Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лигандообменное разделение рекомбинантных белков без применения хроматографии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Лигандообменное разделение рекомбинантных белков без применения хроматографии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

ПУРТОВ Константин Викторович

ЛИГАНДООБМЕННОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ БЕЗ ПРИМЕНЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИИ

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2004

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научные руководители:

академик, профессор Гнтельзон И. И.

кандидат биологических наук Бондарь B.C.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Волова Т.Г.

доктор химических наук, профессор Миронов П.В.

Ведущая организация: Красноярский государственный университет

Защита диссертации состоится «14.» 2004 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036 г. Красноярск, Академгородок.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат физ.-мат. наук e/i^'S'— Косолапова Л.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С развитием молекулярной биологии и генной -инженерии неразрывно связано развитие новых биотехнологий. В частности, в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка (Ferguson et al., 2001). Поэтому разработка и создание новых высоко эффективных биотехнологий получения белков в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость. При этом основные усилия при - их разработке направлены, прежде всего, на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белковых молекул (Галаев, 1999). Технологии, позволяющие решать задачи быстрой наработки чистых белков с минимальными затратами, не только расширяют арсенал известных методов белковой химии, но и, в свою очередь, интенсифицируют поиски путей и возможностей в расширении спектра практического применения белков, прежде всего, обладающих маркерными свойствами, например, в иммунологии, фармакологии и медицине. В связи с этим данная работа посвящена исследованиям по разработке и созданию новой высокоэффективной технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, не требующей применения хроматографического оборудования и сорбентов и позволяющей значительно, упростить и ускорить процедуру их получения.

Цели настоящего исследования — обоснование и разработка новой биотехнологии для очистки рекомбинантных белков без применения хроматографии - метода лигандообменного разделения белков (ЛОРБ).

Основные задачи исследования:

1. Сформулировать основные, принципиальные положения метода ЛОРБ и провести проверку его пригодности в модельных экспериментах на примере разделения смеси коммерческих белковых препаратов.

2. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантных Са2+-активируемых фотопротеинов: апообелина, апоакворина и их мутантных форм.

3. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из бактериальных клеток Е. coli рекомбинантной бактериальной люциферазы.

4. Разработать общую технологическую схему выделения и очистки. рекомбинантных белков методом ЛОРБ.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований был обнаружен эффект преципитации белков в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта и анализ полученных результатов позволил обосновать, разработать и предложить новый метод выделения и очистки белковых молекул, получивший название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ). Предложенный метод нашел свою практическую реализацию в решении ряда прикладных задач, связанных с выделением и очисткой различных рекомбинантных белков. На основе метода ЛОРБ были разработаны схемы выделения и очистки мономерных белков фотопротеиновой группы - апообелина, апоакворина, а также их различных мутантов. Разработана схема, позволяющая с помощью метода ЛОРБ проводить столь же эффективное выделение и очистку гетеродимерного белка - бактериальной люциферазы. На основании анализа

j РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ |

I БИБЛИОТЕКА I

» О» ТОО jmtycH

полученных результатов была обоснована и предложена общая принципиальная схема выделения и очистки белков технологией ЛОРБ. Была также предложена и продемонстрирована действующая модель технологической установки, показывающая на примере рекомбинантного апообелина возможность проведения процесса очистки белка методом ЛОРБ непрерывно.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведенные исследования дополняют и расширяют представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет несомненную общебиологическую значимость. Учитывая результаты работы можно с большой долей уверенности говорить о том, что создана новая высокоэффективная технология, основанная на принципах лигандообменных взаимодействий/ расширяющая арсенал известных методов, применяемых в белковой химии, и позволяющая в значительной мере интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых молекул. Отличаясь от известных методов простотой, метод ЛОРБ не требует использования дорогого специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, является экспрессным и позволяет с высокой эффективностью получать высокоочищенные белки из сложных белковых смесей. Это дает основания полагать, что предложенная в работе технология имеет широкие перспективы практического применения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новый метод ЛОРБ позволяет проводить разделение белковых молекул без применения хроматографии.

2. Метод ЛОРБ применим для выделения и очистки из клеточной биомассы бактериальных клеток Е. coli ряда рекомбинантных белков, таких как апобелин, апоакворин, некоторых их мутантов, бактериальной люциферазы.

3. Предложенная общая схема разделения и очистки белков методом ЛОРБ позволяет выбрать стратегию поиска оптимальных вариантов применения данного метода при решении практических задач белковой химии.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы докладывались на IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000), I Международном Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), на семинарах лаборатории - фотобиологии Института биофизики СО РАН. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 2 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 29 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 149 источников, из них 134 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для продукции апообелина, апоакворина и их мутантных форм использовали ИГПГ-индуцируемые штаммы BL21 бактериальных клеток Escherichia coli, несущие соответствующую плазмиду, выращенные в стандартной LB-среде, содержащей ампициллин (200 мг/л) при 37°С. Индукцию проводили добавлением ИПТГ.

Выращенные клетки осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин.). Разрушение клеток проводили при помощи ультразвукового дезинтегратора UD-20 (Techpan, Польша) или буфером содержащим 6М мочевины.

При очистке апообелина классическим методом использовали стандартное оборудование для обычной жидкостной хроматографии фирм «LKB» и «Pharmacia» (Швеция).

Все работы по выделению и очистке белков проводили при температуре

+4°С.

Для проведения модельного эксперимента была использована смесь коммерческих препаратов белков, используемых в качестве маркеров при проведении гель-электрофореза. Белковая смесь включала следующие белки: фосфорилазу Б - 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу — 30 кДа; ингибитор трипсина — 20,1 кДа; лактальбумин -14,4 кДа.

Чистоту белковых препаратов на этапах выделения рекомбинантных белков, оценивали электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ в присутствии 0,1%-го Ds-Na по методу Лэммли. В качестве стандартов использовали набор белков для электрофореза фирмы "Pharmacia Biotech." (США).

Белок определяли микробиуретовым методом, используя БСА в качестве стандарта. При определении белка в конечных препаратах их предварительно обессоливали гель-фильтрацией на колонке с Bio-Gel P-4.

Активацию апобелков синтетическим субстратом (перевод апофотопротеинов в активные фотопротеины) проводили инкубацией апобелков при 4°С в 20 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7,0, содержащем 15 мкМ целентеразина, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитола (5 мкл аликвоты образца помещали в 100 мкл буфера).

Биолюминесцентную активность фотопротеинов измеряли с помощью люминометра (модель БЛМ 8801) производства СКТБ "Наука" (Красноярск, Россия), калиброванного по радиоактивному стандарту Гастингса-Вебера. Одна люминесцентная единица составляла 108 фотонов в 1 с. Реакционная смесь включала 500 мкл 100 мМ Трис-НС1-буфера, рН 8,8, содержащего 10 мМ ЭДТА, и 5 мкл активного фотопротеина. Реакцию инициировали впрыскиванием в реакционную смесь 200 мкл 100 мМ Трис-НС1-буфера, рН 8,8, содержащего 100 мМ СаСЬ. Люминесцентный сигнал регистрировав с помощью самописца (модель 2210) фирмы "LKB" (Швеция).

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Ланкин, 1973). Все расчеты проводили с учетом уровня значимости а=0,05.

б

РЕУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обоснование метода ЛОРБ и проверка его применимости на примере разделения смеси маркерных белков. Метод ЛОРБ основывается, прежде всего, на известной из координационной химии и молекулярной биологии способности ионов двухвалентных металлов координироваться аминокислотными остатками белковых молекул (в основном, гистидином, цистеином и триптофаном) с образованием хелатных комплексов. В тоже время, обнаруженный в работе эффект преципитации белковых молекул при добавлении низких (микромолярные, милимолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов к белковым растворам свидетельствует о том, что образование хелатных комплексов белок-металл сопровождается денатурацией белка. Из белковой химии известно, что приобретение (или потеря) отдельными участками белковой молекулы зарядов одного знака приводит к нарушению ее внутримолекулярных электростатических сил и к последующей денатурации. При этом принципиальным положительным отличием предлагаемого метода от известного метода металло-хелат-аффинной хроматографии является то, что взаимодействия белковых молекул с ионами осуществляются в растворе, в результате чего не требуется создания специальных сорбентов и использования специализированного хроматографического оборудования. В процессе образования хелатных комплексов последовательность денатурации белков, очевидно, будет определяться размерами белковых молекул, наличием и числом дисульфидных связей в них, количеством доступных аминокислотных остатков, участвующих в координации, природой иона и его концентрацией, а также величиной рН применяемого буфера. Естественно было предположить, что белки, различающиеся своими аминокислотными последовательностями и физико-химическими свойствами, при различных экспериментальных условиях будут образовывать хелатные комплексы с разными свойствами, либо не будут образовывать их совсем.

В свою очередь, из полученных белковых преципитатов (осадков) можно экстрагировать выделяемый белок (белки), подбирая условия для разрушения хелатного комплекса. Селективность элюции при этом, вероятно, будет определяться выбором используемого свободного лиганда (или комбинацией нескольких лигандов), его концентрацией, рН применяемого элюента или сочетанием этих факторов.

Обоснованность высказанных теоретических положений была проверена в модельном эксперименте. С этой целью была предпринята проверка возможности разделения методом ЛОРБ смеси коммерческих маркерных белков, применяемых при гель-электрофорезе. Белковая смесь включала: фосфорилазу Б

- 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу - 30 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа; лактальбумин

— 14,4 кДа. В качестве хелатообразующего иона в экспериментах были использованы ионы кадмия в концентрациях 1 мМ, 3 мМ и 5 мМ соответственно.

