Метод оптической диффузионной спектроскопии для изучения кислородного статуса экспериментальных опухолей

Пряникова, Татьяна Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метод оптической диффузионной спектроскопии для изучения кислородного статуса экспериментальных опухолей
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метод оптической диффузионной спектроскопии для изучения кислородного статуса экспериментальных опухолей"

На правах/рукописи

ПРЯНИКОВА ТАТЬЯНА ИГОРЕВНА

Метод оптической диффузионной спектроскопии для изучения кислородного статуса экспериментальных опухолей

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Воронеж-2013

005539811

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (ФГБОУ ВПО «ННГУ им. Лобачевского»)

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Масленникова Анна Владимировна

Официальные оппоненты: Путинцева Ольга Васильевна

доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет", биолого-почвенный факультет, кафедра биофизики и биотехнологии, профессор

Феофанов Алексей Валерьевич

доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова", биологический факультет, кафедра биоинженерии, профессор

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Защита диссертации состоится «/}» года в /3 часов на заседании

диссертационного совета Д. 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 г. Воронеж, Университетская пл. 1., ауд. 59

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан « года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

Кислородный статус злокачественных новообразований является одним из ключевых факторов, определяющих прогноз заболевания и эффективность лечебных воздействий (Vaupel et al., 2005, 2008). Гипоксию опухоли (снижение парциального давления кислорода менее 10 мм.рт.ст.) необходимо рассматривать как следствие дисбаланса между высокой потребностью опухолевой ткани в кислороде и недостаточной его доставкой аномально сформированным сосудистым руслом опухоли (Brown, Giaccia, 1998). Гипоксия является независимым источником формирования агрессивного опухолевого фенотипа благодаря своему влиянию на различные метаболические, молекулярно-генетические, патофизиологические процессы, в том числе пролиферацию, апоптоз, неоангиогенез и метастазирование (Horsman, Overgaard, 2002). Кроме того, гипоксия является источником устойчивости новообразований к различным терапевтическим агентам (Höckel, Vaupel, 2001).

Возрастающее понимание роли гипоксии в клинической и экспериментальной онкологии дало толчок исследованиям, посвященным созданию новых методов диагностики и возможностям коррекции данного патофизиологического состояния. На сегодняшний день существует две группы методов определения уровня насыщения крови кислородом - ex vivo (гистоморфометрия, криоспектрофотометрия, иммуногистохимическое исследование) и in vivo (прямое полярографическое измерение парциального давления кислорода, позитронно-эмиссионная томография, магнитно-резонансная томография). В течение последних двадцати лет достаточно широкое распространение в эксперименте и клинике получили оптические методы диагностики гипоксии, в частности, метод оптической диффузионной спектроскопии (ОДС) (Тучин, 2001, Rogatkin, Lapaeva, 2003, Tromberg et al. 2005, Vishwanath et al., 2009, Roblyera et al„ 2011).

Метод ОДС заключается в расчете оптических характеристик биологических тканей (показателей рассеяния и поглощения) путем использования информации о многократно рассеянном свете, прошедшем сквозь объект (Тучин, 1998, Boas et al., 2001, Taroni et al, 2004, Intes, Chance, 2005). Спектроскопические данные позволяют оценить концентрацию основных тканевых хромофоров, характеризующих кислородный статус (оксигемоглобин, дезоксигемоглобин). На основе полученной информации рассчитывается уровень насыщения крови кислородом. Метод ОДС может быть реализован в конфигурации "на отражение" (ближняя инфракрасная спектроскопия) и в

конфигурации "на просвет". Второй вариант позволяет получать информацию о кислородном статусе глубоко расположенных тканей (максимальная глубина зондирования составляет 10 см) фигс1игап е! а1„ 2010). Метод позволяет оценить соотношение основных компонентов, характеризующих баланс доставки кислорода к тканям (оксигемоглобин) и его потребления (дезоксигемоглобин), а также кровенаполнение тканей (общий гемоглобин) (Ое В1а$1 ег а1, 1993; 1м ег а1„ 2004).

Неинвазивное определение кислородного статуса экспериментальных опухолей необходимо для решения задач мониторинга и прогнозирования эффективности противоопухолевых воздействий (облучение, химиотерапия, фотодинамическая терапия), а также для разработки новых методов диагностики и лечения злокачественных новообразований (Вгокп, 1999, Епкяеп ег а1, 2006, \Vouters ег а1, 2007, С1гое ег а1„ 2005; Z/ш ег а1, 2013). Однако, до настоящего времени не имеется прямых доказательств, что уровень насыщения крови кислородом (8Юг), рассчитанный при исследовании методом ОДС, корректно отражает уровень парциального давления кислорода в соответствующих биологических тканях. Не разработана методика исследования кислородного статуса экспериментальных опухолей в конфигурации "на просвет". Данные о динамике кислородного статуса опухолей в процессе естественного роста и при различных противоопухолевых воздействиях являются неполными и в достаточной мере противоречивыми. Цели и задачи

Целью работы было изучение динамики кислородного статуса экспериментальных опухолей методом оптической диффузионной спектроскопии в процессе естественного роста и на фоне проведения терапевтических воздействий. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать возможности метода оптической диффузионной спектроскопии для оценки уровня оксигенации ткани в модельном эксперименте и на экспериментальных опухолях ш v¡Vo. Верифицировать результаты, полученные с использованием ОДС, с помощью стандартных методов определения кислородного статуса.

2. Провести исследование изменений уровня оксигенации экспериментальной опухоли методом ОДС в процессе ее естественного роста и оценить возможные механизмы выявленных изменений.

3. С помощью метода оптической диффузионной спектроскопии изучить изменения кислородного статуса экспериментальной опухоли в ответ на противоопухолевые воздействия (ионизирующее излучение, цитостатическое воздействие).

4. С помощью метода ОДС изучить динамику кислородного статуса экспериментальной опухоли под воздействием кислород-модифицирующего агента.

5. Разработать методику использования оптической диффузионной спектроскопии в конфигурации "на просвет" для задач определения кислородного статуса экспериментальных опухолевых моделей.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Метод оптической диффузионной спектроскопии позволяет корректно определить уровень оксигенации биологических тканей и выявить тканевые механизмы возникающих изменений.

2) Основные механизмы снижения оксигенации в процессе естественного роста опухоли связаны как с увеличением потребления кислорода тканями, так и со снижением поставки кислорода кровью при неизменном уровне кровенаполнения.-В основе изменений уровня оксигенации опухоли под воздействием цитостатических препаратов лежит снижение потребления кислорода опухолевыми клетками, находящимися в состоянии дистрофии, что подтверждается стабилизацией уровня потребления кислорода тканью опухоли.

3) Важную роль в развитии изменений кислородного статуса опухоли в течение первых 24 часов после воздействия ионизирующего излучения играют нарушения перфузии, которые могут вызывать снижение оксигенации ткани новообразования. В более поздние сроки основное влияние на уровень оксигенации оказывает снижение потребления кислорода в результате уменьшения количества жизнеспособных опухолевых клеток.

4) В основе улучшения оксигенации новообразования в ответ на введение вазодилатирующего агента лежит повышение кровенаполнения опухоли и увеличение доставки кислорода тканям.

Научная новизна

Впервые метод ОДС в конфигурации "на просвет" адаптирован и реализован в эксперименте на животных. Разработана новая методика использования оптической диффузионной спектроскопии для задач определения кислородного статуса тканей экспериментальных опухолей.

Впервые результаты определения уровня оксигенации тканей методом оптической диффузионной спектроскопии верифицированы на двух опухолевых моделях с использованием иммуногистохимического исследования с экзогенным маркером гипоксии.

Впервые методом ОДС в конфигурации «на просвет» показана динамика изменений уровня оксигенации экспериментальной опухоли в процессе естественного роста и выявлены механизмы указанных изменений.

Впервые методом ОДС проведено in vivo исследование динамики оксигенации экспериментальной опухоли на фоне цитостатического воздействия и показано, что в основе изменений уровня оксигенации после проведения химиотерапии лежит уменьшение потребности ткани опухоли в кислороде.

Проанализирован баланс поступления и потребления кислорода тканями опухоли при воздействии на нее ионизирующего излучения в зависимости от срока после воздействия и показана роль реакции сосудистого русла в развитии радиационно-индуцированных изменений уровня оксигенации.

Продемонстрирована роль повышения кровенаполнения опухоли и увеличения доставки кислорода в механизме улучшения оксигенации новообразования на фоне воздействия препарата, оказывающего влияние на микроциркуляторную перфузию (пентоксифиллин). Научно-практическая значимость

В работе представлена методика неивазивного определения уровня оксигенации экспериментальных опухолей методом оптической диффузионной спектроскопии. Продемонстрирована возможность ее использования для проведения мониторинговых исследований in vivo на экспериментальных опухолевых моделях для изучения динамики оксигенации новообразований в ходе их естественного роста. Показано, что метод ОДС может дать информацию не только об оксигенации тканей, но и о механизмах развития ее изменений по данным о поставке (оксигемоглобин) и потреблении (дезоксигемоглобин) тканями кислорода. Были выявлены разнонаправленные изменения оксигенации экспериментальной опухоли при различных противоопухолевых воздействиях и рассмотрены механизмы развития этих изменений. В этой связи результаты диссертационной работы могут найти применение в научных исследованиях, посвященных проблеме развития опухолевой гипоксии и разработке методов ее коррекции. Возможно использование разработанной методики в онкологической клинике с целью неинвазивного мониторинга кислородного статуса определенных локализаций злокачественных опухолей и прогнозирования их ответа на лечение. Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при разработке курсов биофизики, радиобиологии, экспериментальной онкологии, лазерной оптики.

Апробация работы

2011), III Международном симпозиуме "Topical Problems of Biophotonics" (Санкт-Петербург - Нижний Новгород, 2011, 2013), V Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине" (Троицк, 2012, диплом 1 степени), 31-й конференции Европейского общества радиологии и терапевтической онкологии (ESTRO 31, Барселона,

2012), международной летней школе для аспирантов ("Biophotonics'13, о. Вен, Швеция, 2013")

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, в том числе в журналах, входящих в российские и международные системы цитирования - 6 работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из Перечня использованных сокращений, Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалов и методов исследования и Результатов и их обсуждения), Заключения, Выводов, Списка литературы (187 источников). Иллюстрационный материал включает 30 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах массой 200-230 г разведения питомника «Столбовая» в соответствии с требованиями нормативных правовых актов. В работе использовались перевивные опухоли крыс различного гистогенеза, имеющие солидный характер роста: лимфосаркома Плисса (ЛСП) и рак молочной железы крыс (РМК-1), различающиеся по своему гистологическому строению и функциональным характеристикам. Эксперименты с перевитой ЛСП начинали на 5Й-7Й день после перевивки опухоли, с РМК-1 - на 30-37Й день после перевивки, когда опухолевые узлы достигали размера 1 см. Перед началом эксперимента животных

наркотизировали введением внутривенно препарата "Золетил" в концентрации 50 мг/кг. По окончании серии ОДС-исследований животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Всего использовано 66 животных.

Неинвазивное определение кислородного статуса экспериментальных опухолей

диффузионной спектроскопии, разработанной и сконструированной в Институте прикладной физики РАН (г. Нижний Новгород) (Orlova et al., 2008). Источниками излучения в установке служат лазеры видимого и ближнего ИК-диапазона с длинами волн 684 нм (близкой к максимуму поглощения дезоксигемоглобина - ННЬ), 850 нм (близкой к максимуму поглощения оксигемоглобина - НЬСЬ) и 794 нм - длина волны, на которой коэффициенты поглощения оксигемоглобина и дезоксигемоглобина совпадают. Частота амплитудной модуляции - 140 МГц. В установке используется синхронное пошаговое сканирование источником и детектором в конфигурации "на просвет" расположенных с противоположных сторон исследуемого объекта с шагом 1-2 мм. В каждой позиции источник-детектор производится считывание данных от всех трех источников. С целью компенсации неоднородностей толщины объекта и создания геометрически правильного объема сканирования закрепленных на опорной пластине животных помещали в прозрачную кювету с иммерсионной жидкостью, по своим оптическим параметрам соответствующей оптическим параметрам биологической ткани (рис. 1).

Принцип метода ОДС состоит в построении изображения от многократно рассеянного света, проходящего через ткани толщиной до нескольких сантиметров. В построении изображения используются диффузионно-рассеянные фотоны (Pera, 2003). С целью четкого разделения коэффициентов поглощения и рассеяния биотканей в ОДС установке применяется лазерное зондирующее излучение, модулированное по интенсивности с высокой частотой (100-200 МГц). Амплитуда (А) и фаза (©) волны, прошедшей сквозь биоткань, зависят как от параметров рассеяния (ц5) так и поглощения (ца) и измеряются высокочувствительным фотоприемником (1).

выполнялось на установке для оптическои

Рис. 1. Функциональная схема экспериментальной установки для ОДС

Так как опухоли располагаются на глубине более 1 мм, то в расчетах используется диффузионное приближение уравнения переноса излучения (УПИ). УПИ описывает распространение света в сильно рассеивающих средах (таких как биоткань). Диффузное приближение УПИ описывает распространение света на больших глубинах. Из диффузионного приближения УПИ получены решения для постоянных затухания ф) и распространения (Ь) лазерного излучения (2).

- +м.

з/Л

(2)

где с - скорость распространения света в среде, со - частота модуляции. Данные величины определяют распространение волны фотонной плотности в среде (2). Зная толщину объекта (И), решая совместно уравнения (2), определяются показатели рассеяния и поглощения на трех длинах волн (к). Решая систему линейных

уравнений (3) рассчитывается концентрации компонентов биотканей:

(3)

где - показатели поглощения отдельных компонентов тканей (РИат е[ а1, 2000) На основе полученных данных о содержании окси- и дезоксигемоглобина рассчитывали уровень насыщения крови кислородом по формуле: 5102=[НЬ02]/[ННЬ+НЬ02]х100% СТготЬег%, е1 а1„ 2005).

На первом этапе исследования изучалось соответствие данных об уровне оксигенации экспериментальной опухоли, полученных методом ОДС, и данных стандартных методов определения оксигенации биологических тканей. На первом этапе работы исследования были проведены на модельной среде, в качестве которой использовалась смесь следующего состава: 20 мл цельной человеческой крови (концентрация гемоглобина 77 мМ/л), 450 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,4), 50 мл 20% раствора липофундина. Деоксигенацию крови проводили путем барботирования азотом, оксигенацию путем барботирования кислородом. Измерения насыщения крови кислородом и парциального давления кислорода модельной среды проводили одновременно с помощью ОДС-установки и кислородного микросенсора ишяепхе. Показания пересчитывали на уровень парциального давления кислорода в тканях (мм.рт.ст.) с учетом условий проведения эксперимента (атмосферное давление, температура). В ходе эксперимента температуру жидкости поддерживали на постоянном уровне.

Далее были изучены возможности метода ОДС в качестве метода неинвазивной оценки кислородного статуса экспериментальных опухолевых моделей in vivo. Использовались две опухолевые модели - ЛСП (11 животных) и РМК-1 (8 животных). Для верификации данных ОДС было использовано иммуногистохимическое (ИГХ) исследование опухоли с экзогенным маркером гипоксии - пимонидазол гидрохлоридом, который обладает свойством селективного связывания с тканями, парциальное давление кислорода в которых не превышает 10 мм рт. ст. (Raleigh et al., 1999). Пимонидазол вводили внутривенно in vivo из расчета 60 мг на килограмм веса. Для иммуногистохимического исследования опухоли препарировались, замораживались и хранились при температуре -135°С. Иммуногиетохимический анализ осуществлялся с использованием набора Hypoxyprobe™-l (Hypoxyprobe, Inc, США) в соответствии с рекомендациями Natural Pharmacia International. На криомикротоме (Leica SM 200М, Германия) изготавливались срезы замороженной опухоли толщиной 60 мкм, которые окрашивались антителами, мечеными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) и исследовались на лазерном сканирующем микроскопе LSM 510 МЕТА (Carl Zeiss, Германия) при стократном увеличении. Для возбуждения флуоресценции ФИТЦ использовалось излучение с длиной волны 488 нм, регистрацию флуоресценции осуществляли в диапазоне 500-540 нм. Для сопоставления результатов, полученных методом ОДС и ИГХ для двух моделей, проводилась количественная оценка относительной гипоксической фракции, которая оценивалась как процентное соотношение площади ФИТЦ-положительных участков к площади всего образца. Участки для данного анализа выбирались случайным образом из центральной части опухоли и с периферических зон.

На втором этапе проводилось изучение динамики кислородного статуса ЛСП (12 животных) на фоне химиотерапевтического (XT) воздействия и ее сравнение с динамикой оксигенации опухоли в процессе ее естественного роста. В качестве XT агента использовали препарат циклофосфан (Харкевич, 1981), который вводили на 4-е сутки после перевивки опухоли внутрибрюшинно однократно из расчета 50 мг/кг. ОДС-исследование проводилось на 4-й день после перевивки (перед введением циклофосфана), а затем на 6-й, 8-й, 10-й и 13-й день. Контрольную группу составили 6 нелеченных животных. Стандартное гистологическое исследование было выполнено у 4 животных (2 в контрольной и 2 в опытной группе) на 4-й и 10-й день после трансплантации клеток опухоли соответственно (Галахин и др., 2000).

На третьем этапе была изучена динамика оксигенации лимфосаркомы Плисса после однократного локального облучения в дозе 10 Гр. Эксперименты проведены на 13 облученных и 8 контрольных животных. ОДС-исследование проводилось перед облучением (7й день после перевивки) и каждые 24 ч после него в течение 4 суток. Для верификации данных, полученных методом ОДС, проводилось измерение парциального давления кислорода методом полярографии: у каждого животного до облучения, затем через 24 часа и через 48 часов после лучевой терапии соответственно. У двух животных из контрольной группы и у двух облученных животных на 8-й и 9-й день после перевивки было проведено гистологическое исследование ткани опухоли.

На четвертом этапе была изучена динамика кислородного статуса ЛСП (5 животных) под воздействием агента, улучшающего микроциркуляторную перфузию (пентоксифиллин). Препарат вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 10 мг/кг. Первое ОДС-исследование осуществляли перед введением, дальнейшие наблюдения проводили через 15, 30, 60, 120, 180 и 240 минут после введения пентоксифиллина. Для каждого животного в каждой временной точке вычисляли разности значений полученных параметров после введения препарата с исходными как в опухолевой, так и в нормальной ткани.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel 2002, Statistica 6.0. Парный t-тест проводился с целью выявления статистически значимых различий между исходными значениями показателей StOi и этими же показателями в динамике через определенные временные промежутки, непарный t-тест - между соответствующими параметрами у леченых и не леченых животных в одинаковые промежутки времени. В качестве порога статистически значимых различий было принято значение р<0.05. С целью установления корреляции между абсолютными значениями StÜ2 и данными прямых измерений рОг в опухоли вычисляли коэффициент корреляции Спирмена (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование возможностей метода оптической диффузионной спектроскопии для оценки уровня оксигенации ткани в модельном эксперименте и на экспериментальных опухолях in vivo

Результаты модельного эксперимента, которые отражают изменение уровня StÜ2 при изменении значений парциального давления кислорода в фантоме ткани, совпали со значениями физиологической кривой диссоциации гемоглобина для соответствующих внешних условий (рис. 2).

«Р ■'' А/с. 2 Результаты модельного

эксперимента, полученные при измерении уровня насыщения крови кислородом методом ОДС и парциального давления кислорода фантома ткани. Пунктиром показана кривая диссоциации гемоглобина,

О Оксигенация

рассчитанная для Т=28 С и

♦ Деоксигенация '

/40 мм рт. ст. (Ке/тап, 1966)

100 120 140 р02, мм рт. ст.

Далее были изучены возможности метода ОДС для неинвазивмой оценки кислородного статуса экспериментальных опухолей in vivo.

ео зо

Рис. 3. Примеры изображений ДСП (размер изображений 50x60 мм) и РМК-! (размер изображений 50x50 мм), полученных методом ОДС и результаты гистологического исследования ЛСП и РМК-1, окраска гематоксилином и эозином, хЮО. а), е) амплитуда ОДС-сигнала (усл. ед.); б),ж) распределение содержания общего гемоглобина (мкМ/л); в), з) распределение содержания дезоксигемоглобина (мкМ/л); г),и) распределение содержания оксигемоглобина (мкМ/л); д),к) распределение насыщения крови кислородом (%)■

При численном восстановлении компонентного состава ткани опухоли было показано, что ЛСП по сравнению с нормальными тканями контралатеральной области характеризуется повышенным содержанием ННЬ (рис. Зв) и сниженным содержанием НЬ02 (рис. Зг). Концентрация общего гемоглобина (№) (рис. 36) в зоне опухоли оказалась сравнимой с его концентрацией в нормальных тканях. Уровень ЭЮт данной опухолевой модели оказался существенно сниженным (рис. Зд).

ОДС-изображения РМК-1 характеризовались относительно сниженным содержанием оксигемоглобина, сравнимым с окружающими тканями содержанием дезоксигемоглобина, и, соответственно, сравнимым с окружающими тканями насыщением крови кислородом всей области опухоли (рис. Зк).

Согласно литературным данным (£>е В1а.и ег а!., 1993, Ы е1 ей., 2004), содержание ШЬ

отражает кровенаполнение ткани, НЬСЬ - поступление кислорода, а ННЬ - его потребление. Высокая концентрация дезоксигемоглобина в ЛСП, характеризующейся наличием большого количества компактно расположенных клеточных элементов, высокой митотической активностью клеток, быстрым ростом, высоким соотношением паренхима/строма, предполагает несоответствие между уровнем поставки и потребления кислорода быстро растущей опухолевой тканью. Отсутствие существенных различий в содержании дезоксигемоглобина в зоне опухоли и в нормальных тканях указывает на сравнимый с ними уровень потребления кислорода моделью РМК-1, которая характеризуется медленным ростом и невысокой митотической активностью. При иммуногистохимическом исследовании с маркером гипоксии отличительными особенностями препаратов ЛСП были высокий уровень флуоресцентного сигнала и сплошное равномерное окрашивание тканей ФИТЦ. При ИГХ анализе образцов РМК-1 были выявлены лишь отдельные области, в которых наблюдалось специфическое связывание тканей с пимонидазолом. Относительная гипоксическая фракция для ЛСП составила 74,6±14.9%, что соответствовало низкому уровню насыщения крови кислородом данной опухолевой модели. Данный показатель для РМК-1 составил 5,1 ±2,4% (рис. 4).

|||Ь ИМ); ИНЬ

им» $г01 100 ИГХ

Отношение концентраций ННЬ. НЬО?. IНЬ. уровня ЗЮ2 опухоль/норма М±ЭО. * - р < 0.05

Рис. 4 Показатели кислородного статуса экспериментальных опухолей в сопоставлении с результатами ИГХ

Таким образом, возможность использования оптической диффузионной спектроскопии в качестве метода оценки кислородного статуса экспериментальных опухолей была подтверждена результатами стандартного иммуногистохимического исследования с использованием пимонидазола в качестве экзогенного маркера гипоксии.

Исследование динамики кислородного статуса опухоли в процессе естественного роста и в ответ на действие цитостапгического препарата (циклофосфана)

При исследовании кислородного статуса ЛСП в процессе естественного роста было выявлено постепенное снижение оксигенации опухолевой ткани, которое являлось статистически значимым по сравнению с исходным уровнем, начиная с шестых суток после перевивки (рис.5г).

ннь

—Естествен-ьм рост **

—•— 1^*гафэсфэн

** „

•« Ж

—{

б)

Время после перевивки (сутки)

шь

Время после перевивки (сутки)

Ы01

! И^М:

1ШВДЙ

Врелда после перевивки (сутки)

Время после перевивки (сутки)

Рис. 5. Динамика 1НЬ, ННЬ, НЬС>2 и АО2 в опухоли ЛСП в процессе естественного роста и

при действии химиотерапии. - различия статистически значимы между сравниваемыми группами (р<0.05); -различия статистически значимы по сравнению с исходным уровнем (р<0.05) и результаты гистологического исследования ЛСП, окраска гематоксилином и эозином, х400

Это происходило за счет значимого повышения концентрации ННЬ, который отражает уровень потребления тканями кислорода (Рис. 56, в, пунктирные линии). Одновременно наблюдалось некоторое снижение содержания НЬ02 в опухолевой ткани

(рис. 5а), что, возможно, отражает нарушение доставки кислорода через аномально сформированное сосудистое русло опухоли (Уаире1 еI а1., 1989).

После введения циклофосфана отмечались существенные различия динамики показателей кислородного статуса опухоли по сравнению с контрольными животными. В течение всего времени наблюдения содержание дезоксигемоглобнна практически не изменялось по сравнению с исходным значением (рис. 56, сплошная линия). Данный факт соответствует изменениям ткани ЛСП, выявленным при гистологическом исследовании.

После химиотерапии опухоли характеризовались редко расположенными опухолевыми клетками, которые находились в состоянии патологических изменений разной степени выраженности, вплоть до некротических. Кроме того, отсутствовали значимые изменения содержания НЬОг как по сравнению с исходным уровнем, так и с контрольной группой. Последнее может свидетельствовать о сохранении достаточного уровня доставки кислорода с кровью на фоне химиотерапевтического воздействия (рис. 5а, сплошная линия). Уровень оставался неизменным и достоверно более высоким относительно контрольной группы. Кровенаполнение опухолевой ткани не изменялось ни в процессе естественного роста, ни при воздействии цитостатического препарата.

На основании проведенных исследований можно предположить, что одним из наиболее существенных механизмов стабилизации кислородного статуса опухоли после проведения эффективной химиотерапии является значительное уменьшение потребности опухоли в кислороде вследствие снижения количества жизнеспособных опухолевых клеток (уменьшение диффузионного компонента гипоксии).

Исследование динамики кислородного статуса в ответ на действие ионизирующего излучения

При изучении динамики кислородного статуса ЛСП после однократного облучения в дозе 10 Гр было показано, что радиационно-индуцированные изменения оксигенации опухоли носили двухфазный характер. На первой фазе реакции, через 24 часа после облучения, наблюдалось снижение уровня БЮг (рис. 6а) как по сравнению с начальными значениями, так и с контролем. Данное снижение происходило за счет роста содержания ННЬ в опухолевой ткани по сравнению с исходным уровнем (рис. 6в). По сравнению с группой необлученных животных различия также были статистически значимыми. Одновременно наблюдалось снижение содержания НЬОг (рис.66). Важно отметить, что концентрация ШЬ оставалась стабильной, не изменяясь ни по сравнению с исходным уровнем, ни по сравнению с контролем (рис. 6г). В дальнейшем наблюдался постепенный

рост 5(СЬ опухоли по сравнению с необлученным контролем, максимум которого наблюдали через 48 часов после воздействия.

Данное повышение сохранялось в течение последующих 24 часов (рис. 6а). В основе этого процесса лежало повышение НЬСЬ (рис. 66) по сравнению с исходными значениями и с контролем. Содержание ННЬ в эти сроки возвращалось к исходному уровню. В дальнейшем происходило постепенное снижение ЗЮг, которое достигало контрольных цифр через 96 часов после воздействия (рис. 6а).

"Н^Н

—О—Обу —10 Оу

в)

3 1

1 0.8

I 0.6

>- 0 .4

= 0.2

20 40 6П ЯП 100 Время после облучения, ч

—о—осу —10 Су

б)

Рис. 6 Динамика параметров оксигенации лимфосаркомы Плисса (отношение

опухоль/мышца) после облучения (пунктирная линия) и в контроле (сплошная линия): а — уровень насыщения крови кислородем (ВЮ2), р -содержание ?П 4П КП ЯП 1ПП оксигемоглобина (НЬ02), в время после облучения, ч _ содержание

дезоксигелюглобина (ННЬ), г - содержание общего гемоглобина (!НЬ). * - различия

статистически значимы между сравниваемыми группами (р<0.05); ** - различия статистически значимы по сравнению с исходным уровнем (р<0.05)

/--Г-

—о—Ову —10 Су

ЯП 1ПП

Время после облучения, ч Время после облучения, ч

Динамика содержания различных форм гемоглобина, характеризующих кислородный статус опухоли, отражает изменения состояния ее сосудистого русла, выявленные при гистологическом исследовании. Через 24 часа после лучевого воздействия в опухоли фиксировались нарушения сосудистого русла различной степени выраженности с мозаичным, неравномерным характером распределения. В стенках мелких капилляров и артериол наблюдались фибриноидные изменения. Параллельно отмечались стаз и сладжирование крови, диапедезные кровоизлияния. В некоторых сосудах формировались тромбы, главным образом эритроцитарные и гиалиновые, местами смешанные. На небольших по площади участках опухоли кровеносные сосуды

4 65

были расширены и полнокровны, отмечалось запустевание артериол. Клеточные элементы демонстрировали повреждения ядер и цитоплазмы.

Изменения через 48 ч можно в целом охарактеризовать как снижение степени выраженности сосудистых расстройств с одновременным нарастанием альтерации в

строме и паренхиме опухоли. Основная масса кровеносных сосудов была расширена и содержала форменные элементы крови, но •• объем геморрагий при этом уменьшился. В

небольшом количестве капилляров и мелких артериол по-прежнему сохранялись тромбы. * Увеличилось содержание клеток с

i необратимыми изменениями ядер и цитоплазмы.

02468 10 12 ,

В качестве метода верификации

рО,, mmHg

Рис. 7. Соотношение значений р02 и результатов, полученных методом ОДС

St02 в опухоли в ходе лучевой использовался метод полярографического

терапии (до облучения, через 24 ч и

48 ч после облучения) измерения парциального давления кислорода в

тканях. Сопоставление показателей насыщения крови кислородом, полученных сравниваемыми методами (ОДС и рОг) продемонстрировало высокий коэффициент корреляции между двумя методами (г = 0.88, р<0.05, рис. 7).

Таким образом, на первой фазе радиационно-индуцированных изменений кислородного статуса изученной опухолевой модели основную роль играют нарушения микроциркуляции, которые вызывают снижение уровня оксигенации новообразования (перфузионная гипоксия). Улучшение оксигенации через 48 часов после облучения объясняется, по всей видимости, снижением потребления кислорода в результате уменьшения количества жизнеспособных опухолевых клеток (уменьшение диффузионного компонента гипоксии) и частичным восстановлением кровотока в микроциркуляторном русле.

Исследование динамики кислородного статуса в ответ на введение агента, улучшающего микроциркуляторную перфузию (пентоксифиллина)

При изучении динамики кислородного статуса лимфосаркомы Плисса в ответ на введение агента, улучшающего микроциркуляторную перфузию (пентоксифиллин) было выявлено улучшение уровня насыщения крови кислородом за счет повышения концентрации оксигемоглобина. На рисунке 8 представлена динамика St02, ННЬ, НЬОг и tHb в опухоли и в контралатерально расположенной мышечной ткани экспериментального животного

после введения пентоксифиллина. Уже через 15 минут после введения препарата в опухоли отмечается повышение концентрации оксигемоглобина (рис.86), которому соответствует повышение содержания общего гемоглобина (рис.8в), и, соответственно повышение уровня оксигенации опухолевой ткани (рис.8а). Повышенное по сравнению с исходным уровнем насыщение крови кислородом сохраняется в течение последующих 90 минут, после чего снижается до исходного уровня. Важно отметить, что концентрация дезоксигемоглобина, отражающего уровень потребления кислорода тканями, остается практически неизменной в течение всего времени мониторинга (рис. 8г).

а)

о Опухоль • Мыица

б)

о Олухогъ • Мыика

Время, МИН

время, мин

50 40 30 20 10 0 -10 -20

В)

о Опухо/ъ • Мыида

Время, мин

$50

Время, мин

Рис. 8 Разницы в значениях Б102 (а), 1ИЬ (б), НЪОг (в) и ННЬ (г), определенные методом ОДС до и после введения пентоксифиллина в зоне опухоли ЛСП и в контралатерально расположенной зоне нормы и наложенные на них линии тренда

Таким образом, основным фактором влияния пентоксифиллина на оксигенацию опухоли является снижение перфузионного компонента опухолевой гипоксии. Указанные изменения полностью соответствуют известным механизмам действия пентоксифиллина в отношении патологического сосудистого русла. Изменение уровня потребления кислорода тканями не принимает участия в реакции, что подтверждается стабильной концентрацией дезоксигемоглобина в опухоли. Изучение динамики параметров

оксигенации мышечной ткани продемонстрировало отсутствие изменений в течение всего времени наблюдения (рис.8 а, б, в, г).

Таким образом, с использованием метода ОДС выявлены изменения уровня оксигенации ДСП при воздействии цитостатического препарата, ионизирующего излучения и препарата, улучшающего микроциркуляторную перфузию. Применение метода ОДС позволило выявить ведущие механизмы изменения оксигенации ткани опухоли и оценить роль перфузионного и диффузионного компонентов гипоксии в зависимости от типа воздействия. Определена роль повышения кровенаполнения и увеличения доставки кислорода ткани опухоли, а также роль снижения потребления кислорода в механизме улучшения оксигенации новообразования. Определены временные интервалы, в течение которых происходит изменение оксигенации. На основании выполненных экспериментальных исследований предложена методика использования метода оптической диффузионной спектроскопии в конфигурации "на просвет" для определения кислородного статуса экспериментальных опухолевых моделей ш vivo.

ВЫВОДЫ

1. Методами иммуногистохимического исследования с экзогенным маркером гипоксии на двух опухолевых моделях и полярографическим измерением парциального давления кислорода ткани опухоли доказано, что метод оптической диффузионной спектроскопии позволяет неинвазивно определить уровень оксигенации биологических тканей без использования дополнительного контрастирования. Данные, полученные методом ОДС, адекватно отражают уровень оксигенации модельной среды и уровень оксигенации биологических тканей.

2. Методом ОДС показано, что в процессе естественного роста экспериментальной опухоли снижение уровня ее оксигенации происходит как за счет повышения уровня потребления кислорода (диффузионный компонент гипоксии), так и за счет снижения доставки кислорода к ткани опухоли (перфузионный компонент гипоксии) на фоне неизменного кровенаполнения.

3. Методом ОДС показано, что в ответ на цитостатическое воздействие уровень оксигенации экспериментальной опухоли стабилизируется вследствие влияния химиотерапии на диффузионный (хронический) компонент гипоксии. Циклофосфан вызывает дистрофические изменения ткани опухоли и снижает потребность опухоли в кислороде, что подтверждается стабилизацией уровня дезоксигемоглобина в ткани опухоли.

4. С использованием метода ОДС продемонстрировано, что радиационно-индуцированные изменения оксигенации экспериментальной опухоли могут носить двухфазный характер: снижение оксигенации на первой фазе радиационно-индуцированных изменений (24 часа после воздействия) и ее восстановление на второй фазе (48 часов после воздействия). Важную роль в развитии изменений через 24 часа после облучения играют нарушения перфузии. Последующее восстановление оксигенации опухоли может быть связано как с улучшением доставки кислорода, так и со снижением потребления кислорода тканью опухоли.

5. Повышение уровня оксигенации опухоли после введения пентоксифиллина происходит за счет влияния препарата на перфузионный компонент гипоксии, что подтверждается повышением кровенаполнения опухоли и увеличением доставки кислорода тканям. Изменение потребления кислорода опухолевой тканью не принимает участия в реакции. Изменения оксигенации нормальной мышечной ткани не наблюдалось.

6. Предложена методика прижизненной неинвазивной оценки кислородного статуса экспериментальных опухолевых моделей in vivo с использованием метода оптической диффузионной спектроскопии в конфигурации "на просвет".

Благодарность. Автор выражает особую благодарность к.б.н. А.Г. Орловой за ценные советы при выполнении и обсуждении диссертационной работы, д.б.н. Сноповой Л.Б., проф. Кузнецову С.С. за проведение и описание морфологического исследования на базе ГБОУ ВПО НижГМА МЗ РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Maslennikova A.V., Orlova A.G., Golubiatnikov G.Yu., Kamensky V.A., Shakhova N.M., Babaev A.A., Snopova L.B., Ivanova I.P., Plekhanov V.l., Pryanikova T.I., Turchin I.V. Comparative study of tumor hypoxia by diffuse optical spectroscopy and immunohistochemistry in two tumor models // Journal of Biophotonics. - V. 3. - № 12. - 2010. - P. 743-751

2) Голубятников Г.Ю., Масленникова A.B., Орлова А.Г., Пряникова Т.И. Метод оптической диффузионной спектроскопии для in vivo исследования динамики оксигенации опухоли // Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики. - № 5. -2010.-С. 114-117

3) Орлова А.Г., Масленникова A.B., Голубятников Г.Ю., Каменский В.А., Шахова Н.М., Бабаев A.A., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Плеханов В.И., Пряникова Т.И., Турчин И.В. Неинвазивное определение кислородного статуса экспериментальной опухоли методом оптической диффузионной спектроскопии // Биофизика. - т. 56. - № 2. - 2011. - С. 349-355

4) Масленникова A.B., Орлова А.Г., Голубятников Г.Ю., Каменский В.А., Плеханов В.И., Бабаев A.A., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Пряникова Т.И., Шахова Н.М., Турчин И.В. Метод оптической диффузионной спектроскопии для in vivo исследования

пространственного распределения зон гипоксии в ткани опухоли // Технологии живых систем. - т. 8. - №2. - 2011. - С. 38-43

5) Масленникова A.B., Орлова А.Г., Пряникова Т.И., Костеников H.A., Виноградова Ю.Н., Денисенко А.Н. Опухолевая гипоксия: патогенез, клиническое значение, методы диагностики // Вопросы онкологии. - № 4. - 2011. - С. 413-420

6) Пряникова Т.И., Орлова А.Г., Голубятников Г.Ю., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Масленникова A.B. Исследование динамики оксигенации экспериментальной опухоли на фоне химиотерапевтического воздействия методом оптической диффузионной спектроскопии // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - № 6(1).-серия Биология. - 2012. - С. 92-98

7) Орлова А.Г, Масленникова A.B., Голубятников Г.Ю, Пряникова Т.И., Плеханов В.И., Каменский В.А., Шахова И.М., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Бабаев A.A., Турчин И.В. Неинвазивная оценка динамики кислородного статуса опухолевых моделей методом оптической диффузионной спектроскопии в процессе естественного роста и на фоне проведения XT // Российский биотерапевтический журнал. - № 2. - 2010. - С. 56-57. - IX Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 18-19 мая 2010, г. Нижний Новгород.

8) Пряникова Т.И., Орлова А.Г, Масленникова A.B., Голубятников Г.Ю, Плеханов В.И., Каменский В.А., Шахова Н.М., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Турчин И.В. Оценка влияния пентоксифиллина на уровень оксигенации опухолевой ткани методом оптической диффузионной спектроскопии // Российский биотерапевтический журнал. - № 2. - 2010,-С. 57. - IX Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 18-19 мая 2010, г. Нижний Новгород.

9) Maslennikova A., Orlova A., Golubjatnikov G., Kamensky V., Plekhanov V., Shakhova N., Snopova L., Babaev A., Prjanikova T. Non-invasive monitoring of tumor oxygen status after oxygen-modification by pentoxyphillin // Radiotherapy & Oncology. - 96 (suppl.). - 2010. - P. 873

10) Масленникова A.B., А.Г. Орлова, Голубятников Г.Ю., Пряникова Т.И., Плеханов В.И., Снопова Л.Б., Бабаев A.A., Каменский В.А., Шахова Н.М., Турчин И.В. Оптическая диффузионная спектроскопия - метод неинвазивного определения кислородного статуса опухолей. Сравнение с иммуногистохимическим исследованием // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика -2010", С.42-45, 2010 (21-25 июня 2010 года, г. Москва).

11) Пряникова Т.И., Исследование влияния циклофосфана на уровень насыщения крови кислородом экспериментальной опухоли методом оптической диффузионной спектроскопии, Материалы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», С.169-170, 2010 (19-23 апреля 2010 года, г. Пущино).

12) Орлова А.Г., Масленникова A.B., Пряникова Т.И., Голубятников Г.Ю., Плеханов В.И., Снопова Л.Б., Бабаев A.A., Иванова И.П., Каменский В.А., Шахова Н.М., Турчин И.В., Метод оптической диффузионной спектроскопии для неинвазивной оценки кислородного статуса экспериментальных опухолей в ходе терапевтический воздействий,

Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика -2010", 2010, С. 46-49 (21-25 июня 2010 года, г. Москва)

13) Pryanikova T.I., Maslennikova A.V., Orlova A.G., Golubiatnikov G.Yu., Plekhanov V.l., Babaev A.A., Ivanova I.P., Snopova L.B., Kamensky V.A. Evaluation of tumor's oxygen state by diffuse optical spectroscopy. International Autumn School Biophysics & Bioelectrochemistry for Medicine: Basic Concepts, New Techniques and Application Perspective (1-6 Октября, 2010 года, г. Вулкан, Румыния)

14) Орлова А.Г., Масленникова A.B., Голубятников Г.Ю., Пряникова Т.И., Плеханов В.И., Снопова Л.Б., Иванова И.И., Каменский В.А., Шахова Н.М., Турчин И.В., Неинвазивный мониторинг уровня оксигенации экспериментальных новообразований методом оптической диффузионной спектроскопии, Материалы VI Съезда Российского Фотобиологического Общества, С. 176, 2011 (15-22 сентября, пос. Шепси, 2011 г).

15) Пряникова Т.И., Масленникова A.B., Орлова А.Г., Голубятников Г.Ю., Иванова И.И., Плеханов В.И., Каменский В.А., Турчин И.В., Исследование влияния циклофосфана на уровень насыщения крови кислородом опухолевой модели с использованием метода оптической диффузионной спектроскопии, Материалы VI Съезда Российского Фотобиологического Общества, С. 183, 2011 (15-22 сентября, пос. Шепси, 2011 г).

16) Пряникова Т.И., Масленникова A.B., Орлова А.Г., Голубятников Г.Ю., Каменский В.А., Турчин И.В. Изучение динамики кислородного статуса экспериментальной опухоли в процессе химиотерапевтического воздействия методом оптической диффузионной спектроскопии. Российский Биотерапевтический Журнал, № 1, С. 52, 2011. X Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (22-23 марта, Москва, 2011 г).

17) А.Г. Орлова, A.B. Масленникова, Г.Ю. Голубятников, Т.П. Пряникова, И.И. Иванова, В.А. Каменский, И.В. Турчин. Мониторинг оксигенации новообразований под воздействием пентоксифиллина методом оптической диффузионной спектроскопии, Российский Биотерапевтический Журнал, № 1, С. 44, 2011. X Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (22-23 марта, Москва, 2011г).

18) Пряникова Т.И. «Исследование кислородного статуса экспериментальных опухолей с использованием метода оптической диффузионной спектроскопии», тезисы докладов на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011». С. 28-29. 2011 (11 — 15 апреля , Москва, 2011 г.)

19) Смирнова Т.В., Пряникова Т.И. «Исследование кислородного статуса экспериментальной опухоли с помощью метода оптической диффузионной спектроскопии в ходе проведения лучевой терапии», тезисы докладов на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011», С. 42-43, 2011. (11 — 15 апреля , Москва, 2011 г.)

20) Orlova A.G., Maslennikova A.V., Golubiatnikov G.Yu., Kamensky V.A., Pryanikova T.I., Plekhanov V.l., Ivanova I.P., Smirnova T.V., Shakhova N.M., Turchin I.V. Monitoring of experimental tumor oxygenation by diffuse optical spectroscopy Proc. of III International Symposium "Topical problems of biophotonics", p.87-88, 2011 (16-22 июля, С.-Петербург -Н.Новгород, 2011 г.)

21) Pryanikova T.I., Maslennikova A.V., Orlova A.G., Golubiatnikov G.Yu., Kamensky V.A., Plekhanov V.l., Ivanova I.P., Shakhova N.M., Turchin I.V. The study of cyelophosphane effect on blood oxygen saturation level in tumor models using diffuse optical spectroscopy Proc. of III International Symposium "Topical problems of biophotonics", p.89-90, 2011 (16-22 июля, С.Петербург - Н.Новгород, 2011 г.).

22) Pryanikova T.I., Orlova A.G., Smirnova T.V., Ivanova I.P., Golubiatnikov G.U., Maslennikova A.V. Dynamics of tumor model oxygen state after irradiation estimated by diffuse optical spectroscopy, Radiotherapy & Oncology 2012; 103(suppl):5376 (9-13 мая 2012 г., г. Барселона, Испания).

23) Пряникова Т.Н., Смирнова Т.В., Орлова А.Г., Голубятников Г.Ю., Масленникова A.B., "Исследование динамики оксигенации экспериментальной опухоли методом оптической диффузионной спектроскопии на фоне лучевого воздействия", V Троицкая конференция "Медицинская физика и инновации в медицине", Т.1., С. 168-170, 2012.(4 - 7 июня 2012, г. Троицк, Московская обл.)

24) Пономарева Н.Г., Голубятников Г.Ю., Орлова А.Г., Пряникова Т.Н., Кузнецов С.С., Масленникова A.B., Шахова Н.М. "Мониторинг кислородного статуса злокачественных опухолей молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии" V Троицкая конференция "Медицинская физика и инновации в медицине", Т.1, С. 280-282, 2012 (4-7 июня 2012, г. Троицк, Московская обл.).

25) Масленникова A.B., Пряникова Т.П., Голубятников Г.Ю., Кузнецов С.С., Орлова А.Г., Пономарева Н.Г., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Шахова Н.М., Турчин И.В., «Изучение динамики кислородного статуса злокачественных новообразований на фоне химиотерапевтического воздействия методом оптической диффузионной спектроскопии», Материалы докладов IV Съезда биофизиков России, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», С. 154, 2012 (20-26 августа 2012, г. Нижний Новгород)

26) Орлова А.Г., Масленникова A.B., Пряникова Т.И., Голубятников Г.Ю., Смирнова Т.И., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Шахова Н.М., Каменский В.А., Турчин И.В., «Динамика уровня оксигенации экспериментальной опухоли после лучевого воздействия, определенная методом оптической диффузионной спектроскопии», Материалы докладов IV Съезда биофизиков России, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», С. 183, 2012 (20-26 августа 2012, г. Нижний Новгород)

27) Плеханова A.C., Пряникова Т.Н., Смирнова Т.В., Орлова А.Г., Масленникова A.B., Голубятников Г.Ю., Иванова И.П., Каменский В.А., Турчин И.В., «Исследование кислородного статуса экспериментальной опухоли методом оптической диффузионной спектроскопии при воздействии пентоксифиллина», Материалы докладов IV Съезда биофизиков России, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», С. 188, 2012 (20-26 августа 2012, г. Нижний Новгород)

28) Пряникова Т.И., Орлова А.Г., Голубятников Г.Ю., Снопова Л.Б., Иванова И.П., Бабаев A.A., Масленникова A.B., «Мониторинг кислородного статуса экспериментальных опухолей в ходе естественного роста методом оптической диффузионной спектроскопии», Материалы докладов IV Съезда биофизиков России, г. Нижний Новгород, 20-26 августа 2012, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», С. 188,2012.

29) Pryanikova T.I., Maslennikova A.V., Orlova A.G., Golubyatnikov G.Yu., Snopova L.B., Kuznetsov S.S., Turchin I.V. Influence of irradiation on the oxygenation of experimental tumor

estimated by diffuse optical spectroscopy. Proc. of IV International Symposium "Topical problems of biophotonics", p.96-97, 2013 (21-27 июля, Н.Новгород, 2013 г.)

Статьи № 1-6 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 24.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 875. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в РИУ ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пряникова, Татьяна Игоревна, Нижний Новгород

III к

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Пряникова Татьяна Игоревна

МЕТОД ОПТИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ для ИЗУЧЕНИЯ КИСЛОРОДНОГО СТАТУСА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ОПУХОЛЕЙ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(Специальность: 03.01.02 - биофизика)

Научный руководитель: Доктор медицинских наук Масленникова A.B.

Нижний Новгород - 2013

На правах рукописи

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень использованных сокращений 4

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Патогенез опухолевой гипоксии. Молекулярно-генетические

механизмы опухолевой прогрессии в условиях сниженной оксигенации

1.2. Методы диагностики кислородного статуса биологических тканей 20

1.3. Биологические и медицинские приложения оптической

диффузионной спектроскопии и томографии

Глава 2. Материалы и методы исследования 44

2.1. Объект исследования 44 2.1.1 Животные 44 2.1.2. Опухолевые модели 44

2.2. Установка для оптической диффузионной спектроскопии 45

2.2.1. Подбор иммерсионной жидкости 48

2.2.2. Получение исходных ОДС-изображений 49 2.3 Методики проведения эксперимента 52

2.3.1. Общая методика работы с экспериментальными животными 52

2.3.2. Получение и обработка ОДС-изображений 53

2.3.3. Схема модельного эксперимента 55

2.3.4. Определение состояния гипоксии экспериментальных опухолей

методами ОДС и иммуногистохимического анализа

2.3.5. Исследование динамики кислородного статуса в процессе

естественного роста опухоли

2.3.6. Исследование динамики кислородного статуса в ответ на

противоопухолевые воздействия

2.3.7. Статистическая обработка результатов 64

Глава 3. Результаты и их обсуждение 66

3.1. Результаты модельного эксперимента 66

3.2. Исследование уровня насыщения крови кислородом методом оптической диффузионной спектроскопии и иммуногистохимического

анализа на опухолевых моделях

3.3. Исследование динамики кислородного статуса в процессе

естественного роста опухоли

3.4. Исследование динамики кислородного статуса опухоли в ответ на

цитостатическое воздействие

3.5. Исследование динамики кислородного статуса опухоли в ответ на

воздействие ионизирующего излучения

3.6. Исследование динамики кислородного статуса в ответ на введение агента, улучшающего микроциркуляторную перфузию 97 (пентоксифиллина)

Заключение 102

Выводы 105

Список литературы 107

Перечень использованных сокращений

ОДС - оптическая диффузионная спектроскопия

НЮ2 - оксигемоглобин

ННЬ - дезоксигемоглобин

tHb - общий гемоглобин

St02 - уровень насыщения крови кислородом

RHF - относительная гипоксическая фракция (relative hypoxic fraction)

р02 - парциальное давление кислорода

ИК - инфракрасная область

ЛСП - лимфосаркома Плисса

РМК-1 - рак молочной железы

ИГХ - иммуногистохимический

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ВВЕДЕНИЕ

Возрастающее понимание роли гипоксии в клинической и экспериментальной онкологии дало толчок исследованиям, посвященным созданию новых методов диагностики и возможностям коррекции данного патофизиологического состояния. На сегодняшний день существует две группы методов определения уровня оксигенации - ex vivo (гистоморфометрия, криоспектрофотометрия, иммуногистохимическое исследование) и in vivo (прямое полярографическое измерение парциального давления кислорода, позитронно-эмиссионная томография, магнитно-резонансная томография). В течение последних двадцати лет достаточно широкое распространение в эксперименте и клинике получили оптические методы диагностики гипоксии, в частности, метод оптической диффузионной спектроскопии (ОДС) (Тучин, 2001, Rogatkin, Lapaeva, 2003, Tromberg et al. 2005, Vishwanath et al., 2009, Roblyera et al., 2011).

ОДС заключается в восстановлении оптических характеристик биологических тканей (показателей рассеяния и поглощения) путем использования информации о многократно рассеянном свете, прошедшем сквозь объект (Тучин, 1998; Boas et al., 2001; Taroni et al., 2004; Intes, Chance, 2005). Спектроскопические данные позволяют восстановить концентрацию основных тканевых хромофоров, характеризующих кислородный статус (оксигемоглобин, дезоксигемоглобин). На основе полученной информации вычисляется уровень насыщения крови кислородом (StÛ2). Метод ОДС может быть реализован в конфигурации "на отражение" (ближняя инфракрасная спектроскопия) и в конфигурации "на просвет". Второй вариант позволяет получать информацию о кислородном статусе глубоко расположенных тканей (максимальная глубина зондирования составляет 10 см) (Durduran et al., 2010). Метод позволяет оценить соотношение основных компонентов, характеризующих баланс доставки кислорода к тканям (оксигемоглобин) и его потребления (дезоксигемоглобин), а также кровенаполнение тканей (общий гемоглобин) (De Blasi et al., 1993; Lu et al., 2004; Orlova et al., 2008).

Неинвазивное определение кислородного статуса экспериментальных

опухолей необходимо для решения задач мониторинга и прогнозирования

эффективности противоопухолевых воздействий (облучение, химиотерапия,

фотодинамическая терапия), а также для разработки новых методов

диагностики и лечения злокачественных новообразований (Brown, 1999,

Eriksen et al, 2006, Wouters et al, 2007, Choe et al., 2005; Zhu et al, 2013).

Однако, до настоящего времени не имеется прямых доказательств, что

уровень насыщения крови кислородом (БЮг), рассчитанный при

исследовании методом ОДС, корректно отражает уровень парциального

давления кислорода в соответствующих биологических тканях. Не

разработана методика исследования кислородного статуса

экспериментальных опухолей в конфигурации "на просвет". Данные о

динамике кислородного статуса опухолей в процессе естественного роста и

при различных противоопухолевых воздействиях, таких как лучевая терапия (Cerussi et al., 2007; Wang et al., 2004), химиотерапевтическое воздействие (Duwuri et al., 2001), фотодинамическая терапия (Wang et al., 2004) являются неполными и в достаточной мере противоречивыми.

Цель и задачи исследования

1. Исследовать возможности метода оптической диффузионной спектроскопии для оценки уровня оксигенации ткани в модельном эксперименте и на экспериментальных опухолях in vivo. Верифицировать результаты, полученные с использованием ОДС, с помощью стандартных методов определения кислородного статуса.

Научная новизна

Научно-практическая значимость

В работе представлена методика неивазивного определения уровня

оксигенации экспериментальных опухолей методом оптической

диффузионной спектроскопии. Продемонстрирована возможность ее использования для проведения мониторинговых исследований in vivo на экспериментальных опухолевых моделях для изучения динамики оксигенации новообразований в ходе их естественного роста. Показано, что метод ОДС может дать информацию не только об оксигенации тканей, но и о механизмах развития ее изменений по данным о поставке (оксигемоглобин) и потреблении (дезоксигемоглобин) тканями кислорода. Были выявлены разнонаправленные изменения оксигенации экспериментальной опухоли при различных противоопухолевых воздействиях и рассмотрены механизмы развития этих изменений. В этой связи результаты диссертационной работы могут найти применение в научных исследованиях, посвященных проблеме развития опухолевой гипоксии и разработке методов ее коррекции. Возможно использование разработанной методики в онкологической клинике с целью неинвазивного мониторинга кислородного статуса определенных локализаций злокачественных опухолей и прогнозирования их ответа на лечение. Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при разработке курсов биофизики, радиобиологии, экспериментальной онкологии, лазерной оптики. Основные положения, выносимые на защиту

2) Основные механизмы снижения оксигенации в процессе естественного роста опухоли связаны как с увеличением потребления кислорода тканями, так и со снижением поставки кислорода кровью при неизменном уровне кровенаполнения. В основе изменений уровня оксигенации опухоли под воздействием цитостатических препаратов лежит снижение потребления кислорода опухолевыми клетками, находящимися в состоянии дистрофии, что подтверждается стабилизацией уровня потребления кислорода тканью опухоли.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 13-м симпозиуме студентов-биологов Европы «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders» 2009 (Казань, 2009, диплом за инновационный проект), VII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2010, диплом за лучший устный доклад), Международной весенней школе "Биофизика и биоэлектрохимия для медицины" (Румыния, 2009), 13-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), Международной осенней школе "Биофизика и биоэлектрохимия для медицины: основные концепции, новые методы и перспективы применения" (Румыния, 2010), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), III Международном симпозиуме "Topical Problems of Biophotonics" (Санкт-Петербург - Нижний Новгород, 2011, 2013), V Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине" (Троицк, 2012, диплом 1 степени), 31-й конференции Европейского общества радиологии и терапевтической онкологии (ESTRO 31, Барселона, 2012), международной летней школе для аспирантов ("Biophotonics'13, о. Вен, Швеция, 2013")

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 29 работ, в том числе в журналах, входящих в российские и международные системы цитирования -6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включая обзор литературы), заключения, выводов и списка литературы. Изложена на 125 страницах, содержит 30 рисунков. Список цитируемой литературы включает 187 источников, из них 169 на иностранных языках.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Патогенез опухолевой гипоксии. Молекулярно-генетические механизмы опухолевой прогрессии в условиях сниженной оксигенации

Кислородный статус злокачественных новообразований является одним из ключевых факторов, определяющих эффективность основных видов противоопухолевого лечения и оказывающих влияние на прогноз заболевания (Vaupel et al., 2005). Гипоксия злокачественных новообразований, которую необходимо рассматривать одновременно и как следствие неадекватного опухолевого кровотока, и как мощнейший стимул опухолевого неоангиогенеза, находится в ряду важнейших проблем современной экспериментальной и клинической онкологии. Состояние гипоксии, возникающее в результате дисбаланса между потребностями тканей в кислороде и его доставкой, является характерной чертой многих солидных опухолей (Brown, Giaccia, 1998).

К основным патогенетическим механизмам, которые приводят к возникновению гипоксии, относятся структурные и функциональные аномалии микроциркуляторного русла опухоли и связанные с ней нарушения перфузии; неблагоприятные условия диффузии кислорода; анемия, связанная с естественным развитием опухоли или действием терапии, которая ведет к сокращению транспорта 02 кровью (Vaupel, 1989). Формирующееся в процессе неоангиогенеза микроциркулярное русло опухоли является примитивным и хаотичным и характеризуется наличием ряда аномалий строения (рис. 1) (Cao, 2009; Brown, Giaccia, 1998).

Возникновение временных окклюзий приводит к формированию

острой ишемической (перфузионной) гипоксии, которая может носить

временный характер (Vaupel, 2005). Гипоксия вследствие нарушений

диффузии обусловлена тем, что аномально сформированное сосудистое

русло опухоли не в состоянии удовлетворить потребности в кислороде со

стороны быстро растущей опухолевой паренхимы. При этом страдает

доставка кислорода к клеткам, находящимся на расстоянии > 70 мкм от

кровеносного сосуда (рис. 1). Такой тип гипоксии носит хронический характер (Уаире!, 2004).

Шунт

Слепое окончание

ГИПОКСИЯ

Временная окклюзия

Нарушение целостности стенки \

СОСУДИСТОЕ РУСЛО в НОРМЕ

- организованное макро- и микроциркуляторное русло;

- сосуды равномерно распределены, не расширены;

- имеют гладкомышечный слой;

- цельная базальная мембрана;

- нормальная скорость кровотока;

- проницаемость сосудистой стенки не нарушена.

СОСУДИСТОЕ РУСЛО в ОПУХОЛИ

- дезорганизованное макро- и микроциркуляторное русло;

- сосуды неравномерно распределены, расширены;

- не имеют гладкомышечного слоя;

- отсутствует базальная мембрана;

- медленный, застойный кровоток;

- проницаемость сосудистой стенки повышена.

Рис. 1. Особенности сосудистого русла в норме и в опухоли (ВгиеЫше1ег, 20

Информация о работе

Пряникова, Татьяна Игоревна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Метод оптической диффузионной спектроскопии для изучения кислородного статуса экспериментальных опухолей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы