Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivo

Сергеев, Артемий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivo
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivo"

На правах рукописи

Сергеев Артемий Александрович

ИЗУЧЕНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА В ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РЕСПИРАТОРНЫХ ОРГАНОВ ДЛЯ ПРОГНОЗА ЕГО ИНФЕКЦИОННОСТИ IN VIVO

OS 00 Об - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

003168139

Кольцове - 2008

003168139

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научные руководители

кандидат биологических наук Шишкина Лариса Николаевна кандидат технических наук Жуков Владимир Александрович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна кандидат биологических наук Булычев Леонид Егорович

Ведущая организация

ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России - ВЦ», г Сергиев Посад , Московская область

Защита состоится » 2008 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208 020 01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559, тел (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автореферат разослан « » СЬ/фб/^е 2008 ]

Ученый секретарь диссертационного совета

Карпенко Л И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Вирус гриппа является самым известным и распространенным среди вирусов, вызывающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей Грипп представляет собой острое респираторное заболевание, часто с тяжелым течением Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 млн случаев тяжелых заболеваний и к 300-500 тыс случаев со смертельным исходом [CDC, 2005] Эпидемии гриппа по масштабам распространения заболевания среди населения представляют меньшую угрозу по сравнению с пандемиями, которые охватывают целые континенты, и приводят к огромной смертности среди заболевших [Kamps and Reyes-Teran, 2006] Продолжающиеся вспышки гриппа H5N1 среди птиц со случаями передачи людям вызывают беспокойство у ученых во всем мире [Kamps and Reyes-Teran, 2006] Многие эксперты считают, что именно вирус гриппа птиц H5N1 может породить новый паядемичный штамм [Webster et al, 1992, Guan et al, 2004, WHO, 2005, Perdue and Swayne, 2005]

Умение количественно оценивать восприимчивость человека и животных к новым штаммам вируса гриппа, а также прогнозировать степень защиты организма человека и животных противовирусными препаратами, повысит как вероятность раннего выявления пандемичного штамма, так и вероятность выбора наиболее эффективных средств борьбы с гриппом в случае возникновения пандемии

Для оценки восприимчивости организма к вирусу широко используют показатели степени его патогенности, например, 50%-ю летальную дозу (ЛД50) или инфекционности, например, 50%-ю инфицирующую дозу (ИД50) [Чермашенцев В M и др, 1993, Ludwig et al, 1999, Guo et al, 2000]

Кроме генетических штаммовых особенностей вируса гриппа А восприимчивость организма к нему определяется как специфическими клеточными рецепторами, в состав которых входит сиаловая кислота, так и внеклеточными факторами, ингибирующими (сурфактант) или, напротив, потенцирующими (протеиназы) проникновение вируса в клетки-мишени органов дыхания [Kido et al 1999, Ito et al, 2000, Matrosovich et al, 2000, Tamura and Kurata, 2004]

для вируса гриппа кроме алгоритма расчетов включает также методики получения первичных клеток и определения параметров вирус-клеточного взаимодействия, которые должны учитывать особенности патогенеза инфекции В связи с этим в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования

Цель исследования. Разработать экспериментально-теоретическую систему прогнозирования восприимчивости организма к вирусу гриппа (in vivo) на основе восприимчивости к вирусу гриппа его клеток-мишеней (in vitro) и оценить возможность ее применения при сравнении прогнозируемых и экспериментально полученных инфицирующих доз вируса гриппа для лабораторных животных

Задачи исследования:

1 Разработать методы получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток легких и трахеи лабораторных животных

2 Разработать методы оценки параметров инфекционное™ вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи лабораторных животных (мышей и крыс)

3 Провести сравнительный анализ показателей инфекционности вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных т vivo и для восприимчивых клеток легких и трахеи т vitro

4 Оценить возможный вклад внеклеточных защитных (барьерных) факторов выстилки респираторных органов лабораторных животных в формирование их восприимчивости к вирусу гриппа.

5 Сделать прогноз ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных и проверить адекватность разработанной системы прогнозирования путем сравнения прогнозированных и экспериментально определенных величин ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных

Научная новизна работы Впервые разработана лабораторная технология получения и культивирования первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи, сохраняющих жизнеспособность и способных продуцировать вирус гриппа в течение трех суток Впервые разработаны оригинальные процедуры определения показателей восприимчивости к вирусу гриппа для первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи (50% инфицирующей дозы и средней урожайности вируса гриппа в инфицированной клетке)

Впервые показано, что восприимчивость первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи мышей CD-I и крыс Wistar при инфицировании вирусом гриппа т vitro одинакова, но ниже, чем у мышей ICR

Впервые проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток у мышей CD-I и крыс Wistar при инфицировании вирусом гриппа т vitro Показано, что восприимчивость и вирус-продуцирующая способность реснитчатых клеток при их инфицировании вирусом гриппа m vitro значительно выше, чем восприимчивость и вирус-продуцирующая способность апьвеолоцитов 1-го и 2-го типов

Впервые показано, что при инфицировании вирусом гриппа т vivo (1) восприимчивость легких у мышей CD-I выше, чем у крыс Wistar, но ниже, чем у мышей ICR, (2) восприимчивость трахеи у мышей CD-I и крыс Wistar одинакова, но ниже, чем у мышей ICR, (3) у мышей CD-I и ICR восприимчивость легких и трахеи одинакова, тогда как у крыс Wistar восприимчивость трахеи достоверно выше, чем восприимчивость легких

Впервые установлено, что прямое вируснейтрализующее действие секреторных факторов бронхоальвеолярной эпителиальной выстилки может быть одной из причин существенного снижения вероятности инфицирования вирусом гриппа клеток-мишеней и, следовательно, восприимчивости легких к вирусу гриппа у крыс Wistar

Впервые разработан и апробирован алгоритм прогнозирования восприимчивости к вирусу гриппа лабораторных животных, характеризуемой величиной ИД50 для респираторных органов (легких и трахеи) при инфицировании вирусом гриппа in vivo, и рассчитанной с использованием величины ИД50 для клеток легких и трахеи при инфицировании вирусом гриппа т vitro

Впервые обнаружено, что прогнозируемая восприимчивость легких к вирусу гриппа у крыс должна быть существенно выше, чем наблюдаемая в эксперименте, то есть прогнозируемая ИД50 была меньше, чем ИД50 для легких, определенная при аэрогенном инфицировании крыс вирусом гриппа, что обусловлено наличием у крыс выраженной вируснейтрализующей активности секреторных факторов бронхоальвеолярной выстилки

Впервые установлено, что прогнозированные и экспериментально полученные при аэрогенном инфицировании вирусом гриппа величины ИД50 для трахеи крыс, а также для легких и трахеи мышей статистически совпадают Следовательно, разработанный и апробированный нами алгоритм прогнозирования может быть использован для прогноза восприимчивости т vivo к вирусу гриппа тех органов, в которых внеклеточные защитные (барьерные) факторы существенно не уменьшают вероятность инфицирования клеток-мишеней

возможность контролировать эпизоотическую ситуацию в птицеводческих и животноводческих хозяйствах Параметры вирус-клеточных взаимодействий, полученные с использованием первичных культур клеток респираторных органов животных и человека, совместно с параметрами инфекционности вируса гриппа у модельных животных т vivo, в дальнейшем, после того как будут разработаны методики оценки инфекционности вируса гриппа в первичной культуре клеток легких человека, позволят заблаговременно определять потенциальную восприимчивость человека к новым штаммам вируса гриппа, циркулирующим среди животных и птиц Предложенный метод прогнозирования в будущем даст возможность количественно оценивать восприимчивость человека к новым штаммам вируса гриппа животного происхождения до их перехода в человеческую популяцию, и тем самым повысит вероятность раннего выявления пандемичного штамма и ускорит разработку эффективных противоэпидемических мероприятий Кроме того, после дальнейшего совершенствования методической основы прогнозирования восприимчивости человека к вирусу гриппа, этот метод может быть использован для оценки потенциальной эффективности разрабатываемых противовирусных препаратов для лечения гриппозной инфекции у людей

Положения, выносимые на.защиту:

1 Первичная суспензионная культура клеток легких и трахеи лабораторных животных содержит основные типичные для этих органов клетки, в том числе восприимчивые к вирусу гриппа, и способна продуцировать вирус гриппа при культивировании не менее трех суток

2 Защитные секреторные факторы бронхоальвеолярной поверхностной выстилки у крыс могут существенно снижать восприимчивость легких к вирусу гриппа при аэрогенном заражении посредством прямого вируснейтрализующего воздействия

3 Показатели восприимчивости к вирусу гриппа для суспензионных первичных культур легочных клеток лабораторных животных (»и vitro) могут быть использованы дня прогноза базовой (клеточной) видоспецифической восприимчивости легочных клеток-мишеней к вирусу гриппа т vivo без учета вмешательства внеклеточных факторов бронхоальвеолярной выстилки

4 Показатели восприимчивости к вирусу гриппа для суспензионных первичных культур клеток трахеи лабораторных животных (т vitro) могут быть использованы для адекватного прогноза восприимчивости трахеи при заражении этих животных вирусом гриппа т vivo

Апробация материалов диссертации Результаты основных разделов диссертации были представлены в десяти докладах и обсуждены на трех отечественных и четырех зарубежных конференциях

Biological Medical Defense Conference of prophylaxis and treatment of BW health disorders, Oct 29-30,2003, Munich, Germany,

Biological Medical Defense Conference, October 20-21,2004, Munich, Germany, Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний, Международная конференция, 8-10 сентября 2004, Сосновка, Новосибирская область, Россия,

Компенсаторные приспособительные процессы фундаментальные, экологические и клинические аспекты, Всероссийская конференция, 5-7 октября 2004, Новосибирск, Россия,

Microbes m a changing world, XIII International Congress of Virology, Jul 23-28 2005, San Francisco, California, USA,

2-я Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология -биомедицина - Окружающая среда», 10-13 мая 2005, Пущино, Россия,

Biological Medical Defense Conference, October 26-27 2005, Munich, Germany Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных статей, из них 6 - в журнале Вестник РАМН (2004, 2006, 2007) и 2 - на сайтах в Интернете (medline ruA)ubhc/art/tom7/art016pdf phtml. medline ru/public/art/tom7/art0I7Ddf phtml)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах, содержит 7 рисунков и 13 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 60 отечественных и 290 зарубежных источников

Вклад автора в диссертационную работу. Весь материал, представленный в диссертации, получен и проанализирован лично автором при участии к т н Жукова В А, к б н Шишкиной JIН д б н, профессора Рябчиковой Е И, дм н Мапковой Б М, к б н Пьянкова OB, к б н Плясунова ИВ, не Киселева CA, не Петрищенко В А, инженеров Окуловой Л М, Копыловой Е О и старших лаборантов Филипповой Ю С, Кириченко Т Б, Прудниковой Н В , Соловей И М, Генераловой Т И

Всем перечисленным сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» автор выражает огромную и искреннюю благодарность

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали штамм вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), свободных от патогенной флоры белых мышей CD-I и крыс Wistar, а также мышей ICR

Получение первичных культур клеток легких и трахеи осуществляли с помощью ферментативной (трипсин и ДНКаза) дезагрегации ткани этих органов Получение первичных клеточных культур с разным содержанием определенных типов легочных клеток проводили с помощью методов фракционирования Для изменения соотношений концентраций различных типов клеток в суспензии использовали метод адгезии суспензии легочных клеток в пластиковых флаконах в присутствии 10% эмбриональной сыворотки, а также метод фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/см3 В дальнейшем инфицированию подвергали в первом случае - неадгезированные клетки, во втором - клетки, собранные в верхней и нижней фракциях

Цитологическое исследование проводили в препаратах, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову Оценивали процентное содержание различных типов клеток реснитчатых эпителиальных клеток, бокаловидных эпителиальных клеток, альвеолоцитов I и ÍI пипов, недифференцированных эпителиальных клеток, а также макрофагов-моноцитов, нейгрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и прочих Идентификацию клеток при световой микроскопии осуществляли на основе характерных для них морфологических признаков Репродукцию вируса гриппа в суспензионных первичных клеточных культурах легких и трахеи у мышей CD-I, ICR и крыс Wistar подтверждали методом ультратонких срезов

Для изучения инфекционности вируса гриппа определяли кинетики его репродукции в первичных культурах клеток легких, 50% инфицирующую дозу вируса для первичной суспензионной культуры клеток (КИДя)) легких или трахеи m vitro и 50% инфицирующую дозу (ИД50) для легких и трахеи у животных m vivo ИД50 вируса гриппа, осевшего в легких или трахее, в экспериментах in vivo вычисляли по формуле ИД so = АИДмхТхЛУхк, и выражали в lg3Hflso/opraH, где АИД50 - 50% инфицирующая доза, рассчитанная исходя из концентрации ВГ в аэрозоле, Т - время экспозиции животных в аэрозоле, к, - коэффициент осаждения частиц аэрозоля с диаметром 3,5 мкм в отделе респираторного тракта, W - объемная скорость дыхания (в см3/мин) рассчитывается по формуле Гайтона Урожайность вируса в клетке (JV) рассчитывали по формуле N= П30 + пзо х к, * (ti - ti), где пзо - количество вирусных частиц, произведенных одной клеткой и не инактивировавшихся к моменту времени (30 ч) из интервала стационарной фазы продукции вируса, к, - константа инактивации вируса, (t2 - t¡) -интервал времени стационарной фазы продукции вируса Значение пзо вычисляли, исходя из оценки продукции вируса одной клеткой через 30 ч после ее инфицирования ВГ, по формуле пзо = VW(Vo х 1п2/КИД5о), где Vw - концентрация вируса в среде

культивирования через 30 ч инкубации, Vo - концентрация вируса в среде в момент инфицирования клеток (0 ч)

Метод прогнозирования ИД50 основан на алгоритме экстраполяции ИД50 с модельного животного на целевой объект Для прогноза ИД50 для целевого объекта использовали уравнение

lgИД5o=IgИД!om-lgKИД5»m+lgKИД5o+]g[l-exp(-In2xNm/ИД5ora)]-lg[l-exp(-ln2xN/ИД5o)] Нижний индекс "т" у параметра указывает на то, что параметр измерен для модельного животного Проверку адекватности алгоритма прогнозирования проводили на примере экстраполяции ИД50 ВГ для легких и трахеи с мышей CD-I на мышей ICR и крыс Wistar, а также с мышей ICR на крыс Wistar с последующим сравнением прогнозируемых ИД50 с экспериментально измеренными величинами ИД50

Жидкость, содержащую внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки (ИФСЭВ) крыс получали из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), которую диализировали с целью максимального освобождения полученной жидкости от хлорида натрия и лиофилизировали Изучение вирус-нейтрализующего действия жидкости, содержащей ИФСЭВ, проводили в контактных опытах in vitro с последующим определением инфекционносш вируса гриппа при заражении РКЭ [Хабриев Р У, 2005] в собственной модификации

В работе использовали общепринятые статистические методы [Закс JI, 1976, Ашмарин И П и Воробьев А А, 1962]

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка методик определения параметров взаимодействия вируса гриппа

с клетками легких и трахеи в первичной суспензионной культуре В качестве клеточной системы для изучения параметров взаимодействия вируса гриппа с клетками широко используют первичные культуры клеток, полученные из органов дыхания, в виде монослоя, сформированного на специальных подложках, например, на коллагене [Choi and Jacoby, 1992, Wright et al, 1996, Slepushkm et al, 2001] Однако клеточный состав таких первичных клеточных культур не соответствует естественному соотношению клеток в органе, поскольку там присутствуют клетки, которые обладают слабой адгезивной способностью и, соответственно, не «приживаются» в монослое На первом этапе работы нами были разработаны методы получения первичной суспензионной культуры легочных клеток и оценки ее восприимчивости к вирусу гриппа Было показано, полученная с помощью ферментативной дезагрегации первичная суспензионная культура легочных клеток мышей, содержит все основные

клеточные типы реснитчатые клетки - 0,7±0,5 %, бокаловидные клетки - 0,5±0,4 %, альвеолоциты I типа - 0,9±0,4 %, альвеолоциты II типа - 3,8±1,2 %, недифференцированные эпителиальные клетки - 5,2±1,5 %, макрофаги - 12,8+2,6 %, нейтрофилы - 10,3+2,0 %, эозинофилы - 1Д±0,6 %, лимфоциты - 51,4+6,8 %, прочие -13,3±1,4 %

Для культивирования инфицированных вирусом гриппа первичных культур клеток в суспензии по результатам серии экспериментов нами была выбрана среда DMEM/F12 с добавлением 0,5 % эмбриональной сыворотки Gold (ICN Biomedicals Inc)

На следующем этапе работы были разработаны методики определения параметров взаимодействия вируса гриппа с восприимчивыми клетками органов-мишеней в первичной суспензионной клеточной культуре с учетом особенностей его репродукции

С помощью электронной микроскопии было показано, что клетки в суспензионной первичной культуре, полученной при дезагрегации легочной ткани у мышей CD-I, ICR и крыс Wistar продуцируют вирус гриппа при культивировании в течение 30 ч после инфицирования вирусом гриппа in vitro

Для определения параметра инфекционности вируса гриппа в первичной суспензионной культуре клеток КИД50 необходимо определить момент времени для измерения концентрации вируса, при котором несвязавшийся вирус инакгивируется, а вероятность наличия в суспензии неинактивированного вновь наработанного вируса максимальная Для этого были изучены кинетики наработки вируса в суспензиях клеток при разной множественности заражения и кинетики инактивации вируса в суспензиях дебриса клеток с целью определения интервала времени выхода вируса из клеток ji скорости инактивации вируса (таблицы 1,2)

Во всех экспериментах через 24 ч и позже при инкубации вируса гриппа в суспензии клеточного дебриса инфекционного вируса не было обнаружено при титровании на РКЭ Таким образом, в дальнейших экспериментах по изучению кинетики накопления вируса гриппа в суспензии первичных культур легочных клеток мышей и крыс факт наличия вируса более чем через 24 ч будет свидетельствовать об эффективном размножении вируса в клетках суспензии

На основании сравнения данных по инактивации вируса гриппа в дебрисе клеток (таблица 1) и наработке вируса в первичных суспензионных культурах легочных клеток экспериментальных животных (таблица 2) можно сделать вывод о том, что потомство вируса гриппа начинает выходить из клеток через 6-12 ч после их инфицирования Концентрация вируса гриппа в суспензии достигает максимальных значений через 18 ч после инфицирования, после чего остается на стационарном или близком к нему уровне в

Таблица 1 Кинетика концентрации вируса гриппа при инкубировании в суспензии

дебриса легочных клеток лабораторных животных

Вид животных Ха эксперимента Концентрация вируса гриппа (^ЭИД5о/мл) при его инкубировании в дебрисе клеток в течение времени

0ч Зч 6ч 24 ч 30 ч 36 ч

Мыши I 4,0 3,7 2,8 # # #

CD-I 2 2,8 1,6 1,2 # # #

3 2,0 1,7 # # # #

Крысы Wistar 1 4,0 3,8 3,3 § « и

2 2,8 2,5 2,5 # # §

3 1,8 0,8 # # # #

Примечание средняя величина дисперсии концентрации во всех экспериментах равняется 0,07, ч -часы инкубации суспензии дебриса клеток с вирусом гриппа, # - вирус гриппа не выявлен, для каждого эксперимента дебрис получали из суспензионной первичной культуры клеток легких, содержащей 1 млн клеток

Таблица 2. Кинетика продукции вируса гриппа при инфицировании первичной

суспензионной культуры легочных клеток лабораторных животных

Вид животных № экспе- Концентрация вируса гриппа (^ЭЩЬо/мл) в первичных суспензионных культурах легочных клеток в течение времени

римен та 0ч 6ч 12 ч 18ч 24 ч 30 ч 36 ч 42 ч 48 ч 54 ч

Мыши 1 3,6 4,6 4,6 5,1* 5,1* 5,2* 5,2* 5,1* 4,6 4,1

CD-I 2 2,9 2,1 3,9 4,2 4,6* 4,2* 4,6* 4,4* 5,1* 4,1

3 1,7 1,7 2,2 3,2* 3,4* 3,5* 3,4* 3,5* 3,0* 2,5

Крысы Wistar 1 2,7 2,7 3,2 3,9* 3,7* 3,9* 2,9* 2,7 3,2 но

2 2,1 1,9 1,9 3,1* 2,9* 3,1* 3,2* 2,9* 2,6 но

3 <0,5 0,9 1,3 2,1* 1,9* 2,3* 2,4* 1,4 0,8 но

Примечание средняя величина дисперсий концентраций во всех экспериментах равняется 0,048, * -стационарная фаза продукции вируса, достоверное отличие от значения в 0 ч для данного эксперимента, ч -часы инкубации суспензии клеток с вирусом гриппа, но- концентрацию вируса гриппа не определяли, в каждом эксперименте использовали суспензионную первичную культуру, содержащую 1 млн. клеток.

среднем до 48 ч для клеток мышей и 36 ч для клеток крыс После 24 ч инкубации вирус гриппа в дебрисе клеток не обнаруживается, в то время как в суспензии клеток

наблюдается увеличение концентрации вируса Исходя из полученных данных, мы выбрали 30 ч как время отбора биопроб для определения наличия наработки вируса в первичных суспензионных культурах легочных клеток экспериментальных животных, т е установления факта продуктивной адсорбции вируса на первичных клетках и определения урожайности вируса в клетках

Величины потери инфекционной вирусной активности, за первые и последующие 3 ч инкубации в дебрисе легочных клеток мышей (0,6±0,17 и 1,0±0,23 lg, соответственно) и крыс (0,5±0,11 и 0,4±0,09 lg, соответственно) не отличаются (а>0,05) друг от друга, что подтверждает возможность использования экспоненциальной зависимости для описания инактивации вируса в среде культивирования (таблица 1) Среднее значение константы инактивации к, равняется 0,49±0,11 час"1, и это значение в дальнейшем будет использовано для определения урожайности вируса в первичной суспензионной культуре клеток легких

На основании данных таблицы 2 для каждой дозы заражения были определены интервалы, соответствующие стационарной фазе продукции вируса Средняя продолжительность стационарной фазы продукции вируса для легочных клеток мышей равняется 26,0±2,0 ч и для легочных клеток крыс - 18,0±3,5 ч

2. Проверка возможности прогнозирования ИДя> вируса гриппа для хозяина Для определения ИД50 in vivo животных экспонировали в вируссодержащем аэрозоле со средним счетным аэродинамическим диаметром частиц 3,5±0,88 мкм Как известно, реснитчатые клетки, также как альвеолоциты 1-го и 2-го типов, восприимчивы к вирусу гриппа В тоже время, альвеолоциты 1-го и 2-го типов входят в состав эпителиальной выстилки легких, а в составе выстилки трахеи их нет Кроме того, известно, что аэрозоль в разной степени осаждается в верхних и нижних отделах дыхательной системы В связи с этим, целесообразно было определить, при аэрогенном заражении животных вирусом гриппа, наличие инфекционного процесса отдельно в трахее (трахея с частью главных бронхов вне легких) и отдельно в легких с учетом коэффициентов осаждения аэрозоля для этих органов, то есть отдельно определить ИД50 для легких и трахеи

Результаты оценки АИД50 и ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи при аэрогенном заражении мышей и крыс приведены в таблице 3 Из полученных результатов следует, что для мышей CD-I и ICR отличия между восприимчивостью к вирусу гриппа легких и трахеи незначимы (а>0,05), a у крыс трахея существенно (а<0,05) более восприимчива к вирусу гриппа, чем легкие Далее видно, что отличия по восприимчивости трахеи к вирусу гриппа у крыс Wistar и мышей CD-I незначимы (а>0,05), но обе эти характеристики достоверно ниже, чем восприимчивость к вирусу гриппа трахеи у мышей ICR

Обнаружено, что восприимчивость к вирусу гриппа легких у крыс Wistar значительно ниже, чем у мышей CD-I и ICR (а<0,05), а также, что восприимчивость легких у мышей CD-I достоверно ниже, чем у мышей ICR (а<0,05)

Таблица 3. 50% инфицирующие дозы вируса гриппа для органов дыхания экспериментальных животных при аэрогенном заражении с учетом коэффициента осаждения аэрозоля

Вид животных Средние значения ИД50 (lg3Hfljo) для органов дыхания

Трахея Легкие

Крысы Wistar -0,13±0,15** 1,29±0,15*

Мыши CD-I -0,40±0,15** -0,52±0,15**

Мыши ICR -1,10±0,21 -1,23±0,15

Примечание в качестве дисперсии ИДТО использовали для трахеи мышей ICR - среднюю величину S2 дисперсий всех измеренных ИД50, в остальных случаях - S2/2, * - показатель достоверно отличается (и>0,05) от показателя для легких у мышей и от показателей для трахеи у мышей и крыс, ** - показатель достоверно отличается (а>0,05) от аналогичного показателя у мышей ICR

Полученные данные можно объяснить более высокой противовирусной активностью факторов, входящих в состав секрета эпителиальной выстилки легких у крыс Как ранее было установлено бронхоальвеолярная лаважная жидкость, полученная из легких у крыс, способна подавлять гемагглютинирующую активность вируса гриппа [Митченко В П и Горбунова А С, 1964] Более низкая восприимчивость к вирусу гриппа легких у крыс может быта связана с действием ИФСЭВ, входящих в состав секрета эпителиальной выстилки, которые прямьм или косвенным образом могут эффективно нейтрализовать вирус гриппа Как результат этого нейтрализующего действия, для возникновения инфекционного процесса в легких у крыс требуется более высокая доза вируса гриппа, чем дня трахеи крыс, а также, чем для легких и трахеи у мышей

На следующем необходимо было оценить вклад различных клеток эпителия респираторных органов в развитие инфекции Оценка степени участия тех или иных клеток эпителия респираторных органов в развитие инфекционного процесса позволит определить стратегию прогнозирования инфекционности вируса гриппа, а именно определить возможность прямого использования математической модели (2) или необходимость ее модификации Дело в том, что модель (2) применима в 3-х случаях во-первых, когда в органе мишени существует только один тип восприимчивых клеток, во-вторых, несколько равновосприимчивых типов клеток и, в-третьих, несколько типов, один из которых намного более восприимчив, чем другие Целью экспериментов, описываемых в данном разделе, является сравнительная оценка восприимчивости и продуктивности

реснитчатых клеток и альвеолоцитов I и И типов к вирусу гриппа, а также значимости влияния клеточных факторов неспецифического иммунитета (макрофагов и нейтрофилов) на восприимчивость к вирусу гриппа клеток-мишеней в суспензионной первичной культуре легочных клеток

В экспериментах использовали первичные суспензионные клеточные культуры, представляющие собой смесь из клеток разных видов, входящих в состав эпителия легких и трахеи мышей CD-I и крыс Wistar В смесях, полученных с помощью двух методов фракционирования, определяли процентное содержание клеток (реснитчатых, альвеолоцитов I и II типов, макрофагов, нейтрофилов, и других) Данные по концентрациям клеток приведены в таблице 4, параметры вирус-клеточного взаимодействия приведены в таблице 5

Таблица 4, Процентное содержание различных типов клеток в первичных суспензионных

культурах респираторных органов мышей и крыс после их разделения разными способами

Вид животных Виды полученных первичных суспензионных клеточных культур легких и трахеи Процентное содержание (%) различных типов клеток, (M±SM)

Реснит чатые клетки Альвеоле циты I типа Альвеоло циты И типа Макро фаги Нейтро филы Все другие клетки

Мыши CD-I Суспензия дезагрегированных клеток легких 1,3±0,3 1,2±0,5 *&$ 0,9±0,4 *,#$ 9,8±1,1 & 15,0±1,3 *#& - 72,8±2,5

Неадгезированные клетки легких 2,3±0,2 0,1±0,1 0,0±0,0 т 8,1±1,7 & 3,3±0,7 & 85,2±1,9

Клетки легких, собранные в верхней фракции * 3,3±1,6 10,6±1,5 @ 1,6±0,8 2,3±2,3 #$@ 0,0±0,0 82,2±4,0

Клетки легких, собранные в нижней фракции * 3,2±0,6 3,9±1,6 *,&$ 3,8±0,9 *$@ 11,9±1,6 & 6,2±2,0 &$ 70,9±3,9

Суспензия клеток трахеи 1,2±0,1 0,0±0,0 #&м 0,0±0,0 № 8,0±2,0 2,3±1,0 &$ 88,5±1,3

Уровень значимости отличий между суспензиями клеток в дисперсионном анализе, а 0,254 <0,001 <0,001 0,038 <0,001

Крысы Wistar Суспензия дезагрегированных клеток легких 2,4±0,6 0,9±0,3 *,#& 0,3±0,2 # 11,0±0,5 *,&$ 4,2±1,6 & 81,2±1,7

Неадгезированные клетки легких 2,1±0,5 1,0±0,3 *.#.& 1,0±0,6 7,5±1,4 &.Й 2,6±0,5 85,Ш,9

Клетки легких, собранные в 0,7±0,7 19,9±2,6 0,4±0,4 # 0,8±0,8 0,0±0,0 80,5±4,1

верхней фракции1

Клетки легких, собранные в нижней фракции1 1,7±0,1 2,7±0,1 *&@ 3,6±1,3 10,6±1,8 & 2,8±0,4 *,& 78,5±2,0

Суспензия клеток трахеи 1,9±0,4 0,0±0,0 #&м 0,0±0,0 # 6,2±1,8 ш 1,4±0,3 90,5±1,5

Уровень значимости отличий между суспензиями клеток в дисперсионном анализе, а 0,283 <0,001 0,023 <0,001 <0,001

Мыши ICR Суспензия дезагрегированных клеток легких 0,7±0,5 0,9±0,4 * 3,8±1,2 * 12,8±2,6 10,3±2,0 * 71,5 3,1

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 1,1±0,2 0,0±0,0 @ 0,0±0,0 @ 9,3±2,3 2,8±1,0 @ 86,8±2,5

Примечание M - среднее значение, SM - стандартное отклонение среднего , * - клетки, полученные методом фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фшсолла с плотностью 1,041 г/см3, * - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток трахеи (а<0,05), # - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток, собранных в нижней фракции (а<0,05), & - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток, собранных в верхней фракции (ос<0,05), $ - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии, содержащей неадгезированные клетки легки* (а<0,05), @ - содержание клеток достоверно отличается от содержания в исходной суспензии клеток легких (а<0,05)

Полученные первичные суспензионные культуры легочных клеток представляют различные комбинации по содержанию клеток (реснитчатых, альвеолоцитов I и II типов, макрофагов и нейтрофилов), которые позволят в дальнейших экспериментах оценить вклад названных клеток в восприимчивость к вирусу гриппа первичных суспензионных клеточных культур, полученных из легких и трахеи экспериментальных животных

Далее определяли величины КИД50 для всех клеточных смесей (таблица 5) Значимость варьирования КИД50 и N, а также содержания каждого типа клеток в клеточных суспензиях в зависимости от способа их получения проверялась методом однофакторного дисперсионного анализа [Шефе Г, 1980] Предварительно было показано, что дисперсии ошибок для каждого из анализируемых показателей (КИД50, N и содержание клеток) являются однородными (критерий Кокрена (а = 5%)) [Закс Л , 1976] Согласно результатам дисперсионного анализа для обоих видов животных концентрация реснитчатых клеток в первичных клеточных суспензиях и в суспензиях, полученных различными методами сепарирования, меняется несущественно (а=0,05) Напротив, концентрации остальных типов клеток меняются значимо (а<0,035) (таблица 4) При этом изменение КИД50 и N вируса является незначимым (ос=0,05) (таблица 5)

Таблица 5. Значения 50% клеточных инфицирующих доз вируса гриппа (КИД50) и урожайности вируса гриппа (К) в суспензиях первичных культур клеток легких и трахеи

мышей и крыс

Вид животных Виды полученных первичных суспензионных клеточных культур легких и трахеи Параметры вирус-клеточного взаимодействия в суспензионных первичных культурах

КИД50 Og3HA50), M±Sm N(lg3Hibo), M±SM

Мыши CD-I Суспензия дезагрегированных клеток легких 4,0±0,5 3,2±0,3 #

Неадгезированные клетки легких 4,0±0,6 2,8±0,3

Клетки легких, собранные в верхней фракции * 4,3±0,3 2,6±0,1

Клетки легких, собранные в нижней фракции ^ 4,0±0,4 2,4±0,2

Суспензия дезагрегированных клеток клеток трахеи 3,8±0,2 * 3,3±0,2 $

Крысы Wistar Суспензия дезагрегированных клеток легких 4,0±0,4 2,1±0,2

Неадгезированные клетки легких 3,9±0,2 2,1±0,2

Клетки легких, собранные в верхней фракции ^ 4,0±0,6 1,9±0,1

Клетки легких, собранные в нижней фракции * 3,7±0,3 1,1±0,6

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 3,7±0,3 * 2,2±0,5

Мыши ICR Суспензия дезагрегированных клеток легких 3,1 ±0,1 3,3±0,3 it

Суспензия дезагрегированных клеток трахеи 2,8±0,2 3,4±0,3

Примечание КИД50 - 50% клеточная инфицирующая доза вируса гриппа, нормированная на 1 млн клеток, N - урожайность вируса гриппа для 1 клетки в суспензии клеток, * - клетки, полученные мепгодом фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с гаюшосгыо 1,041 г/см , * - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток трахеи мышей ICR (а<0,05), $ -значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток трахеи крыс Wistar (а<0,05), # - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток легких крыс Wistar (а<0,05), M±Sm - среднее значение ± стандартное отклонение среднего

Из полученных данных следует, что восприимчивость к вирусу гриппа клеток легких и трахеи одинакова у мышей CD-I и крыс Wistar и меньше чем у мышей ICR при этом восприимчивость и вирус-продуцирующая способность реснитчатых клеток существенно выше, чем альвеолоцитов I и II типов Увеличение более чем в 2 раза процентного содержания альвеолоцитов I типа по сравнению с долей (в процентах) реснитчатых клеток на фоне уменьшения доли (в процентах) фагоцитов не приводит к значимому изменению восприимчивости к вирусу гриппа и его урожайности для суспензионных первичных культур клеток (таблицы 4 и 5) О меньшей восприимчивости к вирусу гриппа и его урожайности для альвеолоцитов II типа по сравнению с реснитчатыми клетками можно сделать заключение из сравнения суспензий «Клетки легких, отобранные в нижней фракции» и «Суспензия дезагрегированных клеток трахеи» Эти суспензии достоверно отличаются друг от друга только по содержанию альвеолоцитов II типа, причем величина изменения доли этих клеток не меньше, чем доля реснитчатых клеток (таблицы 4 и 5)

Попытки построить значимую регрессию для КИД50 и N в зависимости от изменения относительного количества клеток методом пошаговой регрессии [Себер Дж, 1980] дали отрицательный результат Это также свидетельствует о том, что восприимчивость к вирусу гриппа и его урожайность у реснитчатых клеток выше, чем у альвеолоцитов I и II типов, а присутствие макрофагов и нейтрофилов незначимо изменяет восприимчивость клеток-мишеней

В дополнение к указанным суспензиям клеток были получены суспензии клеток легких и трахеи мышей ICR, для которых были также определены процентные соотношения различных типов клеток и параметры вирус-клеточного взаимодействия (таблицы 4 и 5) Концентрации реснитчатых клеток и альвеолоцитов I и II типов в суспензиях клеток мышей ICR не отличались значимо от концентраций реснитчатых клеток и альвеолоцитов I и II типов в соответствующих суспензиях клеток, полученных от мышей CD-I и крыс Wistar (а>0,05) Это свидетельствует о стандартности методик получения клеток

Таким образом, было показано, что параметры вирус-клеточного взаимодействия КИД50 и N вируса гриппа представляют собой характеристики, которые могут отличаться по своим величинам в суспензиях первичных культур клеток легких и трахеи у мышей CD-I и ICR и крыс Wistar и обусловлены индивидуальными особенностями восприимчивых клеток в составе данных суспензий Альвеолоциты I и II типов у мышей и крыс имеют существенно меньшую восприимчивость к вирусу гриппа и вирус-продуцирующую способность по сравнению с реснитчатыми клетками Кроме того, изменение численности фагоцитов (макрофагов и нейтрофилов) в исследованных

интервалах незначимо влияет на восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа в суспензионных первичных культурах легочных клеток у мышей и крыс

На основании этих результатов можно предполагать, что при заражении вирусом гриппа интактных мышей и крыс in vivo такие клеточные факторы врожденного иммунитета как макрофаги и нейтрофилы могут не оказывать существенного влияния на величину ИД50 вируса гриппа для трахеи и легких Тем не менее, как было показано выше, восприимчивость легких к вирусу гриппа у крыс оказалась достоверно ниже, чем восприимчивость к вирусу гриппа трахеи крыс, а также легких и трахеи мышей В связи с этим, на следующем этапе работы возникла необходимость оценить, способны ли внеклеточные факторы, входящие в состав секреторной эпителиальной выстилки, в значительной степени нейтрализовать вирус гриппа и, таким образом оказывать существенное влияние на снижение восприимчивости к вирусу гриппа легких у крыс при аэрогенном инфицировании

Внеклеточные факторы неспецифического иммунитета были получены методом промывания полости легких изотоническим раствором NaCl, последующего центрифугирования для освобождения от клеток, диализа супернатанта для освобождения от NaCI, лиофилизации супернатанта, концентрирования и разведения продукта лиофилизации в изотоническом растворе NaCl Этот метод не позволяет получать внеклеточные факторы неспецифического иммунитета отдельно от компонентов сурфактанта, находящихся совместно в секреторной выстилке, покрывающей поверхность воздухоносных путей и альвеол Поэтому была оценена вируснейтрализующая активность, как компонентов сурфактанта, так и сопутствующих факторов неспецифического иммунитета Обозначим все эти факторы как «внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки» (ИФСЭВ) легких, среди которых находятся компоненты сурфактанта.

Жидкость, содержащая ИФСЭВ, была приготовлена из концентрированного раствора лиофилизированного супернатанта, исходя из физиологической концентрации в легких у крыс В таблице 6 приводятся данные экспериментов по определению вирус-нейтрализующей активности ИФСЭВ, полученных от крыс, в отношении вируса гриппа

Обнаружено, что инфекционность вируса гриппа для РКЭ (в ^ЭИД5о/мл) после его инкубации в жидкости, содержащей ИФСЭВ, достоверно снижается относительно контрольной инфекционности вируса гриппа (а<0,05) (таблица 6) Об этом свидетельствует уменьшение в 6 раз количества ЭИД50 вируса гриппа после его инкубирования в течение 1 ч с ИФСЭВ крыс m vitro в 1 мл жидкости в пробирке (таблица 6) Таким образом, полученные данные по снижению способности вируса гриппа

Таблица 6. Инфешионность вируса гриппа в РКЭ после его инкубирования в течение часа в жидкости, содержащей ИФСЭВ крыс

Состав жидкости при инкубации вируса гриппа Количество ЭИД50 вируса гриппа в жидкости, содержащей ИФСЭВ, и в контроле (в lg/мл)

1 2 3 M±Sm

Вирус гриппа+ИФСЭВ 6,2 5,7 6,3 6,0±0,19 *

Вирус гриппа+0,9% раствор КаС1 (контроль) 6,7 6,7 7,2 6,8±0,17

Примечание 1, 2, 3 - повторы эксперимента, * - количество ЭИД50 вируса гриппа достоверно меньше, чем в кошроле (а<0,05), М±8м - среднее значение ± стандартное отклонение среднего

инфицировать восприимчивые клетки в системе РКЭ после его инкубации в жидкости, содержащей ИФСЭВ, подтверждают возможное существенное влияние этих факторов, прежде всего, компонентов сурфактанта, на эффективную восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа в легких у крыс

3. Прогноз восприимчивости животных in vivo на основании показателей инфекционности вируса гриппа в клетках легких и трахеи in vitro

Проверка адекватности метода прогнозирования восприимчивости организма-хозяина к вирусу гриппа проведена на примере экстраполяции данных по восприимчивости к нему легких и трахеи у мышей CD-I и ICR m vivo и m vitro на восприимчивость к вирусу гриппа легких и трахеи крыс Wistar m vivo Также проведена экстраполяция аналогичных данных, полученных в экспериментах с мышами CD-I и клетками их легких и трахеи, на восприимчивость легких и трахеи мышей ICR in vivo

Прогнозирование ИД50 осуществлялось по уравнению lgИД50=lgИД5om-IgKИД5(,m+lgKИД5o+lg[l-cxp(-lIl2xNn,/ИД5om)]-lg[l-exp(-^n2x^'/ИД5o)l,

где нижний индекс «т» означает соответствие параметра модельному животному, параметры без такого индекса относятся к целевому животному, те животному, для которого осуществляется прогнозирование ИД50 Для решения уравнения относительно величины ИД50 использовали метод перебора

Суть метода заключается в последовательной подстановке в это уравнение возможных значений прогнозируемой ИД50 с шагом 0,1, а также полученных экспериментальных данных При решении уравнения с различными подставляемыми значениями искомой ИД50 выбирается минимальная разность (Л) между величинами, стоящими в левой и полученными в правой частях уравнения Поиск решения прекращали

Таблица 7. Примеры прогноза ИД50 ВГ для трахеи крыс in vivo методом перебора прогнозных величин ИД50 при экстраполяции экспериментальных данных по восприимчивости к ВГ мышей ICR

Пробное значение ИД50 ОвЭИДю) Разность между левой и правой частями уравнения, Д (lg)

-0,4 -0,2

-0,3 -0,1

-0,2* 2,8xl0"ls

-ОД ОД

0,0 0,2

Примечание * - Искомое значение ИД50 абсолютная величина А меньше 0,1

при достижении абсолютной величины Д меньше 0,1 В таблице 7 приводятся величины А, вычисленные при решении уравнения прогнозирования ИД50 вируса гриппа для трахеи крыс in vivo при экстраполяции экспериментальных данных, полученных для мышей ICR

В таблице 8 приводятся результаты прогнозирования ИД50 вируса гриппа для мышей ICR или крыс Wistar при использовании экспериментальных данных по восприимчивости клеток этих животных (таблица 5), а также усредненных величин ИД50 вируса в органах дыхания при аэрогенном заражении мышей CD-I или ICR (таблица 4) Во всех случаях решения уравнения величины Д были меньше 2,8х10"16 Об адекватности прогнозирования судили по результатам сравнения вычисленной прогнозной величины ИД50 с экспериментально определенными ИД50

Во всех приведенных вариантах прогнозирования восприимчивости трахеи прогнозные величины с высокой точностью и достоверностью (а=0,08) соответствуют величинам ИД50, полученным в эксперименте Также с высокой достоверностью (а=0,35) наблюдается соответствие прогнозируемой и экспериментальной величин ИДз0 для легких у мышей ICR Иначе говоря, если использовать для прогноза ИД50 вируса гриппа для легких у мышей ICR в качестве модельных животных мышей CD-I, то прогнозируемая и экспериментальная величины ИД50 для легких у мышей ICR совпадают Это обусловлено, прежде всего, тем, что восприимчивость легочных клеток к вирусу гриппа ш vitro у мышей отражает реальную восприимчивость их легких к вирусу гриппа, поскольку у мышей, как следует из литературных данных, наблюдается низкая эффективность ИФСЭВ легких в отношении вируса гриппа [Митченко ВП и Горбунова АС, 1963] Как и ожидалось, для легких у крыс в обоих случаях при использовании в качестве модельных

Таблица 8. Анализ достоверности прогнозов ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи

лабораторных животных

Модельное животное Целевое животное Орган Значение ИД5()ц ВГОяЭИДи) Уровень значимости, а ИД»м 1«эид5() КИДзом 1вЭИДи Nm 1«эид5„ КИД„ц ig3K№o Ыц 18ЭИД50

Прогноз Экспери мент

мышь CD-I крыса Wistar трахея -0,5 -0,1 0,08* "0,4 3,8 3,3 3,7 2,2

мышь CD-I мышь ICR трахея -1,4 -1,1 0,16* -0,4 3,8 3,3 2,8 3,4

мышь ICR крыса Wistar трахея -0,2 -0,1 0,64* -1,1 2,8 3,4 3,7 2,2

мышь CD-I крыса Wistar легкие -0,5 1,3 <0,001 -0,5 4,0 за 4,0 2Д

мышь CD-I мышь ICR легкие -1,4 -1,2 0,35* -0,5 4,0 3,2 3,1 3,3

мышь ICR крыса Wistar легкие -0,3 1,3 <0,001 -1,2 3,1 3,3 4,0 2,1

Примечание модельное животное - животное, все показатели которого используются для прогноза ИДи целевого животного, целевое животное — животное, для которого прогнозируется ИД50, целевой орган - орган для которого прогнозируется ИД50, м - параметр относится к молельному животному, ц - параметр относится к целевому животному, ИДи - 50% инфицирующая доза вируса для органа (трахея, легкие) животного, КИД50 - 50% инфицирующая доза вируса для первичных клеток органа (трахея, легкие) животного, N - урожайность вируса гриппа для одной клетки, * - значение прогнозной величины ИД50 не отличается от экспериментально измеренной (а>0,05), в качестве дисперсий прогнозной и экспериментально полученной величин ИД50 вируса для трахеи мышей ICR использовали величину 0,04 во всех остальных случаях использовали величину 0,02

животных мышей CD-I и ICR прогнозируется более высокий уровень восприимчивости к вирусу гриппа, чем наблюдается в действительности при аэрогенном заражении крыс Wistai вирусом гриппа (а<0,001) Несоответствие прогнозируемой и экспериментальной величин ИД50 для легких у крыс и, напротив, соответствие таковых для легких у мышей может быть объяснено различием в вирус-нейтрализующей активности ИФСЭВ, прежде всего компонентов сурфактанта, в легких у мышей и у крыс

Проведенное исследование позволяет заключить, что данные о восприимчивости к вирусу гриппа только легочных клеток животного, для которого осуществляется прогноз ИД50, позволяют прогнозировать потенциальную или базовую (клеточную) его восприимчивость к вирусу Иначе говоря, восприимчивость к вирусу гриппа легочных клеток мышей совпадает с эффективной или реальной восприимчивостью их легких к вирусу гриппа Это соответствует литературным данным о низкой эффективности нейтрализующих секреторных факторов эпителиальной выстилки легких этих животных Однако при наличии в легких эффективных нейтрализующих вирус гриппа факторов, восприимчивость к вирусу гриппа легких ш vivo оказывается ниже, чем восприимчивость клеток легких m vitro В этом случае для прогнозирования реальной (эффективной)

восприимчивости легких m vivo в модели прогнозирования необходимо учитывать активность барьерных факторов неспецифического иммунитета. Это может оказаться доступным при возможности выделения этих факторов и исследования их вирус-нейтрализующей способности в экспериментах in vitro

ВЫВОДЫ

1 Разработаны методы получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток и оригинальные методики определения параметров инфекционносги вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи мышей CD 1, ICR и крыс Wistar

2 Показано, что восприимчивость трахеи и легких у мышей CD-I и ICR к вирусу гриппа при аэрогенном инфицировании одинакова, а у крыс Wistar восприимчивость трахеи больше в 14,5 раз, чем восприимчивость легких

3 Показано, что восприимчивость первичных культур клеток легких и трахеи у мышей CD-I и крыс Wistar к вирусу гриппа одинакова, но ниже в 10 раз, чем восприимчивость первичных культур клеток легких и трахеи мышей ICR

4 Показано, что изменение процентного содержания макрофагов и нейтрофилов в суспензионных первичных клеточных культурах не влияет на восприимчивость первичных клеточных культур легких и трахеи мышей и крыс к вирусу гриппа

5 Секреторные факторы эпителиальной выстилки, выделенные из легких крыс Wistar, обладают нейтрализующей активностью по отношению к вирусу гриппа и могут значимо снижать его инфекционность для восприимчивых клеток

6 Для легких у крыс Wistar прогнозируемая величина ИД50 вируса гриппа ниже, чем экспериментально измеренная, если в качестве модельных животных использовали мышей CD-I или ICR

7 Прогнозируемые и экспериментально измеренные величины ИД50 вируса гриппа для трахеи крыс Wistar совпадали с высокой достоверностью, если в качестве модельных животных использовали мышей CD-I или ICR

8 Прогнозируемые и экспериментально измеренные величины ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи мышей ICR совпадали с высокой достоверностью, при использовании в качестве модельных животных мышей CD-I

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Zhukov V, Shishkina L, Sergeev AN, Piankov О V, Safatov О V, Petrishenko V A, Sergeev A A, Zhukov A V, Vorobyev A A Method for predicting specific efficacy of antiviral preparations for macro-organism from in vitro data Biological Medical Conference 2003 Prophylaxis and treatment of BW health disorders, 2003 Oct 20-21, Munich, Germany Munich Bundedeswehr Institute of Microbiology, 2003 p 38

2 Жуков В A, Шишкина JIH, Сергеев А А, Сергеев А Н, Пьянков О В , Топорков В А, Сафатов А С, Петрищенко В А, Рябчикова Е И, Малкова Е М, Беляев НМ, Яшин В А Уравнение инфекционное™ и его применение для прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», 8-10 сентября 2004, Сосновка, Новосибирская область, Россия Новосибирск ЦЭРИС, 2004 с 55

3 Сергеев А А, Шишкина Л Н, Жуков В А, Сергеев А Н, Петрищенко В А, Фанкин И В, Пьянков О В, Рябчикова Е И, Малкова Е М, Воробьев А А Восприимчивость клеток легких у мышей и крыс к вирусу гриппа при инфицировании in vitro и m vivo Вестник РАМН 2004, (3) 15-18

4 Жуков В А, Сафатов А С, Пьянков О В , Топорков В С, Сергеев А А, Киселев С А, Яшин В А, Беляев Н М, Рябчикова Е И, Жуков А В, Шишкина Л Н, Медведев А А, Петрищенко В А, Сергеев АН, Воробьев А А Новый комплекс для получения и изучения монодисперсных микробиологических аэрозолей в медико-биологических исследованиях Вестник РАМН 2004,(3) 11-15

5 Сергеев А А, Шишкина Л Н, Жуков В А, Сергеев А Н, Петрищенко В А, Фанкин И В, Пьянков О В, Смоленцев М Н, Малкова Е М Разработка клеточной системы для изучения способов и средств коррекции инфекционного воспаления Материалы Всероссийской конференции «Компенсаторные приспособительные процессы фундаментальные, экологические и клинические аспекты», 5-7 октября 2004, Новосибирск, Россия Новосибирск Сибвузиздат, 2004 с 70-71

6 Шишкина Л Н, Жуков В А, Фанкин И В, Пьянков О В, Сергеев А А , Сергеев А Н, Петрищенко В А, Омигов В В, Колесникова Л В, Малкова Е М Изучение влияния глюкокортикоидного гормона кеналога на резистентность мышей к вирусу гриппа//Материалы Всероссийской конференции «Компенсаторные приспособительные процессы фундаментальные, экологические и клинические аспекты» 5-7 октября 2004, Новосибирск, Россия Новосибирск Сибвузиздат, 2004 с 181-182

7 Sergeev A A, Shishkina LN, Zhukov VA, Sergeev AN, Petrishenko VA, Safatov A S , Fankm IV, Pyankov О V, Ryabchikova EI, Malkova E M The comparative evaluation of the susceptibility of mouse and rat lung cells to influenza virus m vivo and m vitro Biological Medical Defense Conference 2004, 2004 October 20-21, Munich, Germany Munich Bundedeswehr Institute of Microbiology, 2004 p 99

8 Сергеев A A, Сметанникова M A, Шишкина Л H, Жуков В А, Сергеев А Н, Петрищенко В А, Фанкин И В, Пьянков О В , Рябчикова Е И, Малкова Е М Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности 2-я Международная конференция «НАУКА - БИЗНЕС -ОБРАЗОВАНИЕ Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда», тезисы докладов, 10-13 мая 2005, Пущине, Россия Пущино Элементы, 2005 с 99-100

9 Zhukov V, Sergeev A, Shishkina L, Zhukov A, Sergeev AN, Safatov A, Ptankov О, Petrishenko V, Ryabchikova E, Malkova E, Vorobyev A Method for predicting Influenza virus infectivity for macro-organisms from in vitro data on cell susceptibility and activity of immune factors In Microbes m a changing world Abstracts of the XIII International Congress of Virology, 2005 Jul 23 - 28, San Francisco, California, USA Washington American Society of Microbiologist, 2005 166 V52 p 119

10 Shishkina LN, Smetannikova MA, Zhukov VA, Fankm IV, Sergeev A A, Pyankov О V, Petnshchenko V A, Plyasunov IV, Sergeev A N Pathogenetic significance of alterations of target cells susceptibility and functional activity of lung phagocytes at giucocorticoid-mduced decreased resistance to Influenza virus Biological Medical Defense Conference 2005, 2005 Oct 26-27, Munich, Germany Munich Bundedeswehr Institute of Microbiology, 2005 p48

11 Smetannikova M A, Shishkina L N, Sergeev A A, Fankin IV, Bulychyov L G, Kolesmkova L V, Otnigov V V, Petrishchenko V A, Sergeev A N, Zhukov V A Features of pathogenesis of experimental infection at reduction of a resistance to Influenza virus A/Aichi/2/68 after injection of glucocorticoid immunosuppressor Kenalog //Biological Medical Defense Conference 2005, 2005 Oct 26-27, Munich, Germany Munich Bundedeswehr Institute of Microbiology, 2005 p 122

12 Zhukov V A, Shishkina L N, Sergeev A A, Zhukov A V, Sergeev A N, Fankin IV, Piankov OV, Ryabchikova EI, Malkova EM, Safatov AS, Petnshchenko VA, Toporkov V S , Yashin V A., Belyaev N M, Lugovskaya L Ya., Vorobyev A A Prediction of host's susceptibility to influenza virus taking into account factors of non specific immunity Biological Medical Defense Conference 2005,2005 October 26-27, Munich, Germany Munich Bundedeswehr Institute of Microbiology, 2005 p 39

13 Сметанникова M A, Шишкина JIH, Жуков В А, Фанкин И В , Сергеев А А, Пьянков О В, Бондаренко В Н, Петрищенко В А, Сергеев А Н Изучение клеточных и молекулярных механизмов понижения резистентности легких к вирусу гриппа при ведении фармакологических доз глюкокортикоидов Тезисы И международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 20-21 октября 2005, Москва, Россия Москва Московская медицинская акдемия, 2005 с 250-251

14 Шишкина Л Н, Сметанникова М А, Селятицкая В Г, Сергеев А А, Жуков В А, Фанкин И В , Бондаренко В Н, Макарова О П, Сергеев А Н Патогенетическое значение секвестрации и метаболизации нейтрофилов в легких при снижении резистентности к вирусу гриппа на фоне искусственного глюкокортицизма Тезисы II международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 20-21 октября 2005, Москва, Россия Москва Московская медицинская акдемия, 2005 с 290291

15 Сметанникова МА, Шишкина ЛН, Сергеев А А, Фанкин ИВ, Булычев Л Е, Малкова Е М, Петрищенко В А, Скарнович М О, Сергеев А Н, Жуков В А особенности патогенеза экспериментальной зооантропонозной инфекции на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии Материалы международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 21-23 июня 2006, Ульяновск, Россия Ульяновск Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия, 2006 с 479-482

16 Жуков В А, Шишкина Л Н, Сергеев А А, Фанкин И В, Сметанникова М А, Щянков О В , Петрищенко В А, Сергеев А Н, Воробьев А А Проверка возможности прогнозирования восприимчивости хозяина к инфекции гриппа используя данные экспериментов с первичными клетками Medline ru [серия онлайн] 2006 [цитировано 25 марта2008], 7 195-204 Доступно с URL http //www medlme га/pubhc/last/

17 Жуков В А, Шишкина ЛН, Сергеев А. А, Малкова ЕМ, Рябчикова ЕИ, Петрищенко В А, Сергеев А Н, Устюжанина Н В, Воробьев А А Изучение восприимчивости и продуктивности реснитчатых клеток и альвеолоцитов 1-го и 2-го типов мышей при заражении вирусом гриппа m vitro Medlme ru [серия онлайн] 2006 [цитировано 25 марта 2008], 7 205-213 Доступно с URL http //www medlme ш/public/last/

18 Сметанникова М А, Шишкина Л Н, Сергеев А А, Фанкин И В , Булычев Л Г, Колесникова Л В, Омигов В В , Малкова Е М, Петрищенко В А, Сергеев А Н, Жуков В А Некоторые аспекты патогенеза экспериментального гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии Вестник РАМН 2006, (6) 22-27

19 Сметанникова М А, Шишкина JIН, Короленко Т А, Сергеев А А, Малкова Е М, Скарнович М О, Петрищенко В А, Жуков В А, Сергеев А Н Поиск и изучение способов коррекции пониженной резистентности организма к вирусу гриппа на фоне введения глюкокортикоидов III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 27-29 сентября 2006, Новосибирск, Россия Новосибирск ЦЭРИС, 2006 с 242

20 Сметанникова М А, Шишкина Л Н, Жуков В А, Фанкин И В, Сергеев А А, Скарнович М О, Пьянков О В, Петрищенко В А, Бондаренко В Н, Сергеев А Н Изучение восприимчивости клеток-мишеней и активности фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии Вестник РАМН 2007,(1) 3-8

21 Шишкина Л Н, Киселев С А, Сафатов А С , Демина О К, Скарнович М О, Сергеев А А, Петрищенко В А, Сметанникова М А, Буряк Г А, Сергеев А Н, Дроздов ИГ Оценка эффективности аэрозоля вируса гриппа птиц (субгипа H5N1) Тезисы докладов XIV заседания Рабочей группы «Аэрозоли Сибири», 27-30 ноября 2007, Томск, Россия Томск Институт оптики атмосферы СОР АН, 2007 с 51

22 Демина О К, Киселев С А, Шишкина Л Н, Сафатов А С, Сергеев А А, Сметанникова МА Изучение некоторых особенностей течения гриппа птиц (субгипа H5N1) при респираторном инфицировании кур в эксперименте //Материалы 3-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 7-9 ноября 2007, Новосибирск, Россия, Новосибирск «Сибирский Консилиум», 2007 №7 с 33-34

23 Сергеев А А, Шишкина Л Н, Кабанов А С, Скарнович М О, Демина О К и др Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционносги m vivo //Материалы 3-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» 7-9 ноября 2007, Новосибирск, Россия, Новосибирск «Сибирский Консилиум», 2007 №7 с 76-77

Сергеев Артемий Александрович

' ИЗУЧЕНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА В ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РЕСПИРАТОРНЫХ ОРГАНОВ ДЛЯ ПРОГНОЗА ЕГО ИНФЕКЦИОННОСТИ

INVIVO

Автореф. дисс на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 18.04 2008 Заказ № 30 Формат 60x90/16 Уел печ л 1 Тираж 100 экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Сергеев, Артемий Александрович

Глава Стр.

Обозначения и сокращения

Введение

1 Обзор литературы «Использование первичных культур клеток для изучения инфекционных свойств вирусов»

1.1. Характеристика восприимчивости организма к вирусу гриппа. Методы оценки патогенности и инфекционности вирусов

1.2. Использование модельных животных в вирусологических экспериментах

1.3. Использование первичных и перевиваемых культур клеток для изучения инфекционности вирусов

1.4. Метод прогнозирования ИД50 вируса с использованием первичных культур клеток

1.5. Вирус гриппа, клетки-мишени и механизмы адсорбции и репродукции вируса гриппа в клетках-мишенях

1.5.1. Механизмы адсорбции и репродукции вируса гриппа в клетках-мишенях

1.5.2. Клетки-мишени для вируса гриппа

1.6. Факторы врожденного иммунитета к вирусу гриппа у мышей, крыс, других животных и человека

1.7. Использование первичных культур клеток для научных исследований

2 Материалы и методы

2.1. Вирус и определение его концентрации

2.2. Лабораторные животные

2.3. Получение первичных культур клеток легких и трахеи

2.4. Получение первичных клеточных культур с разным содержанием определенных типов легочных клеток

2.5. Оценка жизнеспособности клеток при длительном культивировании

2.6. Цитологическое исследование

2.7. Изучение кинетики инактивации вируса в дебрисе клеток. Определение константы скорости инактивации вируса

2.8. Определение кинетики репродукции вируса

2.9. Определение 50% инфицирующей дозы вируса для первичной суспензионной культуры клеток легких или трахеи

2.10. Определение продукции (урожайности) вируса для одной клетки

2.11. Определение 50% инфицирующей дозы для легких и трахеи у животных

2.12. Метод прогнозирования ИД

2.13. Проверка адекватности алгоритма прогнозирования

2.14. Получение бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), содержащей внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки (ИФСЭВ)

2.15. Диализ и лиофилизация жидкости, содержащей ИФСЭВ

2.16. Изучение нейтрализующей активности жидкости, содержащей ИФСЭВ крыс, при инфицировании развивающихся куриных эмбрионов вирусом гриппа

2.17. Статистические методы 86 3 Результаты собственных исследований 89 3.1. Разработка методик определения параметров взаимодействия вируса гриппа с клетками трахеи и легких в первичной суспензионной культуре

3.1.1. Оптимизация условий культивирования первичной суспензионной культуры клеток, выделенной из легочной

3.1.2. Разработка методик определения параметров вирус-клеточного взаимодействия с учетом кинетических особенностей репродукции и инактивации вируса гриппа в первичной суспензионной культуре легочных клеток мышей и крыс

3.1.2.1 Определение вероятности продуктивной адсорбции вируса гриппа на восприимчивой клетке

3.1.2.2. Определение урожайности вируса гриппа в клетке (N)

3.1.2.3. Определение константы инактивации вируса (k¡) и длительности стационарной фазы продукции вируса

3.2. Проверка возможности прогнозирования ИД50 вируса гриппа для хозяина

3.2.1. Определение ИД50 вируса гриппа для респираторных органов-мишеней у экспериментальных животных при аэрогенном заражении

3.2.2. Определение параметров вирус-клеточного взаимодействия для клеток легких и трахеи экспериментальных животных в первичной суспензионной клеточной культуре

3.2.3. Изучение вирус нейтрализующей активности внеклеточных ингибирующих факторов, входящих в состав секреторной эпителиальной выстилки, в легких у крыс

3.3. Прогнозирование восприимчивости животных in vivo на основании показателей инфекционности вируса гриппа в клетках легких и трахеи in vitro 124 Заключение 128 Выводы 136 Список использованной литературы

5 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ аид50 - 50% аэрогенная инфицирующая доза вируса

БАЛЖ - бронхоальвеолярная лаважная жидкость

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВАЖ - вирусаллантоисная жидкость

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения вРНК - вирусная рибонуклеиновая кислота

ВГ - вирус гриппа

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дпвх - дипальмитилфосфатидилхолин ж - доля жизнеспособных клеток ид50 - 50% инфицирующая доза вируса

ИФСЭВ - ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки респираторных органов к - кратность отмирания клеток кид50 - 50% клеточная инфицирующая доза

КРД - карбогидрат распознающий домен

КРС - крупный рогатый скот лд50 - 50% летальная доза мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота мел - маннозосвязывающий лектин пвп - противовирусные препараты

ПДзо - 50% доза, вызывающая параличи пкк - первичная культура клеток

РГА - реакция гемагглютинации

РКЭ - развивающийся куриный эмбрион

РНК - рибонуклеиновая кислота

СО РАМН - Сибирское отделение Российской академии медицинских

СП-А, СП-Б - сурфактантные протеины

СПФ ТГАЕ

ТЦПДзо

ФГУНГНЦ

УФ ХАО

ЦНС ЦОД

ЭИД50 о а ка к.

- средняя продолжительность жизни

- свободные от патогенной флоры

- единицы торможения гемагглютинации

- 50% тканевая культуральная инфицирующая доза

- 50% тканевая цитопатогенная доза

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

- ультрафиолетовый

- хорион аллантоисная оболочка

- центральная нервная система

- цитопатическое действие

- 50% эмбриональная инфицирующая доза

- степень разведения факторов сурфактанта относительно их концентраций в легких

- уровень значимости

- коэффициент осаждения аэрозоля

- константа скорости инактивации вируса

- гемагглютинин

- перевиваемая культура клеток почки быка

- перевиваемая культура клеток почки спаниеля

- среднее значение ± ошибка среднего

- урожайность вируса в одной клетке

- нейраминидаза

- вероятность инфицирования организма

- вероятность продуктивной адсорбции вируса на клетке

- объемная скорость дыхания

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivo"

Актуальность исследования. Вирус гриппа является самым известным и распространенным среди вирусов, вызывающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. Грипп представляет собой острое респираторное заболевание, часто с тяжелым течением. Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 млн. случаев тяжелых заболеваний и к 300-500 тыс. случаев со смертельным исходом [CDC, 2005]. Эпидемии гриппа по масштабам распространения заболевания среди населения представляют меньшую угрозу по сравнению с пандемиями, которые охватывают целые континенты, и приводят к огромной смертности среди заболевших [Kamps and Reyes-Teran, 2006]. Продолжающиеся вспышки H5N1 гриппа среди птиц со случаями передачи людям вызывают беспокойство у ученых во сем мире, так как известно, что штамм вируса гриппа (H1N1), вызвавший пандемию в 1918 году, был подобен вирусу гриппа птиц [Kamps and Reyes-Teran, 2006]. Многие эксперты считают, что именно вирус гриппа птиц H5N1 может породить новый пандемичный штамм [Webster et al., 1992; Guan et al., 2004; WHO, 2005; Perdue and Swayne, 2005].

Проблема возникновения смертоносной пандемии или эпидемии гриппа свидетельствует об необходимости создания методов, позволяющих оценивать степень опасности для человека вновь возникающих вариантов вируса гриппа А, в частности, прогнозировать потенциальную степень инфекционности вируса или эквивалентную характеристику - потенциальную степень восприимчивости человека к вирусу гриппа. Кроме того, эффективное противодействие пандемии предполагает не только раннее выявление потенциальных пандемичных вариантов вируса гриппа А, но и определение противовирусных препаратов, способных эффективно защитить человека от гриппа.

Кроме генетических штаммовых особенностей вируса гриппа А восприимчивость организма к нему определяется как специфическими клеточными рецепторами, в состав которых входит сиаловая кислота, так и внеклеточными факторами, ингибирующими (сурфактант) или, напротив, потенцирующими (протеиназы) проникновение вируса в клетки-мишени органов дыхания [Kido et al. 1999; Ito et al., 2000; Matrosovich et al., 2000; Tamura and Kurata, 2004],

В основу разрабатываемого в данной работе метода положен метод прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусу Марбург путем экстраполяции ЛД50 вируса с модельного животного [Чермашенцев В.М. и др., 1993]. Уравнение и схема прогнозирования были выведены, исходя из наиболее общей схемы формирования инфекционного процесса, с учетом того, что инфицирование клетки и продукция новых вирусных частиц являются вероятностными процессами. Система прогнозирования ИД50 для вируса гриппа кроме алгоритма расчетов включает также методики получения первичных клеток и определения параметров вирус-клеточного взаимодействия, которые должны учитывать особенности патогенеза инфекции. В связи с этим в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Задачи исследования:

1. Разработать методы получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток легких и трахеи лабораторных животных.

2. Разработать методы оценки параметров инфекционности вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи лабораторных животных (мышей и крыс).

3. Провести сравнительный анализ показателей инфекционности вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных in vivo и для восприимчивых клеток легких и трахеи in vitro.

4. Оценить возможный вклад внеклеточных защитных (барьерных) факторов выстилки респираторных органов лабораторных животных в формирование их восприимчивости к вирусу гриппа.

5. Сделать прогноз ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных и проверить адекватность разработанной системы прогнозирования путем сравнения прогнозированных и экспериментально определенных величин ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных.

Научная новизна работы. Впервые разработана лабораторная технология получения и культивирования первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи, сохраняющих жизнеспособность и способных продуцировать вирус гриппа в течение трех суток. Впервые разработаны оригинальные процедуры определения показателей восприимчивости к вирусу гриппа для первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи (50% инфицирующей дозы и средней урожайности вируса гриппа в инфицированной клетке).

Впервые показано, что восприимчивость первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи мышей CD-1 и крыс Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro одинакова, но ниже, чем у мышей ICR.

Впервые проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток у мышей CD-I и крыс Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro. Показано, что восприимчивость и вирус-продуцирующая способность реснитчатых клеток при их инфицировании вирусом гриппа in vitro значительно выше, чем восприимчивость и вирус-продуцирующая способность альвеолоцитов 1-го и П-го типов.

Впервые показано, что при инфицировании вирусом гриппа in vivo (1) восприимчивость легких у мышей CD-I выше, чем у крыс Wistar, но ниже, чем у мышей ICR; (2) восприимчивость трахеи у мышей CD-I и крыс Wistar одинакова, но ниже, чем у мышей ICR; (3) у мышей CD-I и ICR восприимчивость легких и трахеи одинакова, тогда как у крыс Wistar восприимчивость трахеи достоверно выше, чем восприимчивость легких.

Впервые разработан и апробирован алгоритм прогнозирования восприимчивости к вирусу гриппа лабораторных животных, характеризуемой величиной ИД50 для респираторных органов (легких и трахеи) при1 инфицировании вирусом гриппа in vivo, и рассчитанной с использованием величины ИД50 для клеток легких и трахеи при инфицировании вирусом гриппа in vitro.

Впервые обнаружено, что прогнозируемая восприимчивость легких к вирусу гриппа у крыс должна быть существенно выше, чем наблюдаемая в эксперименте, то есть прогнозируемая ИД5о была меньше, чем ИД50 для легких, определенная при аэрогенном инфицировании крыс вирусом гриппа, что обусловлено наличием у крыс выраженной вируснейтрализующей активности секреторных факторов бронхоальвеолярной выстилки.

Следовательно, разработанный и апробированный нами алгоритм прогнозирования может быть использован для прогноза восприимчивости ш vivo к вирусу гриппа тех органов, в которых внеклеточные защитные (барьерные) факторы существенно не уменьшают вероятность инфицирования клеток-мишеней.

Практическая значимость работы. Изучение параметров инфекционности вируса гриппа на модельных животных позволит заблаговременно выявлять штаммы, потенциально способные вызывать масштабные эпизоотии. Это даст возможность контролировать эпизоотическую ситуацию в птицеводческих и животноводческих хозяйствах. Параметры вирус-клеточных взаимодействий, полученные с использованием первичных культур клеток респираторных органов животных и человека, совместно с параметрами инфекционности вируса гриппа у модельных животных in vivo, в дальнейшем, после того как будут разработаны методики оценки инфекционности вируса гриппа в первичной культуре клеток легких человека, позволят заблаговременно определять потенциальную восприимчивость человека к новым штаммам вируса гриппа, циркулирующим среди животных и птиц. Предложенный метод прогнозирования в будущем даст возможность; количественно оценивать восприимчивость человека к новым штаммам вируса гриппа животного происхождения до их перехода в человеческую популяцию, и тем самым повысит вероятность раннего выявления пандемичного штамма и ускорит разработку эффективных противоэпидемических мероприятий. Кроме того, после дальнейшего совершенствования методической основы прогнозирования восприимчивости человека к вирусу гриппа, этот метод может быть использован для оценки потенциальной эффективности разрабатываемых противовирусных препаратов для лечения гриппозной инфекции у людей.

Положения, выносимые назащиту: 1. Первичная суспензионная культура клеток легких и трахеи лабораторных животных содержит основные типичные для этих органов клетки, в том числе восприимчивые к вирусу гриппа, и способна продуцировать вирус гриппа при культивировании не менее трех суток.

2. Защитные секреторные факторы бронхоальвеолярной поверхностной выстилки у крыс могут существенно снижать восприимчивость легких к вирусу гриппа при аэрогенном заражении посредством прямого вируснейтрализующего воздействия.

3. Показатели восприимчивости к вирусу гриппа для суспензионных первичных культур легочных клеток лабораторных животных (in vitro) могут быть использованы для прогноза базовой (клеточной) видоспецифической восприимчивости легочных клеток-мишеней к вирусу гриппа in vivo без учета вмешательства внеклеточных факторов бронхоальвеолярной выстилки.

4. Показатели восприимчивости к вирусу гриппа для суспензионных первичных культур клеток трахеи лабораторных животных (in vitro) могут быть использованы для адекватного прогноза восприимчивости трахеи при заражении этих животных вирусом гриппа in vivo.

Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены в десяти докладах и обсуждены на "трех отечественных и четырех зарубежных конференциях:

Biological Medical Defense Conference of prophylaxis and treatment of BW health disorders; Oct 29-30, 2003; Munich, Germany;

Biological Medical Defense Conference; October 20-21, 2004; Munich, Germany;

Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний; Международная конференция; 8-10 сентября 2004; Сосновка, Новосибирская область, Россия;

Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты; Всероссийская конференция; 5-7 октября 2004; Новосибирск, Россия;

Microbes in a changing world; XIII International Congress of Virology; Jul 2328 2005; San Francisco, California, USA;

2-я Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда», 10 - 13 мая 2005, Пущино, Россия;

Biological Medical Defense Conference; October 26-27 2005, Munich, Germany.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных статей, из них 6 - в журнале Вестник РАМН (2004, 2006, 2007) и 2 - на сайте электронного журнала в Интернете ("medline.ru/public/art/tom7/art01 ópdf.phtml, medline.ru/public/art/tom7/art017pdf.phtml).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Сергеев, Артемий Александрович

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток и оригинальные методики определения параметров инфекционности вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи мышей CD1, ICR и крыс Wistar.

2. Показано, что восприимчивость трахеи и легких у мышей CD-I и ICR к вирусу гриппа при аэрогенном инфицировании одинакова, а у крыс Wistar восприимчивость трахеи больше в 14,5 раз, чем восприимчивость легких.

3. Показано, что восприимчивость первичных культур клеток легких и трахеи у мышей CD-I и крыс Wistar к вирусу гриппа одинакова, но ниже в 10 раз, чем восприимчивость первичных культур клеток легких и трахеи мышей ICR.

4. Показано, что изменение процентного содержания макрофагов и нейтрофилов в суспензионных первичных клеточных культурах не влияет на восприимчивость первичных клеточных культур легких и трахеи мышей и крыс к вирусу гриппа.

5. Секреторные факторы эпителиальной выстилки, выделенные из легких у крыс Wistar, обладают нейтрализующей активностью по отношению к вирусу гриппа и могут значимо снижать его инфекционность для восприимчивых клеток.

6. Для легких у крыс Wistar прогнозируемая величина ИД50 вируса гриппа ниже, чем экспериментально измеренная, если в качестве модельных животных использовали мышей CD-I или ICR. t

7. Прогнозируемые и экспериментально измеренные величины ИД50 вируса гриппа для трахеи крыс Wistar совпадали с высокой достоверностью, если в качестве модельных животных использовали мышей CD-I или ICR.

8. Прогнозируемые и экспериментально измеренные величины ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи мышей ICR совпадали с высокой достоверностью, при использовании в качестве модельных животных мышей CD-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вирус гриппа А является наиболее частой причиной эпидемий гриппа [CDC, 2005]. Кроме того, существует угроза возникновения пандемии, способной охватить весь мир, при этом остается не извесным, насколько она будет смертоносной [Kamps and Reyes-Teran, 2006]. Периодические вспышки гриппа H5N1 среди птиц в юго-восточной азии со случаями передачи людям вызывают серьезное беспокойство у специалистов во всем мире [Kamps and Reyes-Teran, 2006]. Полагают, что эффективное противодействие пандемии заключается не только в раннем выявлении потенциальных пандемичных вариантов вируса гриппа А, но и в определении противовирусных препаратов, которые могут надежно защитить человека от выявленных штаммов вируса гриппа [Kamps and Reyes-Teran, 2006].

Важным аспектом предотвращения неблагоприятных - последствий эпизоотии, эпидемии или пандемии гриппа является своевременный прогноз восприимчивости животных или человека к циркулирующим штаммам вируса гриппа. Данная работа посвящена изучению инфекционности вируса гриппа и на уровне клетки-мишени, и на уровне всего организма с целью разработки метода экстраполяции 50% инфицирующей дозы (ИД50) вируса гриппа для какого-либо вида животных на основании данных ИД5о данного вируса для другого вида животных и 50% инфицирующей дозы вируса гриппа для восприимчивых клеток (КИД5о) обоих видов. В перспективе этот метод может быть использован и для прогноза восприимчивости человека к вирусу гриппа.

Величина 50% инфицирующей дозы является количественной мерой инфекционности вирусов и широко используется при их характеризации, в том числе при оценке эффективности профилактических противовирусных препаратов и вакцин. Она также может быть использована для оценки возможности инфицирования животных и человека новыми штаммами вируса гриппа. В данной работе проведена оценка возможности прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусу гриппа на основании данных по восприимчивости первичной культуры клеток органа-мишени методом экстраполяции ИД5о вируса гриппа с одного вида млекопитающих на другой. Теоретическая основа этого метода была ранее сформулирована и проверена для филовируса Марбург [Чермашенцев В.М. и др., 1993]. Для прогнозирования ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи одного животного определяли ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи другого (модельного) животного, а также КИД50 вируса гриппа для культуры клеток легких и трахеи у обоих видов животных. Для вычисления ИД5о хозяина на основании указанных выше параметров использовалась разработанная нами математическая модель.

Первоочередной задачей данного исследования стало получение первичной клеточной культуры респираторных органов лабораторных животных, адекватно отражающих представительство основных восприимчивых к вирусу гриппа клеток этих органов. Первичные культуры клеток человека и животных в настоящее время широко используются для изучения изменений их функциональной активности при влиянии лекарственных препаратов, физических, химических и биологических факторов. Предполагают, что в организме исследуемые клеточные показатели изменяются аналогично экспериментальным данным, полученным in vitro [Condit, 2001; Gambaryan et al., 2004; Sidwell and Smee, 2004].

В работе использованы суспензионные первичные культуры клеток легких и трахеи, которые в более полном составе представлены основными восприимчивыми к вирусу гриппа клетками, чем монослойные культуры, из этих органов. Примененная в работе методика дезагрегации легких и трахеи мышей и крыс позволила получить первичные культуры клеток, которые продуцировали вирус гриппа при культивировании в суспензии. Оценка процентного соотношения различных типов клеток в получаемых суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи мышей и крыс подтвердила стандартность и воспроизводимость процедур выделения дезагрегированных клеток из соответствующих органов.

По результатам экспериментов и с учетом данных литературы была выбрана среда DMEM/F12 с 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки Gold для культивирования суспензионных первичных культур клеток, инфицированных вирусом гриппа [Buchman et al., 2000; Endo et al., 1996; Kuchler, 1977; O'Callaghan et al., 1977; Travis and Salvesen, 1983; Zhirnov et al., 2002]. В серии экспериментов показана способность полученных суспензий первичных культур клеток легких мышей и крыс продуцировать вирус гриппа при культивировании более 48 часов.

Восприимчивость легких и трахеи у мышей и крыс к вирусу гриппа in vivo оценивали ранее разработанным методом [Жуков В.А. и др., 2004]. Показано, что отличия между восприимчивостью легких и трахеи для мышей CD-I и ICR незначимы, а у крыс легкие более резистентные к гриппу, чем трахея. Отличия в восприимчивости трахеи крыс Wistar и мышей CD-I к вирусу гриппа незначимы, в тоже время восприимчивость к вирусу гриппа легких у крыс Wistar достоверно ниже, чем у мышей CD-I и ICR.

Более высокая резистентность к вирусу гриппа легких у крыс связывают с высокой концентрацией факторов, входящих в состав секрета их эпителиальной выстилки по сравнению с концентрацией этих факторов в трахее крыс, а также в легких и трахее у мышей [Митченко В.П., 1959; Митченко В Л. и Горбунова А.С., 1963; Elhalwagi, et al., 1999; Wright, 1997]. Результаты наших исследований подтверждают эти данные.

Клетками-мишенями у грызунов для вируса гриппа являются как реснитчатые клетки, локализованные в эпителиальной выстилке респираторного тракта, так и альвеолоциты I и II типов. Сравнительных данных по восприимчивости к вирусу гриппа различных типов клеток-мишеней в научной литературе не представлено. По-видимому, это связано со сложностью получения таких данных при инфицировании лабораторных животных или органных культур, поскольку альвеолоциты I и II типов и реснитчатые клетки расположены в различных отделах дыхательной системы: реснитчатые клетки - в трахее, бронхах и терминальных бронхиолах, а альвеолоциты - в альвеолярных ходах и альвеолах [Spicer et al., 1983; Chang et al., 1986; Jeffery and Li, 1997].

В настоящее время не установлена роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в формировании более высокой резистетнтности крыс к вирусу гриппа по сравнению с мышами. В доступной литературе отсутствуют публикации, посвященные изучению этой проблемы, которая представляет большой интерес, так как эти клетки являются первым звеном реакции организма на заражение вирусом гриппа [Burleson and Burleson, 2007]. По результатам наших экспериментов было обнаружено, что альвеолярные макрофаги и нейтрофилы в исследованных диапазонах изменения процентного содержания не оказывают достоверного влияния на инфекционность вируса гриппа в первичных суспензионных клеточных культурах легких и трахеи мышей и крыс.

Применение методов адгезии суспензии легочных клеток в пластиковых флаконах в присутствии 10% эмбриональной сыворотки и разделения легочных клеток в градиенте плотности фиколла 1,041 г/см3 позволило получить смеси клеток разных типов, входящих в состав эпителия легких и трахеи мышей CD-I и крыс Wistar. Изучение восприимчивости к вирусу гриппа суспензий первичных культур клеток, содержащих реснитчатые, альвеолоциты I и II типов, макрофаги и нейтрофилы в различных соотношениях, показало, что альвеолоциты I и II типов- у мышей и крыс имеют существенно меньшую восприимчивость и вирус-продуцирующую способность по сравнению с реснитчатыми клетками у этих же животных.

Развитие инфекционного процесса зависит, во-первых, от восприимчивости клеток-мишеней, а во-вторых, от защитного действия клеточных и внеклеточных факторов неспецифического иммунитета в органе-мишени для инфекционного агента [Медуницын Н.В., 2004]. В экспериментах in vitro нами не было обнаружено различий восприимчивости к вирусу гриппа между суспензиями клеток легких и трахеи у крыс, также как и у мышей. Однако в экспериментах in vivo было установлено, что восприимчивость легких к вирусу гриппа у крыс существенно ниже, чем восприимчивость их трахеи. Более того, восприимчивость легких к вирусу гриппа у крыс достоверно ниже, чем у мышей CD-I и ICR. Результаты наших экспериментов не выявили значимого влияния альвеолярных макрофагов и нейтрофилов на восприимчивость суспензии клеток-мишеней к вирусу гриппа, поэтому мы провели оценку возможного вклада внеклеточных факторов неспецифического иммунитета в уменьшение восприимчивости к вирусу гриппа легких у крыс, которое наблюдается in vivo. С этой целью выделили ИФСЭВ из легких у крыс и изучили их нейтрализующее действие по отношению к вирусу гриппа. Было показано, что, действительно, ИФСЭВ, выделенные из легких у крыс, могут почти на порядок снижать инфекционность вируса гриппа после контакта с ними в течение 1 часа при последующем заражении РКЭ.

Известно, что основными внеклеточными факторами неспецифического иммунитета в легких, оказывающими противовирусное действие, являются белки сурфактанта СП-А и СП-D [Hartshorn et al., 1997; Wright, 2004; Sano and Kuroki, 2005]. Опубликованы единичные работы, посвященные изучению концентрации сурфактантных белков СП-А и СП-D в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) у мышей и крыс. Так, концентрация СП-А в БАЛЖ у 6-12 недельных FBV/N мышей составила 11,1±5,3 мкг/кг массы животного [Elhalwagi, et al., 1999]. Количество СП-А в БАЛЖ крыс, по данным разных авторов, составляет 32, 100, 180 мкг/крысу [Wright, 1997]. Также известно, что СП-D у грызунов составляет 12% от концентрации СП-А [Wright, 1997]. Таким образом, в среднем количество СП-А в БАЛЖ крыс составляет 104±74 мкг/крысу. При пересчете количества СП-А в БАЛЖ крыс массой 300 г на кг массы животного получаем 346,6±246,9 мкг/кг массы животного.

В нашей работе были использованы мыши массой 28 г, крысы 212 г; расчетное количество СП-А = 0,31 мкг/мышь, и СП-А = 73,4 мкг/крысу. Площадь поверхности легких мыши массой 28 г = 5,4x0,212 = 0,15 м2. Площадь поверхности легких крысы массой 212 г = 3,3x0,212 = 0,7 м2. Соотношение площади поверхности легких к массе мыши = 5,4 м2/кг; а у л крысы = 3,3 м /кг. [Трахтенберг И.М. и др., 1991]. Соответственно, о содержание СП-А у мышей = 0,31/0,15 = 2 мкг/м ; а содержание СП-А у крыс = 73,4/0,7 = 104,8 мкг/м2 поверхности легких. Таким образом, содержание СП-А на единицу площади поверхности легких у FBV/N мышей в среднем 52,4 раза ниже, чем у крыс. Расчетные данные подтверждают ранее полученные экспериментальные результаты о более низкой вируснейтрализующей активности секреторных факторов эпителиальной выстилки мышей по сравнению с такими же факторами крыс [Митченко В.П. и Горбунова A.C., 1963].

Таким образом, изменение инфекционности вируса гриппа под воздействием внеклеточных факторов неспецифического иммунитета (в т.ч. СП-A и СП-D) в составе лаважной жидкости, полученной путем промывания легких у крыс, показало его достоверное вируснейтрализующее действие, что находится в согласии с ранее полученными данными других исследователей.

На следующем этапе исследования, используя полученные данные о восприимчивости легких и трахеи мышей и крыс, и о восприимчивости первичных культур клеток легких и трахеи этих животных, осуществили проверку адекватности метода прогнозирования восприимчивости хозяина для вируса гриппа. Во всех случаях прогнозирования восприимчивости трахеи величины прогнозируемой и экспериментальной ИД50 отличались незначимо. Также с высокой достоверностью наблюдалось соответствие прогнозируемой и экспериментальной величин ИД50 при использовании данных ИД50 и КИД5о мышей CD-I, а также КИД50 мышей ICR, при пересчете ИД5о для мышей ICR. Как и ожидалось, для легких у крыс прогнозируется более высокий уровень восприимчивости, чем наблюдаемый в действительности, как при пересчете с использованием данных по восприимчивости к вирусу гриппа легких in vivo и легочных клеток in vitro мышей CD-I, так и с использованием аналогичных данных мышей ICR. Это может объясняться различием вирус-нейтрализующей активности секреторных факторов, прежде всего, сурфактанта, в легких у мышей и крыс [Митченко В.П. и Горбунова A.C., 1963; Elhalwagi, et al., 1999; Wright, 1997]. В тоже время прогнозируемая величина ИД50 для трахеи крыс соответствует экспериментально полученной ИД50, что может быть связано с почти полным отсутствием сурфактанта в трахее крыс [Sims and Hörne, 1997]. Слизь, выстилающая поверхность трахеи у крыс, содержит 9±9% сурфактанта и липидов, при этом средние значения содержания липидов для индивидуальных животных изменялись от 4% до 16% [Sims and Hörne, 1997].

Проведенное исследование позволяет заключить, что данные о восприимчивости к вирусу гриппа только самих легочных клеток животного, для которого осуществляется прогноз ИД50, позволяют прогнозировать потенциальную или базовую (клеточную) его восприимчивость к вирусу. Иначе говоря, восприимчивость к вирусу гриппа легочных-клеток мышей совпадает с реальной восприимчивостью их легких к вирусу гриппа. Это соответствует литературным данным ,о низкой эффективности нейтрализующих секреторных факторов эпителиальной выстилки легких этих животных. Однако при наличии в легких эффективных нейтрализующих вирус гриппа факторов, восприимчивость к вирусу гриппа легких in vivo оказывается ниже, чем восприимчивость клеток легких in vitro. В этом случае для прогнозирования реальной восприимчивости легких in vivo в модели "прогнозирования необходимо учитывать активность барьерных факторов неспецифического иммунитета. Это может оказаться доступным при возможности выделения этих факторов и исследования их вирус-нейтрализующей способности в экспериментах in vitro.

Для оценки потенциальной восприимчивости людей к новым штаммам вируса гриппа, предположительно обладающим пандемичным потенциалом, важно оценить именно восприимчивость самих легочных клеток-мишеней человека к вирусу, так как имеются „случаи недостаточности секреторных факторов эпителиальной выстилки, и в частности дефицита сурфактанта, в легких у людей [Власенко A.B. и др., 2005]. Считают также, что дефицит сурфактанта в легких, выработка которого уменьшается при синдроме катаболизма и нарушении питания, способствует увеличению адгезии бактериальных и вирусных патогенов и возникновению инфекционного поражения легких и сепсиса. Не следует исключать и то обстоятельство, что пандемичный штамм вируса гриппа может обладать устойчивостью к действию секреторных факторов эпителиальной выстилки легких, включая факторы сурфактанта. Исходя из всего вышесказанного, прогноз восприимчивости к вирусу гриппа собственно клеток-мишеней в легких может являться наиболее важным лимитирующим звеном в прогностической оценке восприимчивости к вирусу гриппа всего организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Сергеев, Артемий Александрович, Кольцово

1. Абрамов М.Г. Гематологический атлас. М.: Медицина; 1979.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. Издат. Мед. Лит; 1962.

3. Афанасьев Ю.И., Юрина H.A. (ред.) Гистология. М.: Медицина; 2002.

4. Беляков В.Д., Яфаев Р.Х. Эпидемиолгия. М.: Медицина; 1989.

5. Большая Советская энциклопедия. М.: Советская энциклопедия; 1971.

6. Быков В.Л. Частная гистология человека. СПб.: СОТИС; 2001.

7. Власенко A.B., Остапченко Д.А., Мороз В.В., Розенберг O.A., Закс И.О., Линев Д.В. Применение сурфактанта-BL у взрослых больных с острым респираторным дистресс-синдромом. Общая реаниматология 2005; 1 (6): 21-29.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Метод культур тканей в гематологии. Томск: Издательство Томского университета; 1992.

9. Громашевский Л.В., Общая эпидемиология, 4 изд. М.: Медицина; 1965.

10. Данилов Р.К. (ред.) Руководство по гистологии. СПб.: СпецЛит; 2001.

11. Дауэл В.Р., Шилд Г.С. Культивирование вирусов гриппа человка в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинических материалов. В: Кильбурн Э.Д., (ред.) Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина; 1978. с. 281-308

12. Дуглас Р.Г. Грипп у человека. В: Кильбурн Э.Д., (ред.) Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина; 1978. с. 438-92.

13. Игнатьев Г.М. Экспериментальные препараты для профилактики фило-и аренавирусных геморрагических лихорадок диссертация. Кольцово, Новосибирская область: ГНЦ ВБ «Вектор»; 2002.

14. Жемчугов В.Е. Кутырев В.В. Препарат для профилактики и лечения особоопасных инфекционных заболеваний. Патент РФ 2147234. 10 апр. 2000. Бюл. №10.

15. Жуков В.А., Пьянкова О.Г., Рыжиков А.Б., Воробьев A.A. Прогнозирование коэффициента эпидемиологической эффективности профилактических препаратов по данным лабораторных исследований. Вестник РАМН 1996; (10): 36-40.

16. Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976.

17. Кильбурн Э.Д. Эпидемиология гриппа. В: Кильбурн Э.Д., (ред.) Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина; 1978. с. 526- 585.

18. Кингсбери Д.У. Орто-и парамиксовирусы и их репликация. В: Филдс Б.Н., Найп ДМ. (ред.) Вирусология. М.: Мир; 1989; 2: 446-486. .

19. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для медицинских вузов. 3 изд. СПб.: СпецЛист; 2002.

20. Кост Е.А. ред. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М. Медицина; 1979.

21. URL: http://www.pharmateca.ru/cgibin/statvi.pl?sid=:605&mid-1085056570&magid=50&full-l

22. Лебедева О.П. О бактериальных осложнениях гриппозной пневмонии у облученных животных. В: Морозкин Н.И., (ред.) Грипп (сборник научных работ). Выпуск III. Киев: Государственное медицинское издательство УССР; 1959. с. 134-141.

23. Лобзин Ю.В., Козлов С.С., Усков А.Н. (ред.) Руководство по инфекционным болезням с атласом инфекционной патологии. СПб. серия онлайн. 2000 [цитировано 15 марта 2007]. Доступно с: URL: http://www.infectology.ru/RUK/Ruk2000/index.aspx.

24. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология. М.: Мир; 1981.

25. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. М.: Товарищество научных изданий КМК; 1998.

26. Маянский А.Н. Микробиология для врачей. Нижний Новгород: Издательство НГМА; 1999.

27. Медуницын Н.В. Вакцинология. 2-е изд. М.: Триада-Х; 2004.

28. Мечников И.И. Невосприимчивость к инфекционным болезням. 2 изд. М.: Медгиз; 1947.

29. Мейхи Б. ред. Вирусология. Методы. М.: Мир; 1988.

30. Митченко В.П. Адсорбция вируса гриппа на клетках респираторного тракта. В: Морозкин Н.И., (ред.) Грипп (сборник научных работ). Выпуск III. Киев: Государственное медицинское издательство УССР; 1959. с. 178-185.

31. Надлежащая клиническая практика Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52379-2005 Москва 2005.

32. Перадзе Т.В., Фридман Э.А., Шилд Д. Противогриппозные профилактические препараты. М,: Медицина; 1986.

33. Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации Стандарт отрасли 42-511-99 Утвержден Минздравом России от 29 декабря 1998 года.

34. Пшеничнов В.А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. М.: Медицина; 1974.

35. Пьянков О.В. Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г. Чепурнов A.A. Экспериментальная лихорадка Эбола у макак резусов. Вопр Вирусол 1995; 40(3): 113-115.

36. Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы медицинской иммунологии. М.: Мир; 2006.

37. Ройзман Б. Размножение вирусов: общие представления. В: Филдс Б.Н. и Найп Д.М., (ред.) Вирусология. М.: Мир; 1989; 1: 124-137.

38. Ройзман Б., Баттерсон У. Герпесвирусы и их репликация. В: Филдс Б.Н. Найп Д.М., (ред.) Вирусология. М.: Мир; 1989; 3: 186-245.

39. Себер Дж. Линейный регрессионный анализ. М.: Мир; 1980.

40. Сергеев А.Н., Жуков В.А., Порываев В.Д., Пьянков О.В., Шишкина Л.Н., Петрищенко В.А., Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Сафатов A.C.s

41. Разработка простого метода прямой оценки наличия инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа. Вопр вирусол 2002; (4): 44-46.

42. Сергеев A.A., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Шишкина Л.Н., Кочнева Г.В., Максимов В.А и др. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности рекомбинантной бивакцины против оспы и гепатита В на людях. Вопр вирусол 2004; (5): 22-26.

43. Скрипченко A.A., Рябчикова Е.И., Воронцова JI.A., Шестопалов A.M., Вязунов С.А. Вирус Марбурга и мононуклеарные фагоциты: изучение взаимодействий. Вопр Вирусол 1994: 39 (5): 214-18.

44. Скрипченко A.A., Шестопалов А. М. и Ярославцева О.И. Сравнительное изучение взаимодействия вируса Марбург с макрофагами из различных видов животных in vitro. Вопр Вирусол 1991; 36 (6): 503-506.

45. Сметанникова М.А., Шишкина JI.H., Жуков В.А., Фанкин И.В., Сергеев

46. A.A., Скарнович М.О., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Бондаренко

47. B.Н., Сергеев А.Н., Воспиимчивость клеток-мишеней и активность фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии. Вестник РАМН 2007; (1): 3-8.

48. Сметанникова М.А., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A., Фанкин И.В., Булычев Л.Г., Колесникова Л.В., Омигов В.В., Малкова Е.М.,t

49. Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Жуков В.А. Влияние глюкокортикоидной иммуносупрессии на течение, экспериментальной гриппозной инфекции. Вестник РАМН 2006; (6): 22-27,

50. Смородинцев A.A. Грипп и его профилактика. Л.: Медицина; 1984.

51. Сугиура А. Генетика вируса гриппа: из Э.Д. Кильбурн (ред.) Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина; 1978. с. 206-251.

52. Трахтенберг И.М., Сова P.E., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. Проблема нормы в токсикологии. 2 изд. М.: Медицина; 1991.

53. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир; 1975.

54. Хабриева Р.У. ред. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина; 2005.

55. Чермашенцев В.М., Жуков В.А., Марьясов А.Г., Сафатов A.C. Некоторые теоретические подходы к оценке эффективности противовирусных препаратов. Вестник РАМН 1993;(9):3-7.

56. Шефе Г. Дисперсионный анализ. М.: Наука; 1980.

57. Шолтиссек К., Кленк Х.-Д. Репликация вируса гриппа. В: Э.Д. Кильбурн (ред.) Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина; 1978. с. 252-280

58. Шоппин П.В., Компанс Р.В. Структура вируса гриппа. В: Кильбурн Э.Д. (ред.) Вирусы гриппа и грипп. М.: Медицина; 1978. с. 33-74.

59. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. М.: Медицина; 1999.

60. Шульц И.Т. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин. В: Кильбурн Э.Д. (ред.) Вирусы гриппа и грпп. М.: Медицина; 1978. с. 75-108.

61. Ada G. L., Jones P. D. The immune response to influenza infection. Curr Top Microbial Immunol 1986; 128: 1-54.

62. Air G.M., Laver W.G. The neuraminidase of influenza virus. Proteins 1989; 6(4): 341-56.

63. Alexander D.J. A review of avian influenza in different bird species. Vet Microbiol 2000 May; 22(74): 3-13.

64. Alexander D.J., Brown I.H. Resent zoonoses caused by influenza A viruses. Rev Sci Tech 2000; 19(1): 197-225.

65. Alford RH, Kasel JA, Gerone PJ, Knight V. Human influenza resulting from aerosol inhalation.Proc Soc Exp Biol Med. 1966 Jul; 122(3): 800-4.

66. Andervont H.B. Activity of herpetic virus in mice. J Infect Dis 1929; 44: 383393.

67. Auerbach R., Grobstein C. Inductive interaction of embryonic tissues after dissociationand reaggregation. Exp Cell Res 1958; 15: 384-397.

68. Austin F.J., Webster R.G. Antigenic mapping of an avian HI influenza virus haemagglutinin and interrelationships of HI viruses from humans, pigs and birds. J Gen Virol 1986; 67(Pt 6): 983-992.

69. Azoulay-Dupuis E., Lambre C.R., Soler P., Moreau J., Thibon M. Lung alterations in guinea-pigs infected with influenza virus. J Comp Pathol 1984 Apr; 94(2): 273-83.

70. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans les cultures in vitro de deux souches cellularis en association de cellules de caractere "hybride". CR Acad Sci D. Paris 1961; 251: 1825.

71. Bastacky J., Lee C.Y., Goerke J., Koushafar H., Yager D., Kenaga L., Speed T.P., Chen Y., Clements J.A. Alveolar lining layer is thin and continuous: low-temperature scanning electron microscopy of rat lung. J Appl Physiol 1995; 79(5): 1615-28.

72. Bean W.J., Cox N. J., Kendal A.P. Recombination of human influenza A viruses in nature. Nature (London) 1980; 284(5757): 638-640.

73. Bean W.J., Simpson R.W. Primary transcription of the influenza virus genome in permissive cells. J Virology 1973; 56: 646-651.

74. Benne C.A., Kraaijeveld C.A., van Strijp J.A., Brouwer E., Harmsen M., Verhoef J., van Golde L.M., van Iwaarden J.F. Interactions of surfactant protein A with influenza A viruses: binding and neutralization. J Infect Dis 1995 Feb;171(2):335-41.

75. Biron C.A., Nguen K.B., Pien G.C., Cousens L.P., Salazar-Mather T.P. Natural killer cells in antiviral defence: function and regulation by innate cytokines. Annu Rev Immunol 1999; 17:189-220.

76. Bornstain M.B., Murray M.R. Serial observations on patterns of growth, myelin formation, maintance and degeneration in cultures of newborn rat and kitten cerebellum. J Biophys Biochem Cytol 1958; 4: 499.

77. Boyce S.T., Hansbrough J.F. Biologic attachment growth, and differentiation of cultured human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chondroitin-6-sulfate substrate. Surgery 1988; 103:421-431.

78. Brookes S.M., Parsons G., Johnson N., McElhinney L.M., Fooks A.R. Rabies human diploid cell vaccine elicits cross-neutralising and cross-protectingimmune responses against European and Australian bat lyssaviruses. Vaccine 2005;23:4101-4109.

79. Bryan W.R., Beard J.W. Host influence in the characterization of response to the papilloma protein and to vaccinia virus. J Infectious Diseases 1940; 67: 524.

80. Buchman C.A., Fregien N. Influenza A Virus Infection of Human Middle Ear Cells In Vitro. Laringoscope 2000; 110: 1739-1744.

81. Buller R.M., Straus S.E.,Rose J.A. Mechanism of host restriction of adenovirus-associated virus replication in African green monkey kidney cells. J Gen Virol 1979 Jun; 43(3): 663-72.

82. Burleson G.R., Burleson F.G. Influenza virus host resistance model. Methods 2007 Jan; 41 Issue 1:31-37.

83. Burt A.M., Pallet C.D., Sloane J.P., O'Hare M.J., Schafler K.F., Yardeni P., Eldad A., Clarke J.A., Guesterson B.A. Survival of cultured allografts in patients with burns assessed with probe specific for Y chromosome. Br Med J 1989; 298: 915-917.

84. Campbell D., Sweet C. and Smith H. Comparisons of Virulence of Influenza Virus Recombinants in Ferrets in Relation to their Behaviour in Man and their Genetic Constitution. J Gen Virol 1979; 44: 37-44.

85. Capua I., Alexander D.J. Avian influenza and human health. Acta Trop 2002; 83(1): 1-6.

86. Carrel A. On the permanent life of tissues outside the organism. J Exp Med 1912; 15:516-528.

87. Cavanagh D., Collie M. H., Sweet C., Smith H. Production and release of influenza virus from fresh and maintained organ cultures of ferret neonatal lung. FEMS Microbiology Letters 1979 Jun; 5: 431-433.

88. Centers for Disease Control (CDC). Prevention and control of influenza „ recommendations of the advisory committee on immunization practices

89. ACIP). MMWR serial online. 2005 [cited 2007 Apr 26]; 54(RR08): 1-40. Available from: URL:http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5408al.htm

90. Chang L.Y., Mercer R.R., Crapo J.D. Differential distribution of brush cells in the rat lung.The Anatomical Record 1986; 216: 49-54.

91. Choi A.M.K., Jacoby D.B. Influenza virus A infection induces interleukin-8 gene expression in human airway epithelial cells. Federation of European Biochemical Societies (FEBS) 1992 Sept; 309(3): 327-329.

92. Coates D.M., Husseini R.H., Collie M.H., Sweet C., Smith H The role of cellular susceptibility in the declining severity of respiratory influenza of ferrets with age. Br J Exp Pathol 1984 Feb; 65(1): 29-39.

93. Compans R.W., Dimmock N.T., Meier-Ewert H. An electron microscopic study of the influenza virus-infected cell. In.: R.D. Barry & B.W. J. Mahy editors. The Biology of Large RNA Viruses. London: Academic Press; 1970. P. 87-108.

94. Condit R.C. Principles of virology. In: Knipe, D.N. and Howley P.M., editors. Field's virology. 4rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001. p.19-51.

95. Couch RB, Douglas RG Jr,Fedson DS, Kasel JA. Correlated studies of a recombinant influenza-virus vaccine. 3. Protection against experimental influenza in man. J Infect Dis 1971 Nov; 124(5): 473-80.

96. Couch RB, Kasel JA, Gerin JL, Schulman JL, Kilbourne ED. Induction of partial immunity to influenza by a neuraminidase-specific vaccine. J Infect Dis 1974 Apr; 129 (4): 411-20.

97. Crapo J.D., Barry B.E., Foscue H.A., Shelburne J. Structural and biochemical changes in rat lungs occurring during exposures to lethal and adaptive doses of oxygen. Am Rev Respir Dis 1980; 122: 123-145.

98. Cunha G.R. Androgenic effects upon prostatic epithelium are mediated via tropic influences from stroma. In: New Approaches to the Study of Benign Prostatic Hyperplasia. New York: Alan R, Liss; 1984. p. 81-102.

99. Dales S., Choppin P.W. Attachment and penetration of influenza virus. J Virology 1962 Nov; 18: 489-93.

100. Dales S. Early events in cell- animal virus interactions. Bacteriol Rev 1973;37: 103- 135.

101. Daniels M.J., Selgrade M.K., Doerfler D., Gilmour M.I. Kinetic profile of influenza virus infection in three rat strains. Comp Med 2003 Jun; 53(3): 2938.

102. Day A.J., The C-type carbohydrate recognition domain (CRD) superfamily. Biochem Soc Trans 1994; 22: 83-88.

103. Dennis L.W. Tissue-cultured skin grafts. J Burn Care Rehab 1992; 13: 93-94.

104. DFabrizi F., Lunghi G., Dixit V., Martin P. Meta-analysis: anti-viral therapy of hepatitis C virus-related liver disease in renal transplant patients. Aliment Pharmacol Ther 2006 Nov; 24(10):1413-22.

105. Donald H.B., Isaacs A. Counts of influenza virus particles. J Gen Microbiol 1954; 10: 457-464.

106. Dormans JA. The ultrastructure of various cell types in the lung of the rat: a survey. Exp Pathol. 1983; 24(1): 15-33.

107. Dourmashkin R.R., Tyrrell D.A. Attachment of two myxoviruses to ciliated epithelial cells. J Gen Virol 1970 Oct; 9(1): 77-88.

108. Dubois M. F. Localization of the restrictive event of EMC virus replication in semi-permissive monkey and monkey-mouse hybrid cells. J Gen Virol 1977; 37: 115-125.

109. Dybing J.K., Schultz-Cherry S., Swayne D.E. et al. Distinct pathogenesis of Hong Kong -origin H5N1 viruses in mice compared to that of other highly pathogenic H5 avian influenza viruses. J Virology 2000 Feb; 74(3): 14431450.

110. Ebisawa I. T., Kitamoto O., Takeuchi Y., Makino M. Immunocytologic study of nasal epithelial cells in influenza. Am Rev Respir Dis 1969; 99: 507-515.

111. Edwards K.M., Snyder P.N., Stephens D.S., Wright P.F. Human adenoid organ culture: a model to study the interaction of influenza A with human nasopharyngeal mucosa. J Infect Dis 1986 Jan; 153(1): 41-7.

112. Endo Y., Carroll K.N., Ikizler M.R., Wright P.F. Growth of influenza A virus in primary, differentiated epithelial cells derived from adenoids. J Virology 1996 Mar; 70(3): 2055-8.

113. Ferrari M., Scalvini A., Losio M.N., Corradi A., Soncini M., Bignotti E.,

114. Milanesi E., Ajmone-Marsan P., Barlati S., Bellotti D., Tonelli M.i

115. Establishment and characterization of two new pig cell lines for use in virological diagnostic laboratories. J Virological Methods 2003; 107: 205212.

116. Fields B.N. Pathogenesis of viral Infections. In: Emerging Viruses. New York: Oxford Unversity Press; 1993. p.69-78.

117. Fischer-Hoch S.P., Piatt G.S., Neid G.H.,Southee T., Baskerville A., Raymond R.T., Lloyd G., Simpson D.I. Pathophysiology of shock andhemorrhage in fulminating viral infection (Ebola). J Infect Dis 1985; 152(5): 887-894.

118. Franklin R.M., Breitenfeld P.M., The abortive infection of L-cells by fowl plaque virus. J Virology 1959; 8: 293-307.

119. Frederick M.A., Brent R., Kingston R.E., Moore R.E., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. Current Protocols in Molecular biology. New York: John Wiley& Sons; 1993.

120. Freshney R.I. Culture animal cells. 3rd ed. New York: Wiley Liss; 1994.

121. Folkman J., Haudenschild C. Angeogenesis in vitro. Nature 1980; 288: 551556.

122. Fritz R.S., Hayden F.G., Calfee D.P. et al. Nasal cytokine and chemokineresponses in experimental influenza A virus infection: results of a J placebocontrolled trial of intravenous zanamivir treatmen. J Infect Dis 1999;180:586-593.

123. Fujimoto I., Pan J., Takizawa T., Nakanishi Y. Virus clearance through apoptosis-dependent phagocytosis of influenza A virus-infected cells by macrophages. J Virology 2000; 74: 3399-3403.

124. Gambaryan A.S., Tuzikov A.B., Pazynina G.V., Webster R.G., Matrosovich M.N. and Bovin N.V. H5N1 chicken influenza viruses display a high binding affinity for Neu5Aca2-3Galhl-4(6-HS03)GlcNAc-containing receptors. J Virology 2004; 326: 310-316.

125. Gard S. Purification of poliomyelitis viruses, Expiriments on murine'and human strains. ActaMedica Scand 1943; (Suppl): 143.

126. Genzel Y., Fischer M., Reichl U. Serum-free influenza virus production avoiding washing steps and medium exchange in large-scale microcarrier culture. J Vaccine 2006 Apr; 24(16): 3261-72.

127. Gong J., Xu W., Zhang J. Structure and functions of influenza virus neuraminidase. Curr Med Chem 2007; 14(1): 113-22.

128. Goto H., Kawaoka Y. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus. J Microbiology 1998; 95(17): 10224-10228.

129. Green H., Kehinde O., Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76: 5665-5668.

130. Groth F. De St. Viropexis, the mechanism of influenza virus infection. Nature 1948; 162:294- 295.

131. Grunert R.R., Davies W.L., McGahen J.W., Hoffman C.E., Yates R.A. The antiviral activity of labile carbamyl compounds and cyanate against the pseudorabies virus in vivo. J Infectious Deseases 1966; 116: 346-352.

132. Guan Y., Poon L. L. M., Cheung C. Y., et al. H5N1 influenza: A protean pandemic threat. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(21): 8156-8161.

133. Guyton A.C. Measurement the respiratory volumes of laboratory animals. Am J Physiol 1947; 150(1): 70-77.

134. Haller O., Arnheiter H., Lindenmann J. Genetically determined resistance to infection by hepatotropic influenza A virus in mice: effect of immunosupression. Infect Immunol 1976; 13: 844-854. "

135. Halloran M.E., Haber M., Longini I.M., Jr., Struchiner C.J. Direct and Indirect Effects in Vaccine Efficacy and Effectiveness. Am J Epidem 1991; 133(4): 323-331.

136. Hammarland E., Lewis M.W., Hansen S.G. et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nat Med 2003; 9 (9):1131-1136.

137. Hanika A., Larisch B., Steinmann E., Schwegmann-Wessels C., Herrler G., Zimmer G. Use of influenza C virus glycoprotein HEF for generation of vesicular stomatitis virus pseudotypes. J Gen Virol 2005 May; 86(Pt 5): 145565.

138. Hanon N., Simpson J., Eckert H.L. Assessment of Virus Infectivity by the Immunofluorescent and Immunoperoxidase Techniques. J Clin Micrbiol 1975 Mar; 1(30): 324-329.

139. Harris H., Watkins J.F. Hibrid cells from mouse and man: Artificial heterokaryones of mammalian cells from different species. Nature 1965; 205: 640-646.

140. Harrison R.G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol Med 1907; 4: 140-143.

141. Hartshorn K.L., Crouch E.C., White M.R., Eggleton P., Tauber A.I., Chang D., Sastry K. Evidence for a protective role of pulmonary surfactant protein D (SP-D) against influenza A viruses. J Clin Invest 1994; 94: 311-319.

142. Hartshorn K.L., Sastry K., Brown D., White M.R., Okarma T.B., Lee Y.M., Tauber A.I. Conglutinin acts as an opsonin for influenza A viruses. J Immunol 1993; 151:6265-6273.

143. Hartshorn K.L., White M.R., Mogues T., Ligtenberg T., Crouch E., Holmskov U. Lung and salivary scavenger receptor glycoprotein-340 contribute to the host defense against influenza A viruses. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003; 285: L1066-L1076.

144. Hartshorn K.L., White M.R., Shepherd V., Reid K., Jensenius J.C., Crouch E. C. Mechanisms of anti-influenza activity of surfactant proteins A and D: comparison with serum collectins. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 1997; 273: LI 156-L1166.

145. Hatta M., Gao P., Halfmann P., Kawaoka Y. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N 1 influenza A viruses. Science 2001; 293(5536): 1840-1842.

146. Hayden F.G., Fritz R., Lobo M.C. et al. Local and systemic cytokine responses during experimental human influenza A virus infection. Relation to symptom formation and host defense. J Clin Investig 1998; 101: 643-649.

147. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 1961; 25: 585-621.

148. Hers, J.F .P. Disturbances of the ciliated epithelium due to influenza virus. Am RevRespirDis 1966; 93: 162-171.

149. Hers J.F.P., Mulder J. Broad aspects of the pathology and pathogenesis of human influenza. Am Rev Respir Dis 1961 Feb; 83(2 Pt 2): 84-97.

150. Herz C., Stavnezer E., Krug R.M., Gurney T. Influenza virus, an RNA virus, Synthesizes its messenger RNA in the nucleus of infected cells. Cell 1981; 26: 391-400.

151. Hicks J.T., Ennis F.A., Kim E., Verbonitz M. The importance of an intact complement pathway in recovery from a primary viral infection: influenza in decomplemented and in C5-deficient mice. J Immunol 1978; 121: 1437-1445.

152. Hinshaw V.S., Bean W.J., Webster R.G., Sriram G. Genetic reassortment of influenza A viruses in the intestinal tract of ducks. J Virology 1980; 102(2): 412-419.

153. Hirst G. K., Pons M. W. Mechanism of influenza virus recombination. II. Virus aggregation and its effect on plague formation by so- called noninfectious virus. J Virology 1973; 56: 620- 631.

154. Hofmann P., Sprenger H., Kaufmann A., Bender A., Hasse C., Nain M., Gemsa D. Susceptibility of mononuclear phagocytes to influenza A vims infection and possible role in the antiviral response. J Leukoc Biol 1997 Apr;61(4):408-14.

155. Hoppe H.J., Reid K.B.M. Collectins soluble proteins containing collagenous regions and lectin domains - and their roles in innate immunity. J Protein Sci 1994; 3: 1143-1158.

156. Horimoto T., Kawaoka Y. Influenza: Lessons from past pandemics, warnings from current incidents. Nature Reviews. Microbiology 2005; 3(8): 591-600.

157. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses. Clinical Microbiology Reviews 2001; 14(1): 129-149.

158. Horst J., Kluge F., Beyreuther K., Gerok W. Gene transfer to human cells: Transducting phage X plac gene expression in Gm gsangliosidosis fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 1975; 72: 3531-3535.

159. Hoyle L. The entry of myxoviruses into the cell, Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol 1962; 27: 113-121.

160. Huang R.T.C., Rott R., Klenk H.-D. Influenza viruses cause hemolysis and fusion of cells. J Virology 1981; 110: 243-247.

161. Huang R.T.C., Rott R., Klenk H.-D., Kohama T. The function of the neuraminidase in membrane fusion induced by myxoviruses. J Virology 1980; 107:313-319.

162. Ingenito E. P., Mark L., Morris J., Espinosa F. F., Kamm R. D., and Johnson M. Biophysical characterization and modeling of lung surfactant components.! Appl Physiol 1999; (86): 1702-1714.

163. Jeffery P. K., Li D. Airway mucosa: secretory cells, mucus and mucin genes. EurRespir J 1997; 10: 1655-1662.

164. Jessel T.M., Melton D.A. Diffusible factors in vertebrate embryonic induction. Cell 1992; 68:257-270.

165. Johnson R.T. The pathogenesis of herpes virus encephalitis.il. A cellular basis for the development of resistance with age. J ExpMed 1964; 120: 359-379.

166. Johnson R.T., Griffin D.E. Pathogenesis of viral infections. In: Vinken P.J., Bruyn G.W., editors. Handbook of clinical neurology: Infections of the nervous system. New York: North Holland; 1978.

167. Kagi D., Ledermann B., Biirki K. et al. Cytotoxicity mediated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforin-deficient mice. Nature 1994; 369:31-37.

168. Kaiser L., Fritz R.S., Straus S.E., Gubareva L., Hayden F.G. Symptom pathogenesis during acute influenza: interleukin-6 and other cytokine responses. J Med Virol 2001; 64:262-268.

169. Kamps B.S., Reyes-Teran G. Influenza 2006. In: Kamps B.S., Hoffman C., Preiser W., editors. Influenza report 2006, Paris, Cagliari, Wuppertal, Sevilla: Flying publisher; 2006. p. 17-47.

170. Karber G. Beitrag zur kollectiven Behandlung pharmakologischer reihenversuche. Arch Exp Path Pharmak 1931; 162:480-483.

171. Katz J.M., Lu X., Tumpey T.M., Smith C.B., Shaw M.W., Subbarao K. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice. J Virology 2000; 74(22): 10807-10810.

172. Katz J.M., Naeve C.W., Webster R.G. Host cell-mediated variation in H3N2 influenza viruses. J Virology 1987; 156(2): 386-395.

173. Kaufmann A., Salentin R., Meyer R.G., Bussfeld D., Pauligk C., Fesq H., Hofmann P, Nain M, Gemsa D, Sprenger H. Defense against influenza A virus infection: essential role of the chemokine system. Immunobiology 2001 Dec; 204(5): 603-13.

174. Kawaoka Y, Krauss S, Webster RG. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics. J Virol 1989; 63: 4603-8.

175. Kido H., Chen Y., Yamada H., Okumura Y. Host cellular proteases trigger the infectivity of the influenza virus in the airway and brain Nippon Yakurigaku Zasshi. 2003 Jul; 122(1): 45-53.

176. Kida H., Kawaoka Y., Naeve C. W., Webster R. G. Antigenic and genetic conservation of H3 influenza in wild ducks. J Virology 1987; 159(1): 109119.

177. Kido H., Murakami M., Oba K. et al. Cellular proteinases trigger the infectivity of the influenza A and Sendai viruses //Mol. Cells.-1999 (Jun).1. V.30;9(3).-P.235-244.

178. Kido H., Sakaib K., Kishinob Y. and Tashiro M. Pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza A virus. FEBS 1993 May; 322(20):115-119.

179. Kikkava Y., Yoneda K. The type II epithelial cell of the lung. I. Method of isolation. Laboratory Investigation 1974; 30 (1): 76-84.

180. Kilbourne E.D., Horsfall F.L. Studies of herpes simplex virus in newborn mice. J Immunol 1951; 67: 321-329.

181. King R.J., Clements J.A., Surface active materials from dog lung. I. Method of isolation. Am J Physiol 1972; 223: 707-714.

182. Kingsbury A., Gallo V., Woodhams P.L., Balazs R. Survival, morphology and adhesion properties of celebellar interneurons cultured in chemically defined and serum-supplemented medium. Dev Brain Res 1985; 17: 17-25.

183. Kingsman S.M., Sweet C., Toms G.L., Smith H. The differential susceptibilities to infection with influenza virus of fresh and maintainedorgan cultures of ferret urogenital, foetal and noenatal tissues. FEMS Microbiology Letters 1977 Nov; 2: 251-253.

184. Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Biodorn J. Activation of influenza virus by tripsin treatment. J Virology 1975; 68: 426-439.

185. Koch A. L. Encounter efficiency of coliphage- bacterium interaction. Biochim Biophys Acta 1960; 39: 311-318.

186. Kohler G., Milstein C. Contineus cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-497.

187. Kopf M., Abel B., Gallimore A., Carroll M., Bachmann M.F. Comlement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nat Med 2002; 8: 373-378.

188. Koss L.G. Diagnostic cytology and its histopathologic bases. PhiladelphiaToronto: J.B.Lippincott Company; 1979.

189. Kuiken T., Rimmelzwaan G. F., van Amerongen G., Osterhaus A. D. M. E. Pathology of Human Influenza A (H5N1) Virus Infection in Cynomolgus Macaques (Macaca fascicularis). Vet Pathol 2003; 40: 304-310.

190. Kuchler R.J. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology. Stroudsburg, Pennsylvania: Dowden, Hutchingson & Ross Inc; 1977.

191. Kuroki Y., Akino T. Pulmonary surfactant protein A (SP-A) specifically binds dipalmitoylphosphatidylcholine. J Biol Chem 1991; 266: 3068-3073.

192. Kuroki, Y., Gasa S., Ogasawara Y., Makita A., Akino T. Binding of pulmonary surfactant protein A to galactosylceramide and asialo-GM2. Arch Biochem Biophys 1992a; 299: 261-267.

193. Kuroki Y., Gasa S., Ogasawara Y., Shiratori M., Makita A., Akino T. Binding specificity of lung surfactant protein SP-D for glucosylceramide. Biochem Biophys Res Commun 1992b; 187: 963-969.

194. Kuroki Y., Voelker D.R. Pulmonary surfactant proteins. J Biol Chem 1994; 269: 25943-25946.

195. Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication. In: Knipe, D.N. and Howley P.M. editors. Field's virology. 4rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001. p.1487-1531.

196. Larski Z. Diagnostyka wirusologiczna chorobzwierzat. Warszawa: Pacst.Wydaw.Rol.i Lerane; 1977.

197. Lawson P.R., Reid K.B.M. The roles of surfactant proteins A and D in innate immunity. Immunol Rev 2000; 173: 66-78.

198. Lazarowitz S.G., Choppin P.W. Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide, J Virology 1975; 68 (2): 440-454.

199. Lazarowitz S. G., Goldberg A. R., Choppin P. W. Proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide of influenza virus. Function of the uncleaved polypeptide HA. J Virology 1973; 52(1): 199-212.

200. Lazzari S, Stohr K. Avian influenza and influenza pandemics. Bull World Health Organ 2004; 82: 242.

201. Lemercier G., Mavet S., Burckhart M.F., Fontanges R. "In vitro" interactions between influenza virus and mouse lung alveolar macrophages. Ann Microbiol (Paris) 1979 Jan; 130 A(l): 119-32.

202. Lennette E.H., Koprowski H. Influence of age on the susceptibility of mice to infection with certain neurotropic viruses. J Immunol 1944; 49: 175-191.

203. LeVine A. M., Whitsett J. A., Hartshorn K. L., Crouch E. C., Korfhagen T. R. Surfactant Protein D Enhances Clearance of Influenza A Virus from the Lung In Vivo. J Immunol 2001; 167: 5868-5873.

204. Levitt N.H., Crowell R.L. Comparative studies of the regeneration of HeLa cell receptors for poliovirus T1 and coxsackievirus B3. J Virology 1967 Aug; 1(4): 693-700.

205. Lindenmann J. Inheritance of resistance to influenza virus in mice. Proc Soc Exp Biol Med 1964; 116: 506-509.

206. Lindenmann J., Deuel E., Fanconi S., Haller O. Inborn resistance of mice to myxoviruses: macrophages express phenotype in vitro. J Exp Med 1978; 147: 531-540.

207. Lindenmann J., Lane C.A., Hobson D. The resistance A2G mice to myxoviruses. J Immunol 1963; 90: 942-951.

208. Littlefield J.W. Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science 1964; 145: 709-710.

209. Lopez C. Genetics of natural resistance to herpesvirus infection in mice. Nature 1975; 258: 152-153.

210. Lu X., Tumpey T.M., Morken T., Zaki S. R., Cox N. J., Katz J. M. A Mouse Model for the Evaluation of Pathogenesis and Immunity to Influenza A (H5N1) Viruses Isolated from Humans. J Virology 1999 July; 73(7): 59035911.

211. Maassab H.F.The propagation of multiple viruses in chick kidney cultures. Proc Natl Acad Sci U S A 1959 July; 45(7): 1035-1039.

212. Mahy B.W.J. A Dictionary of Virology. San Diego, California: Academic Press; 1997.

213. Mahy B.W.J., Hastie N.D., Armstrong S.J. Inhibition of influenza virus replication by a-amanitin : Mode of action. Natl Acad Sci USA 1972; 69: 1421-1424.

214. Mak N„ Leung C., Wei X., Shen X., Wong R. N., Leung K., Fung M. Inhibition of RANTES expression by indirubin in influenza. Biochemical Pharmacology 2004; 67: 167-174.

215. Mak N.K., Leung K.N., Ada G.L. The generation of "cytotoxic" macrophages in mice diring infection with influenza A or Sendai virus. Scand J Immunol 1982; 15: 553-561.

216. Maniatis T., Hardison R. C., Lacy E., Lauer J., O'Connell C., Quon D., Sim G.K., Efstradiadis A. The isolation of structural genes from libraries of eukaryotic DNA. Cell 1978; 15: 687-701.

217. Marchesi V.T., Jackson R.L., Segrest J.P., Kahane I. Molecular features of the major glycoprotein of the human erythrocyte membrane. Fed Proc 1973 Aug; 32(8): 1833-7.

218. Marcus P.I. Dynamics of surface modification in myxovirus-infected cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1962; 27: 351-65.

219. Matrosovich M.N., Matrosovich T.Y., Gray T., Roberts N.A., Klenk H.D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. PNAS 2004; 101(13): 4620- 4624.

220. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Websfer R. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties. J Virology 1999; 73(2): 1146-1155.

221. McGraw P.A., Ikizler M.R., Aiyegbo M., Wright P.F. International Congress Series 1263 2004; 477: 476^180.

222. McKimm-Breschkin J.L. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors: a review. Antiviral Res 2000; 47(1): 1-17.

223. Mercer R.R., Russel M.L., Roggli V.L., Crapo J.D. Cell number and distridution in human and rat airways. Am J Respir Cell Mol Biol 1994; 10(6): 613-624.

224. Merril C.R. Bacterial virus gene expression in human cells. Nature 1971; 233: 398-400.

225. Minna I., Glazer D., Nirenberg M. Genetic dissection of neural properties using somatic cells hybrids. Nature New Biol 1972; 235: 225-231.

226. Mohler L., Flockerzi D., Sann H., Reichl U. Mathematical model of influenza A virus production in large-scale microcarrier culture. J Biotechnol Bioeng 2005 Apr; 90(1): 46-58.

227. Mogensen S.C. Biological conditions influencing the focal necrotic hepatits test for differentiation between herpes simplex virus types 1 and 2. Acta Pathol Microbiol Scand Sect 1976; 84: 154-158.

228. Mogensen S.C. Genetics of macrophage-controlled resistance to hepatitis induced by herpes simplex virus type 2 in mice. Infect Immun 1977; 17: 268273.

229. Mogensen S.' C. Role of Macrophages in Natural Resistance to Virus Infections. Microbiological reviews 1979 Mar; 43(1): 1-26.

230. Monteiro J.M., Harvey C., Trinchieri G. Role of interleukin-12 in primary influenza virus infection. J Immunol 1998; 72:4825-4831.

231. Morgan C., Rose H. M. Structure and development of viruses as observed in the electron microscope. VIII. Entry of influenza virus. J Virol 1968; 2: 925936.

232. Morgan J.E., Moore S.E., Walsh F.S., Partridge T.A. Formation of skeletal muscle in vivo from the mouse C2 cell line. J Cell Sci 1992; 102: 779-787.

233. Muraki Y., Washioka H., Sugawara K., Matsuzaki Y., Takashita E., Hongo S. Identification of an amino acid residue on influenzae virus Ml protein responsible for formation of the cord-like structures of the virus. J Gen Virol 2004; 85: 1885-1893.

234. Murata Y., Kuroki Y., Akino T. Role of the C-terminal domain of pulmonary surfactant protein A in binding to alveolar type II cells and regulation of phospholipid secretion. Biochem J 1993; 291: 71-76.

235. Murphy B.R., Webster R.G. Orthomyxoviruses. In: Field B.N. Knipe D.N., et al. editors. Virology. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers; 1996. 1397-1445.

236. Naeve C.W., Hinshaw V.S., Webster R.G. Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus. J Virology 1984; 51(2): 567-569.

237. Ogasawara Y., Kuroki Y., Akino T. Pulmonary surfactant protein D specifically binds to phosphatidylinositol. J Biol Chem 1992; 267: 21244— 21249.

238. Ogston A. G. On uncertainties inherent in the determination of the efficiency of collision between virus particles and cells. Biochim Biophys Acta 1963; 66:279-281.

239. Ottolini M.G., Blanco J.C., Eichelberger M.C., Porter D.D., Pletneva L., Richardson J.Y., Prince G.A. The cotton rat provides a useful small-animal model for the study of influenza virus pathogenesis. J General Virology 2005; 86: 2823-2830.

240. Palese P., Tobita K., Ueda M., Compans R. W. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. J Virology 1974 Oct; 61(2): 397-410.

241. Parker R.F., Rivers T.M. Immunological and chemical investigations of vaccine virus. J Exp Med 1936; 64: 439-452.

242. Pasteur L., Chamberland C., Roux E. Physiologie experimentale: nouvelle communication sur le rage. CR Acad Sci 1889; 98: 457- 468.

243. Paulson, J.C., Interaction of animal viruses with cell surface receptors. In: Corn, M. editors. Receptors. Orlando: Academic Press; 1985; 2: 131-219.

244. Perdue M.L., Suarez D.L. Structural features of the avian influenza virus hemagglutinin that influence virulence. Veterinary Microbiology 2000; 74(1-2): 77-86.

245. Persson A.V., Gibbons BJ, Shoemaker J.D., Moxley M.A., Longmore W.J. The major glycolipid recognized by SP-D in surfactant is phosphatidylinositol. Biochemistry 1992; 31: 12183-12189.

246. Peto S.A. Dose-response Equation for the Invasion of Microorganism, Biometrics 1953; 9(9): 320-335.

247. Philipson L., Lonberg- Holm K., Petterson U. Virus- receptor interaction in an adenovirus system. J Virology 1968; 2: 1064- 1075.

248. Piazza F.M., Carson J.L., Hu S.C., Leigh M.W. Attachment of influenza A virus to ferret tracheal epithelium at different maturational stages. Am J Respir Cell Mol Biol 1991 Jan; 4(1): 82-7.

249. Pinkerton K.E., Barry B.E., O'Neil J.J., Raub J.A., Pratt P.C., Crapo J.D. Morphologic lung changes in the lifespan of Fisher 344 rats. Am J Anat 1982; 164: 155-174.

250. Pison U., Wright J.R., Hawgood S. Specific binding of surfactant protein SPA to rat alveolar macrophages. Am J Physiol 1992; 262: L412-L417;

251. Prather S.O., Taylor M.W. Host-dependent restricton of mengovirus replication. III. Effect of hos restriction on late viral RNA synthesis and viral maturation. J Virology 1975; 15: 872-881.

252. Reading P.C., Morey L.S., Crouch E.C., Anders E.M. Collectin-mediated antiviral host defense of the lung: evidence from influenza virus infection of mice. J Virology 1997 Nov; 71(11): 8204-12.

253. Reed L.J., Muench H. A simple method for estimating 50% endpoints. Am J Hyg 1932;27:493-497.

254. Reid AH, Fanning TG, Hultin JV, Taubenberger JK. Origin and evolution of the 1918 "Spanish" influenza virus hemagglutinin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: 1651-6.

255. Rimmelzwaan, G. F., Kuiken, T., van Amerongen, G., Bestebroer, T. M., Fouchier, R. A., Osterhaus, A. D. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model. J Virology 2001; 75: 6687-6691.

256. Riser BL, Maassab HF. Differential interaction of virulent and attenuated influenza virus strains with ferret alveolar macrophages: possible role in pathogenicity. J Infect Dis. 1990 Apr; 161(4):699-705.

257. Ritchey M. B., Palese P., Kilbourne E. D. RNA, s of influenza A, B and C viruses. J Virology 1976; 18: 738 744.

258. Robertson J.S., Bootman J.S., Newman R., Oxford J.S., Daniels R.S., Webster R.G., Schild G.C. Structural changes in the haemagglutinin which accompany egg adaptation of an influenza A (H1N1) virus. J Virology 1987; 160(1): 3137.

259. Rogers G.N., D'Souza B.L. Receptor binding properties of human and animal HI influenza virus isolates. J Virology 1989; 173(1): 317-322.

260. Rohm C., Zhou N., Süss J., Mackenzie J., Webster R. G. Characterization of a novel influenza hemagglutinin, HI 5: criteria for determination of influenza A subtypes. J Virology 1996; 217(2): 508-516.

261. Roy A.M., Parker J.S., Parrish C.R., Whittaker G.R. Early Stages of Influenza Virus Entry into Mv-1 Lung Cells: Involvement of Dynamin. Virology 2000; 267: 17-28.

262. Ruchman I. Virulence of strains of herpes simplex virus for mice. Proc Soc Exp Biol Med 1954; 86: 649-652.

263. Ryabchikova E., Strelets L., Kolesnikova L., Pyankov O., Sergeev A. Respiratory Marburg virus infection in guinea pigs. Arch Virol 1996; 141(11):2177-2190.

264. Ryabchikova E.I., Vorontsova L.A., Skripchenko A.A., Shestopalov A.M., Sandakhchiev L.S. Involvment of internal organs of expiremental animals infected with Marburg desease virus. Biull Eksp Biol Med 1994; 117(4):430-434.

265. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

266. Sano H., Kuroki Y. The lung collectins, SP-A and SP-D, modulate pulmonary innate immunity. Molecular Immunology 2005; 42: 279-287.

267. Schagat T.L., Wofford J.A., Wright J. R. Surfactant Protein A Enhances Alveolar Macrophage Phagocytosis of Apoptotic Neutrophils. J Immunol 2001; 166: 2727-2733.

268. Selgrade M.K., Osborn J.E. Role of macrophages in resistance to .murine cytomegalovirus. Infect Immun 1974; 10: 1383-1390.

269. Seo S.H., Hoffmann E., Webster R.G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat Med 2001; 8: 950-954.

270. Sidwell R, W., Smee D. F. Experimental disease models of influenza virus infections: recent developments. Infect Dis 2004; 1(1): 57-63.

271. Sims D.E., Home M.M. Heterogeneity of the composition and thickness of tracheal mucus in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 1997 Nov; 273: L1036-L1041.

272. Shelkov A., Vogel J.E., Chi 1. Hemadsorbtion (adsorbtion-hemagglutination) test for viral agents in tissue culture with spetial reference to influenza. Proc Soc Exp Biol Med 1958; 97: 802-809.

273. Shortley G., Wilkins J.R. Independent-Action and Birth-Death Models in Experimental Microbiology. Bacteriological Reviews 1965 Mar; 29(1): 102141.

274. Slepushkin V.A., Staber P.D., Wang G., McCray P.B., Jr., Davidson B.L. Infection of Human Airway Epithelia with H1N1, H2N2, and H3N2 Influenza AVirus Strains. Mol Therapy 2001 Mar; 3(3): 395-402.

275. Snyder E.Y., Deitcher D.L., walsh C.,Arnold-Aldea S., Hartweig E.A., Cepko C.L. Multipotent cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell 1992; 68:33-51.

276. Sorieul S., Ephrussi B. Karylogical demonstration of hybritization of mammalian cells in vitro. Nature 1961; 190: 653-654.

277. Spearman C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. Br J Psychol 1908; 2: 227-242.

278. Spicer S.S., Schulte B.A., Thomopoulos G.N. Histochemical properties of the respiratory tract epithelium in different species. Am Rev Respir Dis 1983 Aug; 128(2 Pt 2): S20-6.

279. Steinhauer D.A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. J Virology 1999; 258(1): 1-20.

280. Stein-Streinlein J., Bennet M., Mann M.D., Kumor V. Natural killer cells in mouse lung: surface phenotype, target preference and response to local influenza virus infection. J Immunol 1983; 131: 3699-3704.

281. Stinson S.F., Ryan D.P., Hertweck S., Hardy J.D., Hwang-Kow S.Y., Loosli C.G. Epithelial and surfactant changes in influenzal pulmonary lesions. Arch Pathol Lab Med 1976 Mar; 100(3): 147-53.

282. Stone K.C., Mercer R.R., Freeman B.A. Chang L.Y., Crapo J.D. Distribution of lung cell numbers and volumes between alveolar and nonalveolar tissue. Am Rev Respir Dis 1992; 146(2): 454-456.

283. Strasser P., Unger U.5 Strobl B., Vilas U., Vlasak R. Recombinant viral sialate-O-acetylesterases. Glycoconj J 2004; 20(9): 551-61.

284. Suarez D.L., Schultz-Cherry S. Immunology of avian influenza virus: a review. Developmental and Comparative Immunology 2000; 24(2-3): 269283.

285. Sugiura A., Ueda M. Neurovirulence of influenza virus in mice. I. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains, J Virology 1980; 101: 440- 449.

286. Suzuki Y., Fujita Y., Kogishi K. Reconstitution of tubular myelin from synthetic lipids and proteins associated with pig pulmonary surfactant. Am Rev Respir Dis 1989; 140: 75-81.

287. Suzuki Y., Kato H., Naeve C. W., Webster R.G. Single-amino-acid substitution in an antigenic site of influenza virus hemagglutinin can alter the specificity of binding to cell membrane-associated gangliosides. J Virology 1989; 63(10): 4298^1302.

288. Sweet C., Bird R.A., Howie A.J., Overton H.A., Coates D.M., Smith H. Further studies of the reasons for the lack of alveolar infection during influenza in ferrets. Br J Exp Pathol 1985 Apr; 66(2): 217-31.

289. Sweet C., Cavanagh D., Collie M.H., Smith H. Yields of a virulent and an attenuated clone of influenza virus from organ cultures of ferret nasal tissue: Divergence with time of incubation. FEMS Microbiology Letters 1978 Oct; 4: 191-194.

290. Tamura S., Kurata T. Defense mechanisms against influenza virus infection in respiratory tract mucosa. Jpn J Infect Dis 2004; 57: 236-247.

291. Tateno I., Kitamoto O., Kawamura A.Jr. Diverse immunocytologic findings of nasal smears in influenza. N Engl J Med 1966; 274: 237-242.

292. Theis G., Koprowski H. A cellular basis for virus resistence. Fed Proc 1961; 20: 265.

293. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors. Annu Rev Biochem 1983; 52: 655-709.

294. Turner M.W., The role of mannose-binding lectin in health and disease. Mol Immunol 2003; 40: 423-429.

295. Verilizer J.-L., Allison A.C. Correlation of persistent mouse hepatitis virus (MHV-3) infection with its effect on mouse macrophage cultures. Arch Virol 1976; 50: 279-285.

296. Waterson A.P., Wilkinson L. An introduction to the history of virology. London: Cambridge University Press: 1978.

297. Watson D.H., Russel W.C.,Wildy P. Electron microscopic particle counts on herpes virus using phosphotungstate staining technique. Virology 1963: 19: 250-260.

298. Webster R. G., Bean W. J., Gorman O. T., Chambers T.M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev 1992; 56(1): 152-179.

299. Webster R.G., Laver W.G., Air G. M., Schild G.C. Molecular mechanisms of variation in influenza viruses. Nature 1982; 296(5853): 115-121.

300. Weller N.K., Karnovsky M.J. Isolation of pulmonary alveolar type I cells from adult rats. Am J Pathol 1986; (124): 448-456.

301. Wells M.A., Albrecht P., Daniel S., Ennis F.A. Host defense mechanisms against influenza virus: interaction of influenza virus with murine macrophages in vitro. Infect Immun 1978 Dec; 22(3):758-62.

302. Welsh R.M. Natural cell-mediated immunity during viral infections. Curr Top Microbiol Immunol 1981; 92: 83-103.

303. World Health Organization. WHO Checklist for influenza pandemic preparedness planning, serial online. 2005 Jan 16 [cited 2007 Apr 26]. Available from: URL: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/FluCheck6web.pdf

304. Wright P.F., Webster R.G. Orthomyxoviruses. In: Knipe, D.N. and Howley P.M., editors. Field's virology. 4rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001. p. 1533-79.

305. Wright P.F., Ikizler M., Carroll K. N., Endo Y. Interactions of viruses with respiratory epithelial cells. Seminars in Virology 1996; 7: 227-235.

306. Wright J.R. Host defense functions of pulmonary surfactant. Biol Neonate 2004 Jun; 85(4):326-32.

307. Wright J.R. Immunomodulatory Functions of Surfactant. Physiologycal Reviews 1997 Oct; 77(4): 931-962.

308. Wright J.R., Borchelt J.D., Hawgood S. Lung surfactant apoprotein SP-A (2636 kDa) binds with high affinity to isolated alveolar type II cells. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 5410- 5414.

309. Wright J.R., Wager R.E., Hawgood S., Dobbs L., Clements J.A. Surfactant apoprotein Mr = 26,000-36,000 enhances uptake of liposomes by type II cells. J Biol Chem 1987; 262: 2888-2894.

310. Wyde P.R., Wilson M.R., Cate T.R. Interferon production by leucocyts infiltrating the lungs of mice during primary influenza virus infection. Infect Immun 1982; 38: 1249-1255.

311. Yamamoto N., Urade M. Pathogenic significance of a-N-acetylgalactosaminidase activity found in the hemagglutinin of influenza virus. Microbes Infect 2005 Apr; 7(4):674-81.

312. Yilma T., Zee Y.C., Osebold J.W. Immunofluorescence determination of the pathogenesis of infection with influenza virus in mice following exposure to aerosolized virus. J Infect Dis 1979 Apr; 139(4): 458-64.

313. Young J.F., Palese P. Evolution of human influenza A viruses in nature: Recombination contributes to genetic variation of H1N1 strains. PNAS 1979; 76(12): 6547-6551.

314. Zhang L., Bukreyev A., Thompson C. I., Watson B., Peeples M. E., Collins P. L. and Pickles R. J. Infection of Ciliated Cells by Human Parainfluenza Virus Type 3 in an In Vitro Model of Human Airway Epithelium J Virology 2005 Jan; 79(2): 1113-24.

315. Zhirnov O.P., Ikizler M.R., Wright P.F. Cleavage of influenza a virus hemagglutinin in human respiratory epithelium is cell associated and sensitive to exogenous antiproteases. J Virology 2002 Sep; 76(17): 8682-9.

316. Zitzow L.A., Rowe T., Morken T., Shieh W., Zaki S. and Katz J. M. Pathogenesis of Avian Influenza A (H5N1) Viruses in Ferrets. J Virology 2002 May; 76(9): 4420^1429.

Информация о работе

Сергеев, Артемий Александрович
кандидата медицинских наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivo - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы