химических и физических факторов, невозможно; так как в отличие от последних микробы являются размножающимися или1 инфекционными объектами. Инфекционность - важнейшее свойство« микробов, отражающее их способность проникать, выживать и размножаться в организме «хозяина», то есть образовывать инфекционный процесс, в ходе которого может произойти нарушение функций организма-носителя^ т.е. развиться заболевание. .

Количественно- инфекционность микробов для макроорганизма; (животного и человека) принято характеризовать величиной 50% инфицирующей дозы (Ю50), которая позволяет инфицировать 50% объектов-получивших такую дозу [68, 313]. Доза Ю50 одновременно характеризует и степень восприимчивости/резистентности; хозяина к патогену: чем больше частиц микробов соответствует Ю50, тем менее/более хозяин восприимчив/резистентен- к патогену. Важность данного показателя определяется тем, что вероятность инфицирования организма хозяина является дозо-зависимой, при этом величина Ш50 является характеристическим параметром функциональной зависимости вероятности инфицирования от дозы заражения [32,. 167, 177, 387, 439]. Это означает, что Ю50 определяет долю заболевших в группе инфицированных объектов- т.е. заболеваемость в коллективе. Выше сказанное объясняет, почему наряду с такими количественными показателями патогенности или вирулентности, как Ю50, среднее: время болезни,, среднее время жизни, выживаемость и др. [134, 427, 431, 432], при оценке уровня- резистентности, хозяина, а также: защитных свойств разрабатываемых профилактических средств (вакцин и химиопрепаратов) на. стадиях, предшествующих клиническим испытаниям, в экспериментах с лабораторными животными используются Ю50 или показатели производные от Ю50 [45, 64, 241, 285, 286].

Вследствие того, что разные виды животных, вообще говоря- не являются равно чувствительными к одному и тому же виду микробов, то прямой перенос результатов экспериментов по определению показателей инфекционности патогенов или защитного уровня противомикробных препаратов, полученных на модельных животных, на другие виды животных и человека неправомочен.

Более того, возможно, что, будучи эффективными при испытаниях вмодельных системах, препараты не всегда являются эффективными для человека [58]. последние годы были; созданы программные комплексы, [14, 108, 114, 330; 349; 377], предназначенные для прогнозирования последствий артифициального заноса, (вследствие техногенной' катастрофы или террористического акта) высоковирулентных бактерий и вирусов (в т.ч. натуральной оспы) в> популяцию-людей и животных и оценки эффективности противоэпидемических мероприятий. Существенным недостатком таких систем моделирования является то, что одна из наиболее существенных характеристик начальных условий возникновения эпидемической,' ситуации — количество первично-инфицированных — задается самим исследователем — вследствие чего данные системы позволяют оценить эффективность систем противодействия для конкретных начальных условий« без учета величины риска возникновения такой конкретной1 ситуации. Соответственно, такой анализ не может дать реальной оценки готовности системы противодействия для наиболее вероятных условий возникновения, кризисной ситуации и,, следовательно, практическая значимость такого анализа существенно снижена.

Для прогнозирования, количества первично-инфицированных индивидуумов кроме моделирования распространения патогенов; например, в приземном слое атмосферы [264] требуется знание величин. Ю50 патогенов* для человека. В литературе приводятся оценки 50% инфекционных доз лишь для некоторых потенциальных агентов биологического оружия, см., например [24, 55, 122, 161, 187, 260, 261, 464, 472, 492], а также [398] и приводимые там ссылки. Однако, согласно [206, 239, 398, 464] многие из этих данных, касающиеся и бактерий, и вирусов, являются приблизительными, требуют уточнения и дополнительного обоснования, так как оценки проведены на основании экспериментов с приматами, анализа, лабораторных аварий, внутрибольничных заражений и других ситуаций, для которых дозы инфицирования можно оценить лишь приблизительно. Определение Ю50 экспериментальным путем требует заражение групп макроорганизмов известными дозами патогена. Для человека это возможно для патогенов, вызывающих нелетальные инфекции [107, 158, 218, 280, 471, 482]. Очевидно, что для микроорганизмов (особенно для вирусов), вызывающих инфекции с летальным исходом, в том числе для потенциальных агентов биологического оружия (вирусов натуральной оспы, Марбург, Эбола и др.) в применении к человеку такая возможность отсутствует.

В заключение следует отметить проблему оценки опасности для человека возникающих инфекций, одним из источников которых являются животные, и проблему разработки эффективных средств борьбы с такими инфекциями [20, 362]. По свидетельству [60] "на глазах одного поколения вирусологов меняется спектр вирусной патологии как в отдельных регионах, так и в межрегиональном масштабе". В последние годы эта проблема приобрела особую актуальность в связи с ожиданием возникновения пандемичного штамма вируса гриппа [436, 494]. Несмотря на то, что многие эксперты считали, что именно птичий грипп (в частности штамм H5N1) может породить пандемичный штамм [214, 317, 466, 487], тем не менее, находились эксперты, которые считали, что риск генерации пандемичного штамма (на базе птичьего штамма H5N1) остается неоцененным [384]. Действительно, исследования клеточных рецепторов к штаммам вируса гриппа человека и птиц [154, 265, 266, 344, 345, 383, 410, 507] объясняют, почему возможен переход гриппа птиц в популяцию человека, но, к сожалению, не могут дать ответа на вопрос, какова степень восприимчивости человека к вирусу и как она соотносится с восприимчивостью к известным пандемичным штаммам. Как отмечается в [92], заслуживает особого внимания состояние восприимчивости людей к тем или иным возбудителям, определяющее в значительной мере, как специфику, так и масштабы распространения инфекционных болезней.

Умение количественно оценивать восприимчивость человека и животных к вирусам, а также прогнозировать степень защиты организма человека и животных противовирусными препаратами позволит более1 эффективно и надежно решать различные практические задачи борьбы с существующими, так и вновь возникающими инфекциями.

Более пятидесяти лет в вирусологических исследованиях используются первичные культуры клеток, выделенные из органов-мишеней хозяина [80]. В многочисленных исследованиях с первичными культурами макрофагов показано наличие корреляции способности макрофагов продуцировать, вирус в экспериментах in vitro с восприимчивостью организма хозяина к различным макрофаготропным вирусам, таким как вирус гепатита мышей, Хунин, Мачупо, Марбург и др. [75, 80, 352-355, 403, 428]. Было показано, что более вирулентные штаммы одного и того же вируса для одного вида животных более эффективно репродуцировались и в первичных макрофагах, выделенных от этих животных, а также, что макрофаги, выделенные от более восприимчивых животных к одному и тому же вирусу, более эффективно репродуцировали вирус в экспериментах in vitro. Эти данные свидетельствуют о потенциальной пригодности первичных культур клеток органов-мишеней для оценки восприимчивости их хозяина к микроорганизмам.

В свете вышеизложенного особо актуальными становятся работы по изучению межвидовой взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на клеточном и организменном уровнях хозяина, в том числе при изучении свойств вируса с использованием первичных культур клеток органов-мишеней. Следует признать актуальным проведение таких исследований для социально-значимых и особо-опасных инфекций. Представителем первой группы является вирус гриппа, второй - вирус Марбург.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка метода экстраполяции (прогнозирования) 50% инфицирующей дозы вируса (/Z)50) с модельного (лабораторного) животного на хозяина (в том числе человека), а также разработка на базе предложенного метода новых подходов к выбору кандидатных препаратов и модельных животных для оценки эффективности потенциальных противовирусных препаратов в отношении защиты хозяина (в том числе человека).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Построение математической модели взаимосвязи IDB0} вируса для хозяина- и параметров взаимодействия вируса с восприимчивыми клетками хозяина, на фоне действия факторов врожденного иммунитета (далее -уравнение инфекционности).

2. Построение алгоритма экстраполяции ID5Q, с модельного «животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток.

3: Построение алгоритмов. оценки параметров модели' прогнозирования ID50 в экспериментах in vitro.

5. Экспериментальное определение ID50 вируса гриппа» при аэрогенном инфицировании экспериментальных животных.

6. Экспериментальное изучение особенностей взаимодействия! вируса гриппа-с восприимчивыми клетками (альвеолоцитами I и II типа, реснитчатыми клетками),1 макрофагами и нейтрофилами в суспензионной первичной культуре клеток легких и трахеи экспериментальных животных.

8. Проверка работоспособности алгоритма предсказания ID50 на примере прогнозирования Ю50 вируса Марбург для обезьян и Ш50 вируса гриппа для крыс и мышей.

9. Применение метода для прогнозирования ID50 вируса Марбург для человека. Разработка новых подходов к выбору кандидатных препаратов и экспериментальных животных, моделирующих заданную инфекцию* и пригодных для; оценки противовирусной активности кандидатных препаратов; перспективных в отношении защиты человека от данной инфекции.

Научная новизна. Теоретическая ипрактическаяценность работы. В данной работе впервые проведено комплексное теоретико-экспериментальное исследование взаимосвязи параметров^ инфекционности вирусов на организменном и клеточном уровнях хозяина с использованием методов математического и, экспериментального моделирования. В ходе исследования получены следующие новые результаты.

1. На' основании обобщенной» схемы развития инфекционного процесса для патогенов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания, разработано уравнение инфекционности. Данное уравнение связывает параметры вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) с вероятностью инфицирования хозяина одним вирионом, которая связана с IDS0 обратной зависимостью.

2. На основании анализа уравнения инфекционности разработаны два варианта алгоритма экстраполяции ID50 с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток: частный вариант предназначен для случая, когда отличия в активности факторов врожденного иммунитета у хозяина и модельного животного не существенны и модифицированный вариант — когда отличия существенны.

4. Показана адекватность («=0,05) уравнения инфекционности, алгоритма оценки параметров модели прогнозирования IDS0, частного и модифицированного алгоритмов прогнозирования на примерах прогнозирования Я)50 вируса Марбург для обезьяны (зеленой африканской мартышки) и ID5q вируса гриппа для мыши ICR и крысы Wistar.

6. Проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток мыши CD-I и крысы Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro. Показано, что восприимчивость и вируспродуцируюгцая способность альвеолоцитов I и II типов при их инфицировании вирусом гриппа in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток.

7. Показано, что для прогнозирования восприимчивости трахеи и легких мыши ICR и трахеи крысы Wistar к вирусу гриппа при использовании мыши CD-I в качестве модельного животного достаточно использовать только первичные культуры клеток соответствующего органа, а для легких крысы Wistar необходимо также использовать данные по вируснейтрализующему действию секреторных факторов бронхоальвеолярной эпителиальной выстилки крыс. Это свидетельствует, что первичные культуры клеток адекватно моделируют свойства клеток (при взаимодействии с вирусом) in vivo и позволяют адекватно оценивать «базовую» (клеточно-опосредованную и без учета факторов врожденного иммунитета) восприимчивость хозяина к вирусу гриппа. При незначимом проявлении иммунных факторов «базовая» соответствует реальной восприимчивости.

8. На основании анализа уравнения инфекционности обоснованы количественные критерии восприимчивости и резистентности хозяина к инфекции в зависимости от величин параметров вирус-клеточного взаимодействия' (вероятности инфицирования клетки одним вирионом и средней урожайности вируса в клетке), критерий оптимального выбора ПВП, определяющий критическую степень снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия, при достижении которой - вероятность образования инфекционного процесса при любой дозе инфицирования становится равной нулю, т.е. когда макроорганизм становится резистентным к инфекции. Показано, что для обеспечения невосприимчивости хозяина нет необходимости достигать полной невосприимчивости клеток, когда вероятность инфицирования клеток и/или урожайность клеток равна нулю, необходимо, чтобы величина произведения параметров вирус-клеточного произведения была меньше либо равна 1. Данный критерий можно использовать для выбора кандидатных ПВП при их испытании в клеточных системах.

9. Математическими методами показано, чтобы перевести макроорганизм с помощью противовирусных средств в невосприимчивое к вирусу состояние, достаточно с одной и той же кратностью уменьшить один из следующих параметров — вероятность инфицирования клетки (интегрально характеризующую стадии прикрепления и проникновения вируса в клетку) или среднюю урожайность вируса в клетке (интегрально характеризующую стадии репродукции, сборки и выхода вируса).

12. С применением разработанного метода оценено, что вероятность (аэрогенного) инфицирования человека одним вирионом вируса Марбург равняется 0,014 (-0,004;+0,005). Полученное значение может быть использовано для оценивания риска заражения человека при моделировании различных ситуаций чрезвычайного характера. В частности, данная оценка была использована в исследовании, выполненном с участием автора в Center for Security Studies and Research, East Carolina University, Greenville, North Carolina, USA и посвященном оценке эффективности современных средств обнаружения микроорганизмов в воздушной среде (основанных на методах ИФА, ПЦР, масс-спектрометрии) в сравнении с вероятностью инфицирования человека, находящегося в контаминированной зоне [419-421].

13. С использованием разработанных алгоритмов оценена восприимчивость к вирусу Марбург и вируспродуцирующая способность клеток макрофагов морской свинки, обезьяны и человека in vitro. На основании этих данных оценены величины критического уровня критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к животным и человеку. Прогнозируется, что оптимальный для человека ПВП должен снижать вероятность инфицирования клетки или урожайность вируса или их произведение не менее чем в 187 раз. На основании анализа критических уровней критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к человеку, морской свинке и обезьяне (зеленой африкансой мартышке) показано, что для выбора эффективного ПВП против вируса Марбург морская свинка являются более подходящей моделью человека, чем обезьяна. Оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия могут быть использованы в математических моделях развития- инфекции. Марбург указанных хозяев, а критические уровни - при подборе ПВП для борьбы с указанной-инфекцией:

14. Разработана^ лабораторная' технология получения и культивирования первичных суспензионных культура клеток легких и," трахеи, сохраняющих жизнеспособность, и способных продуцировать вирус гриппа в течение 54 часов. Технология, применялась^ в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» для изучения? (in. vitro) инфекционных свойств новых штаммов вируса гриппа и-может быть использована для изучения других возбудителей аэрогенное передаваемых инфекций.

15. Для вируса гриппа- разработаны^ методики оценки параметров модели прогнозирования/D50 (а именно вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета» и средней урожайности* вируса в клетке) в экспериментах in vitro с суспензионными первичными культурами клеток легкого и трахеи лабораторных животных. Методики применялись в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» для изучения (in vitro) инфекционных свойств новых штаммов вируса гриппа и- могут быть использованы для1 изучения других возбудителей аэрогенно передаваемых инфекций.

16. Построена, и проверена, на литературных данных- формула», для оценки коэффициента эпидемиологической* эффективности противовирусных средствт через дозы J£>5o этиологического вируса, измеренные для иитактного и обработанного препаратом- макроорганизма. В. совокупности, с моделью прогнозирования ID50 формула позволяет прогнозировать возможную эпидемиологическую) эффективность кандидатных препаратов, основываясь на данных лабораторных экспериментов.

17. По результатам исследования изданы методические рекомендации по проблеме прогнозирования 50% инфицирующей дозы вируса для хозяина (см: Приложение).

Полученные данные существенно углубляют и дополняют представления о методических подходах, которые следует использовать при изучении и характеризации вирусов, разработке и оценке потенциальной эффективности противовирусных средств. Разработанные модели, уравнения, методы, алгоритмы и критерии могут быть использованы для количественной* оценки потенциальной опасности существующих и вновь возникающих вирусов для! человека, оценивания значимости участия различных типов'клеток и факторов* врожденного иммунитета в формирование восприимчивости хозяина к инфекции, что позволит более надежно и обоснованно выбирать кандидатные противовирусные средства на стадиях лабораторных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту. Предметом защиты настоящей диссертации является комплекс математических моделей и алгоритмов, позволяющих прогнозировать ID50 вируса для хозяина (в том числе человека) на основе параметров вирус-клеточных взаимодействий, полученных в1 экспериментах in vitro, обеспечивать оптимальный выбор противовирусных препаратов, обладающих заданными свойствами, и оценивать их эпидемиологическую эффективность, подбирать адекватных модельных животных, а также оценивать степеньподобия восприимчивости клеток к вирусам in vitro относительно in vivo. Используя« технологию математического И'экспериментального моделирования, в работе получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.

2. Частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования /D50 с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней позволяют адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам, вызывающим инфекцию» во входных воротах, в условиях соответственно незначительных и выраженных, отличий факторов врожденного иммунитета у модельного животного и* хозяина.

3. Разработанные алгоритмы оценки, параметров вирус-клеточного» взаимодействия позволяют адекватно оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия.

4. Первичные культуры клеток макрофагов адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость, хозяина к вирусу Марбург. Первичные культуры клеток трахеи и легкого-адекватно-отражают свойства клеток in vivo w позволяют прогнозировать восприимчивость соответствующего органа хозяина к вирусу гриппа in vivo.

5. Величина произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия может быть использована в качестве критерия восприимчивости/резистентности хозяина к- инфекции; а также критерия выбора оптимального ПВП и выбора модельного животного для выбора ПВП' оптимального для хозяина.

6. Величина коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП может быть оценена сверху величиной 1- ED50u/ED50V, где ED50u и ED50V -50% эффективная доза патогенна (ID's0 или- LD50), определенная для хозяина, получившего и не получившего препарат.

Апробация-работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях:

Всесоюзная конференция «Математическое моделирование иммунитета и инфекционного процесса». Кольцово, Новосибирская обл. 1989.

Всесоюзная конференция «Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ». Москва. 1990.

International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. Leningrad.USSR. 1991

Всероссийская конференция «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск. 1991.

Fourth International Aerosol Conference. Los Angeles, California-. 1994.

Всероссийская конференция "Экология и здоровье", Новосибирск. 1996.

3rd International Conference on Medical B-Protection. Munchen. 1996.

Russian-German colloquium on Filoviruses: The modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, Russia. 1997.

Всероссийская конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера». Новосибирск. 1998.

Всероссийская вторая научная конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс». Саратов. 1998.

International SB Medical' Treatment Symposium Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without chemical and biological weapons. Zagreb-Dubrovnik, Croatia. 1998.

18th Conference of the American Association for Aerosol Research (AAAR). Tacoma, Washington, USA. 1999.

International Congress on Circumpolar Health. Harstad, Norway. 2000.

International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors. Smolenice, Slovakia. 2000.

19th Conference of the American Association for Aerosol Research (AAAR). St. Louis, Missouri. 2000.

3-rd International Conference on Emerging Zoonoses, 2001. Noordwijkerhout, Holland. 2001.

International Conference On Emerging Infectious Diseases. Atlanta, Georgia, USA. 2002.

X Юбилейная международная конференция «Новые информационные технологии в медицине экологии». Ялта-Гурзуф, Крым, Украина. 2002.

International Biological Medical, Conference 2003. Prophylaxis and treatment of BW health disorders. Munich, Germany. 2003.

22nd Conference of the American Association for Aerosol Research (AAAR). Anaheim, California. USA. 2003.

International Conference On Emerging Infectious Diseases. Atlanta, Georgia, USA. 2004.

Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» - Сосновка, Новосибирская область, Россия. 2004.

23rd Annual Conference of the American Association for Aerosol Research (AAAR). Atlanta, Georgia. 2004.

International Biological Medical Defense Conference 2004. Munich, Germany.

2004.

Всероссийская конференция «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск. 2004.

European Aerosol Conference. Budapest, Hungary. 2004. 2-й Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда». Пущино, Московская обл., Россия. 2005.

XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA.

2005.

International Biological Medical Defense Conference 2005. Munich, Germany.

2005.

Ill Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». 2006; Новосибирск, Россия.

9th World Conference on Biosensors, Toronto, Canada. 2006. Международная конференция: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07». Гурзуф, Украина. 2007. ll-th Internationali Biological! Medicals Defense Conference 2007. Münich; Germany. 2007:

Личный вклад; соискателя; Результаты, полученные:лично: разделы 3.2 - 3:6; 3:7.2-3;7.4, 3:8.8,. 3:9; 3110 - уравнение1 инфекционности, алгоритмы, прогнозирования Ю50 и оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия, теоретический анализ уравнения; инфекционности; и вывод всех; следствий? и критериев; оценка верхней;, границы для; коэффициента^ эпидемиологической! эффективности ПВС; обработка^ всех полученных результатов,, расчет параметров- вирус-клеточного взаимодействия и прогнозинфекционности вирусов Марбург и гриппа.

Результаты.- полученные; под руководством автора* и совместно: разработка всех, методик по измерению параметров вирус-клеточного-взаимодействия;для> вируса гриппа; планирование и проведение экспериментов с вирусом гриппа по; получению и культивированию первичных культур клеток, изучению репликативной активности первичных культур клеток, оценке параметров инфекционности вируса гриппа; в экспериментах im vitro; получению ш изучению нейтрализующей активности секреторных; факторов? эпителиальной? выстилки; легких, аэрозольному заражению животных, для определения г аэрогенных; Ю50 (к.б.н. Шишкина JI.I1. - разделы 3.8.1-3.8.7; к.м.н. Сергеев A.A. - разделы.3.8<1, 3-8:2, 318:4-3.8.7;.Иётрищенко;В:А. - разделы 3:8:1,. 3^8:2^3:8-4-3:8-6; д.м.н. Несвижский«ЮШ: - раздел 3.8.6; к.б.н. Плясунов И:В1 -раздел; 3.8.6; Фанкин И.В! — разделы 3.8:1, 3:8.5; д.м.н. Сергеев; А.Н: - разделы 3.8.1-3.8.7; к.ф.-м.н. Сафатов A.C. разделы - 3.8.3, 3:8.4, 3.8.7; к.б.н. Пьянков О.В: - разделы 3.8.3, 3.8.4, 3.8.6; к.т.н. Топорков B.C. - разделы 3.8.3; 3.8.4; к.т.н. Яшин В.А. - разделы; 318.3, 3.8.4; Беляев Н.М. - разделы 3.8.3, 3.8.4, Киселев С.А. - раздел 3.8.6, к.б.н. Устюжанинова Н.В. - раздел 3:8.5.

Результаты, полученные под руководством автора: изучение тканей трахей и легких инфицированных животных методом электронной микроскопии (д.б.н. Рябчикова Е.И. - раздел 3:8.1); изучение клеточного состава экспериментальных суспензий методом световой? микроскопии (д.м.н.

Малкова Е.И. разделы - 3.8.1, 3.8.5); определение физического титра вируса гриппа методом атомной силовой микроскопии (к.ф.-м.н. Зайцев Б.Н. - раздел 3.8.8).

Результаты, полученные совместно: данные по восприимчивостимышей ICR при инфицировании вирусом, гомологичным использованному в исследовании, метод прямого определения наличия инфекционного процесса гриппа у мышей и крыс (д.м.н. Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., к.б.н. Булычев JI.E., Петрищенко В.А., к.б.н. Пьянков О.В., к.б.н. Рыжиков А.Б., к.б.н. Шишкина Л.Н., к.ф.-м.н. Сафатов A.C.- все радел 3.8.4).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ, в т.ч. 17 в журналах из списка журналов, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных результатов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертационной работы, списка цитируемой литературы (511 ссылок), раздела с благодарностями и приложения. Работа изложена на 324 страницах, включая 14 рисунков и 29 таблиц. Нумерация рисунков, таблиц и формул приводится отдельно для каждого подраздела главы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Жуков, Владимир Александрович

ВЫВОДЫ

Впервые проведено теоретико-экспериментальное исследование взаимодействия «вирус-хозяин» для* установления взаимосвязи параметров инфекционности вирусов для хозяина на уровнях: клетка, организм и популяция с целью разработки методов экстраполяции результатов изучения инфекционности вирусов с модельных животных на хозяина, представляющего интерес для исследования. Теоретическое исследование проведено с использованием системного подхода и математических моделей, описывающих процессы инфицирования клеток и целого организма хозяина, размножения и нейтрализации вируса для инфекций, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции ассоциируется с полноценным инфекционным заболеванием. Для оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия, используемых в разработанных моделях проведен теоретический анализ инфекционных свойств вирусов в культурах клеток и в бесклеточной среде культивирования. На основании полученных результатов сделаны следующие выводы.

1) Получено уравнение инфекционности, которое адекватно выражает восприимчивость организма хозяина к вирусу (вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) в зависимости от параметров вирус-клеточного взаимодействия (вероятности инфицирования клетки на фоне нейтрализующих факторов врожденного иммунитета и средней урожайности вируса в клетке).

2) Построены частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования Ю5 0. Частный алгоритм позволяет адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней при условии, когда нейтрализующие факторы врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина отличаются незначительно. Модифицированный алгоритм позволяет адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам в том числе при выраженных отличиях нейтрализующих факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина. Для экспресс-прогноза восприимчивости хозяина к вирусной инфекции можно использовать упрощенную модель модифицированного алгоритма прогнозирования, которая позволяет учесть факторы иммунитета, но при этом существенно упрощает проведение вычислений по сравнению с полным вариантом алгоритма.

Разработаны алгоритмы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro, которые позволяют адекватно оценивать вероятность инфицирования клетки и урожайность вируса в клетке в первичных культурах клеток.

Разработаны критерии: (а) восприимчивости/резистентности хозяина к инфекции, (б) выбора оптимального ПВП и (в) выбора модельного животного, которое можно использовать для идентификации ПВП, оптимального для хозяина). Обосновано, что основой этих критериев является величина произведения вероятности инфицирования клетки одним вирионом и средней урожайности вируса в клетке.

Математически обоснована и проверена на литературных данных формула, позволяющая оценивать максимально возможную величину коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП используя только величину отношения 50% эффективных доз (Ю50 или LD50) этиологического патогена, определенных для получавших и неполучавших препарат индивидуумов.

Показано, что данные по размножению вируса Марбург в первичных культурах макрофагов, полученные in vitro, могут быть использованы для прогнозирования с помощью частного и модифицированного алгоритмов восприимчивости хозяина к вирусу Марбург in vivo. Это свидетельствует об адекватности разработанных методов оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro и алгоритмов прогнозирования: Рассчитанная доза IDSQ вируса Марбург для человека при аэрогенном инфицировании составила~0,7±0,14 1д(у.е.)

7)= Показано, что данные по размножению вируса гриппа в первичных культурах, трахеи, и легких,, полученные: in vitro, могут, быть использованы для прогнозирования с помощью частного и модифицированного? алгоритмов, восприимчивости; in vivo трахеи? и легких хозяина к вирусам гриппа.

8) Разработанные мётодики получениям и культивирования суспензионных первичных культур клеток трахеи и легких позволяют получать культуры клеток, содержащие; основные типичные для этих органов клетки; в том числе - восприимчивые к вирусу гриппа и способные продуцировать вирус гриппа^ при культивировании не менее 54 часов и позволяющие оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и; трахеи животных.

9) Показано, что восприимчивость и вируспродуцирующая способность, альвеолоцитов Г и И типов при их инфицировании вирусом гриппам in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток у мышей CD-I и ICR, а также крыс Wistar. Определено, что секреторные факторы бронхоальвеолярной выстилки у крыс Wistar могут существенно снижать восприимчивость легких к вирусу гриппа при аэрогенном заражении и могут значимо снижать инфекционность вируса гриппа для восприимчивых клеток in vitro.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Жуков В.А. Экстраполяция ГО5о вируса с модельного животного на хозяина. Методическое пособие. ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск. 2010. 22 с.

3. Чермашенцев В.М., Жуков В. А., Марьясов А.Г., Сафатов A.C. Некоторые теоретические подходы к оценке эффективности противовирусных препаратов // Вестник РАМН. 1993. № 9. С. 4-7.

4. Жуков В.А., Чермашенцев В.М., Воробьев A.A. Теоретическое обоснование критериев оптимального конструирования противовирусных препаратов // Вестник РАМН. 1993. № 9. С. 7-9.

5. Zhukov V.A., Chermashentsev V.M. Theoretical Foundation of Optimal Design Criteria of Antiviral Preparations // Antiviral Research. 1994. 23(S1). P. 144.

6. Жуков B.A., Пьянкова О.Г., Рыжиков А.Б., Воробьев A.A. Прогнозирование коэффициента эпидемиологической эффективности профилактических препаратов по данным лабораторных исследований // Вестник РАМН. 1996. № Ю. С. 36-40.

7. Пьянкова О.Г., Булычев JI.E., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Пьянков О.В., Жуков В.А., Рыжиков А.Б., Колесникова Н.Г., Евтин Н.К., Шишкина JI.H. Изучение некоторых патогенетических характеристик гриппозной инфекции у белых мышей. Вопросы вирусологии. 1997. № 5. С. 216-218.

8. Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., Булычев JI.E., Петрищенко В.А., Пьянков О.В., Жуков В.А., Рыжиков А.Б., Шишкина JI.H., Котляров JI.A.,

Порываев В. Д. Изучение Чувствительности белых мышей к вирусу . гриппа! (А/АИНИ/2/68)/ при аэрогенномг заражении: с: учетом осаждения? аэрозоля в их дыхательном,' тракте :// Вопросы, вирусологии; 1999!. № - 2'. С. 69-71. . '

91.' Sergeyev A.N;,. Pyankova ©lG;5 BulicKev BJE.r Petrischenko V.A., Pyankov 0Ж, Zliukov V.A., Ryzhikov A\BV SKisHkina? YevtimN.K.,. Safatov A.S: Study of mice susceptibility to influenzae virus (A/Aichi/2/68) under aerosoli challenge considering: the aerosol deposition in respiratory tract // J. AerosolLSciencerl999i30p):P: 721-722. 10; Zhukov V.A., Shishkinaib.N.,, Sergeev AVN-., Safatov A.S:, Piankova?0*G;,. Petrishenko V.A., Piankov &N., Ghermashentsev V.M: The: method? of extrapolation! of virus* ГО50 from: one mammalians species tov another. //' The Infectious Disease Review: 200Г. S3. P: 124-126. IV. Sergeev A.N-., Safatov A.S;, Zhukov V.A., P'yankov ShishkinaL.N., Petrishchenko V.Al, P'yankova ©:G:, Buryak G.A., Sergeev A.A. The study of infectious activity, of influenza virus aerosol taking into account its deposition in laboratory animal's organism // J. Aerosol Sci. 2001. 33(S1). P. S793-S794.

12. Сергеев5 A.H., Жуков B.A., Порываев В .Д., Пьянков О.В., Шишкина ЛЩ:, Петрищенко BLA., Пьянкова 0;Г., Булычев J1.E., Сафатов А.С. Разработка простого метода: прямой оценки наличия инфекционного процесса ^ мышей и-крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа // Вопросы вирусологии: 2002. № 4. С. 44-46:

13. Сергеев A.A., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Пьянков 0:В., Петрищенко В.А., Малкова Е.М., Смоленцев М.Н. Получение и культивирование первичных культур клеток легкого экспериментальных животных для? изучения» продуктивных свойств ¿вируса; гриппа// Успехи современного естествознания; 2004. Т 1. № 6: С. 137-138.

14. Жуков-tBiA., Са^фатов?А.С., Пьянков О.В., Топорков.В.С., Сергеев А.А., Киселев С.А., Яшин; В.А., Беляев Н.М., Рябчикова Е.И., Жуков: А.В.,

Шишкина JI.H., Медведев A.A., Петрищенко В:А., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Новый комплекс для получения- и изучения' монодисперсных микробиологических аэрозолей в медико-биологических исследованиях // Вестник РАМН. 2004. № 3. С. 14-15».

15. Сергеев.A.A., Шишкина"ЖН., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Фанкин HB., Пьянков OíB., Рябчикова Е.И., Малкова Е.М., Воробьев A.A. Изучение восприимчивости клеток легких у мышей и крыс к вирусу гриппа'при ¡инфицировании in vivo и in vitro // Вестник» РАМН. 2004. № 8. С. 15-18.

16. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев A.A., Фанкин И.В:, Сметанникова М.А., Пьянков 0:В., Петрищенко. В.А., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Проверка возможности прогнозирования восприимчивости хозяина к инфекции гриппа используя данные экспериментов с первичными клетками // Medline.ru: сетевой журн. 2006. № 7. С. 195-204. URL: http://www.medline.ru/public/last/ (дата обращения: 03.01.2010).

17. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев A.A., Малкова Е.М., Рябчикова Е.И., Петрищенко В.А., Сергеев-А.Н., Устюжанина Н.В., Воробьев A.A. Изучение восприимчивости и продуктивности реснитчатых клеток и альвеолоцитов 1-го и 2-го типов-мышей при заражении вирусом гриппа in vitro // Medline.ru: сетевой журн. 2006. № 7. С. 205-213. URL: http://www.medline.ai/public/iast/ (дата обращения: 03.01.2010).

18. Сметанникова М.А., Шишкина JI.H., Сергеев A.A., Фанкин И.В., Булычев Л.Г., Колесникова JI.B., Омигов В.В., Малкова Е.М., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Жуков В.А. Влияние глюкокортикоидной иммуносупрессии на течение экспериментальной гриппозной инфекции // Вестник РАМН. 2006. № 6. С. 22-27.

19. Сметанникова М.А., Шишкина JI.H., Жуков В.А., Фанкин И.В., Сергеев

A.A., Скарнович М.О., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Бондаренко

B.Н., Сергеев А.Н., Восприимчивость клеток-мишеней и активность фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа урожайности: 53±22 и 117±33 БОЕ/клетка для макрофагов морской свинки и зеленоймартышкисоответственно. Следует уточнить, что оценка ур ожай ности проведена без учета инактивации; поэтому вышеприведенные- величины, являются оценкой урожайности снизу.

3.7.3. Прогноз ID50 вируса Марбург для обезьяны с использованием частого алгоритма

Для прогноза Я)50 для зеленых мартышек с использованием морских свинок как модельного хозяина использовали уравнение (3.3.4)

1дЮ50 = 1дШ50т + IgPjcvm ~ klPicv + +lg(l — e~ln2'Nvm/IDsomy — lg{l — e-ln2-Nv/lDsoy и значения параметров, определенные в разделах 3.7.1 и 3.7.2:

1дЮ50т = -0,67 lg(y. e.); PICVm= 0,45-Ю"3/(БОЕ/мл); PICv = 0,18-10"3/(БОЕ/мл):

NVm=53 БОЕ; Nv=\ 17 БОЕ.

При проведении расчетов, величины N и ID50 в показателе степени экспонент были выражены в одинаковых единицах измерения — в количестве вирионов. Доза Ю50т для морской свинки и пробные значения ID50 для обезьяны пересчитывали исходя из: результатов исследования: вирусных препаратов методом электронной микроскопии, в которых было определено, что одна у.е. соответствует в среднем 10 вирионам вируса Марбург [93]. В частности, для морской свинки Ю50т = 10 ■ Ю-0,67 = 2,13 вириона. Урожайность N для клеток обезьяны и морской свинки была пересчитана в двух вариантах: исходя из очевидного соотношения 1 БОЕ > 1 вирион и исходя из оценки 1 БОЕ = 30 вирионов, приведенной в работе [340]. В первом случае N для клеток морской свинки и обезьяны оценивается величинами 53 и 117 вирионов, а во втором случае: 1590 и 3510 вирионов соответственно.

Уравнение решали методом перебора (см. раздел 2.18). В качестве исходного приближения lgID5Q использовали величину равную -0,26 1д(у.е.), вычисленную по упрощенному уравнению (3.3.8) на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии // Вестник РАМН. 2007. № 1.С. 3-8.

20. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев A.A., Фанкин И.В., Сметанникова М.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев A.A. Изучение возможности прогнозирования чувствительности к гриппу различных отделов респираторного тракта хозяина // Вестник РАМН. 2007. № 5. С. 32-7.

21. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев A.A., Малкова Е.М., Рябчикова Е.И., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Устюжанина Н.В., Воробьев A.A. Сравнительный анализ восприимчивости клеток-мишеней респираторного тракта мышей и крыс при заражении вирусом гриппа in vitro // Вестник РАМН. 2008. № 2. С.12-16.

22. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сергеев A.A., Плясунов И.В., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Зайцев Б.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев A.A. Количественная оценка in vitro вирус-гриппа нейтрализующей активности секреторных факторов легких крыс // Вестник РАМН. 2009. № 11. С. 46-49.

23. Жуков В.А., Шишкина JI.H., Сафатов A.C., Сергеев A.A., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Зайцев Б.Н., Топорков B.C., Сергеев А.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев A.A. Валидация модифицированного алгоритма прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусам с учетом параметров восприимчивости первичных культур клеток-мишеней и факторов врожденного иммунитета // Вестник РАМН. 2010. № 5. С. 24-29. i

AIDS. Leningrad, 1991. P.4-6. i

25. Жуков. В.А., Чермашенцев В.М., Сафатов A.C. Системный подход к проблеме конструирования биопрепаратов: материалы Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской^биотехнологии». Томск, 1991. С. 78.

26. Жуков" В.А., Чермашенцев- В.М., Сафатов A.C., Субханкулов^ Г.Ф. Подход к прогнозированию воздействия, на человека различных неблагоприятных факторов: матер! Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. С. 79i

27. Жуков В.А., Чермашенцев BïM. Подход- к оценке противовирусных препаратов (ПВП) с использованием животных и экспериментов ин витро: матер. Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. С. 80.

29. Zhukov V.A., Shishkina L.N., Ryzhikov A.B., Safatov A.S., Sandakhchiev L.S. Shift of virus infectivity for human: proceedings of the International SB Medical Treatment Symposium Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without- chemical and biological weapons. Zagreb-Dubrovnik, Croatia, 1998. P. 350-352.

30. Жуков B.A., Шишкина JI.H., Сергеев A.H., Сафатов A.C., Пьянкова О.Г., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Рябчикова Е.И., Малкова Е.М., Морзе С., Воробьев A.A. Метод экстраполяции Ш50 с одного вида млекопитающих на другой. Перспективы применения в медицине: тр. X Юбил. междун. конф. и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине экологии». Ялта-Гурзуф, Украина, 2002. С. 237-239.

31. Сергеев A.A., Шишкина JI.H., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Смоленцев М.Н., Малкова Е.М. Разработка клеточной системы для изучения способов и средств коррекции инфекционного воспаления: матер. Всерос. конф. «Компенсаторные1 приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск, 2004. С. 70 - 71.

32. Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Фанкин И:В., Пьянков О.В., Сергеев A.A., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Омигов* В.В., Колесникова Л.В., Малкова Е.М. Изучение влияния глюкокортикоидного гормона кеналога на резистентность мышей к вирусу гриппа: матер. Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск, 2004. С. 181 - 182.

33. Жуков В.A. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов' иммунитета и термоинактивации: теоретическое обоснование алгоритма прогнозирования: тр. междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07». Гурзуф, Украина, 2007. С. 190192.

34. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Плясунов И.В., Сергеев А.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев A.A. Ех vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации: определение вирус нейтрализующей активности сурфактанта крысиных легких: тр. междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 1Т+М&Е'07». Гурзуф, Украина, 2007. С. 192194.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важным аспектом предотвращения неблагоприятных последствий эпизоотий и эпидемий инфекционных заболеваний, появления» новых (вновь возникающих) инфекций'является своевременный прогноз восприимчивости животных или человека к патогенам, а также подбор и создание наиболее эффективных противовирусных средств. Решение данных задач основано на использовании модельных биологических систем — культур клеток и модельных животных с последующим испытанием безвредности и оценки эффективности на животных и человеке. Современные знания и методы вирусологических исследований не дают возможности формулировать количественные требования на необходимый уровень противовирусной активности ПВП на уровне модельных систем и количественно переносить результаты оценки инфекционности вирусов и противовирусной активности ПВП в модельных системах на человека. Целью исследования являлась разработка методов количественного прогнозирования 50% инфицирующей дозы вируса Ю50 для хозяина, в т.ч. человека. Выбор данного показателя объясняется, прежде всего, тем, что этот показатель является количественной характеристикой главного свойства вирусов - способность инфицировать хозяина с образованием инфекционного процесса - основы возникновения заболевания и любых его последствий. Этот показатель характеризует как инфекционность вируса для хозяина, так и восприимчивость хозяина к вирусу, степень изменения показателя характеризует эффективность ПВП.

Другой причиной является то, что, как следует из гипотезы независимого действия микроорганизмов против своего хозяина, для гомогенной популяции справедливо простое выражение Ю50 через вероятность инфицирования хозяина одним вирионом, р, Ю50 = ^р

Последнее обстоятельство открывает возможность перехода от рассмотрения взаимодействия «доза (вирионов) - хозяин» к «вирион-культура клеток» с изучением зависимости инфекционности для коллектива клеток от инфекционности вируса по отношению к отдельно взятой клетке, потому что возбудитель любого заболевания после преодоления факторов врожденного иммунитета в конечном итоге должен инфицировать клетку, репродуцироваться в ней и сформировать новые вирионы, которые должны инфицировать новые клетки и т.д. иначе не будет инфекционного процесса.

Данная работа посвящена разработке метода прогнозирования 50% инфицирующей дозы вируса для хозяина путем экстраполяции с модельного животного на основании показателей инфекционности вируса на уровне клетки-мишени. Выполнение данной задачи предполагает также разработку методов оценки параметров модели прогнозирования, проверку адекватности разработанных моделей и алгоритмов, а также формулирование рекомендаций по практическому применению новых методов.

Решение поставленной задачи осуществлено при следующих достаточно общих предположениях.

Условие 1. Справедлива гипотеза независимого действия микроорганизмов против своего хозяина.

Согласно гипотезе, каждый вирион независимо от других, попавших в организм хозяина, может вызвать инфекционный процесс с некоторой вероятностью, р, которая связана' с Я)50 по формуле р — Эта гипотеза, сформулированная более 60 лет назад, в настоящее время признается справедливой за редким исключением для большинства вирусов. Как отмечается в [44], этот принцип нарушается лишь в ряде случаев - так, например, аденоассоциированные вирусы и вирусы мышиных сарком не могут размножаться, если клетка одновременно не заражена вирусом помощником Условие 2. Рассматривается гомогенная популяция хозяина.

Условие о гомогенности популяции не ограничивает практического применения разработанных методов, поскольку в качестве модельных животных используются если не линейные, то подобранные по полу, весу, условиям выращивания^ и др. признакам» животные, которые образуют практически, гомогенную группу. Если« в, качестве хозяина рассматривается человек, то возможно 2 варианта решения проблемы гомогенности коллектива хозяина. В случае; когда возможно получение от одного1 донора количества клеток достаточного для» проведения необходимых экспериментов: по. определению' параметров модели прогнозирования, прогноз производится для конкретного индивидуума, который естественно гомогенен сам себе. В случае необходимости объединения- клеток от нескольких доноров следует позаботиться о подборе доноров с близкими характеристиками, которые могут повлиять на восприимчивость клеток и активность факторов врожденного иммунитета. Следует отметить, что возможность прогнозирования Ш50 для индивидуума- как раз и открывает возможность прямого изучения, законов распределения параметра восприимчивости Ю50 в популяции на основании данных по распределению параметров вирус-клеточного взаимодействия, что является одной из задач, которые должны быть решены в рамках дальнейшего развития подходов к прогнозированию восприимчивости,хозяина к патогенам.

Условие 3. Рассматривается обобщенная-модель образования инфекционного процесса заболеваний, у которых место первичной репликации одновременно является^ органом-мишенью, или, когда^ место первичной репликации не является органом-мишенью, но наработка вируса в месте первичной репликации непременно приводит к поражению органа-мишени, т.е. ассоциируется с полноценным инфекционным заболеванием, а также выход вируса из первично-инфицированных клеток происходит до значимого изменения активности неспецифических факторов и иммунного ответа.

Согласно данной модели вирус, попавший в организм хозяина, может быть нейтрализован или инактивирован факторами врожденного иммунитета или подвергнуться спонтанной инактивации термоинактивироваться) или' инфицировать восприимчивую клетку. Дальнейшее развитие инфекционного процесса, зависит от поведения вновь наработанных вирионов, выход которых из клетки происходит до значимой активации как факторов врожденного, так и адаптивного иммунитета. Условие 4. Подобие условий in vitro и in vivo.

Известно, что под действием» ферментов может меняться, рецепторный состав мембран [322, 388]. Однако предполагается, что в организме исследуемые клеточные показатели изменяются аналогично экспериментальным данным, полученным in vitro [151, 195, 433]. Считаем, что урожайности вируса в клетке in vitro и in vivo равны, а удельная восприимчивость клеток в условиях in vitro изменяется относительно условий in vivo; при этом степень изменения не зависит от вида клеток и хозяина; удельная противовирусная активность неклеточных (гуморальных) факторов врожденного иммунитета (неспецифических ингибиторов) в условиях in vitro не изменяется по отношению к условиям in vivo; скорость термоинактивации вируса при равных температурах in vivo и in vitro одинакова. Представление стадии становления инфекционного процесса, как вероятностного процесса взаимодействия вируса с восприимчивыми клетками или нейтрализации факторами врожденного иммунитета или термоинактивации, позволило впервые получить уравнение

Р~=Р,С< 1-е-""), ш50 связывающее параметры инфекционности вируса на организменном (р -вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) и клеточном уровнях (Р/с - вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета, N - средняя урожайность вируса в клетке) и поэтому названное уравнением инфекционности. Математическое исследование уравнения инфекционности позволило вывести условия существования ненулевого решения уравнения и на основании этого впервые сформулировать критерии восприимчивости и резистентности (невосприимчивости) хозяина в зависимости от величины произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия. При Р1С ■ N > 1 (критерий восприимчивости) уравнение имеет ненулевое решение и, следовательно, доза Ю50 для хозяина является конечной величиной. В противном случае, когда Pic' N <1 (критерий невосприимчивости), уравнение имеет только нулевое решение и, следовательно, доза ID50 для хозяина является бесконечной величиной, т.е. вероятность возникновения инфекционного процесса при инфицировании хозяина любой дозой равняется 0. Это означает, что даже если будут инфицировано некоторое количество клеток, то на последующих циклах инфицирования с вероятностью равной 1 количество вновь инфицированных клеток станет равно 0, т.е. инфекционный процесс выродится.

Основываясь на уравнении инфекционности и на предположении о подобии условий in vivo и in vitro, впервые был выведен алгоритм прогнозирования дозы IDB0 для хозяина путем экстраполяции с модельного животного на основании данных по восприимчивости модельного животного и параметров вирус-клеточного взаимодействия для клеток-мишеней модельного животного и хозяина. Было сформулировано два варианта алгоритма для двух вариантов образования инфекционного процесса: когда отличия в активности факторов врожденного иммунитета у хозяина и его модели не существенны (частный алгоритм) и существенны (модифицированный алгоритм). В обоих алгоритмах предполагается использование параметров вирус-клеточного взаимодействия, измеренных в экспериментах с первичными культурами клеток органа-мишени, в которых возможно оценить вероятность инфицирования клетки с точностью до коэффициента, величина которого одинакова для разных видов хозяина. В модифицированном алгоритме также используются данные по активности факторов врожденного иммунитета, которые могут модулировать эффективность инфицирования клеток вирусом. Суть обоих алгоритмов прогнозирования сводится к тому, что на первом этапе для модельного животного определяются IDS0 in vivo и параметры вирус-клеточного взаимодействия in vitro (для модифицированного алгоритма - и параметры нейтрализации вируса факторами иммунитета), далее по уравнению инфекционности определяется величина масштабного коэффициента, выравнивающего вероятность инфицирования in* vitro до уровня in vivo, и на следующем этапе с использованием вычисленной величины масштабного коэффициента и параметров вирус-клеточного взаимодействия, измеренных in vitro для клеток хозяина по уравнению инфекционности вычисляется величина вероятности р, что позволяет в конечном итоге вычислить дозу

IDs оНа втором этапе исследования были выведены алгоритмы оценивания параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro на основании данных стандартных вирусологических экспериментов по культивированию вирусов в культурах клеток. Впервые показано, что для случая незначимых отличий факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина вероятность инфицирования клетки можно выразить через 50%

In 2 инфицирующую дозу для культуры клеток (P[cv = ——)■ Для случая значимых отличий факторов врожденного иммунитета у хозяина и модельного животного для построения выражений для вероятности инфицирования in vivo и in vitro были рассмотрены математические модели изменения количества вируса в различных вариантах культивирования вируса in vitro с восприимчивыми клетками, в бесклеточной среде и с вируснейтрализующими факторами иммунитета, представленные в виде обыкновенных дифференциальных уравнений аналогичных уравнениям химической кинетики псевдопервого (для описания убыли вируса в связи с термоинактивацией) и псевдовторого порядка (для описания убыли в связи с использованы суспензионные первичные культуры клеток легких и трахеи, в которых в более полном составе представлены основные восприимчивые к вирусу гриппа клетки, чем в монослойных культурах из этих органов. Примененная .в работе методика дезагрегации легких и трахеи мышей и крыс позволила получить первичные культуры клеток, которые продуцировали вирус гриппа при культивировании в суспензии. Оценка процентного соотношения различных типов клеток в получаемых суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи мышей и крыс подтвердила стандартность и воспроизводимость процедур выделения дезагрегированных клеток из соответствующих органов.

По результатам экспериментов и с учетом данных литературы была выбрана среда DMEM/F12 с 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки Gold для культивирования суспензионных первичных культур клеток, инфицированных вирусом гриппа. В серии экспериментов показана способность полученных суспензий первичных культур клеток легких -мышей и крыс продуцировать вирус гриппа при культивировании более 48 часов.

Дозы ID5q вируса гриппа для лабораторных животных были определены для аэрогенного способа инфицирования в динамической камере. Для повышения точности определения аэрогенной инфицирующей дозы в комплексе генерации аэрозоля был использован классификатор для выделения монодисперсной фракции частиц аэрозоля, позволяющий выделять из полидисперсного аэрозоля монодисперсные фракции с аэродинамическим диаметром из интервала 0,5-15 мкм. Стандартность работы комплекса была продемонстрирована в экспериментах с сухими и жидкими аэродисперсными системами со среднемассовым диаметром частиц соответственно 3,6 и 3,5 мкм. В специальных экспериментах с использованием водной суспензии латексных частиц с диаметром 3 мкм были определены коэффициенты осаждения аэрозоля, генерируемого установкой, в трахее и легких мышей CD-I и крыс Wistar. Были определены следующие величины коэффициента осаждения ка экспериментального аэрозоля для трахеи и легких у мышей - 1,2+0,1 и 2,6±0,2 %, у крыс - 3,2±0,2 и 11,8±0,9 % соответственно, что соответствует приводимым в литературе данным.

На основании результатов определения доз ID50 было показано, что отличия между восприимчивостью легких и трахеи мышей CD-I и ICR незначимы, а у крысы легкие достоверно более резистентны к гриппу, чем трахея. Отличия в восприимчивости трахеи крысы Wistar и мыши CD-I к вирусу гриппа незначимы, в тоже время восприимчивость трахеи мыши ICR значимо выше, чем у других животных. Восприимчивость к вирусу гриппа легких мыши CD-I достоверно выше, чем у крысы Wistar, но достоверно ниже, чем у мыши ICR.

Клетками-мишенями у грызунов для вируса гриппа являются реснитчатые клетки и альвеолоциты I и II типов. Сравнительных данных по восприимчивости к вирусу гриппа различных типов клеток-мишеней в научной литературе не представлено. По-видимому, это связано со сложностью получения таких данных при инфицировании лабораторных животных или органных культур, поскольку альвеолоциты I и II типов и реснитчатые клетки расположены в различных отделах дыхательной системы: реснитчатые клетки - в трахее, бронхах и терминальных бронхиолах, а альвеолоциты - в альвеолярных ходах и альвеолах. В настоящее время не установлена роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в формировании более высокой резистетнтности крыс к вирусу гриппа по сравнению с мышами. В доступной литературе отсутствуют публикации, посвященные изучению этой проблемы, которая представляет большой интерес, так как эти клетки являются первым звеном реакции организма на заражение вирусом гриппа. По результатам наших экспериментов было обнаружено, что альвеолярные макрофаги и нейтрофилы в исследованных диапазонах изменения процентного отношению к вирусу гриппа. Было показано, что, действительно, ИФСЭВ, выделенные из легких у крыс, могут почти на порядок снижать инфекционность вируса гриппа после контакта с ними в течение 1 часа при последующем заражении РКЭ.

Известно, что основными внеклеточными факторами неспецифического иммунитета в легких, оказывающими противовирусное действие, являются белки сурфактанта СП-А и СП-D [231, 424, 496]. Опубликованы единичные работы, посвященные изучению концентрации сурфактантных белков СП-А и СП-D в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) у мышей и крыс. Так, концентрация СП-А в БАЛЖ у 6-12 недельных FBV/N мышей составила 11,1±5,3 мкг/кг массы животного [173]. Количество СП-А в БАЛЖ крыс, по данным разных авторов, составляет 32, 100, 180 мкг/крысу [495]. Также известно, что СП-D у грызунов составляет 12% от концентрации СП-А [495]. Таким образом, в среднем количество СП-А в БАЛЖ крыс составляет 104±74 мкг/крысу. При пересчете количества СП-А в БАЛЖ крыс массой 300 г на кг массы животного получаем 346,6±246,9 мкг/кг массы животного. Для использованных в работе мышей массой 28 г и крыс 212 г, расчетное количество СП-А составляет 0,31 мкг/мышь и 73,4 мкг/крысу. В разделе 3.8.6 площадь поверхности легких крыс была оценена величиной 0,4 м2, для использованных в работе мышей площадь легких оценивается величиной 0,15 м (согласно [85] соотношение площади поверхности легких к массе мыши равняется 5,4 м /кг). Отсюда можно рассчитать удельное содержание СП-А на единицу площади: 0,31/0,15

О I о 2 мкг/м у мыши; а у крысы 73,4/0,4 = 183,5 мкг/м . Таким образом, содержание СП-А на единицу площади поверхности легких у мыши оценивается в среднем в 91,8 раза ниже, чем у крысы. Расчетные данные подтверждают ранее полученные экспериментальные результаты о более низкой вируснейтрализующей активности секреторных факторов эпителиальной выстилки мышей по сравнению с такими же факторами крыс [54].

Таким образом, изменение инфекционности вируса гриппа под воздействием внеклеточных факторов неспецифического иммунитета (в т.ч. СП-А и СП-D) в составе лаважной жидкости, полученной путем промывания легких у крыс, показало его достоверное вируснейтрализующее действие, что находится в согласии с ранее полученными данными других исследователей.

На следующем этапе исследования, используя полученные данные о восприимчивости легких и трахеи экспериментальных животных и восприимчивости первичных культур клеток легких и трахеи этих животных, осуществили проверку адекватности частного алгоритма прогнозирования восприимчивости хозяина для вируса гриппа. Экстраполяцию проводили отдельно для трахеи и легких с мыши CD-I на соответствующий орган мыши ICR и крысы Wistar, а также с мыши ICR на крысу Wistar. Во всех случаях прогнозирования восприимчивости трахеи величины прогнозируемой и экспериментальной ID50 отличались незначимо (а=0,05). С такой же достоверностью наблюдалось соответствие прогнозируемой и экспериментальной величин Ю50 для трахеи и легких при экстраполяции с мыши CD-I на мышь ICR. Как и ожидалось, в обоих примерах экстраполяции для легких крысы с мышей CD-I и ICR прогнозируется существенно более высокий уровень восприимчивости, чем наблюдаемый в действительности. Как было показано выше и отмечается в литературе [54, 15, 495], это может объясняться различием вируснейтрализующей активности секреторных факторов, прежде всего, сурфактанта, в легких у мышей и крыс. В тоже время прогнозируемая величина ID50 для трахеи крыс соответствует экспериментально полученной IDso, что может быть связано с почти полным отсутствием сурфактанта в трахее крыс [437].

Проверку модифицированного алгоритма прогнозирования проводили для трахеи и легких при экстраполяции с мышей CD-1 и ICR на крысу Wistar с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток и данных по оценке вируснейтрализующей активности секреторных факторов эпителиальной выстилки легких крыс. Во всех случаях прогнозирования восприимчивости трахеи и легких крысы величины прогнозируемой и экспериментальной Ю50 отличались незначимо (а=0,05). В заключение была проверена возможность прогнозирования по упрощенной модели модифицированного алгоритма прогнозирования, которая в отличие от основной модели не требует решения трансцендентного уравнения, а позволяет вычислить величину прогнозной величины дозы выполнением только арифметических операций. Существенно также и то, что в полном уравнении необходимо использовать дозы вируса, выраженные в физическом количестве вирионов, а в упрощенной модели дозы можно выражать в условных единицах. Величины прогнозов по упрощенной и полной модели отличались друг от друга незначимо (а=0,05). Результаты прогнозирования подтвердили оценки математического анализа упрощенной формулы прогнозирования, согласно которым отклонения величин прогнозов по упрощенной модели от прогнозов по полной модели должны составлять величины порядка 0,3 1дЭИД50. Сравнение прогнозных доз с экспериментальными также свидетельствует о достаточно хороших прогностических свойствах упрощенной модели. Только в одном случае (из 6) прогноз для трахеи крысы отличался от экспериментально определенной дозы достоверно, но при этом уровень достоверности отличий (а=0,037) не является высоко достоверным. Также невелика и абсолютная величина отклонения прогноза от экспериментально измеренной дозы равная 0,6 1дЭИД50. Кроме того, прогноз дозы для трахеи крысы делали исходя из оценки концентрации сурфактанта в трахее равной 9±9%, что существенно превышает реальную. Действительно, согласно [437] слизь, выстилающая поверхность трахеи у крыс, содержит 9±9% сурфактанта и липидов, при этом средние значения содержания липидов для индивидуальных животных изменялись от 4% до 16%. Таким образом, даже 5% является оценкой сверху для концентрации сурфактанта. В этом случае прогноз по упрощенной модели модифицированного алгоритма дает величину дозы равную 0,3 1дЭИД,50, что недостоверно (а=0,05) отличается от экспериментально определенной дозы -0>\ 1д ЭИД50. Следует добавить, что прогноз восприимчивости легких крысы (именно в этом случае необходимо реально учитывать факторы иммунитета) в обоих случаях экстраполяции с каждого из видов мышей дал незначимое (а=0,05) отличие прогноза по упрощенной модели от экспериментально определенной дозы. Таким образом, результаты прогнозирования восприимчивости трахеи и легких экспериментальных животных к вирусу гриппа подтвердили адекватность модифицированного алгоритма прогнозирования и показали возможность использования упрощенной модели модифицированного метода для экспресс-прогнозирования.

Проведенное исследование с вирусом гриппа позволяет заключить, что данные о восприимчивости к вирусу гриппа только самих легочных клеток животного, для которого осуществляется Прогноз /£>50, позволяют прогнозировать потенциальную или базовую (клеточно-опосредованную) его восприимчивость к вирусу. Так, восприимчивость к вирусу гриппа легочных клеток мышей определяет реальную восприимчивость легких к вирусу гриппа. Это соответствует литературным данным о низкой эффективности нейтрализующих секреторных факторов эпителиальной выстилки легких этих животных. Однако при наличии у крыс в легких эффективных нейтрализующих вирус гриппа факторов, эффективная восприимчивость к вирусу гриппа легких in vivo оказывается ниже, чем прогнозируемая воссприимчивость только с учетом клеток. Напротив, учет клеток и нейтрализующих вирус гриппа факторов приводит к соответствию прогнозируемой и реальной восприимчивости легких у крыс.

Для оценки потенциальной восприимчивости человека к новым штаммам вируса гриппа, предположительно обладающим пандемичным потенциалом, важно оценить именно восприимчивость самих легочных клеток-мишеней человека к вирусу, так как возможны случаи недостаточности секреторных факторов эпителиальной выстилки, и в частности дефицита сурфактанта, в легких у людей [12]. Не следует исключать и то обстоятельство, что пандемичный штамм вируса гриппа может обладать устойчивостью к действию секреторных факторов эпителиальной выстилки легких, включая факторы сурфактанта. Исходя из всего вышесказанного, прогноз восприимчивости к вирусу гриппа собственно клеток-мишеней в легких может являться наиболее важным лимитирующим звеном в прогностической оценке восприимчивости к вирусу гриппа всего организма и поэтому разработанные методы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия и частный алгоритм прогнозирования восприимчивости трахеи и легких к вирусу гриппа могут быть использованы для прогнозирования потенциальной опасности новых штаммов вируса гриппа для человека.

Проверка работоспособности метода прогнозирования для вируса гриппа продемонстрировала возможность использования данного метода для изучения на модельных животных существенности вклада различных типов клеток и факторов врожденного иммунитета в формирование восприимчивости организма хозяина к инфекции. Только при правильном выборе клеток и факторов будет наблюдаться соответствие прогнозируемой и экспериментально измеренной дозы /1>50. В противном случае будет наблюдаться несоответствие прогнозной величины экспериментально определенной. Напомним, что для трахеи и мышей и крыс достаточно было учесть восприимчивость клеток, а для легких крыс необходимо учесть и секреторные факторы. Соответственно в первом случае был адекватен прогноз только с учетом клеток, тогда как во втором случае прогноз с учетом только клеток был неадекватен, а адекватность наблюдали после учета секреторных факторов.

После проверки адекватности алгоритмов прогнозирования был проведен теоретический анализ уравнения инфекционности. Было показано, что метод прогнозирования, может быть использован для прогнозирования потенциальной эффективности противовирусных средств, и, даны математические определения оптимальному ПВП, эффекту синергизма при сочетанном'применении* ПВП, критерию • выбора модельного животного при выборе оптимального ПВП, что в свою очередь позволяет оптимизировать поиск кандидатных ПВП в клеточных культурах и с использованием, модельных животных. Действительно, противовирусное действие химиопрепаратов, интерферонов или их индукторов и иммуномодуляторов, а также иммуноглобулинов № вакцин в- конечном итоге проявляются либо в модуляции вероятности инфицирования^ восприимчивой клетки (нейтрализация внеклеточного вируса, супрессия' слияния и- проникновения^ вируса в клетку или уменьшение количества'восприимчивых клеток) либо в. модуляции урожайности вируса в клетке (блокирование внутриклеточных стадий репродукции, сборки и почкования! или лизис инфицированных клеток). На основании математического анализа уравнения инфекционности был сформулирован критерий выбора оптимальных противовирусных средств, (как профилактических, так и терапевтических), когда под оптимальным средством понимается средство, под действием которого организм хозяина переводится в состояние невосприимчивости к любой) дозе заражения инфицирования (для терапевтических препаратов под, дозой инфицирования можно понимать количество вируса, находящегося в хозяине на момент применения средства). Формально это означает, что после применения препаратов параметр восприимчивости организма хозяина (вероятность инфицирования хозяина одним вирионом, р) должен стать равным 0. Это возможно, только если вследствие применения препаратов величина произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия? с исходного уровня 1С = Р1Со • ЛГ0 уменьшится не менее, чем в 1С раз, потому что только в этом случае уравнения инфекционности не будет иметь положительного решения, т.е. вероятность р станет равной 0. Требование снижения произведения параметрові вирус-клеточного^ взаимодействия' не менее, чем в 1С раз и является1 критерием оптимальности ПВП, а уровень /с -критическим уровнем критерия' оптимальности ПВП. Данный критерий справедлив как для» средств; снижающих вероятность! адсорбции, так и урожайность, как профилактических, так и терапевтических. Следует отметить, что для, обеспечения, невосприимчивости хозяина нет необходимости достигать полной невосприимчивости клеток, когда вероятность инфицирования^ клеток и/или урожайность клеток равна 0. Для выполнения' критерия. Р1С • N < 1 параметры вирус-клеточного взаимодействия, могут быть больше 0, а это и означает, что клетка является восприимчивой к вирусу, но при этом вероятность образования инфекционного процесса будет равняться- 0, т.е. совокупность клеток при этом'в целом будет не восприимчива. Также из критерия следует объяснение эффекта синергизма при сочетанном применении двух неоптимальных средств. Если один из них снижает вероятность инфицирования, а второй урожайность, при этом произведение степеней снижения* параметров1 больше критического уровня /с, то при сочетанном применении таких средств будет достигнут критический уровень ь уменьшения1 произведение параметров вирус-клеточного взаимодействия и соответственно перевод организма в невосприимчивое состояние. На основании уравнения инфекционности математически также доказывается, что при одной и той же степени снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия меньше критического уровня равного 1С снижение вероятности инфицирования эффективнее снижает восприимчивость хозяина, чем снижение урожайности. На основании этого свойства и математического толкования эффекта синергизма можно строить оптимальные схемы выбора кандидатных препаратов на стадиях лабораторного изучения. На первом этапе необходимо определить величину критического уровня /с для хозяина. На втором этапе для» каждого из тестируемых, препаратов определяются величины снижения вероятности инфицирования и урожайности. После этого выбираются индивидуальные ПВП или пары ПВП, для которых произведение степеней снижения вероятности инфицирования и урожайности превышают величину критического уровня 1С для хозяина. Такой способ не требует проведения испытаний для пар ПВП, что приводит к резкому сокращению опытов. Также отсекаются препараты, которые заведомо не обеспечат перевод организма хозяина в невосприимчивое состояние.

Из критерия оптимальности ПВП следует критерий выбора модельных животных для тестирования противовирусных средств. Пусть для хозяина и некоторого вируса критический уровень критерия оптимальности оценивается величиной 1С, тогда в качестве модельного следует выбрать то животное, для которого критический уровень оценивается > /с , в противном случае достижение защиты животного (с критическим уровнем меньшим, чем у хозяина) может не гарантировать защиту хозяина. Примечание: предполагается, что противовирусная активность средства в применении к разным видам хозяина одинаковая.

Рекомендации по • практическому использованию метода прогнозирования и следствия из уравнения инфекционности проиллюстрированы для вируса Марбург. На основании литературных данных по восприимчивости к вирусу Марбург первичных культур клеток макрофагов человека и морских свинок и с использованием частного алгоритма экстраполяции была оценена восприимчивость человека к вирусу Марбург при аэрогенном инфицировании. Доза Ю50 оценивается величиной ~0,7±0,14 1д(у.е.), что соответствует вероятности инфицирования человека одним вирионом равной 0,014 (-0,004;+0,005). Отсюда следует, что при аэрогенном пути инфицирования человек менее восприимчив к вирусу Марбург, чем морская свинка примерно в 20 раз и чем обезьяна - в 7-17 раз. Большая восприимчивость морских свинок по сравнению с человеком и

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Жуков, Владимир Александрович, Кольцово

1. Г. АбрамовМ;Г. Гематологическийатлас. Ml: Медицина, 1979: 344 с.

2. Ашмарин Й.П., Воробьев^ A.A. Статистические методы- в микробиологических исследованиях. ЛС: Гос.Издат.Мед.Лит, 1962. 173 с.

3. Афанасьев Ю.И., ГОрина H.A. (ред.) Гистология. М.: Медицина, 2002; 744 с.4: Бажаи С.И. Теоретическое исследование механизмов противовирусного иммунитета: дис. . докт. биол. наук. Кольцово, Новосибирская обл., ГНЦ ВБ «Вектор», 2008. 307 с.

4. Влияние способов экспериментального заражения вирусом Марбург на особенности протекания болезни у зеленых мартышек / Н.Б; Бажутин и дрО // Вопросы вирусологии. 1992. № 3; С. 153-156.

5. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: ГИМЛ, 1963. 149 с.

6. Беляков В.Д., Яфаев Р.Х. Эпидемиология. М.: Медицина, 1989. 416 с.

7. Большая советская энциклопедия. В 30 тт. Т.5. М.: Советская энциклопедия, 1971. С. 96.

8. Боровков А;А. Курс теории вероятностей. М:: Наука, 1972. 287 с:

9. Быков В Л. Частная гистология человека. СПб.: СОТИС, 2001: 304 с.

10. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

11. Применение сурфактанта-BL у взрослых больных с острым респираторным дистресс-синдромом / A.B. Власенко и др. // Общая реаниматология 2005. Т. 1. № 6. С. 21-29.

12. Волошин Н. А., Григорьева Е. А. Лектины животного и растительного происхождения: роль в процессах морфогенеза // Журнал АМН Украши. 2005. Т.Н. № 2. С. 223-237.

13. Проблемы биотерроризма в современных условиях / A.A. Воробьев A.A. и др.7/ ЖМЭИ. 2002'. № 3. С. 3-12.

14. Гавришева Н.А., Антонова Т.В. Инфекционный процесс: клинические и патофизиологические аспекты. СПб.: Элби; 2006. 282 с.

15. Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. Практическая оптимизация. М.: Мир, 1985. 509 с.

16. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Метод культур тканей в гематологии. Томск: Издательство Томского университета; 1992. 272 с.

17. Чувствительность к вирусу Марбург различных экспериментальных животных / Н.И. Гончар и др. // Вопросы вирусологии. 1991. №5. С.435-437.

18. ГОСТ Р 52379-2005. Надлежащая клиническая практика. Национальный стандарт Российской Федерации. Утвержден Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27.09.2005 № 232-ст. М.: Стандартинформ, 2006. 34 с.

19. Громашевский JI.B. Механизм передачи инфекций. Клев: Госмедиздат УССР; 1962. 448 с.

20. Громашевский JI.B., Общая эпидемиология, М.: Медицина, 1965. 290 с.

21. Данилов Р.К., Быков B.JL, Одинцова И.А. (ред.) Руководство по гистологии. В 2 тт.:Т. 2. Частная гистология органов и систем. СПб.: СпецЛит, 2001. 736 с.

22. Дауэл В.Р., Шилд Г.С. Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинических материалов // Вирусы гриппа и грипп / под ред. Э.Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. 281-308.

23. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях / С.Г. Дроздов и др.. М.: Медицина, 1987. 256 с.

24. Дуглас Р.Г. Грипп у человека // Вирусы гриппа и грипп / под ред. Э.Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. 438-92.

25. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. М.:Медицина, 1998. 187 с.

26. Жемчугов В.Е. Кутырев В.В. Препарат для профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний // База патентов на изобретения РФ. 1ЖЬ: Ьир://ги-ра1еп1пп1Ш 1/45-49/2147234.html (дата обращения: 02.04.2010).

27. Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976. 598 с.

28. Игнатьев Г.М. Экспериментальные препараты для профилактики фило-и аренавирусных геморрагических лихорадок: дис. . докт. мед. наук. Кольцово, Новосибирская обл., ГНЦ ВБ «Вектор», 2002. 276 с.

29. Интегрины // Сайт ИМГ РАН. ИЕЬ: http://humbio.rn/Humbio/genexp/x00692a9.htm (датадата обращения: 20.03.2010).

30. Ионов С.Н., Кириллова С.Л., Пшеничнов В.А. Интегральные характеристики экспериментальных вирусных инфекций: Статистические аспекты // Вопросы вирусологии. 1990. № 6. С. 448-452.

31. Кильбурн Э.Д. Эпидемиология гриппа // Вирусы гриппа и грипп / под ред. Э.Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. С. 526-585.

32. Кильбурн Э.Д. Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина, 1978. 584 с.

33. Кингсбери Д.У. Орто-и парамиксовирусы и их репликация //Вирусология. В 3 тт.:Т.2 / под ред. Б.Н. Филдс, Д.М. Найп. М.: Мир, 1989. 446-486.

34. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике (для научных сотрудников и инженеров). М.: Наука, 1977. 831 с.

35. Проявления экспериментальной гриппозной инфекции при различной интенсивности иммунитета у белых мышей / Н.П. Корнюшенко и др. //

36. Грипп, (сборник научных работ). Выпуск-, III / под ред. Н.И. Морозкин. Киев: Государственное медицинское издательство УССР, 1959: 67-76.

37. Справочник по теории вероятности и математической статистики / B.C. Королюк и др.. М.: Наука; 1985. 640 с.

38. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для медицинских вузов. СПб.: СпецЛист, 2002. 592 с.40: Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М.:Медицина, 1975. 384 с.

39. Лебедева О.П. О бактериальных осложнениях гриппозной пневмонии у облученных животных // Грипп (сборник научных работ). Выпуск III / под ред. Н.И. Морозкин. Киев: Государственное медицинское издательство УССР, 1959. 134-141.

40. Лобзин Ю.В., Козлов С.С., Усков А.Н. Руководство по инфекционным болезням с атласом инфекционной патологии // Вестник инфектологии и паразитологии: сетевой журнал. СПб. URL: http://www.infectology.ru/RUK/Ruk2000/index.aspx (дата обращения: 08.03.2010).

41. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология. М.: Мир, 1981.680 с.

42. Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Изучение иммуно- и патогенеза сапа и мелиоидоза. Гетерологичные вакцины / И.Н. Манзенюк и др. // Антибиотики и Химиотерапия. 1999. № 6. С. 21-26.

43. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. М.: Товарищество научных изданий КМК, 1998. 386 с.

44. Марчук Г.И. Математические модели в иммунологии. Вычислительные методы ^эксперименты. М.: Наука, 1991. 304 с.

45. Математическая энциклопедия. В 5 тт. Т. 1. М.: Советская энциклопедия, 1977. С. 793-795.

46. Маянский А.Н. Микробиология для врачей. Нижний Новгород: Издательство НГМА, 1999. 392 с.

47. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2004. 446 с.

48. Мечников- И.И. Невосприимчивость к инфекционным болезням. М.: Медгиз, 1947. 700 с.

49. Мейхи Б. Вирусология. Методы. М.: Мир, 1988. 344 с.

50. Митченко В.П. Адсорбция вируса гриппа на клетках респираторного тракта // Грипп (сборник научных работ). Выпуск III / под ред. Н.И. Морозкин. Киев: Государственное медицинское издательство УССР, 1959. 178-185.

51. Огарков В.И., Гапочко К.Г. Аэрогенная инфекция. М.: Медицина, 1975. 232 с.

52. Панюкова Т.А. Численные методы. М.: Либроком, 2010. 224 с.

53. Перадзе Т.В., Фридман Э.А., Шилд Д. Противогриппозные профилактические препараты. М.: Медицина, 1986. 272 с.

54. Пол Мак-Федрис. Формулы и-функции в Microsoft Office Excel-2007. М.; СПб.; К.: Издательский дом Вильяме, 2008. 640 с.

55. Пшеиичнов В.А. Элементы системного подхода при изучении и применении противовирусных препаратов // Вопросы вирусологии. 1989. №2. С. 139-144.

56. Пшеничнов В:А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. М.: Медицина, 1974. 168 с.

57. Экспериментальная лихорадка Эбола у макак резусов / О.В. Пьянков // Вопросы Вирусологии. 1995. № 3. С. 113-115.

58. Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы медицинской иммунологии. М.: Мир, 2006.319 с.

59. Ройзман Б. М. Размножение вирусов: общие представления // Вирусология. В Зтт. Т.1 / под ред. Б.Н. Филдс Б.Н. и Найп Д.М. Мир, 1989. С. 124-137.

60. Ройзман Б., Баттерсон У. Герпесвирусы и их репликация // Вирусология. В Зтт. Т.1 / под ред. Б.Н. Филдс Б.Н. и Найп Д.М. Мир, 1989. С. 186-245.

61. Ройт А. Основы иммунологии. М.:Мир, 1991. 328 с.

62. Руководство ВОЗ. Ответные меры системы общественного здравоохранения на угрозу применения биологического и химического оружия. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 2004. 265 с.

63. Рябчикова Е.И. Морфофункциональные аспекты патогенеза филовирусных геморрагических лихорадок: дис. . докт. биол. наук. Кольцово, Новосибирская область: ГНЦ ВБ «Вектор», 1997. 210 с.

64. Поражение внутренних органов экспериментальных животных, зараженных вирусом болезни Марбург / Е.И. Рябчикова и др. // Бюлл. Эксперим. Биол. Мед. 1994. Т. CXVII. № 4. С. 430-434.

65. Себер Дж. Линейный регрессионный анализ. М.: Мир, 1980. 456 с.

66. Чувствительность белых мышей к вирусу гриппа (А/АИЧИ/2/68) при аэрогенном заражении / А.Н. Сергеев и др. // Вопросы Вирусологии. 1999. №2. С. 69-71.

67. Разработка простого метода, прямой оценки наличия инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа / А.Н. Сергеев и др. // Вопросы Вирусологии. 2002. №4. С.44-46.

68. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности рекомбинантной бивакцины против оспы и гепатита В на людях / А.Н. Сергеев и др. // Вопросы Вирусологии. 2004. №5. С.22-26.

69. Вирус Марбурга и мононуклеарные фагоциты: изучение взаимодействий / A.A. Скрипченко и др. // Вопросы вирусологии. 1994. № 5. С. 214-18.

70. Скрипченко A.A., Шестопалов А. М. и Ярославцева О.И. Сравнительное изучение взаимодействия вируса Марбург с макрофагами из различных видов животных in vitro // Вопросы вирусологии. 1991. № 6. С. 503-506.

71. Восприимчивость клеток-мишеней и активность фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии / М.А. Сметанникова и др. // Вестник РАМН. 2007. №1. С. 3-8.

72. Влияние глюкокортикоидной иммуносупрессии на течение экспериментальной гриппозной инфекции / М.А. Сметанникова и др. // Вестник РАМН. 2006. №6. С. 22-27.

73. Смородинцев A.A. Грипп и его профилактика. Л.: Медицина, 1984. 383 с.

74. Смородинцев A.A., Лузянина Т.Я., Смородинцев Ал.А. Основы противовирусного иммунитета. Л.: Медицина, 1975. 312 с.

75. Сугиура А. Генетика вируса гриппа // Вирусы гриппа и грипп / под ред. Э.Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. 206-251.

76. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. М.: Вузовская книга, 2000. 376 с.

77. Терских И.И., Львов Д.К. Некоторые вопросы экспериментальной аэровирусологии. Новости медицины и медицинской техники (экспресс-информация). Москва. 1983. С. 37-66.

78. Топорков B.C., Медведев A.A. Классификатор для выделения монодисперсной фракции частиц аэрозоля. Патент РФ № 2070318 от 10.12.1996 // База патентов на изобретения РФ. URL: http://ru-patent.info/20/70-74/2070318.html (дата обращения: 02.04.2010).

79. Проблема нормы в токсикологии / И.М. Трахтенберг и др.. М.: Медицина, 1991. 206 с.

80. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975. 324 с.

81. Феллер В. Введение в теорию вероятностей и ее приложения. В 2 тт. Т.2. М.: Мир. 1984, 528 с.

82. Биология вирусов животных. В 2-х т. Т.1 / Ф. Феннер и др.. М.: Мир. 1977. 448 с.

83. Вирусология. В 3 тт. Т.1. / Б.Н. Филдс и др.. М.: Мир, 1989. С.264-297.

84. Фихтенгольц Г.М. Курс дифференциального и интегрального исчисления. В 3 тт. Т.1. М.: Физматлит, 2001. 616с.

85. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005. 832с.

86. Черкасский Б.Л. Новые инфекции: мифы и реальность // ЖМЭИ. 2007. № З.С. 111-116.

87. Некоторые теоретические подходы к оценке эффективности противовирусных препаратов / В.М. Чермашенцев и др.. Вестник РАМН. 1993. №9. С.: 3-7.

88. Шеффе Г. Дисперсионный анализ. М.: Наука, 1980. 512 с.

89. Шолтиссек К., Кленк Х.-Д. Репликация вируса гриппа // Вирусы-гриппа и грипп / под ред. Э.Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. С. 252-280.

90. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. М.: Медицина; 1999. 656 с.

91. Шульц И.Т. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин // Вирусы гриппа и грипп / под ред. Э.Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. С. 75-108.

92. Эммануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. М.: Высш. Шк., 1984. 463 с.

93. Ada G. L., Jones P. D. The immune response to influenza infection // Curr. Top. Microbial. Immunol. 1986. 128. P. 1-54.

94. Air G.M., Laver W.G. The neuraminidase of influenza vims // Proteins. 1989. 6(4). P. 341-56.

95. Alexander D.J. A review of avian influenza in different bird species // Vet. Microbiol. 2000 May. 22(74). P. 3-13.

96. Alexander D.J., Brown I.H. Resent zoonoses caused by influenza A viruses // Rev. Sci. Tech. 2000. 19(1). P. 197-225.

97. Alford RH, Kasel JA, Gerone PJ, Knight V. Human influenza resulting fromfaerosol inhalation //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1966 Jul. 122(3). P. 800-4.

98. Alonso-Caplen F.V., Krug R.M. Regulation of the extent of splicing of influenza virus NS1 mRNA: role of the rates of splicing and of the nucleocytoplasmic transport of NS1 mRNA // Mol. Cell Biol. 1991. 11. P. 1092-1098.

99. Andervont H.B. Activity of herpetic virus in mice // J. Infect. Dis. 1929. 44. P. 383-393.

100. Rotavirus Survival on Human Ha nds and Transfer of Infectious. Virus to Animate and Nonporous Inanimate Surfaces. / S.A. Ansaris et al. // J. of Microbiology. 1988. 26(8). P: 1513-1518.

101. Antoine Flahault, Judith Legrand and Alain-Jacques Valleron. Epidemics of malevolent origin: Mathematical modeling // Сайт CNRS. URL: http://www.cnrs.fr/cw/ en/pres/compress/ScienceDefense/O l.htm (дата обращения: 03.01.2010).

102. Asgharian В., Yu C.P. Deposition of fibers in the rat lung // J. Aerosol Sci. 1989. 20. P. 355-366.

103. Austin F.J., Webster R.G. Antigenic mapping of an avian HI influenza vims haemagglutinin and interrelationships of HI viruses from humans, pigs and birds // J. Gen. Virol. 1986. 67(Pt 6). P. 983-992.

104. Human Macrophage C-Type Lectin Specific for Galactose and N-Acetylgalactosamine Promotes* Filovirus Entry / Ayato1 Takada- et al. // Journal of Virology. March 2004. 78(6). P. 2943-2947.

105. Lung alterations in guinea pigs infected with influenza virus / E. Azoulay-Dupuis // J. Сотр. Pathol. 1984 Apr. 94(2). P. 273-83.

106. Bardi J. Aftermath of a Hypothetical Smallpox Disaster // Emerging Infectious Diseases. 1999. 5(4). P. 547-551.

107. Cyanovirin-N binds to the viral surface glycoprotein, GP(1,2) and inhibits infectivity of Ebola virus / L.G. Barrientos et al. // Antiviral Res. 2003. 58. P. 47-56.

108. Alveolar lining layer is thin and continuous: low-temperature scanning electron microscopy of rat lung / J. Bastacky et al. // J. Appl. Physiol. 1995. 79(5): P. 1615-28.

109. Bean W.J., Cox N. J., Kendal A.P. Recombination, of human influenza A viruses*in nature //Nature (London). 1980: 284(5757. P: 638-640.

110. Past, present, and possible future human infection with influenza virus A subtype H7 / J.A. Belser et al. // Emerg. Infect. Dis. 2009: 15(6). P. 859865.

111. Interactions of surfactant protein A with» influenza A viruses: binding and neutralization / C.A. Benne et al. // J'. Infect. Dis. 1995 Feb. 171(2). P. 33541.

112. Berke H.L., Dipasgua A.C. Distribution and excretion of polonium-210. 8 after inhalation by the rat // Radiat. Res. 1964. S5. P: 133-148.

113. Natural killer cells in antiviral defence: function and regulation, by innate cytokines / C.A. Biron et al. // Annu. Rev. Immunol. 1999. 17. P. 189-220.

114. Hemorrhagic Fever Viruses as a Biological Weapons. Medical and public health management / L. Borio et al. // JAMA. 2002. 287(18). P. 2391-2405.

115. Ebola and Marburg viruses replicate in monocyte-derived dendritic cells without inducing the production of cytokines and full maturation / C.M. Bosio et al. // J. Infect. Dis. 2003 Dec. 188(11). P. 1630-8.

116. Boyce S.T., Hansbrough J.F. Biologic attachment growth, and differentiation of cultured human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chondroitin-6-sulfate substrate // Surgery. 1988. 103. P. 421-431.

117. Rabies human diploid cell vaccine elicits cross-neutralising and cross-protecting immune responses against European and Australian bat lyssaviruses / S.M. Brookes et al. // Vaccine. 2005. 23. P. 4101—4109.

118. Bryan W.R., Beard J.W. Host influence in the characterization of response to the papilloma protein and to vaccinia virus // J. Infectious Diseases. 1940. 67. P. 5-24.

119. Buchman C.A., Fregien N. Influenza A Virus Infection of Human Middle Ear Cells In Vitro // Laringoscope. 2000. 110. P. 1739-1744.

120. Buller R.M., Straus S.E.,Rose J.A. Mechanism- of host restriction of adenovirus-associated virus replication in. African green monkey kidney cells //J. Gen. Virol: 1979'Jun. 43(3). P. 663-672.

121. Burleson G.R'., Burleson F.G. Influenza virus host resistance model // Methods 2007 Jan. 41(1). P. 31-37.

122. Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in, 2003 / K.M. Butt et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43 (11). P. 5760-5767.

123. Viral haemrrhagic fever in southern Sudan and northen Zaire. Preliminary stadies on the aethological agent / E.J.W. Bwen et al. // Lancet. 1977. 1(8011). P. 571-573.

124. Campbell D., Sweet C. and Smith H. Comparisons of Virulence of Influenza Virus Recombinants in Ferrets in Relation to their Behaviour in Man and their Genetic Constitution // J. Gen. Virol. 1979. 44. P. 37-44.

125. Inhibition of RNA Viruses In Vitro and in Rift Valley Fever-Infected Mice by Didemnins A and B / P.G. Canonico et al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1982: 22(4). P. 696-697.

126. Capua I., Alexander D.J. Avian influenza and human health // Acta Trap. 2002. 83(1). P. 1-6.

127. Cardenas W. B. Evasion of the Interferon-Mediated Antiviral Response by Filoviruses // Viruses. 2010., 2(1). P. 262-282.

128. Carnes BA, Grahn D, Hoel D. Mortality of atomic bomb survivors predicted from laboratory animals // Radiat. Res. 2003. 160 (2). P. 159-167.

129. Carnes B.A., Olshansky S.J., Grahn D. An interspecies prediction of the risk of radiation-induced mortality. Radiat. Res. 1998. 149(5). P. 487-492.

130. Carrel A. On the permanent life of tissues outside the organism // J. Exp. Med. 1912. 15. P. 516-528.

131. Cattoli G., Capua I., Diagnosing avian influenza in the framework of wild surveillance efforts and environmental samples // J. Wildl. Dis. 2007. 43 (3). P. S5-S9.

132. Production and release of influenza virus from fresh and maintained organ cultures of ferret neonatal lung / D. Cavanagh et al. // FEMS Microbiology Letters. 1979 Jun. 5. P. 431-433.

133. The localization of influenza virus in the respiratory tract of ferrets: susceptible nasal mucosa cells produce and release more virus than susceptible lung cells / D. Cavanagh et al. // J. Gen. Virol. 1979 Aug. 44(2). P. 505-14.

134. Folate receptor-a is a cofactor for cellular entry by Marburg and Ebola viruses / S.Y. Chan et al. // Cell. 2001. 106. P. 117-126.

135. Chang L.Y., Mercer R.R., Crapo J.D. Differential distribution of brush cells in the rat lung // The Anatomical Record. 1986. 216. P. 49-54.

136. Chen B.J., Lamb R.A. Mechanisms for enveloped virus budding: can some viruses do without an ESCRT? // Virology. 2008. 372 (2). P. 221-232.

137. Choi A.M.K., Jacoby D.B. Influenza virus A infection induces interleukin-8 gene expression in human airway epithelial cells // Federation of European Biochemical Societies (FEBS). 1992 Sept. 309(3). P. 327-329.

138. CLEC4G, Recombinant, Human (C-type Lectin Domain Family 4 Member G, Liver and Lymph Node Sinusoidal Endothelial Cell C-type Lectin, LSECtin) // Сайт USBIOLOGICAL. URL: http://www.usbio.net/item/C5839-73 (дата обращения 08.03.2010).

139. The role of cellular susceptibility in the declining severity of respiratory influenza of ferrets with age / D.M. Coates et al. // Br. J. Exp. Pathol. 1984 Feb. 65(1). P. 29-39*

140. Compans R.W., Dimmock N.T., Meier-Ewert H. An electron microscopic study of the influenza vims-infected cell // The Biology of Large RNA Viruses / editors R.D. Barry & B.W. J. Mahy. London: Academic Press, 1970. 87-108.

141. Condit R.C. Principles of virology // Field's virology. 4rd ed. / editors D.N. Knipe and P.M. Howley. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. P. 19-51.

142. Correlated studies of a recombinant influenza virus vaccine. 3. Protection against experimental influenza in man / R.B Couch et al. // J. Infect. Dis. 1971 Nov. 124(5). 473-80.

143. Induction of partial immunity to influenza by a neuraminidase-specific vaccine / R.B. Couch et al. // J. Infect. Dis. 1974 Apr. 129 (4). P. 411-20.

144. Structural and biochemical changes in rat lungs occurring during exposures to lethal and adaptive doses of oxygen / J.D. Crapo et al. // Am. Rev. Respir. Dis. 1980. 122. P. 123-145.

145. Dales S. Early events in cell- animal virus interactions // Bacteriol. Rev. 1973. 37. P. 103- 135.

146. Dales S., Choppin P.W. Attachment and penetration of influenza virus // J. Virology. 1962 Nov. 18. P. 489-493.

147. Transmission of experimental rhinovirus colds in volunteer married couples / D.J. D'Alessio et al. // J. Infect. Dis. 1976 Jan. 133(1). P. 28-36.

148. Kinetic profile of influenza virus infection in three rat strains / MJ. Daniels et al. // Comp. Med. 2003 Jun. 53(3). P. 293-298.

149. Day A.J., The C-type carbohydrate recognition domain (CRD) superfamily // Biochem. Soc. Trans. 1994. 22. P. 83-88.

150. Dennis D.T., Iglesby T.V., Henderson D.A. Tularemia as a Biological Weapon. Medical and public health management // JAMA. 2001. 285(21). P. 2763-2773.

151. Respiratory Syncytial virus infection of human mononuclear leukocytes in vitro and in vivo / F. Domurat et al. // J. Infect. Dis. 1985. 152(7). P. 895902.

152. Donald H.B., Isaacs A. Counts of influenza virus particles // J. Gen. Microbiol. 1954. 10. P. 457-464:

153. Dormans JA. The ultrastructure of various cell types in the lung of the rat: a survey // Exp. Pathol. 1983. 24(1). P. 15-33.

154. Dourmashkin R.R., Tyrrell D.A. Attachment of two myxoviruses to ciliated epithelial cells // J. Gen. Virol. 1970 Oct. 9(1). P. 77-88.

155. Avian influenza virus isolates from wild birds replicate and cause disease in a mouse model of infection / E.A. Driskell et al. // Virology. 2010. 399(2). P. 280-289.

156. Druett H.A. Bacterial invasion //Nature. 1952.170. P. 288.

157. Dubois M. F. Localization of the restrictive event of EMC virus replication in semi-permissive monkey and monkey-mouse hybrid cells // J: Gen. Virol. 1977. 37. P. 115-125.

158. Hazard characterisation of chemicals in food and diet: dose response, mechanisms and extrapolation issue / E. Dybing et al. // Food and Chemical Toxicology. 2002. 40. P. 283-326.

159. Distinct pathogenesis of Hong Kong -origin H5N1 viruses in mice compared to that of other highly pathogenic H5 avian influenza viruses / J.K. Dybing et al. // J. Virology. 2000 Feb. 74(3). P. 1443-1450.

160. Immunocytologic study of nasal epithelial cells in influenza / I. T. Ebisawa et al. // Am. Rev. Respir. Dis. 1969. 99. P. 507-515.

161. Human adenoid organ culture: a model to study the interaction of influenza A with human nasopharyngeal mucosa / K.M. Edwards et al. // Infect. Dis. 1986 Jan. 153(1). P. 41-47.

162. Normal surfactant pool sizes and ingibition-resistant surfactant from mice that overexpress surfactant protein A / B.M. Elhalwagi et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1999. 21. P. 380-387.

163. Expression of Adhesion Molecules on> Granulocytes and Monocytes from Patients with Asthma Stimulated in Vitro with Interleukin-8 and Monocyte Chemotactic Protein-1 / M. E. Els et al. // Inflammation. 1998; 22(2). P. 229-242.

164. Growth of influenza A virus in primary, differentiated epithelial cells derived from adenoids / Y. Endo et al. // J. Virology. 1996 Mar. 70(3). P. 2055-8.

165. Meta-analysis: anti-viral therapy of hepatitis C virus-related liver disease in renal transplant patients / F. Fabrizi et al. // Aliment. Pharmacol. Ther. 2006 Nov. 24(10). P.1413-22.

166. Fazekas De St. Groth, S. and P. A. P. Moran. Noninfective influenza virus // J. Hyg. 1955. 53. P. 291-296.

167. Filovirus-induced endothelial leakage triggered by infected monocytes/macrophages / H. Feldmann et al. // J. Virol. 1996. 70. P. 22082214.

168. Ebola virus: From discovery to vaccine / H. Feldmann et al. // Nat. Rev. Immunol. 2003. 3. P. 677-685.

169. Filoviridae / H. Feldmann et al. // Virus taxonomy, Vlllth report of the ICTV / editors C.M. Fauquet [et al.] London: Elsevier Academic Press, 2004. P. 645-653.

170. Fenner F. The pathogenesis of the acute exanthems; an interpretation based on experimental investigations with mousepox; infectious ectromelia of mice //Lancet. 1948. 11(2). P. 915-920.

171. Establishment and characterization of two new pig cell lines for use in virological diagnostic laboratories / M. Ferrari et al. // Virological Methods. 2003. 107. P. 205-212.

172. Fields B.N. Pathogenesis of viral Infections // Emerging Viruses /editor Morse S. New York: Oxford Unversity Press, 1993. P. 69-78.

173. Pathophysiology of shock and hemorrhage in fulminating viral infection (Ebola) / S.P. Fischer-Hoch et al.s// J. Infect. Dis. 1985. 152(5). P. 887-894.

174. Multiorgan distribution of human influenza A virus strains observed in a mouse model / T. Fislova et ah. //Arch. Virol. 2009. 154 (3). P. 409-419.

175. Characterisation of a novel influenza1 A virus hemagglutinin subtype (HI6) obtained from black-headed gulls / R.A.M. Fouchier et al. // J. Virology. 2005. 79(5). P. 2814-2822.

176. Fournier P-E., Marrie T.J., Raolt D. Diagnosis of Q Fever // J. Clin. Microbiol. 1998. 36(7). P. 1823-1834.

177. Franklin R.M., Breitcnfeld P.M., The abortive infection of L-cells by fowl plaque virus // J. Virology. 1959. 8. P. 293-307.

178. Freshney R.I. Culture animal cells. New York: Wiley Liss, 1994. 496 p.

179. Nasal cytokine and chemokine responses in experimental influenza A virus infection: results of a placebocontrolled trial of intravenous zanamivir treatmen // R.S. Fritz et al. // J. Infect. Dis. 1999.180. P.586-593.

180. Measles virus suppresses cell-mediated immunity by interfering with the survival and function of dendritic and T cells / I. Fugier-Vivier et al. // J. Exp. Med. 1997. 186. P. 813-823.

181. Virus clearance through apoptosis-dependent phagocytosis of influenza A virus-infected cells by macrophages /1. Fujimoto et al. // J. Virology. 2000. 74. P. 3399-3403.

182. Monoclonal antibodies specific to human ETS-2 oncoprotein: recognition of epitopes clustered on the B domain / S. Fujiwara et al. // Hybridoma. 1990. 9(6). P. 559-571.

183. H5N1 chicken influenza viruses display a high' binding affinity for Neu5Aca2-3Galhl-4(6-HS03)GlcNAc-containing receptors / A.S. -Gambaryan et al. // J(. Virology. 2004. 326: P: 310-316i

184. Association of Ebola related1 Reston* virus particles and antigen with tissue lesions of monkeys imported to the United States / T.W. Geisbert et al. // J. Comp. Pathol. 1992, 106. P. 137-152.

185. Apoptosis induced in vitro and in vivo during infection by Ebola and Marburg viruses / T.W. Geisbert et al. // Lab. Invest. 2000. 80. P. 171-186.

186. Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques: evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection / T.W. Geisbert et al. // Am. J. Pathol! 2003. 163(6). P. 2347-70.

187. Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in primate models: evidence that hemorrhage is not a direct effect of virus-induced cytolysis of endothelial'cells / T.W. Geisbert et al. // Am. J. Pathol. 2003. 163. P. 2371-2382.

188. Genzel Y., Fischer M., Reichl U. Serum-free influenza virus production avoiding washing steps and medium exchange in large-scale microcarrier culture // J. Vaccine. 2006 Apr. 24(16). P. 3261-3272.

189. Geonnotti A.R., Katz D.F. Dynamics of HIV Neutralization by a Microbicide Formulation Layer: Biophysical Fundamentals and Transport Theory // Biophysical Journal. 2006. 91. P. 2121-2130.

190. Avian influenza H6 viruses productively infect and cause illness in mice and ferrets / L. Gillim-Ross et al. // J. Virol. 2008. 82 (21). P. 10854-10863.

191. Gong J., Xu W., Zhang J. Structure and functions of influenza virus neuraminidase // Curr. Med. Chem. 2007. 14(1). P.l 13-122.

192. Goto H., Kawaoka Y. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus // J. Microbiology. 1998. 95(17). P. 10224-10228.

193. Folate Receptor Alpha and Caveolae Are Not Required for Ebola Virus Glycoprotein-Mediated Viral Infection / Graham Simmons et al. // J. of Virology. 2003. 77(24). P. 13433-13438.

194. Graham T.W., Sabelnikov A.G. How Much Is Enough: Real-Time Detection and Identification of Biological? Weapon Agents // Journal of Homeland Security and Emergency Management. 2004; 1(3). Article 303.

195. PLSECtin interacts with filovirus glycoproteins and the spike protein of SARS coronavirus / T. Gramberg et al. // Virology. 2005. 340(2). P. 224236.

196. Grass G.M. Simulation models to predict oral drug absorption from in vitro data //Advanced Drug Delivery Reviews. 1997. 23. P. 199-219.

197. Greenwood M., Yule U.G. The statistics of antityphoid and anti-cholera inoculations, and the interpretation of such statistics in general // Proc. R. Soc. Med. 1915. 8 (2). P. 113-194.

198. Avian Influenza (H5N1) Viruses Isolated from Humans in Asia in 2004 Exhibit Increased Virulence in Mammals / P. W. Greer et al. // J. Virology. 2005 Sept. 79(18). P. 11788-11800.

199. Griffiths W.D., DeCosemo G.A.L. The assessment of bioaerosols: A critical review//J. Aerosol. Sci. 1994. 25 (8). P. 1425-1458.

200. Measles virus infects human dendritic cells and blocks their allostimulatory properties for CD4 T Cells /1. Grosjean et al. // J. Exp. Med. 1997. 186. P. 801-812.

201. The antiviral activity of labile carbamyl compounds and cyanate against the pseudorabies virus in vivo / R.R. Grunert et al. //. J. Infectious Deseases. 1966. 116. P. 346-352.

202. H5N1 influenza: A protean pandemic threat / Y. Guan et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. 101(21). P. 8156-8161.

203. Guarner J, Falcon-Escobedo R. Comparison of the pathology caused by H1N1, H5N1, and H3N2 influenza viruses // Arch. Med. Res. 2009. 40(8). P. 655-661.

204. Guyton A.C. Measurement the respiratory volumes of laboratory animals // Am. J. Physiol. 1947. 150(1). P. 70-77.

205. Haller O., Arnheiter H., Lindenmann J. Genetically determined resistance to infection by hepatotropic influenza A virus in- mice: effect of immunosuppression//Infect. Immunol: 1976. 13. P. 844-854.

206. Direct and Indirect Effects in Vaccine Efficacy and Effectiveness / M.E. Halloran etal. // Am. J. Epidem. 199Г. 133(4). P. 323-331.

207. Halstead S.E., O'Ruorke E.J., Allison A.G. Denge viruses and mononuclear phagocytes. II. Identity of blood and* tissue leukocytes supporting in vitro infection // J. Exp. Med. 1977. 46(2). P. 218-229.

208. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination / E. Hammarland etal. // Nat Med 2003. 9 (9). P.l 131-1136.

209. Use of influenza С vims glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus pseudotypes / A. Hanika et al. // J. Gen. Virol: 2005 May. 86(Pt 5). P. 1455-65.

210. Hanon N., Simpson J., Eckert H.L. Assessment of Virus Infectivity by the Immunofluorescent and Immunoperoxidase Techniques // J. Clin. Micrbiol. 1975 Mar. 1(30). P. 324-329.

211. Harper G.J., Morton J.D. The respiratory retention of bacteriological aerosol: experiments with radioactive spores // J. Hyg. 1953. 51. P. 372-385.

212. Harrison R.G. Observations on the living developing nerve fiber // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1907. 4. P. 140-143.

213. Evidence for a protective role of pulmonary surfactant protein D (SP-D) against influenza A viruses / K.L. Hartshorn et al. // J. Clin. Invest. 1994. 94. P. 311-319.

214. Conglutinin acts as an opsonin for influenza A viruses / K.L. Hartshorn et al. // J. Immunol. 1993. 151. P. 6265-6273.

215. Lung and salivary scavenger receptor glycoprotein-340 contribute to the host defense against influenza A viruses / K.L. Hartshorn et al. // Am: J: Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2003. 285. P. L1066-L1076.

216. Mechanisms of anti-influenza activity of surfactant proteins A and D: comparison with serum collectins / K.L. Hartshorn et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1997. 273«. P. L1156-L1166.

217. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N 1 influenza A viruses / M. Hatta et al. // Science. 2001. 293(5536). P. 1840-1842.

218. Hatta M., Kawaoka Y. The continued pandemic threat posed by avian influenza viruses in Hong Kong // TRENDS in Microbiology. 2002. 10(7). P. 340-344.

219. Pulmonary Collectins Modulate Strain-Specific Influenza A Virus Infection and Host Responses / S. Hawgood et al. // J. Virology. 2004 Aug. 78(16). P. 8565-8572.

220. Local and systemic cytokine responses during experimental human influenza A virus infection. Relation to symptom formation and host defense / F.G. Hayden et al. // J. Clin. Investig. 1998. 101. P. 643-649.

221. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp Cell Res 1961. 25. P. 585-621.

222. Macrophages and Dendritic Cells Use Different Axl/Mertk/Tyro3 Receptors in Clearance of Apoptotic Cells / M. Heather et al. // The Journal of Immunology 2007. 178, 5635 -5642.

223. Biosinthesis and role of filoviral glicoproteins / Heinz Feldman et al. // J. of Gen. Virology 2001. 82. P. 2839-2848.

224. Smallpox» as a Biological Weapon. Medical ands public health management / D.A. Henderson et al. // JAMA. 1999. 281(22). P. 2127-2137.

225. Proinflammatory response during Ebola virus infection of primate models: possible involvement of the tumor, necrosis! factor receptor superfamily / L.E. Hensley et al. // Immunol. Lett. 2002. 80. P: 169-179.

226. Herbst-Kralovetz M.M., Pyles R.B. Quantification of Poly(I:C)-Mediated Protection against Genital Herpes Simplex Virus Type 2 Infection // Journal of virology. 2006. 80(20). P. 9988-9997.

227. Hers, J.F.P. Disturbances of the ciliated epithelium due to influenza virus // Am. Rev. Respir. Dis. 1966. 93. P. 162-171.

228. Hers J.F.P., Mulder J. Broad aspects of the pathology and pathogenesis of human influenza // Am. Rev. Respir. Dis. 1961 Feb. 83(2 Pt 2). P. 84-97.

229. The importance of an intact complement pathway in recovery from a primary viral infection: influenza in decomplemented and in C5-deficient mice / J.T. Hicks et al. // J. Immunol. 1978. 121. P. 1437-1445.

230. Genetic reassortment of influenza A viruses in the intestinal tract of ducks / V.S. Hinshaw et al. // Virology. 1980. 102(2). P. 412-419.

231. Infection of human dendritic cells by dengue viruses causes cell maturation and cytokine production / L.J. Ho et al. // J. Immunol. 2001. 166. P. 14991506.

232. Hofrnann W., Daschil F., Pohl E. Animal lung models for the inhalation of natural radioactive particles and their relevance to man // J. Aerosol. Sci. 1980. 11. P. 235-236.

233. Hoppe H.J., Reid K.B.M. Collectins soluble proteins containing collagenous regions and lectin, domains — and their roles in- innate immunity // J. Protein Sci. 1994.3. P. 1143-1158.

234. Horimoto T., Kawaoka Y. Influenza: Lessons from past pandemics, warnings from current incidents // Nature Reviews. Microbiology. 2005. 3(8). P. 591600.

235. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses // Clinical Microbiology Reviews. 2001. 14(1). P. 129-149.

236. Hsieh T.H., Yu C.P., Oberdorster G. A dosimetry model of Ni compounds in the rat lung // Inhalation Toxicol. 1999. 11. P. 229-248.

237. Huang R.T.C., Rott R., Klenk H.-D. Influenza viruses cause hemolysis and fusion of cells // J. Virology. 1981. 110. P. 243-247.

238. The function of the neuraminidase in membrane fusion induced by myxoviruses / R.T.C. Huang et al. // J. Virology. 1980. 107. P. 313-319.

239. Immunoexpression of Tyro 3 Family Receptors—Tyro 3, Axl, and Mer—and Their Ligand Gas6 in Postnatal Developing Mouse Testis. Huizhen Wang et al. // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 2005. 53(11). P. 13551364.

240. Distribution of viral antigen with the lower respiratory tract of ferrets infected with a virulent influenza virus: production and release of virus from corresponding organ cultures / R.H. Husseini et al. // Gen. Virol. 1983 Mar. 64(3). P. 589-598.

241. The relation of interferon and nonspecific ihibitors to virus levels in nasal washes of ferrets infected with influenza viruses of differing virulence / R.H. Husseini et al. // Br. J. Exp. Pathol. 1982. 62. P. 87-93.

242. Influenza Virus Receptor Specificity and Cell Tropism in Mouse and Human Airway Epithelial Cells / A. Imbricevic et al. // J. Virology. 2006 Aug. 80(15). P. 7469-7480.

243. Plague as a Biological Weapon. Medical and public health management / T.V. Iglesby et al. // JAMA. 2000. 283(17). P. 2281-2256.

244. Anthrax as a Biological Weapon, 2002. Updated recommendations for management. T.V. Iglesby et al. // JAMA 2002. 287 (17). P. 2236-2252.

245. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential / T. Ito et al. // Virology. 1998. 72(9). P. 7367-73.

246. Recognition of N-Glycolylneuraminic acid linked to galactose by the a2,3 linkage is associated with intestinal replication of influenza A virus in ducks / T. Ito et al. // J. Virology. 2000. 74(19). P. 9300-9305.

247. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses //Nat. Immunol. 2004. 5 (10). P. 987-995.

248. Jeffery P. K., Li D. Airway mucosa: secretory cells, mucus and mucin genes // Eur. Respir. J. 1997. 10. P. 1655-1662.

249. Johnson R.T. The pathogenesis of herpes virus encephalitis.II. A cellular basis for the development of resistance with age // J. Exp. Med. 1964. 120. P. 359379.

250. Johnson R.T. The pathogenesis of herpes vims encephalitis. II. A cellular basis for the development of resistance with age // J. Exp. Med. 1964. 120. P. 359-374.

251. Heparan Sulfate Proteoglycan Isoforms of the CD44 Hyaluronan Receptor Induced in Human Inflammatory Macrophages Can Function as Paracrine Regulators of Fibroblast Growth Factor Action / M. Jones et al. // J. of Biol.l Chem. 2000. 275: P. 7964-7974.

252. Kamps B;S., Reyes-Teran:G: Influenza 2006 // Inflüenza;report 2006V editors B.S. Kamps. C. Hoffman, W. Preiser. Paris, Cagliari, Wuppertal, Sevilla: Flying publisher, 2006. P. 17-47.

253. Karber G; Beitrag zur kollectiven Behandlung- pharmakologischer reihenversuche // Arch. Exp. Path. Pharmak. 1931. 162. P. 480-483.

254. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice / J.M. Katz et al. // Virology. 2000* 74(22). P. 10807-10810.

255. Defense against influenza A virus infection: essential role of the chemokine system / A. Kaufmann et al. // Immunobiology. 2001 Dec. 204(5). P.* 603613.

256. The heparan sulfate proteoglycan form of epithelial CD44v3 Serves as a CD lib/CD 18 " ;c6unter-receptor during polymorphonuclear leukocyte transepithelial migration / Ke Zen et al. // The Journal of Biological Chemistry. 2009. 284(6); P. 3768-3776.

257. Kedderis G.L. Extrapolation of in vitro enzyme induction data to humans in vivo // Chemico-BiologicaliInteractions. 1997. 107. P. 109-121.

258. Antigenic and genetic conservation'of H3 influenza in wild,ducks / H. Kida et ah.//Virology. 1987. 159(1). P. 109-119.

259. Host cellular proteases trigger the infectivity of the influenza virus in the airway and brain / H. Kido et ah. // Nippon Yakurigaku Zasshi. 2003 Jul. 122(1). P. 45-53.

260. Cellular proteinases trigger the infectivity of the influenza A and Sendai viruses / H. Kido et ah. // Mol. Cells. 1999. 9(3). P. 235-244.

261. Pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolyticactivation of Sendai- virus and influenza A virus / H. Kido et ah. // FEBS.» x i * < *1993 May. 322(20). P. 115-119.

262. Kikkava Y., Yoneda K. The type II epithelial cell of the lung. I. Method of isolation // Laboratory Investigation. 1974. 30 (1). P. 76-84.

263. Kilbourne E.D., Horsfall« F.L. Studies of herpes simplex virus in newborn mice // J. Immunol. 1951. 67. P. 321-329.

264. King R.J., Clements J.A., Surface active materials from dog lung. I. Method of isolation//Am. J. Physiol. 1972. 223. P. 707-714.

265. The differential susceptibilities to infection with influenza virus of fresh and maintained organ cultures of ferret urogenital; foetal and noenatal tissues / S.M. Kingsman et al. // FEMS Microbiology Letters. 1977 Nov. 2. P.* 251253.

266. Activation of influenza vims by tripsin treatment / H.D. Klenk et al. // J. Virology. 1975. 68. P. 426-439.

267. Klenk H.D., Garten W. Host cell proteases controlling vims pathogenicity // Trends Microbiol. 1994 Feb. 2(2). P. 39-43.

268. Koch A. L. Encounter efficiency of coliphage- bacterium interaction // Biochim. Biophys. Acta. 1960. 39. P. 311- 318.

269. Kohler G., Milstein C. Contineus cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity//Nature 1975. 256. P. 495-497.

270. Comlement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza vims infection / M. Kopf et al. // Nat. Med. 2002. 8. P. 373-378.

271. Koss L.G. Diagnostic cytology and its histopathologic bases. PhiladelphiaToronto: J.B.Lippincott Company, 1979. 1041 p.

272. Mature dendritic cells infected with herpes simplex vims type 1 exhibited inhibited T-cell stimulatory capacity / M. Kruse et al. // J. Virol. 2000. 74. P. 7127-7136.

273. Pathology of Human Influenza A (H5N1) Vims Infection in Cynomolgus Macaques (Macaca fascicularis) / T. Kuiken et al. // Vet. Pathol. 2003. 40. P. 304-310.

274. Kuchler R.J. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology. Stroudsburg, Pennsylvania: Dowden, Hutchingson & Ross Inc, 1977. 331 p.

275. Kumagai Y., Takeuchi O., Akira S. Pathogen recognition by innate receptors //J. Infect. Chemother. 2008. 14 (2). P. 86-92.

276. Absolute Risk or Relative Risk? A Study of Intraspecies and Interspecies Extrapolation of Chemical-Induced1 Cancer Risk / Jl Kuo et al. // Risk Analysis. 2002. 22(1). P. 141-157.

277. Kuroki Y., Akino T. Pulmonary surfactant protein A, (SP-A) specifically binds dipalmitoylphosphatidylcholine // J. Biol: Chem. 1991. 266. P: 3068-3073:

278. Kuroki Y., Voelker D:R. Pulmonary surfactant proteins // J. Biol. Chem. 1994. 269. P. 25943-25946.

279. Lamb R.A., Krug R.M: Orthomyxoviridae: The viruses and their replication // Field's virology. 4rd ed. / editors D.N. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. P. 1487-1531.

280. Kinetic analysis of synthetic analogues of linear-epitope peptides of glycoprotein D of herpes simplex virus type 1 by surface plasmon resonance / E. Lasonder et al. // Eur. J. Biochem. 1996. 240. P. 209-214.

281. Larski> Z. Diagnostyka wirusologiczna chorobzwierzat. Warszawa: Panst Wydaw Rol i Lesne, 1977. 400 p.

282. Lawson P.R., Reid K.B.M: The roles of surfactant proteins A and D in innate immunity//Immunol. Rev. 2000. 173. P. 66-78.

283. Lazarowitz S.G., Choppin P.W. Enhancement of the infectivity of influenza A-and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide // J. Virology. 1975. 68 (2). P. 440-454.

284. Lazarowitz S. G., Goldberg A. R., Choppin P. W. Proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide of influenza virus. Function of the uncleaved polypeptide HA // J. Virology. 1973. 52(1). P. 199-212.

285. Lazzari S, Stohr K. Avian influenza and influenza pandemics // Bull. World Health Organ. 2004. 82. P. 242.

286. Lennette E.H., Koprowski H. Influence of age on the susceptibility of mice to infection with certain neurotropic viruses // J. Immunol. 1944. 49. P. 175-191.

287. Surfactant Protein D Enhances Clearance of Influenza A Virus from the Lung In Vivo / A. M. LeVine et al. // J. Immunol. 2001. 167. P. 5868-5873.

288. Levitt N.H., Crowell R.L. Comparative studies of the regeneration of HeLa cell receptors for poliovirus T1 and coxsackievirus B3 // J. Virology. 1967 Aug. 1(4). P. 693-700.

289. Lin J.H. Application and limitations of interspecies scaling and in vitro extrapolation in pharmacokinetics // Drug metabolism and disposition. 1998. 26(12). P. 1202-1212.

290. Lindenmann J. Inheritance of resistance to influenza virus in mice // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1964. 116. P. 506-509.

291. Inborn resistance of mice to myxoviruses: macrophages express phenotype in vitro / J. Lindenmann et al. // J. Exp. Med. 1978. 147. P. 531-540.

292. Lindenmann J., Lane C.A., Hobson D. The resistance A2G mice to myxoviruses // J. Immunol. 1963. 90. P. 942-951.

293. Liprandi F., Walder R. Replication of virulent and attenuated strains of yellow fever virus in human monocytes and macrophage-like cells (U937) // Arch. Virol. 1983.76(1). P. 51-61.

294. The destruction of type 2 pneumocytes by airborne influenza PR8-A virus; its effect on surfactant and lecithin content of the pneumonic lesions of mice / C.G. Loosli et al. II Chest. 1975 Feb. 67 (2 Suppl 1). P. 7S-14S.

295. Differential expression of cell surface heparan sulfate proteoglycans in human mammary epithelial cells and lung fibroblasts / V. Lories et al. // The Journal of Biological Chemistry. 1992 January. 267. P. 1116-1122.

296. Lotze M., Thomson A. Dendritic cells. Biology and clinical applications. London: Academic Press, 2001. 794 p.

297. A Mouse Model for the Evaluation of Pathogenesis and Immunity to Influenza A (H5N1) Viruses Isolated from Humans / X. Lu et al. // Virology. 1999 July. 73(7). P. 5903-5911.

298. Maassab H.F. The propagation of multiple viruses in chick kidney cultures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1959 July. 45(7). P. 1035-1039.

299. Mahanty S., Bray M. Pathogenesis of filoviral haemorrhagic fevers // Lancet. Infect Dis 2004. 4. P. 487^198.

300. Mahy B.W.J. A Dictionary of Virology. San Diego, California: Academic Press, 1997. 422 p.

301. Mahy B.W.J., Hastie N.D., Armstrong S.J. Inhibition of influenza virus replication by a-amanitin : Mode of action // Natl. Acad. Sci. USA. 1972. 69. P. 1421-1424.

302. Inhibition of RANTES expression by indirubin in influenza / N. Mak et al. // Biochemical Pharmacology. 2004. 67. P. 167-174.

303. MakN.K., Leung K.N., Ada G.L. The generation of "cytotoxic" macrophages in mice diring infection with influenza A or Sendai virus // Scand. J. Immunol. 1982. 15. P. 553-561.

304. The isolation of structural genes from libraries of eukaryotic DNA / T. Maniatis et al. // Cell. 1978. 15. P. 687-701.

305. Marcus P.L Dynamics of surface modification in myxovirus-infected cells // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1962. 27. P. 351-65.

306. Tyro3 family-mediated cell entry of Ebola and Marburg viruses / Masayuki Shimojima et al. // J. of Virology. 2006. 80(20). P. 10109-10116.

307. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium / M.N. Matrosovich et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. 101(13). P. 4620-4.

308. Early alterations of the receptor-binding properties of HI, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals / M. Matrosovich et al. // Virology. 2000. 74(18). P. 8502- 8512.

309. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties / M. Matrosovich et al. // J. Virology. 1999. 73(2). P. 1146-1155.

310. Co-infection of primary human adenoid epithelial cells with Influenza A and Streptococcus pneumonia / P.A. McGraw et al. // International Congress Series 1263. 2004. P. 476-480.

311. McKimm-Breschkin J.L. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors: a review // Antiviral Res. 2000. 47(1). P. 1-17.

312. Modeling potential responses to smallpox as a bioterrorist weapon / M.I. Meltzer et al. // Emerg. Infect. Dis. 2001. 7(6). P. 959-969.

313. Cell number and distridution in human and rat airways / R.R. Mercer et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1994. 10(6). P. 613-624.

314. Mims C.A. Aspects of pathogenesis of virus diseases // Bacterid. Rev. 1964. 28. P. 30-71.

315. Mogensen S.C. Genetics of macrophage-controlled resistance to hepatitis induced by herpes simplex vims type 2 in mice // Infect. Immun. 1977. 17. P. 268-273.

316. Mogensen S. C. Role of Macrophages in Natural Resistance to Vims Infections // Microbiological reviews. 1979 Mar. 43(1). P. 1-26.

317. Mogensen S.C. Genetic aspects of macrophages involvement in natural resistance to vims infections // Immunol. Letters. 1985. 11(3). P. 219-224.

318. Activation of triggering receptor expressed on myeloid, cells-1 on human neutrophils by Marburg and Ebola vimses / M. Mohamadzadeh et al. // J. Virol. 2006a. 80. P. 7235-7244.

319. Filovimses and the balance of innate, adaptive and inflammature responses. M. Mohamadzadeh et al. // Virol. Immunol. 2006. 19. P. 602-612.

320. Mathematical model of influenza A vims production in large-scale microcarrier culture /L. Mohler et al. // J. Biotechnol. Bioeng. 2005 Apr. 90(1). P. 46-58.

321. Monteiro J.M., Harvey C., Trinchieri G. Role of interleukin-12 in primary influenza virus infection // J. Immunol. 1998. 72. P.4825-4831.

322. Morgan C., Rose H. M. Structure and development of vimses as observed in the electron microscope. VIII. Entry of influenza vims // J. Virol. 1968. 2. P. 925- 936.

323. Morse S.S. Emerging Viruses. N.Y., Oxford: Oxford University Press, 1993. 317 p.

324. Mini-plasmin-found in the epithelial cells of bronchioles triggers infection by broad-spectrum iinfluenzatA viruses and Sendai virus / M. Murakami et al. // Eur. J: Biochem: 2001'May. 268(10). P. 2847-2855.

325. Identification of an amino acid residue on influenzae virus Ml protein responsible for formation of the cord-like structures of the virus / Y. Muraki et al. // J. Gen. Virol. 2004. 85. P. 1885-1893.

326. Murata Y., Kuroki Y., Akino T. Role of the C-terminal domain of pulmonary surfactant protein A in binding to alveolar type II cells and regulation of phospholipid secretion // Biochem. J. 1993. 291. P. 71-76.

327. Ebola and Marburg virus morphology and taxonomy / F.A. Murphy et al. // Ebola virus haemorrhagic fever / editor S.R. Pattyn. North Holland, Amsterdam, New York: Elsevier, 1978. P. 61-84.

328. Murphy B.R., Webster R.G. Orthomyxoviruses // Virology. 3rd ed. / editors B.N. Field et al. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1996. P. 13971445.

329. Naeve C.W., Hinshaw V.S., Webster R.G. Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza vims // J. Virology. 1984. 51(2). P. 567-569.

330. Isolation of hemorrhagic fever with renal syndrome vims from leukocytes of rats and vims replication in cultures of rat and human macrophages / T. Nagai et al. // J. Gen. Virol. 1985. 66(8). P. 1271-1278.

331. Nakagawa Y., Oda K., Nakada S. The PB1 subunit alone can catalyze cRNA synthesis, and the PA subunit in addition to the PB1 subunit is required for viral RNA synthesis in replication of the influenza vims genome // J. Virol. 1996. 70. P. 6390-6394.

332. Nakagima S., Sigiura A. Neupovimlence of influenze vims in mice. II. Mechanism of vimlence as studied in a neuroplastoma cell line // Virology. 1980. 101. P. 450-457.

333. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. Assembly and budding of influenza,virus // Virus Res. 2004 Dec. 106(2). P. 147-65.

334. Influenza virus morphogenesis and budding / D.P. Nayak et all. // Virus Research. 20091 143. P. 147-161.

335. Evolving complexities of influenza virus and its receptors / J.M. Nicholls et al. // Trends Microbiol. 2008. 16. P. 149-157.

336. Properties of Influenza C Virus Grown in Cell Culture / R.J. O'Callaghan et al. // Journal of Virilogy. 1977. 24 (3). P. 875-882.377.0'Toole T., Smallpox: An Attack Scenario // Emerging Infectious Diseases. 1999. 5(4). P. 540-546.

337. Ogasawara Y., Kuroki Y., Akino T. Pulmonary surfactant protein D specifically binds to phosphatidylinositol // J. Biol. Chem. 1992. 267. P. 21244-21249.

338. Ogston A. G. On uncertainties inherent in the determination of the efficiency of collision between virus particles and cells // Biochim. Biophys. Acta. 1963. 66. P. 279- 281.

339. The cotton rat provides a useful small-animal model for the study of influenza virus pathogenesis / M.G. Ottolini Blanco et al. // J. General Virology. 2005. 86. P. 2823-2830.

340. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase / P. Palese et al. // J. Virology. 1974 Oct. 61(2). P. 397-410.

341. Parker R.F., Rivers T.M. Immunological and chemical investigations of vaccine virus // J. Exp. Med. 1936. 64. P. 439-452.

342. Paulson, J.C. Interaction of animal viruses with cell surface receptors // Receptors / editor M. Corn. Orlando: Academic Press, 1985. P. 131-219.

343. Perdue M.L., Swayne D.E. Public health risk from avian influenza viruses // Avian Diseases. 2005; 49. P. 317-327.

344. Peto S.A. Dose-response Equation for the Invasion of Microorganism: // Biometrics. 1953. 9(9). P. 320-335.

345. Morphologic lung changes in the lifespan of Fisher 344 rats / K. Pinkerton Am: J. Anat. 1982. 164. P. 155-174.

346. A functionally defined model for the M2 proton channel of influenza A virus suggests a mechanism for its ion selectivity / L.H. Pinto et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.94 (21). P. 11301-11306.

347. Pison U., Wright J.R., Hawgood S. Specific binding of surfactant protein SPA to rat alveolar macrophages // Am. J. Physiol. 1992. 262. P. L412-L417.393; Pollard, E. C. The physics of viruses. New York, N.Y.: Academic Press, 1953. 103-121.

348. A novel mechanism for LSECtin binding to Ebola virus surface glycoprotein through truncated glycans / A.S. Powlesland et al. //J. Biol: Chem. 2008 Jan 4. 283(1). P. 593-602.

349. Prather S.O:, Taylor M.W. Host-dependent restricton of mengovirus replication. III. Effect of hos restriction on late viral RNA synthesis and viral maturation // J: Virology. 1975. 15. P. 872-881.

350. Regional deposition of inhaled monodisperse coarse, and' fine mode particles in small laboratory animals // OiG: Raabe et al . Annals of Occup: Hygiene. 1988. 32(1). P. 53-63.

351. Deposition of inhaled monodisperse; particles in small rodents / 0:G. Raabe et?al:.!//hihaled;Particles; 4?/editor W.Hi Walton: Oxford: Pergamon Press, 1977. P. 3-21.

352. Randhawa A.K., Hawn T.R. Toll-like receptors: their roles in bacterial recognition and respiratory infections // Expert Rev. of Anti Infect. Ther. 2008. 6(4). P. 479-95.

353. Collectin-mediated antiviral host defense of the lung: evidence from influenza virus infection of mice / P.G. Reading et al. // J: Virology. 1997. 71(11). P. 8204-8212.

354. Reed L.J., Muench H. A simple method for estimating 50% endpoints // Am. J. Hyg. 1932. 27. P. 493-497.

355. Replication of Hemorrhagic Fever Viruses in Monocytic Cells / Richard M. Lewis et al. II Reviews of Infectious Diseases. 1989: 11 (S4). P. S736-S742.

356. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model / G.F. Rimmelzwaan et al. // J. Virology. 2001. 75. P. 6687-6691.

357. Riser BL, Maassab HF. Differential interaction of virulent and attenuated influenza virus strains with ferret alveolar macrophages: possible role in pathogenicity II J. Infect. Dis. 1990 Apr. 161(4). P. 699-705.

358. Ritchey M. B., Palese P., Kilbourne E. D. RNA, s of influenza A, B and C viruses // J: Virology. 1976. 18. P. 738 744.1. V \

359. Structural changes in the haemagglutinin which accompany egg adaptation of an influenza A (H1N1) virus / J.S. Robertson et al. // J. Virology. 1987. 160(1). P: 31-37.

360. Rogers G.N., D'Souza B.L. Receptor binding properties of human and animal HI influenza virus isolates // J. Virology. 1989. 173(1). P. 317-322.

361. Characterization of a novel influenza hemagglutinin, HI5: criteria for determination of influenza A subtypes / C. Rohm et al. //J. Virology. 1996. 217(2). P. 508-516.

362. Early Stages of Influenza Virus Entry into Mv-1 Lung Cells: Involvement of Dynamin / A.M. Roy et al. // Virology. 2000. 267. P. 17-28.

363. Ruchman I. Virulence of strains of herpes simplex virus for mice // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. 86. P. 649-652.

364. Ryabchikova E., Kolesnikova L., Sergeev A. Specific features of filovirus infection in respiratory challenged experimental animals // The ASA newsletter. 1996. 4. P. 10-13.

365. Ebola virus infection in guinea pigs: presumable role of granulomatous inflammation in pathogenesis / E. Ryabchikova et al. // Arch. Virol. 1996. 141(5). P. 909-922.

366. Respiratory Marburg virus infection in guinea pigs / E. Ryabchikova et al. // Arch. Virol. 1996. 141(11). P. 2177-2190.

367. Ryabchikova E.I., Price, B. B. S. Ebola and Marburg viruses: a view of infection using electron microscopy. Columbus, Ohio.: Battelle Press, 2004. 21 lp.

368. Ryabchikova E. I., Kolesnikova L. V., Luchko S. V. An analysis of features of pathogenesis in-two animal models of Ebola virus infection // J. Infect. Dis. 1999. 179 (SI). P. 199-202.

369. Sabelnikov A, Zhukov V, Kempf R. Airborne exposure limits for chemical and biological warfare agents: is everything set and clear? // Int. J. Environ Health Res. 2006 Aug. 16(4). P. 241-253.

370. Variations in disperse composition of dry powders according to energy of their dispersion / A.S. Safatov et al. // Powder Technology. 1998. 97. P. 227-232.

371. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659-p.

372. Sano H., Kuroki Y. The lung collectins, SP-A and SP-D, modulate pulmonary innate immunity // Molecular Immunology. 2005. 42. P. 279-287.

373. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses / A. Sanchez'et al. Fields virology. 4th edition. / editors D.M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins Company, 2001. P. 1279-1304.

374. Schagat T.L., Wofford J.A., Wright J. R. Surfactant Protein A Enhances Alveolar Macrophage Phagocytosis of Apoptotic Neutrophils // J. Immunol. 2001. 166. P. 2727-2733.

375. Antiviral Activity of 5-Ethyl-2'-Deoxyuridine against Herpes Simplex Viruses in Cell Culture, Mice, and Guinea Pigs / R. Schinazi et al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1985. 28(4). P. 552-560.

376. Selgrade M.K., Osborn J.E. Role of macrophages in resistance to murine cytomegalovirus//Infect Imrnun. 1974. 10. P. 1383-1390.

377. Seo S.H., Hoffmann E., Webster R.G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses //Nat. Med. 2001. 8. P. 950-954.

378. Sergeev A.N., Lub M.Yu., Kotlyarov L.A., Pyankov O.V., Vorontsova L.A. Some aspects of Marburg virus Pathogenesis in guinea pigs infected through respiratory tract. J .Aerosol Medicine 1995. 8(1). P. 76.

379. In Vivo Antiviral Properties of Biologically Active Compounds II. Studies with Influenza and Vaccinia Viruses / R.W. Sidwell et al. // Applied Microbiology 1968. 16(2). P. 370-392.

380. In Vitro and In Vivo Phlebovirus Inhibition by Ribavirin / R.W. Sidwell et al. //Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 1988. 32(3). P. 331-336.

381. Sidwell R. W., Smee D. F. Experimental disease models of influenza virus infections: recent developments // Infect. Dis. 2004. 1(1). P. 57-63.

382. Siegert R., Shu H., Slenczka W. Zurdiagnostik und pathogenese der infection mit Marburg-virus //Dtsc. Arzebl. 1968. 65. P. S. 1827-1830.

383. DC-SIGN and DC-SIGNR bind ebola glycoproteins and enhance infection of macrophages and endothelial cells / G. Simmons et al. // Virology. 2003. 305. P. 115-23.

384. Pandemic influenza and mortality: past evidence and projections for the future / L. Simonsen et al. // The Threat of Pandemic influenza. Are We Ready? / editors S.L. Knobler [et al.] Washington: The National Academies Press, 2004. P. 89-114.

385. Sims D.E., Home M.M. Heterogeneity of the composition and thickness of tracheal mucus in rats // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1997 Nov. 273. P. L1036-L1041.

386. Shelkov A., Vogel J.E., Chi 1. Hemadsorbtion (adsorbtion-hemagglutination) test for viral agents in tissue culture with spetial reference to influenza // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958. 97. P. 802-809.

387. Shortley G., Wilkins J.R. Independent-Action and Birth-Death Models in Experimental Microbiology // Bacteriol. Reviews. 1965 Mar. 29(1). P. 102141.

388. Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor binding and5membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin // Annu. Rev. Biochem. 2000. 69. P. 531-69.

389. Changes ins the conformation of influenza virus hemagglutinin^ at the pH optimun of vurus- mediated membrane fusion^/ J.J. Skehel et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. 79. P. 968-972.

390. Infection of Human Airway Epithelia with H1N1, H2N2, and H3N2 Influenza AVirus Strains / V.A. Slepushkin et al. // Mol. Therapy. 2001 Mar. 3(3). P. 395-402.

391. Slouka V. Interspecies radiotoxicological correlations and extrapolation ofaanimal data to man // Strahlentherapie. 1969 Aug. 138(2). P.213-217.

392. Snipes M.B., Olson T.R., Yeh H.C. Deposition and retention patterns for 3-, 9-, and 15 pm latex microspheres inhaled by rats and guinea pigs // Experimental Lung Research. 1988. 14. P. 37-50.

393. Spearman C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae // Br. J. Psychol. 1908. 2. P. 227-242.

394. Spicer S.S., Schulte B.A., Thomopoulos G.N. Histochemical properties of the respiratory tract epithelium in different species // Am. Rev. Respir. Dis. 1983 Aug. 128(2 Pt 2). P. S20-6.

395. Steinhauer D.A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus // J. Virology. 1999. 258(1). P. 1-20.

396. Natural killer cells in mouse lung: surface phenotype, target preference and response to local influenza virus infection / J. Stein-Streinlein et al. // J. Immunol. 1983. 131. P. 3699-3704.

397. Epithelial and surfactant changes in influenzal pulmonary lesions / S.F. Stinson et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1976 Mar. 100(3). P. 147-53.

398. Stone K.C., Mercer R.R., Freeman B.A. Chang L.Y., Crapo J.D. Distribution of lung cell numbers and volumes between alveolar and nonalveolar tissue. Am Rev Respir Dis 1992. 146(2). P. 454-456.

399. Recombinant viral sialate-O-acetylesterases / P. Strasser et al. // Glycoconj. J. 2004. 20(9). P. 551-61.

400. Different expression of integrins by mononuclear phagocytes in peripheral blood and bronchoalveolar lavage fluid / I. Striz et al. // Respiratory medicine. 1998. 92(12). P. 1326-1330.

401. Infection and activation of monocytes by Marburg and Ebola viruses / U. Stroher et al. // J. Virol. 2001, 75. P.l 1025-11033.

402. Suarez D., Schultz-Cherry S. Immunology of avian influenza virus: a review // Developmental and Comparative Immunology. 2000. 24(2-3). P. 269-283.

403. Sugiura A., Ueda M. Neurovirulence of influenza virus in mice. I. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains // J. Virology. 1980. 101. P. 440- 449.

404. Suzuki Y., Fujita Y., Kogishi K. Reconstitution of tubular myelin from synthetic lipids and proteins associated with pig pulmonary surfactant // Am. Rev. Respir. Dis. 1989. 140. P. 75-81.

405. Single-amino-acid substitution in an antigenic site of influenza virus hemagglutinin can alter the specificity of binding to cell membrane-associated gangliosides / Y. Suzuki et al. // J. Virology. 1989. 63(10). P. 4298^1302.

406. Further studies of the reasons for the lack of alveolar infection during influenza in ferrets / C. Sweet et al. // Br. J. Exp. Pathol. 1985 Apr. 66(2). P. 217-31.

407. Yields of a virulent and an attenuated clone of influenza virus from organ cultures of ferret nasal tissue: Divergence with time of incubation / C. Sweet et al. // FEMS Microbiology Letters. 1978 Oct. 4. P. 191-194.

408. Downregulation of betal integrins by Ebola virus glycoprotein: implication for virus entry / A. Takada et al. // Virology. 2000. 278(1). P. 20-26.s

409. Task Group on Lung Dynamics. Health Phys. 1966. 12. 173 p.

410. Tateno I., Kitamoto O., Kawamura A. Jr. Diverse immunocytologic findings of nasal smears in influenza // N. Engl. J: Med! 1966. 274. P. 237-242.

411. Technical Guide 275. Personal Protective Equipment Guide for Military Medical Treatment Facility Personnel Handling Casualties from Weapons of Mass Destruction and Terrorism Events. USACHPPM. 2003 August. 119 p.

412. Theis G., Koprowski H. A cellular basis for vims resistence // Fed. Proc. 1961.20. 265 p.

413. Interactions of LSECtin and DC-SIGN/DC-SIGNR with viral ligands: Differential pH dependence, internalization and virion binding / Thomas Gramberg et al.// Virology. 2008. 373(1). P. 189-201.

414. The new aerodynamic particle analyzer / V. Toporkov et al. // J. Aerosol. Sci. 1993. 24(S1). P. S85-S86.

415. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors // Annu. Rev. Biochem. 1983. 52. P. 655-709.

416. Turner M.W. The role of mannose-binding lectin in health and disease // Mol. Immunol. 2003. 40. P. 423-429.

417. Tyrell D. Assesment of vaccine efficacy by challenge studies in man // Postgrad. Med. J. 1976. 52. P. 379-380.

418. USAMRIID's medical management of biological casualties handbook. 6th edition // сайт US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. URL:http://www.usamriid.anriy.mil/education/bluebookpdf/USAMRIID%20BlueBV

419. Infection and Activation of Monocytes by Marburg and Ebola Viruses. Ute Stroher et al. //1 Virol. 2001 November. 75(22). P. 11025-11033.

420. Valcarcel J., Portela A., Ortin J. Regulated Ml mRNA splicing in influenza virus-infected cells // J. Gen. Virol. 1991. 72. P. 1301-1308.

421. Valentine R.C., Allison A.C. Virus- particle adsorption. I. Theory of adsorption and experiments on the attachment of particles to nonbiological surfaces // Biochim. Biophys. Acta. 1959. 34. P. 10-23.

422. Animal models in influenza vaccine testing / J.W. Van der Laan et al. // Expert. Rev. 2008. 7. P. 783-793.

423. Binding of surfactant protein A to the lipid A moiety of bacterial lipopolysaccharides. J.F. van Iwaarden et al. // Biochem. J. 1994. 303. P. 407^411.478. van Reeth K. Cytokines in the pathogenesis of influenza / Vet. Microbiol. 2000. 74. P. 109-116.

424. Quantitative Expression of Toll-Like Receptor 1-10 mRNA in Cellular Subsets of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and Sensitivity to CpG Oligodeoxynucleotides / Veit Hornung et al. // The Journal of Immunology. 2002. 168. P. 4531-4537.

425. Verilizer J.-L., Allison A.C. Correlation of persistent mouse hepatitis vims (MHV-3) infection with its effect on mouse macrophage cultures // Arch. Virol. 1976. 50. P. 279-285.

426. Quantitative risk analysis of particulate matter in the air: interspecies extrapolation► with bioassay and mathematical models / M. Wakae et al. // Inhal. Toxicology. 2006 December. 18(13). P. 1013-1023.

427. Human rotavims studies in volunteers: determination of infectious dose and serological response to infection / R.L. Ward et al. // J. Infect. Dis. 1986 Nov. 154(5). P. 871-880.

428. Watanabe К., Bois F.Y., Zeise L. Interspecies Extrapolation: A Reexamination of Acute Toxicity Data // Risk Analysis. 1992. 12(2). P. 301310.

429. Watanabe K.H. and Bois F.Y. Interspecies Extrapolation of Physiological Pharmacokinetic Parameter Distributions // Risk Analysis. 1996. 16(6). P. 741-54.

430. Waterson A.P., Wilkinson L. An introduction to the history of virology. London: Cambridge University Press, 1978. 237 p.

431. Watson D.H., Russel W.C.,Wildy P. Electron microscopic particle counts on herpes vims using phosphotungstate staining technique. Virology 1963. 19. P. 250-260.

432. Evolution and ecology of influenza A vimses / R.G. Webster et al. // Microbiol. Rev. 1992. 56(1). P. 152-179.

433. Molecular mechanisms of variation in influenza vimses / R.G. Webster et al. //Nature. 1982. 296(5853). P. 115-121.

434. Weller N.K., Karnovsky M.J. Isolation of pulmonary alveolar type I cells from adult rats // Am. J. Pathol. 1986. 124. P. 448-456.

435. Host defense mechanisms against influenza vims: interaction of influenza vims with murine macrophages in-vitro. M.A. Wells et al. // Infect. Immun. 1978 Dec. 22(3). P. 758-62.

436. Welsh R.M. Natural cell-mediated immunity during viral infections // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1981. 92. P. 83-103.

437. An airborne outbreak of smallpox in a German hospital and its significance with respect to other recent outbreaks in Europe / P.F. Wehrle // Bull. World Health Organ. 1970. 43(5). P. 669-679.

438. Increased metalloproteinase activity, oxidant production, and emphysema in surfactant protein D gene-inactivated mice / S.E. Wert et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97. P. 5972-5977.

439. WHO Checklist for influenza pandemic preparedness planning // сайт World Health Organization. URL:http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/FluCheck6web.pdf (дата обращения: 01.04.2010).

440. Wright J.R. Immunomodulatory Functions of Surfactant // Physiologycal Reviews. 1997 Oct. 77(4). P. 931-962.

441. Wright J.R. Host defense functions of pulmonary surfactant / Biol. Neonate. 2004 Jun. 85(4). P.326-32.

442. Wright P.F., Webster R.G. Orthomyxoviruses // Field's virology. 4rd ed. / editors D:N. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. P. 1533-1579.

443. Interactions of viruses with respiratory epithelial cells / P.F. Wright et al. // Seminars in Virology. 1996. 7. P. 227-235.

444. Wright J.R., Borchelt J.D., Hawgood S. Lung surfactant apoprotein SP-A (2636 kDa) binds with high affinity to isolated alveolar type II cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. 86. P. 5410- 5414.

445. Surfactant apoprotein Mr = 26,000-36,000 enhances uptake of liposomes by type II cells / J.R. Wright et al. // J. Biol. Chem. 1987. 262. P. 2888-2894.

446. Wyde P.R., Wilson M.R., Cate T.R. Interferon production by leucocyts infiltrating the lungs of mice during primary influenza virus infection //Infect. Immun. 1982. 38. P. 1249-1255.

447. Yamamoto N., Urade M. Pathogenic significance of a-N-acetylgalactosaminidase activity found in the hemagglutinin of influenza vims // Microbes Infect. 2005 Apr. 7(4). P.674-81.

448. Yilma Т., Zee Y.C., Osebold J.W. Immunofluorescence determination of the pathogenesis of infection with influenza virus in mice following exposure to aerosolized virus // J. Infect. Dis. 1979 Apr. 139(4). P. 458-64.

449. Efficacy of thymosin alpha-1 and interferon alpha in treatment of chronic viral hepatitis B: a randomized controlled study / J. You et al. // World J. Gastroenterol. 2006 Nov. 12(41). P. 6715-6721.v \

450. Young J.F., Palese P. Evolution of human influenza A viruses in nature: Recombination contributes to genetic variation of H1N1 strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. 76(12). P. 6547-6551.

451. Deposition modelling of refractory ceramic fibers in the rat lung / C.P. Yu et al. // Aerosol. Sci. 1994. 25. P. 407-417.

452. Infection of Ciliated Cells by Human Parainfluenza Virus Type 3 in an In Vitro Model of Human Airway Epithelium / L. Zhang et al. // Virology. 2005 Jan. 79(2). P. 1113-1124.

453. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytotoxicity / L. Zhang et al. // Virology. 2002 Jun. 76(11). P. 5654-5666.

454. Zhang L., Yu C.P. Empirical equations for nasal deposition of inhaled particles in small laboratory animals and humans // Aerosol. Sci. Technol. 1993. 19. P. 51-56.

455. Zhirnov O.P., Ikizler M.R., Wright P.F. Cleavage of influenza a virus hemagglutinin in human respiratory epithelium is cell associated and sensitive to exogenous antiproteases // J. Virology. 2002 Sep. 76(17). P. 8682-8689.

456. Pathogenesis of Avian Influenza A (H5N1) Viruses in Ferrets / L.A. Zitzow et al. // Virology. 2002 May. 76(9). P. 4420^1429.1. БЛАГОДАРНОСТИ!

457. Автор выражает искреннюю благодарность коллегам из ГНЦ ВБ «Вектор», ММА им. Сеченова (*) и НИИ« физиологии СО'РАМН'С**):

458. Котлярову JI.A., Греховой Г.П., Евтину Н.К. и Колесниковой Н.Г. за техническое обеспечение выполнения исследований;

459. Ставскому Е.А., Бондаренко В.Н., Криницину JT.A. и Иванову П.Ф. за помощь в организации экспериментальных исследований с вирусом гриппа и животными;

460. Мартынюк P.A., Фомичевой И.В. и Прытковой О.В. за содействие в координации исследований со смежными подразделениями и* зарубежным партнером;

461. Лобановой Т.П., Николаевой А.И. и Речкиной О.Л. за помощь при работе с литературными источниками;

462. Юркину А.Ю. и Оробею Д.В. за доставку животных из питомника г. Пущино;отдельную благодарность:

463. Fenner F., Druett Н. и Peto S. за теоретические результаты, которые были положены в основание данного исследования;

464. Зайцеву С.А., Игнатову М.С., Наумочкину А.Н., Офицерову В.И., Скрипченко A.A., Сучкову С.И., Теличкину В.П., Терещенко А.Ю.,

465. ЗАО «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирская обл.) за помощь и содействие при оформлении диссертационной работы;

Информация о работе

Жуков, Владимир Александрович
доктора биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и ее использование для выбора противовирусных препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы