Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологический анализ инфракрасных спектров плазмы крови животных в норме и при экспериментальном онкогенезе

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологический анализ инфракрасных спектров плазмы крови животных в норме и при экспериментальном онкогенезе"

005010194

На правах рукописи

КРАСНИКОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИНФРАКРАСНЫХ СПЕКТРОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОНКОГЕНЕЗЕ

03.03.01 - физиология 03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 С 0ЕЗ 20:2

Нижний Новгород - 2012

005010194

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского и кафедре общей химии Нижегородской государственной медицинской академии.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем химической физики РАН (г. Черноголовка)

Защита состоится « 4» кЛлОЬТ&'ЮП года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 212.166». 15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23

Автореферат разослан «3>j> 2012 года и размещен на сайтах

http: // www.mon.gov.ru/ и // www.unn.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Копылова С.В.

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Крылов Василий Николаевич

доктор химических наук, профессор Гордецов Александр Сергеевич

доктор медицинских наук Зимин Юрий Викторович

доктор биологических наук Бояринова Лариса Валентиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Современная физиология находится в постоянном поиске новых методов исследования, которые бы раскрывали физиолого-биохимическую сущность протекающих в организме процессов. Одним из таких методов может быть инфракрасная (ИК) спектроскопия. ИК-спектроскопия является одним из фундаментальных методов исследования органических веществ и широко используется в химии, биологии и медицине. Применение данного метода для изучения такого биологического объекта, как кровь, началось с середины прошлого века, и в настоящее время начинает применяться в клинической лабораторной диагностике (Гордецов, 2010), т.к. позволяет определить наличие патологического процесса на стадии, когда он не устанавливается традиционной диагностикой, а также используется при анализе лекарственных средств (Елизарова, 2009). Метод отличается высокой специфичностью, т.к. позволяет по характеристикам спектра поглощения инфракрасного излучения химическими связями определить в крови практически любые вещества качественно и количественно. Аналитически информативными показателями в данном методе являются полосы поглощения ИК-спектра, соответствующие связям фосфор-кислород (P-О) фосфорсодержащих соединений (Гордецов, 2002). Однако вопрос идентификации фосфорсодержащих соединений плазмы крови методом ИК-спектроскопии остается открытым. С наибольшей вероятностью следует считать, что в ИК-спектре плазмы крови определяются полосы поглощения Р-0 связей: неорганических фосфатов (Верченко, 1991), фосфолипидов

(фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол) (Кейтс, 1975), фосфорилированных белков (Верболович и др., 1980), фосфора кислоторастворимого эритроцитарного (нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных) (Afanasyeva et al., 1998). Увеличение их концентрации в крови отмечается при определенных патологиях, например, почечной недостаточности, передозировке витамина Д, недостаточности паращитовидных желёз, при миеломных болезнях, нарушениях липидного обмена (липидный фосфор) и т.д. Количество кислоторастворимого фосфора увеличивается при всех заболеваниях, сопровождающихся кислородной недостаточностью. Напротив, снижение концентрации происходит при дефиците витамина Д, нарушениях всасывания в кишечнике, рахите, гиперфункции паращитовидных желёз и т.д. (Лифшиц, Сидельнюсова, 2000). Таким образом, на содержание фосфорсодержащих веществ в крови влияет как физиологическое состояние организма, так и экзогенное введение лекарственных препаратов, что дает возможность исследовать изменения параметров ИК-спектров плазмы крови пациентов, в том числе и онкологических, на фоне лечения современными видами лекарств, биологически активных добавок (БАД). Метод ИК-спектроскопии плазмы крови также позволяет исследовать влияние озонотерапии, электрорефлексотерапии, т.к. данные виды воздействий влияют на концентрации фосфорсодержащих

соединений в плазме крови, что приводит к изменению, а часто и к нарушению энергетического обмена организма, и не всегда вызывает положительный терапевтический эффект. Поэтому исследование особенностей ИК-спектров крови организмов-опухоленосителей при проведении современных терапевтических мероприятий для выявления наиболее эффективных и безопасных методов диагностики и лечения онкологических заболеваний остается актуальным и позволяет сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования:

Экспериментальное обоснование применения в физиологии метода ИК-спектроскопии для исследования динамики изменений соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных в плазме крови крыс с перевивными опухолями на фоне озоно-, электрорефлексо- и фармакотерапии.

Задачи исследования:

1. Идентифицировать фосфорсодержащие соединения плазмы крови экспериментальных животных по ИК-спектрам.

2. Изучить особенности ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей и их взаимосвязь с содержанием фосфорсодержащих соединений.

3. Исследовать динамику изменений параметров ИК-спектров плазмы крови животных с экспериментальными опухолями на фоне введения БАД на основе янтарной кислоты (ЯК) и её комплексов с аскорбиновой кислотой (АК) и олигосахаридом хитозана (ОХ), комплексного введения озона и химиопрепаратов (доксорубицина (ДР), 5-фторурацила (5-ФУ)), а также под влиянием самоконтролируемой элекгронейроадаптивной регуляции (СКЭНАР), динамической электронейростимуляции (ДЭНС).

Научная новизна исследования

Впервые исследованы и проанализированы изменения параметров ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей при действии на организм ДЭНС, СКЭНАР, Ж и её комплексов, комплексного применения озона и некоторых противоопухолевых препаратов (ДР, 5-ФУ). Установлено, что фосфорсодержащими соединениями, определяющимися в инфракрасном спектре плазмы крови, являются нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфаты.

Показано, что применение БАД на основе ЯК и её производных не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов в плазме крови животных-опухоленосителей. Выявлено, что совместное применение ОФР и 5-ФУ; ОФР и ДР приводит к нормализации показателей ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей.

Применение СКЭНАР-, ДЭНС-воздействий не вызывает достоверного изменения соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфатов в плазме крови экспериментальных животных.

Практическая значимость работы

Результаты работы являются обоснованием для экспериментальных и клинических исследований возможности комбинированного применения ОФР и цитотоксических препаратов как способа повышения противоопухолевого эффекта химиотерапевтических воздействий.

Применение Ж и её производных, СКЭНАР-, ДЭНС-терапии при неоплазии не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфосфатов в плазме крови экспериментальных животных, в связи с чем, данные виды воздействий не могут быть рекомендованы для использования.

Разработан способ диагностики рецидива онкологических заболеваний головного мозга // Приоритет по заявке на изобретение № 2011139627 от 30.09. 2011.

Полученные результаты и выводы могут использоваться в учебном процессе на кафедре физиологии и биохимии человека и животных ННГУ и кафедре общей химии НижГМА для ознакомления с неинвазивным способом диагностики различных заболеваний, в том числе и онкологических.

Положения, выносимые на защиту

1. ИК-спектры плазмы крови экспериментальных животных подтверждают физиологические изменения в организме животного-опухоленосителя по сравнению со здоровым, различаются по своим спектральным характеристикам и соответствуют разному содержанию фосфорсодержащих соединений (нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных).

2. Введение животным с лимфосаркомой (ЛФС) Плисса ЯК и её производных не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно) фосфатов в плазме крови экспериментальных животных.

3. Комбинированное введение озонированного физиологического раствора (ОФР) с ДР животным с раком молочной железы (РМК-1), а также комплексное введение ОФР и 5-ФУ животным с гепатомой Зайделя (Г-3), нормализует параметры ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных.

4. Применение СКЭНАР-, ДЭНС-воздействий не вызывает изменения соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфатов в плазме крови животных с ЛФС Плисса.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007), международной конференции «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), межвузовской научно-практической конференции студентов и аспирантов с международным

участием «Трибуна молодого ученого 2011. Актуальные проблемы науки глазами молодежи» (Мурманск, 2011), на расширенном заседании кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ и кафедры общей химии НижГМА Росздрава (2011). По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Благодарности

Автор выражает сердечную, искреннюю благодарность своим научным руководителям, В.Н. Крылову и А.С. Гордецову, за мудрые советы, терпение и понимание. Автор работы признателен д.б.н. К.Н. Конторщиковой, д.м.н. Ю.В. Зимину, д.б.н. Т.Г. Щербатюк, к.б.н. О.М. Московцевой, к.х.н. С.В. Зиминой, к.м.н. И.А. Медянику, асп. А.И. Сазанову (НижГМА), О.Н. Груздевой (региональный ДЭНАС - центр) за оказанную консультационную помощь и сотрудничество при получении материала для настоящего исследования. Автор высказывает особую признательность своей семье за помощь и поддержку.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический список (233 источника). Диссертационная работа содержит 9 рисунков, 12 таблиц и приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 215 белых нелинейных крысах (самцы, самки) массой 250±20 г. Животных содержали в полипропиленовых клетках размером 32x22x9,5 см, покрытых железной проволочной сеткой с расстоянием между прутьями 0,75 см. Животные получали корм и водопроводную воду без ограничений. Эксперимент проводился в соответствии с требованиями нормативных правовых актов, регламентирующих выполнение исследований по безопасности и эффективности фармакологических веществ в РФ (Приказ М3 РФ «Об утверждении правил лабораторной практики» № 267 от 19.06.2003 г.) и международных правил правовых и этических норм использования животных.

Моделирование онкогенеза проводили посредством трансплантации крысам опухоли. В первой и третьей серии эксперимента использована экспериментальная модель опухолевого роста - лимфосаркома (ЛФС) Плисса (Плисс, 1961), приобретенного в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (г. Москва), изучение которого продолжается более полувека и не закончено на сегодняшний день (Васильев и др., 2009).

Штамм ЛФС Плисса пассировался на крысах в возрасте 3 месяцев. Опухоль брали для инокуляции крысе - реципиенту на 14 день развития. Взвесь опухолевых клеток в физиологическом растворе (1:3) объемом 0,5 мл вводили подкожно в область правого бедра.

е

Модель неоплазии во второй серии исследования создавали путем перевивки опухолевого штамма рака молочной железы крысы (РМК-1) и гепатомы Зайделя (Г-3), приобретенных в Онкологическом научном центре им.

Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва), обладающих высокой чувствительностью к используемым на данном этапе исследования химиопрепаратам (Ларионов, 1962).

Кусочки опухолевой ткани РМК-1 (диаметр 1мм) с физиологическим раствором (0,5мл) вводили подкожно в область правой подмышечной впадины крысе реципиенту (крысам-самкам). Животных включали в эксперимент на 45-е сутки после перевивки опухоли, объем которой к этому времени достигал 6—8 см3.

Штамм Г-3 пассировался на крысах в возрасте 3-х месяцев. Г-3 брали на 5 сутки после трансплантации штамма. Внутрибрюшинную асцитную жидкость Г-3 объемом 0,3 мл вводили крысам-самцам подкожно в область правого бедра.

Исследовали влияние следующих видов воздействий:

1.В первой серии эксперимента:

- янтарной кислоты (ЯК);

Учитывая плохую способность к проникновению через мембраны ЯК, а также возможность раздражения слизистой желудочно-кишечного тракта, использовали её комплекс с олигосахаридом хитозана (ОХ), способного легко абсорбироваться в кишечнике и быстро попадать в системный кровоток.

- олигосахарида хитозана сукпината (ОХС);

- олигосахарида хитозана сукыинат-аскорбата (ОХСА) (ТУ 9289-00457184729-03), в котором олигосахарид хитозана (70%), сукцината (15%) и аскорбата (15%).

Исследуемые вещества животным, крысам — самцам, вводили с помощью зонда в желудок в виде раствора в дозе 100 мг/кг веса ежедневно (7 дней). Доза, способ и курс введения веществ были установлены согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000) и работами В.Н. Анисимова, М.Н. Кондрашовой (1979), С.В. Цвиренко и др. (1987), Н.И. Федотчева и др. (1997). Влияние ЯК и её производных на организм экспериментальных животных в условиях неоплазии изучали во время общего периода (с 6-го дня) начальной фазы роста ЛФС Плисса.

2.Во второй серии исследования:

- доксорубицина (1,4-гидрооксидауномицин);

- 5-Фторурапила (2,4-диокси-5-фторпиримидин);

- озонированного Физиологического раствора (ОФР)

В эксперименте использованы: 5-ФУ производства ООО «ЛЭНС-ФАРМ» ЗАО «Верофарм» (г. Москва) в ампулах по 5 мл 5% раствора в дозе 500 мг/л, внутримышечно, общим курсом 10 дней (5 воздействий через день); ДР производства ООО «ЛЭНС-ФАРМ» ЗАО «Верофарм» (г. Москва) в ампулах

по 10 мг лиофилизированного порошка в дозе 0,04 мг на особь, внутрибрюшинно, общим курсом 10 дней (5 воздействий через день).

Доза, способ и курс введения веществ были установлены согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000) и работами Н.И. Переводчиковой (2005).

ОФР получали барботированием 0,9% ЫаС1 озоно-кислородной смесью с помощью серийного отечественного генератора озона фирмы «Квазар» (Н.Новгород). Концентрацию озона в физиологическом растворе определяли с помощью серийного отечественного анализатора концентраций «ИКОЖ-5» (Киров). Воздействия ОФР осуществлялось сразу после барботирования. ОФР вводили внутрибрюшинно, в объеме 0,02 мл с дозой озона 20 мкг, продолжительностью общего курса 11 дней (6 воздействий).

З.В третьей серии работы:

- СКЭНАР-воздействия;

- ДЭНС-воздействия.

Воздействие производилось системно, для чего использовалась специально сконструированная клетка, пол которой состоял из металлических электродов, к которым подключался через внешний выход прибор СКЭНАР (модель «СКЭНАР 97.4+», ОКБ «Ритм», г. Таганрог). Влияние ДЭНС, СКЭНАР на организм экспериментальных животных-опухоленосителей изучали во время общего периода (с 8-го дня) начальной фазы роста ЛФС Плисса.

Животные с ЛФС Плисса, подвергались 15-минутному' СКЭНАР -воздействию, с частотой 80 Гц, в течение 5-ти дней, с 8-го дня после трансплантации штамма;

Крысам опытной группы ДЭНС-воздействие осуществляли выносным электродом аппарата «ДЭНАС» (ООО «Региональный центр адаптивно - рецепторной терапии», г. Екатеринбург), используя прямую контактную проекцию на место трансплантации штамма опухоли. Животные с ЛФС Плисса, подвергались 15-минутному ДЭНС-воздействию, с частотой 77 Гц, в течение 5-ти дней, с 8-го дня после трансплантации штамма.

Способ и курс проведения СКЭНАР, ДЭНС были установлены согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2004).

Основные серии исследования и количество экспериментальных животных представлены в табл. 1.

На следующий день после окончания манипуляций животным проводили эвтаназию под эфирным наркозом. Исследованию подвергалась плазма крови, полученная путём центрифугирования цельной гепаринизированной крови в течение 15 минут при 3000 оборотов в минуту. Исследование проводили с помощью метода ИК-спектроскопии плазмы крови (Гордецов и др., 1998). Для исследования биологических тканей использовали ЙК-спектроскопию биологических тканей (Кукош и др.,

1994). Для исследования плазму крови высушивали в течение двух дней при комнатной температуре. Для обезвоживания тканей применяли диметилформамид (ДМФА). Кусочек каждой ткани в количестве 0,05-0,5 г помещали в пробирку с 2 мл ДМФА, нагревали на водяной бане при 100-140°С в течение 1-2 часов, удаляли растворитель, промывали образцы тканей диэтиловым эфиром, высушивали на воздухе при комнатной температуре. Образец готовили в виде суспензии в вазелиновом масле. Регистрацию спектров поглощения производили на спектрофотометре «Carl Zeiss Jena SPECORD IR-75» (Германия), в диапазоне волновых чисел 1170-1025 см'1.

Таблица 1

Группы экспериментальных животных

Вид воздействия Количество животных в опытных группах

1.БАД

ЛФС Плисса + Ж, ОХС, Животные с ЛФС Плисса, 50 крыс,

ОХСА самцов

Без ЛФС Плисса,б/в- 1)Интактная (п=10);

б/в- 2)Контрольная (п=10);

Ж- 3)Опытная-1 (п=10);

ОХС- 4)Опытная-2 (п=10);

ОХСА- 5)Опытная-3 (п=10).

2.Химиопрепараты и озон

А) РМК-1 + ДР, ОФР Животные с РМК-1, 75 крыс, самок

Без РМК-1, б/в- 1) Интактная (п=15);

б/в- 2) Контрольная (п=15);

др- 3)Опытная-1 (п=15);

ОФР- 4)Опытная-2 (п=15);

ДР+ОФР- 5)Опытная-3 (п=15).

Б) Г-3 + 5-ФУ, ОФР Животные с Г-3, 50 крыс, самцов

Без Г-3, б/в- 1) Интактная (п=10);

б/в- 2) Контрольная (п=10);

5-ФУ- 3)Опытная-1 (п=10);

ОФР- 4) Опытная-2 (п=10);

5-ФУ+ОФР- 5)Опытная-3 (п=10).

3.Электрорефлексотерапия

ЛФС Животные с ЛФС Плисса, 40 крыс,

Плисса+СКЭНАР,ДЭНС самцов

Без ЛФС Плисса, б/в- 1) Интактная (п=10);

б/в- 2) Контрольная (п=10);

СКЭНАР- 3) Опытная-1 (п=10);

ДЭНС- 4)Опытная-2 (п=10).

За ИК-спектроскопические параметры принимали частные, полученные в результате деления высот пиков полос поглощения друг на друга -относительные величины, с целью исключения зависимости от концентрации биоматериала в образце (Кукош и др., 1994; Гордецов и др., 1998; Игнатьев и др., 2005) (с учетом информативности для каждой серии эксперимента): в первой серии эксперимента: X = 1165/1070, Y = 1165/1150, Z = 1165/1125; во второй серии исследования: X = 1125/1100, Y = 1165/1080, Z = 1080/1070; в третьей серии исследования: X = 1165/1070, Y = 1165/1150, Z = 1125/1025. Для оценки параметров ИК-спектра были выбраны условные единицы (у.е.).

Методом ИК-спектроскопии проводили идентификацию фосфорсодержащих соединений. Исследуемые образцы, а именно: калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4) (Россия, г. Старая Купавна, «Виктория»), фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ) (Россия, г. Екатеринбург, «ОРМЕТ»), миоглобин (Украина, г. Иваново-Франковск, «Monobind»), АТФ (двунатриевый Triphosphat аденозина) (Китай, г. Шанхай, «Shaanxi Sciphar Hi-Tech Industry Co.»), АДФ (аденозин 5-дифосфат двунатриевая соль) (Китай, г. Шанхай, «A&Z Food Additives Со.»), АМФ (5-адениловая кислота двунатриевая соль) (Китай, г. Шанхай, «Seebio Biotech Inc.») - готовили в виде суспензии в вазелиновом масле. Регистрацию спектров поглощения производили на спектрофотометре «Carl Zeiss Jena SPECORD IR-75» (Германия), в диапазоне волновых чисел 1170-1025 см"1.

Полученные данные были обработаны на ЮМ PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica-6.0 (Windows ХР) и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики. Результаты представляли в виде М ± т, где М - среднее арифметическое, m - стандартное отклонение. Достоверность различий средних значений определяли по t - критерию Стьюдента, используя поправку Бонферонни. Парные внутригрупповые и межгрупповые сравнения средних определяли также по критериям Вилкоксона и Манна-Уитни. Выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Идентификация фосфорсодержащих соединений плазмы крови экспериментальных животных методом ИК-спектроскопии

Полосы поглощения, выбранные с учетом их информативности в данном исследовании, а именно: 1165; 1150; 1125; 1100; 1080; 1070; 1025 см'1 -соответствуют связям фосфор-кислород (P-О) фосфорсодержащих соединений (Гордецов, 2002), в роли которых, согласно литературным данным (Лифшиц, Сидельникова, 2000) выступают нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорные кислоты и их производные. На данном этапе исследования были изучены эталонные образцы нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов, получены их ИК-спектры. Было установлено, что полоса поглощения 1165 см'1 - является характеристической полосой ИК-спектра нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ и др.) (рисЛ.А); полоса

ю

поглощения 1150 см'1 - характеристической полосой ИК-спектра нуклеозиддифосфатов (АДФ, ГДФ и др.) (рисЛ.Б); 1070 см'1 - частью ИК-спектра нуклеозидмонофосфатов (АМФ, ГМФ и др.) (рис.1 .В).

Рис.1. Реконструкция ИК-спектров: А) АТФ, Б) АДФ, В) АМФ

В рабочем атласе А. Могтап (1978) показано, что полосе поглощения при 1125 см'1 соответствует глюкоза (рис. 2).

Полосы поглощения 1100; 1025 см'1 не были идентифицированы, так как на данном этапе исследования отнести их к каким-либо определенным фосфорсодержащим соединениям не представлялось возможным.

Рис.2. Реконструкция ИК-спектра глюкозы

Были изучены также образцы следующих соединений: неорганического фосфата (рис.З.А), фосфолипидов (рис. З.Б,В), фосфорилированного белка (рис.З.Г).

Рис.З. Реконструкция ИК-спектров: А) КН2Р04, Б) ФЭ, В) ФХ, Г) миоглобина

Было установлено, что ИК-спектры данных соединений отличаются от ИК-спектров нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов и имеют специфические характеристические полосы поглощения.

Таким образом, с наибольшей вероятностью следует считать, что в ИК-спектре плазмы крови определяются полосы поглощения Р-0 связей нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот.

2. Особенности ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленоснтелей

На данном этапе исследования проводили сравнение ИК-спектров плазмы крови здоровых животных и животных-опухоленосителей. Регистрировали ИК-спектры плазмы крови экспериментальных животных в диапазоне волновых чисел 1170-1025 см'1. ИК-спектры плазмы крови здоровых животных и животных-опухоленосителей выглядят следующим образом (рис.4):

Рис.4. Реконструкция ИК-спектров плазмы крови: А) здорового животного, Б) животного-опухоленосителя

В ходе работы вычислили значения исследуемых параметров ИК-спектров плазмы крови здоровых животных и животных с ЛФС Плисса (табл.2):

Таблица 2

Значения параметров X, У, Z ИК-спектров плазмы крови ___________экспериментальных животных ________________________

Отношение полос поглощения, у.е. X (1165/1070), у.е. У (1165/1150), у.е. г (1165/1125), у.е.

интактная 0,68 ± 0,04 0,55 ± 0,01 3,80 ± 0,03

конторольная 0,39 ±0,01* 0,65 ± 0,05* 0,96 ±0,01*

* - различия статистически значимы по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05).

Таким образом, методом ИК-спектроскопии плазмы крови установили, что плазма крови здоровых животных и животных-опухоленосителей характеризуется

аз

различным соотношением нуклеозидтри- (да-, моно-) фосфатов. Было отмечено, что при опухоленосительстве (на 14-й день после трансплантации штамма) параметры X, Ъ по сравнению с интактными животными ниже на 42 % и 75 %, соответственно (р < 0,05) (табл.2), т.е. частное от деления высоты пика поглощения 1165 см'1 на высоты пиков поглощения 1070,1125 см'1 уменьшается, а значит, в плазме крови животных контрольной группы увеличилось содержание монофосфатов, глюкозы и снизилось содержание нуклеозидтрифосфатов. Параметр У увеличился на 18% (р < 0,05), т.е. снизилось содержание нуклеозиддифосфатов. Причем параметр X (1165/1070) для животных с ЛФС Плисса равен 0,39 ± 0,01 у.е., что по данным патента № 2117289 РФ (Гордецов и др., 1998) соответствует наличию онкологического заболевания. Согласно данному патенту в норме величина отношения 1165/1070 для человека превышает значение 0,43, у.е., что было установлено и в настоящей работе: параметр X (1165/1070) для интакгных животных равен 0,68 ± 0,04, у.е. Таким образом, кровь человека и животных в норме и при неоплазии обладает сходным соотношением нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов,

3. Особенности ИК-спектров плазмы крови животных с ЛФС Плисса на фоне введения ЯК и её производных

В ходе исследования были изучены особенности ИК-спектров плазмы крови крыс с ЛФС Плисса на фоне введения Ж, ОХС, ОХСА в дозе 100 мг/кг (7 дней). ■

Было установлено, что введение исследуемых веществ изменяет параметры ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей, по сравнению с контрольной группой, следующим образом (табл.З):

Таблица 3

Значения параметров X, У, Ъ ИК-спектров плазмы крови крыс с лимфосаркомой Плисса на фоне введения ЯК, ОХС, ОХСА

Отношение полос поглощения, у.е. X (1165/1070), у. е. У (1165/1150), у. е. Ъ (1165/1125), у. е.

контрольная 0,39 ±0,01* 0,65 ± 0,05* 0,96 ±0,01*

Ж 0,27 ±0,03** 0,47 ±0,04** 0,63 ± 0,04**

ОХС 0,40 ±0,02 0,54 ±0,02** 0,82 ± 0,05**

ОХСА 0,37 ±0,01 0,50 ±0,01** 0,57 ±0,01**

* - различия статистически значимы по сравнению с группой контрольных животных (р < 0,05).

Отмечено достоверное снижение параметров X, У, Ъ по отношению к контролю (на 14-й день после трансплантации штамма), т.е. частное от деления

высоты пика поглощения 1165 см'1 на высота пиков поглощения 1070, 1150, 1125 см'1 уменьшается.

Таким образом, при опухоленосительстве введение исследуемых препаратов способствует накоплению в плазме крови нуклеозидцифосфатов, монофосфатов, глюкозы; снижению нуклеозидтрифосфатов.

4. Особенности ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных на фоне комплексного введения ОФР н химиопрепаратов в условиях неоплазии

4.1. Особенности ИК-спектров плазмы крови животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР

В ходе исследования были рассчитаны параметры ИК-спектров плазмы крови крыс с РМК-1 на фоне введения ДР, ОФР, комплекса ДР+ОФР (табл.4).

Таблица 4

Значения параметров X, У, Z ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных на фоне введения ДР, ОФР, ОФР+ДР

Отношение полос поглощения, у.е. X (1125/1100), у.е. У (1165/1080), у. е. Ъ (1080/1070), у. е.

интактная 0,83 ± 0,04 1,42 ±0,11 0,50 ± 0,03

контрольная 6,47 ±0,13* 2,42 ±0,12* 0,67 ±0,02*

ДР 0,67 ±0,01** 1,09 ±0,02** 0,48 ±0,01**

ОФР 1,85 ±0,02** 1,00 ±0,01** 0,50 ±0,01**

ДР+ОФР 1,56 ±0,03** 1,03 ±0,01** 0,85 ± 0,03**

* - различия статистически значимы по сравнению с группой интакгных животных (р < 0,05).

** - различия статистически значимы по сравнению с группой контрольных животных (р < 0,05).

Установлено, что у животных с РМК-1 (на 56-й день после трансплантации штамма) увеличились параметры Х,У^ по сравнению с нормой, соответственно на 680%, 70% и 34% (р < 0,05), т.е. в плазме крови животных-опухоленосителей увеличилось содержание глюкозы, нуклеозидтрифосфатов и снизилось содержание монофосфатов.

Из результатов исследований видно, что исследуемые вещества изменяют значения параметров ИК-спектров плазмы крови у животных-опухоленосителей. Отмечено, что параметры Х,У в опытных группах по отношению к контролю ниже (р < 0,05), т.е. частое от деления высоты пика поглощения 1125, 1165 см'1 соответственно на высоты пиков поглощения 1100,1080 см'1 уменьшается, а значит, снижается интенсивность полос поглощения при 1125, 1165 см'1. В опытных группах наблюдается снижение концентрации

15

нуклеозидтрифосфатов, т.е. происходит нормализация их уровня в плазме крови животных-опухоленосителей.

В данном исследовании установлено изменение параметра Ъ (р < 0,05): снижение данного параметра при введении ДР и озона и увеличение при введении комплекса озона и ДР. Таким образом, моновведение озона и ДР способствует накоплению монофосфатов в плазме крови животных -опухоленосителей, а введение их совместного комплекса способствует снижению содержания монофосфатов в плазме крови животных с РМК-1. Совместное применение озона и ДР способствует резкому снижению концентрации монофосфатов.

Введение озона, ДР и их совместного комплекса способствует уменьшению концентрации в плазме крови глюкозы по сравнению с контролем, т.е. нормализации её концентрации. Таким образом, применение исследуемых веществ приводит к ослаблению системного действия злокачественного новообразования на организм хозяина, сопровождающееся нормализацией уровня глюкозы; что возможно в результате индуцирования пероксидами каскада реакций, которые приводят в действие пентозо-фосфатный шунт, способствующий восстановлению процессов гликолиза и нормализации метаболизма глюкозы.

На данном этапе работы, кроме плазмы, были исследованы также значения параметров ИК-спектров печени, почек, легких, мозга, опухолей экспериментальных групп животных (на 56-й день после трансплантации штамма) на фоне введения ДР, ОФР, комплекса ДР+ОФР. Было установлено:

- в печени животных-опухоленосителей отмечено увеличение содержания глюкозы, монофосфатов, нуклеозидтрифосфатов по сравнению с интактными животными. По сравнению с плазмой крови - в печени животных-опухоленосителей наблюдается высокий уровень монофосфатов.

Введение исследуемых веществ и плазме крови и печени животных-опухоленосителей способствует увеличению глюкозы, нуклеозидтрифосфатов. В печени происходит снижение уровня монофосфатов при введении ДР, ОФР и их комплекса. Однако, в плазме крови снижение концентрации монофосфатов вызывает лишь совместное введение ДР+ОФР.

- в почках животных - опухоленосителей уровень глюкозы выше нормы

(р < 0,05), при одновременном снижении уровня нуклеозидтрифосфатов и повышении монофосфатов. В отличие от плазмы крови, в почках отмечено снижение содержания нуклеозидтрифосфатов.

По сравнению с плазмой крови, в почках введение ДР способствует увеличению содержания глюкозы и нуклеозидтрифосфатов, а введение ОФР, также как и комплекса ДР+ОФР вызывает снижение уровня монофосфатов.

- в мозге животных с неоплазией концентрация глюкозы и нуклеозидтрифосфатов - выше, чем их концентрация у здоровых организмов, при одновременном снижении уровня АМФ, ГМФ и др. Такая же тенденция наблюдается и в плазме крови опухоленосителей.

Введение исследуемых веществ влияет на соотношение фосфорсодержащих веществ в ткани мозга следующим образом: ДР и ДР+ОФР способствуют снижению глюкозы, нуклиозидтрифосфатов в ткани мозга; ОФР повышает содержание глюкозы и монофосфатов; ДР способствует повышению содержания монофосфатов в мозге экспериментальных животных; ДР + ОФР максимально приближает параметры X, У к значениям нормы; как и в плазме крови - способствует снижению уровня АМФ, ГМФ и др. в клетках мозга животных с неоплазией.

- в легких животных-опухоленосителей концентрация глюкозы и нуклеозидтрифосфатов выше, чем их концентрация у здоровых животных, при одновременном увеличении уровня АМФ, ГМФ. По сравнению с плазмой крови, наблюдается повышение уровня монофосфатов в легких животных.

В плазме крови снижению монофосфатов способствует комплекс ДР+ОФР; в легких также и ДР, и ОФР.

- в опухолевой ткани вводимые препарата: снижают уровень глюкозы в опухолевой ткани; ОФР, ДР + ОФР снижают уровень нуклеозидтрифосфатов; ДР приводит к увеличению АМФ, ГМФ в опухоли, тем самым нарушая энергетических обмен опухолевой ткани, разрушая её структуру.

Комплекс ДР+ОФР не вызывает изменения содержания монофосфатов в ткани опухоли экспериментальных животных.

Наличие нарушения нормальных биоэнергетических процессов в раковой клетке влечет за собой глубокие повреждения во всех звеньях обмена веществ. Возникающие продукты метаболизма раковых клеток, являющиеся для организма патологическими, существенным образом влияют на состояние обмена веществ органов и тканей животных — носителей опухоли, непосредственно не поврежденных раковыми клетками, что и было установлено в данном исследовании.

4.2. Влияние ОФР и 5-ФУ на характеристики ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных на фоне роста Г-3

В ходе исследования были изучены параметры ИК-спектров плазмы крови, крыс с Г-3 на фоне введения 5-ФУ, ОФР, комплекса 5-ФУ+ОФР (табл. 5).

Установлено, что у животных с Г-3 (на 14-й день после трансплантации штамма) по сравнению со здоровыми животными снизились значения параметров X, У, Ъ, соответственно на 24%, 7% и 13% (р < 0,05), т.е. в плазме крови животных -опухоленосителей снизилось содержание глюкозы, нуклеозидтрифосфатов и увеличилось содержание монофосфатов.

Из табл. 5 видно, что исследуемые вещества изменяют значения параметров ИК-спектров плазмы крови у животных-опухоленосителей. В настоящей работе отмечено, что параметры Х,У в опытных группах по отношению к контролю ниже (р < 0,05), т.е. частное от деления высоты пика поглощения 1125,1165 см'1 соответственно на высоты пиков поглощения 1100,1080 см'1 уменьшается, а значит, снижается интенсивность полос поглощения при

1125, 1165 см'1. Снижение параметра У (р < 0,05) происходит при введении озона. 5-ФУ и комплекс озона и 5-ФУ не изменяют значение данного параметра (р < 0,05).

Таблица 5

Значения параметров X, У, Ъ ИК-спекгров плазмы крови экспериментальных животных на фоне введения 5-ФУ, ОФР, 5-ФУ+ОФР

Отношение полос поглощения, у.е. X (1125/1100), у.е. У (1165/1080), у.е. Ъ (1080/1070), у.е.

интактная 0,54 ± 0,02 0,41 ±0,01 1,08 ±0,02

контрольная 0,41 ± 0,02* 0,38 ±0,01* 0,94 ± 0,02*

5-ФУ 0,51 ±0,02** 0,38 ± 0,01 1,20 ±0,02**

ОФР 0,38 ± 0,01 0,30 ±0,03** 0,88 ±0,03**

5-ФУ+ОФР 0,44 ± 0,01 0,37 ±0,01 1,50 ±0,05**

* - различия статистически значимы по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);

** - различия статистически значимы по сравнению с группой контрольных животных (р < 0,05).

В данном исследовании установлено изменение параметра Z (р < 0,05): снижение данного параметра при введении озона и увеличение при введении 5-ФУ и комплекса озона и 5-ФУ. Таким образом, введение озона способствует накоплению монофосфатов в плазме крови животных -опухоленосителей. Совместное применение озона и 5-ФУ способствует резкому снижению концентрации монофосфатов, а значит, способствует стабилизации клеточных мембран, снижает их разрушение при неоплазии.

Введение 5-ФУ способствует повышению концентрации в плазме крови глюкозы по сравнению с контролем, т.е. нормализации её концентрации. Таким образом, применение 5-ФУ приводит к ослаблению системного действия злокачественного новообразования на организм хозяина, сопровождающееся нормализацией уровня глюкозы. .

На данном этапе работы были исследованы и рассчитаны также значения параметров ИК-спектров опухолей экспериментальных групп животных (на 14-й день после трансплантации штамма) на фоне введения 5-ФУ, ОФР, комплекса 5-ФУ+ОФР. Было установлено следующее:

- введение исследуемых препаратов снижает параметр Ъ у животных опытных групп;

- 5-ФУ способствует более сильному росту уровня монофосфатов в опухолевой ткани, тем самым, нарушая энергетический обмен опухолевой ткани, разрушая её структуру;

- комплекс препаратов снижает концентрацию глюкозы в опухолевой ткани, повышает уровень монофосфатов и не влияет на уровень нуклеозидгрифосфатов в опухолевой ткани опухоленосителей.

В отличие от плазмы крови, в опухолевой ткани введение исследуемых препаратов вызывает увеличение уровня монофосфатов.

5, Изменение характеристик ИК-спектров плазмы крови животных -опухоленосителей под влиянием СКЭНАР-, ДЭНС-терапии

На данном этапе исследования были изучены параметры ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных под влиянием короткоимпульсных электрических сигналов (СКЭНАР, ДЭНС) (табл.6).

Таблица 6

Значения параметров X, У, Ъ ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных под влиянием короткоимпульсных электрических сигналов

Отношение полос поглощения, у.е. X (1165/1070), у.е. У (1165/1150), у.е. Ъ (1125/1025), у.е.

интактная 0,47 ±0,02 0,62 ±0,01 0,32 ± 0,02

контрольная 0,33 ±0,01* 0,42 ±0,02* 0,39 ±0,01*

СКЭНАР 0,32 ± 0,01 0,22 ± 0,02** 0,45 ±0,01**

ДЭНС 0,28 ± 0,04 0,30 ±0,01** 0,32 ±0,01**

* - различия статистически значимы по сравнению с группой шггакгных животных (р < 0,05);

** - различия статистически значимы по сравнению с группой контрольных животных (р<0,05).

Установлено, что при опухоленосительстве (на 13-й день после трансплантации штамма) значения параметров X, У по отношению к соответствующим параметрам здоровых животных ниже на 30%, 32% (р < 0,05), т.е. частное от деления высоты пика поглощения 1165 см'1 на высоты пиков поглощения 1070, 1150 см'1 уменьшается. Таким образом, у животных с ЛФС Плисса увеличилось содержание в плазме крови монофосфатов, дифосфатов и снизилось содержание нуклеозидтрифосфоных кислот.

Установлено, что при опухоленосительстве параметр 2 по сравнению с интактными животными выше на 18% (р < 0,05). Таким образом, при опухоленосительстве увеличивается содержание глюкозы в плазме.

Влияние короткоимпульсных электрических сигналов СКЭНАР-воздействия способствует снижению значения параметра У и увеличению параметра Ъ, при этом параметр X не меняется, это значит, что под влиянием электрического тока низкой частоты в плазме животных с неоплазией не

происходит повышения содержания монофосфатов, при одновременном росте количества нуклеозиддифосфатов и глюкозы. Известно, что уменьшение уровня нуклеозидтрифосфатов в клетках обусловлено либо снижением их синтеза, либо быстрым его распадом. Данное исследование показывает, что количество монофосфатов не растет, а значит уменьшение концентрации АТФ, ГТФ и др. обусловлено замедлением их синтеза в организме. СКЭНАР-воздействие способствует повышению уровня глюкозы в плазме опухоленосителя.

ДЭНС-воздействие способствует снижению параметра У, а значит, в плазме незначительно увеличивается содержание нуклеозиддифосфатов. Значение параметра Ъ в опытной труппе равно значению данного параметра у интактных животных, т.е. ДЭНС-воздействие способствует нормализации уровня глюкозы в плазме крови у животных с неоплазией. Не установлено изменения параметра X, а значит, уровень монофосфатов в плазме экспериментальных животных не изменился.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установили, что в инфракрасных спектрах плазмы крови определяются полосы поглощения фосфор-кислородных связей нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных, соотношение которых в плазме крови экспериментальных животных варьирует при норме и неоплазии. Установлено, что плазма крови животных-опухоленосителей характеризуются различным соотношением нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных на ранних (13е, 14-е сутки) и более поздних (56-е сутки) сроках роста опухоли: на ранних срока роста отмечено увеличение в плазме крови содержания нуклеозидмонофосфатов и снижение нуклеозидтрифосфатов, предположительно, за счет снижения синтеза нуклеозидтрифосфатов и высокой скоростью их распада, на более поздних сроках наоборот, повышается содержание нуклеозидтрифосфатов и снижается содержание монофосфатов, что объясняется запуском адаптационно-приспособительных реакций в организме-опухоленосителя, в результате чего снижается скорость потребления нуклеозидтрифосфатов. В плазме крови животных с ЛФС Плисса, исследованной на 13-е и 14-е сутки после перевивки, а также Г-3, исследованной на 14-е сутки после перевивки наблюдается одинаковая динамика в изменении соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфорных кислот и их производных - происходит увеличение в плазме крови содержания нуклеозидмонофосфатов и снижение нуклеозидтрифосфатов.

Изменение соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных в плазме крови опухоленосителей происходит при проведении экспериментально-терапевтических воздействий: озоно-, электрорефлексо- и фармакотерапии. Метод ИК-спектроскопии позволяет регистрировать данные изменения и оценивать эффективность проводимых мероприятий по изменениям параметров ИК-спектров плазмы крови. Введение Ж и её

производных животным с ЛФС Плисса способствует снижению содержания нуклеозидтрифосфатов и повышению уровня монофосфатов в плазме крови опухоленосителей. Таким образом, данный вид воздействия является не эффективным и не безопасным. Комбинированное введение химиопрепаратов и озона на ранних и более поздних сроках роста опухоли вызывает нормализацию основных метаболических показателей крови экспериментальных животных. Проведение СКЭНАР-, ДЭНС-терапии животным с ЛФС Плисса не вызывает изменения соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфорных кислот и их производных в плазме крови, что указывает на не эффективность данного способа.

ВЫВОДЫ

1. ИК-спектры плазмы крови здоровых животных и животных-опухоленосителей имеют разные спектральные характеристики, соответствующие разному содержанию фосфорсодержащих соединений (нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных).

2. Введение животным с ЛФС Плисса янтарной кислоты и её производных в дозе 100 мг/кг общим курсом 7 дней не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов в плазме крови экспериментальных животных.

3. Комбинированное введение озонированного физиологического раствора (с дозой озона 20 мкг на особь, 6 процедур через день) с доксорубицином (в дозе 0,04 мг на особь, 5 процедур через день) животным с РМК-1, а также комплексное введение озонированного физиологического раствора (с концентрацией озона 0,2 мг/л, б процедур через день) и 5-фторурацила (с концентрацией 500 мг/л, 5 процедур через день) животным с Г-3, нормализует параметры ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных.

4. Применение СКЭНАР-, ДЭНС-воздействий не вызывает изменения соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфорных кислот и их производных в плазме крови животных с ЛФС Плисса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Работы, опубликованные в научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Красникова О.В. Инфракрасные спектры плазмы крови экспериментальных животных в оценке эффективности введения сукцинатсодержащих веществ / О.В. Гордиевская (Красникова), О.М. Московцева, Т.Г. Щербатюк, А.С. Гордецов // Уральский медицинский журнал.

- 2010. -№11. -С. 75-77.

2. Красникова О.В. Изменение параметров ИК-спектров биологических тканей животных-опухоленосителей на фоне совместного введения доксорубицина и озона / О.В. Красникова, А. С. Гордецов, К.Н. Конторщикова, В.Н. Крылов, А.И. Сазанов // Современные технологии в медицине. - 2011. - № З.-С. 83-87.

3. Красникова О.В. Изменение параметров ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей на фоне введения биологически активных добавок / О.В. Красникова, А.С. Гордецов, В.Н. Крылов // Современные технологии в медицине. - 2011. - № 4. - С. 18-21.

4. Красникова О.В. Изменение параметров ИК-спектров плазмы крови животных - опухоленосителей на фоне совместного введения доксорубицина и озона / О.В. Красникова, А.С. Гордецов, К.Н. Конторщикова, В.Н. Крылов, А.И. Сазанов // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. - 2011. - № 5 (1). - С. 105-109.

2. Статьи, тезисы докладов региональных, Всероссийских и международных конференций:

1. Красникова О.В. Особенности инфракрасных спектров плазмы крови

крыс-опухоленосителей / О.В. Гордиевская (Красникова), Т.Г. Щербатюк, А.С. Гордецов // Современные решения актуальных научных проблем в медицине НижГМА / под ред. Б.Е. Шахова. - Нижний Новгород: Изд-во НГМА, 2007.-С. 180-184. -

2. Красникова О.В. Особенности инфракрасных спектров плазмы крови животных-опухоленосителей на фоне введения сукцинатсодержащих препаратов / О.В. Гордиевская (Красникова), О.М. Московцева, Т.Г. Щербатюк // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - № 1. - С. 85-86.

3. Красникова О.В. Особенности инфракрасных спектров плазмы крови животных-опухоленосителей на фоне введения янтарной кислоты и её производных / О.В, Гордиевская (Красникова) // Электронный сборник научной конференции «Ломоносов 2007» (Москва, 2007) - Москва, 2007. — Режим доступа: http: // lomonosov-msu.ru /archive/ Lomonosov_2007 / 02 / lala-g@yandex.ru. doc.pdf.

4. Красникова О.В. Особенности инфракрасных спектров плазмы крови животных-опухоленосителей на фоне введения сукцинатсодержащих препаратов / О.В. Гордиевская (Красникова), О.М. Московцева, Т.Г. Щербатюк // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007). - Москва, 2007. - С. 85-86.

5. Красникова О.В. Оценка эффективности СКЭНАР-, ДЭНС-терапии при опухоленосительстве методом ИК-спектроскопии плазмы крови / О.В. Красникова // Материалы межвузовской научно-практической конференции студентов и аспирантов с международным участием «Трибуна молодого ученого 2011: Актуальные проблемы науки глазами молодежи» (Мурманск, 2011)-Мурманск, 2011.-С. 171-176.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАД - биологически активные добавки

б/в - без воздействия

Г-3 - гепатома Зайделя

ДМФА - диметилформамид

ДР - доксорубицин

ДЭНС - динамическая электронейростимуляция

ИК - инфракрасная

ЛФС Плисса - лимфосаркома Плисса

ОФР - озонированный физиологический раствор

ОХС - олигосахарид хитозана сукцинат

ОХСА - олигосахарид хитозана сукцинат-аскорбат

РМК-1 - рак молочной железы крысы

СКЭНАР - самоконтролируемая энергонейроадаптивная регуляция ФХ - фосфатидилхолин ФЭ - фосфатидилэтаноламин ЯК - янтарная кислота 5-ФУ - 5-фторурацил

Отпечатано с готового оригинала-макета в РИО НИУ РАНХиГС Лицензия ИД №04568 от 20 апреля 2001 г.

Лицензия ПД №18-0140 от 8 октября 2001 г.__________________________________________________

Подписано в печать 30.01.2012.

Формат 60x84/16. Печать офсетная. Бумага офсетная.

Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Зак. 6444._________________________________________________

Нижегородский институт управления - филиал Российской академии народного хозяйства и государственной службы при Президенте Российской Федерации 603950, Нижний Новгород-292, пр. Гагарина, 46 тел./факс: (831) 412-33-01

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Красникова, Ольга Владимировна, Нижний Новгород

61 12-3/589

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Н.И. ЛОБАЧЕВСКОГО»

На правах рукописи

КРАСНИКОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИНФРАКРАСНЫХ СПЕКТРОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОНКОГЕНЕЗЕ

03.03.01 - физиология 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., проф. В.Н. Крылов д.х.н., проф. A.C. Гордецов

Нижний Новгород 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение....................................................................................5

1. Обзор литературы...................................................................11

1.1. Инфракрасная спектроскопия..........................................11

1.1.1. Суть метода ИК-спектроскопии........................................11

1.1.2. Аппаратура..................................................................14

1.1.3. Применение ИК-спектроскопии в медицине........................16

1.1.4. ИК-спектроскопия биологических жидкостей и тканей в диагностике различных заболеваний...............................................25

1.1.5. Математическая обработка результатов, полученных методом ИК-спектроскопии сыворотки крови...............................................30

1.1.6. Основы и логика медико-диагностического применения метода ИК-спектроскопии.....................................................................39

2. Материалы и методы исследования.............................................43

2.1. Материалы исследования..................................................43

2.2. Схема эксперимента.........................................................47

2.3. Методы исследования......................................................49

2.3.1. Метод ИК-спектроскопии..............................................49

2.3.1.1. Идентификация фосфорсодержащих соединений методом ИК-спектроскопии ...........................................................................49

2.3.1.2. Метод ИК-спектроскопии плазмы крови...........................49

2.3.2. Методы статистической обработки результатов....................50

3. Результаты и их обсуждение......................................................52

3.1. Идентификация фосфорсодержащих соединений плазмы крови экспериментальных животных методом ИК-спектроскопии...............52

Выводы к разделу 3.1............................................................55

3.2. Особенности ИК-спектров плазмы крови животных-опухо леносител ей......................................................................56

3.2.1. Особенности ИК-спектров плазмы крови здоровых животных и

животных-опухо леносителей.........................................................56

Выводы к разделу 3.2.1..........................................................59

3.3. Особенности ИК-спектров плазмы крови животных с ЛФС Плисса на фоне введения ЯК и её производных...........................................60

Выводы к разделу 3.3............................................................63

3.4. Особенности ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных на фоне комплексного введения ОФР и химиопрепаратов в условиях неоплазии....................................................................64

3.4.1. Особенности ИК-спектров плазмы крови животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР..........................................66

Выводы к разделу 3.2.3.1.......................................................71

3.4.2. Особенности ИК-спектров биологических тканей животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР..............................72

3.4.2.1. Особенности ИК-спектров печени животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР..................................................72

Выводы к разделу 3.4.2.1.........................................................75

3.4.2.2. Особенности ИК-спектров почек животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР..................................................76

Выводы к разделу 3.4.2.2.......................................................78

3.4.2.3. Особенности ИК-спектров мозга животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР................................................ ..79

Выводы к разделу 3.4.2.3.........................................................80

3.4.2.4. Особенности ИК-спектров легких животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР..................................................81

Выводы к разделу 3.4.2.4.........................................................82

3.4.2.5. Особенности ИК-спектров опухолей животных с РМК-1 на фоне комплексного введения ОФР и ДР..........................................82

Выводы к разделу 3.4.2.5......................................................86

3.4.3. Влияние ОФР и 5-ФУ на характеристики ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных на фоне роста Г-3.....................86

Выводы к разделу 3.4.3..........................................................88

3.4.3.1. Влияние ОФР и 5-ФУ на характеристики ИК-спектров опухолей экспериментальных животных на фоне роста Г-3.................89

Выводы к разделу 3.4.3.1.......................................................91

3.5. Изменение характеристик ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей под влиянием СКЭНАР-, ДЭНС-терапии..................92

Выводы к разделу 3.5............................................................95

Заключение...............................................................................97

Выводы....................................................................................98

Литература...............................................................................99

Приложение............................................................................125

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

БАД - биологически активные добавки

б/в - без воздействия

Г-3 - гепатома Зайделя

ДМФА - диметилформамид

ДР - доксорубицин

ДЭНС - динамическая электронейростимуляция

ИК - инфракрасная

ЛФС Плисса - лимфосаркома Плисса

ОФР - озонированный физиологический раствор

ОХС - олигосахарид хитозана сукцинат

ОХСА - олигосахарид хитозана сукцинат-аскорбат

РМК-1 - рак молочной железы крысы

СКЭНАР - самоконтролируемая энергонейроадаптивная регуляция

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ЯК - янтарная кислота

5-ФУ - 5-фторурацил

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Современная физиология находится в постоянном поиске новых методов исследования, которые бы раскрывали физиолого-биохимическую сущность протекающих в организме процессов. Одним из таких методов может быть инфракрасная (ИК) спектроскопия. ИК-спектроскопия является одним из фундаментальных методов исследования органических веществ и широко используется в химии, биологии и медицине. Применение данного метода для изучения такого биологического объекта, как кровь, началось с середины прошлого века, и в настоящее время начинает применяться в клинической лабораторной диагностике (Гордецов, 2010), т.к. позволяет определить наличие патологического процесса на стадии, когда он не устанавливается традиционной диагностикой; также ИК-спектроскопия используется при анализе лекарственных средств (Елизарова, 2009). Метод отличается высокой специфичностью, т.к. позволяет по характеристикам спектра поглощения инфракрасного излучения химическими связями определить в крови практически любые вещества качественно и количественно. Аналитически информативными показателями в данном методе являются полосы поглощения ИК-спектра, соответствующие связям фосфор-кислород (Р-О) фосфорсодержащих соединений (Гордецов, 2002). Однако вопрос идентификации фосфорсодержащих соединений плазмы крови методом ИК-спектроскопии остается открытым. С наибольшей вероятностью следует считать, что в ИК-спектре плазмы крови определяются полосы поглощения Р-0 связей: неорганических фосфатов (Верченко, 1991), фосфолипидов (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин,

фосфатидилинозитол) (Кейтс, 1975), фосфорилированных белков (Верболович и др., 1980), фосфора кислоторастворимого эритроцитарного

(нуклеозидтри- (ди-, moho-) фосфорных кислот и их производных) (Afanasyeva et al., 1998). Увеличение их концентрации в крови отмечается при определенных патологиях, например, почечной недостаточности, передозировке витамина Д, недостаточности паращитовидных желёз, при миеломных болезнях, нарушениях липидного обмена (липидный фосфор) и т.д. Количество кислоторастворимого фосфора увеличивается при всех заболеваниях, сопровождающихся кислородной недостаточностью. Напротив, снижение концентрации происходит при дефиците витамина Д, нарушениях всасывания в кишечнике, рахите, гиперфункции паращитовидных желёз и т.д. (Лифшиц, Сидельникова, 2000). Таким образом, на содержание фосфорсодержащих веществ в крови влияет как физиологическое состояние организма, так и экзогенное введение лекарственных препаратов, что дает возможность исследовать изменения параметров ИК-спектров плазмы крови пациентов, в том числе и онкологических, на фоне лечения современными видами лекарств, биологически активных добавок (БАД). Метод РЖ-спектроскопии плазмы крови также позволяет исследовать влияние озонотерапии, электрорефлексотерапии, т.к. данные виды воздействий влияют на концентрации фосфорсодержащих соединений в плазме крови, что приводит к изменению, а часто и к нарушению энергетического обмена организма, и не всегда вызывает положительный терапевтический эффект. Поэтому исследование особенностей ИК-спектров крови организмов-опухоленосителей при проведении современных терапевтических мероприятий для выявления наиболее эффективных и безопасных методов диагностики и лечения онкологических заболеваний остается актуальным и позволяет сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования:

Экспериментальное обоснование применения в физиологии метода ИК-спектроскопии для исследования динамики изменений соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных в плазме крови крыс с перевивными опухолями на фоне озоно-, электрорефлексо- и фармакотерапии.

Задачи исследования:

¡.Идентифицировать фосфорсодержащие соединения плазмы крови экспериментальных животных по ИК-спектрам.

2.Изучить особенности ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей и их взаимосвязь с содержанием фосфорсодержащих соединений.

3.Исследовать динамику изменений параметров ИК-спектров плазмы крови животных с экспериментальными опухолями на фоне введения БАД на основе янтарной кислоты (ЯК) и её комплексов с аскорбиновой кислотой (АК) и олигосахаридом хитозана (ОХ), комплексного введения озона и химиопрепаратов (доксорубицина (ДР), 5-фторурацила (5-ФУ)), а также под влиянием самоконтролируемой электронейроадаптивной регуляции (СКЭНАР), динамической электронейростимуляции (ДЭНС).

Научная новизна исследования

Впервые исследованы и проанализированы изменения параметров ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей при действии на организм ДЭНС, СКЭНАР, ЯК и её комплексов, комплексного применения озона и некоторых противоопухолевых препаратов (ДР, 5-ФУ). Установлено, что фосфорсодержащими соединениями, определяющимися в инфракрасном спектре плазмы крови, являются нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфаты.

Показано, что применение БАД на основе ЯК и её производных не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов в плазме крови животных-опухоленосителей. Выявлено, что совместное применение ОФР и 5-ФУ; ОФР и ДР приводит к нормализации показателей ИК-спектров плазмы крови животных-опухоленосителей.

Применение СКЭНАР-, ДЭНС-воздействий не вызывает достоверного изменения соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфатов в плазме крови экспериментальных животных.

Практическая значимость работы

Результаты работы являются обоснованием для экспериментальных и клинических исследований возможности комбинированного применения ОФР и цитотоксических препаратов как способа повышения противоопухолевого эффекта химиотерапевтических воздействий.

Применение ЯК и её производных, СКЭНАР-, ДЭНС-терапии при неоплазии не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов в плазме крови экспериментальных животных, в связи с чем, данные виды воздействий не могут быть рекомендованы для использования.

Разработан способ диагностики рецидива онкологических заболеваний головного мозга // Приоритет по заявке на изобретение № 2011139627 от 30.09.2011.

Полученные результаты и выводы могут использоваться в учебном процессе на кафедре физиологии и биохимии человека и животных ННГУ и кафедре общей химии НижГМА для ознакомления с неинвазивным способом диагностики различных заболеваний, в том числе и онкологических.

Положения, выносимые на защиту

1. ИК-спектры плазмы крови экспериментальных животных подтверждают физиологические изменения в организме животного-опухоленосителя по сравнению со здоровым, различаются по своим спектральным характеристикам и соответствуют разному содержанию фосфорсодержащих соединений (нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфорных кислот и их производных).

2. Введение животным с ЛФС Плисса янтарной кислоты и её производных не вызывает нормализации соотношений нуклеозидтри- (ди-, моно-) фосфатов в плазме крови экспериментальных животных.

3. Комбинированное введение озонированного физиологического раствора (ОФР) с ДР животным с раком молочной железы (РМК-1), а также комплексное введение ОФР и 5 - ФУ животным с гепатомой Зайделя (Г-3), нормализует параметры ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных.

4. Применение СКЭНАР-, ДЭНС-воздействий не вызывает изменения соотношений нуклеозидтри- (моно-) фосфатов в плазме крови животных с ЛФС Плисса.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007), международной конференции «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), межвузовской научно-практической конференции студентов и аспирантов с международным участием «Трибуна молодого ученого 2011. Актуальные проблемы науки глазами молодежи» (Мурманск, 2011), на расширенном заседании кафедры физиологии и биохимии человека и животных (ННГУ)

и кафедры общей химии НижГМА Росздрава (2011). По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Благодарности

Автор выражает сердечную, искреннюю благодарность своим научным руководителям, В.Н. Крылову и A.C. Гордецову, за мудрые советы, терпение и понимание. Автор работы признателен д.б.н. К.Н. Конторщиковой, д.м.н. Ю.В.Зимину, д.б.н. Т.Г. Щербатюк, к.б.н. О.М. Московцевой, к.х.н. C.B. Зиминой, к.м.н. И.А. Медянику, асп. А.И. Сазанову (НижГМА), О.Н. Груздевой (региональный ДЭНАС - центр) за оказанную консультационную помощь и сотрудничество при получении материала для настоящего исследования. Автор высказывает особую признательность своей семье за помощь и поддержку.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический список (233 источника). Диссертационная работа содержит 9 рисунков, 12 таблиц и приложение.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Инфракрасная спектроскопия

1.1.1. Суть метода ИК-спектроскопии

ИК-спектроскопия - раздел молекулярной оптической спектроскопии, изучающий спектры поглощения и отражения электромагнитного излучения в ИК-области, т.е. в диапазоне длин волн от 10" до 10" м (Химическая энциклопедия, 1990). ИК-спектр представляет собой сложную кривую с большим числом максимумов и минимумов. Полосы поглощения появляются в результате переходов между колебательными уровнями основного электронного состояния изучаемой системы. Спектральные характеристики (положения максимумов полос, их полуширина, интенсивность) индивидуальной молекулы зависят от масс составляющих ее атомов, строения, особенностей межатомных сил, распределения заряда и др. Поэтому ИК-спектры отличаются высоким уровнем индивидуальности, что и определяет их ценность при идентификации и изучении строения соединений (особенно органических) В целом ИК-спектры характеризуют энергетическое состояние молекул, касающееся, в первую очередь, колебательных и вращательных движений ядер атомов и молекул. Поэтому их часто называют молекулярными спектрами, а метод относят к нанотехнологиям. В области волновых чисел 1400-700 см"1 ИК-спектры многих органических молекул настолько сложны, что отнесение абсорбционных полос к отдельным элементам строения вызывает значительные трудности даже при наличии обширного экспериментального материала (Kr äfft et al, 2004). Эту область используют для идентификации веществ, причем любые два вещества могут быть признаны идентичными, если их ИК-спектры в этой области полностью совпадают во всех деталях. Поэтому данную область спектра органических веществ (в том числе и входящих в состав

биологических жидкостей и тканей) называют дактилоскопической («фингерпринт») (Общий практикум по органической химии, 1965, КтаШ е1 а1, 2004).

В ИК-спектроскопии установлены четкие эмпирические закономерности, связывающие структуру вещества с параметрами спектра, что дает возможность решать с помощью ИК-спектроскопии различные задачи в области идентификации и установления строения соединений, анализа смесей, кинетического контроля за ходом реакции, изучения внутри- и межмолекулярного взаимодействий (Кудрявцева, 1981).

ИК-спектр возникает при поглощении веществом электромагнитного излучения с длиной волны от 2.5 до 25 мкм (4000-400 см"1). Поглощенная энергия преобразуется главным образом в энергию колебания атомов. И молекула переходит из исходного нулевого колебательного состояния в возбужденное.

Молекула, находящаяся на нулевом колебательном уровне, н