Было показано (рис. 1а), что при добавке ионов кадмия во всех указанных выше концентрациях к раствору маркерных белков в буфере, содержащем

хаотропный агент (6 М мочевины), не наблюдалось образования белкового преципитата. В тоже время (рис. 1б,в,г), преципитация белков в растворах, предварительно обработанных ионами кадмия, наблюдалась при ступенчатом снижении в них концентрации хаотропного агента. Причем, при разведении белкового раствора, содержащего 1 мМ кадмия, в осадок переходил практически только один белок - фосфорилаза Б (рис. 16). Разведение раствора белковой смеси, содержащей 3 мМ кадмия, приводило к тому, что в осадке, помимо фосфорилазы Б, обнаруживалось также около 20% бычьего сывороточного альбумина и примерно 40% лактальбумина (рис. 1в). Разведение раствора, в который предварительно было добавлено 5 мМ кадмия, сопровождалось, наряду с полным переходом в осадок фосфорилазы Б, преципитацией примерно 30% бычьего сывороточного альбумина, около 60% лактальбумина, следовых количеств яичного альбумина и ингибитора трипсина (рис. 1г). Следует отметить, что во всех исследованных вариантах белок карбоангидраза не образовывал осадка.

Из представленных выше данных следует важный практический вывод. Для каждого из исследованных белков, находящихся в растворе, существует определенная концентрация хелатирующего иона, при которой белок может денатурировать с образованием осадка. Это свидетельствует в пользу возможности применения ионов двухвалентных металлов для сепарации белков из сложных белковых смесей.

Следующим этапом модельного эксперимента являлась проверка возможности экстракции белков из полученных преципитатов лигандообменным способом. Для этих целей в качестве свободного лиганда был использован SH-реагент - ДТТ в конечной концентрации 5 мМ.

Эксперименты показали (рис. 1в и 1г), что применение ДТТ позволяет осуществить элюцгао из полученных осадков, как отдельные белковые фракции, так и практически гомогенные белки. При этом, из осадков удается элюировать все белки кроме фосфорилазы Б, которая при данных условиях остается в осадке.

В целом результаты модельного эксперимента позволяют сделать следующие важные выводы:

1. Образование нерастворимых хелатных комплексов белок-ион двухвалентного металла зависит от индивидуальных свойств разделяемых белков.

2. С повышением концентрации хелатируюшего иона возрастает число белков, образующих с ними хелатные комплексы и формирующих осадки.

3. Нельзя исключить существования белков, не образующих хелатные комплексы с ионами двухвалентных металлов, либо образование таких комплексов не приводит к их денатурации с последующей преципитацией. Это может быть в случае, если на поверхности белков отсутствуют аминокислотные остатки, способные образовывать хелатные комплексы с ионами металлов, либо не подобраны условия преципитации комплексов.

4. Из полученного белкового осадка, подобрав соответствующие условия, можно избирательно элюировать нужные белки.

В г

Рис. 1. Электрофореграммы образцов на этапах разделения смеси коммерческих маркерных белков методом ЛОРБ. А: исходная смесь белков в буфере, содержащем 6М мочевины (1) и после ее обработки (2) ионами Сё в концентрации 1 мМ (аналогичные данные получены при добавке 3 мМ и 5 мМ кадмия). Б: исходная смесь белков (1), обработанная 1 мМ Сё; супернатант (2), полученный после разведения 1:2 исходной смеси буфером без мочевины и удаления образующегося осадка центрифугированием; полученный осадок (3). В: исходная смесь (1), обработанная 3 мМ Сё; супернатант (2) после разведения 1:2 исходной смеси буфером без хаотропного агента и удаления белкового осадка центрифугированием; элюат (3) после экстракции белков из осадка; осадок (4) после элюции. Г: исходная смесь (1), обработанная 5 мМ Сё; супернатант (2) после разведения исходной смеси буфером без мочевины и удаления образовавшегося белкового осадка центрифугированием; элюат (3) после экстракции белков из осадка; осадок (4) после элюции.

Исследование щшменимости метода ЛОРБ для выделения рекомбинантных Са ^-активируемых фотопротеинов апообелина, апоакворнна и их мутантных форм.

В начале данного этапа работы было проведено исследование влияния ряда ионов двухвалентных металлов на апообелин. Целесообразность этого определялась тем, что некоторые ионы двухвалентных металлов, прежде всего "тяжелых", оказывают негативное действие на белки и ингибируют их ферментативную активность.

С этой целью к белковому экстракту из биомассы клеток Е. тоН, полученному при их разрушении буфером, содержащим хаотропный агент (6М мочевины), и осветленному центрифугированием, добавляли ионы кальция, магния, никеля, кобальта, кадмия, марганца, цинка, меди до финальной концентрации 1 мМ. Образующийся белковый преципитат удаляли центрифугированием, в супернатанге измеряли остаточную активность обелина. Было показано, что добавление ионов Mg, №, Ca, Мп приводило к

образованию в экстракте незначительного белкового осадка и не вызывало преципитации апообелина. Ионы Cd, Си и Zn в концентрации 1 мМ вызывали образование в экстракте более солидного (визуально) белкового осадка. При обработке экстракта данными ионами апообелин также не переходил в осадок, а его люминесцентная активность при этом возрастала по сравнению с контролем в 2-5 раз. Однако следует заметить, что уровень активности в экстрактах, обработанных ионами Си и Zn, был значительно ниже, чем после обработки ионами Cd. Было установлено также, что повышение концентрации ионов Cd, Си и Zn, добавляемых в экстракт, сопровождается переходом апообелина в осадок и, как следствие, снижением фотопротеиновой активности в экстракте.

На основании полученных данных, ионы кадмия были выбраны для дальнейших исследований при разработке технологии очистки апообелина методом ЛОРБ.

Добавка к исходному экстракту ионов кадмия до концентрации 1 мМ приводила к преципитации части балластных белков. Следует заметить, что рекомбинантный апообелин при данной концентрации хелатообразующего иона практически не образовывал осадка. Потери апобелка на этой стадии составляли не более 2-3%.

Для перевода апообелина в осадок полученный супернатант разводили исходным буфером без мочевины, содержащим 0,5 мМ кадмия. При этом в образовавшемся белковом осадке, собираемом центрифугированием, обнаруживался практически весь апофотопротеин, остаточная активность в супернатанте составляла не более 5%. Концентрация иона в буфере для разведения экстракта была подобрана экспериментально.. Без добавки иона в разводящий буфер потери апобелка составляли 20 - 25%. Если в буфере для разведения концентрацию иона снижали (менее 0,5 мМ), уменьшалось количество искомого белка в осадке, а если повышали (более 0,5 мМ) -увеличивалось загрязнение осадка балластными белками. Вероятнее всего, концентрация иона может быть индивидуальной для каждого конкретного белка и, варьируя этим параметром, можно подобрать оптимальные условия преципитации очищаемого белка.

Осадок, содержащий апообелин, однократно промывали буфером 20 мМ Трис^О. Стадия промывки необходима для более полного удаления незначительной доли балластных белков, находящихся в жидкой фазе осадка.

Для подбора и оптимизации условий лигандообменной элюции апобелка из осадка были проведены предварительные эксперименты. Проводилась оценка выхода апообелина и чистота экстрагируемого белка в зависимости от природы применяемого свободного лиганда, его концентрации, времени элюции и рН элюирующего буфера.

В качестве свободных лигандов для элюции использовали ДТТ, имидазол, гистидин и Трис^О буфер. Была проверена возможность экстракции апообелина из осадка и под действием №0. Хотя хлорид натрия нельзя рассматривать, в данном случае, как свободный лиганд, известно (Poгath J. et я1., 1975), тем не менее, что его использовали для элюции белков в исследованиях метода металло-хелат-аффинной хроматографии.

Как видно из полученных данных (Рис. 2а), элюция апообелина из белкового осадка осуществляется весьма эффективно под действием добавок ДТТ в элюирующий буфер (20 мМ Трис^О, рН 7,0). Зависимость выхода активности фотопротеина от концентрации элюента достигает плато уже при концентрации ДТТ, равной 5 мМ. Имидазол при тех же условиях элюции (время, буферная система, рН, температура) оказался менее эффективным элюентом для апообелина.

Из рисунка 26 видно, что выход искомого белка на максимум достигается при значительно (в 40 раз) больших концентрациях имидазола, составляющих около 200 мМ. Кроме того, суммарный выход искомого белка при использовании ДТТ в качестве элюента был примерно в 1,5-2 раза выше, чем при использовании имидазола. Самым малоэффективным элюентом при данных экспериментальных условиях оказался гистидин (рис. 2в).

При элюции гистидином выхода белка на максимум не наблюдалось даже при концентрации свободного лиганда, равной 200 мМ, а сам выход составлял только 8-9%.

Использование Трис(гидроксиметил)аминометана в качестве свободного лиганда дало неплохие результаты экстракции апообелина (рис. 2г). Зависимость выхода апобелка от концентрации элюента имела практически линейный характер, однако лишь в диапазоне 0,1 - 0,5 М. В диапазоне концентраций 0-0,1 М экстракции апообелина практически не наблюдалось.

Использование хлорида натрия как элюента также приводило к частичной экстракции апообелина из осадка. Однако, выход активности искомого белка под действием №0 крайне мал (около 14%), даже при концентрации реагента, равной 0,5 М.

Суммируя приведенные выше результаты можно сделать следующее заключение. Все элюенты, кроме ДТТ, дают реальный выход искомого белка только при использовании их в больших концентрациях.

Б

Рис 2. Зависимость выхода апообелина от концентрации: А - ДТТ;

имидазола; В — гистидина; Г — Трис^О (данные для графиков б,в,г,

нормированы относительно графика а).

При этом ДТТ обеспечивает максимальный выход апопротеина уже при концентрации, равной 5 мМ. Следует отметить также, что при максимальном выходе препарата при элюции наибольшую его чистоту (по данным SDS-электрофореза) удалось получить именно при использовании ДТТ в качестве свободного лиганда.

Суммируя приведенные выше результаты можно сделать следующее заключение. Все элюенты, кроме ДТТ, дают реальный выход искомого белка только при использовании их в больших концентрациях. При этом ДТТ обеспечивает максимальный выход апопротеина уже при концентрации, равной 5 мМ. Следует отметить также, что при максимальном выходе препарата при

элюции наибольшую его чистоту (по данным SDS-электрофореза) удалось получить именно при использовании ДТТ в качестве свободного лиганда.

На следующем этапе работы было проведено исследование стабильности хелатного комплекса ион кадмия - апообелин в зависимости от рН среды. Исследования проводили в диапазоне рН 6,5 - 10 с шагом 0,5. Полученные результаты представлены на рисунке За.

Видно, что разрушение хелатного комплекса и, как следствие, повышение выхода апообелина в элюат наблюдались при щелочных значениях рН с максимумом при рН 10. Наблюдаемый эффект, вероятно, более корректно рассматривать как лигандный обмен, происходящий за счет повышения концентрации ОН- групп в среде. Зависимость выхода апообелина при одновременном воздействии на хелатный комплекс нескольких факторов элюирующей среды, а именно, рН и свободного лиганда (ДТТ) имеет совершенно иной вид (рис. 36). Зависимость выхода апобелка при разных значениях рН с добавлением 5 мМ ДТТ имеет практически линейный характер, что может свидетельствовать об участии двух факторов в лигандообменном процессе.

А

Б

Рис. 3. Зависимость стабильности хелатного комплекса иона кадмия с апообелином от рН буфера. А - без ДТТ; Б - в присутствии 5 мМ ДТТ.

При исследовании выхода апообелина из хелатного комплекса в зависимости от времени элюции было показано (рис. 4), что при рН среды 7,5 и использовании ДТТ (5 мМ) в качестве свободного лиганда максимальный выход апобелка наблюдался уже через 30 минут экстракции. Увеличение времени элюции не приводило к дальнейшему повышению выхода белка.

В целом проведенные исследования позволили оптимизировать условия отдельных этапов выделения рекомбинантного апообелина методом ЛОРБ из

биомассы клеток Е. coli. Например, был определен хелатообразующий ион, его концентрация и условия, при которых достигался перевод искомого белка в осадок.

Рис. 4. Зависимость выходя апообелина от времени его элюции из осадка.

Показано также, что наиболее оптимальными условиями элюции апообелина из хелатного комплекса металл-белок (максимальный выход апобелка, чистота получаемого препарата) является его 30 минутная экстракция при рН буферной системы 7,5 и использовании 5 мМ ДТТ в качестве свободного лиганда. Результаты очистки апообелина при оптимальных условиях суммированы в таблице 1 и на рис. 5. Видно, что выход активного высокоочищенного апообелина составил 35-40%. Следует отметить, что время, затрачиваемое на очистку данного белка технологией ЛОРБ, составляет не более 2-3 часов.

Таблица 1.

Распределение люминесцентной активности апообелина по фракциям при очистке методом ЛОРБ.

Суммарная активность, отн.ед. Суммарный белок, мг Выход апообелина, %

Экстракт без иона 40160 121 100

Экстракт с 1 мМ Cd 44000 116 110

Супернатант 2400 30,4 6

Отмывка 120 0,4 0,3

Элюат 16000 22,6 40

1 2 3 4 5

Рис. 5. Электрофореограмма белковых фракций, полученных на этапах очистки белка апообелина методом ЛОРБ. 1 — исходный экстракт; 2 -экстракт после добавления 1 мМ кадмия; 3 — супернатант после разведения экстракта с ионом; 4 - отмывка осадка; 5 - элюат

Таким образом, на данном этапе работы показана принципиальная применимость технологии ЛОРБ для решения конкретной биохимической задачи и разработана схема выделения и очистки рекомбинантного апообелина из биомассы клеток Е. coll.

Сравнение метода ЛОРБ с хроматографическим методом. Приведенные в предыдущем разделе данные свидетельствовали в пользу высокой эффективности очистки рекомбинантного апообелина технологией ЛОРБ. В тоже время, представлялось целесообразным на примере апообелина сравнить данный метод с методами, традиционно используемыми при выделении рекомбинантных белков, образующих "тельца включения". Результаты очистки апообелина с применением традиционных хроматографических методов приведены в таблице 2 и на рисунке 6.

Таблица 2.

Распределение люминесцентной активности по фракциям при

очистки апообелина с применением хроматографических методов..

Суммарная Суммарный Процент

активность, отн.ед. белок, мг выхода, %

Супернатант после обработки ультразвуком 2400 44,2 12

Отмывка № 1 125 5 0,6

Суммарная активность отмывок № 2,3,4,5 20 0,3 0,1

Экстракт 7000 14,3 35

После ДЕАЕ-сефарозы 6400 9,8 32

После Moho Р 5200 7,4 26

1 2 3 4 5

Рис. 6. Электрофореограмма белковых препаратов, полученных на этапах очистки белка апообелина хроматографическим методом.

1 - цитозольная фракция; 2 - экстракт из "телец включения";

3 - отмывочная фракция; 4 - апообелин после хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе;

5 - апообелин после хроматографии на Моно Р.

Следует отметить, что время, затраченное на очистку белка традиционным способом, составляло не менее двух суток. Выше было показано, что метод ЛОРБ позволяет за очень короткое время (2-3 часа) и с минимальными затратами получить высокоочищенный препарат рекомбинантного апообелина с выходом 35-40%. Необходимо подчеркнуть, что схема выделения с использованием метод ЛОРБ более технологична и более проста, чем общепринятая. Она позволяет отказаться не только от дополнительных промежуточных операций, например, концентрирования образца, замены буфера в образце диализом и т.п., но и от использования дорого хроматографического оборудования и не менее дорогих сорбентов.

Сравнение биохимических характеристик апообелина, полученного разными методами. Методы выделения и очистки не должны приводить к изменению биохимических свойств получаемого белка. В методе ЛОРБ используются ионы тяжелых металлов (например, ионы кадмия), а, как известно, взаимодействие таких ионов с белками часто приводит к изменениям их биохимических характеристик (Дарбре А. 1989). Для того чтобы, ответить на вопрос, влияет ли очистка белков методом ЛОРБ на их биохимические характеристики, было проведено сравнение этих параметров у апообелина, полученного разными методами.

Как видно из полученных данных (табл. 3), различия в основных люминесцентных характеристиках белка, полученного разными методами, практически отсутствуют. Это может свидетельствовать в пользу того, что

очистка белков методом ЛОРБ не приводит к драматическим изменениям их биохимических свойств.

Таблица 3

Люминесцентные характеристики рекомбинантного обелина, выделенного из бактериальных клеток Е. coli разными способами._

Параметр Обелин, полученный' хроматографическими методами Обелин, полученный методом ЛОРБ

Константа спада люминесцентной реакции (к, с'1) 6,5 6,1

Удельная активность, (квант на 1 мг белка) 9,53*1015 1,1*10'6

Квантовый выход. люминесцентной реакции 0,35 0,42

1ё (Ытах) -6,13 -6,1

Выделение апоакворина. Схема выделения рекомбинантного апоакворина методом ЛОРБ очень похожа на схему, использованную при выделении апообелина, хотя и имеет некоторые модификаци. Вероятно, это обусловлено тем, что эти белки принадлежат к одной группе Са2+-активируемых фотопротеинов и имеют близкие физико-химические свойства. Как и в случае апообелина, экстракцию белков, включая рекомбинантный апоакворин, из клеток К coli проводили при 4°С. Клетки ресуспендировали в буфере 20 мМ Трис-HCl (рН 7,0), содержащем 6М мочевины, при соотношении 1:10 (вес/объем) и экстрагировали белки I час при постоянном перемешивании. Клеточный, дебрис удаляли центрифугированием, полученный супернатант (исходный экстракт) использовали для выделения апоакворина.

К экстракту при постоянном перемешивании добавляли ионы Cd2+ до финальной концентрации 2 мМ. Образовавшийся белковый осадок, содержащий балластные примеси, удаляли центрифугированием. Полученный супернатант разводили в соотношение 1:2 буфером 20 мМ Трис-HCl (рН 7,0), содержащим 1 мМ Cd2+. Сформировавшийся белковый осадок собирали центрифугированием. Осадок однократно промывали.

На стадии элюции апоакворина из полученного осадка в качестве свободных лигандов> были использованы SH-реагенты ДТТ и Р-МЭ в концентрациях 5 и 10 мМ соответственно. Осадок ресуспендировали в буфере 20 мМ Трис-HCl (рН 7,0), в суспензию добавляли ДТТ (Р-МЭ) и выдерживали ее при 4°С в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После этого к суспензии добавляли ионы Са2+ до конечной концентрации 10 мМ и удаляли образующийся белковый преципитат центрифугированием.

В результате проведенной работы, из грубого экстракта бактериальных клеток Е. coli технологией ЛОРБ был получен препарат практически

гомогенного рекомбинантного апоакворина с выходом искомого белка 30-35% (рис.7).

1 2 3 4 5

Рис. 7. Электрофореограмма белковых фракций, полученных на этапах очистки апоакворина методом ЛОРБ.

На треках: 1 - исходный экстракт; 2 - супернатант после разведения экстракта, обработанного ионами кадмия; 3 - элюат, полученный при экстракции апоакворина из отмытого осадка с использованием Р-МЭ; 4 - элюат, полученный при экстракции апоакворина из отмытого осадка с использованием ДТТ; 5 - маркерные белки.

Очистка мутантов апообелина и апоакворина

В ходе исследовательских работ, проводимых с Са2+-активируемыми фотопротеинами обелином и акворином, был получен ряд мутантов этих белков. В частности, были получены мутанты обелина с заменой в его белковой молекуле цистеина в 158 позиции и гистидина в 157 позиции на серии и аланин. Данные аминокислоты следует рассматривать и как потенциальные лиганды, способные образовывать координационные связи с ионами двухвалентных металлов. В связи с этим, представлялось целесообразным проверить, как замена данных аминокислот повлияет на возможность выделения полученных мутантов методом ЛОРБ.

Проведенные исследования показали, что замена цистеина в 158 позиции апообелина на серии и аланин не влияет сколько-нибудь существенным образом на его очистку методом ЛОРБ. Данные мутантные белки столь же эффективно выделялись по схеме, приведенной выше для исходного апообелина. Также как и в случае исходного апообелина, выход обоих мутантов был примерно одинаковым и составлял 35-40%. Причем, оба белка были получены в высокоочищенном виде (рис. 8). Вероятно, полученные данные могут свидетельствовать в пользу того, что SH-группа консервативного цистеина 158 в молекуле рекомбинантного апообелина не играет доминирующей роли в лигандообменных процессах выделения данных мутантов методом ЛОРБ.

Мутанты, полученные в результате точечной замены гистидина 157 на аланин и серия, не удалось выделить методом ЛОРБ. Исходя из этого, можно предположить, что этот аминокислотный остаток не только непосредственно участвует в образовании апообелином металл-хелатного комплекса, но и играет в этом процессе основную роль. Нельзя исключить, что его удаление приводит к уменьшению стабильности металл-хелатного комплекса.

1 2 3 4 5

Рис 8. Электрофореограмма белковых фракций, полученных на этапах очистки методом ЛОРБ мутантных белков апообелина с заменой цистеина 158 на аланин - мутант А и серии - мутант S.

На треках: 1 - исходный экстракт; 2 - супернатант после разведения экстракта, обработанного ионами кадмия; 3 - элюат мутанта А; 4 - элюат мутанта S; 5 - маркерные белки.

Кроме мутантов с точечными заменами отдельных аминокислот в работе были использованы также мутанты апоакворина и апообелина с делециями N-концевых участков их аминокислотных последовательностей. При этом у мутанта апобелина (D14) было удалено 14 N-концевых аминокислот. У трех укороченных мутантов апоакворина (а7, ац и аи) были делегированы семь, одиннадцать и пятнадцать N-концевых аминокислот соответственно. Как показали исследования, выделение и очистка этих мутантов из биомассы клеток Е. coli проводится технологией ЛОРБ по несколько иной (еще более упрощенной) схеме, чем приведенная выше.

В экспериментах было обнаружено, что укороченные мутантные белки образовывали нерастворимые хелатные комплексы уже при добавлении 1 мМ ионов кадмия в исходный экстракт, содержащий 6 М мочевины. Поэтому после сбора осадков центрифугированием их промывали и сразу проводили элюцию апобелков в течение 30 минут буфером 20 мМ Трис (рН 7,5), содержащим 5 мМ ДТТ. Выход мутантных апобелков составил 35-40 %. По данным SDS-электрофореза (рис. 9) искомые белки, выделенные по такой схеме, были получены в чистом виде. Заметим, что метод ЛОРБ позволил провести одновременное выделение всех 4 мутантов, поскольку для этого не требовалось

применения хроматографического оборудования. Время, затраченное на очистку белков, не превышало 1 часа.

Наблюдаемые, по сравнению с исходными белками, различия в поведении укороченных мутантных белков при добавлении к ним ионов кадмия, вероятно, могут быть обусловлены дополнительной дестабилизацией структуры белковой молекулы, вызванной удалением нескольких ^концевых аминокислот.

1 2 3 4 5

Ряс 9. Электрофореограмма конечных белковых препаратов укороченных мутантов апообелина в апоакворина, выделенных.методом ЛОРБ.

Натреках: 1-мутант Ат;2-мутант Ац;3-мугант Аи:;4-мутантПц; 5 -маркерные белки.

Суммируя результаты исследований, проведенных в данном разделе работы, можно сделать следующие выводы:

1. Проведенные исследования подтверждают применимость метода ЛОРБ в решении биохимических задач., связанных с выделением и очисткой белков, по крайней мере, рекомбинантных Са2+-акгивируемых фотопротеинов.

2. С использованием технологии ЛОРБ разработаны и реализованы схемы выделения и очистки рекомбинантных Са2+-активируемых апофотопротеинов (апообелин, апоакворин), а также некоторых их мутантов из биомассы клеток Е. coli.

3. Метод ЛОРБ позволяет быстро, эффективно и с минимальными затратами получать высокоочищенные препараты белков данной группы.

4. Показана возможность различных модификаций метода ЛОРБ при решении конкретных задач.

Применение метода ЛОРБ для очистки рекомбинантной бактериальной люциферазы из бактериальных клеток Е. coll Многие белки имеют гораздо более сложную структурную организацию, чем фотопротеины.

Эти белки более чувствительны к различным повреждающим факторам, к которым относятся как хаотропные агенты, так и ионы тяжелых металлов. Исходя из этого, представлялось вполне оправданным и целесообразным проверить пригодность метода ЛОРБ для выделения подобных белков.

С. этой целью в качестве маркерного белка была использована рекомбинантная люцифераза. Выбор маркера определялся тем, что данный белок относится к иному классу светоизлучающих ферментов, чем фотопротеины. В отличие от фотопротеинов, люцифераза является гетеродимерным белком, состоящим из аир субъединиц, и содержит в своей структуре флавин в качестве кофактора. Обычно очистку данного белка проводят без применения денатурирующих (например, хаотропных) агентов по схемам, включающим несколько хроматографических стадий (Бондарь В. С. и др., 1988), промежуточных и подготовительных этапов и занимающим по времени не менее 2-3 суток.

Для очистки люциферазы технологией ЛОРБ исходный экстракт получали, разрушая биомассу клеток Е. coli ультразвуковой обработкой. В осветленный центрифугированием экстракт добавляли ионы кадмия до конечной

концентрации 3 мМ. Образовавшийся осадок, не содержащий люциферазу, удаляли

центрифугированием, а в супернатанте концентрацию хелатообразующего иона доводили до 5 мМ. Образующийся при этом преципитат собирали. На данной стадии удалось удалить большое количество балластных примесей и получить белковый пул, обогащенный искомым ферментом. Осадок промывали буфером, содержащим 1 мМ кадмия. Ионы добавляли в промывочный буфер для предотвращения потерь очищаемого белка из-за диссоциации хелатного комплекса. Как показали эксперименты, подбирая концентрацию ионов кадмия в промывочном буфере, можно добиться отмывки большего количества балластных примесей. Лигандообменную элюцию люциферазы из осадка проводили таким же образом, как это было предложено для 1 2 фотопротеинов.

Рис. 10.Электрофореограмма результатов очистки бактериальной люциферазы методом ЛОРБ.

1 - исходный экстракт; 2 — элюат (финальный препарат).

В результате проведенной работы технологией ЛОРБ из биомассы клеток Е. coli был получен препарат высокоочищенной рекомбинантной люциферазы. При этом, по данным SDS-электрофореза (рис. 10) чистота финального препарата составляла не менее 90%. Следует отметить, что вся процедура

выделения и очистки искомого белка не превышала 1,5-2 часов, а выход искомого белка при этом составлял 50-60%.

Технологическая схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ. На основании результатов, полученных в ходе экспериментальной работы, и их последующего анализа была предложена принципиальная схема выделения рекомбинантных белков методом ЛОРБ, представленная на рисунке 11.

Рис. 11. Принципиальная схема выделения и рекомбинантных белков методом ЛОРБ.

очистки

Следует сказать, что предложенная схема выделения и очистки белков (в частности, рекомбинантных) технологией ЛОРБ носит общий характер и адаптирована для проведения работ в лабораторных условиях. В тоже время, в условиях крупно масштабного биотехнологического производства желательно

при реализации общей схемы использовать на отдельных ее этапах технические решения, позволяющие интенсифицировать процесс и повысить его эффективность. Частным случаем такого технического решения может быть, например, система, позволяющая проводить процесс очистки белка (белков) методом ЛОРБ непрерывно.

В качестве модели такой системы, позволяющей вести процесс более технологично, можно привести пример непрерывной очистки апообелина с использованием ячейки для ультрафильтрации (рис. 12).

Рис 12. Схема очистки апообелина методом ЛОРБ в ячейке для ультрафильтрации. А — разведение белкового экстракта; Б — промывка осадка; С - элюция белка.

В заключение следует отметить, что приведенная выше схема (рис. 11) не только суммирует результаты применения технологии ЛОРБ, полученные в данной работе, но и призвана оказать помощь исследователю в определении стратегии и поиске оптимальных вариантов при использовании данного метода в решении практических задач белковой химии, связанных с выделением и очисткой различных белков.

ВЫВОДЫ

1. Сформулированы принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основанные на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием низких (милимолярные, микромолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов и использовании данных координационной ' химии, белковой химии, молекулярной биологии и физхимии ионов двухвалентных металлов в растворе.

2. В модельных экспериментах с использованием смеси коммерческих белковых препаратов, включающих: фосфорилазу Б - 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу -30 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа; лактальбумин - 14,4 кДа, показана принципиальная возможность применения метода ЛОРБ для разделения белковых молекул.

3. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантного апообелина и его мутантов с заменами в молекуле белка консервативного Cysl58 на аланин и серии, а также с делецией 14 N-концевых аминокислот. Получены высокоочищенные препараты этих белков с выходом 35-40%. Процедура очистки белков по данной технологии занимает 2-3 часа и не требует использования хроматографического оборудования и сорбентов.

4. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантного апоакворина и его мутантов с делецией 7, 11 и 15 N-концевых аминокислот. Получены высокоочищенные препараты этих белков с выходом 35-40%. Время очистки белков данной технологией составляет 2-3 часа и из процесса исключается хроматографическое оборудование и сорбенты.

5. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ гетеродимерного белка - рекомбинантной люциферазы из биомассы бактериальных клеток Е. coli. Получен высокоочищенный препарат данного фермента с выходом 50-60%. Время очистки белка составляет не более 1,5 часов, из процесса исключено хроматографическое оборудование и сорбенты.

6. Разработана и предложена общая схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ. Рекомендации, приведенные для каждого этапа схемы, позволяют осуществить выбор стратегии и подбор условий очистки конкретного выделяемого белка с учетом его структурно-функциональных особенностей.

7. На примере использования ячейки для ультрафильтрации показана модель работающей технологической установки для выделения рекомбинантного апообелина, позволяющая проводить процесс очистки белка непрерывно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бондарь B.C., Пуртов К.В. Лигандообменное разделение белков без использования, хроматографии (на примере выделения из Escherichia coli рекомбинантных апообелина и апоакворина) // Доклады РАН.- 2000. - Т. 373. -№4. - С. 547-549.

2. Пуртов К.В., Бондарь B.C. Новый способ лигандообменного разделения белков без применения хроматографии // Тезисы докладов IV Съезда Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков (Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем). Минск. - 2000. - С. 322.

3. Бондарь B.C., Пуртов К.В., Маликова Н.П., Франк Л.А., Илларионов Б.А. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фото протеинового комплекса обелина // Биохимия. - 2001. - Т. 66. - №9. - С. 1245-1251.

4. Пуртов К.В., Бондарь B.C. Лигандообменное разделение белков без использования хроматографии - биотехнология 21 века // Материалы 1-го Международного Конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития". Москва. - 2002. - С. 437-438.

5. Бондарь B.C., Пуртов К.В., Пузырь А.П. Высокоэффективные технологии выделения и очистки белков яа основе лигандного обмена и детонационных наноалмазов // Очерки экологической биофизики. Издательство СО РАН. Новосибирск. - 2003. - С. 212-230.

Подписано в печать 30.03.04. Формат бумаги 60x84 1/16 Усл. печ. л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ 76

Отпечатано на ризографе КГТУ 660074, Красноярск, Киренского 26

»- 74 94

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пуртов, Константин Викторович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ.

1.1. Методы разделения белков.

1.2. Лигандообменная хроматография, общие принципы метода.

1.3. Применение принципов лигандообменной хроматографии при разделении белковых молекул.

1.4. Очистка рекомбинантных белков, включая белки Са -активируемой; фотопротеиновой группы - апообелин и апоакворин.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ И ПРОВЕРКА ЕГО

ПРИМЕНИМОСТИ НА ПРИМЕРЕ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ

МАРКЕРНЫХ БЕЖОВ.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИМЕНИМОСТИ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ Са2+-АКТИВИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ И ИХ МУТАНТНЫХ ФОРМ ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК E.coli.

4.1. Очистка апообелина.

4.2. Сравнение метода ЛОРБ с хроматографическим методом.

4.3. Сравнение биохимических характеристик апообелина, полученного разными методами.

4.4. Выделение апоакворина.

4.5. Очистка мутантов апообелина и апоакворина.

ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ОЧИСТКИ

РЕКОМБИНАНТНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ ИЗ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК E.coli.

ГЛАВА 6. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ

РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ МЕТОДОМ ЛОРБ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лигандообменное разделение рекомбинантных белков без применения хроматографии"

Успехи молекулярной биологии и генной инженерии за последние 15-20 лет предопределили значительный прогресс в биологии в целом и, в частности, в белковой химии. Пожалуй, следует выделить три главных достижения.

Во-первых, развитие рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, привело к тому, что в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка [1].

Во-вторых, стало возможным получение не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов [2].

В-третьих, создание штаммов-продуцентов позволило решить серьезную проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для получения больших количеств изучаемых белков [3].

В значительной мере решение именно этих вопросов позволило экспериментаторам резко активизировать фундаментальные исследования, направленные на изучение не только особенностей строения различных белковых молекул, но и взаимосвязи между структурой белка и выполняемой им специализированной функцией [4]. До недавнего времени, такого рода работы либо сдерживались, либо были серьезно затруднены в силу того, что природные источники не могли обеспечить значительных количеств изучаемых и используемых белков.

В тоже время, решение проблемы получения больших количеств белков и, прежде всего, белков, обладающих маркерными свойствами, позволило активизировать поиски путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии [5,6].

Одним из примеров такого рода достижений являются успехи в изучении Са -активируемых фотопротеинов. К настоящему времени клонированы и успешно экспрессированы в клетках-реципиентах четыре Са2+-активируемых фотопротеина - акворин, клитин, митрокомин и обелин [7, 8, 9, 10]. Создание штаммов-продуцентов этих белков, а также их мутантных форм, способствовало не только существенному продвижению в понимании функционирования этой группы светоизлучающих белков, но и применению фотопротеинов как биолюминесцентных меток при разработке различных тест-систем [11,12].

Достижения молекулярной биологии и генной инженерии способствовали развитию биотехнологии. Разработка и создание современных высоко эффективных биотехнологий получения белков в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость. При этом предполагается, что усилия при разработке новых биотехнологий будут, прежде всего, направлены на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белков [13].

Исходя из этого, основной целью работы являлась обоснование и разработка новой биотехнологии для очистки рекомбинантных белков без применения хроматографии - метода лигандообменного разделения белков (ЛОРБ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Сформулировать основные, принципиальные положения метода ЛОРБ и провести проверку его пригодности в модельных экспериментах на примере разделения смеси коммерческих белковых препаратов.

2. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки I из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантных Са -активируемых фотопротеинов: апообелина, апоакворина и их мутантных форм.

3. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из бактериальных клеток Е. coli рекомбинантной бактериальной люциферазы

4. Разработать общую технологическую схему выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ.

При решении поставленных задач получены следующие результаты:

1. Многие белковые молекулы способны образовывать хелатные комплексы с ионами металлов в растворе, что приводит к их последующей денатурации. Причем, последовательность денатурации белков, очевидно, определяется размерами белковых молекул, наличием и числом дисульфидных связей в них, количеством доступных аминокислотных остатков, участвующих в координации, природой иона и его концентрацией, а также величиной рН применяемой буферной системы.

2. Из образовавшегося белкового осадка, можно с высокой селективностью экстрагировать нужный белок (белки), подбирая условия для разрушения хелатного комплекса металл-белок. При этом селективность экстракции, будет определяться выбором используемого свободного лиганда, его концентрацией, рН применяемого элюента, или сочетанием этих факторов.

3. Данные координационной химии, молекулярной биологии, лигандного обмена, а также обнаруженный эффект преципитации белков в растворе под действием двухвалентных ионов металлов позволили обосновать, сформулировать и предложить новую технологию разделения и очистки белков - метод «лигандообменного разделения белков» (ЛОРБ).

4. Разработанные и исследованные схемы очистки позволили получить из биомассы бактериальных клеток Е. coli высокоочищенные препараты рекомбинантных апообелина, апоакворина и их мутантов с выходом 35-40%. Из биомассы; бактериальных клеток Е. coli получен препарат рекомбинантной бактериальной люциферазы в практически гомогенном состоянии с выходом 50-60%. Время очистки белков методом ЛОРБ не превышает 2-3 часов.

5. Предложенная технологическая схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ, позволяет произвести выбор стратегии в очистке искомого белка. На примере использования ультрафильтрационной ячейки впервые показан вариант технологической; установки для очистки рекомбинантного апообелина, позволяющей вести процесс очистки белка непрерывно.

Проведенные в работе исследования дополняют и расширяют представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет несомненную общебиологическую значимость. Учитывая результаты работы можно с большой долей уверенности говорить о том, что создана новая высокоэффективная технология, основанная на принципах лигандообменных взаимодействий, расширяющая арсенал известных методов, применяемых в белковой химии, и позволяющая в значительной мере интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых молекул. Отличаясь от известных методов простотой, метод ЛОРБ не требует использования дорогого специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, является экспрессным и позволяет с высокой эффективностью получать высокоочищенные белки из сложных белковых смесей. Это дает основания полагать, что предложенная в работе технология имеет широкие перспективы практического применения.Разработанный метод успешно применяется в лаборатории фотобиологии НИУБФ СО РАН для выделения рекомбинантных белков.

Материалы диссертации докладывались на IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000), I Международном Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), конференциях молодых ученых и специалистов Института биофизики СО РАН (Красноярск, 2000-2001), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Пуртов, Константин Викторович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Сформулированы принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основанные на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием низких (милимолярные, микромолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов и использовании данных координационной химии, белковой химии, молекулярной биологии и физхимии ионов двухвалентных металлов в растворе.

2. В модельных экспериментах с использованием смеси коммерческих белковых препаратов, включающих: фосфорилазу Б — 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу - 30 кДа; соевый ингибитор трипсина — 20,1 кДа; лактальбумин - 14,4 кДа, показана принципиальная возможность применения метода ЛОРБ для разделения белковых молекул.

3. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантного апообелина и его мутантов с заменами в молекуле белка консервативного Cysl58 на аланин и серин, а также с делецией; 14 N-концевых аминокислот. Получены высокоочищенные препараты этих белков с выходом 35-40%. Процедура очистки белков по данной технологии занимает 2-3 часа и не требует использования хроматографического оборудования и сорбентов.

4. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантного апоакворина и его мутантов с делецией 7, 11 и 15 N-концевых аминокислот. Получены высокоочищенные препараты этих белков с выходом 35-40%. Время очистки белков данной технологией составляет 2-3 часа и из процесса исключается хроматографическое оборудование и сорбенты.

5. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ гетеродимерного белка - рекомбинантной люциферазы из биомассы бактериальных клеток Е. coli. Получен высокоочищенный препарат данного фермента с выходом 50-60%. Время очистки белка составляет не более 1,5 часов, из процесса исключено хроматографическое оборудование и сорбенты.

6. Разработана и предложена общая схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ. Рекомендации, приведенные для каждого этапа схемы, позволяют осуществить выбор стратегии и подбор условий очистки конкретного выделяемого белка с учетом его структурно-функциональных особенностей.

7. На примере использования ячейки для ультрафильтрации показана модель работающей технологической установки для выделения рекомбинантного апообелина, позволяющая проводить процесс очистки белка непрерывно.

108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена разработке и созданию новой высоко эффективной биотехнологии выделения и очистки рекомбинантных белков — метода лигандообменного разделения белков (ЛОРБ).

Успехи молекулярной биологии и генной инженерии за последние годы предопределили значительный прогресс в биологии в целом и, в частности, в белковой химии.

Во-первых, развитие рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, привело к тому, что в настоящее время можно получить пггамм-продуцент практически любого белка.

Во-вторых, стало возможным получение не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов.

В-третьих, создание штаммов-продуцентов позволило решить серьезную проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для получения больших количеств изучаемых белков.

В значительной мере решение именно этих вопросов позволило экспериментаторам, работающим в области бежовой химии, резко активизировать фундаментальные исследования, направленные на изучение не только особенностей строения различных белковых молекул, но и взаимосвязи между структурой белка и выполняемой им специализированной функцией. До недавнего времени такого рода работы либо сдерживались, либо были серьезно затруднены в силу того, что природные источники не могли обеспечить значительных количеств изучаемых и используемых белков.

В тоже время, решение проблемы получения больших количеств белков и, прежде всего, белков, обладающих маркерными свойствами, позволило активизировать поиски путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии.

В связи с этим, очевидно, что разработка и создание новых высоко эффективных биотехнологий для решения прикладных задач белковой химии, связанных с получением высокоочищенных белков, в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость. При этом; основные усилия исследователей направлены на разработку таких технологий, которые позволяли бы, прежде всего, убыстрять, упрощать и удешевлять процедуры выделения и очистки белков.

Именно этими обстоятельствами объяснялась целесообразность проведения данной работы

В результате проведенных исследований был обнаружен эффект преципитации белков в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта и анализ полученных, результатов позволил обосновать разработать и предложить новый метод выделения и очистки белковых молекул, получивший название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ).

Разработанный метод нашел свою практическую реализацию в решении ряда прикладных задач связанных с выделением и очисткой различных рекомбинантных белков. С помощью метода ЛОРБ были выделены и очищены мономерные белки фотопротеиновой группы - апообелин, апоакворин, а также их различные мутанты. Этот метод оказался столь же эффективен и при очистке гетеродимерного белка — бактериальной люциферазы. На основании анализа полученных результатов была обоснована и предложена общая принципиальная схема выделения и очистки белков технологией ЛОРБ. Была также предложена и продемонстрирована действующая модель технологической установки, показывающая на примере рекомбинантного апообелина возможность проведения процесса очистки белка непрерывно.

Предложенная технология имеет широкие перспективы применения в белковой химии. Метод ЛОРБ прост и не требует использования дорогого специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, является экспрессным и позволяет с высокой эффективностью получать высокоочищенные белки из сложных белковых смесей.

Суммируя приведенные выше результаты, можно с большой долей уверенности говорить о том, что создана новая высокоэффективная технология, основанная на принципах лигандообменных взаимодействий, расширяющая арсенал методов, применяемых в белковой химии, и позволяющая в значительной мере интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых молекул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пуртов, Константин Викторович, Красноярск

1. Ferguson H.A., Goodrich, J. A. Expression and purification of recombinant human c-Fos/c-Jun that is highly active in DNA binding and transcriptional activation in vitro. // Nucleic Acids Res. - 2001. - V. 29. P. 98-105.

2. Kidokoro S. Design of protein function by physical perturbation method. // Adv Biophys. -1998. -V. 35. -P. 121-143.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир. — 2002. — 590 с.

4. Бондарь B.C., Пуртов К.В., Маликова Н.П., Франк Л.А., Илларионов Б.А. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина. // Биохимия. 2001. - Т. — 66. - №9. - С.1245-1251.

5. Пуртов К.В., Пузырь А.П., Бондарь B.C. Создание надмолекулярной структуры из частиц наноалмаза и обелина на двумерной подложке. // Доклады РАН. 2001. - Т. - 380. - №3. - С.411-414

6. Jackson R.J., Fujihashi К., Kiyono Н., McGhee J.R. Luminometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. // J. Immunol Methods. 1996. - V. 190. - P. 189-197.

7. Prasher D.C., McCann R.O., Cormier M.J. Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1985. - V. 126. - P. 1259-1268.

8. Inouye S., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-activated photoprotein, clytin. // FEBS Lett. 1993. - V. 315. - P. 343-346.

9. Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay. // Biochem Biophys Res Commun. 1996. - V. 219. -P. 475-479.

10. Campbell A.K., Dormer R.L., Hallett M.B. Coelenterate photoproteins as1. Ч Iindicators of cytoplasmic free Ca in small cells. // Cell Calcium. 1985. - V. 6. -P. 69-82.

11. Галаев И.Ю. Новые методы очистки белков. Аффинная ультрафильтрация. // Биохимия. 1999. - Т. 64. - С. 1013-1021.

12. Welch P., Scopes R. К. Rapid purification and crystallization of yeast phosphofructokinase // Anat. Biochem. -1981. P. 154-157.

13. Tanford C. The hydrophobic effect: Formation of micelles and biologicalmembranes / New York: Wiley-Interscience. 1980. - 318 p.

14. Скоупс P. Методы очистки белков. M.: Мир. 1985. - 358 с.

15. Curling J. М. Methods of plasma protein fractionation / New York: AcademicPress. 1980.-297 p.

16. Czok R., Biicher T. Crystallized enzymes from the myogen of rabbit skeletal muscle // Advan. Prot. Chem. 1960. - V. 15. - P. 315-415.

17. Dobry A., Boyer-Kawenoki F. Phase separation in polymer solution // J. Polym. Sci. 1947. - V. 2. - P. 90-100.

18. Albertsson P. A. In: Partition of cell particles and macromolecules / New York: Wiley.-1971.-315 p.

19. Hartman A., Johansson G., Albertsson P. A. Partition of proteins in a three-phase system // Eur. J. Biochem. 1974. - V. 46. - P. 75-81.

20. Chaabouni A., Dellacherie E. Affinity partition of proteins in aqueous two phase systems containing polyoxyethylene glycol bound ligand and charged dextrans // J. Chromatogr. 1979. - V. 171. - P. 135-143.

21. Kula M. R. Extraction and purification of enzymes using aqueous 2-phase systems. In: Applied biochemistry and bioengineering // AcademicPress. 1979. -V. 2.-P. 71-96.

22. Fischer L. Gel filtration chromatography // In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Work T. S. and Burdon R. H., (eds.). -Elsevier North-Holland, Amsterdam. - 1980. - V. 1. - 213 p.

23. Gordon A. H. Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels // In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Work T. S. and Burdon R. H., (eds.). - Elsevier North-Holland, Amsterdam. - 1979. - V. 1. -345p.

24. Pharmacia Fine Chemicals AB Publications . Gel filtration: Theory and practice. -Uppsala. 1980.-257 p.

25. Gribnau Т. C. J., Visser L, Nivard R. J. F. Affinity chromatography and related techniques. Elsevier, Amsterdam.- 1982. 302 p.

26. Lowe C. R., Dean P. D. G. Affinity chromatography. Wiley, London. — 1974. -378 p.

27. Jackoby W. B. Affinity techniques: Enzyme purification // Methods in Enzymology. 1974. - V. 34. - P. 214-221.

28. Peterson E. A., Sober H. A. Chromatography of proteins. I. Cellulose ion exchange adsorbents // J. Amer. Chem. Soc. 1956. - V. 78. - P. 751-755.

29. Affinity chromatography: Principles and methods. Pharmacia Fine Chemicals AB publications. Uppsala. - 1979. - 218 p.

30. Scopes R. K. Quantitative studies of ionexchange and affinity elutiort chromatography of enzymes // Anal. Biochem. — 1981.-V. 114. P. 8-18.

31. Scopes R. K. Techniques for protein purification // Elsevier North-Holland, Amsterdam. 1978. - V. 101. - P. 1-42.

32. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusingon ion-exchange columns. I. General principles // J. Chromatogr. 1978. - V. 150. -P. 17-30.

33. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusing on ion-exchange columns. II. Experimental verification // J. Chromatogr. — 1978. -V. 150.-P. 31-44.

34. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing. III. The properties of a DEAE-agarose anion exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 1981. - V. 206. - P. 429-440.

35. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing. IV. Properties of an agarose polyethyleneimine ion-exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 1981. - V. 206. - P. 441-447.

36. Pogell B. N. Enzyme purification by selective elution with substrate from substituted cellulose columns // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. - V. 7.-P. 225- 230.

37. Black W. S., van Tol A., Fernando S., Horecker B. L. Isolation of a highly active fructose diphosphatase from rabbit muscle: Its subunit structure and activation by monovalent cations // Arch. Biochem. Biophys. 1972. - V. 151. -P. 576-590.

38. Scopes R. K. Purification of clycolytic enzymes by using affinity elution chromatography // Biochem. J. 1977. - V. 161. - P. 253-263.

39. Scopes R. K. Multiple enzyme purifications from muscle extracts by using affinity elution chromatographic procedures // Biochem. J. 1977. - V. 161. - P. 265-277.

40. Von der Haar F. Affinity elution principles and applications to purification of aminoacyl-tRNA synthetases // Meth. Enzymol. 1974. - V. 34. - P. 163-171.

41. Eisenbarth G. S. Application of monoclonal antibody techniques to biochemical research // Anat. Biochem. 1981. - V. 11. - P. 1-16.

42. Porath J., Flodin P. Gel filtration: A method for desalting and group separation //Nature. 1959.-V. 83. ~P. 1657-1659.

43. Whitaker J. R. Determination of molecular weights of proteins by gel filtration on Sephadex // Anal. Chem. 1963. - V. 35. - P. 1950-1953.

44. Andrews P. The gel filtration behaviour of proteins related to their molecular weight over a wide range // Biochem. J. 1965. - V. 96. - P. 595-606.

45. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: Group variations in the serum proteins of normal human adults // Biochem. J. 1955. — V. 61. - P. 629641.

46. Gordon A. H. Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Work T. S. and Burdon R. H. (eds.). - Elsevier North-Holland, Amsterdam. - 1979. - V. 1. -311p.

47. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory // Ann N. Y. Acad. Sci.- 1964. — V. 121.-P. 321-349.

48. Hofejsi V., Kocourek I. Affinity electrophoresis: Separation of phytohemagglutimns on O-glycosyl polyacrylamide gels // Meth. Enzymol. — 1974.-V. 34.-P. 178-181.

49. Bog-Hansen Т. C. Crossed immuno-affinoelectrophoresis: An analytical method to predict the result of affinity Chromatography // Anal. Biochem. 1973. — V. 56.-P. 480-488.

50. Tichd M., Hofejsi V., Barthovd J. Affinity electrophoresis of proteins interacting with blue dextran // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - V. 534. - P. 58-63.

51. Baumann G., Chrambach A. Gram-preparative protein fractionation by isotachophoresis: Isolation of human growth hormone isohormones // Proc. Nat. Acad. Sci. 1976. - V. 73. - P. 732-736.

52. Tsuji A., Sekiguchi K. Adsorption of nicotine acid hydrazide on cation exchanger of various metal forms // Nippon Kagaku Zasshi. 1960. - V. 81. - P. 847-852.

53. Helfferich F. Ligand exchange. A novel separation technique // Nature. 1961. — V.189.-P. 1001-1005.

54. Helfferich F. Ligand exchange. I. Equilibria I I J. Am. Chem. Soc. 1962. -V. 84. -P. 3237-3241.

55. Helfferich F. Ligand exchange. II. Separation of ligands having different coordinative valencies //J. Am Chem. Soc. 1962.- V. 84. - P. 3242-3248.

56. Даванков B.A., Рогожин C.B. Хроматография лигандов новый метод изучения смешанных комплексов. // ДАН СССР. - 1970. - Т. 193. - С. 94111.

57. Wagner F.W., Shepherd S.L. Ligand exchenge amino acid analysis resolution of some amino sugars and cysteine derivatives. // Anal. Biochem. - 1971. - V. 41. -P. 314-320.

58. Sampson В., Barlow G.B, Separation of peptides and amino acids by ion exchenge chromatography of their copper complexes. // J: Inst. Brew. 1980. - V. 77.-P. 9-23.

59. Даванков В.А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир. -1989. -294 с.

60. Fazakerley S., Best D.R. Separation of amino acids, as copper chelates, from amino acid protein, and peptide mixtures. // Anal. Biochem. 1965. - V. 12. - P. 290- 297.

61. Rothenbuhler E., Waibel R., Solms J. An improved method for the separation of peptides and a-amino acids on copper Sephadex. // Anal. Biochem. 1979. - V. 97.-P. 367-373.

62. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation // Nature. — 1975. — V. 258.-P. 598-564.

63. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии. М.: Мир, 1970. - 567 с.

64. Cooke N. Н. С., Viavattene R. L., Eksteen R., Wong W. S., Davies G., Karger B. L. Use of metal ions for selective separations in high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1978. - V. 149. - P. 391-403.

65. Yoneda H. Baba Т. Studies of thin layer chromatography of inorganic salts. V. Resolution of the racemic tris-ethy.ene-diamine-cobalt(III) complex by means of thin layer chromatography on silica gel. // J. Chromalogr. 1970. — V. 53. - P. 610-614;

66. Yoneda H., Miura T. Complete resolution of the racemic tris-ethylenediamine-cobalt(III) complex into its optical antipodes by means of electrophoresis. // Bull. Chern. Soc. Jpn. -1970. -V. 43. P. 574-580.

67. Kobayashi K., Shibata M. Ion exchange chromatographic studies of the Co(N)4(0)2.+ type complexes. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1975. - V. 48. - P. 2561-2567.

68. Gaal J., Inszedy J. Chromatographic separation of optical isomers by means of outer sphere complex formation reactions. // Talanta. 1976. - V. 23. - P. 78-82.

69. Lindner W., LePage J. N., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Reversed-phase separation of optical isomers of Dns-amino acids and peptides using chiral metal chelate additives // J. Chromatogr. 1979. - V. 185. - P. 323-329.

70. LePage J. N., Lindner W., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Resolution of the optical isomers of dansyl amino acids by reversed-phase liquid chromatography with optically active metal chelae additives // Anal. Chem. 1979. - V. 51. — P. 433-438.

71. Davankov V.A., Navratil J.D., Walton H.F. Ligand exchange chromatography. CRC Press, Inc. Boca Raton.: Florida. 1988. - 294 p.

72. Maeda M., Tsuji A., Ganno S., Onishi Y. Fluorophotometric assay of amino acids by using automated ligand-exchange chromatography and pyridoxalzinc(II) reagent // J. Chromatogr. 1973. - V. 77. - P. 434-438.

73. Wagner F. W., Shepherd S. L. Ligand exchange amino acid analysis: resolution of some amino sugars and cysteine derivatives // Anal. Biochem. 1971. - V. 41. -P. 314-319.

74. Скороход О. P., Варрава А. Г. Комплексы тиомочевины с кадмием в сульфокатионитах КУ-2 // ЖФХ. — 1972. V. 46. - Р. 1708-1715.

75. Shimomura К., Walton Н. F. Thin-layer chromatography of amines by ligand exchange // Sep. Sci. -1968. V. 3. - P. 493-496.

76. Yasuda K. Thin-layer chromatography of aromatic amines on cadmium sulphate-impregnated silica gel thin layers // J. Chromatogr. 1971. - V. 60. - P. 144-149.

77. Kunzru D., Frei R. W. Separation of aromatic amine isomers by high-pressure liquid chromatography on cadmium-impregnated silica gel columns // J. Chromatogr. Sci. 1974.-V.12.-P. 191-205.

78. Vogt C. R., Ryan T. R:, Baxter J. S. High-speed liquid chromatography on cadmium-modified silica gel // J. Chromatogr. 1977. - V. 136. - P. 221-227.

79. Frci R. W., Beall K., Cassidy R. M. Determination of aromatic nitrogen heterocycles in air samples by high-speed liquid chromatography / Mikrochim. Acta.- 1974.-859 p.

80. Guha О. K., lanak J. Charge transfer complexes of metals in the chromatographic separation of organic compounds // J. Chromatogr. 1972. - V. 68.-P. 325-330.

81. Houx N. W. H., Voerman S., Jongen W. M. F. Purification and analysis of synthetic insect sex attractants by liquid chromatography on a silver-loaded resin // J. Chromatogr. 1974. - V. 96. - P. 25-33.

82. Snyder L. R. Nitrogen and oxygen compound types in petroleum // Anal. Chem. 1969.-V. 41.-P. 314-319.

83. Funasaka W., Hanai Т., Fujimura K., Ando T. Nonaqueous solvent chromatography // J. Chromatogr. 1973. - V. 78. - P. 424-428.

84. Petronio В. M., DeCaris Е., lannuzzi L. Some applications of ligand-exchange // Talanta. 1982. -V. 29.-P. 691-705.

85. Shahwan G. J., Jezorek J. R. Liquid chromatography of phenols on an 8-quinolinol silica gel-iron(III) stationary phase // J. Chromatogr. 1983. -V. 256. -P. 39-47.

86. Maslowska J., Pietek; W. The use of ligand exchange for the separation of aromatic acids on synthetic cation exchangers // Chromatographia. 1985. - V. 20.-P. 46-52.

87. Webster P. V., Wilson J. N., Franks M. C. Macroreticular ion-exchange resins: some analytical applications to petroleum products // Anal. Chim. Acta. — 1967.— V. 38.-P. 193-200.

88. Funasaka W., Fujimura K., Kuriyama S. Ligand exchange chromatography. I. Separation of phenylaminediamne isomers // Bunseki Kagaku. 1969. - V. 18. - P. 19-26.

89. Fujimura К., Коуата Т., Tanigawa Т., Funasaka W. Studies in ligand-exchange chromatography. IV. Separation of hydroxybenzoic and hydroxy-naphthoic acid isomers // J. Chromatogr. 1973. - V. 85. - P. 101-106.

90. Kothari R. M. Some aspects of the fractionation of DNA on an IR-120-A1(III) column//J. Chromatogr.- 1971.-V. 57.-P. 83-87.

91. Otto J., de Hernandez С. M., Walton H. P. Chromatography of aromatic acids on La-loaded ion-exchange resins // J. Chromatogr. 1982. - V. 247. - P. 91-103.

92. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography a new approach to protein fractionation // Nature. - 1975. - V. 258.-P. 598-600.

93. Lonnerdal В., Keen C. L. Metal chelate affinity chromatography of proteins // J. Appl. Biochem. -1982. V. 4. - P. 203-207.

94. Davankov V. A. Review of ligand exchange chromatography / Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides, and Proteins. V. 1, Hancock W. S. (ed.). - CRC Press, Boca Raton, Fla. - 1984. - 393 p.

95. Gozdzicka-Josefiak A., Augustyniak J. Preparation of chelating exchangers with a polysaccharide network and low cross-linkage // J. Chromatogr. 1977. -V. 131.-P. 91-98.

96. Moroux Y., Boschetti E., Egly J. M. Preparation of metal-chelating trisacryl gels for chromatographic applications // Sci. Tools. 1985. - V. 32. - P. 1-9.

97. Варламов В. П., Лопатин С. А., Рогожин С. В. Лигандообменная хроматография ферментов. I. Синтез хелатирующих сорбентов и очистка экзонуклеазы А5 от актиномицинов // Биоорг. Химия. 1984. —Т. 10. - С. 927934.

98. Fanou Ayi L., Vijayalakshmi M. Metal-chelatc affinity chromatography as a separation tool // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - V. 413. - P. 300-305.

99. Sulkowski E. Purification of Proteins by IMAC // Trends Biotechnol. 1985.-V.3.-P. 1-10.

100. Nexo E. A new principle in biospecific affinity chromatography used for purification of cobalamin-binding proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 379.-P. 189-192.

101. Nexe E., Purification of rabbit transcobalamin II by labile ligand; affinity chromatography // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1977. - V. 55. - P. 923-926.

102. Nexe E., Olesen H., Backer D., Thomsen J. Purification and characterization of rabbit transcobalamin // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V. 494. - P. 395399.

103. Nexe E. Transcobalamin I and other human R-binders purification, structural, spectral, and physiological studies // Scand. J. Haemotol. - 1978. - V. 20. - P. 221226.

104. Lindemans J., Van Kapel J., Abels I. Purification of human transcobalamin II cyanocobalamin by affinity chromatography using thermolabile immobilization of cyanocobalamin // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V. 579. - P. 40-47.

105. Van Kapel J., Loef B. G., Lindemans J., Abels J. An improved method for large scale purification of human holo-transcobalamin II // Biochim. Biophys Acta. -1981. -V. 676.-P. 307-311.

106. Jacobsen D. W., Montejano Y. D., Huennekens F. M. Rapid purification of cobalamin-binding proteins using immobilized aminopropylcobalamin // Anal. Biochem. -1981. -V. 113. P. 164-170.

107. Nexe E., Olesen H. Purification and characterization of rabbit haptocorrin // Biochim. Biophys. Acta. -1981. -V. 667. P. 370-377.

108. Backer D., Thomsen J., Nexe E. Amino terminal sequence of hog intrinsic factor//Biochem. Physiol. 1979.-V. 628.-P. 175-179.

109. Rudolf R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. // FASEB J. -1996.-V. 10.-P. 49-56.

110. Doonan S. Protein purification protocols. General strategies. // Methods Mol Biol. 1996. - V. 59. - P. 1-16.

111. Doonan S. Bulk purification by fractional precipitation. // Methods Mol Biol. -1996. -V. 59.-P. 135-144.

112. Fischer В., Sumner I., Goodenough P. Isolation and renaturation of bio-active proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. // Arzneimittelforschung. 1992. - V. 42. - P. 1512-1515.

113. Hockney R.C. Recent developmets in heterologous protein production in Escherichia coli J/ TIBTECH. 1994. - V. 12. - P. 456-463.

114. Gupta M.N., Kaul R., Guoqiang D., Dissing U., Mattiasson B. Affinity precipitation of proteins. // J Mol Recognit. 1996. - V. 9. - P. 356-359.

115. Teotia S., Lata R., Khare S.K., Gupta, M.N. One-step purification of glucoamylase by affinity precipitation with alginate. // J Mol Recognit. 2001. -V. 14.-P. 295-299.

116. Roy I., Gupta, M.N. Purification of alkaline phosphatase from chicken intestine by expanded- bed affinity chromatography on dye-linked cellulose. // Biotechnol Appl Biochem. 2000. -V. 32. - P. 81-87.

117. Roy I., Gupta M.N. Three-phase affinity partitioning of proteins. // Anal Biochem. 2002. - V. 300. - P. 11-14.

118. Gupta M.N., Jain S., Roy I. Immobilized metal affinity chromatography without chelating ligands: purification of soybean trypsin inhibitor on zinc alginate beads. II Biotechnol Prog. 2002. - V. 18. - P. 78-81.

119. Hefti M.H., Van Vugt-Van der Toorn C.J., Dixon R:, Vervoort J. A novel purification method for histidine-tagged proteins containing a thrombin cleavage site. // Anal Biochem. -2001. -V. 295. -P. 180-185.

120. Morin J.G. Coelenterate biology: Reviews and Perspectives / Eds. Muscatine L., Lenhoff H.M. New York: Academic Press. 1974. - P. 397-438.

121. Shimomura O., Johnson F.H, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. II J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59. - P. 223-240.

122. Shimomura O., Jolinson F.H., Saiga Y. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura. II J. Cell. Сотр. Physiol. 1963. - V. 62. - P. 9-15.

123. Бондарь B.C., Трофимов К.П., Высоцкий E.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima // Биохимия. 1992. - Т.57. - С.1481-1490.

124. Levine L.D., Ward W.W. Isolation and characterization of a photoprotein, "phialidin", and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phialidmm gregarium II Сотр. Biochem. Physiol. -1982.-V. 72.-P. 77-85.

125. Ward W.W., Seliger H.H. Extraction and purification of calcium-activated photoprotein from ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata. II Biochemistry. 1974.-V. 13.-P. 1491-1499.

126. Blinks J.R. Intracellular Ca2+ measurements //The Heart and Cardiovascular System. Eds. Fozzard H.A. et al. /Raven Press, New York. 1986. - P. 671-701.

127. Cormier M.J., Prasher D.C., Longiaru M., McCann R.O. The enzymology and; molecular biology of the Ca -activated photoprotein, aequorin. // Photochem. Photobiol. 1989. - V. 49. - P. 509-512.

128. Inouye S., Noguchi M., Sakaki Y., Takagi Y., Miyata Т., Iwanaga S., Miyata Т., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. - V. 82. - P. 3154-3158.

129. Илларионов Б.А., Маркова C.B., Бондарь B.C., Высоцкий E.C., Гительзон И.И. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima. // Докл. АН СССР. — 1992.-Т.326.-С. 911-913.л ,

130. Blinks J.R. Use of calcium-regulated photoproteins as inlracellular Ca indicators // Methods in Enzirnology. 1989. - V. 174. - P. 164-203.

131. Campbell A.K., Dormer R.L., Hallett M.B. Coelenterate photoproteins asл iindicators of cytoplasmic free Ca in small cells. // Cell Calcium. 1985. - V. 6. -P. 69-82.

132. Bondar V.S., Sergeev A.G., Illarionov B.A. et al. Cadmium-induced luminescence of recombinant photoprotein obelin. // Biochim. biophys. acta. -1995.-V. 1231.-P. 29-32.

133. Галаев И.Ю., Маттиасон Б. Новые методы аффинной очистки белков. Аффинное осаждение. // Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 669-676.

134. Bondar V.S., Purtov K.V. Nonchromatographic ligand exchange separation of proteins as exemplified by isolation of recombinant apoobelin and apoaquorin from Escherichia coli. //Dokl Biochem. 2000. -V. 373. - P. 142-144.

135. Bondar V.S., Puzyr A.P. Use of nanodiamond particles for rapid isolation of recombinant apoobelin from Escherichia coli. // Dokl Biochem. 2000. - V. 373. -P. 129-131.

136. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA purification, and characterization as a calcium indicator. // Methods Enzymol. 2000. - V. 305.-P. 223-249.

137. Бондарь В. С., Высоцкий Е. С., Заворуев В. В., Межевикин В.В., Райбекас А.А. Получение препарата бактериальной люциферазы для биолюминесцентного анализа. // Прик. Биох. и Микроб. 1988. - Т. 24. - С. 745-753.

138. Illarionov В. A, Protopopova М. V. Cloning and expression of genes of the luminescence system in Photobacterium leiognathi. // Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1987. -V. 8.-P. 41-46.

139. Дарбре А. Практическая химия белка. M.: Мир. 1989. - 621с.

140. Evangelista J., Suttnar. Separation used for purification of recombinant proteins // J. Chromatogr. -1997. V. 699. - P. 383-401.

141. Kricka L. J., Stanley P. E., Thorpe G., Whitehead T. P. Analytical Applications of Bioluminescence and Chemiluminescence. / London. Acad. Press. 1984. -602 p.