Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов

Бондарь, Владимир Станиславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов"

На правах рукописи

БОНДАРЬ Владимир Станиславович

МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ ПОСРЕДСТВОМ ЛИГАНДНОГО ОБМЕНА И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЧАСТИЦ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Красноярск - 2006

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН, г. Красноярск.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

академик РАН И.И.Гительзон ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Н.Е.Судачкова

доктор химических наук, профессор П.В.Миронов

доктор физико-математических наук, профессор Р.Г.Хлебопрос

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт неорганической химии им. А.В.Николаева СО РАН, г. Новосибирск.

Защита состоится « _2006 г. в *^"часов на заседании

диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, (факс: 8 (3912) 433-400, тел.: 8 (3912) 431-579).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан « 9 » ос Пя 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук | ~ Н.С.Кудряшева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последнее время активизировались исследования, направленные на разработку и создание новых технологий выделения и очистки биомолекул. Во многом, этому способствовали успехи, достигнутые за последние 10-15 лет, в молекулярной биологии и генной инженерии. Развитие рекомбинантных технологий привело к тому, что в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка (Ferguson, Goodrich, 2001). Стало возможным получение не только аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов (Kidokoro, 1998). Создание штаммов-продуцентов позволило решить проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для наработки больших количеств изучаемых белков (Глик, Пастернак, 2002). Решение этих вопросов с одной стороны открыло новые возможности получения множества белков в препаративных количествах, с другой - способствовало возникновению и развитию новой ветви молекулярной биологии - протеомики.

В связи с изложенным, разработка и создание новых (адекватных разнообразию решаемых задач) высокоэффективных технологий получения чистых белков приобретает большую актуальность и значимость. Основные усилия направлены на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белковых молекул (Галаев, 1999). Технологии, позволяющие решать такие задачи быстро и с минимальными затратами, не только позволят расширить арсенал известных методов белковой химии. Быстрое получение больших количеств чистых белков будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - расширению спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии (Jackson et al., 1996).

Дель и задачи исследования. Основная цель данной работы формулируется как «Создание новых высокоэффективных технологий разделения и очистки белков, основанных на лигандном обмене и применении частиц детонационных наноалмазов».

Указанная цель достигается выполнением следующих задач:

1. Обосновать и сформулировать общие принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основываясь на обнаруженном эффекте преципитации белковых молекул в растворе под действием ионов двухвалентных металлов с использованием данных о физико-химических свойствах двухвалентных ионов в растворе.

2. Провести экспериментальную оценку возможности практического использования метода ЛОРБ в модельных экспериментах по разделению смеси коммерческих белковых препаратов.

3. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из биомассы бактериальных клеток Е. coli различных рекомбинантных светоизлу-чающих белков: Са2+-активируемых фотопротеинов (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков) и люциферазы морских светящихся бактерий.

4. Основываясь на результатах исследований очистки белков технологией ЛОРБ, предложить общую схему их выделения данным методом.

5. Обосновать возможность применения детонационных наноалмазов (НА) для разделения и очистки белковых молекул, основываясь на данных о физико-химических свойствах частиц, и провести экспериментальную проверку адсорбционных свойств данного материала на модельных белках.

6. Показать возможность применения частиц НА для экспресс выделения и очистки из сложных белковых смесей: а), биолюминесцентных белков (апообелин, люцифераза) из рекомбинантных штаммов-продуцентов Е. coli, б), ферментов из природных источников (глутатионредуктаза из печени быка, ли-зоцим из куриного яйца).

7. Исследовать возможные механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц НА, исходя из экспериментальных данных.

8. Провести проверку возможности создания индикаторных систем, основным элементом которых являются частицы НА, несущие на своей поверхности маркерные люминесцентные белки (обелин, люциферазу).

9. Показать применимость частиц НА как сорбента для колоночной хро-матонграфии обычного давления.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта позволило теоретически обосновать, разработать и предложить новую высокоэффективную технологию разделения и очистки белков, которая пополняет арсенал известных методов, применяемых в биохимии для сепарации белковых молекул, и позволяет без использования хроматографиче-ского оборудования и сорбентов получать высокоочищенные и гомогенные белковые препараты при минимальных временных затратах. Полученные новые знания дополняют и расширяют представления о координационных и лигандо-обменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет общебиологическое значение.

Анализ имеющихся данных о физико-химических свойствах частиц детонационных НА и проведенные исследования позволили обосновать, сформулировать и развить новое научное направление по изучению механизмов взаимодействия частиц НА с белковыми молекулами. Полученные новые знания не только расширяют представления о свойствах этого материала, традиционно используемого в физических, физико-химических исследованиях и технических приложениях, но и открывают новую возможность его изучения и использования в различных областях биологии. Открываются перспективы применения НА в качестве сорбента при разработке новых высокоэффективных технологий выделения и очистки белков и создании сенсорных систем. Исходя из результатов исследований механизмов взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц НА, делается вывод о возможности их применения как универсального сорбента, позволяющего проводить разные типы хроматографий.

Практическая значимость работы.

С помощью метода ЛОРБ разработаны экпресс-технологии выделения и очистки мономерных и полимерных рекомбинантных светоизлучающих белков

(Са2+-активируемые фотопротеины апообелин, апоакворин и их мутанты, а также люцифераза морских светящихся бактерий) из биомассы штаммов-продуцентов Е. coli.

Предложенная принципиальная схема выделения белков технологией ЛОРБ позволяет выбрать стратегию поиска оптимальных вариантов применения данного метода для выделения искомого белка с сохранением его структурно-функциональной организации и свойств.

На основе применения частиц детонационных НА разработаны экспресс-технологии выделения рекомбинантных белков (апообелин, люцифераза) из штаммов-продуцентов Е. coll и ферментов (лизоцим, глутатионредуктаза) из природных источников (куриное яйцо, печень быка).

На твердой подложке получены прототипы люминесцентных сенсорных систем (биочипов), основным элементом которых являются частицы НА, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза), и показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новая высокоэффективная технология разделения и очистки белковых молекул, получившая название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ) и позволяющая исключить из процесса выделения искомого белка оборудование для колоночной хроматографии и сорбенты, что значительно упрощает сам процесс и минимизирует временные затраты на его проведение. Технология основывается на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием ионов двухвалентных металлов за счет образования нерастворимых координационных (хелатных, межмолекулярных) комплексов металл-белох.

2. Разработанные на основе метода ЛОРБ схемы экспресс-очистки рекомбинантных мономерных белков фотопротеинов (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков) и рекомбинантного гетеродимерного белка лю-циферазы из биомассы штаммов-продуцентов бактериальных клеток Е. coli, по-

зволяющие за 1,5-3 часа получать препараты данных белков в высокоочшцен-ном и гомогенном состоянии с выходом 35-45 % и 50-60 % соответственно.

3. Обобщающая схема применения технологии ЛОРБ для выделения и очистки белков, основанная на анализе полученных экспериментальных данных и позволяющая определить оптимальные варианты использования данного метода с учетом индивидуальных свойств выделяемого белка (белков).

4. Разработанные на основе применения частиц НА высокоэффективные технологии выделения и очистки рекомбинантных светоизлучающих белков (алообелин, люцифераза) из биомассы бактериальных клеток Е. coli и ферментов из природных источников (лизоцим из куриного яйца и глутатионредуктаза из печени быка). Данные технологии являются экспрессными и позволяют при наличии исходных экстрактов за 30-60 минут получать указанные белки в вы-сокоочищенном и гомогенном состоянии с выходом от 35 до 60% без применения специализированного хроматографического оборудования.

5. Обоснование возможности применения частиц детонационных НА, как нового универсального материала, для сепарации белковых молекул, позволяющего проводить на нем разные типы хроматографического разделения. Выводы делаются на основании экспериментальных данных выделения и очистки с помощью НА белков, принадлежащих к разным классам ферментов, и анализа возможных механизмов связывания их с поверхностью частиц.

6. Решение физической проблемы, связанной с невозможностью применения НА, как частиц крайне малого размера (4-6 нм), в качестве сорбента для колоночной хроматографии обычного давления. Полученный на основе только частиц НА новый материал, может использоваться как сорбент в колоночной хроматографии обычного давления, что подтверждается экспериментами по адсорбции-десорбции на данном носителе маркерного белка (цитохром С).

Апробация работы и публикации.

Материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены на: V Всесоюзном симпозиуме «Химия и физика белков и пептидов» (Баку, 1980); I Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография» (Вильнюс,

1982); III Всесоюзной межуниверситетской конференции «Физико-химическая биология» (Тбилиси, 1982); III Всесоюзном симпозиуме «Молекулярная жидкостная хроматография» (Рига, 1984); V Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Кобулети, 1985); 14th International Congress of Biochemistry (Prague, 1988, Czechoslovakia); First International School on Biological Luminescence (Wroclaw, 1989, Poland); VII Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Москва, 1991); 7th - 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Banff, Alberta, 1993, Canada; Cambridge, 1994, England; Woods Hole, 1996, USA; Bologna, 1998, Italy; Cambridge, 2001, England); Bioluminescence Symposium (Westin Maui, Hawaii, 1993, USA); III Всероссийской конференции по направлению «Генная и клеточная инженерия» (Москва, 1993); 31st European Marine Biology Symposium (St. Petersburg, 1996, Russia); II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000); 3-й Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нано-технологии» (С.-Петербург, 2001); 12th International Symposium «Thin Films in Electronics» (Kharkov, 2001, Ukraine); HIGH-TECH-2001 (Krasnoyarsk, 2001, Russia); I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); VI Всероссийской конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Томск, 2002); I Международном симпозиуме «Детонационные наноалмазы: получение, свойства и применение» (С.-Петербург, 2003); Всероссийской научно-технической конференции «Ультрадисперсные порошки, наноструктуры, материалы: получение, свойства, применение (Красноярск, 2003); International Conference on Biophotons and Biophotonics (Beijing, 2003, China); NATO advanced research workshop «Synthesis, properties and applications of ultrananocrystalline diamond» (St. Petersburg, 2004); The 9th International Conference on New Diamonds Science and Technology ICNDST-9 (Tokyo, 2004, Japan); NATO advanced research workshop «Innovative superhard materials and sustainable coating» (Kyiv, 2004, Ukraine); The XII Symposium of the

Russia-Japan Medical Exchange (Krasnoyarsk, 2005, Russia); The 6th Pacific Rim Conference on Ceramic and Glass Technology (Kapalua, Maui Hawaii, 2005, USA); The IV-th Moscow International Conference «Theory and Practice of Technologies of Manufacturing Composite Materials and New Metal Alloys Products» (TMCMM) (Moscow, 2005, Russia).

По материалам диссертации опубликовано 49 работ.

Проекты и гранты, в которых автор принимал участие.

Отечественные гранты: Российский Фонд Фундаментальных Исследований (№93-04-21308, №96-0448489, №99-04-48452); Красноярский Краевой Фонд Науки (№ 9F37, № 10F026C, 1F0099, 5F0029).

Международные проекты: INTAS № 97-1754; Bayer AG (Germany); Federal Ministry of Investigation and Technology (Germany) and the Russian Ministry of Science and Technology (Russia); Department of Trade and Industry (DTI, UK); National Institutes of Health (NIH, USA) (HL12186); National Institutes of Health (NIH, USA) (TW00412); Grant NA76RG0119, Project R/B-32 from the National Oceanic and Atmospheric Administration to Washington Sea Grant Program, University of Washington (USA); EC grant ERB IC15-CT96-0103 (The Netherlands); EU contract CHGE-CT94-0061 (The Netherlands); NWO Grant 047.007.021 for Dutch-Russian research cooperation (The Netherlands).

Личный вклад автора.

очистки белков посредством лигандообменных взаимодействий и применения НА. Им лично, или под его непосредственным научным и техническим руководством разрабатывались технологии выделения рекомбинантных светоизлу-чающих белков и белков из природных источников с помощью ионов металлов и частиц НА. Автор принимал личное участие в обработке, систематизации, анализе и интерпретации полученных результатов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и списка литературы, изложенных на 259 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 261 источник, из них 176 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Рассматривается уровень технологий выделения белковых молекул, используемых в современной биохимии. Особое внимание уделено совокупности методов жидкостной колоночной хроматографии, занимающих центральное место среди технологий разделения и очистки белков. Наиболее подробно рассматриваются вопросы, относящиеся к лигандообменой хроматографии и, в частности, ее варианта, адаптированного для выделения и очистки белков.

С позиций возможности применения в биотехнологии в целом и в сепарации беловых молекул, в частности, рассматривается вопрос о частицах детонационных НА. Обсуждается возможность применения данного материала в различных биологических приложениях.

В целом, аспекты, рассматриваемые в обзоре литературы, дают общее представление о направленности исследований, проводимых в представленной работе, и позволяют определить ее место и значение в системе научных дисциплин, изучающих вопросы выделения и очистки белковых молекул.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Для выделения рекомбинантных белков фотопротеиновой группы в работе использованы И11П '-индуцируемые штаммы-продуценты бактериальных клеток Escherichia coli BL21, полученные сотрудниками ИБФ СО РАН Б.А.Илларионовым, С.В.Марковой и В.А.Илларионовой. Культивирование кле-

ток, индукцию синтеза в них искомых белков, сбор и предподготовку полученной биомассы осуществляли по стандартным технологиям, применяемым в этих целях (Illarionov et al., 2000).

Выделение рекомбинантной люциферазы проводили из биомассы бактериальных клеток штамма-продуцента, полученного Б.АЛпларионовым и НА. Тюльковой, любезно предоставленного сектором биотехнологии ИБФ СО РАН.

Дня выделения и очистки маркерных белков хроматографическими методами использовали стандартное оборудование для обычной жидкостной колоночной хроматографии фирм «LKB» и «Pharmacia» (Швеция).

Динамику процессов очистки белков па этапах их выделения контролировали с помощью SDS-электрофореза, проводимого по методу (Laemmli, 1974). В качестве стандартов использовали наборы белков для электрофореза фирмы «Pharmacia Biotech.» (США).

Содержание белка в образцах измеряли методом микроопределения с би-уретовым реактивом (Кочетов, 1971), используя БСА в качестве стандарта. В ряде случаев, при определении белка в конечных препаратах их предварительно обессоливали гель-фильтрацией на колонке с Bio-Gel Р-4.

Активацию белков фотопротеиновой группы синтетическим субстратом (перевод из апоформы в активный фотопротеиновый комплекс) проводили, инкубируя апобелки при 4°С в 20 мМ Трис-НС1-буфере (рН 7,0), содержащем 15 мкМ целентеразина, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ ДТТ (5 мкл аликвоты образца помещали в 100 мкл буфера).

Биолюминесцентную активность светоизлучающих белков (фотопротеины, бактреиальная люцифераза) измеряли с помощью люминометра (модель Б JIM 8801) производства СКТБ «Наука» (Красноярск, Россия), калиброванного по радиоактивному стандарту Гастингса-Вебера. Одна люминесцентная единица составляла 10s фотонов в 1 с. Люминесцентные сигналы регистрировали с помощью самописца фирмы «LKB» (Швеция) (модель 2210).

При оценке активности фотопротеинов реакционная смесь включала 500 мкл 100 мМ Трис-НС1-буфера (рН 8,8), содержащего 10 мМ ЭДТА, и 5 мкл ак-

тивного фотопротеина. Реакцию инициировали впрыскиванием в реакционную смесь 200 мкл 100 мМ Трис-НС1-буфера (pH 8,8), содержащего 100 мМ СаС12.

Люминесцентные показатели фотопротеиновой реакции включали: максимальную интенсивность свечения (Lmllx, оти. ед.); константу псевдопервого порядка спада люминесцентной реакции (к, с"1), рассчитываемую как тангенс угла наклона спада люминесценции (lnL| - lnL2)/Ax; удельную активность (суммарное количество излученных квантов на 1 мг белка) и квантовый выход реакции (Q), определяемый из отношения Ф5р • Мг / А (где Ф5р - удельная активность, Мг - относительная молекулярная масса фермента, А - число Авогадро).

Для измерения люминесцентной активности люциферазы использовали два общепринятых способа: 1 - применение фотовосстановлегшого ФМН-Н2,2 -биферментную реакцию НАДН:ФМН-редуктаза - люцифераза (Гительзон и др., 1984; Бондарь и др.,1988).

Активность глутатионредуктазы определяли спектрофотометрически при 340 нм на приборе фирмы «Shimadzu», Япония (модель UV300) в 100 мМ Трис-НС1 буфере (pH 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА, 1 мМ окисленного глутатиона и 0,2 мМ НАДФН (10-100 мкл аликвоты образца вносили в 1 мл реакционной смеси).

Активность лизоцима, выделенного из белка куриного яйца с помощью НА, оценивали по лизису рекомбинантных бактериальных клеток Е. coli (штамм SL60) с клонированными генами Lux А и В светящихся морских бактерий Photobacterium leiognathi.

В работе использовали образцы НА, синтезированные с незначительными модификациями по методу (Ставер и др., 1984) и полученные от ОФВДМ КНЦ (Красноярск), РФНЦ-ВНИИТФ (Снежинск), ФГУП ФНПЦ «Алтай» (Бийск), ЗАО «Алмазный центр» (С.-Петербург). Применялись также НА, обладающие повышенной коллоидной устойчивостью, которые были получены в ИБФ СО РАН модификацией поверхности наночастиц, производимых ОФВДМ КНЦ и ФГУП ФНПЦ «Алтай» (Бондарь, Пузырь, 2004).

В экспериментах использовали водные суспензии исходных НА, которые готовили в деионизованной воде (>16.7 МОм/см) ультразвуковой обработкой смеси НА-вода, и суспензии модифицированных НА, которые получали простым добавлением деионизованной воды к навеске порошка наночастиц.

Основным оборудованием, используемым при разработке новых технологий, являлись центрифуги фирмы «Beckman», США (модель J21B) и «Eppendorf», Германия (модель 5415D).

В биохимических исследованиях использовали реагенты фирм «Sigma», «Serva», «Fluka», «Aldrich», «Bio-Rad», «Reanal», а также реагенты отечественного производства квалификации «хч» и «чда».

ГЛАВА 3. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ, ПРОВЕРКА ЕГО ПРИМЕНИМОСТИ В МОДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ В экспериментах было обнаружено, что добавление ионов двухвалентных металлов в малых (микромолярные, милимолярные) концентрациях к белковым растворам (грубые экстракты бактериальных клеток Е. coli) сопровождалось преципитацией части белковых молекул, а повышение концентрации иона в растворе приводило к увеличению количества осадка. Наиболее вероятной причиной наблюдаемого эффекта может являться формирование нерастворимых комплексов белка (хелатных или межмолекулярных) при образовании координационных связей белок-металл. Из физической и координационной химии ионов двухвалентных металлов известно (Даванков и др., 1989; Frausto da Silva, Williams, 1991), что катионы переходных и некоторых других металлов, классифицируемые как «мягкие» кислоты (акцепторы электронов), не обладают электронной структурой благородных газов. Обобществляя неподеленную электронную пару донорного атома лиганда, центральный ион металла достраивает свою электронную оболочку до структуры, аналогичной электронной оболочке атома инертного газа. Лиганд характеризуется как нейтральная молекула или анион, связанный с ионом металла координационной связью. Двухвалентные ионы металлов могут реагировать с двумя (линейное расположение), с четырьмя (расположение в одной плоскости или углах тетраэдра при центр аль-

ном размещении иона), или с шестью (расположение в углах октаэдра при центральном размещении иона) лигандами (Малер, Кордес, 1970). «Мягкие» катионы связываются в основном с лигандами, у которых донорами электронов выступают атомы азота и серы. Известно (Даванков и др., 1989), что в молекулах белка роль таких лигандов могут выполнять аминокислотные остатки, прежде всего гистидин, цистеин, триптофан и, в меньшей степени, тирозин и лизин, способные образовывать координационные связи с ионами двухвалентных металлов. Число лигандов, участвующих в образовании комплекса, и стереохимия самого комплекса зависят как от природы иона металла, так и от природы лиганда. Когда катион металла связывается с двумя и более атомами одного ли-ганда, образуется хелатный комплекс. Установлена закономерность, по которой ионы двухвалентных металлов первой переходной серии (ряд Ирвинга-Виль-ямса) и другие двухвалентные катионы образуют комплексы возрастающей стабильности в порядке Са < М§ < Мп < Бе < Со < № « Си > Ъп (Малер, Кордес, 1970; Даванков и др., 1989). Если связь металл-лиганд является лабильной (легко образуется и разрушается), тогда один лиганд может замещать другой.

Основные положения новой технологии разделения и очистки белковых молекул, основанной на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий белок - ион двухвалентного металла формулируются следующим образом:

1. Перевод белка в осадок посредством образования нерастворимого (хе-латного или межмолекулярного) координационного комплекса белок-металл при добавлении ионов двухвалентного металла в белковый раствор. Последовательность преципитации белков будет определяться особенностями их физико-химических свойств (размер белковых молекул, наличие и число дисульфидных связей, количество доступных аминокислотных остатков, участвующих в координации), природой иона и его концентрацией, рН буферной системы. В зависимости от решаемой задачи (выделение индивидуального белка или группы белков) и экспериментальных условий (нативные или денатурирующие условия, буферная система, рН и температура среды и т.д.) используемый ион и его

концентрация являются индивидуальными и в каждом конкретном случае могут быть подобраны эмпирически.

2. Из полученного осадка можно с высокой селективностью экстрагировать выделяемый белок (белки), подбирая условия для разрушения координационного комплекса. Селективность экстракции будет определяться выбором используемого свободного лиганда (или комбинацией нескольких лигандов), его концентрацией, рН применяемого элюента или сочетанием этих факторов. Например, понижение рН элюента будет приводить к протонированию донор-ных групп белка и диссоциации комплекса белок-металл. В качестве свободного лиганда могут быть использованы: аминокислоты (например, гистадии, цис-теин, триптофан), БН-реагенты (в частности, дитиотреитол, р-меркаптоэтанол, восстановленный глутатион), комплексоны (ЭДГА, ЭГТА), имидазол и т.д.

3. Если выделение проводилось в денатурирующих условиях, на этапе лигандообменной экстракции искомого белка из осадка можно проводить его рефолдинг, поскольку элюент может включать необходимые для этого добавки. Денатурирующий агент либо совсем исключается из состава элюента, либо его концентрация снижается до значений, не препятствующих рефолдингу белка.

Обоснованность высказанных положений была проверена в модельном эксперименте. Исследовалась возможность разделения методом ЛОРБ смеси коммерческих маркерных белков, содержащей фосфорилазу Б — 94 кДа, бычий сывороточный альбумин — 67 кДа, яичный альбумин — 43 кДа, карбоангидразу — 30 кДа, соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа и лактальбумин — 14,4 кДа и приготовленной в буфере, содержащем хаотропный агент (6М мочевины). Предполагалось, что у белков, находящихся в денатурирующих условиях, будут экспонированы наружу (или станут более доступными) аминокислотные остатки, способные образовывать координационные связи с ионами двухвалентных металлов. В качестве комплексообразующего иона были использованы ионы кадмия в конечных концентрациях 1 мМ, 3 мМ и 5 мМ соответственно.

Добавка в раствор смеси белков ионов кадмия ни в одной из выбранных концентраций не приводила к образованию белкового осадка. Однако преципи-

тация белков вызывалась ступенчатым снижением концентрации хаотропного агента в растворах, обработанных ионами. Разведение раствора, содержащего 1 мМ кадмия, вызывало переход в осадок практически одного белка - фосфорила-зы Б (Рис. 1А). Аналогичная манипуляция с раствором, содержащим 3 мМ кадмия, приводила к тому, что в осадке, помимо фосфорилазы Б, обнаруживались бычий сывороточный альбумин и лактальбумин (Рис. 1Б). При разведении раствора, содержащего 5 мМ кадмия, наблюдался полный переход в осадок фосфорилазы Б, около трети бычьего сывороточного альбумина, примерно половины лактальбумина, следовых количеств яичного альбумина и ингибитора трип-сипа (Рис. 1В). Во всех вариантах карбоангидраза не образовывала осадка.

В^^Д^Ч г-_— тгу^уул'^-ч-г-.-'Ти-- .- СГ-- ■•?•*■■ Г'^.ТДЗТГ' ¡''Г-'Ц' ГТя |пм7|Г*-''"**ГГ;^^?.. Г' Г!

V . '«• " I и-. - .V. ■ . - • ^ ; ^^^^^^^^^ ■ д| ^ | --1 • .: I . • .V

ИМГ «н* ! «маЬ •ищи ——• Л « л 1|Ц» |1Г" 1-1М.1 I —

>. { Г * ^

f ' f 4 - " ЯШШ N л» «ям» м «ч»

^ii^iiftsi^iSSfs

«•If I Л ' - V)

i JL 12 3 А] * 1 2 3 4

кГ ^ А ^ В

Рис. 1. Электрофореграммы образцов на этапах разделения смеси коммерческих маркерных белков методом ЛОРБ. К: контроль исходной смеси белков в буфере, содержащем 6М мочевины. А: исходная смесь белков (1), обработанная 1 мМ Cd; супернатант (2), полученный после разведения 1:2 исходной смеси буфером, не содержащим мочевину, и удаления образующегося осадка центрифугированием; полученный осадок (3). Б: исходная смесь (1), обработанная 3 мМ Cd; супернатант (2) после разведения 1:2 исходной смеси буфером без хаотропного агента и удаления белкового осадка центрифугированием; элюат (3) после экстракции белков из осадка; осадок (4) после элюции. В: исходная смесь (1), обработанная 5 мМ Cd; супернатант (2) после разведения исходной смеси буфером без мочевины и удаления образовавшегося белкового осадка центрифугированием; элюат (3) после экстракции белков из осадка; осадок (4) после элюции.

Проверка возможности экстракции белков лигандообменным способом показала (Рис. 1Б и 1В), что применение в качестве свободного лиганда SH-реагента дитиотреитола (ДТТ) в концентрации 5 мМ позволяет элюировать из осадков, полученных при разных концентрациях ионов кадмия, белковые фрак-

S Й

»■и

ции разной степени чистоты и состава. При данных условиях лигандообменпо-го замещения в осадке остается только фосфорилаза Б.

В целом, результаты модельного эксперимента подтверждают высказанные положения метода ЛОРБ и свидетельствуют в пользу возможности его применения для сепарации белков из сложных белковых смесей. ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ СВЕТОИЗЛУЧАЮЩИХ БЕЛКОВ

Возможности нового метода иллюстрируются примерами выделения ре-комбинантных апофотопротеинов и бактериальной люциферазы из биомассы бактериальных клеток Е. coli. Выбор белков определялся их значительными различиями в структурно-функциональной организации и физико-химических свойствах. Са2+ -активируемые фотопротеины - светоизлучающие EF-белки, присутствующие в морских кишечнополостных организмах и генерирующие кванты видимого света при взаимодействии с ионами кальция (Blinks et al., 1976, 1982). Белки представляют собой стабильные фермент-субстратные комплексы, состоящие из небольшой односубъединичной молекулы апобелка (около 20 кДа), субстрата (целентеразин) и кислорода. Люциферазы морских светящихся бактерий - гетеродимерные белки (состоят из а и ß субъединиц), имеющие молекулярную массу около 80 кДа (Гительзон и др. 1984).

Известно (Hockney, 1994), что при экспрессии некоторых генов в клетках Е. coli синтезируемые ими рекомбинантные белки накапливаются в виде нерастворимых агрегатов - «телец включения». На этом свойстве основано выделение рекомбинантных белков, в том числе апофотопротеинов (Stulls et al., 1992; Bondar et al., 1995). Общепринятая схема очистки состоит из выделения фракции телец включения после разрушения клеток (ультразвук, пресс Френча), экстракции из нее искомого белка высокими концентрациями хаотропного агента (мочевина, гуанидин-HCl), хроматографической очистки и рефолдинга белка после удаления денатурирующего агента. Очистка, например, апообелина по такой схеме включает несколько хроматографических стадий и занимает по времени не менее 2 суток (Illarionov et al., 2000).

При выделении апообелина методом ЛОРБ экстракцию белков (включая искомый) из биомассы клеток Е. соИ проводят сразу высокими концентрациями хаотропного агента, минуя стадию выделения фракции телец включения. При этом уже в течение 1 часа из бактериальных клеток удается экстрагировать до 95-97% искомого белка. Аналогичные результаты получены при экстракции апоакворина и мутантов апофотопротеинов.

На следующем этапе проверялось воздействие ряда ионов двухвалентных металлов на стабильность апообелина в исходных экстрактах с целью поиска оптимального иона. В осветленный центрифугированием белковый экстракт добавляли ионы Са, N1, Со, С<1, Мп, 2л\, Си до концентрации 1 мМ, образующийся белковый преципитат удаляли центрифугированием и измеряли остаточную активность в супернатанте. Было показано, что добавление в экстракт ионов Со, Са, Мп приводило к образованию незначительного белкового

осадка, а добавка ионов Сё, Си и 2л- более солидного белкового преципитата. Во всех случаях апообелин не переходил в осадок. Повышение концентрации ионов Сё, Си и 7л более 1 мМ сопровождалось переходом искомого белка в осадок и снижением его активности в экстракте. Следует отметить, что активность обелила в экстракте, обработанном ионами кадмия, меди и цинка (1 мМ), возрастала по сравнению с контролем в 2-5 раз (Рис. 2).

Рис. 2. Люминесцентная активность обелина в экстракте без (контроль) и после его обработки ионами двухвалентных металлов в концентрации 1 мМ и удаления образующегося белкового преципитата.

Причина эффекта была установлена при изучении стабильности апобелка в экстрактах от времени и условий их хранения. Было показано, что активность обелина в контрольных экстрактах достаточно быстро снижается при их хранении в течение суток при 4°С и при однократном замораживании при -20°С с последующим оттаиванием. В тоже время, в экстрактах, обработанных, например, ионами С<1 в концентрации 1 мМ и удаления образующегося преципитата, обнаруживается до 86-92% активности обелина после хранения образцов в течение месяца при 4°С и после многократного (7 раз) замораживания - оттаивания.

Поскольку лучший результат был получен с ионами кадмия, они были использованы для выделения апообелина методом ЛОРБ. Исходный экстракт обрабатывают ионами С(1 (1 мМ), а образующийся белковый преципитат, содержащий балластные примеси, удаляют центрифугированием. Выделяемый белок переводят в осадок ступенчатым снижением концентрации хаотропного агента в супернатанте разведением (1:2) буфером, содержащим ионы кадмия (0,5 мМ), и собирают центрифугированием. Необходимость добавки иона в.буфер для разведения и его оптимальная концентрация установлены экспериментально. Без добавки иона апообелин не переходит в осадок полностью (потери составляют до 20-25%), очевидно, из-за диссоциации координационного комплекса белок-металл при разведении. Повышение концентрации иона в буфере для разведения более чем 0,5 мМ увеличивает количество загрязняющих осадок балластных белков. Полученный осадок однократно промывают буфером. На завершающей стадии выделения в качестве свободного лигапда используют ДТТ в концентрации 5 мМ, которая является оптимальной. Осадок ресуспенди-руют в буфере, содержащем свободный лиганд, выдерживают 10-15 минут для полноты элюции искомого белка и удаляют нерастворенные балластные белки центрифугированием. На стадии лигандообменного замещения могут применяться также имидазол, гистидин и Трис (трис(гидроксиметил)аминометан). Показано, что по эффективности действия перечисленные реагенты располагаются в ряду: ДТТ > имидазол > Трис > гистидин.

При формулировании положений метода ЛОРБ отмечалось, что одним из важных параметров является значение рН буферной системы, применяемой на стадии элюции, а также возможное сочетанное действие рН и свободного ли-ганда. В исследованиях было показано, что разрушение координационного комплекса и, как следствие, повышение выхода апообелина в элюат наблюдается только при щелочных значениях рН с резким максимумом при рН 10. Вероятно, наблюдаемый эффект более корректно рассматривать как вариант ли-гандного обмена, происходящего за счет повышения концентрации ОН- групп в среде, выполняющих функцию свободного лиганда. В тоже время, зависивость выхода апообелина при воздействии на хелатный комплекс рН и свободного лиганда (ДТТ) имела совершенно иной характер, что свидетельствует об участии обоих факторов в лигандообменном процесе.

Метод ЛОРБ позволил максимально упростить процедуру очистки апообелина, сократить время его выделения до 2-3 часов и получить практически гомогенный препарат (Рис. 3) с выходом активного белка 35-45%. У белка, выделенного по новой технологии, не наблюдается изменений в способности формировать фермент-субстраный комплекс и характеристиках люминесцентной реакции, по сравнению с белком, полученным по стандартной схеме с применением хроматографических методов (Таблица 1).

•yj.v -т\г!>■ -v.-'V-r.'--У'^'-т.-дс-ч чту-",-. :-•>>-.■

Ш&ШШШШШША

Рис. 3. Динамика очистки рекомбинаотного апообелина из бактериальных клеток Е. coli технологией ЛОРБ. На треках: 1 — исходный экстракт; 2 — экстракт после обработки ионами кадмия; 3 — супернатант после разведения экстракта, обработанного ионами кадмия; 4 — промывка осадка; 5 — финальный препарат. Стрелкой показано положение апообелина.

Таблица 1. Люминесцентные характеристики рекомбинантного обелина, полу_ченного из бактериальных клеток Е. coli разными технологиями._

Параметр Обелин, выделенный хро-матографическими методами Обелин, выделенный методом ЛОРБ

Константа спада люминесценной реакции (к, с'1) 6,5 6,1

Удельная активность, (квант на 1 мг белка) 9,53 • 1015 1,1 • 1016

Квантовый вход люминесценной реакции 0,35 0,42

1ё (ЬЪтах) -6,13 -6,1

Использование метода ЛОРБ позволило столь же эффективно (за 1,5-2 часа) провести очистку рекомбинантного апоакворина и некоторых мутантов апо-фотопротеинов. В целом, выход искомых высокоочищенных белков (Рис. 4-6) был примерно одинаковым и составлял около 35-45%. Для этого были выполнены весьма незначительные модификации схемы, примененной для очистки апообелина. Вероятно, с точки зрения молекулярной биологии и координационной химии такие модификации могут быть вполне объяснимы и в значительной мере прогнозируемы. Выделяемые аиофотопротеины (в том числе мутанты) имеют ряд существенных отличий на молекулярном уровне, которые необходимо учитывать в лигандообменных взаимодействиях. Например, при выделении апоакворина концентрация иона Сё была увеличена до 2 мМ на стадии обработай экстракта. При использовании 1 мМ кадмия не наблюдалось полной преципитации апоакворина на стадии разведения экстракта. Это, очевидно, связано с тем, что апообелин и апоакворин содержат разное (5 и 3 соответственно) количество аминокислотных остатков цистеина (Шагюпоу е1 а1., 1995), которые участвуют в координации ионов металла. Коррекция, внесенная в технологию, позволила получить высокоочищенный апоакворин (Рис. 4).

Рис. 4. Динамика очистки рекомбинантного апоакворина методом ЛОРБ: 1 — исходный экстракт; 2 — супернатант после разведения экстракта, обработанного ионами кадмия; 3,4 — конечные образцы, полученные при элюции с использованием p-меркаптоэтанола и ДТТ соответственно; 5 - маркерные белки.

Замена в молекуле апообелина высоко консервативного цистеина в 158 позиции, играющего важную роль в формировании фермент-субстратного комплекса фотопротеина (Бондарь и др. 2001), на аланин и серин не повлияла сколько-нибудь существенно на эффективность выделения мутантов новой технологией (Рис. 5). Вероятно, этот остаток, участвующий в формировании активного центра белка, экранирован от взаимодействия с ионом металла и не участвует в образовании координационного комплекса. В тоже время, делеции N-концевых участков аминокислотных последовательностей апообелина и апоакворина приводят к тому, что мутанты переходят в осадок уже после добавления 1 мМ иона в исходный экстракт. Это еще больше упрощает процедуру их получения технологией ЛОРБ, поскольку после сбора преципитата центрифугированием сразу проводится стадия элюции. Метод ЛОРБ позволил выделить одновременно 4 мутантных белка за 1-1,5 часа в чистом виде (Рис. 6). Структура «укороченных» фотопротеиновых мутантов является менее стабильной по сравнению со структурой исходных белков, поэтому они легче преципитируют при образовании комплекса металл-белок. Об этом свидетельствуют данные, показывающие, что не только фермент-субстратные комплексы мутантов нестабильны и у них довольно быстро снижается люминесцентная активность, но и апобелки неустойчивы при хранении (Таблица 2).

1 2 3 4 5

Рис. 5. Динамика очистки мутантов апообелина с заменой консервативного Суэ158 на аланин (А-мутант) и серии (Б-мутант) технологией ЛОРБ: 1 - исходный экстракт, содержащий А-мутант; 2 - супернатант после разведения обработанного ионами кадмия экстракта, содержащего А-мутант; 3 - конечный препарат А-мутанта; 4 - конечный препарат Б-мутанта, полученный по аналогичной схеме; 5 - маркерные белки.

■- - "Л1

Рис. б. Электрофореграмма препаратов «укороченных» мутантов апообелина и апоакворина, полученных технологией ЛОРБ: 1-3 — мутанты апоаквори-на (удалено 7, 11 и 15 Ы-концевых аминокислот соответственно); 4 — мутант апообелина (удалено 14 Ы-концевых аминокислот); 5 - маркерные белки.

Таблица 2. Стабильность мутантов акворина (А) и обелина (О), при хранении в виде апобелков и активных фотопротеинов при разных температурах.

Мутант Апобелок (4°С) Фотопротеин (4°С) Фотопротеин (20°С)

А7 81 84 80

АН 71 76 43

А15 53 52 0,3

014 61,5 71,6 0,4

Примечание: Данные представлены в виде процента остаточной активности мутантов через 7 дней хранения. За 100% принята активность свежевыде-ленных мутантов. Числовое значение после буквы соответствует номеру Ы-концевого аминокислотного остатка, с которого начинается укороченная аминокислотная последовательность мутанта.

Столь же эффективно методом ЛОРБ было проведено выделение из биомассы Е. coli рекомбинантного гетеродимерного белка - люциферазы. Использовали штамм-продуцент, клетки которого накапливали синтезируемый искомый белок в цитозольной фракции без образования телец включения (Илларионов, Тюлькова, 1997). Обычно очистку этого белка проводят без денатурирующих агентов по схемам, включающим несколько хроматографических стадий (например, Бондарь и др., 1988) и занимающим по времени не менее 2-3 суток.

Клетки разрушали ультразвуковой обработкой. После удаления клеточного дебриса центрифугированием в экстракт добавляли ионы Cd до концентрации 3 мМ. Образовавшийся белковый осадок, содержащий балластные белки, удаляли центрифугированием, а в супернатанте концентрацию иона повышали до 5 мМ. Вновь образовавшийся преципитат, включающий искомый фермент, собирали центрифугированием и однократно промывали буфером, содержащим 1 мМ кадмия. Добавка иона предотвращает диссоциацию координационного комплекса и потери выделяемого белка. Стадию лигапдообменной элюции проводили с использованием 5 мМ ДАТ. Показано, что в течение 30 минут из осадка удается элюировать до 50-60% искомого белка. По данным SDS-элекгрофореза (Рис. 7), полученный препарат имеет высокую степень чистоты. Вся процедура выделения и очистки занимает не более 1,5 — 2 часов.

1 2

Рис. 7. Электрофореграмма образцов рекомбинантной люциферазы на этапах ее выделения из биомассы клеток Е. coli технологией ЛОРБ. На треках: 1 — исходный экстракт, 2 — финальный препарат. Стрелкой показано положение аир субъдиниц люциферазы.

Анализ результатов проведенных исследований позволил предложить общую схему выделения белков (например, рекомбинантных) методом ЛОРБ (Рис. 8), включающую два наиболее общих возможных варианта.

Клеточная биомасса

Рекомбинантные белки, образующие тельца включения Рекомбинантные белки, не образующие тельца включения

1 4

Разрушение клеток и экстракция белков хаотропным агентом Разрушение клеток в отсутствии хаотропного агента

1 1

"" Добавление хелатарующего иона Получение цкгаэольной фракции

Снижение концентрации хаотропного агента разведением экстракта Добавление хедатирующего нона

Отделение осадха

Промывка осадка

Отделение супернатанта

Дальнейшая доочистка белка с использованием других методов

Элюция

Целевой продукт

Рис. 8. Принципиальная схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ.

В первом варианте предполагается на начальной стадии одновременно разрушать клетки-продуценты и экстрагировать из них белки (включая искомый) высокими концентрациями хаотропного агента. Такой способ может применяться в тех случаях, когда синтезируемый рекомбинантный белок накапливается в клетках-продуцентах в виде «телец включения», однако при условии, что выделяемый белок не претерпевает необратимых изменений под действием хаотропного агента. Следующие стадии включают обработку экстракта ком-плексообразующим ионом для перевода выделяемого белка в осадок и его элюцию из преципитата лигандообменным замещением.

Второй вариант предполагает экстракцию белков из клеток штамма-продуцента механическим их разрушением (ультразвук, пресс Френча) в буферной системе, не содержащей денатурирующих агентов. Такой способ в меньшей степени оказывает необратимое повреждающее воздействие на белковые молекулы и может применяться при выделении как рекомбинантных белков, не образующих «телец включения» (частный случай), так и клеточных цитозольных белков (общий случай). Последующие этапы, как и в первом варианте, предполагают перевод искомого белка в осадок добавлением комплексообразующего иона с последующим замещением белка в координационном комплексе лиган-дообменной реакцией.

ГЛАВА 5. ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЧАСТИЦ ДЕТОНАЦИОННЫХ НА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ.

Детонационные НА, синтезируемые в виде наночастиц среднего размера 4-6 нм из плазмы при детонации мощных взрывчатых веществ (Ставер и др., 1984), являются традиционным объектом исследования у специалистов, работающих в области физики и химии твердого тела, материаловедения, электроники, электрохимии, техники и т.д. Интерес к частицам НА определяется широким спектром их применений в различных областях физики и техники: в качестве композитного материала в электрохимических и химических металл-алмазных покрытиях, полимерных пленках и мембранах, в резинах различной природы, антифрикционных присадках к смазкам и маслам, в финишных и суперфинишных полировальных композициях, и т. д. (Долматов, 2001).

В тоже время, детонационные НА весьма привлекательный материал для исследователей, работающих в различных областях биологии, в частности, биохимиков и биофизиков. Такой интерес определяется тем набором физико-химических характеристик и свойств, который частицы НА приобретают в процессе технологического цикла их получения, включающего синтез с использованием энергии взрыва и последующую химическую очистку от сопутствующих примесей. К таким характеристикам относятся: размерный фактор частиц НА (4-6 нм), обеспечивающий высокоразвитую поверхность материала (320-

400 м2/г), наличие на поверхности частиц значительного числа различных высокоактивных функциональных групп (гидроксильные, карбоксильные, карбонильные, эфирные и др.). углеводородных фрагментов и микропримесей металлов (Чиганова, 1994; Чиганова, Чиганов, 1999; Долматов, 2001). Это позволяет рассматривать НА как материал, который должен обладать превосходными адсорбционными свойствами по отношению к биомолекулам. Более того, выраженный химический полиморфизм поверхности, содержащей широкий спектр функциональных групп, предполагает возможность разных механизмов взаимодействия с ней белковых молекул (координационные, ковалентные, ионообменные, гидрофобные взаимодействия). Исходя из этого, НА можно рассматривать как универсальный сорбент, позволяющий проводить разные типы хрома-тографий, например, лигандообменную, ковалентную, ионообменную, гидрофобную. Причем, в ходе одной процедуры разделения и очистки белков с помощью НА появляется возможность проведения разных типов хроматографии.

Обоснованность высказанных теоретических положений была подтверждена в модельных экспериментах. С использованием двух маркерных белков -бычьего сывороточного альбумина и цитохрома С, часто применяемых в хроматографии для оценки емкостных свойств сорбентов (Остерман, 1985), впервые было установлено, что 1 мг частиц НА может адсорбировать от 0,3 до 0,5 мг белка. Оценка емкости произведена из расчетов изменения спектральных характеристик белковых растворов при их титровании добавками строго определенных количеств НА (Рис. 9). Эти данные хорошо согласуются с аналогичными показателями для многих ионообменных адсорбентов, выпускаемых ведущими зарубежными фирмами (Остерман, 1985), и свидетельствуют о высоких сорбционных свойствах частиц НА по отношению к биомолекулам.

В модельных экспериментах показана также возможность адсорбции-десорбции на поверхности частиц НА белков, различающихся физико-химическими свойствами. В качестве маркеров использованы коммерческие препараты ферментов (карбоангидраза, р-амилаза (тип I-B) и каталаза) и препарат высокоосновных белков (гистоны тип II-A), поставляемые фирмой «Sigma». Установ-

лено (Рис. 10, 11), что подбор экспериментальных условий (водная или буферная система, молярность и рН буферной системы, добавление хаотропного ан-гента или нативные условия, добавление ионов двухвалентных металлов, например, кальция) позволяет осуществить как эффективную адсорбцию белков на поверхности частиц НА, так и последующую их десорбцию. Во всех случаях этот процесс сопровождается доочисткой белковых препаратов от присутствующих балластных микропримесей (Рис 10). Применение разных элюентов на стадии десорбции позволил разделить с помощью частиц НА белковые фракции, имеющиеся в препарате гистонов (Рис. 11).

Рис. 9. Изменение спектральных характеристик растворов БСА (А) и ци-тохрома С (Б) при титровании частицами НА. Примечание: по оси ординат - величина оптической плотности (СЮ) в оптических единицах, по оси абсцисс длина волны в нанометрах.

А Б

123456 1234 5

Рис. 10. Электрофоре граммы образцов на этапах адсорбции-десорбции катал азы (А) и р-амилазы (Б) на частицы НА. А: 1 — исходный препарат; 2 — супернатант после обработки раствора белка частицами НА; 3 — отмывка частиц; 4,5 - белок, последовательно десорбированный с поверхности частиц элюирующим буфером разной молярности, 6 - маркерные белки. Б: 1 — исходный препарат; 2 — супернатант после обработки белкового раствора частицами

НА; 3 — промывка частиц буфером с низкой молярностью; 4 — элюция белка с поверхности частиц буфером с высокой молярностью; 5 — маркерные белки.

1 2 3 4 5 6

Рис. 11. Электрофореграмма образцов на этапах адсорбции-десорбции гистонов на частицах НА. На треках: 1 — исходный препарат; 2 — супернатант после обработки исходного препарата частицами НА; 3 — отмывка частиц водой; 4 — элюция пизкомолекулярной фракции гистонов буфером, содержащим хаотропный агент; 5 — повторная элюция буфером, содержащим хаотропный агент и ионы металла; 6 — маркерные белки.

ГЛАВА 6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЕТОНАЦИОННЫХ НА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ.

Приводятся примеры применения НА для выделения и очистки рекомби-нантных стоизлучающих белков (апообелин, люцифераза) из биомассы клеток Е. coli и ферментов (глутатионредуктаза, лизоцим) из природных источников (печень быка, белок куриных яиц). Выбор белков определялся их принадлежностью к разным классам ферментов, существенными различиями в структурно-функциональной организации и физико-химических свойствах.

При выделении апообелина белки (включая искомый) экстрагируют из биомассы в течение 1 часа хаотропным агентом (6М мочевина), а клеточный дебрис удаляют центрифугированием. В экстракте ресуспендируют частицы НА и собирают их центрифугированием. Осадок частиц с адсорбированными белками, в том числе апообелином, дважды промывают буфером. Искомый белок элюируют буфером, содержащим ДГТ в концентрации 10 мМ. Полученный препарат имеет высокую степень чистоты (Рис. 12а), выход апобелка составляет не менее 35-45%. После получения исходного экстракта вся процедура выделения занимает не более 30-40 минут. Было показано, что один и тот же образец

частиц может многократно (5 раз) использоваться для очистки апообелина без значительных изменений их адсорбционно-десорбционных свойств. Преимуществом применения НА является также возможность одновременно с выделением белка проводить его концентрирование. За 30-40 минут, необходимых для выделения апообелина, из клеток с крайне низкой продукцией (30-300 мкг в 1 г биомассы) были получены практически гомогенные его препараты при выходе белка 40-50% в результате десорбции очень малыми объемами элюента.

Рис. 12. Элекрофореграммы образцов апообелина (а), люциферазы (б) и глутатионредуктазы (в) на этапах их выделения из исходных экстрактов с помощью частиц НА. На треках: (а) 1 — исходный экстракт, 2 — конечный препарат; (б) 1 — исходный экстракт; 2,3 — финальные препараты фермента при его последовательной десорбции с поверхности наночастиц элюирующим буфером; (в) 1 — исходный экстракт, 2 — конечный препарат, 3 — маркерные белки. Стрелкой показано положение: апообелина (а), аир субъединиц люциферазы (б), глутатионредуктазы (в).

Не менее эффективно с помощью НА проходит выделение рекомбинант-ной бактериальной люциферазы. Биомассу разрушают в воде ультразвуком, клеточный дебрис удаляют центрифугированием. В супернатант добавляют НА и после перемешивания собирают частицы центрифугированием. Осадок дважды промывают. Фермент десорбируют с поверхности частиц 20 мМ элюирующим буфером. Вся процедура выделения занимает не более 40 минут. Конечный препарат белка по данным электрофореза (Рис. 126) имеет высокую степень чистоты, а его выход составляет 45-60%.

Применение частиц НА позволило существенно упростить схему выделения глутатионредуктазы (ГР) из печени быка. Клетки печени разрушают ульт-

развуковой обработкой в буфере при нейтральных значениях рН и удаляют клеточный дебрис центрифугированием. Супернатант обрабатывают сульфатом аммония (20% насыщения) и удаляют образовавшийся белковый осадок. В полученный образец добавляют НА и после перемешивания собирают центрифугированием. Осадок дважды промывают буфером. Десорбцию фермента осуществляют добавкой в элюирующий буфер окисленного глутатиона в концентрации 2,5 - 5 мМ. По данным электрофореза (Рис. 12в), полученный препарат фермента имеет высокую степень чистоты, выход белка составляет 35-40%.

Так же эффективно осуществляется с помощью НА очистка лизоцима. К водным растворам белка из куриного яйца добавляют частицы НА и после перемешивания собирают центрифугированием. Осадок дважды промывают буфером со щелочными значениями рН для удаления балластных примесей. Фермент элюируют последовательными отмывками осадка буфером, имеющим слабокислые значения рН. Вся процедура выделения занимает не более 40-50 минут. По данным электрофореза (Рис. 13), с помощью НА получены препараты лицоцима в практически гомогенном виде.

Рис. 13. Динамика очистки лизоцима из белка куриного яйца с применением частиц НА. На треках: 1 — исходный препарат; 2 — препарат после обработки частицами НА; 3,4 — десорбция балластных примесей последовательной отмывкой осадка частиц буфером со щелочным значением рН; 5-7 - элюция лизоцима последовательными отмывками осадка слабокислым буфером.

Анализ результатов очистки разных белков с помощью НА и данных о физико-химических свойствах поверхности частиц позволил развить положения о возможных механизмах связывания белковых молекул поверхностью частиц (см. Глава 5). Так, эффективная десорбция апообелина под действием БН-

12 3 4

5 6 7

реагента (ДТТ) свидетельствует в пользу возможности образования между белковой молекулой и частицей НА как в-Б-связи (связей), так и координационных связей. Поскольку на поверхности частиц НА могут присутствовать примеси серы, можно допустить наличие реакционноспособных БН-групп. Тогда вероятно образование дисульфидных мостиков между белком и частицей. В этом случае БН-реагент будет восстанавливать Б-Б-связи и вызывать десорбцию белка. Если предположить, что примеси двухвалентных металлов на поверхности НА имеют свободные координационные валентности, вероятно образование координационных связей белок-металл. В этом случае БН-реагент будет являться свободным лигандом, замещающим выделяемый белок в координационном комплексе. Экспериментальная проверка показала, что предварительная обработка частиц избирательным блокатором БН-групп (ДТНБ), или хелатором ионов двухвалентных металлов (ЭДТА) приводит к снижению сорбционной емкости частиц к апообелину. Выяснено, что молекулы апообелнна могут взаимодействовать с НА как посредством образования Б-Б-мостиков (около 10% молекул), так и образования координационных связей (около 40% молекул). Примерно 50% молекул данного белка, вероятно, связываются с частицами НА по иным механизмам. Вполне вероятен механизм многоточечного взаимодействия белковых молекул с разными функциональными группами на поверхности наночастиц, например, одновременные ионные, гидрофобные, кова-лентные (исключая Б-в-связи) взаимодействия. В пользу этого может свидетельствовать то, что повторная обработка или существенное (в 10 раз) повышение концентрации БН-реагента не приводило к увеличению выхода апообелина на стадии элюции. Эффективная десорбция люциферазы при незначительном повышении молярности (ионной силы) элюирующего раствора (буфера) говорит о слабом ионообменном взаимодействии данного фермента с поверхностью частиц. Связывание молекул ГР осуществляется по механизму гидрофобных взаимодействий, так как эффективная адсорбция фермента осуществляется в присутствии (ЫН^Си. Общеизвестно (например, Скоупс, 1985), что в присутствии сульфата аммония повышается гидрофобность поверхности белковых

молекул. Такой механизм взаимодействия белка с частицами вполне возможен еще и потому, что на поверхности НА обнаруживаются различные углеводородные фрагменты, которые могут обладать выраженной гидрофобностью (Долматов, 2001). Результаты очистки лизоцима говорят о том, что одним из важных факторов, влияющих на механизмы адсорбции-десорбции белков на частицы, является рН применяемой буферной системы. Показано (Рис. 13), что применение щелочных буферов позволяет элюировать с поверхности частиц высокомолекулярные белковые компоненты, а слабокислых - лизоцим.

Как видно из приведенных результатов, детонационные НА могут эффективно применяться для очистки белков в объеме. В тоже время НА являются новым перспективным материалом и для колоночной хроматографии. Частицы имеют хорошие адсорбционные свойства, обладают высокой химической устойчивостью и механической прочностью. Однако прямое применение частиц в качестве сорбента невозможно из-за их крайне малых размеров. Для удержания такого носителя в колонке необходим фильтр с размерами пор, меньшими, чем размер частиц в 4-6 нм. Если бы такую колонку удалось сделать, крайне сложно прокачивать растворы через ультрадисперсный носитель. Расчеты, используемые в хроматографии высокого давления (Каргер, 1974), показывают, что, например, при линейной скороста перемещения фронта растворителя 1 мм в секунду через колонку диаметром 2 мм и высотой 1 мм необходимо подать давление на входе, равное 3000-5000 атмосфер (в зависимости от вязкости жидкости). Такой хроматографической техники в настоящее время просто не существует. Однако даже если бы такая техника была, хроматографию белков невозможно осуществить. Размеры белковых молекул соизмеримы или превышают размеры НА, что не позволит белкам проходить между плотно уложенными частицами сорбента, а затем и через фильтр колонки. Несмотря на эти препятствия, НА можно применять для колоночной хроматографии. Для этого необходимо получить (создать) сорбент с общепринятыми в хроматографии размерами зерен. Эту задачу можно решить двумя способами. Во-первых, фиксацией частиц НА в объеме или на поверхности инертной матрицы, во-вторых, созда-

нием крупных зерен (агрегатов) только из частиц НА. В обоих случаях необходимым условием является сохранение свойств функционально-активных групп поверхности частиц. В результате проведенных исследований из частиц НА был получен сорбент, позволяющий проводить колоночную хроматографию обычного давления. Модельные эксперименты показали, что через колонку размером 0,7 х 2,5 см, заполненную полученным сорбентом, можно прокачивать раствор маркерного белка (цитохром С) с концентрацией 1 мг/мл при скорости протока 20-30 мл/час. При этом наблюдается полная адсорбция маркера на носителе. Было показано, что емкость сорбента относительно выбранного маркерного белка, по сравнению с исходными частицами изменилась не существенно и составила 0,2 - 0,4 мг белка на 1 мг веса сорбента.

ГЛАВА 7. БИОТЕХНОЛОГИИ, ОСНОВАННЫЕ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ С ЧАСТИЦАМИ НА.

Этот раздел работы является логическим продолжением исследований, результаты которых представлены в двух предыдущих главах.- Целесообразность его введения в общую структуру диссертации объяснялась необходимостью продемонстрировать более широкий спектр возможных биотехнологических применений НА.

Известно, что помимо НА детонационным синтезом могут быть получены наночастицы другой физической природы и свойств, например, ультрадисперсные частицы оксида алюминия (Белошапко и др., 1990). Обычный оксид алюминия общеизвестен как хороший сорбент, применяемый в колоночной и тонкослойной хроматографии (Киркленд, 1974). На примере цитохрома С было показано, что детонационные частицы оксида алюминия также способны адсорбировать белковые молекулы. Эти данные и результаты исследований с частицами НА, позволили высказать идею об использовании белковых молекул как «сшивающих» агентов для создания сложных надмолекулярных структур. Для проверки этой возможности белок (апообелин) сначала адсорбировали на частицы НА, после чего полученный комплекс инкубировали с частицами оксида алюминия. Было показано (Рис. 14), что такой способ обработки позволяет

получить комплекс с упорядоченным распределением частиц НА по поверхности частиц оксида алюминия.

Рис. 14. Электронно-микроскопическое изображение порошка 5-оксида алюминия, полученного взрывным методом (А), и комплекса наноалмаз-белок-5-оксид алюминия (Б).

Полученные результаты послужили основой для исследований по созданию сенсорных систем, в которых основным элементом являются частицы НА, несущие на своей поверхности маркерные белки, например, светоизлучающие (Са2+-активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза) (см. Глава 4), широко применяемые в биолюминесцентном анализе (Гительзон и др., 1984, Бондарь и др., 1990; Бондарь и др., 1991; Шапопоу ег а1., 2000).

Было показано, что обелин, адсорбированный на поверхности НА, сохраняет способность генерировать кванты видимого света при взаимодействии с ионами кальция. Активность белка, входящего в состав комплекса НА-обелин, измеряемая непосредственно после его получения, составляет 40-50% от активности исходного белка в растворе. Различий в кинетике люминесцентной реакции у белка, адсорбированного на частицы и находящегося в растворе, обнаружено не было. Вероятно, наблюдаемое снижение активности обелина, является следствием его иммобилизации на частицах, которые выполняют роль носите-

ля. Известно, что при иммобилизации ферментов на носителе они могут частично утрачивать свою активность (Тривен, 1983).

Комплекс НА-обелин использовали для создания надмолекулярной структуры на поверхности плоской подложки, покрытой слоем алюминия, образующего при контакте с кислородом воздуха окисный слой. На окисную пленку алюминия предварительно наносили адгезионный слой, что позволило создать на двумерной подложке структуру: окисная пленка алюминия - адгезионный слой - НА - обелин (Рис. 15). Маркерный белок, входящий в состав структуры, сохраняет активность не только при условии-, когда подложка находится в буферных растворах (Рис. 16а), но и после ее лиофильного высушивания. Биолюминесцентный ответ может быть получен как при внесении сухой подложки в буферную систему с последующим добавлением анализируемого раствора, содержащего ионы кальция (Рис. 166), так и при его добавлении к сухой подложке (Рис. 16в).

Рис. 15. Гипотетическая схема надмолекулярной структуры: окисная пленка алюминия — адгезивный слой - НА - обелин при расположении применяемых компонентов в монослое.

Иммобилизация на плоской структуре светоизлучающего белка, сохраняющего свою активность, позволила создать биолюминесцентную тест-систему регистрации ионов кальция (прототип биочипа), альтернативную общеизвестным методам его измерения. Сохранение активности маркерного белка при

высушивании подложек дает определенные преимущества таким люминесцентным датчикам.

■ ¡ ¿. ,5 4 » к ' Т

Рис. 16. Кинетика биолюминесцентного сигнала обелина, иммобилизованного в надмолекулярном комплексе, в ответ на добавку раствора кальция (Ь - интенсивность биолюминесценции): а - подложка постоянно находится в буферном растворе, б - лиофильно высушенная подложка, помещенная в реакционный буфер, в — лиофильно высушенная подложка без реакционного буфера.

Аналогичным образом был сконструирован надмолекулярный коплекс: окисная пленка алюминия - адгезионный слой - наноалмаз - люцифераза. Эксперименты с комплексом НА-люцифераза и плоской надмолекулярной структурой показали, что фермент сохраняет свою каталитическую активность при иммобилизации. При использовании тест-системы в ходе реакции происходит десорбция части фермента с поверхности подложки, что сопровождается снижением интенсивности световых сигналов при каждом последующем измерении (Рис. 17). Вероятно, это связано с конформационными изменениями структуры фермента в момент проявления им каталитической функции. Показано, что только полный набор ингредиентов люминесцентной реакции вызывает десорбцию люциферазы. Добавки отдельных компонентов реакции и их различные комбинации не обладают таким эффектом. Наблюдаемое изменение не является серьезным препятствием для использования полученной тест-системы в люминесцентном анализе.

1 3 5 7 9

количество измерений

В1 02

Рис. 17. Динамика интенсивности люминесцентных сигналов при многократном использовании плоской подложки, содержащей надмолекулярную структуру, индикаторным элементом которой является комплекс НА-люци-фераза. 1 - подложка находится в реакционной смеси измерительной кюветы, 2 — реакционная смесь после удаления подложки.

Экспериментальные факты, установленные в данном разделе работы, свидетельствуют о том, что открываются реальные перспективы создания нового класса индикаторных тест-систем на основе частиц НА и маркерных белков. Можно полагать также, что частицы НА с иммобилизованными ферментами найдут широкое применение и в создании биореакторов для наработки биологически активных соединений и веществ, а также при разработке новых материалов для медико-биологических целей.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснованы и сформулированы принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основанные на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием низких (милимолярные, микромолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов.

2. В модельных экспериментах показана принципиальная возможность применения метода ЛОРБ для разделения белковых молекул на примере разделения смеси коммерческих белков, включающих: фосфорилазу Б — 94 кДа; бычий сывороточный альбумин — 67 кДа; яичный альбумин — 43 кДа; карбоангид-

разу — 30 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа; лактальбумин — 14,4 кДа,.

3. Разработаны схемы выделения и очистки методом ЛОРБ рекомбинант-ных белков, различающихся структурно-функциональной организацией и физико-химическими свойствами, из биомассы бактериальных клеток Е. coli: а) -апообелина и его мутантов с заменами в молекуле белка консервативного Cysl58 на аланин и серин, а также мутанта с делецией 14 N-концевых аминокислот; б) - апоакворина и его мутантов с делецией 7, 11 и 15 N-концевых аминокислот в молекуле белка; в) — бактериальной люциферазы. Показано, что время выделения белков данной технологией составляет не более 1,5-3 часов и из процесса очистки исключаются хроматографическое оборудование и сорбенты. Все белки получены в высокоочищенном и гомогенном виде с выходом 35-45% для апофотопротеинов и 50-60% для бактериальной люциферазы.

4. Предложена общая схема выделения и очистки белков методом ЛОРБ. Для каждого этапа схемы предложены рекомендации, позволяющие осуществить выбор стратегии и оптимальных вариантов выделения и очистки конкретного белка с учетом его структурно-функциональных особенностей.

5. Теоретически обоснована возможность применения детонационных ПА для разделения и очистки белковых молекул, исходя из имеющихся данных о физико-химических характеристиках и свойствах частиц. В модельных экспериментах определена емкость данного материала, составляющая 0,3-0,5 мг белка на 1 мг веса частиц. Показана принципиальная возможность разделения белковых молекул в процессе их адсорбции-десорбции на поверхности частиц.

6. Разработаны технологии экспресс выделения и очистки с помощью частиц НА светоизлучающих рекомбинантных белков (апообелин, люцифера-за) из штаммов-продуцентов Е. coli и ферментов из природных источников (грутатионредуктаза из печени быка, лизоцим из куриного яйца). Время выделения белков данной технологией составляет не более 30-60 минут, из процесса очистки исключается хроматографическое оборудование. Все белки получены в высокоочищенном и гомогенном виде с выходом от 35-40% до 45-60%.

7. Показано, что связывание белковых молекул с поверхностью частиц НА может осуществляться посредством образования ковалентных (например, -Б-Б-) и координационных связей, ионообменных и гидрофобных взаимодействий. Это позволяет рассматривать частицы НА как универсальный сорбент, на котором можно выполнять разные типы хроматографии.

8. Из частиц НА получен сорбент, который можно использовать в колоночной хроматографии обычного давления. Показано, что емкость сорбента по отношению к маркерному белку (цитохром С) составляет 0,2 — 0,4 мг на 1 мг носителя.

9. Созданы прототипы люминесцентных индикаторных тест-систем (биочипов), в которых основным элементом являются частицы НА, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза). Показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бондарь, B.C. Биоспецифическая адсорбция дисульфидредуктаз цитозоля печени крыс на 2\5'-АДФ-сефарозе и НАДФ(Н)-содержа1цих аффинных адсорбентах / В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, Л.С.Колесниченко // Регулятор-ные эффекты и обмен моноаминов и циклонуклеотидов: Сб. науч. тр. -Красноярск, 1981. - С.71-75.

2. Бондарь, B.C. Получение глутатионредуктазы из печени крыс методом аффинной хроматографии и ее некоторые свойства / В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин // Физико-химическая биология: Матер. III Всесоюз. межуниверситетской конф. - Тбилиси, 1982. — T.I. - С.62-63.

3. Бондарь, B.C. Простой способ получения глутатионредуктазы с высокой активностью из печени крыс / В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межеви-кин, Л.С.Колесниченко, Л.А.Лихачева // Биологическая роль и обмен мо-иоаминов и циклонуклеотидов: Сб. науч. тр. - Красноярск, 1983. - С.8-12.

4. Бондарь, B.C. Использование брушита для препаративного получения вы-сокоочищенной бактериальной люциферазы / В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, В.В. Заворуев, В-В.Межевикин, А.А.Райбекас // Молекулярная жидкостная хроматография: Матер. III Всесоюз. симп. -Рига, 1984. - С.131-132.

5. Бондарь, B.C. Синтез, скрининг и использование новых аффинных адсорбентов для получения высокоочшценных НАДФ(Н)-зависимых ферментов / В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин // Препринт №63Б Института физики СО АН. - Красноярск, 1987. - 35с.

6. Высоцкий, Е.С. Сравнительный анализ способов выделения Са-зависимого фотопротеина - обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е.С. Высоцкий, В.С-Бондарь // Препринт №76Б Института физики СО AR -Красноярск, 1988. - 45с.

7. Бондарь, B.C. Получение высокоочищенных НАДФ(Н)-зависимых ферментов из печени крыс с использованием НАДФ-гидразидоадипоил-оксипропил сефарозы / В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин // Прикладная биохимия и микробиология. — 1988. - Т.24, №3. - С.361-367.

8. Бондарь, B.C. Получение препарата бактериальной люциферазы для биолюминесцентного анализа / В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, В.В.Заворуев, В.В.Межевикин, А.А.Райбекас // Прикладная биохимия и микробиология.

- 1988. - Т.24, №6. - С.745-753.

9. Vysotsky, E.S. Extraction, some properties and application of obelin, calcium-activated photoprotein / E.S.Vysotsky, V.S.Bondar, I.I.Gitelson, V.V.Petrunya-ka, I.A.Gamalei, A.B.Kaulin // Biological Luminescence: Proceedings of the First International School on Biological Luminescence. - World Scientific Publishing Co., 1990. - P.386-395.

10. Бондарь, B.C. Получение высокоочищенной глутатионредуктазы из гидроидных полипов Obelia longissima и изучение некоторых ее физико-химических свойств / В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, В.Н.Летунов // Препринт №123Б Института биофизики СО АН. - Красноярск, 1990. - 32с.

11. Бондарь, B.C. Использование фотопротеина из гидроида Obelia longissima для измерения внутриклеточного Ca + в макрофагах / В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, И.А.Гамалей, А.Б.Каулин // Препринт №137Б Института биофизики СО АН. - Красноярск, 1990. - 45с.

12. Бондарь, B.C. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima / В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, И.А.Гамалей, А.Б.Каулин // Цитология. - 1991. - Т.ЗЗ, №6. - С.57-66.

13. Бондарь, B.C. Са2+-активируемый фотопротеин обелин как индикатор кальциевого транспорта в протеолипосомах, включающих мембраны Т-систе-мы скелетных мышц / В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, О.М.Рожманова, С.Г. Воронина II Биохимия. - 1991. - Т.56, №56. - С.806-811.

14. Илларионов, Б.А. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli Са(++)-активируемого фотопротеина из гидроида Obelia longissima / Б.А.Илларионов, С.В.Маркова, В.С.Бондарь, Е.С.Высоцкий, И.И.Гительзон // Доклады Академии наук. - 1992. - Т.326, №5. - С.911-913.

15. Бондарь, B.C. Влияние температуры на активность и стабильность обелина / В.С.Бондарь, К.П.Трофимов, Т.П.Сандалова, Е.С.Высоцкий // Биохимия.

- 1992. - Т.57, №7. - С. 1039-1048.

16. Бондарь, B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / В.С.Бондарь, К.П.Трофимов, Е.С.Высоцкий // Биохимия. - 1992. - Т.57, №10. - С.1481-1490.

17. Бондарь, B.C. Са2+-аюгивируемый фотопротеин обелин из гидроидных полипов Obelia longissima: Дисс.... канд. биол. наук / В.С.Бондарь. - Красноярск, 1992.- 131с.

18. Illarionov, В.A. Cloning, expression and nucleotide sequence investigation of apoobelin cDNA from the hydroid Obelia longissima / B.A.Illarionov, S.V. Markova, V.S.Bondar, V.A.Illarionova, E.S.Vysotski // Bioluminescence and Chemiluminescence. - John Wiley&Sons, 1993. - P.183-185.

19. Illarionov, B.A. Sequence of the cDNA encoding the Ca2+-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima / B.A.Illarionov, V.S.Bondar, V.A.Illarionova, E.S.Vysotski // Gene. - 1995. - V.153. - P.273-274.

20. Bondar, V.S. Cadmium-induced luminescence of recombinant photoprotein obelin / V.S.Bondar, A.G.Sergeev, B.A.Illarionov, J.Vervoort, W.R.Hagen // Bio-chimica et Biophysica Acta. - 1995. - V.1231. - P.29-32.

21. Matveev, S.V. Obelin mRNA - a new tool for studies of translation in cell-free systems / S.V.Matveev, B.AJUarionov, E.S.Vysotski, V.S.Bondar, S.V.Marko-va, Yu.B.Alakhov // Analitical Biochemistry. - 1995. - V.231. - P.34-39.

22. Illarionova, V.A. Characterization of recombinant obelin as an intracellular Ca^ indicator / V.A.Illarionova, B.AJllarionov, V.S.Bondar, E.S.Vysotski, J.R. Blinks // Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons. - John Wiley&Sons, 1997. - P.427-430.

23. Illarionov, B.A. Obelin as a carrier protein and reporter enzyme for in vitro synthesized small bioactive polypeptides: new approach to obtain sarcotoxin /

B.A.Illarionov, S.V.Matveev, V.S.Bondar, V.A.Skosyrev, Yu.B. Alakhov // Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons. -John Wiley&Sons, 1997. - P.435-438.

24. Бондарь, B.C. О возможной биологической функции кадмия как аналога кальция / Бондарь B.C. // Доклады Академии наук. — 1997. - Т.352, №5. -

C.693-694.

25. Шалойко, JI.A. Подход к созданию новых биосенсоров на основе систем бесклеточного биосинтеза белка / Л.Л.Шалойко, А.Ю.Гороховатский, B.C. Бондарь, Е.С.Высоцкий, Ю.Б.Алахов // Сенсорные системы. — 1998. - Т. 12, №1. - С.29-35.

26. Gorokhovatsky, A.Yu. Cell-free bioluminescent screening of translation inhibitors / A.Yu.Gorokhovatsky, L.A.Shaloiko, V.S.Bondar, E.S.Vysotski, E.E.Maxi-mov, H. von Doehren, Yu.B.Alakhov // Biotechnology and Applied Biochemistry. - 1998. - V.27. - P.259-263.

27. Bondar, V.S. Bioluminescent activity of the recombinant obelin after chemical modification of histidine and cysteine residues / V.S.Bondar, L.A.Frank, N.P. Malikova, E.V.Inzhevatkin, V.A.IIlarionova, E.S. Vysotski // Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for the 21st Century. - Wiley & Sons, 1999. - P.400-403.

28. Illarionov, B.A. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator / B.A.Illarionov, L.A.Frank, V.A.Illarionova, V.S.Bondar, E.S.Vysotski, J.R.Blinks // Methods in Enzymo-logy. - 2000. - V.305. - P. 223-249.

29. Бондарь, B.C. Применение частиц наноалмаза для экспресс выделения ре-комбинантного апообелина из Escherichia coli / В.С.Бондарь, А.П.Пузырь // Доклады Академии наук. - 2000. - Т.373, №2. - С.251-253.

30. Пузырь, А.П. Получение комплекса наноалмаз - белок - 5-оксид алюминия / А.П.Пузырь, В.С.Бондарь, П.И.Белобров, А.А.Букаемский // Доклады Академии наук. - 2000. - Т.373, №3. - С.408-410.

31. Бондарь, B.C. Лигандообменное разделение белков без использования хроматографии (на примере выделения из Escherichia coli рекомбинантных апообелина и апоакворина) / В.С.Бондарь, К.В.Пуртов // Доклады Академии наук. - 2000. - Т.373, №4. - С.547-549.

32. Бондарь, B.C. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина / В.С.Бондарь, К.В.Пуртов, Н.П.Ма-ликова, Л.А.Франк, Б.А.Илларионов // Биохимия. — 2001. - Т.бб, №9. -С.1245-1251.

33. Пуртов, К.В. Создание надмолекулярной структуры из частиц наноалмаза и обелина на двумерной подложке / К.В.Пуртов, В.С.Бондарь, А.П.Пузырь // Доклады Академии наук. - 2001. - Т.380, №3. - С.411-414.

34. Пузырь, А.П. Создание надмолекулярных структур на основе наночастиц и белковых молекул / А.П.Пузырь, К.В.Пуртов, П.И.Белобров, А.А.Букаемс-кий, В.С.Бондарь // Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии: авторефераты докладов 3-й Междунар. конф. - С.Петербург, 2001. - С.384-386.

35. Pu2yr, А.Р. Nanostructures Based on Explosive Synthesis Particles and Protein Molecules / A.P.Puzyr, K.V.Purtov, A.A.Bukayemskii, V.S. Bondar И Thin Films in Electronics: Proceedings of 12th International Symposium. - Kharkov, 2001. -P.320-325.

36. Puzyr, A.P. Alternative Aplication of Explosive Synthesis Nanopowders / A.P. Puzyr, A.A.Bukayemskii, K.V.Purtov, V.S. Bondar II Proceedings of HIGH-TECH-2001. - Krasnoyarsk, 2001. - V.l. - P.265-270.

37. Vysotski, E.S. Efficiency of apophotoprotein charging depends strongly on protein concentration / E.S.Vysotski, L.A.Frank, V.S.Bondar // Bioluminescence and Chemiluminescence: Proceedings of the 11th International Symposium. -World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., 2001. - P. 139-142.

38. Пузырь, А.П. Повреждающее действие детонационных алмазов на клетки белой и красной крови человека in vitro / А.П.Пузырь, С.В.Тарских, Г.В. Макарская, Г.А.Чиганова, И.С.Ларионова, ПЛ.Детков, В.С.Бондарь // Доклады Академии наук. - 2002. - Т.385, №4. - С.561-564.

39. Бондарь, B.C. Новые биотехнологии с применением наноалмазов / B.C. Бондарь, К-В.Пуртов, АЛ.Пузырь // Биотехнология — состояние и перспективы развития: Матер. 1-го Междунар. Конгресса. - Москва, 2002. - С.435-436.

40. Пуртов, К.В. Лигандообменное разделение белков без использования хроматографии — биотехнология 21 века / К.В.Пуртов, В.С.Бондарь // Биотехнология — состояние и перспективы развития: Матер. 1-го Междунар. Конгресса. - Москва, 2002. - С.437-438.

41. Пузырь, А.П. Прототип твердотельного биочипа для измерения ионов кальция / А.П.Пузырь, К.В.Пуртов, В.С.Бондарь // Биотехнология - со-

стояние и перспективы развития: Матер. 1-го Междунар. Конхресса. - Москва, 2002. С.436-437.

42. Бондарь, B.C. Детонационные наноалмазы — универсальный сорбент для белковой химии / В.С.Бондарь, А.П.Пузырь // Ультрадисперсные порошки, наноструктуры, материалы: получение, свойства, применение (третьи ста-веровские чтения): Матер. Всерос. науч.-тех. конф. - Красноярск, 2003. -С.205-208.

43. Пузырь, А.П. Детонационные наноалмазы с новыми свойствами / А.П.Пу-зырь, К.В.Пуртов, В.С.Бондарь // Ультрадисперсные порошки, наноструктуры, материалы: получение, свойства, применение (третьи ставеровские чтения): Матер. Всерос. науч.-тех. конф. - Красноярск, 2003. - С.96-98.

44. Бондарь, B.C. Высокоэффективные технологии выделения и очистки белков на основе лигандного обмена и детонационных наноалмазов / B.C. Бондарь, К.ВЛуртов, А.П.Пузырь // Очерки экологической биофизики. — Новосибирск: Издательство СО РАН, 2003. - С.212-230.

45. Puzyr, А.Р. Feasibility of creation of bioluminescent chips using nanodiamonds and light-emitting proteins / A.P.Puzyr, V.S.Bondar // Biophotons and Biopho-tonics: Proceedings of International Conference. - Beijing, China, 2003. - P.68.

46. Бондарь, B.C. Наноалмазы для биологических исследований / В.С.Бондарь, А Л.Пузырь // Физика твердого тела. - 2004. - Т.46, вып.4. - с.698-701.

47. Бондарь, B.C. Применение наноалмазов для разделения и очистки белков / В.С.Бондарь, И.О.Позднякова, А.П.Пузырь // Физика твердого тела. — 2004. - Т.46, вып.4. - С.737-739.

48. Пузырь, А.П. Создание люминесцентного биочипа с использованием наноалмазов и бактериальной люциферазы / А.ПЛузырь, И.О.Позднякова, В.С.Бондарь // Физика твердого тела. - 2004. - Т.46, вып.4. - С.740-742.

49. Бондарь, B.C. Лигандообменное разделение белков — новый метод для белковой химии / В.С.Бондарь, К.В.Пуртов, А.П.Пузырь // Доклады Академии наук. - 2005. - Т.403, №4. - С.546-550.

50. Бондарь, B.C. Возможность и перспективы создания новых нанотехноло-гий на основе частиц детонационных наноалмазов: медико-биологический и технический аспекты / В.С.Бондарь, АЛЛузырь // Конструкции из композиционных материалов. — 2005. - вып.4. - С.80-94.

Подписано к печати 15.06.2006 г. Формат 60x84 1/16 Уч.-изд. л. - 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 465

Отпечатано в типографии КГТУ 660074, Красноярск, ул. Киренского, 26

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бондарь, Владимир Станиславович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Способы получения исходных белковых препаратов.

1.2. Методы разделения белков с помощью осаждения, общие представления.

1.3. Фракционирование белков посредством их распределения между жидкими фазами, общие принципы метода.

1.4. Разделение биомолекул с помощью ультрафильтрации, общий принцип метода.

1.5. Методы разделения белков посредством адсорбции, общие положения и типы хроматографий.

1.5.1. Адсорбенты, применяемые в хроматографии белков.

1.5.2. Методы элюции белков, адсорбированных на носителе, общие принципы.

1.6. Аффинная хроматография, общие принципы метода.

1.7. Гель-фильтрационная хроматография белков, общие принципы метода.

1.8. Электрофоретическое разделение белков, общие положения и основные методы.

1.9. Лигандообменная хроматография, общие принципы метода.

1.9.1. Применение лигандообменной хроматографии для разделения белковых молекул.

1.10. О возможности применения наноалмазов детонационного синтеза как новых сорбентов в технологиях выделения и очистки белков.

1.11. Резюме обзора литературы.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ, ПРОВЕРКА ЕГО ПРИМЕНИМОСТИ В МОДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ.

3.1 Предпосылки создания метода ЛОРБ - обнаружение феномена преципитации белков под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов.

3.2 Сравнительный анализ действия ионов кальция и кадмия на белки в экстрактах из бактериальных клеток Е. coli.

3.3 Рассмотрение феномена преципитации белков в растворе под действием ионов двухвалентных металлов с позиций координационной и белковой химии.

3.4 Обоснование и основные положения метода ЛОРБ.

3.5 Проверка метода ЛОРБ в модельных экспериментах по разделению смеси маркерных белков.

ГЛАВА 4. МЕТОД ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ СВЕТОИЗЛУЧАЮЩИХ БЕЖОВ.

4.1. Метод ЛОРБ при выделении рекомбинантного апообелина.

4.2. Выделение апоакворина и мутантов апофотопротеинов.

4.3. Применение технологии ЛОРБ для очистки рекомбинантной бактериальной люциферазы.

4.4. Обобщающая технологическая схема выделения белков, основанная на применении метода ЛОРБ.

ГЛАВА 5. ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЧАСТИЦ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЖОВ.

5.1. Физико-химические свойства наноалмазов детонационного синтеза как базовая основа возможности использования данного материала для сепарации белковых молекул.

5.2. Модельные исследования с маркерными белками: проверка адсорбции-десорбции белковых молекул на поверхности наноалмазов, определение сорбционной емкости наночастиц к белку.

ГЛАВА 6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЖОВ.

6.1. Выделение рекомбинантного апообелина с помощью наноалмазов.

6.2. Применение детонационных наноалмазов для выделения рекомбинантной люциферазы.

6.3. Выделение глутатионредуктазы с использованием наноалмазов.

6.4. Применение наноалмазов для выделения лизоцима.

6.5. Механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза.

6.6. Детонационные наноалмазы - новый сорбент для колоночной хроматографии.

ГЛАВА 7. БИОТЕХНОЛОГИИ, ОСНОВАННЫЕ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ С ЧАСТИЦАМИ НАНОАЛМАЗОВ.

7.1 Получение композиционных материалов из наночастиц разной физической природы с применением белков как «сшивающих» агентов.

7.2. Создание систем индикации (биочипов) на основе комплекса наноалмаз-маркерный белок.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов"

Актуальность проблемы. Значительный прогресс, достигнутый за минувшее столетие в понимании механизмов функционирования сложно организованных биологических систем, включая организм человека, был во многом предопределен успехами биологической химии. Прежде всего, этому способствовало выделение многих биологических макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в чистом виде, что позволило перейти к изучению их структурно-функциональной организации и свойств. Нет надобности говорить о том, насколько основательно были проработаны теоретические основы фракционирования биомолекул и как огромен арсенал технологических приемов и методов, применяемых в современной белковой химии, например, для разделения и очистки белков. Накопленные знания суммированы и подробно изложены в большом количестве монографических изданий, учебников, методических руководств, пособий и рекомендаций (например, Киркленд Д. (ред.), 1974; Нидервайзер А. и Патаки Г. (ред.), 1974; Дейл 3., Мацек К., Янак Я. (ред.), 1978; Туркова Я., 1980; Кочетов Г.А., 1980; Скоупс Р., 1985, Остерман Л.А., 1981, 1983, 1985; Даванков В.А. и соавт., 1989; Дарбре А., 1989; Руденко Б.А. (отв. ред.), 2003).

Наиболее значимые успехи в сепарации и очистке биологических макромолекул связаны с появлением хроматографии. В более широком смысле хроматографию рассматривают как один из самых распространенных и совершенных методов разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003). При этом вполне обоснованно утверждается, что по универсальности применения и эффективности с хроматографическими методами разделения сложных многокомпонентных смесей не может конкурировать ни один из известных аналитических методов. Этим объясняется столь широкое применение данного метода в самых разных сферах деятельности человека (Руденко (отв. ред.), 2003; Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003).

В настоящее время хроматографические методы анализа используются в различных промышленных технологиях (например, химической, газовой, нефтехимической, пищевой, целлюлозно-бумажной отраслях) для поддержания оптимальных условий производства и контроля качества исходного сырья и готовой продукции. В экологии хроматография применяется для оценки и контроля загрязнений окружающей среды различными соединениями биологической и небиологической природы. Метод хроматографии применяется в геологоразведке, археологии, энергетике, криминалистике, судебной и медицинской экспертизе. С помощью хроматографических методов проводят оценку качества продуктов питания, устанавливают их пищевую ценность и допустимые сроки хранения, выявляют наличие порчи, загрязняющих и токсических веществ. В медицинской практике хроматография является мощным диагностическим методом. Скрининг биохимических маркеров (низко- и высокомолекулярных биомолекул), осуществляемый данным методом в биологических жидкостях и образцах биопсийного материала, позволяет своевременно выявлять наличие заболеваний, контролировать эффективность применяемой терапии, предсказывать прогноз в ходе выбранного лечения и своевременно устанавливать появление противопоказаний, определять возможность рецидивов заболевания. Хроматографические методы самым активным образом используются ведущими фармацевтическими фирмами. С их помощью получают важную информацию, как на этапах производства новых лекарственных препаратов, так и при изучении фармакодинамики, эффективности и селективности действия нового лечебного средства, его перераспределении между органами и тканями после введения в организм.

Широкое использование методов хроматографии в различных областях (промышленность, экология, биология, медицина, фармакология и т.д.) послужило мощным стимулом для развития хроматографического приборостроения. В этой отрасли применяются передовые достижения микроэлектроники, пневматики, теплотехники, оптики, высокоточной механики, автоматики, микропроцессорного управления и компьютерной обработки данных.

На вооружении исследователей, работающих в области биологической химии, имеется приборный парк, позволяющий решать практические задачи, связанные с выделением и очисткой биомолекул. Например, для совокупности различных методов жидкостной колоночной хроматографии, занимающих центральное место среди технологий разделения и очистки белков, разработан и производится ведущими фирмами («Bio-Rad», США; «Toyo-Soda», Япония; «Sigma», США; «Мегск» и «Serva», Германия; раньше «ЬКВ» и «Pharmacia», Швеция; в настоящее время «Amersham» и другие) широкий ассортимент соответствующего аппаратурного оснащения и сорбентов. В этих целях крупными мировыми лидерами, производящими хроматографическое и вспомогательное оборудование и сорбенты, ежегодно затрачиваются значительные финансовые ресурсы, которые исчисляются миллиардами долларов (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003). В последние годы отмечается успешная тенденция к миниатюризации аппаратуры, применяемой для хроматографических технологий. Портативное оборудование при сохранении эффективности более экономично в эксплуатации и становится все более популярным в исследовательских и диагностических лабораториях.

Однако, несмотря на высокий уровень технической оснащенности и обилие технологий сепарации биологических макромолекул, применяемых в современной биохимии, научный поиск новых путей и методических приемов их выделения и очистки по-прежнему продолжается. Более того, в последнее время активизировались исследования, направленные на разработку и создание новых высокоэффективных технологий выделения и очистки биомолекул для решения прикладных задач в области биологии, белковой химии, биофизики, молекулярной биологии, экологии и т.д. Об этом свидетельствует факт проведения в 2002-2003 годах 1-го и Н-го Международных Конгрессов «Биотехнология - состояние и перспективы развития» с участием специалистов из многих стран Мира.

Активизации этих процессов, во многом, способствовали успехи, достигнутые за последние 10-15 лет, в молекулярной биологии и генной инженерии. Пожалуй, с биотехнологической точки зрения, следует выделить три главных достижения. Во-первых, развитие рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, привело к тому, что в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка (Ferguson Н.А., Goodrich J.A., 2001). Во-вторых, стало возможным получение не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов (Kidokoro S., 1998). В-третьих, создание штаммов-продуцентов позволило решить серьезную проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для наработки больших количеств изучаемых белков (Глик Б., Пастернак Д., 2002). В значительной мере решение этих вопросов с одной стороны открыло новые возможности и перспективы получения множества белков в препаративных количествах, с другой - способствовало возникновению и развитию новой ветви молекулярной биологии - протеомики.

В связи с этим, очевидно, что разработка и создание новых (адекватных разнообразию решаемых задач) высокоэффективных технологий получения чистых белков приобретает в настоящее время большую актуальность и значимость. Понятно, что при этом основные усилия исследователей направлены, прежде всего, на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белковых молекул (Галаев И.Ю., 1999). Технологии, позволяющие решать задачи быстрой наработки чистых белков с минимальными затратами, не только позволят расширить арсенал известных методов белковой химии. Решение проблемы быстрого получения больших количеств чистых белков в целом будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - поиску путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии (Jackson R.J. et al., 1996).

Особую значимость и ценность создание и внедрение новых экспрессных и дешевых технологий сепарации и выделения чистых бежов могут представлять для России. К сожалению, нельзя не согласиться с мнением ведущих специалистов в области хроматографии (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003) о том, что в настоящее время положение России в этой сфере науки и техники по сравнению с мировым уровнем не отличается от положения третьестепенной развивающейся страны. Очевидно, что с таким положением трудно мириться, поскольку неоспоримый приоритет открытия метода хроматографии принадлежит российскому ученому М.С.Цвету, а вклад отечественных ученых в теорию и техническое оснащение данного метода весьма весом. Вероятно, при дефиците финансирования и слабой развитости отечественного хроматографического приборостроения одним из рациональных путей выхода из сложившейся ситуации может являться создание новых и высокоэффективных технологий сепарации веществ, в частности, разделения и очистки биомолекул.

Представляемая диссертационная работа, выполненная на базе Института биофизики СО РАН, обобщает результаты многолетних исследований автора по созданию новых экспрессных технологий выделения высокоочищенных белковых препаратов из сложных белковых смесей. В работе формулируются и теоретически обосновываются основные положения новых разработанных технологий, основанных на принципах лигандообменных взаимодействий и применении частиц детонационных наноалмазов, существенно упрощающих, ускоряющих и удешевляющих процедуры очистки белков. Приводятся примеры их практического использования в решении конкретных биохимических задач.

Решаемая фундаментальная проблема.

Фундаментальной проблемой, которая решается в рамках предлагаемой работы, является теоретическое обоснование и последующая разработка высокоэффективных технологий разделения и очистки белковых макромолекул, позволяющих исключить из процесса специализированное хроматографическое оборудование и сорбенты и значительно упрощающих процедуры получения белков как из рекомбинантных штаммов-продуцентов, так и из природных источников.

Цель и задачи исследования.

Основная цель предлагаемого исследования формулируется как «Создание новых высокоэффективных технологий разделения и очистки белков, основанных на лигандном обмене и применении частиц детонационных наноалмазов».

Указанная цель достигается выполнением следующих задач:

1. Обосновать и сформулировать общие принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основываясь на обнаруженном эффекте преципитации белковых молекул в растворе под действием ионов двухвалентных металлов, с использованием данных о физико-химических свойствах двухвалентных ионов в растворе.

3. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из биомассы бактериальных клеток Е. coli различных рекомбинантных светоизлучающих белков: a i а). Са -активируемых фотопротеинов (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков), б), люциферазы морских светящихся бактерий.

5. Обосновать возможность применения детонационных наноалмазов для разделения и очистки белковых молекул, основываясь на данных о физико-химических свойствах этих частиц, и провести экспериментальную проверку адсорбционных свойств данного материала на модельных белках.

6. Показать возможность применения частиц наноалмаза для экспресс выделения и очистки из сложных белковых смесей: а), биолюминесцентных белков (апообелин, люцифераза) из рекомбинантных штаммов-продуцентов Е. coli, б), ферментов из природных источников (глутатионредуктаза из печени быка, лизоцим из куриного яйца).

7. Исследовать возможные механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмазов, исходя из экспериментальных данных.

8. Провести проверку возможности создания индикаторных систем, основным элементом которых являются частицы наноалмаза, несущие на своей поверхности маркерные люминесцентные белки (обелин, люциферазу).

9. Показать применимость частиц наноалмаза как сорбента для колоночной хроматонграфии обычного давления.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Разработанные на основе метода ЛОРБ схемы экспресс-очистки рекомбинантных мономерных белков фотопротеиновой группы (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков) и рекомбинантного гетеродимерного белка люциферазы из биомассы штаммов-продуцентов бактериальных клеток Е. coli, позволяющие за 1.5-3 часа получать препараты данных белков в высокоочищенном и гомогенном состоянии с выходом 3540 % и 50-60 % соответственно.

3. Обобщающая принципиальная схема применения технологии ЛОРБ для выделения и очистки белков, основанная на анализе полученных экспериментальных данных и позволяющая определить стратегию поиска оптимальных вариантов использования данного метода с учетом индивидуальных особенностей и свойств выделяемого белка (белков).

4. Разработанные на основе применения частиц наноалмазов высокоэффективные технологии выделения и очистки рекомбинантных светоизлучающих белков (апообелин, люцифераза) из биомассы бактериальных клеток Е. coli и ферментов из природных источников (лизоцим из куриного яйца и глутатионредуктаза из печени быка). Данные технологии являются экспрессными и позволяют при наличии исходных экстрактов за 30-60 минут получать указанные белки в высокоочищенном и гомогенном состоянии с выходом от 35 до 60% без применения специализированного хроматографического оборудования.

5. Обоснования возможности применения частиц детонационных наноалмазов, как нового универсального материала, для сепарации белковых молекул, позволяющего проводить на нем разные типы хроматографического разделения. Выводы делаются на основании экспериментальных результатов выделения и очистки с помощью наноалмазов белков, принадлежащих к разным классам ферментов, и анализа возможных механизмов связывания их с поверхностью частиц наноалмаза.

6. Решение физической проблемы, связанной с невозможностью применения наноалмазов, как частиц крайне малого размера (4-6 нм), в качестве сорбента для колоночной хроматографии обычного давления. Полученный на основе только частиц наноалмаза новый материал, может использоваться как сорбент в колоночной хроматографии обычного давления, что подтверждается экспериментами по адсорбции-десорбции на данном носителе маркерного белка (цитохром С).

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под' действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта позволило теоретически обосновать, разработать и предложить новую высокоэффективную технологию разделения и очистки белков. Предложенная технология пополняет арсенал известных методов, применяемых в биохимии для сепарации белковых молекул, и позволяет без использования хроматографического оборудования и сорбентов получать высокоочищенные и гомогенные белковые препараты при минимальных временных затратах. Полученные новые знания дополняют и расширяют представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет общебиологическое значение.

Анализ имеющихся данных о физико-химических свойствах частиц детонационных наноалмазов и проведенные в работе исследования позволили обосновать, сформулировать и развить новое научное направление по изучению механизмов взаимодействия частиц наноалмазов с белковыми молекулами. Полученные новые знания не только расширяют представления о свойствах этого материала, традиционно используемого объекта в физических, физико-химических исследованиях и технических приложениях, но и открывают новую возможность его изучения и использования в различных областях биологии. Открываются перспективы применения наноалмазов в качестве сорбента при разработке новых высокоэффективных технологий выделения и очистки белков и создании сенсорных систем. Исходя из результатов исследований механизмов взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза, делается вывод о возможности применения этого материала как универсального сорбента, позволяющего проводить разные типы хроматографических процессов.

Практическая значимость работы.

С помощью метода ЛОРБ разработаны экпресс-технологии выделения и очистки мономерных и полимерных рекомбинантных светоизлучающих белков (Са -активируемые фотопротеины апообелин, апоакворин и их мутанты, а также люцифераза морских светящихся бактерий) из биомассы штаммов-продуцентов Е. coli.

Предложенная принципиальная схема выделения белков технологией ЛОРБ, позволяет выбрать стратегию поиска оптимальных вариантов применения данного метода для выделения искомого белка с сохранением его структурно-функциональной организации и свойств.

На основе применения частиц детонационных наноалмазов разработаны экспресс-технологии выделения рекомбинантных белков (апообелин, люцифераза) из штаммов-продуцентов Е. coli и ферментов (лизоцим, глутатионредуктаза) из природных источников (куриное яйцо, печень быка).

На твердой подложке получены прототипы люминесцентных сенсорных систем (биочипов), основным элементом которых являются частицы наноалмаза, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза), и показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

Технологии выделения и очистки белков методом ЛОРБ и с применением частиц наноалмазов реализованы и используются на базе Института биофизики СО РАН (Красноярск).

Предложения по практическому использованию результатов работы.

Разработанные технологии разделения и очистки белковых молекул, основанные на применении метода ЛОРБ и частиц наноалмаза, отличаются от известных технологий простотой исполнения, минимумом оборудования, задействованного в технологическом процессе, и малыми временными затратами. Это позволяет предполагать возможность их широкого применения для решения прикладных задач белковой химии и протеомики, связанных с выделением и очисткой биомолекул.

Методы исследования.

Биофизические методы, основанные на регистрации биолюминесценции; спектрофотометрические методы оценки спектральных характеристик изучаемых белков и определения активности ферментов класса дегидрогеназ; биохимические методы выделения и очистки белков и изучения особенностей их структурно-функциональной организации и свойств; микробиологические методы культивирования бактериальных клеток Е. coli.

Достоверность представленных в диссертации результатов.

Достоверность результатов работы подтверждается их воспроизводимостью в серии экспериментов выделения и очистки разработанными технологиями рекомбинантных белков из клеток штаммов-продуцентов Е. coli, отличающихся разными конструкциями плазмид и обладающих разным уровнем продукции искомого белка. Технология экспресс-выделения рекомбинантного апообелина из биомассы Е. coli с помощью частиц наноалмаза и технология получения плоскостного люминесцентного биочипа с использованием обелина и наноалмазов были полностью воспроизведены и прошли экспертную оценку в независимых условиях лаборатории «Биологических и медицинских исследований» университета города Дарема (Англия). Критериями оценки воспроизводимости результатов являются данные SDS-электрофореза о качестве получаемых конечных белковых препаратов и проценты выхода искомых белков, определяемые из измерений их специфической активности. Эффективность технологии ЛОРБ и технологий, основанных на использовании частиц наноалмаза, подтверждается примерами выделения и очистки с их помощью белков, принадлежащих к разным классам ферментов, как из рекомбинантных (штаммы-продуценты бактериальных клеток Е. coli), так и природных (например, печень быка, белок куриных яиц) источников.

Апробация работы и публикации.

Основные материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены на Пятом Всесоюзном симпозиуме «Химия и физика белков и пептидов» (Баку, 1980); I Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография» (Вильнюс, 1982); III Всесоюзной межуниверситетской конференции «Физико-химическая биология» (Тбилиси, 1982); III Всесоюзном симпозиуме «Молекулярная жидкостная хроматография» (Рига,

1984); V Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Кобулети,

1985); 14th International Congress of Biochemistry (Prague, 1988.

Czechoslovakia); First International School on Biological Luminescence

Wroclaw, 1989. Poland); Седьмом Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Москва, 1991); VII International Symposium on

Bioluminescence and Chemiluminescence (Banff, Alberta, 1993. Canada);

Bioluminescence Symposium (Westin Maui, Hawaii, 1993. USA); III

Всероссийской конференции по направлению «Генная и клеточная th инженерия» (Москва, 1993); 8 International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects (Cambridge, 1994. England); 31st European Marine Biology Symposium (Saint Petersburg, 1996. Russia); 9th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons (Woods Hole, 1996. USA); 10th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for the 21st Century (Bologna, 1998. Italy); II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000); 3-й Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Санкт-Петербург, 2001); 12th International Symposium «Thin Films in Electronics» (Kharkov, 2001. Ukraine); HIGH-TECH-2001 (Krasnoyarsk, 2001. Russia); 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Cambridge, 2001. England); I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); VI Всероссийской (международной) конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Томск, 2002); I

Международном симпозиуме «Детонационные наноалмазы: получение, свойства и применение» (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-технической конференции «Ультрадисперсные порошки, наноструктуры, материалы: получение, свойства, применение (третьи ставеровские чтения)» (Красноярск, 2003); International Conference on Biophotons and Biophotonics (Beijing, 2003. China); NATO advanced research workshop «Synthesis, properties and applications of ultrananocrystalline diamond» (St. Petersburg, 2004); The 9th International Conference on New Diamonds Science and Technology ICNDST-9 (Tokyo, Japan 2004); NATO advanced research workshop «Innovative superhard materials and sustainable coating» (Kyiv, Ukraine, 2004); The XII Symposium of the Russia-Japan Medical Exchange (Krasnoyarsk, 2005); The 6th Pacific Rim Conference on Ceramic and Glass Technology (Kapalua, Maui Hawaii, 2005 USA); The IV-th Moscow International Conference «Theory and Practice of Technologies of Manufacturing Composite Materials and New Metal Alloys Products» (TMCMM) (Moscow, 2005).

По материалам диссертации опубликовано 49 работ.

Проекты и гранты, в которых автор принимал участие.

Отечественные гранты: Российский Фонд Фундаментальных Исследований (№93-04-21308, №96-0448489, №99-04-48452, №05-04-48422); Красноярский Краевой Фонд Науки (№ 9F37, № 10F026C, 1F0099, 5F0029).

Washington (USA); EC grant ERB IC15-CT96-0103 (The Netherlands); EU contract CHGE-CT94-0061 (The Netherlands); NWO Grant 047.007.021 for Dutch-Russian research cooperation (The Netherlands).

Личный вклад автора.

Автор принимал личное участие в планировании и проведении основного комплекса исследований, результаты которых представлены в диссертационной работе. Им обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. При его основном участии проводились эксперименты по изучению механизмов адсорбции-десорбции белковых молекул на поверхности частиц детонационных наноалмазов. С его непосредственным участием проводилось теоретическое обоснование и формулирование основных положений новых технологий выделения и очистки белков, основанных на лигандообменных взаимодействиях и применении наноалмазов. Им лично, или под его непосредственным научным и техническим руководством разрабатывались технологии выделения рекомбинантных светоизлучающих белков и белков из природных источников с помощью ионов металлов и частиц наноалмазов. Автор принимал личное участие в обработке, систематизации, анализе и интерпретации полученных результатов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 259 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 261 источник, из них 176 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Бондарь, Владимир Станиславович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснованы и сформулированы принципиальные положения нового метода «лигандообменного разделения белков» (ЛОРБ), основанные на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием низких (милимолярные, микромолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов.

2. В модельных экспериментах показана принципиальная возможность применения метода ЛОРБ для разделения белковых молекул на примере разделения смеси коммерческих белков, включающих: фосфорилазу Б - 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу - 30 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа; лактальбумин -14,4 кДа,.

3. Разработаны схемы выделения и очистки методом ЛОРБ рекомбинантных белков, различающихся структурно-функциональной организацией и физико-химическими свойствами, из биомассы бактериальных клеток Е. coli: а) - апообелина и его мутантов с заменами в молекуле белка консервативного Cysl58 на аланин и серин, а также мутанта с делецией 14 N-концевых аминокислот; б) - апоакворина и его мутантов с делецией 7, 11 и 15 N-концевых аминокислот в молекуле белка; в) - бактериальной люциферазы.

Показано, что время выделения белков данной технологией составляет не более 1,5-3 часов и из процесса очистки исключаются хроматографическое оборудование и сорбенты. Все белки получены в высокоочищенном и гомогенном виде с выходом 35-45% для апофотопротеинов и 50-60% для бактериальной люциферазы.

5. Теоретически обоснована возможность применения детонационных наноалмазов для разделения и очистки белковых молекул, исходя из имеющихся данных о физико-химических характеристиках и свойствах частиц. В модельных экспериментах определена емкость данного материала, составляющая 0,3-0,5 мг белка на 1 мг веса частиц. Показана принципиальная возможность разделения белковых молекул в процессе их адсорбции-десорбции на поверхности частиц.

6. Разработаны технологии экспресс выделения и очистки с помощью частиц наноалмаза светоизлучающих рекомбинантных белков (апообелин, люцифераза) из штаммов-продуцентов Е. coli и ферментов из природных источников (грутатионредуктаза из печени быка, лизоцим из куриного яйца). Время выделения белков данной технологией составляет не более 30-60 минут, из процесса очистки исключается хроматографическое оборудование. Все белки получены в высокоочищенном и гомогенном виде с выходом от 35-40% до 45-60%.

7. Показано, что связывание белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза может осуществляться посредством образования ковалентных (например, -S-S-) и координационных связей, ионообменных и гидрофобных взаимодействий. Это позволяет рассматривать частицы наноалмаза как универсальный сорбент, на котором можно выполнять разные типы хроматографий.

8. Из частиц наноалмазов получен сорбент, который можно использовать в колоночной хроматографии обычного давления. Показано, что емкость сорбента по отношению к маркерному белку (цитохром С) составляет 0,2 - 0,4 мг на 1 мг носителя.

9. Созданы прототипы люминесцентных индикаторных тест-систем (биочипов), в которых основным элементом являются частицы наноалмаза, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза). Показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена решению проблем создания высокоэффективных технологий разделения и очистки белков, основанных на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий ионов двухвалентных металлов с белковыми макромолекулами, а также на применении частиц детонационных наноалмазов в нетрадиционной области использования этого материала - белковой химии, основанном на способности наночастиц адсорбировать белковые макромолекулы. При этом основные усилия в экспериментальных исследованиях фокусировались на создании таких методических подходов, которые позволили бы значительно упростить и удешевить процедуры выделения искомых белков как из рекомбинантных штаммов-продуцентов, так и из природных источников. Предполагалось, что новые технологии позволят минимизировать аппаратурное оснащение, применяемое для процедур разделения и очистки белков, за счет исключения из процесса дорогостоящего специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, а также приведут к сокращению временных затрат, необходимых для получения целевых продуктов. Несомненно, что реализация заявляемых в работе новых методов требовала как их предварительного теоретического обоснования, так и последующего изучения возможности применения в практических целях.

При обосновании целесообразности выбора такой темы диссертационной работы, оправданности основной цели научного исследования и постановки экспериментальных задач, при выполнении которых она достигалась, учитывались известные факты и обстоятельства, которые рассматриваются ниже.

Совершенно очевидно, что за минувшее столетие накоплен колоссальный опыт и знания в области разделения самых разных веществ и, в том числе, макромолекул биологического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты) (например, Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003; Руденко

Б.А. (отв. ред.), 2003). В свою очередь, это предопределило развитие и значительный прогресс в понимании тонких механизмов функционирования сложно организованных биологических систем, включая организм человека, поскольку этому способствовало выделение многих биологических макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в чистом виде, что позволило перейти к последующему изучению их структурно-функциональной организации и свойств.

Теоретические основы различных методов выделения и фракционирования биополимеров (в частности, белков) основательным образом проработаны и подробно излагаются в большом количестве монографических изданий, учебников, методических руководств, пособий и рекомендаций. И хотя арсенал технологических приемов, применяемых в современной белковой химии в этих целях, весьма широк, тем не менее, наиболее значимые успехи в сепарации и очистке биологических макромолекул, как самостоятельной области биохимии, обоснованно связывают с появлением хроматографии.

Активное внедрение этого метода в разные сферы деятельности человека объясняется тем, что по универсальности и эффективности разделения сложных многокомпонентных смесей с хроматографией не может конкурировать ни один из известных методов (Руденко Б.А. (отв. ред.), 2003; Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003). В свою очередь, широкое применение методов хроматографии для решения практических задач в таких отраслях как промышленность, экология, биология, медицина, фармакология и т.д. стимулировало развитие приборостроения, в котором используются передовые достижения микроэлектроники, пневматики, теплотехники, оптики, высокоточной механики, автоматики, микропроцессорного управления и компьютерной обработки данных.

Известные фирмы, которые являются мировыми лидерами в этой сфере («Bio-Rad», «Sigma» и «Aldrich» (США); «Toyo-Soda» (Япония); «Мегск» и

Serva» (Германия); ранее «ЬКВ» и «Pharmacia» (Швеция), а в настоящее время «Amersham» и другие), разрабатывают и производят широкий ассортимент соответствующего аппаратурного оснащения и сорбентов, которые применяются в жидкостной колоночной хроматографии, занимающей центральное место среди технологий разделения и очистки белков (Остерман JI.A., 1985; Скоупс Р, 1985). Причем в последние годы отмечается тенденция к миниатюризации аппаратуры, применяемой для хроматографических технологий. Портативное оборудование при сохранении эффективности более экономично в эксплуатации и становится все более популярным для использования в исследовательских и диагностических лабораториях (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003; Руденко Б.А. (отв. ред.), 2003). Благодаря этому, на вооружении исследователей, работающих, например, в области биологической химии, имеется приборный парк, позволяющий решать практические задачи, связанные с выделением и очисткой биомолекул.

В тоже время нельзя не заметить, что, несмотря на высокий уровень технической оснащенности и обилие технологий сепарации биологических макромолекул, применяемых в современной биохимии, научный поиск новых путей и методических приемов их выделения и очистки по-прежнему продолжается и остается актуальным. Более того, в последнее время наблюдается заметная активность в этом направлении. Причем основные усилия экспериментаторов направлены на разработку и создание высокоэффективных технологий, которые позволяют упростить, удешевить и убыстрить процессы выделения и очистки биомолекул. Вполне вероятно, что такая тенденция объясняется успехами, которые были достигнуты за последние 10-15 лет в области молекулярной биотехнологии. К основным достижениям в области молекулярной биологии и генной инженерии, которые способствовали развитию биотехнологии в целом можно отнести следующие:

1. Благодаря развитию рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, в настоящее время стало возможным получение штаммов-продуцентов практически любого белка (Ferguson Н.А., Goodrich J.A., 2001).

2. Открылись возможности получения не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов (Kidokoro S., 1998).

3. Разработка и создание рекомбинантных штаммов-продуцентов позволяет решать серьезные проблемы, связанные с наличием надежных и стабильных источников исходного сырья для наработки изучаемых белков в больших количествах (Глик Б., Пастернак Д., 2002).

В значительной мере решение этих вопросов с одной стороны открыло новые возможности и перспективы получения множества белков в препаративных количествах, с другой - способствовало возникновению и развитию новой ветви молекулярной биологии - протеомики. До недавнего времени такого рода работы либо сдерживались, либо были серьезно затруднены в силу того, что природные источники не могли обеспечить значительных количеств изучаемых и используемых белков.

Исходя из этого, очевидно, что разработка и создание новых (адекватных разнообразию решаемых задач) высокоэффективных технологий получения чистых белков приобретает в настоящее время большую актуальность и значимость. В тоже время, такой подход вполне оправдан еще и с экономической точки зрения, поскольку при дефиците финансирования российской науки и слабой развитости отечественного хроматографического приборостроения он является в настоящий момент одним из рациональных путей выхода из сложившейся ситуации.

Технологии, позволяющие решать задачи быстрой наработки чистых белков с минимальными затратами, не только позволят расширить арсенал известных методов белковой химии. Решение проблемы быстрого получения больших количеств чистых белков в целом будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - поиску путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии (Jackson RJ. et al., 1996).

В результате исследований, проведенных при выполнении работы, были разработаны две новые экспресс-технологии, позволяющие проводить выделение и очистку целевого белка из сложных белковых смесей и пригодные для применения в области прикладной биохимии.

Создание нового метода (технологии), получившего название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основывалось на экспериментальных данных и, прежде всего, установлении феномена преципитации белковых молекул при добавлении малых (микромолярные, милимолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов к белковым растворам. Установленные экспериментальные факты и анализ известных данных из таких областей знаний как физическая химия ионов двухвалентных металлов в растворе, координационная химия, молекулярная биология и химия белка, позволили высказать и обосновать идею создания новой технологии разделения и очистки белковых макромолекул, основанной на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий белок - ион двухвалентного металла в растворе.

В самом общем виде идеология нового метода может быть представлена следующим образом. Вначале искомый белок переводится в осадок за счет образования нерастворимых координационных (хелатных или межмолекулярных) комплексов с ионами двухвалентных металлов, добавляемых в исходный образец (экстракт). После этого целевой продукт селективно извлекается из преципитата посредством его лигадообменного замещения в координационном комплексе свободным лигандом.

Оба этапа (и вся технология в целом) предполагают возможность их оптимизации и модификации с учетом физико-химических особенностей строения и свойств выделяемого белка. В зависимости от решаемой задачи (выделение индивидуального белка или группы белков) осуществляется подбор экспериментальных условий (нативные или денатурирующие условия, буферная система, рН и температура среды, и т.д.). При этом используемый ион двухвалентного металла и его концентрация являются индивидуальными и в каждом конкретном случае могут быть подобраны эмпирически. Селективность экстракции и, как следствие, качество получаемого технологией ЛОРБ конечного продукта определяется выбором используемого свободного лиганда (или комбинацией нескольких лигандов), его концентрацией, рН применяемого элюента или сочетанием этих факторов.

Идея о возможности применения детонационных наноалмазов в нетрадиционной области использования этого материала, а именно, при создании новых технологий сепарации и очистки белковых макромолекул основывалась на анализе известных данных о физико-химических свойствах этих наночастиц. В этой связи следует отметить, прежде всего, размерный фактор (4-6 нм) частиц наноалмаза (первичных нанокристаллитов), обеспечивающий высокоразвитую поверхность материала (до 300 - 420 м /г), и, что особенно важно, выраженный химический полиморфизм их поверхности. Известно, что на поверхности детонационных наноалмазов обнаруживается значительное количество различных, высокоактивных с химической точки зрения, функциональных групп (гидроксильные, карбоксильные, карбонильные, эфирные и др.), присутствуют различные углеводородные фрагменты взрывчатых веществ и микропримеси металлов (Чиганова Г.А, 1994; Чиганова Г.А. и Чиганов А.С., 1999; Долматов В.Ю., 2001). Такой набор физико-химических характеристик и свойств частицы наноалмаза приобретают в процессе технологического цикла их получения, включающего синтез с использованием энергии взрыва и последующую химическую очистку от сопутствующих примесей.

Перечисленные выше свойства наноалмазов позволили рассматривать их как материал, который должен обладать превосходными адсорбционными свойствами по отношению к различным соединениям биологической (в частности, белковым макромолекулам) и небиологической природы и, следовательно, имеющий перспективы практического применения как новый адсорбент. Более того, с химической точки зрения, наличие выраженного химического полиморфизма поверхности наночастиц, содержащей широкий спектр функциональных групп, углеводородных фрагментов и микропримесей металлов, позволяло предполагать возможность разных механизмов взаимодействия с ней белковых молекул, например, координационных, ковалентных, ионообменных и гидрофобных, одновременного вовлечением в процесс связывания белка нескольких механизмов.

В свою очередь, высказанные предположения о различных механизмах связывания белков с наночастицами алмаза дали основание полагать, что данный материал может являться универсальным сорбентом, позволяющим осуществлять разные типы хроматографий, например, лигандообменную (или металл-хелатную), ковалентную, ионообменную и гидрофобную. Причем, в ходе одной процедуры разделения и очистки белков с применением наноалмазов появляется возможность проведения разных типов хроматографий. Надо заметить, что такой универсальностью не обладает ни один из известных сорбентов, применяемых в настоящее время в белковой химии и производимых ведущими зарубежными фирмами (например, Pharmacia, Amersham, Sigma и др.).

Обоснованность и правильность теоретических предпосылок, высказанных относительно возможности создания новых технологий, были подтверждены результатами предварительных исследований. В ходе выполнения модельных экспериментов с использованием коммерческих препаратов маркерных белков была продемонстрирована принципиальная возможность сепарации белковых макромолекул как с помощью метода ЛОРБ, так и с помощью наноалмазов взрывного синтеза.

Одним из основных моментов всей диссертационной работы являлось экспериментальное подтверждение применимости и эффективности разработанных методов (технологий) для решения с их помощью прикладных задач в области белковой химии, связанных с выделением и очисткой белков. Исходя из этого, практическое применение новых технологий было проиллюстрировано в работе примерами выделения разных белков как из рекомбинантных штаммов-продуцентов (бактериальные клетки Е. coli) так и из природных источников (печень быка, белок куриных яиц). Причем, при проверке выделения искомых белков новыми технологиями решались задачи максимальной сложности, а именно, получить высокоочищенные препараты целевых продуктов из сложных белковых смесей (грубых экстрактов), содержащих полный набор белков после разрушения исходной биомассы, и не подвергавшихся предварительным способам фракционирования. Такой подход представлялся вполне оправданным, поскольку давал информацию о возможностях новых методов и позволял оценить их надежность, воспроизводимость и эффективность.

Проведенные исследования показали возможность применения новых технологий в практических целях. С помощью метода ЛОРБ и технологий, основанных на использовании частиц наноалмаза, были выделены рекомбинантные светоизлучающие белки группы

Са - активируемых фотопротеинов (апообелин, апоакворин, их различные мутанты) и бактериальная люцифераза из бактериальных клеток Е. coli, а также ферменты из природных источников - глутатионредуктаза из печени быка и лизоцим из белка куриных яиц. Следует подчеркнуть, что перечисленные белки принадлежат к разным классам ферментов, имеют существенные отличия в структуре и физико-химических свойствах. Несмотря на это, применение новых технологий позволило успешно провести их очистку из сложных белковых смесей и получить целевые продукты высокого качества и с высоким выходом.

Анализ полученных в работе результатов позволяет выделить наиболее общие и важные преимущества практического применения разработанных новых технологий для выделения и очистки белков:

1. Простота и экономичность технологий. Выделение искомого белка с применением как метода ЛОРБ, так и детонационных наноалмазов проводится при минимальном аппаратурном оснащении, что существенно облегчает задачу исследователя. В обоих вариантах из процесса очистки исключается дорогостоящее специализированное хроматографическое оборудование, применяемое в колоночной хроматографии, а при использования метода ЛОРБ еще и сорбенты. Надо заметить, что в случае использования метода ЛОРБ это является принципиальным положительным отличием от общеизвестных технологий «лигандообменной хроматографии» (Helfferich F., 1961; Даванков В.А. и др., 1989) и «металло-хелат-аффинной» хроматографии (Porath J. et al., 1975),

2. Быстрота процедуры выделения. Схемы выделения и очистки белков с помощью разработанных технологий характеризуются минимумом промежуточных и подготовительных этапов, что существенно сокращает затраты времени на получение целевого продукта. Так, выделение белков технологии ЛОРБ составляет не более 1.5 - 3.0 часов, а применение наноалмазов около 30 - 60 минут. Для сравнения отметим, что выделение перечисленных выше ферментов стандартными технологиями, включающими значительное число промежуточных (подготовительных) этапов и несколько стадий колоночной хроматографии, занимает не менее 23 суток (Бондарь B.C. и соавт., 1988; Бондарь B.C. и соавт., 1992; Bondar V.S. et al., 1995; Illarionov В.А. et al., 2000).

3. Эффективность технологического процесса. Выход искомых белков, полученных как с помощью технологии ЛОРБ, так и с применением наночастиц алмаза высок и составляет от 35-45% (апообелин, апоакворин, мутанты апофотопротеинов, глутатионредуктаза) до 50-60% (люцифераза). При этом все целевые продукты по данным SDS-электрофореза были получены в высокоочищенном и гомогенном виде.

4. В случае применения для очистки частиц наноалмазов, возможность в процессе технологического цикла параллельно с выделением проводить концентрирование белка, что весьма затруднительно сделать в условиях обычной колоночной хроматографии.

В дополнение нельзя не отметить также, что анализ результатов, полученных при использовании технологии ЛОРБ в практических целях, позволил обосновать и предложить общую схему выделения и очистки белков этим методом. Предложенная схема позволяет экспериментатору осуществить выбор стратегии и поиск оптимальных вариантов технологии, исходя из особенностей строения и физико-химических свойств выделяемого белка.

В тоже время, анализ данных, полученных при исследованиях механизмов взаимодействия белковых макромолекул с поверхностью частиц наноалмазов, позволяет прогнозировать возможность применения этого материала как универсального сорбента для проведения разных типов хроматографического разделения белков.

Подводя итог исследованиям, выполненным в представленной диссертационной работе в целом, и суммируя полученные при этом экспериментальные результаты можно сделать заключение общего характера. С большой долей уверенности можно говорить о том, что созданы новые высокоэффективные технологии сепарации белков, основанные на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий и применении наноалмазов детонационного синтеза, расширяющие арсенал известных методов, применяемых в белковой химии, и позволяющие в значительной степени интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых макромолекул. Разработанные технологии позволяют без применения оборудования, используемого в колоночной хроматографии, и сорбентов, с минимальными затратами времени осуществлять эффективное выделение белков, имеющих существенные различия в структурно-функциональной организации и физико-химических свойствах, и получать их в высокоочищенном и гомогенном виде. Исходя из этого, есть все основания полагать возможность их широкого применения в биологической химии. Данные методы хорошо зарекомендовали себя и используются в практических целях в Институте биофизики СО РАН. Кроме того следует отметить, что технология очистки белков с помощью частиц наноалмаза в целом и, в частности, эффективное выделение с их помощью рекомбинантного апообелина из биомассы Е. coli, была полностью воспроизведена, прошла независимую экспертизу в университете города Дарема (School of Biological & Biomedical Sciences, University of Durcham) (Англия) и получила положительную высокую оценку.

Изложенные выше факты отражают практический аспект выполненной работы. В тоже время, вполне очевидно, что полученные данные могут представлять и фундаментальное значение. Например, установленный в ходе исследований феномен преципитации белков в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов дополняет и расширяет представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ион металла - белковая макромолекула, что имеет общебиологическое значение. В настоящий момент нельзя исключить, что полученные новые знания позволят взглянуть с несколько иных позиций на регуляторные механизмы функционирования сложноорганизованных биологических систем, в которых участвуют ионы двухвалентных металлов.

В тоже время, анализ имеющихся данных о физико-химических свойствах частиц детонационных наноалмазов и проведенные в работе исследования позволили обосновать, сформулировать и развить новое научное направление по изучению механизмов взаимодействия наночастиц с белковыми молекулами. При этом полученная новая информация не только расширяет представления о свойствах этого материала, традиционно используемого в физических, физико-химических исследованиях и технических приложениях, но и открывает новую возможность его изучения и использования в различных областях биологии. Обоснованность высказанного предположения уже подтверждается результатами представленной работы. В ходе ее выполнения была показана принципиальная возможность создания нового класса индикаторных тест-систем (биочипов) с использованием детонационных наноалмазов, несущих на своей поверхности маркерные, например, светоизлучающие (обелин, бактериальная люцифераза) белки. Продемонстрирована также возможность применения таких индикаторов в биолюминесцентном анализе.

В заключении целесообразно выделить и рассмотреть те перспективные направления дальнейших исследований, которые основываются на результатах выполненной работы и являются ее логическим продолжением.

Интерес представляют исследования применимости разработанных методов для последовательного выделения с их помощью нескольких целевых продуктов (белков) в ходе одного технологического цикла, что могло бы еще больше повысить их эффективность и экономичность. Как правило, в биохимических исследованиях усилия экспериментатора оправданно фокусируются на выделении и очистке одного искомого белка и под решение этой задачи разрабатывается конкретная технологическая схема. При этом остальные белковые молекулы, естественно, рассматриваются как нежелательные балластные примеси и по этой причине отбрасываются. В тоже время, с практической точки зрения это не всегда оправдано и экономично при промышленном производстве белковых препаратов. В связи с этим, разработка методических приемов, позволяющих получать за один технологический цикл несколько целевых продуктов высокого качества, представляется весьма перспективной. Анализ результатов, полученных в работе, свидетельствует в пользу потенциальной возможности адаптации метода ЛОРБ и технологий с применением наноалмазов под решение таких задач. Более того, надо заметить, что такие исследования уже начаты, а предварительные результаты модельных экспериментов вселяют надежду в перспективность данного направления.

Актуальным направлением является изучение возможностей внедрения и адаптации новых технологий в промышленное производство белковых препаратов, что также потребует дополнительных исследований. Из практической биохимии хорошо известно, что переход от аналитических и полупрепаративных вариантов выделения и очистки белка по отработанной технологической схеме к препаративному или крупномасштабному получению целевого продукта может сопровождаться снижением его качества. Как правило, это сопряжено с дополнительными исследованиями, направленными на коррекцию и адаптацию имеющейся технологии.

Нельзя не отметить, что наряду с эффективным использованием наноалмазов для очистки белков в объеме, не менее перспективным представляется применение наночастиц и как нового материала для колоночной хроматографии. Причем для задач белковой химии наиболее ценным, вероятно, будет являться создание нового класса сорбентов для хроматографии обычного давления. Принципиальная возможность этого уже показана в данной работе. Мы полагаем, что проведение в рамках данного направления исследований по модификации поверхности наночастиц различными методами (физические, химические, биологические), позволит еще больше расширить спектр возможностей этого материала в практической биохимии, например, при создании класса сорбентов селективного действия.

Не менее многообещающим направлением применения наноалмазов в биологии является разработка на их основе новых индикаторных систем регистрации (биочипов), в которых сенсорным элементом является комплекс наночастица-маркерный белок. Во многом, этому будет способствовать и продолжение исследований, направленных на развитие представлений о механизмах взаимодействия наноалмазов и белковых молекул, включая теоретический анализ и построение теоретических моделей, отражающих общие процессы физико-химических взаимодействий биомакромолекул с поверхностью наночастиц. Надо отметить, что перспективность этого направления очевидна и с позиции развивающейся в настоящее время биотехнологии в целом, и с позиции отдельной ее отрасли -нанобиотехнологии. За последние годы отмечается заметный рост интереса к поиску новых методических подходов в разработке и создании миниатюрных полифункциональных систем регистрации, пригодных для использования различных сферах биологии и медицины (например, MacBeath G., 2002; Templin M.F. et al., 2002; Warren E.N. et al., 2004; Stoll D. et al., 2005; Poetz O. et al., 2005). Изучается также возможность применения для этих целей нанометровых частиц разной физической природы и химических свойств.

В тоже время, эффект взаимодействия белков с наночастицами детонационного синтеза может быть использован и при создании сложных надмолекулярных структур (комплексов) и новых композиционных материалов, в которых белковые молекулы выполняют роль «сшивающих» агентов. Результаты исследований в этом направлении могут, вероятно, представлять не только академический интерес, но быть востребованными, например, в области физики, микроэлектроники и техники.

И, наконец, весьма интересным, многообещающим и перспективным является направление, связанное с использованием наноалмазов как нового материала медицинского назначения. Полученные в работе данные позволяют прогнозировать возможность применения наноалмазов в области медицины, например:

1) как энтеросорбента для выведения из организма или как адсорбента для удаления с поверхности, например, открытых посттравматических и ожоговых ран нежелательных и токсичных соединений белковой и небелковой природы (продукты метаболизма, токсины, тяжелые металлы, радионуклиды, ксенобиотики и т.п.);

2) в качестве носителя препаратов, применяемых в лечебных целях (например, различные лекарства, ферменты, изотопы и т.д.), и транспортера биомакромолекул и веществ, адсорбированных на частицы, через мембраны к биологическим мишеням;

3) для разработки новых аналитических тест-систем, расширяющих арсенал диагностических методов, и создания новых методических приемов, пригодных для применения в лечебной практике.

Совершенно очевидно, что более обоснованная и объективная оценка возможности (или невозможности) применения любого нового материала в медицинской практике требует предварительной и всесторонней экспериментальной проверки его воздействия на сложноорганизованные биологические системы (например, организм животных). Такого рода исследования до недавнего времени были существенно затруднены (или невозможны), поскольку наноалмазы, выпускаемые в России и за рубежом, из-за малой коллоидной стабильности в гидрозолях (водных коллоидах) быстро образуют осадки. Это не позволяет получать золи с точной концентрацией частиц, проводить их стерилизацию, хранить в замороженном виде и применять в длительных медико-биологических экспериментах. Однако недавно в ИБФ СО РАН получены модифицированные наноалмазы, которые лишены перечисленных недостатков и адаптированы для медико-биологических исследований (Бондарь B.C., Пузырь А.П., 2004).

Модифицированные наночастицы обладают рядом уникальных свойств (Puzyr А.Р. et al., 2005) и пока не имеют аналогов в мировой практике, а технологии их получения подтверждены патентами (Пузырь А.П., Бондарь B.C., 2005а, б). Благодаря появлению модифицированных наноалмазов открываются реальные возможности и перспективы проведения комплексных исследований медико-биологического характера.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бондарь, Владимир Станиславович, Красноярск

1. Альбертсон Пер-Оке. Разделение клеточных частиц и макромолекул. М.: Мир.- 1974.-381с.

2. Арутчева А.А., Петраков А.А., Нуждин В.И., Попова Т.П. Ранняя диагностика послеоперационных нагноений при эндопротезировании тазобедренного сустава // Вестн. хирургии. 1994. - Т. 152. - С.79-82.

3. Безвершенко И.А. Аффинная хроматография. Киев: Наукова думка. -1978.- 127с.

4. Беленький Б.Г., Виленчик JI.3. Хроматография полимеров. М.: Химия.- 1978.-343с.

5. Белошапко А.Г., Букаемский А.А., Ставер A.M. Образование ультрадисперсных соединений при ударно-волновом нагружении пористого алюминия. Исследование полученных частиц // Физика горения и взрыва. -1990. Т.26. - С.93-98.9+

6. Бондарь B.C. Са -активируемый фотопротеин обелин из гидроидных полипов Obelia longissima // Дисс. канд. биол. наук. -Красноярск. 1992. - 131с.

7. Бондарь B.C. О возможной биологической функции кадмия как аналога кальция // Доклады РАН. 1997. - Т.352. С.693-694.

8. Бондарь B.C., Лихачева Л.А. Способ разделения ферментов тиол-дисульфидного обмена из печени крыс на ДЭАЭ-сефадексе. // В сб.: Вклад молодых ученых Красноярья в программу «Здоровье», Красноярск, 1982. -С.15-16.

9. Бондарь B.C., Пузырь А.П. Наноалмазы для биологических исследований // Физика твердого тела. 2004. -Т.46. - С.698-701.

10. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Летунов В.Н. Получение высокоочищенной глутатионредуктазы из гидроидных полипов Obelialongissima и изучение некоторых ее физико-химических свойств // Препринт №123Б Института биофизики СО АН СССР, Красноярск. 1990. - 32с.

11. Бондарь B.C., Кузнецов П.В., Межевикин В.В. Синтез, скрининг и использование новых аффинных адсорбентов для получения высокоочищенных НАДФ(Н)-зависимых ферментов. // Препринт №63Б Института физики СО АН СССР, Красноярскю 1987. - 35с.

12. Бондарь B.C., Кузнецов П.В., Межевикин В.В. Получение высокоочищенных НАДФ(Н)-зависимых ферментов из печени крыс с использованием НАДФ-гидразидоадипоилоксипропил сефарозы // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. - Т.24. - С.361-367.

13. Бондарь B.C., Трофимов К.П., Высоцкий Е.С. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima // Биохимия. 1992. - Т.57. - С.1481-1490.

14. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Использование фотопротеина из гидроида Obelia longissima для измерения внутриклеточного Са в макрофагах // Препринт №137Б Института биофизики СО АН СССР, Красноярск. 1990. - 45с.

15. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima // Цитология. 1991а. - Т.ЗЗ. - С.57-66.

16. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Межевикин В.В., Райбекас А.А. Получение препарата бактериальной люциферазы для биолюминесцентного анализа // Прикладная биохимия и микробиология. -1988.-Т.24.-С.745-753.

17. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Рожманова О.М, Воронина С.Г. Са2+-активируемый фотопротеин обелин как индикатор кальциевого транспорта в протеолипосомах, включающих мембраны Т-системы скелетных мышц // Биохимия. 19916. - Т.56. - С.806-811.

18. Бондарь B.C., Пуртов К.В., Маликова Н.П., Франк JI.A., Илларионов Б.А. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина // Биохимия. 2001. - Т.66. - С. 12451251.

19. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск: Изд-во Томского университета. - 1974. - 208с.

20. Варламов В. П., Лопатин С. А., Рогожин С. В. Лигандообменная хроматография ферментов. I. Синтез хелатирующих сорбентов и очистка экзонуклеазы А5 от актиномицинов // Биоорг. Химия. 1984. - Т. 10. - С.927-934.

21. Галаев И.Ю. Новые методы очистки белков. Аффинная ультрафильтрация. // Биохимия. -1999. Т.64. - С.1013-1021.

22. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии (Кондратьева Е.Н. ред.). Новосибирск: Наука. 1984. - 277с.

23. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. М.: Мир. -2002. 590с.

24. Горшков А.И., Евреинов В.В. Критическая хроматография макромолекул / В кн.: 100 лет хроматографии (Б.А.Руденко ред.). 2003. -С.136-184.

25. Даванков В.А. Лигандообменная хроматография прорыв в области энантиоселективных технологий / В кн.: ЮОлет хроматографии (Руденко Б.А. ред.).-2003.-С.212-232.

26. Даванков В.А., Рогожин С.В. Хроматография лигандов новый метод изучения смешанных комплексов. Стереоселективные эффекты вкомплексах меди(Н) с а-аминокислотами // ДАН СССР. 1970. - Т.193. -С.94-96.

27. Даванков В. А., Яшин Я. И. Сто лет хроматографии // Вестник Российской академии наук. 2003. - Т. 73, N 7. - С. 637-646.

28. Даванков В.А., Навратил Д., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир. 1989. - 294с.

29. Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир. 1989. - 621с.

30. Дейл 3., Мацек К., Янак Я. Жидкостная колоночная хроматография. М.: Мир. 1978.-Т.1.-554с.

31. Дин Щред.) Аффинная хроматография: Методы. М.: Мир. 1988.278с.

32. Долматов В.Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза: свойства и применение // Успехи химии. 2001. - Т.70. - С.687-708.

33. Долматов В.Ю. Биологически активные ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза // Патент Р.Ф. 2203068 МПК А61КЗЗ/44. Опубл. 04.27. 2003.

34. Дорофейчук В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом // Лабораторное дело. 1968. - №1. - С.28-30.

35. Жуховицкий А.А., Туркельтауб Н.М. Газовая хроматография. М.: Гостоптехиздат. 1962. - 240с.

36. Илларионов Б.А., Тюлькова Н.А. Штамм бактерий Escherichia coli -продуцент бактериальной люциферазы // Патент Р.Ф. №2073714, С12 N1/21 Опубл. 02. 20.1997.

37. Илларионов Б.А., Маркова С.В., Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гительзон И.И. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli Са(++)-активируемого фотопротеина из гидроида Obelia longissima // Доклады АН СССР. 1992. - Т.326. - С.911-913.

38. Истратов В. Г., Карелин А. А., Кубышкин В. А., Мозгалин А. Г., Титова М., Значение определения хитинолитической активности лизоцима вдиагностике инфицирования перитонеального экссудата // Вестник новых медицинских технологий. 1997.- Т.4. - С.58-60.

39. Каграманова К.А., Ермольева З.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима // Антибиотики. 1966. - №10. -С.317-319.

40. Каргер Б. Связь теории и практики в высокоскоростной жидкостной хроматографии / В кн.: Современное состояние жидкостной хроматографии (Киркленд Д. ред.). М.: Мир. 1974. - С.9-45.

41. Карелин А.А., Короткина Р.Н. Некоторые современные аспекты диагностической энзимологии с помощью органоспецифических ферментов // Вестник АМН СССР. 1984. - № 8. - С.89-94.

42. Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия. 1986. - 272с.

43. Киркленд Д. Современное состояние жидкостной хроматографии. М.: Мир, 1974.-325с.

44. Коликов В.М., Мчедлишвилли Б.В. Хроматография биополимеров на макропористы кремнеземах. JL: Наука. 1986. - 192с.

45. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. 1981. -272с.

46. Кратасюк В.А., Гительзон И.И. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе // Успехи микробиологии. 1987. -Т.21. -С.3-30.

47. Кузнецов П.В., Бондарь B.C. Новые НАДФН-содержащие аффинные сорбенты для очистки дисульфидредуктазных ферментов. // В сб.: Пятый Всесоюзный симпозиум по химии и физике белков и пептидов. -Баку.- 1980.-С.82.

48. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Типы режимов // Журнал физической химии. 1995. - Т.69. -С.1080-1084.

49. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Хроматограммы убывающего типа // Журнал физической химии. -1997. — Т.71. — С.1877-1881.

50. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир. 1974. - 957с.

51. Лещенко И.Г. Активность лизоцима сыворотки крови при ранениях и тяжелой политравме // Военно-медицинский журнал. 1981. - №9. - С.61-62.

52. Майстренко В.Н., Круглов Э.А. Эколого-аналитический мониторинг диоксинов: состояние проблемы и пути решения // Экологические проблемы регионов России. № 4. М.: ВИНИТИ, 1997. С. 6176.

53. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии. М.: Мир. -1970.-567с.

54. Межевикин В.В., Заворуев В.В., Высоцкий Е.С., Родичева Э.К. Способ получения препарата бактериальной люциферазы // А.с. СССР №1035062. Опубл. в БИ №30 1983.

55. Мецлер Д.Е. Биохимия. М.: Наука. 1980. - Т1. - 407с.

56. Нидервайзер А. и Патаки Г. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. М.: Мир. 1974. - 462с.

57. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение. -1987.-815с.

58. Онучак Л. А., Даванков В.А., Кудряшов С.Ю. Расчет стандартных термодинамических функций сорбции в газожидкостной хроматографии // Журнал физической химии. 2003. - Т.77. - С. 1677-1682.

59. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. 1981. -288с.

60. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука. 1983. - 304с.

61. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. 1985.-536с.

62. Пермяков Е.А. Парвальбумин и родственные кальцийсвязывающие белки. М.: Наука. 1985. - 191с.

63. Полякова А.А., Ревельский И.А., Токарев М.И., Коган Л.О., Тальрозе В.А. Масс-спектральный анализ смесей с применением ионно-молекулярных реакций. М.: Химия. 1989. - 240с.

64. Пузырь А.П., Бондарь B.C. Способ получения наноалмазов взрывного синтеза с повышенной коллоидной устойчивостью // Патент РФ №2252192 С2, С01 В31/06, Опубл. 20.05.2005а Бюл. №14.

65. Пузырь А.П., Бондарь B.C. Способ обработки наноалмазов // Патент РФ №2258671 С2, С01 В31/06, Опубл. 20.08.20056 Бюл. №23.

66. Пузырь А.П., Бондарь B.C., Белобров П.И., Букаемский А.А. Получение комплекса наноалмаз белок - 8-оксид алюминия. // Доклады РАН. - 2000. - Т.373. - С.408-410.

67. Рогинский С.З., Яновский М.И., Берман А.Д. Основы применения хроматографии в катализе. М.: Наука. 1972. - 376с.

68. Родичева Э.К., Выдрякова Г.А., Медведева С.Е. Каталог культур светящихся бактерий. Новосибирск: Наука. 1997. - 125с.

69. Руденко Б.А. (отв. ред.). 100 лет хроматографии. М.: Наука. 2003. - 739с.

70. Самсонов Г. В., Меленевский А. Т. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии. Л.: Наука. -1986.- 229с.

71. Скороход О. Р., Варрава А. Г. Комплексы тиомочевины с кадмием в сульфокатионитахКУ-2//ЖФХ.- 1972.-V.46.-P. 1708-1715.

72. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985. - 358 с.

73. Ставер A.M., Губарева Н.В., Лямкин А.И., Петров Е.А. Ультрадисперсные алмазные порошки, полученные с использованием энергии взрыва // Физика горения и взрыва. 1984. - Т.20. - С. 100-104.

74. Степанов В.М. Молекулярная биология (Структура и функция белков). М.: Высшая школа. 1996. - 335с.

75. Тихонов А.Н., Жуховицкий А.А., Забежинский Я.Л. Поглощение газа из потока воздуха слоем зернистого материала // Журнал физической химии. 1946. - Т.20. - С.1113-1121.

76. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1977. - 302с.

77. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир. 1983. - 213с.

78. Туркова Я. Аффинная хроматография. М.: Мир. 1978. - 471с.

79. Цвет М.С. О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу // Труды и протоколы заседаний общества естествоиспытателей Варшавского университета. Отд. биол. -1903. Т.14. С.1-20.

80. Чиганова Г.А. Исследование поверхностных свойств ультрадисперсных алмазов // Коллоидный журнал. 1994. - Т.56. - С.266-268.

81. Чиганова Г. А., Чиганов С. А. Структура и свойства ультрадисперсных алмазов детонационного синтеза // Неорганические материалы. 1999. - Т.35. - С.581-586.

82. Шпигун О. А., Золотов Ю. А. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. М.: Изд-во МГУ. 1991. 200с.

83. Энтелис С.Г., Евреинов В.В., Кузаев А.И. Реакционноспособные олигомеры. М.: Химия. 1985. - 304с.

84. Aigner R., Spitzy H., Frei R. W. Separation of drug substances by modern liquid chromatography on silver impregnated silica gels // J. Chromatogr. Sci. 1976. - N8. - P.381-385.

85. Affinity chromatography: Principles and methods. Pharmacia Fine Chemicals AB publications. Uppsala. - 1979. - 218p.

86. Askonas B.A. The use of organic solvents at low temperature for the separation of enzymes: Application to aqueous rabbit muscle extract // Biochem. J. 1951. V.48. - P.42-48.

87. Andrews P. The gel filtration behaviour of proteins related to their molecular weight over a wide range // Biochem. J. 1965. - V. 96. - P. 595-606.

88. Anselstetter V., Weidemann G. Separation of glutathione reductase in human serum by gradient gel electrophoresis // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. -1979. V. 17. - P.767-769.

89. Baumann G., Chrambach A. Gram-preparative protein fractionation by isotachophoresis: Isolation of human growth hormone isohormones // Proc. Nat. Acad. Sci. 1976. - V.73. - P.732-736.

90. Bellinger J.F., Buist N.R.M. The separation of peptides from amino acids by ligand-exchange chromatography //J. Chromatogr. 1973. - V.87. - P.513-522.

91. Biveau D., Daussant J. Immunoaffinity chromatography of proteins: A gentle ant simple desorption procedure // J. Immunol. Meth. 1981. - V.41. -P. 187-392.

92. Black W. S., van Tol A., Fernando S., Horecker B. L. Isolation of a highly active fructose diphosphatase from rabbit muscle: its subunit structure and activation by monovalent cations // Arch. Biochem. Biophys. 1972. -V.151. -P.576-590.

93. Blinks J.R., Prendergast F.G., Allen D.G. Photoproteins as biological calcium indicators // Pharmacol. Rev. 1976. - V.28. - P. 1-93.

94. Blinks J.R., Wier W.G., Hess P., Prendergast F.G. Measurement of Ca2+ concentration in living cells // Prog. Biophys. Molec. Biol. 1982. - V.40. - P.l-114.

95. Bog-Hansen Т. C. Crossed immuno-affinoelectrophoresis: An analytical method to predict the result of affinity Chromatography // Anal. Biochem. 1973. -V.56.-P.480-488.

96. Bondar V.S., Sergeev A.G., Illarionov B.A., Vervoort J., Hagen W.R. Cadmium-induced luminescence of recombinant photoprotein obelin // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V.1231. - P.29-32.

97. Bucher D., Thomsen J., Nexo E. Amino terminal sequence of hog intrinsic factor//Сотр. Biochem. Physiol. В. 1979. -V62.-P. 175-177.

98. BuistN.R.M., O'Brien D. The separation of peptides from amino acids in urine by ligand exchange chromatography // J. Chromatogr. 1967. - V.29. -P.398-402.

99. Burgess J. Metal ions in solution. Chichester: Ellis Horwood; New York: Halsted Press. 1978. - 48 lp.

100. Burgess P., Appel S.H., Wuson C.A., Polk H.C. Detection of intraabdominal abscess by serum lysozyme estimation // Surgery. 1996. - V.l 15.- P.16-21.

101. Carlberg I., Mannervik B. Inhibition glutathione reductase by interaction of 2,4,6-trinitrobenzenesulfonate with the active-site ditiol // FEBS Lett. 1979. - V.98. - P.263-266.

102. Chaabouni A., Dellacherie E. Affinity partition of proteins in aqueous two phase systems containing polyoxyethylene glycol bound ligand and charged dextrans// J. Chromatogr.- 1979.- V. 171.-P. 135-143.

103. Chang R. Physical chemistry with application to biological systems / New York: Macmillan Publ. Co. -1981. 659p.

104. Chen Da-Ren, Wendt C.H., Pui D.Y.H. A novel approach for introducing bio-materials into cells // Journal of Nanoparticles Research. 2000. -V.2. - P.133-139.

105. Cooke N. H. C., Viavattene R. L., Ekstein R., Wong W. S., Davies G., Karger B. L. Use of metal ions for selective separations in high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1978. - V.149. - P.391-398.

106. Curling J. M. Methods of plasma protein fractionation / New York: Academic Press. 1980. -326p.

107. Davankov V. A. Review of ligand exchange chromatography / Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides, and Proteins. -V. 1, Hancock W. S. (ed.). CRC Press, Boca Raton, Fla. -1984. - P.393.

108. Davankov V.A. Enantioselective ligand exchange in modern separation techniques // J. Chromatogr. A. 2003. - V.1000. -P.891-915.

109. Digman J.D., Deutscher M.P. Aminoacyl-tRNA synthetase stimulatory factors and inorganic pyrophosphatase // Biochemistry. 1979. - V.18. - P.3165-3170.

110. Dobry A., Boyer-Kawenoki F. Phase separation in polymer solution // J. Polym. Sci. 1947. - V. 2. - P. 90-100.

111. Dolmatov V.Yu., Fujimura T. Physical and chemical problems of modification of detonation nanodiamond surface properties. In: Synthesis, properties and applications of ultrananocrystalline diamond (Gruen D.M.,

112. Shenderova O.A., Vul' A.Ya. eds.) / NATO Science Series. II. Mathematics, Physics and Chemistry. 2005. - V.192. - P.217-230.

113. Dong Y.S., Liang F., Yu X.Y., Guo L.A., Chang J.H. Preparation of novel magnetic dextran affinity adsorbents and their application to purify urokinase // Se pu (Chinese journal of chromatography). 2001. - V.19. - P.21-24. Chinese.

114. Eisenbarth G. S. Review: application of monoclonal antibody techniques to biochemical research // Anal. Biochem. 1981. - V.l 11. - P. 1-16.

115. Escott G.M., Adams D.J. Chitinase activity in human serum and leukocytes // Infect. Immun. 1995. - V.63. - P.4770-4773.

116. Fagan T.F., Ohmiya Y., Blinks J.R., Inouye S., Tsuji F.I. Cloning,iexpression and sequence analysis of cDNA for the Ca -binding photoprotein, mitrocomin // FEBS Lett. 1993. - V.333. - P.301-305.

117. Fanou-Ayi L., Vijayalakshmi M. Metal-chelate affinity chromatography as a separation tool // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - V. 413. - P. 300-306.

118. Fazakerley S., Best D.R. Separation of amino acids, as copper chelates, from amino acid, protein, and peptide mixtures // Anal. Biochem. 1965. - V.l2. -P.290-295.

119. Ferguson H.A., Goodrich J.A. Expression and purification of recombinant human c-Fos/c-Jun that is highly active in DNA binding and transcriptional activation in vitro. // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. P. 98-105.

120. Fernandez-Lahore H.M., Geilenkirchen S., Boldt K., Nagel A., Kula M.R., Thommes J. The influence of cell adsorbent interactions on protein adsorption in expanded beds // J. Chromatogr. A. 2000 - V.873. - P. 195-208.

121. Fleming A. On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions // Proc. Roy. Soc. Ser. B. 1922. - V.93. - P.306-17.

122. Frausto da Silva J.J.R., Williams R.J.P. The biological chemistry of the elements / Oxford: Clarendon Press. 1991. - 561 p.

123. Frei R. W., Beall K., Cassidy R. M. Determination of aromatic nitrogen heterocycles in air samples by high-speed liquid chromatography // Mikrochim. Acta.-1974.-N5.-P.859-869.

124. Fujimura К., Коуата Т., Tanigawa Т., Funasaka W. Studies in ligand-exchange chromatography. IV. Separation of hydroxybenzoic and hydroxy-naphthoic acid isomers //J. Chromatogr. 1973. - V. 85. - P. 101-106.

125. Funasaka W., Fujimura K., Kuriyama S. Ligand exchange chromatography. I. Separation of phenylaminediamine isomers // Bunseki Kagaku.- 1969.-V. 18.-P. 19-24.

126. Funasaka W., Hanai Т., Fujimura K., Ando T. Nonaqueous solvent chromatography // J. Chromatogr. 1973. - V.78. - P.424-428.

127. Gaberc-Porekar V., Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. - V.49. - P.335-360.

128. Ganizal G., Ascencio J.A., Gardea-Torresday J., Jose Yacaman M. Multiple twinned gold nanorods grown by bio-reduction techniques // Journal of Nanoparticles Research. 2001. - V.3. - P.475-481.

129. Gardea-Torresdey J.L., Tiemann K.J., Gamez G., Dokken K., Tehuacanero S., Jose-Yacaman M. Gold nanoparticles obtained by bio-precipitation from gold (III) solutions // Journal of Nanoparticles Research. 1999.- V.l. -P.397-404.

130. Goodman W.F., Baptist J.N. Isoelectric point electrophoresis: A new technique for protein purification // J. Chromatogr. 1979. - V.179. - P.330-332.

131. Gordon A.H. Electrophoresis and chromatography of amino acids and proteins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1979. - V.325. - P.94-105.

132. Gubitz G, Jellenz W, Santi W. Separation of the optical isomers of amino acids by ligand-exchange chromatography using chemically bonded phases //J. Chromatogr.- 1981.-V.203.-P.377-384.

133. Guha О. K., Janak J. Charge transfer complexes of metals in the chromatographic separation of organic compounds // J. Chromatogr. 1972. -V.68. -P.325-343.

134. Gutwein L.G., Webster T.J. Osteoblast and chondrocyte proliferation in the presence of alumina and titania nanoparticles // Journal of Nanoparticles Research. 2002. - V.4. - P.231-238.

135. Hartman A., Johansson G., Albertsson P.-A. Partition of proteins in a three-phase system // Eur. J. Biochem. 1974. - V. 46. - P. 75-81.

136. Hastings J.W., Baldwin Т.О. Nicoli M.Z. Bacterial luciferase: assay, purification and properties // Meth. Enzymol. 1978. - V.57. -P.135-153.

137. Hefti M.H., Van Vugt-Van der Toorn C.J., Vervoort J. A novel purification method for histidine-tagged proteins containing a thrombin cleavage site // Anal. Biochem. 2001. - V.295. - P. 180-185.

138. Hefti M.H., Milder F.J., Boeren S., Vervoort J., van Berkel W.J. A His-tag based immobilization method for the preparation and reconstitution of apoflavoproteins // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - V. 1619. - P. 139-143.

139. Helfferich F. Ligand exchange. A novel separation technique // Nature. 1961.-V. 189.-P. 1001-1002.

140. Helfferich F. Ligand exchange. I. Equilibria // J. Am. Chem. Soc. -1962a.-V.84.-P.3237-3241.

141. Helfferich F. Ligand exchange. II. Separation of ligands having different coordinative valencies // J. Am. Chem. Soc. 19626. - V.84. - P.3242-3246.

142. Hemdan E.S., Zhao Y.J., Sulkowski E. Porath J. Surface topography of histidine residues: a facile probe by immobilized metal ion affinity chromatography //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989. V.86. -P.l811-1815.

143. Hemmasi В. Ligand-exchange chromatography of amino acids on nickel-Chelex 1001 IJ Chromatogr. 1975. - V.104. - P.367-372.

144. Hemmasi В., Bayer E. Ligand exchange chromatography of amino acids on copper-, cobalt-, and zinc-Chelex 100 // J. Chromatogr. 1975. - V.109. -P.43-48.

145. Hockney R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli // TIBTECH. 1994. - V.12. - P.456-463.

146. Holmgren A. Pyridine-nucleotide-disulfide oxidoreductases // Experientia Suppl. 1980. -V.36. - P. 149-180.

147. Holzman T.F., Baldwin Т.О. Isolation of bacterial luciferases by affinity chromatography on 2,2-Diphenylpropylamine-Sepharose // Biochemistry. 1982. - V.21. -P.6194-6201.

148. Horejsi V. Review: Affinity electrophoresis // Anal. Biochem. 1981. -V.112.-P.1-8.

149. Horejsi V., Kocourek J. Affinity electrophoresis: Separation of phytohemagglutinins on O-glycosyl polyacrylamide gels // Meth. Enzymol. -1974. -V.34. -P.178-181.

150. Houx N. W. H., Voerman S., Jongen W. M. F. Purification and analysis of synthetic insect sex attractants by liquid chromatography on a silver-loaded resin // J. Chromatogr. 1974. - V. 96. - P. 25-32.

151. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Sequenceч iof the cDNA encoding the Ca -activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima // Gene. 1995. - V.l53. - P.273-274.

152. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator // Meth. Enzymol. 2000. -V.305. - P.223-249.

153. Inouye S., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-activated photoprotein, clytin // FEBS Lett. 1993. - V.315. - P.343-346.

154. Jackson R.J., Fujihashi К., Kiyono H., McGhee J.R. Luminometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. // J. Immunol. Methods. 1996. - V.190. - P. 189197.

155. Jacobsen D. W., Montejano Y. D., Huennekens F. M. Rapid purification of cobalamin-binding proteins using immobilized aminopropylcobalamin // Anal. Biochem. 1981. - V.113. - P. 164-171.

156. Jolles P. and Jolles J. What's new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday // Mol. Cell. Biochem. 1984. - V.63. - P.165-189.

157. Kidokoro S. Design of protein function by physical perturbation method // Adv. Biophys. 1998. - V. 35. -P. 121-143.

158. Kossovsky N., Gelman A., Hnatyszyn H.J., Sponsler E., Chow G.M. Conformationally stabilizing self-assembling nanostructured delivery vehicles for biochemically reactive pair // Nanostructured Materials. 1995a. - V.5. - P. 233247.

159. Kossovsky N., Gelman A., Hnatyszyn H.J., Rajguru S., Garrell R.L., Torbati S., Freitas S.S., Chow G.M. Surface-modified diamond nanoparticles as antigen delivery vehicles //Bioconjug. Chem. -19956. V.6. -P.507-511.

160. Kothari R. M. Some aspects of the fractionation of DNA on an IR-120 A13+ column. V. The effect of RNA contamination on the chromatographic profiles of DNA // J. Chromatogr. 1971. - V.57. - P.83-88.

161. Kula M. R. Extraction and purification of enzymes using aqueous 2-phase systems. In: Applied biochemistry and bioengineering (Wingard L.B.,

162. Katchalski-Katzir E. and Goldstein L., eds.) / New York: Academic Press. -1979.-V. 2.-P. 71-96.

163. Kunzru D., Frei R. W. Separation of aromatic amine isomers by high-pressure liquid chromatography on cadmium-impregnated silica gel columns // J. Chromatogr. Sci. 1974.-V. 12.-P. 191-196.

164. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

165. LePage J. N., Lindner W., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Resolution of the optical isomers of dansyl amino acids by reversed-phase liquid chromatography with optically active metal chelae additives // Anal. Chem. 1979. - V.51. -P.433-438.

166. Levine L.D. and Ward W.W. Isolation and characterization of a photoprotein, "phialidin", and spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phyalidium gregarium // Сотр. Biochem. Physiol. -1982. V.72B. - P.77-85.

167. Lindner W., LePage J. N., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Reversed-phase separation of optical isomers of Dns-amino acids and peptides using chiral metal chelate additives // J. Chromatogr. 1979. - V.185. -P.323-329.

168. Liu Z.J., Vysotski E.S., Chen C.J., Rose J.P., Lee J., Wang B.C. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure // Prot. Sci. 2000. - V.9. - P.2085-2093.

169. Livingstone D.M. Immunoaffmity chromatography of proteins // Meth. Enzymol. 1974.-V.34.-P.723-731.

170. Lonnerdal В., Keen C. L. Metal chelate affinity chromatography of proteins // J. Appl. Biochem. 1982. - V. 4. - P. 203-208.

171. Lopatin S.A., Varlamov P.V. A new trend toward using metal chelates in affinity chromatography of proteins (review) // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. -1995. V.31. - P.259-266.

172. Lopatin S.A., Varlamov V.P., Davankov V.A. Ligand-exchange chromatography of proteins and enzymes // Bioorg. Khim. 1990. - V.16. -P.725-750.

173. MacBeath G. Protein microarrays and proteomics // Nat. Genet. 2002. - V.32.-P.526-532.

174. Maeda M., Tsuji A., Ganno S., Onishi Y. Fluorophotometric assay of amino acids by using automated ligand-exchange chromatography and pyridoxal-zinc(II) reagent // J. Chromatogr. 1973. - V.77. - P.434-438.

175. Maslowska J., Pietek W. The use of ligand exchange for the separation of aromatic acids on synthetic cation exchangers // Chromatographia. 1985. -V.20. -P.46-51.

176. Melander W., Horvath C. Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: An interpretation of the lyotropic series // Arch. Biochem. Biophys. 1977. - V.183. - P.200-215.

177. Morin J.G. Coelenterate bioluminescence. In: Coelenterate biology. Reviews and new perspectives (Muscatine L., Lenhoff H.M. eds.) / New York: Academic Press. 1974. - P. 397-438.

178. Moroux Y., Boschetti E., Egly J. M. Preparation of metal-chelating trisacryl gels for chromatographic applications // Sci. Tools. 1985. - V. 32. - P. 1-9.

179. Morris C.J.O.R., Morris P. Molecular-sieve chromatography and electrophoresis in polyacrylamide gels //Bochem. J. 1971. - V. 124. -P.517-528.

180. Muller K.M., Arndt K.M., Bauer K., Pluckthun A. Tandem immobilized metal-ion affinity chromatography/immunoaffinity purification of His-tagged proteins evaluation of two anti-His-tag monoclonal antibodies // Anal. Biochem. - 1998.- V.259.-P.54-61.

181. Muramatsu Т., Iwanaga S.-i., Kan S. Isolation and characterization of glutathione reductase from the dark muscle of Pacific Mackerel // Bull. Jap. Soc. Sci. Fisch. 1980. - V.46. - P.757-762.

182. Nexo E. A new principle in biospecific affinity chromatography used for purification of cobalamin-binding proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.379. -P.189-192.

183. Nexo E. Purification of rabbit transcobalamin II by labile ligand affinity chromatography // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1977. - V.55. - P. 923924.

184. Nexo E., Olesen H. Purification and characterization of rabbit haptocorrin // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.667. - P.370-376.

185. Nikolova-Damyanova В., Momchilova S. Silver ion thin-layer chromatography of fatty acids. A survey // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2001. - V.24. - P. 1447 - 1466.

186. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1964,-V.121.-P.321-349.

187. Otto J., de Hernandez С. M., Walton H. F. Chromatography of aromatic acids on La-loaded ion-exchange resins // J. Chromatogr. 1982. - V. 247. - P. 9196.

188. Ouyang Q., Okada K. Friction properties of aluminium-based composites containing cluster diamond // J. Vac. Sci. Technol. A. 1994. - V.12. -P.2577-2580.

189. Peterson E. A., Sober H. A. Chromatography of proteins. I. Cellulose ion exchange adsorbents // J. Amer. Chem. Soc. 1956. - V.78. -P.751-755.

190. Petronio В. M., DeCaris E., Iannuzzi L. Some applications of ligand-exchange // Talanta. 1982. - V.29. - P.691-705.

191. Poetz O., Ostendorp R., Brocks В., Schwenk J.M., Stoll D., Joos Т.О., Templin M.F. Protein microarrays for antibody profiling: specificity and affinity determination on a chip // Proteomics. 2005. - V.5. - P.2402-2411.

192. Pogell B. N. Enzyme purification by selective elution with substrate from substituted cellulose columns // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. - V.7.-P.225-230.

193. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.F., Mears G.E.F., Joubert F.J. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of high molecular weight // Biochim. Biophys. Acta. 1964. - V.82. - P.463-475.

194. Porath J. Immobilized metal ion affinity chromatography // Protein Expr. Purif. 1992. - V.3. -P.263-281.

195. Porath J., Flodin P. Gel filtration: A method for desalting and group separation //Nature. 1959. - V.83. - P. 1657-1659.

196. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography a new approach to protein fractionation // Nature (London). -1975. - V.258. - P.598-599.

197. Puzyr A.P., Bondar V.S., Bukayemsky A.A., Selyutin G.E., Kargin V.F. Physical and chemical properties of modified nanodiamonds // NATO

198. Science Series. II. Mathematics, Physics and Chemistry (Gruen D.M., Shenderova O.A., Vul' A.Ya. Eds.), Springer. - 2005. - Vol. 192. - P.261-270.

199. Rabilloud T. (Ed). Proteome Research: Two Dimensional Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice) / Springer. -1999.-248p.

200. Racker E. Glutathione reductase from baker's yeast and beef liver // J. Biol. Chem. 1955. - V.217. - P.855-866.

201. Robertson J. Deposition of diamond-like carbon // Phil. Trans. Roy. Soc. A. 1993a. -V.342. -P.277-286.

202. Robertson J. Deposition mechanisms for promoting sp3 bonding in diamond like carbon // Diam. Rel. Mat. 19936. - V.2. - P.984-989.

203. Scopes R. K. Purification of clycolytic enzymes by using affinity elution chromatography // Biochem. J. 1977a. - V. 161. - P.253-263.

204. Scopes R. K. Multiple enzyme purifications from muscle extracts by using affinity elution chromatographic procedures // Biochem. J. 19776. -V.161. -P.265-277.

205. Scopes R. K. Techniques for protein purification. In: Techniques in the life sciences // Elsevier North-Holland, Amsterdam. 1978. - V.B101. - P. 142.

206. Scopes R. K. Quantitative studies of ion-exchange and affinity elution chromatography of enzymes // Anal. Biochem. 1981. - V. 114. - P.8-18.

207. Schwinghamer E.A. A method for improved lysis of some gram-negative bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1980. - V.7. - P. 157-162.

208. Service R.F. Nanomaterials show sins of toxity // Science. 2003. -V.300. - P.243.

209. Shahwan G. J., Jezorek J. R. Liquid chromatography of phenols on an 8-quinolinol silica gel-iron(III) stationary phase // J. Chromatogr. 1983. - V.256. -P. 9-44.

210. Sharma S., Agarwal G.P. Interactions of proteins with immobilized metal ions: a comparative analysis using various isotherm models // Anal. Biochem. 2001. - V.288. - P. 126-140.

211. Shimomura K., Walton H. F. Thin-layer chromatography of amines by ligand exchange // Sep. Sci. 1968. - V. 3. - P. 493-496.

212. Shimomura 0., Johnson F.H. Structure of the light-emitting moiety of aequorin // Biochemistry. 1972. - V.l 1. - P. 1602-1608.

213. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V.59. - P.223-240.

214. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura // J. Cell. Сотр. Physiol. 1963. - V.62. - P.9-15.

215. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusingon ion-exchange columns. I. General principles // J. Chromatogr. -1978a. -V. 150. -P. 17-30.

216. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusing on ion-exchange columns. II. Experimental verification // J. Chromatogr. 19786. -V. 150.-P. 31-44.

217. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing: III. The properties of a DEAE-agarose anion exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 1981a. - V. 206. - P.429-440.

218. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing: IV. Properties of an agarose polyethyleneimine ion-exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 19816. - V. 206. - P.441-447.

219. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: Group variations in the serum proteins of normal human adults // Biochem. J. 1955. - V. 61. - P. 629-641.

220. Snyder R.V., Angelichi R.J., Meek R.B. Partial resolution of amino acids by column chromatography on a polystyrene resin containing an optically active copper(II) complex // J. Am. Chem. Soc. 1972. - V.94. - P.2660-2663.

221. Stoll D., Templin M.F., Bachmann J., Joos Т.О. Protein microarrays: applications and future challenges // Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. 2005. -V.8. -P.239-252.

222. Strynadka N.C.J., James M.N.G. Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V.58. - P.951-998.

223. Sulkowski E. Purification of Proteins by IMAC // Trends Biotechnol. -1985.-V.3. -P.l-10.

224. Sulkowski E. The saga of IMAC and MIT // Bioessays. 1989. - V.10. -P.170-175.

225. Sulkowski E. Immobilized metal-ion affinity chromatography: imidazole proton pump and chromatographic sequelae. I. Proton pump //J. Mol. Recognit. 1996a. - V.9. - P.389-393.

226. Sulkowski E. Immobilized metal-ion affinity chromatography: imidazole proton pump and chromatographic sequelae. II. Chromatographic sequelae // J. Mol. Recognit. 19966. - V.9. - P.494-498.

227. Swain A. Restrained least-squares refinement of native (Ca) and Cd-substituted carp parvalbumin using X-ray data to 1.6A resolution // Ph. D. Tesis. Univ. S. Carolina. 1988.196p.

228. Swain A.L., Kretsinger R.H., Amma E.L. Restrained least squares refinement of native (calcium) and cadmium-substituted carp parvalbumin using

229. X-ray crystallographic data at 1.6-A resolution // J. Biol. Chem. 1989. - V.264. -P.16620-16628.

230. Tanford C. The hydrophobic effect: Formation of micelles and biological membranes / New York: Wiley-Interscience. 1980. - 233p.

231. Templin M.F., Stoll D., Schrenk M., Traub P.C., Vohringer C.F., Joos Т.О. Protein microarray technology // Trends Biotechnol. 2002. - V.20. - P. 160166.

232. Ticha M., Horejsi V., Barthova J. Affinity electrophoresis of proteins interacting with blue dextran // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - V.534. -P.58-63.

233. Todd R.J., Johnson R.D., Arnold F.H. Multiple-site binding interactions in metal-affinity chromatography. I. Equilibrium binding of engineered histidine-containing cytochromes с // J. Chromatogr. A. 1994. - V.662. - P. 13-26.

234. Tsuji A., Sekiguchi K. Adsorption of nicotine acid hydrazide on cation exchanger of various metal forms // Nippon Kagaku Zasshi. 1960. - V.81. -P.847-852.

235. Tsuji F.I., Ohmiya Y., Fagan T.F., Toh H., Inouye S. Molecular evolution of the Ca -binding photoproteins of the hydrozoa // Photochem. Photobiol. 1995. - V.62. -P.657-661.

236. Tswett M.S. Physikalisch-chemische Studien uber das Chlorophyll. Die Adsorbtionen // Berichte der Deutschen botanischen Geselschaft. 1906a -Bd.24.-S. 316-323.

237. Tswett M.S. Adsorbtionanalyse und chromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls // Berichte der Deutschen botanischen Geselschaft. 1906b - Bd.24. - S. 384-393.

238. Ueda E.K., Gout P.W., Morganti L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding // J. Chromatogr. A. 2003. - V.988. P. 1-23.

239. Vogt C. R., Ryan T. R., Baxter J. S. High-speed liquid chromatography on cadmium-modified silica gel // J. Chromatogr. 1977. - V.136. - P. 221-227.

240. Von der Haar F. Affinity elution principles and applications to purification of aminoacyl-tRNA synthetases // Meth. Enzymol. 1974. - V.34. -P.163-171.

241. Wagner F.W., Shepherd S.L. Ligand exchange amino acid analysis: resolution of some amino sugars and cysteine derivatives. // Anal. Biochem. -1971. V.41. - P.314-322.

242. Walters J.A.L.I., Bont W.S. An improved method for the separation of proteins by zonal electrophoresis on density gradients // Anal. Biochem. 1979. - V.93. -P.41-45.

243. Ward W.W., Seliger H.H. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata // Biochemistry. 1974. - V. 13. - P. 1491 -1499.

244. Warren E.N., Elms P.J., Parker S.E., Borchers C.H. Development of a protein chip: a MS-based method for quantitation of protein expression and modification levels using an immunoaffinity approach // Anal. Chem. 2004. -V.76. - P.4082-4092.

245. Webster P. V., Wilson J. N., Franks M. C. Macroreticular ion-exchange resins: some analytical applications to petroleum products // Anal. Chim. Acta. -1967.-V.38.-P. 193-200.

246. Whitaker J. R. Determination of molecular weights of proteins by gel filtration on Sephadex // Anal. Chem. 1963. - V.35. - P.1950-1953.

247. Xiao S., Liu F., Rosen A.E., Hainfeld J.F., Seeman N.C., Musier-Forsyth K., Kiehl R.A. Selfassembly of metallic nanoparticle arrays by DNA scaffolding // Journal of Nanoparticles Research. 2002. - V.4. - P.313-317.

248. Yasuda K. Thin-layer chromatography of aromatic amines on cadmium sulphate-impregnated silica gel thin layers // J. Chromatogr. 1971. - V. 60. - P. 144-149.

249. Yoshikawa Y., Yamasaki K. Complete chromatographic resolution of cobalt(III) complexes on ion exchange Sephadex // Inorg. Nucl. Chem. Lett. -1970. V.6. - P.523-527.

250. Yoshikawa Y., Yamasaki K. Chromatographic resolution of metal complexes on Sephadex ion exchangers // Coord. Chem. Rev. 1979. - V.28. -P.205-211.

251. Zhao Y.J., Sulkowski E. Porath J. Surface topography of histidine residues in lysozymes // Eur. J. Biochem. 1991. - V.202. -P.l 115-1119.

252. Zhao Y.Q., Lin L., Li J.R., Tang J.A., Duan M.X., Jiang L. DNA biosensor with high sensitivity amplified by gold nanoparticles // Journal of Nanoparticles Research. -2001. V.3. - P.321-323.

Информация о работе

Бондарь, Владимир Станиславович
доктора биологических наук
Красноярск, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы