Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах

Миняев, Михаил Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах"

На правах рукописи

Миняев Михаил Владимирович

Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

иичЗ 1Ь2 314

Тверь - 2007

003162314

Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук,

профессор Ворончихина Людмила Ивановна

Официальные оппоненты.

доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна кандидат биологических наук, доцент Карцова София Владимировна

Защита состоится 12 ноября 2007 г в 1400 на заседании диссертационного совета К 212 263 01 в Тверском государственном университете по адресу 170002, г Тверь, пр Чайковского, 70 а, корп 5, ауд 318

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу 170000, г. Тверь, ул Володарского, 44 а

Автореферат разослан « {б » ,'{/)/, % 2007 г.

Ведущая организация Тверская государственная

медицинская академия

Ученый секретарь диссертационного совета

Костюк Н В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Молекулярный кислород является без преувеличения важнейшим метаболитом аэробного обмена, имеющим ключевое значение в энергообеспечении организма Поэтому уровень и характер биохимического потребления кислорода обычно рассматривается как основной показатель метаболической активности тканей, клеток и субклеточных структур Современные биохимические измерительные приборы, предназначенные для регистрации данного показателя, обладают вполне приемлемыми техническими характеристиками Тем не менее реальные результаты измерения биохимического потребления кислорода, согласно литературным данным, отличаются неоправданно низкой воспроизводимостью ошибка среднего, которая в биохимических исследованиях используется для характеристики разброса показаний, при измерении метаболического потребления кислорода обычно составляет порядка 12% от измеряемой величины (Горская И.А, 1988, Капитанов А Б. и др, 1990; Меер-сон Ф 3, 1995 и др ), а довольно часто (БсЬигек НЛ йа, ] 990, ОПшапп С , 2003, Бийпег Б е1 а, 2004 и др ) достигает 30 и более процентов В результате корректной оказывается только сравнительная интерпретация полученных данных

Подобное несоответствие между характеристиками оборудования и точностью полученных с его помощью результатов объясняется тем, что изменение концентрации кислорода в инкубационной среде, фиксируемое прибором, зависит не только от биохимического потребления кислорода изучаемым объектом, но и от диффузионных потоков кислорода между средой инкубации и ее окружением (Миняев М.В и др , 1996, 2001, 2005, 2006, 2007), которые по величине сравнимы, а зачастую и превышают биохимическое потребление Поэтому задача по выявлению и изучению факторов, определяющих величину и направление этих потоков, является актуальной, так как ее решение позволило бы существенно повысить точность биохимических исследований, связанных с изучением аэробного метаболизма и, как следствие, осуществить строгий количественный подход к изучению его важнейших биохимических механизмов

Решение данной задачи с использованием аэробных биологических объектов оказалось крайне затруднительным по ряду причин, основной из которых явилась невозможность определения действительного количества потребленного ими кислорода и, следовательно, расчета наиболее важной количественной характеристики метода - относительной погрешности Поэтому возникла необходимость моделирования биохимического процесса потребления кислорода с привлечением устойчивой, простой, доступной и воспроизводимой химической модели, так как действительное количество кислорода, поглощенное моделью, в отличие от биологического объекта, может быть легко проконтролировано Использование подобной модели

позволяет определять важнейшие динамические характеристики существующего оборудования, а также значительно облегчает разработку новой специальной биохимической аппаратуры, предназначенной для изучения аэробного метаболизма, что также является весьма актуальным

Целью исследования явилось выявление и изучение факторов, искажающих результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами в малых объемах жидких инкубационных сред, и разработка специальной биохимической аппаратуры и методических подходов, позволяющих устранить или учесть влияние данных факторов для существенного повышения точности такого рода измерений 6 задачи исследования входило

1) разработать эталонную химическую модель, имитирующую биохимическое потребление кислорода в жидких инкубационных средах, позволяющую точно контролировать действительное количество поглощенного кислорода,

2) путем химического моделирования метаболического потребления кислорода выявить факторы, оказывающие наибольшее искажающее влияние на результаты измерения потребления кислорода в малых объемах жидких инкубационных сред,

3) разработать конструкцию измерительной системы на базе амперометри-ческого кислородного датчика, обладающую низкой собственной кислородной емкостью и позволяющую легко изменять и точно контролировать площадь поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации

4) изучить динамику пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду открытой измерительной ячейки при различной площади поверхности раздела фаз воздух-среда,

5) разработать метод учета количества кислорода, поступившего в среду инкубации из атмосферы за время проведения замера биохимического потребления кислорода, и вычисления соответствующей поправки к результату измерения,

6) изучить динамику обмена кислородом между средой инкубации и собственной кислородной емкости измерительной системы в ходе замера потребления кислорода моделью биологического объекта,

7) разработать метод определения собственной кислородной емкости измерительной системы и ее количественного вклада в погрешность измерения для вычисления соответствующей поправки к результату измерения биохимического потребления кислорода

вании полученных данных разработана специальная биохимическая аппаратура и комплексный методический подход, позволяющие кардинально повысить точность подобных измерений и в значительной мере устранить искажения характера регистрационных кривых биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах

Основные положения, выносимые на защиту. Неучтенный кислород, поступающий в среду инкубации из атмосферы, способствует существенному занижению результатов измерения биохимического потребления кислорода в открытых измерительных системах Предлагаемый в данной работе метод позволяет учесть поступивший из атмосферы кислород и, таким образом, снизить погрешность измерения до уровня, характерного для закрытых измерительных систем

Существующие приборы, предназначенные для измерения концентрации растворенного кислорода, обладают собственной кислородной емкостью Диффузионный обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью измерительной системы ведет к заметному искажению результатов измерения биохимического потребления кислорода Предлагаемый в данной работе метод предоставляет возможность определения как самой кислородной емкости, так и ее количественного вклада в величину погрешности результата измерения потребления кислорода, что позволяет существенно повысить точность такого рода измерений

Конструкции выпускаемых промышленностью электрохимических измерительных приборов, предназначенных для регистрации метаболического потребления кислорода, не позволяют в достаточной мере учесть влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения, чем обусловлена неоправданно высокая погрешность при их использовании в биохимических исследованиях Предлагаемая в данной работе измерительная система дает возможность снизить погрешность динамического измерения биохимического потребления кислорода до уровня погрешностей используемого оборудования

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят определенный вклад в экспериментальную биохимию аэробного метаболизма, позволяя с иной точки зрения взглянуть на интерпретацию результатов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность отдифференцировать биохимические и физико-химические причины регистрируемых изменений измеряемой величины при изучении потребления кислорода биологическими объектами Большинство из выявленных в работе закономерностей являются универсальными, то есть в той или иной мере присущими любым измерительным системам, предназначенным для изучения биохимического потребления кислорода, вне зависимости от принципа их действия Поэтому предлагаемый комплекс методических подходов может быть использован с любым

биохимическим оборудованием подобного назначения, как существующим, так и перспективным

Предложенный в работе подход к корректировке результатов измерения позволяет существенно повысить точность методов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность обратиться к изучению тонких биохимических механизмов аэробного метаболизма, а также к исследованию биологических объектов, характеризующихся низким потреблением кислорода Результаты исследования позволяют систематизировать подходы к выбору существующих и конструированию новых электрохимических датчиков и ячеек, предназначенных для биохимических и биоэнергетических исследований

Разработанное оборудование, методы и полученные результаты используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре биомедицины Тверского государственного университета в курсе лекций, большом практикуме, а также при подготовке курсовых и дипломных работ студентов

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета ТвГУ в 1995,1998,1999,2000 и 2003 годах

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, 5 глав, заключение, выводы, список литературы Работа изложена на 179 страницах, документирована таблицами (25) и иллюстрирована рисунками (37) Список литературы включает 114 отечественных и 84 зарубежные работы

МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом настоящего исследования послужила измерительная система, состоящая из закрытого амперометрического кислородного датчика, открытой измерительной ячейки и вспомогательного оборудования, при помощи которой регистрировалось потребление кислорода моделью, имитирующей аэробный биологический объект Выбор определялся широким распространением подобного рода измерительных систем в биохимических исследованиях и очевидным наличием у нее полного комплекса факторов, искажающих результаты измерения потребления кислорода

Измерения проводились с использованием двух близких по параметрам кислородных датчиков N5972 (промышленного изготовления, пр-во ПНР) и разработанного автором кислородного датчика с пониженной кислородной емкостью (ПКЕ) Все замеры производились в десятикратной повторности (п=10) за исключением специально оговоренных случаев

В качестве модели аэробного биологического объекта использовался -0,01 М свежеприготовленный раствор Ка2803, концентрация которого пе-

ред каждым замером уточнялась титриметрически Моделью среды инкубации служил водный раствор КС1 (60 г/л), практически изотонический по отношению к электролиту датчика, что исключало искажение показаний, связанное с осмотическими явлениями на мембране

Всего в ходе работы было записано и расшифровано 130 регистрационных кривых поглощения кислорода моделью аэробного биологического объекта, пассивного насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом и обмена кислородом между инкубационной средой и собственной кислородной емкостью измерительной системы Проведено 240 контрольных титриметрических определений действительного количества поглощенного кислорода и 60 определений изменения концентрации раствора Ка2803 под воздействием атмосферного кислорода.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первый этап работы, изложенный в главе 3, был посвящен выявлению факторов, оказывающих наибольшее искажающее воздействие на результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами, а также разработке оборудования и модельных систем, позволяющих определить количественный вклад данных факторов в величину погрешности измерения

На основании результатов измерения потребления кислорода модельным поглотителем в насыщенной атмосферным кислородом инкубационной среде, полученных при использовании измерительной системы на базе кислородного датчика N5972, было показано следующее

1 Результаты измерений в исходно бескислородной системе (обработка измерительной ячейки раствором Ка2803 и длительная продувка азотом), оказались воспроизводимо завышены на 18% по сравнению с действительными значениями (Су=8%), а в системе, насыщенной атмосферным кислородом - воспроизводимо занижены на 39% (Су=7%) Таким образом было показано, что в первом случае в системе присутствует неучтенный потребитель, а во втором - источник кислорода

2 Результаты, полученные в бескислородной системе, как показано выше, в меньшей степени отличались от действительного значения, чем полученные в системе насыщенной кислородом Таким образом, в обоих случаях измерение происходило на фоне притока кислорода извне

3 При использовании воды в качестве среды инкубации чувствительность датчика в серии последовательных замеров прогрессивно снижалась кривые становились более пологими, значение минимума повышалось, но после выдерживания датчика в течение нескольких часов в 5% растворе ИагБОз его работоспособность полностью восстанавливалась

4 При использовании в качестве среды инкубации изотонического по отношении к электролиту датчика раствора КС1, эффект «растягивания» кри-

вых поглощения полностью устранялся, что сопровождалось снижением относительной погрешности измерения от -20,2 до -10% с одновременным возрастанием Су от 5 до 9%

Таким образом, в результате предварительных экспериментов было установлено следующее

- рассматриваемая измерительная система обладает собственной кислородной емкостью;

- атмосферный кислород во время регистрации потребления кислорода объектом диффундирует в инкубационную среду, что способствует занижению результата измерения,

- использование инкубационных сред, гипотонических по отношению к электролиту закрытого кислородного датчика, ведет к искажению характера кривых потребления и росту погрешности измерения

На основании выявленных особенностей измерительной системы было предложено:

- в качестве исходного для проведения измерений использовать кислородный режим «100» (измерительная система предварительно насыщена кислородом путем длительной продувки атмосферным воздухом), как более стабильный и не требующий усилий для своего поддержания;

- в качестве модели инкубационной среды использовать водный раствор КС1 (60 г/л), как не вызывающий искажения регистрационных кривых за счет осмотических эффектов на мембране кислородного датчика,

- отказаться от использования кислородного датчика N5972, как обладающего избыточно высокой собственной кислородной емкостью, величина которой существенно варьирует от замера к замеру, и разработать конструкцию амперометрического кислородного датчика, обладающего низкой и стабильной кислородной емкостью

Разработанная автором конструкция кислородного датчика с пониженной кислородной емкостью (ПКЕ), представлена на рисунке 1 в одном масштабе с прототипом N5972 Снижение кислородной емкости датчика было осуществлено за счет уменьшения объема электролита, устранения из резервуара гидрофобных материалов и изменению способа крепления датчика к измерительной ячейке, в результате чего складки мембраны, удерживающие газовые пузырьки, были вынесены за пределы ячейки Дополнительно была увеличена рабочая площадь мембраны, что существенно ускорило обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью датчика

Проверка работоспособности предложенной конструкции показала, что влияние кислородной емкости на результат измерения при использовании датчика ПКЕ стало несколько более выраженным (относительная погрешность увеличилась на 25%) и гораздо более воспроизводимым (Су снизился почти в 4 раза и составил 2,4%) Увеличение систематической ошибки, вносимой кислородной емкостью, на фоне снижения самой ки-

слородной емкости, свидетельствует о том, что задача по увеличению скорости диффузии кислорода между инкубационной средой и емкостью была успешно решена. Об этом же свидетельствует и резкое улучшение воспроизводимости: благодаря высокой скорости диффузии исходное состояние емкое™ контролировалось гораздо надежнее.

Рис. 1. Особенности конструкции кислородных датчиков N5972 (п) и ПКЕ (б) I - катод; X - мембрана; 3 - резиновая манжета; 4 - ск;тдкн мембраны; 5 - стенка измерительной ячейки; 6 - корпус (у датчика ПКЕ одновременно выполняет роль анода); 7 - злектршгат; 8 - анод.

Второй этап настоящего исследования (изложен в главе 4) был посвящен изучению динамики массивной диффузии атмосферного кислорода в инкубационную среду открытой измерительной ячейки и разработке метода корректировки результата измерения па поступление кислорода из атмосферы в среду инкубации во время замера.

Для регистрации динамики насыщения измерительной системы атмосферным кислородом измерительную ячейку в исходном кислородном режиме «О» (кислород из системы пр ед царите л ьно удален путем обработки раствором Ка^СЬ, промывки и продувки азотом) заполняли 3,5 мл инкубационной среды, добавляли 100 мкл имитатора поглотителя (0,01М МдтЗО«) и продува."и азотом до установления нулевых показаний регистра-тори. После этого продувку прекращали, закрывали ячейку плавающей перегородкой и ироизводипи непрерывную регистрацию изменения парциального давления кислорода в инкубационной среде, пока оно не достигало 70% (здесь и далее парциальное давление кислорода в среде выражается в процентах от парциального давления кислорода в атмосфере на момент измерения). Изменение площади контакта инкубационной среды с атмосферой осуществлялось путем размещения на поверхности инкубаци-

онной среды плавающих перегородок различного диаметра. Таким образом, в эксперименте использовались три типа ячеек: «открытая» - 183 мм2, «полузакрытая» - 89 мм2 и «закрытая» -16 мм2

Усредненные варианты кривых насыщения показаны на рисунке 2 Как видно из рисунка, скорость насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом проявляла отчетливую зависимость от площади поверхности раздела фаз

Ро2(%)

Рис 2 Регистрационные кривые насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом в открытой (1), полузакрытой (2) и закрытой (3) ячейках (по средним значениям)

Для вычисления поправки к результату измерения потребления кислорода на его диффузию из атмосферы была предложена следующая методика фрагмент каждой кривой насыщения (30-70%) разбивали на участки (дР], АР2, и т д ), как показано на рис 3, каждый из которых соответствовал 2%-ому изменению парциального давления кислорода в среде

Л' 1 Л'2 л'з

Рис 3 Схема анализа примерной кривой насыщения

Для каждого участка определяли время, необходимое для двухпроцентного изменения парциального давления кислорода в среде (ДГЬ Лг2, и

т.д) После чего средняя скорость насыщения v„¡,c, среды кислородом (%/мин) для каждого из участков АР, рассчитывалась по формуле.

У нас —

В дальнейших вычислениях значение средней скорости \тх, рассматривали как мгновенную скорость насыщения у„ас 1 при парциальном

давлении кислорода в среде Р, Мгновенную скорость диффузии кислорода в реакционную среду (моль/мин) рассчитывали по формуле

^аоф, нас , @ ,

где а - цена 1% шкалы регистратора (моль/%), которая вычислялась как:

а = -

V Кс КР 2,156 10'

100

где: V - объем инкубационной среды с учетом объема добавки (мл), 2,156 10"7 - содержание кислорода в 1 мл дистиллированной воды (моль) при 37°С и атмосферном давлении 760 мм рт ст; Кс и К¡>- поправочные коэффициенты, которые вычислялись по формулам

Кс= 1-0,0048 С,

760

где- С - концентрация солей в реакционной среде с учетом добавки (г/л), В - атмосферное давление в момент записи кривой насыщения (мм рт.ст ), 760 - нормальное атмосферное давление (мм рт ст)

Уд„ф (моль 10'/мин)

Ро2(%)

Рис 4 Зависимость скорости диффузии кислорода из атмосферы в среду инкубации от его парциального давления в среде для открытой (1), полузакрытой (2) и закрытой (3) измерительной ячейки

Средние значения ^дчф, для открытой, полузакрытой и закрытой измерительных ячеек представлены на рис 4 Как видно из рисунка, сокращение поверхности контакта ведет к заметному снижению скорости диффузии кислорода в среду, но, даже для закрытой ячейки, диффузия кислорода остается фактором, способным заметно влиять на точность измерения количества потребленного кислорода

Данные, представленные на рис 4 к сожалению нельзя рассматривать как калибровку измерительной системы из-за невозможности непосредственно откалибровать весь диапазон измерения (от 0 до 100%) во-первых, к моменту начала регистрации парциальное давление кислорода в среде успевает подняться до 5-10%, во-вторых, начиная с парциальных давлений 70-80% для закрытой ячейки наблюдается прогрессирующее искажение кривых насыщения, связанное с испарением воды из среды инкубации, предотвратить которое при температуре 37°С в течение более 4 часов регистрации невозможно Поэтому полученную зависимость преобразовывали в прямую пропорциональность, согласно закону диффузии Фика, с последующей аппроксимацией данных «неполной» калибровки на весь измеряемый диапазон. Для этого данные, представленные на рис 4 отображали как зависимость скорости диффузии Vд„ф от градиента парциальных давлений А между атмосферой и средой (%), который вычисляли по формуле

А,, = 100- Р,,

где 100 - парциальное давление кислорода в атмосфере (%) Для аппроксимации использовались только участки кривых, характеризующиеся выраженной линейностью, на которых искажение сопутствующими факторами сказалось в наименьшей степени (31-61%)

Результаты аппроксимации несколько отклонились от закона диффузии (исходные линии тренда не прошли через начало координат), что на наш взгляд объясняется наличием у измерительной системы собственной кислородной емкости скорости диффузии, рассчитанные по показаниям прибора, оказались пропорционально занижены из-за частичного оттока кислорода в исходно незаполненную кислородную емкость (для открытой ячейки занижение скоростей диффузии, по-видимому, маскируется за счет активного испарения воды с открытой поверхности инкубационной среды) Поэтому полученные линии тренда преобразовывались путем параллельного смещения до пересечения с началом координат, как показано на рис 5 Уравнения преобразованных прямых, представленные на рисунке, использовались для вычисления скоростей диффузии кислорода в среду для всего диапазона измерений

Удиф (моль 10"9/мин)

Д, (%)

100

Рис 5 Результат преобразования линий тренда

Таким образом, в результате предварительной калибровки измерительной системы появилась возможность определить скорость диффузии кислорода в среду при любом парциальном давлении, что позволяет произвести корректировку результатов измерения потребления кислорода путем вычисления его количества, поступившего в среду на каждом из «двухпроцентных» участков корректируемой кривой поглощения

Корректировке подвергались результаты трех серий по 10 замеров потребления кислорода модельным поглотителем Замеры первой серии производились в открытой измерительной ячейке, второй - в полузакрытой и третьей - в закрытой

Базовая составляющая количества кислорода, поглощенного в ходе каждого замера вычислялась на основании минимального парциального давления кислорода в среде Ртш , соответствующего точке минимума кривой поглощения (рис 6) Для этого производилась предварительная корректировка Ртт в связи с эффектом разбавления среды бескислородной добавкой по уравнению

где. Пр - поправка на разбавление среды (%), вычисленная по формуле:

где 100 - исходное парциальное давление кислорода в среде (%), ¥с - объем среды (мл), Уд - объем поглотителя (мл)

После чего базовую составляющую количества поглощенного кислорода N0 вычисляли по формуле

ЛГо=(Ю0-Ртп ) а,

где. 100% - исходное парциальное давление кислорода в инкубационной среде, а - цена 1% шкалы регистратора (моль/%)

Рис 6 Структура типичной кривой поглощения а - исходное парциальное давление кислорода в среде инкубации (100%), б - действительное снижение парциального давления кислорода, рассчитанное по результатам титрования поглотителя, в - минимальное парциальное давление кислорода в среде (Ртп), I - момент внесения поглотителя, 2 - нисходящая ветвь кривой поглощения, 3 -фрагмент восходящей ветви кривой

Базовая составляющая 7У0 подвергалась дальнейшей корректировке для учета количества кислорода, поступившего в реакционную среду за время замера из атмосферы Корректировка производилась путем вычисления поправки ПА, характеризующей диффузию кислорода из атмосферы, на основании характера нисходящей ветви кривой поглощения Для этого нисходящую ветвь (рис 6) также разбивали на участки (дРь дР2, . и т д), каждый из которых соответствовал 2%-ому изменению парциального давления кислорода в среде Затем определяли время, необходимое для 2%-го изменения парциального давления на каждом участке (дЛ, д?2, и т д)

Количество кислорода пл,, поступившего в систему из атмосферы за каждый промежуток времени определяли по формуле.

ПА, '„

где vйw/,( - скорость диффузии кислорода (моль/мин) для участка дР„ рассчитанная на основании уравнений, представленных на рис 2 Общую поправку на поступление кислорода из атмосферы Па определяли как сумму всех индивидуальных поправок пА для каждого промежутка времени 4,

ПА = 1«д

Тогда исправленное количество кислорода ЫА, поглощенное сульфитом натрия с учетом поправки на поступление кислорода из атмосферы, вычисляли как сумму базовой составляющей Ло и поправки ПА

Таблица 1. Зависимость результатов измерения поглощения кислорода 0,01 М раствором ИагБОз от площади контакта инкубационной среды с атмосферой (п=10)

& N0 Пл ЛЬ

мм2 моль Ю"7 моль 10"7 моль 107 моль 10'1

16 4,79±0,02 4,16±0,03 0,09±0,02 4,25±0,03

89 4,78±0,05 3,75±0,06 0,63±0,05 4,38±0,05

183 4,90±0,03 3,72±0,06 0,78±0,06 4,49±0,04

Результаты измерений и их последующей корректировки приведены в табл 1, где Бп - площадь поверхности раздела фаз воздух - среда инкубации, Ыт - действительное значение измеренной величины, рассчитанное по результатам титрования поглотителя Как видно из таблицы, увеличение площади контакта инкубационной среды с атмосферой ведет к заметному занижению результатов измерения Использование поправки приводит к парадоксальному результату точность измерения с увеличением площади контакта возрастает Данная тенденция прослеживается и в изменениях значений относительной погрешности А(%), представленных в табл 2 Несколько иначе изменяется коэффициент вариации С,(%) его отчетливый рост для исходных значений при использовании поправки сменяется выравниванием, причем, характер изменения приобретает выраженное сходство с характером изменения коэффициента вариации действительных значений Основной причиной выявленных фактов, как показано выше, также является собственная кислородная емкость измерительной системы

Таблица 2. Влияние площади контакта инкубационной среды с атмосферой на погрешности измерения (п=10)

мм2 16 А (%) СЛ%)

Исходы Исправл Исходи Исправл

-13,20 -11,28 1,75 1,50

89 -21,56 -8,34 3,75 2,18

183 -24,11 -8,24 4,68 1,81

Таким образом, предлагаемый подход к корректировке результатов измерения потребления кислорода на взаимодействие среды инкубации с

атмосферой позволяет заметно улучшить как точность, так и воспроизводимость, что дает возможность фиксации более тонких метаболических особенностей изучаемых объектов В то же время эффективность подхода обнаруживает отчетливую зависимость от площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации, что объясняется наличием у измерительной системы собственной кислородной емкости, влияние которой наиболее отчетливо проявляется в закрытой системе (5д=16 мм2)

Третий этап исследования посвящен изучению влияния собственной кислородной емкости измерительной системы на точность измерения потребления кислорода (глава 4). Для этого оказалось необходимо разработать метод измерения собственной кислородной емкости измерительной системы, изучить динамику обмена кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью, разработать метод вычисления соответствующей поправки к результату измерения

Метод определения собственной кислородной емкости измерительной системы, заключался в следующем. Измерительную ячейку (исходный кислородный режим «О»), заполненную инкубационной средой, продували азотом в течение 10 мин, после чего, не прекращая продувки, среду извлекали и продолжали пропускать азот через пустую измерительную ячейку еще в течение 5 мин Затем включали регистратор, прекращали продувку, быстро заполняли ячейку 3,5 мл инкубационной среды, предварительно насыщенной кислородом воздуха при 37°С, и закрывали ячейку плавающей полиэтиленовой перегородкой В результате непрерывной регистрации получали кривую, отражающую процессы обмена кислородом между инкубационной средой и собственной кислородной емкостью системы (кривую обмена) Ход полученных кривых обмена с учетом латентности кислородного датчика (по средним значениям) представлен на рисунке 7

Как видно из рисунка, кривая обмена имеет резкий перелом (на реальных кривых, показанных пунктиром, вместо точки перелома имеется выраженный максимум, соответствующий парциальному давлению кислорода Ртах) скорость снижения парциального давления кислорода в среде в первые 2 мин оказалась более чем на порядок выше, чем максимальная за последующие 60 мин регистрации Поэтому было высказано предположение, что суммарная кислородная емкость измерительной системы состоит как минимум из двух независимых компонентов Один из них характеризуется исключительно высокой скоростью обмена со средой инкубации и его реализация происходит в течение первых минут или даже секунд регистрации («быстрая» емкость) Второй компонент («медленная» емкость) гораздо менее доступен и характеризуется существенно более низкими скоростями обмена

«Быстрая» кислородная емкость Первоначально предполагалось, что практически вся кислородная емкость измерительной системы локализована внутри кислородного датчика и, таким образом, отделена от среды

мембраной Результаты эксперимента показали, что «быстрая» емкость физически не может располагаться за мембраной датчика, так как скорость обмена кислорода с «быстрой» емкостью заметно превышает скорость диффузии кислорода сквозь мембрану к измерительному электроду датчика Таким образом, «быстрая» емкость могла быть локализована только в самой измерительной ячейке В связи с тем, что при низкой полярности и достаточно шероховатой поверхности стенки сосуда, заполняющая его вода запирает в углублениях пузырьки воздуха (Адомсон У А., 1979, Дан-кверст П В., 1973), было высказано предположение, что «быстрая» кислородная емкость измерительной системы имеет именно такую, поверхностную, природу

Ро2 (%)

* (мин)

Рис 7 Усредненная кривая обмена с учетом оттока кислорода в емкость в первые

минуты измерения (в скобках даны точные координаты точки перегиба)

Определение величины «быстрой» кислородной емкости и вычисление поправки на ее влияние осуществлялось следующим образом отклонение в показаниях датчика (%), обусловленное влиянием «быстрой» емкости рассчитывали как разность между исходным парциальным давлением кислорода в среде инкубации (100%) и значением максимума на кривой обмена Ртах (%)

дР8= 100-Л™

На основании отклонения рассчитывали количество кислорода щ (моль), перешедшее из среды в «быструю» емкость к моменту достижения точки максимума

= а,

где а - цена 1% шкалы регистратора (моль/%)

Так как скорость обмена с «быстрой» емкостью оказалась выше скорости реакции датчика, считали, что в момент достижения точки максимума исходно пустая «быстрая» емкость была заполнена кислородом на Ртах процентов Таким образом, количество кислорода п$, перешедшее из среды инкубации в «быструю» емкость, составляло Ртах процентов от полной величины этой емкости Поэтому полная величина «быстрой» емкости (моль) вычислялась по формуле

100

шах

Результаты обработки двадцати кривых обмена (п=20) приведены в таблице 3 Как видно из таблицы, среднее значение «быстрой» кислородной емкости составило 0,46 10'7 моля, что соответствует приблизительно 12% от содержания кислорода в среде Несмотря на сравнительно небольшую величину, «быстрая» емкость способна оказывать существенное влияние на точность измерения даже при кратковременных замерах, так как характеризуется очень высокой скоростью обмена кислородом со средой

Таблица 3. Результаты измерения «быстрой» кислородной емкости (п=20)

Показатель тах (%) дР.ч (%) Ш, (моль 10"7) Ез (моль 10"7)

X 92,21 7,79 0,43 0,46

т ±0,30 ±0,30 ±0,016 ±0,019

Су(%) 1,13 13,39 13,35 14,39

«Медленная» кислородная емкость для измерительной системы на базе кислородного датчика ПКЕ составила 2,7 10"7 моля Метод ее определения, основанный на анализе нисходящих ветвей кривых обмена (рис 7) подробно изложен в главе 5 Несмотря на то, что величина «медленной» емкости достигает 50% от содержания кислорода в 3,5 мл насыщенной модельной среды инкубации, ее влияние на точность кратковременных замеров потребления кислорода оказалось ничтожным из-за низкой скорости обмена кислородом между «медленной» емкостью и средой По этой причине при корректировке результатов измерений, приведенных в данной работе, влияние «медленной» кислородной емкости не учитывалось Тем не менее, при работе с реальными биологическими объектами, скорости потребления кислорода которыми зачастую оказываются существенно более низкими, «медленная» емкость вполне может оказаться в ряду основных факторов, искажающих результаты измерения

Корректировка результатов измерения на влияние «быстрой» кислородной емкости Корректировке подвергались результаты серии из 10

замеров потребления кислорода модельным поглотителем в закрытой измерительной ячейке Корректировка затрагивала как действительное значение потребленного кислорода NT, вычисленное на основании результатов титрования поглотителя, так и результат измерения потребления кислорода Na (предварительно исправленный на поступление кислорода из атмосферы) Исправление действительного значения количества потребленного кислорода NT производили по формуле

Nt=Nt-Ed,

где Nt - исправленное количество потребленного кислорода, вычисленное по результатам титрования поглотителя (моль); Ео - кислородная емкость наконечника микродозатора (моль) Далее при вычислении погрешности в качестве действительного значения использовалась величина NT*.

Для корректировки результатов измерения вычисляли долю кислородной емкости дРеик (%), перешедшую в среду инкубации за время проведения замера, по формуле

ДРык. = ЮО - Р,„,„,

где. 100 - исходное парциальное давление кислорода в емкости (%), Ртт -парциальное давление кислорода в среде и в «быстрой» емкости (') в момент достижения точки минимума на кривой поглощения (%) Тогда количество кислорода ns, перешедшее в среду, составляло дРеик процентов от величины «быстрой» кислородной емкости Es . Поэтому поправку на влияние кислородной емкости П$ находили по формуле

F Р Я,= "" 100

Исправленное значение поглощенного кислорода NA вычисляли как сумму количества поглощенного кислорода с учетом влияния атмосферного воздуха na и поправки на кислородную емкость i7s

NA,c = NA + ns

Ход и результаты корректировки представлены в таблице 4

Таблица 4. Комплексная корректировка результатов измерения потребления кислорода на влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы (п=10)

Показатель 1V," (моль 10"7) Na (моль 107) ДPe.uk (%) ns (моль 10"7) NA,r (моль 107)

X 4,63 4,26 82,6 0,38 4,64

m ±0,015 ±0,028 ±0,61 ±0,0031 ±0,031

А(%) - -10,90 - - 0,19

Cv(%) 0,98 2,00 2,23 2,48 2,02

Как видно из таблицы, относительная погрешность измерения при использовании поправки на собственную кислородную емкость измери-

тельной системы снизилась по модулю с 10,9 до 0,19%, то есть в 57 раз при практически неизменном значении коэффициента вариации (Су = 2,00 и 2,02% соответственно) Таким образом, разработанный автором комплекс поправок позволил свести систематическую составляющую погрешности при кратковременных измерениях потребления кислорода практически к нулю при достаточно высокой воспроизводимости результатов

ВЫВОДЫ

1 Разработана воспроизводимая (Су~1%) химическая модель, имитирующая биохимическое потребление кислорода аэробным биологическим объектом, с использованием сульфита натрия в качестве поглотителя, пригодная для динамической калибровки измерительных систем и определения их основных технических характеристик

2 Факторами, в наибольшей степени искажающими результаты измерения биохимического потребления кислорода при использовании открытых измерительных систем, являются диффузионные обменные потоки кислорода между средой инкубации и атмосферой, а также между средой инкубации и собственной кислородной емкостью измерительной системы

3 Разработана измерительная система, предназначенная для изучения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах, обладающая низкой и стабильной собственной кислородной емкостью (Ев=0,46-10'7 моля, £//=2,7 10"7 моля), предоставляющая возможность оперативного изменения площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации от 183 до 16 мм2

4 Динамика пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду незначительно отклоняется от закона диффузии для неоднородных сред под влиянием собственной кислородной емкости измерительной системы и за счет испарение воды с поверхности раздела фаз

5 Учет количества кислорода, поступившего из атмосферы в среду инкубации во время замера, позволяет снизить относительную погрешность измерения биохимического потребления кислорода с -24,11 до -8,24% для открытой измерительной ячейки

6 Собственная кислородная емкость измерительной системы, построенной на базе закрытого амперометрического кислородного датчика, включает не менее двух компонентов («быструю» и «медленную» емкость), характеризующихся различными скоростями обмена кислородом со средой

7 Учет количества кислорода, перешедшего из «быстрой» кислородной емкости измерительной системы в среду инкубации во время замера, позволяет снизить относительную погрешность измерения биохимического потребления кислорода с -10,90 до 0,19% для закрытой измерительной ячейки

8 Использование комплекса методических подходов, учитывающих обмен кислородом между средой инкубации и ее окружением, и оригинальных измерительных средств позволяет снизить относительную погрешность измерения потребления кислорода с -38,63 до 0,19%, а коэффициент вариации измеренных значений - с 8,91 до 2,02%

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Миняев M В Применение гальванического кислородного датчика в стандартном исполнении для регистрации потребления кислорода в малых объемах воды и водных растворов / M В Миняев, Г А. Грибанов, И И Гу-гушвили//Учен зап /Тверской гос ун-т -Тверь, - 1996.-ТЗ - С. 56-58. 2. Миняев M В Метод использования сульфита натрия для проверки и калибровки кислородных датчиков / M В Миняев, H Е Дронникова // Пути оптимизации функции дыхания при нагрузках, в патологии и в экстремальных состояниях, сб науч. тр / Тверской гос ун-т - Тверь - 1999 - С 72-77

3 Миняев M В Гальванический кислородный датчик с пониженной собственной кислородной емкостью / M В Миняев // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии, сб науч тр / Тверской гос ун-т - Тверь -2001 -С 154-161.

4 Миняев M В Собственная кислородная емкость закрытых кислородных датчиков / M В. Миняев, И И Гугушвили // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии сб науч тр / Тверскойгос ун-т - Тверь -2001 -С 161-166

5 Миняев M В Метод коррекции результатов измерения поглощения кислорода в сообщающихся с атмосферой измерительных ячейках / M В Миняев, Г А Грибанов, И И Гугушвили // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии сб науч тр / Тверской гос. ун-т - Тверь -2001 -С 166-174

6. Миняев M В Усовершенствованный метод коррекции результатов измерения потребления кислорода в сообщающихся с атмосферой измерительных ячейках / M В Миняев, Ю А Кабанова, H В Сладкова // Пути оптимизации функции дыхания при нагрузках, патологии и экстремальных воздействиях сб науч тр / Тверской гос ун-т - Тверь - 2005 - С 25-32

7. Миняев M В Влияние толщины полиэтиленовой мембраны на работу полярографического кислородного датчика закрытого типа / M В Миняев, НО Иванова//Вестник ТвГУ биология и экология -2005 -TIO -№4 С 84-87

8 Особенности использования микродозаторов с полиэтиленовыми наконечниками для калибровки кислородных датчиков / M В Миняев, M Д Платонова, К В Костина, Л И Ворончихина // Вестник ТвГУ биология и экология - 2006 -Т 22 - №5 С 53-56

9 Разбавление среды инкубации бескислородной добавкой как вероятная причина «эффекта быстрого потребления кислорода» /МБ Белякова, М В Миняев, А А Егорова, Л.И Ворончихина // Вестник ТвГУ биология и экология - 2006 -Т 22 - №5 С 57-60

10 Миняев М В Влияние атмосферного воздуха на результаты измерения потребления кислорода в жидких инкубационных средах с использованием открытых полярографических измерительных ячеек / М В Миняев, Л И Ворончихина // Авиакосмическая и экологическая медицина - 2007. - Т 41 -№2 - С 64-67

Технический редактор H M Петрив Подписано в печать 5 10 2007 Формат 60 х 84 1/1в Уел печ л 1,35 Тираж!00экз Заказ№483 Тверской государственный университет Редакционно-издательское управление Адрес Россия, 170100, г Тверь, ул Желябова, 33 Тел РИУ (4822)35-60-63

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Миняев, Михаил Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Современные представления о методах изучения биохимического потребления кислорода.

1.1. Классификация методов измерения концентрации растворенного кислорода.

1.1.1. Физические методы.

1.1.2. Химические методы.

1.1.3. Оптические методы.

1.1.4. Электрохимические методы.

1.1.5. Прочие методы.

1.2. Полярографический метод измерения концентрации растворенного кислорода.

1.2.1. Принцип полярографического метода.

1.2.2. Полярографическое обнаружение кислорода и измерение его концентрации.

1.2.3. Закрытые полярографические кислородные датчики.

1.3. Факторы, влияющие на точность динамического измерения биохимического потребления кислорода.

1.3.1. Автопотребление.

1.3.2. Осмотические явления на мембранах закрытых кислородных датчиков.

1.3.3. Диффузия атмосферного кислорода в среду инкубации.

1.3.4. Собственная емкость закрытых кислородных датчиков.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Кислородный датчик.

2.1.2. Измерительная ячейка.

2.1.3. Вспомогательное оборудование.

2.1.4. Модельная система.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Подготовка измерительной системы.

2.2.2. Запись кривых поглощения.

2.2.3. Контроль поглощения кислорода объемным методом.

2.2.4. Запись кривых насыщения.

2.2.5. Измерение собственной кислородной емкости системы.

2.2.6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Выявление факторов, оказывающих искажающее воздействие на результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами.

3.1. Анализ ошибок, допускаемых при изучении потребления кислорода биологическими объектами.

3.2. Основные подходы к моделированию процессов, происходящих в измерительной системе во время изучения потребления кислорода биологическими объектами.

3.2.1. Моделирование аэробного биологического объекта.

3.2.2. Моделирование инкубационной среды.

3.2.3. Моделирование закрытого кислородного датчика.

ГЛАВА 4. Влияние диффузии атмосферного кислорода в инкубационную среду на результаты измерения потребления кислорода.

4.1. Изучение динамики диффузии кислорода из атмосферы в среду инкубации.

4.2. Калибровка измерительной системы на поступление кислорода из атмосферы в среду инкубации.

4.3. Корректировка результатов измерения.

ГЛАВА 5. Собственная кислородная емкость измерительной системы и ее влияние на результаты измерения потребления кислорода.

5.1. Вычисление собственной кислородной емкости измерительной системы по косвенным данным.

5.2. Экспериментальное определение собственной кислородной емкости измерительной системы.

5.2.1. «Быстрая» кислородная емкость.

5.2.2. «Медленная» кислородная емкость.

5.3. Корректировка результатов измерения потребления кислорода на влияние собственной кислородной емкости измерительной системы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах"

Актуальность исследования. Молекулярный кислород является без преувеличения важнейшим метаболитом аэробного обмена, имеющим ключевое значение в энергообеспечении организма. Поэтому уровень и характер биохимического потребления кислорода обычно рассматривается как основной показатель метаболической активности тканей, клеток и субклеточных структур. Современные биохимические измерительные приборы, предназначенные для регистрации данного показателя, обладают вполне приемлемыми техническими характеристиками. Тем не менее реальные результаты измерения биохимического потребления кислорода, согласно литературным данным, отличаются неоправданно низкой воспроизводимостью: ошибка среднего, которая в биохимических исследованиях используется для характеристики разброса показаний, при измерении метаболического потребления кислорода обычно составляет порядка 12% от измеряемой величины [26, 45, 61 и др.], а довольно часто [138, 168, 185 и др.] достигает 30 и более процентов. В результате корректной оказывается только сравнительная интерпретация полученных данных.

Подобное несоответствие между характеристиками оборудования и точностью полученных с его помощью результатов объясняется тем, что изменение концентрации кислорода в инкубационной среде, фиксируемое прибором, зависит не только от биохимического потребления кислорода изучаемым объектом, но и от диффузионных потоков кислорода между средой инкубации и ее окружением [65, 67, 68, 69, 72 и др.], которые по величине сравнимы, а зачастую и превышают биохимическое потребление. Поэтому задача по выявлению и изучению факторов, определяющих величину и направление этих потоков, является актуальной, так как ее решение позволило бы существенно повысить точность биохимических исследований, связанных с изучением аэробного метаболизма и, как следствие, осуществить строгий количественный подход к изучению его важнейших биохимических механизмов.

Решение данной задачи с использованием аэробных биологических объектов оказалось крайне затруднительным по ряду причин, основной из которых явилась невозможность определения действительного количества потребленного ими кислорода и, следовательно, расчета наиболее важной количественной характеристики метода - относительной погрешности. Поэтому возникла необходимость моделирования биохимического процесса потребления кислорода с привлечением устойчивой, простой, доступной и воспроизводимой химической модели, так как действительное количество кислорода, поглощенное моделью, в отличие от биологического объекта, может быть легко проконтролировано. Использование подобной модели позволяет определять важнейшие динамические характеристики существующего оборудования, а также значительно облегчает разработку новой специальной биохимической аппаратуры, предназначенной для изучения аэробного метаболизма, что также является весьма актуальным.

В задачи исследования входило:

Научная новизна полученных данных. Впервые проведено исследование, в котором, путем моделирования биохимического потребления кислорода аэробным биологическим объектом, было изучено влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения потребления кислорода, полученные с помощью закрытого амперометрического кислородного датчика. На основании полученных данных разработана специальная биохимическая аппаратура и комплексный методический подход, позволяющие кардинально повысить точность подобных измерений и в значительной мере устранить искажения характера регистрационных кривых биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах.

Основные положения, выносимые на защиту. Неучтенный кислород, поступающий в среду инкубации из атмосферы, способствует существенному занижению результатов измерения биохимического потребления кислорода в открытых измерительных системах. Предлагаемый в данной работе метод позволяет учесть поступивший из атмосферы кислород и, таким образом, снизить погрешность измерения до уровня, характерного для закрытых измерительных систем.

Существующие приборы, предназначенные для измерения концентрации растворенного кислорода, обладают собственной кислородной емкостью. Диффузионный обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью измерительной системы ведет к заметному искажению результатов измерения биохимического потребления кислорода. Предлагаемый в данной работе метод предоставляет возможность определения как самой кислородной емкости, так и ее количественного вклада в величину погрешности результата измерения потребления кислорода, что позволяет существенно повысить точность такого рода измерений.

Конструкции выпускаемых промышленностью электрохимических измерительных приборов, предназначенных для регистрации метаболического потребления кислорода, не позволяют в достаточной мере учесть влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения, чем обусловлена неоправданно высокая погрешность при их использовании в биохимических исследованиях. Предлагаемая в данной работе измерительная система дает возможность снизить погрешность динамического измерения биохимического потребления кислорода до уровня погрешностей используемого оборудования.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят определенный вклад в экспериментальную биохимию аэробного метаболизма, позволяя с иной точки зрения взглянуть на интерпретацию результатов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность отдифференцировать биохимические и физико-химические причины регистрируемых изменений измеряемой величины при изучении потребления кислорода биологическими объектами. Большинство из выявленных в работе закономерностей являются универсальными, то есть в той или иной мере присущими любым измерительным системам, предназначенным для изучения биохимического потребления кислорода, вне зависимости от принципа их действия. Поэтому предлагаемый комплекс методических подходов может быть использован с любым биохимическим оборудованием подобного назначения, как существующим, так и перспективным.

Предложенный в работе подход к корректировке результатов измерения позволяет существенно повысить точность методов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность обратиться к изучению тонких биохимических механизмов аэробного метаболизма, а также к исследованию биологических объектов, характеризующихся низким потреблением кислорода. Результаты исследования позволяют систематизировать подходы к выбору существующих и конструированию новых электрохимических датчиков и ячеек, предназначенных для биохимических и биоэнергетических исследований.

Разработанное оборудование, методы и полученные результаты используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре биомедицины Тверского государственного университета: в курсе лекций, большом практикуме, а также при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Миняев, Михаил Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Разработана воспроизводимая (Су~1%) химическая модель, имитирующая биохимическое потребление кислорода аэробным биологическим объектом, с использованием сульфита натрия в качестве поглотителя, пригодная для динамической калибровки измерительных систем и определения их основных технических характеристик.

2. Факторами, в наибольшей степени искажающими результаты измерения биохимического потребления кислорода при использовании открытых измерительных систем, являются диффузионные обменные потоки кислорода между средой инкубации и атмосферой, а также между средой инкубации и собственной кислородной емкостью измерительной системы.

3. Разработана измерительная система, предназначенная для изучения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах, обладающая низкой и стабильной собственной кислородной емкостью (£г=0,46-10'7 моля, £¿-2,7-10"7 моля), предоставляющая возможность оперативного изменения площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации от 183 до 16 мм .

4. Динамика пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду незначительно отклоняется от закона диффузии для неоднородных сред под влиянием собственной кислородной емкости измерительной системы и за счет испарение воды с поверхности раздела фаз.

5. Учет количества кислорода, поступившего из атмосферы в среду инкубации во время замера, позволяет снизить относительную погрешность измерения биохимического потребления кислорода с -24,11 до -8,24% для открытой измерительной ячейки.

6. Собственная кислородная емкость измерительной системы, построенной на базе закрытого амперометрического кислородного датчика, включает не менее двух компонентов («быструю» и «медленную» емкость), характеризующихся различными скоростями обмена кислородом со средой.

7. Учет количества кислорода, перешедшего из «быстрой» кислородной емкости измерительной системы в среду инкубации во время замера, позволяет снизить относительную погрешность измерения биохимического потребления кислорода с -10,90 до 0,19% для закрытой измерительной ячейки.

8. Использование комплекса методических подходов, учитывающих обмен кислородом между средой инкубации и ее окружением, и оригинальных измерительных средств позволяет снизить относительную погрешность измерения потребления кислорода с -38,63 до 0,19%, а коэффициент вариации измеренных значений - с 8,91 до 2,02%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Моделирование процессов, протекающих в электрохимической измерительной системе при изучении потребления кислорода биологическими объектами, позволило выявить ряд факторов, способствующих заметному снижению точности измерения. Наиболее существенными из них оказались сопутствующие измерению процессы обмена кислородом с атмосферным воздухом и собственной кислородной емкостью измерительной системы. Суммарная погрешность, обусловленная их влиянием, вполне может превышать 38% от измеряемой величины, что фактически исключает количественный подход к изучению окислительного метаболизма.

Разработанные модельные системы, методические подходы и средства измерения позволили определить основные количественные характеристики данных факторов и закономерности их проявления. Показано, что степень воздействия каждого из них существенно зависит от условий, в которых производится измерение. Так, при использовании открытой измерительной ячейки в качестве основного фактора выступает обмен кислорода с атмосферой, тогда как в закрытой погрешность в основном обуславливается влиянием собственной кислородной емкости системы. Данная зависимость объясняется тем, что при полной или частичной изоляции инкубационной среды от атмосферы практически единственным источником для компенсации убыли кислорода из среды инкубации становится собственная кислородная емкость, поэтому в данных условиях ее влияние проявляется в максимальной степени.

Таким образом, процессы обмена кислородом с атмосферой и собственной кислородной емкостью находятся в отношениях обратной взаимообусловленности: снижение или устранение влияния одного из них автоматически усиливает влияние другого. В условиях, когда устранение даже одного искажающего фактора представляется весьма сложным по техническим соображениям, оптимальным выходом, позволяющим снизить погрешность измерения до приемлемого уровня, является описанный в работе комплексный подход, основными составляющими которого являются:

- проведение всех измерений при одинаковом исходном состоянии измерительной системы (п. 3.1, гл. 3);

- устранение осмотических эффектов на мембране закрытого кислородного датчика путем выравнивания осмотического давления инкубационной среды и электролита датчика (п. 3.1, гл. 3);

- динамическая калибровка системы на поступление кислорода из атмосферы (п. 4.1, 4.2, гл. 4) и вычисление на ее основе соответствующей поправки к результату измерения (п. 4.3, гл. 4);

- измерение собственной кислородной емкости системы (п. 5.2, гл. 5) и вычисление соответствующей поправки на основании результатов анализа регистрационных кривых поглощения кислорода (п. 5.3, гл. 5).

Использование данного подхода оказалось достаточно эффективным лишь при условии, что величина собственной кислородной емкости измерительной системы не превышает кислородную емкость среды инкубации и характеризуется высокой скоростью диффузии кислорода через границу раздела фаз емкость-среда. Так как при разработке конструкций датчиков промышленного изготовления данное условие не учитывалось, автором был сконструирован и изготовлен амперометрический кислородный датчик с пониженной кислородной емкостью (ПКЕ), предназначенный для измерения биохимического потребления кислорода в малых объемах инкубационных сред.

Основным результатом использования представленных в работе новых методических и аппаратных средств явилось снижение относительной погрешности измерения потребления кислорода (А) с 38,63 до 0,19%, то есть более чем в 200 раз. Таким образом, погрешность измерения была приведена в полное соответствие с погрешностями используемого оборудования.

Вторым итогом стало заметное улучшение воспроизводимости результатов: коэффициент вариации (Су) снизился с 8,91 до 2,02%, то есть более чем в 4 раза, что также является хорошим показателем для многоступенчатого эксперимента, каковым является измерение метаболического потребления кислорода в малом объеме инкубационной среды.

Таким образом, можно констатировать, что влияние измерительной системы на результат измерения было практически полностью устранено. В результате при изучении потребления кислорода реальными биологическими объектами появилась возможность надежной интерпретации полученных данных как отражения метаболических свойств изучаемого объекта, а не конструктивных особенностей используемых средств измерения.

Следует особо отметить, что большинство из описанных искажающих факторов являются универсальными, то есть не зависящими от принципа работы измерительной системы. Поэтому те же явления, отличающиеся лишь в количественном аспекте, будут наблюдаться и при использовании открытых полярографических электродов, оптических, полупроводниковых, а также любых других кислородных датчиков, как существующих, так и перспективных. По этой причине выявленные в данной работе закономерности и предложенные средства могут заинтересовать не только биохимиков, изучающих количественные проблемы окислительного метаболизма, фотосинтеза и др., но и разработчиков новых средств измерения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миняев, Михаил Владимирович, Тверь

1. Авербух Т.Д. Технология сульфитов / Т.Д. Авербух. - М.: Химия, 1984. -167 с.

2. Агранов Х.И. Электрохимический датчик для определения кислорода в жидких средах / Х.И. Агранов // Бюллетень изобретений. 1979. - № 12. -С. 45-48.

3. Агранов Х.И. Электрохимический анализатор кислорода / Х.И. Агранов // Заводская лаборатория. 1974. - Т.40. - №11. - С. 1332.

4. Агранов Х.И. и др. Электрохимический анализатор кислорода при высоких давлениях / Х.И. Агранов // Приборы и системы управления. 1976. -№11.-С. 34.

5. Адомсон У.А. Физическая химия поверхностей / У.А. Адомсон. М. : Мир, 1979. - 233 с.

6. Альперин В.З. Современные электрохимические методы и аппаратура для анализа газов в жидкостях и газовых смесях / В.З. Альперин, Э.И. Конник, A.A. Кузьмин. М. : Химия, 1975. - 183 с.

7. Альперин В. 3. Современные электрохимические методы и аппаратура для анализа газов в жидкостях и газовых смесях / В.З. Альперин. М. : Химия, 1988.-203 с.

8. Аманназаров А. Методы и приборы для определения кислорода / А. Аманназаров. М.: Химия, 1988. - 143 с.

9. Ананьев Г.М. Датчик кислорода для биологических исследований / Г.М. Ананьев // Сенсоры и датчики физико-химической биологии. Пущино. -1991.-С. 100-105.

10. Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия / Н.С. Ахметов. М. : Высшая школа, 1981. - 679 с.

11. Барковский В.Ф. Основы физико-химических методов анализа / В.Ф. Барковский, Т.Б. Городенцева, Н.Б. Топорова. М. : Высшая школа, 1983. -248 с.

12. Бачило С. М. Регистрация поглощения a'Ag —> b'Hg+ кислорода в растворах / С.М. Бачило, И. Н. Ничипорович, А.П. Лосев // Журнал прикладной спектроскопии. 1998. - №6. - С. 811.

13. Бейли Дж. Основы биохимической инженерии : в 2 т. Т.2. / Дж. Бейли, Д. Оллис. М. : Мир, 1989. - 590 с.

14. Березовский В.А. К методике полярографического определения напряжения кислорода в органах и тканях / В.А. Березовский // Фармакология и токсикология. Киев. - 1966. - С. 260-265.

15. Березовский В.А. Электрохимические и биологические особенности хроноамперометрического определения кислорода / В.А. Березовский // Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. -Киев.- 1968.-С. 98-121.

16. Березовский В.А. О способах оценки результатов хроноамперометрического определения кислорода на открытых индикаторных электродах / В.А. Березовский // Физиологический журнал. 1970. - №8. - С. 1182-1185.

17. Березовский В.А. Электроды для полярографического определения кислорода в биологических объектах / В.А. Березовский // Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. Киев. - 1974. - С. 34-57.

18. Березовский В.А. Напряжение кислорода в тканях животных и человека / В.А. Березовский. Киев : Наукова думка, 1975. - 112 с.

19. Борисов С.М. Новый оптический кислородный датчик, основанный на фосфоресценции катионных водорастворимых Pd(II), Pt(II) и Rh(III) пор-фиринов / С.М. Борисов, В.В. Васильев // Журнал аналитической химии. -2004. Т.59. - №2. - С. 155.

20. Ваня Я. Анализаторы газов и жидкостей / Я. Ваня М. : Энергия, 1970. - 562 с.

21. Виноградов А.Д. Идентификация ионной формы фосфата, сопровождающей активное накопление Ca митохондриями печени крысы / А.Д. Виноградов, Ю.Н. Лейкин // Биохимия. 1971. - №5. - С.1062.

22. Виноградов А.Д. Биохимия митохондрий / А.Д. Виноградов, Ю.Н. Лейкин, Т.Ю. Липская. М.: Изд-во МГУ, 1977. - 65 с.

23. Виноградова E.H. Методы полярографического и амперометрического анализа / E.H. Виноградова. М.: Изд-во МГУ, 1963. - 124 с.

24. Гавриленко В.Ф. Большой практикум по физиологии растений. Фотосинтез. Дыхание / В.Ф. Гавриленко, М.Е. Ладыгина, Л.М. Хандобина. М. : Высшая школа, 1975. - 392 с.

25. Гейровский Я. Основы полярографии / Я. Гейровский, Я. Кута. М. : Мир, 1965.- 559 с.

26. Горская И.А. Выделение митохондрий из сердца крысы / И.А. Горская, И.Д. Шевелева, А.И. Суслова // Новые методы практической биохимии. -М., 1988.-С. 47-50.

27. Горшков В.И. Основы физической химии / В.И. Горшков, И.А. Кузнецов. М.: Изд-во МГУ, 1993. - 336 с.

28. Гройсман А.Ш. Методы определения кислорода в жидкостях / А.Ш. Гройсман, Н.Е. Хомутов // Журнал аналит. химии. 1989. - Т.44. - №12. - С. 2133-2147.

29. Гройсман А.Ш. Растворимость кислорода в растворах электролитов / А.Ш. Гройсман, Н.Е. Хомутов, // Успехи химии. 1990. - Т.59. - №8. - С. 1217-1250.

30. Данкверст П.В. Газожидкостные реакции / П.В. Данкверст. М. : Химия, 1973.- 123 с.

31. Делимарский Ю.К. Электродные процессы и методы исследования в полярографии / Ю.К. Делимарский, A.B. Городысский. Киев : Изд-во АН УССР, 1960. 192 с.

32. Делимарский Ю.К. Полярография на твердых электродах / Ю.К. Делимарский, Е.М. Скобец. Киев : Техника, 1970. - 220 с.

33. Делахей П. Новые приборы и методы в электрохимии / П. Делахей. М. : Наука, 1957. - 493 с.

34. Делахей П. Двойной электрический слой и кинетика электродных процессов / П. Делахей. М. : Мир, 1976. - 315 с.

35. Справочник биохимика / Р. Додсон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс.1. М. : Мир, 1991.-544 с.

36. Доис Э. Количественные проблемы биохимии / Э. Доис. М. : Мир, 1983.- 376 с.

37. Дыхание, фосфорилирование и структура митохондрий печени крыс при действии тироксина in vivo и in vitro / Я.Х. Туракулов, A.K. Мирахме-дов, H.A. Львович, Хусаинова Ф. // Биохимия. 1970. - №2. - С. 349-350.

38. Евтодиенко Ю.В. Влияние pH на окислительное фосфорилирование и поглощение кальция митохондриями печени крысы / Ю.В. Евтодиенко, Л.Ю. Кудзина // Митохондрии. Биохимия и морфология. М., 1967. - С. 18» 23.

39. Захаров А.И. Флуоресцентный датчик для определения растворенного в воде кислорода / А.И. Захаров, Т.И. Гришаева // Журнал аналитической химии. 1996. - Т.51. - №8. - С. 818.

40. Зеленский М.И. О калибровке кислородных электродов / М.И. Зеленский, Г.А. Могилева // Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. Киев. - 1974. - С. 71-77.

41. Зеленский М.И. Полярографическое определение кислорода в исследованиях по фотосинтезу и дыханию / М.И. Зеленский. Л. : Наука, 1986. -140 с.

42. Звягильская P.A. Особенности окисления сукцината митохондриями дрожжей Endomyces magnusii / Р.А.Звягильская, И.М. Коростелева // Митохондрии. Транспорт электронов и преобразование энергии. М., 1976. -С. 73-76.

43. Исаакян JI.A. Электрохимические методы газового анализа в физиологии / Л.А. Исаакян. М.: Наука, 1964. - 79 с.

44. Калиман П.А. Окисление биогенных моноаминов митохондриями некоторых органов кроликов и влияние ингибиторов моноаминоксидазы / П.А. Калиман // Митохондрии. Ферментативные процессы и их регуляция. -М., 1968.-С. 55-58.

45. Капитанов А.Б. Изменение липидного состава мембран митохондрий в ходе сукцинатоксидазной реакции / А.Б. Капитанов, Г.А. Грибанов // Вопросы мед. химии. 1990. - Т.36. - №5 - С. 56-58.

46. Каплан Е.Я. Влияние антиоксидантов на скорость деоксигенации крови животных, подвергшихся воздействию измененной газовой среды / Е.Я. Каплан, В.И. Шубин, И.М. Эпштейн // Космич. биол. и медицина. 1973. -№1. - С. 9-14.

47. Коваленко Е.А. Изменение напряжения кислорода в тканях мозга при действии на организм высоты и перегрузок / Е.А. Коваленко, A.B. Ряжский // Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. -Киев, 1972,-С.53-54.

48. Коваленко Е.А. Полярографическое определение кислорода в организме / Е.А. Коваленко, В.А. Березовский, И.М. Эпштейн. М. : Медицина, 1975.-232 с.

49. Корольков В.И. Напряжение кислорода в мышце сердца и крови в условиях циркуляторной и анемической гипоксии / В.И. Корольков, В.Б. Ко-зинер // Кислородный режим организма и его регулирование. Киев. -1966. - С. 295-298.

50. Кузьмин А.А. Современные методы и аппаратура автоматического контроля и регулирования кислородного режима нефтесодержащих сточных вод в аэрационных очистных сооружениях / А.А. Кузьмин, В.М. Пате-тюк. М.: Изд-во ЦНИИТЭ нефтехимии, 1970. - 78 с.

51. Кулонометрическое определение кислорода растворенного в полярных органических растворителях с электрогенерацией Си (I) ионов / И.Ф. Аб-дуллин, Г.К. Будников, С.С. Филюшина, Ю.Н. Баканина // Журнал аналитической химии. -1998. Т.53. - №6. - С. 568.

52. Кучеренко М.Г. Датчик молекулярного кислорода на основе эффектал

53. О -индуцированной флуоресценции / М.Г. Кучеренко, Г.А. Кецле // Датчики и системы. 1999. - №4. - С. 35.

54. Лайтинен Г.А. Химический анализ / Г.А. Лайтинен. М. : Химия, 1966. -651 с.

55. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1990. - 325 с.

56. Лейкин Ю.Н. Флуоресценция никотинамидадениндинуклеотидов при транспорте Са2+ в митохондриях печени / Ю.Н. Лейкин, А.Д. Виноградов // Биохимия. 1972. - №2. - С. 244.

57. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки / А. Ленинджер. М. : Мир, 1974. - 562 с.

58. Летута С.Н. Люминесцентный способ определения концентрации кислорода / С.Н. Летута, В.А. Бондаренко, Г.А. Кецле // Датчики и системы. -2001.-№9.-С. 27.

59. Лосев А. П. Кинетика -» а^ -флуоресценции молекулярного кислорода в растворах / А. П. Лосев, С. М. Бачило, И. Н. Ничипорович // Журнал прикладной спектроскопии. 1998. - №1. - С. 5.

60. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод / Ю.Ю. Лурье. М.: Химия, 1984. - 448 с.

61. Меерсон Ф.З. Сократительная функция и эффективность использования сердцем кислорода при адаптации к гипоксии / Ф.З. Меерсон, Н.П. Ларионов // Кардиология. 1995. - Т.15. - №7. - С. 70-78.

62. Методы изучения мембран растительных клеток. Л. : Изд-во ЛГУ, 1986.-С. 127-128.

63. Методы практической биохимии / ред. Э. Гриффитц, Б. Уильяме, К. Уилсон. М.: Мир, 1978. - 510 с.

64. Миллер С.Д. Опыт замены ртутного капельного электрода электродом из твердых металлов / С.Д. Миллер // Сб. трудов Всесоюзн. конференции по аналитической химии. М., 1961. - Т.2. - С. 551-558.

65. Миняев М.В. Гальванический кислородный датчик с пониженной собственной кислородной емкостью / М.В. Миняев // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. Тверь. -2001.-С. 154-161.

66. Миняев М.В. Собственная кислородная емкость закрытых кислородных датчиков / М.В. Миняев, И.И. Гугушвили // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. Тверь. -2001.-С. 161-166.

67. Миняев М.В. Влияние толщины полиэтиленовой мембраны на работу полярографического кислородного датчика закрытого типа / М.В. Миняев, Н.О. Иванова // Вестник ТвГУ: биология и экология. 2005. -Т. 10. - №4. С. 84-87.

68. Мясников И.А. Полупроводниковые датчики для определения свободных радикалов и молекулярного кислорода в жидкой полярной среде / И.А. Мясников, Л.А. Обвинчева, А.П. Сысоева // Журнал физической химии -2004. Т.78. - №2. - С. 178.

69. Назаров Н.Г. Метрология. Основные понятия и математические модели / Н.Г. Назаров. М.: Высшая школа, 2002. - 348 с.

70. Накагаки М. Физическая химия мембран / М. Накагаки. М. : Мир, 1991.-255 с.

71. Некрасов H.B. Общая и неорганическая химия / Н.В. Некрасов. М. : Химия, 1976.-412 с.

72. Николаева JI.B. Схема первичной оценки состояния митохондрий в зависимости от функциональной нагрузки на дыхательную цепь / JI.B. Николаева, М.Н. Кондрашова // Митохондрии: структура и функции. М., 1966. -С. 83-85.

73. Николе Д.Д. Биоэнергетика: введение в хемиосмотическую теорию / Д.Д. Николе. М.: Мир, 1985. - 340 с.

74. Никулин В.Н. Катодное восстановление кислорода в зависимости от ' ориентации и структуры кристаллитов электрода. Восстановление 02 наразличных гранях монокристалла серебра / В.Н. Никулин // Журнал физ. химии. 1961. -Т.35. -№1. - С. 84-89.

75. Определение кислорода в воде и газовой фазе с использованием жидкостной хроматографии / Г.И. Барам, A.JI. Верещагин, JI.A. Кочанова, Г.Г. Шамовский // Журнал аналитической химии. 1999. - Т.54. - №8. - С. 739.

76. Ормонт Б.Ф. Структура неорганических веществ / Б.Ф. Ормонт. М. : Химия, 1950. - 798 с.

77. Особенности использования микродозаторов с полиэтиленовыми наконечниками для калибровки кислородных датчиков / М.В. Миняев, М.Д.

78. Платонова, К.В. Костина, Л.И. Ворончихина // Вестник ТвГУ: биология иэкология. 2006. -Т.22 - №5. С. 53-56.

79. Павленко И .Г. Электровосстановление кислорода на ртутно-серебряных катодах: автореф. дис. канд. мед. наук / И.Г. Павленко. М., 1958.- 18 с.

80. Попов Т.А. Влияние ингибитора дыхательного фосфорилирования а,2-4-динитрофенола на потребление кислорода мышечной тканью / Т.А. Попов, И.П. Березин // Кислородный режим организма и его регулирование. -Киев. 1966. - С. 206-208.

81. Разбавление среды инкубации бескислородной добавкой как вероятная причина «эффекта быстрого потребления кислорода» / М.Б. Белякова, М.В. Миняев, А.А. Егорова, Л.И. Ворончихина // Вестник ТвГУ: биология и экология. 2006. -Т.22 - №5. С. 57-60.

82. Разумович А.Н. Измерение некоторых функциональных показателей митохондрий при остром В |-авитаминозе / А.Н. Разумович, И.Л. Фольб // Митохондрии. Ферментативные процессы и их регуляция. М., 1968. - С. 63-67.

83. Разумовский С.Д. Кислород элементарные формы и свойства / С.Д. Разумовский. - М.: Химия, 1979. - 183 с.

84. Редди Т.Г. Влияние 0,Ь-а-токоферолацетата, витамина В)2 и гидроли-зата глюкозоциклоацетоацетата на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени крысы при некрозе / Т.Г. Редди, М.С. Нат // Биохимия. 1972. - №3. - С.649.

85. Рейшахрит Л.С. Электрохимические методы анализа / Л.С. Рейшахрит. Л.: Изд-во ЛГУ, 1970. - 100 с.

86. Родионов А.К. Использование анализаторов растворенного кислорода при решении актуальных экологических задач / А.К.Родионов, Ю.Н. Зиновьев // Экологические системы и приборы. 2003. - №9. - С. 25-27.

87. Роскошный В.Г. Электрохимический анализатор кислорода / В.Г. Роскошный // Приборы и системы управления. 1983. - №10. - С. 25-26.

88. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / ред. Г.М. Франк. М.: Наука, 1973. - 220 с.

89. Русинова Н.Г. Полярографическое определение активности рибулозо-дифосфатоксигеназы / Н.Г. Русинова, Ле Тхи Лай Оань // Биохимические методы. М., 1980. - С. 100-102.

90. Сабадвари Ф. История аналитической химии / Ф. Сабадвари, А. Робинсон -М.: Мир, 1984.-304 с.

91. Сабадош Д. Регулирование биосинтеза киназина и структурного белка митохондрий компонентами фосфатного цикла / Д. Сабадош // Биохимия. -1971.-№2.-С. 402.

92. Сейц И.Ф. Взаимодействие дыхания и гликолиза в клетке и сопряженное фосфорилирование / И.Ф. Сейц. Л.: Медгиз, 1961. -151 с.

93. Семихатова O.A. Манометрические методы изучения дыхания и фотосинтеза растений / O.A. Семихатова, М.В. Чулановская. М. : Наука, 1965. -201с.

94. Словарь-справочник по физиологии и патофизиологии дыхания / ред. В.А. Березовский. Киев : Наукова думка, 1984. - 256 с.

95. Соловьев Л.Г. Опыт применения оксиметра ИОАН для непрерывного определения кислорода, образующегося в процессе фотосинтеза / Л.Г. Соловьев, A.M. Цветкова// Океанология. 1966. - Т.6. - Вып.З. - С. 542-547.

96. Сонгина O.A. Амперометрическое титрование / O.A. Сонгина, В.А. Захаров. М.: Химия, 1979. - 304 с.

97. Справочник химика : в 4 т. Т.4. / ред. Б.П. Никольский. М. : Химия, 1967. - 920 с.

98. Умбрейн В.В. Манометрические методы изучения тканевого дыхания / В.В. Умбрейн. М.: Изд-во иностранной литературы, 1951. - 151 с.

99. Фарзане Н.Г. Технологические измерения и приборы / Н.Г. Фарзане. -М.: Высшая школа, 1989. 456 с.

100. Физика / ред. A.A. Выгодский. М.: Просвещение, 1993. - 416 с.

101. Физическая химия / ред. К. С. Краснов. М. : Высш. школа, 1982. -687 с.

102. Фрумкин А.Н. Адсорбционные явления и электрохимическая кинетика / А.Н. Фрумкин // Успехи химии. 1955. - Т.24. - Вып.8. - С. 933-934.

103. Хватова Е.М. Сравнительная оценка влияния некоторых регуляторных факторов на энергетическую функцию митохондрий мозга / Е.М. Хватова, Г.В. Шуматова // Митохондрии. Транспорт электронов и преобразование энергии. М., 1976. - С. 182-189.

104. Хохлова Л.П. Выделение и изучение функций митохондрий растений / Л.П. Хохлова. Казань : Изд-во Казанского ун-та, 1988. - 126 с.

105. Цыпин Л.В. К вопросу о повышении точности и надежности устройств для амперометрического метода определения кислорода / Л.В. Цыпин // Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. Киев. - 1968. - С. 140-148.

106. Шольц К.Ф. Ячейка для амперометрического определения кислорода / К.Ф. Шольц, Д.Н. Островский // Методы современной биохимии. М., 1975.-С. 55.

107. Шольц К.Ф. Амперометрическое определение ферроцианида в присутствии субклеточных структур / К.Ф. Шольц, И.М. Мосолова, Л.А. Дро-нова // Биохимические методы. М., 1980. - С. 147-150.

108. Эпштейн И.М. Метод электрохимической регистрации кислородного режима в тканях животного / И.М. Эпштейн // Бюлл. экспер. биологии. -1960.-№12.-С. 104-107.

109. Эткинс П. Физическая химия : в 2 т. Т.2. / П. Эткинс. М.: Мир, 1980. - 230 с.

110. A sensitive measurement of oxygen uptake rate using a optochemical sensor / Chung-Ming Chi, L.N. Frautschy, F.B. Cerra, Wei-Shou Hu // Biotechnology Tech. 1993. - V.7. - №2. - P. 99-104.

111. Adverse Effects of Hyperoxemia During Cardiopulmonary Bypass / P.O. Joachimsson, F. Sjöberg, M. Forsman, M. Johansson, H.C. Ahn, H. Rutberg // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1996. - V.l 12. - №9. - P. 812.

112. Aiba S. Rapid determination of oxygen permeability of polymer membranes / S. Aiba, M. Ohashi, Schin Yow Huang // Industr. Eng. Chem. Fundament. 1968. - V.7. - № 3. - P. 497-502.

113. Amao Y. Probes and Polymers for Optical Sensing of Oxygen / Y. Amao // Microchimica Acta. 2003. - V. 143. - №1. - P. 1-12.

114. An electrochemical Nafion® matrix oxygen sensor and the evaluation of oxygen permeation in coated films / Y. Gao, H. Kita, Y. Watanabe, K. Sima // J. of Appl. Electrochem. 1993. - V.23. - №11. - P. 1102 - 1106.

115. Armstrong W. Stem Photosynthesis not Pressurized Ventilation is Responsible for Light-enhanced Oxygen Supply to Submerged Roots of Alder (Alnus glutinosa) / W. Armstrong, J. Armstrong // Ann. Bot. 2005. - V.96. - №9. - P. 591-612.

116. Bard A.J. Application of controlled potential coulometry to the study of electrode reactions / A.J. Bard, K.S.V. Santhanam // Electroanal Chem. / Marcel Dekker. N.Y., 1970. - V.4. - P. 215.

117. Bassnett S. The effect of elevated intraocular oxygen on organelle degradation in the embryonic chicken lens / S. Bassnett, R. McNulty // J. Exp. Biol. -2003.-V.206.-№12.-P. 4353.

118. Battino R. The Solubility of Gases in Liquids / R. Battino, H.L. Clever // Chem. Rev. 1966. - V.66. - № 4. - P. 395.

119. Battino R. The Solubility of Oxygen and Ozone in Liquids / R. Battino, T.R. Rettich, T. Tominaga //J. Phys. and Chem. Ref. Data. 1983. - V.12. - №2. -P. 163.

120. Baucke F.G.K. High-temperature oxygen sensors for glass-forming melts / F.G.K. Baucke // Fresenius' J. of Anal. Chem. 1996. - V.356. - №3-4. - P. 209.

121. Brina R. Electrogenerated chemiluminescence : Part XLVIII. Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence of bis(2,4,6-trichlorophenyl) ox-alate-luminescer systems / R. Brina, A.J. Bard // J. Electroanal. Chem. 1987. -V. 238.-№1.-P. 277-295.

122. Cater D.B. Apparatus and technique for the quantitative measurement of oxygen tension in living tissues / D.B. Cater, J.A. Silver, G.M. Wilson // Proc. Roy. Soc. 1959. - V. 151.-P. 256-276.

123. Cerebral oxygen vasoreactivity and cerebral tissue oxygen reactivity / A.J. Johnston, L.A. Steiner, A.K. Gupta, D.K. Menon // Br. J. Anaesth. 2003. -V.90. - №6. - P. 774.

124. Comparison of tumor and normal tissue oxygen tension measurements using OxyLite or microelectrodes in rodents / R.D. Braun, J.L. Lanzen, S.A. Snyder, M.W. Dewhirst // J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2001. - V.280. - №6. -P. 2533.

125. Davies P.W. Microelectrodes for measuring local oxygen tension in animal tissues / P.W. Davies, F. Brink // Rev. Sci. Instr. 1942. - V. 13. - P. 524-533.

126. Degn H. Continuous measurement of dissolved gases in biochemical systems with the quadrupole mass spectrometer / H. Degn, R.P. Cox, D. Lloyd. // Methods of Biochemical Analysis. 1985. - V.31. - P. 165-194.

127. Deshpande R.R. On-line oxygen uptake rate and culture viability measurement of animal cell culture using microplates with integrated oxygen sensors / R.R. Deshpande, E. Heinzle // Biotechnology Letters. 2004. - V.26. - №9. - P. 763-767.

128. Diaz I. Kinetics of heterogeneous oxidation of diluted sulphite solutions /1. Diaz//Hung. J. Ind. Chem. 1987. - V.5. - P. 213-215.

129. Endogenous NO regulates superoxide production at low oxygen concentrations by modifying the redox state of cytochrome c oxidase / M. Palacios-Callender, M. Quintero, V.S. Hollis, R.J. Springett, S. Moncada // PNAS. -2004. -V.101. №5. - P. 7630 - 7635.

130. Evidence for a preglomerular oxygen diffusion shunt in rat renal cortex / H.J. Schurek, U. Jost, H. Baumgartl, H. Bertram, U. Heckmann // J. Physiol. Renal. Physiol. 1990. - V.259. - №12. - P. 910.

131. Gloves G.A.H. The membrane Oxygenerator. Extracorporeal circulation / G.A.H. Gloves, W.E. Neville // Ch.Thomas. 1958. - №3. - P. 83.

132. Guth U. Electrochemical solid electrolyte gas sensors hydrocarbon and NOx analysis in exhaust gases / U. Guth, J. Zosel // Ionics. - 2004. - V.10. - №5-6.-P. 366-377.

133. Hersch P.A. Trace monitoring in gases using galvanic systems / P.A. Hersch // Anal. Chem. 1960. - V.32. - №8. - P. 1030-1034.

134. Hitchman M.L. Measurment of dissolved oxygen / M.L. Hitchman N.Y. : John Wiley and Sons Inc, 1978. - 71 p.

135. Indomethacin lowers optic nerve oxygen tension and reduces the effect of carbonic anhydrase inhibition and carbon dioxide breathing / D.B. Pedersen, T.

136. Eysteinsson, E. Stefänsson, J.F. Kiilgaard, M. la Cour, K. Bang, P.K. Jensen // Br. J. Ophthalmol. 2004. - V.88. - №8. - P. 1088 - 1091.

137. Influence of Water Vapor on the Response of Mg-Doped SrTi03 Ceramic Oxygen Sensors / Hong Zheng, O.T. Sörensen, Liu Xin Gqin, H. Jensen // J. of Electroceramics. 1999. - V.3. - №3. - P. 301 - 310.

138. Jeroschewski P. A flow system for calibration of dissolved oxygen sensors / P. Jeroschewski, D. zur Linden // Fresenius' J. of Anal. Chem. 1997. - V.358. - №6. - P. 677 - 682.

139. Joyner J.L. Possible Roles of Sulfur-Containing Amino Acids in a Chemo-autotrophic Bacterium-Mollusc Symbiosis / J.L. Joyner, S.M. Peyer, R.W. Lee // Biol. Bull. 2003. - V.205. - №12. - P. 331.

140. Kenten R. Gasometric analysis in plant investigation / R. Kenten // Moderne methoden der Pflancenanalyse. Berlin. - 1956. - Bd.l. - S. 415.

141. Killing of Bacillus Spores by Aqueous Dissolved Oxygen, Ascorbic Acid, and Copper Ions / J.B. Cross, R.P. Currier, D.J. Torraco, L.A. Vanderberg, G.L. Wagner, P.D. Gladen // Appl. Envir. Microbiol. 2003. - V.69. - №4. - P. 2245 -2252.

142. Klots C.E. Isotope effect in the solution of oxygen and nitrogen in distilled water / C.E. Klots, B.B. Benson // J. Chem. Phys. 1963. - V.38. - №4. - P. 890892.

143. Knapp H. Phase equilibria for the design of gas wash systems: Experimental techniques / H. Knapp, S. Zeck, R. Langhorst // Chem. Eng. and Process. -1987. V.21. - №1. - P.25-32.

144. Kraus D.W. Sulfide consumption by mussel gill mitochondria is not strictly tied to oxygen reduction: measurements using a novel polarographic sulfide sensor / D.W. Kraus, J.E. Doeller // J. Exp. Biol. 2004. - V.207. - №10. - P. 3667 -3679.

145. Kreuzer F.Ed. Oxygen pressure recording in gases, fluids and tissaes / F.Ed. Kreuzer, S. Karger. Basel:, 1969. - 248 p.

146. Kuznetsov V.V. Reversed Flow-Injection Photometric Analysis for the Monitoring of Dissolved Oxygen in Water / V.V. Kuznetsov, M.V. Murasheva. // J. Anal. Chem. 1996. - V.51. - №10. - P. 993.

147. Glucose Utilization Is Essential for Hypoxia-Inducible Factor la-Dependent Phosphorylation of c-Jun / K.R. Laderoute, J.M. Calaoagan, M. Knapp, R.S. Johnson // Mol. Cell. Biol. 2004. - V.24. - №5. - P. 4128 - 4137.

148. Laitinen H.A. A study of diffusion processes by electrolysis with micro-electrodes / H.A. Laitinen, J.M. Kolthoff// J. Am Chem. Soc. 1939. - V.61. -P. 3344-3349.

149. Lee E.D. Luminescence ratio indicators for oxygen / E.D. Lee, T.C. Werner, W.R. Seitz // Anal. Chem. 1987. - V.59. - №2. - P. 279-283.

150. Liposomal NAD+ prevents diminished 02 consumption by immunostimu-lated Caco-2 cells / A.U. Khan, R.L. Delude, Y.Y. Han, P.L. Sappington, X. Han, J.A. Carcillo, M.P. Fink // J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2002. -V.282. - №5. - P. 1082.

151. Luminescence-Based Oxygen Sensors: ReL(CO)3Cl and ReL(CO)3CN Complexes on Copolymer Supports / K.A. Kneas, W. Xu, J.N. Demas, B.A. DeGraff, A.P. Zipp // J. of Fluorescence. 1998. - V.8. - №4. - P. 295 - 300.

152. Mancy K.H. A galvanic cell oxygen analyzer / K.H. Mancy, D.A. Okun, C.N. Reilley // J. Electroanal. Chem. 1962. - V.4. - №2. - P. 65-92.

153. Maskell W.C. Solid state potentiometric oxygen gas sensors / W.C. Maskell, B.C.H. Steele // J. of Applied Electrochem. 1986. - V.16. - №4. - P. 475489.

154. Monitor and control of blood and tissue oxygen tensions // Soc. Artific. Intern. Organs. 1956. - V.2. - P. 41-43.

155. Moran A.L. Energy Metabolism During Larval Development of Green and White Abalone, Haliotis fiilgens and H sorenseni / A.L. Moran, D.T. Manahan // Biol. Bull. 2003. - V.204. - №6. -P. 270.

156. Nishri A. Solubility of oxygen in the Dead Sea brine / A. Nishri, S. Ben-Yaakov // Hydrobiologia. 1990. - V. 197. - №1. - P. 99-104.

157. Optical Sol-Gel-Based Dissolved Oxygen Sensor: Progress Towards a Commercial Instrument / C.M. Mcdonagh, A.M. Shields, A.K. Mcevoy, B.D. Maccraith, J.F. Gouin // J. of Sol-Gel Sci. and Tech. 1998. - V.13. - №1-3. - P. 207-211.

158. Ortmann C. Energy metabolism and valve closure behaviour in the Asian clam Corbicula fluminea / C. Ortmann, M.K. Grieshaber // J. Exp. Biol. 2003. -V.206. - №11. - P. 4167.

159. Oxygen Sensors Based on a Quenching of Tris-(4,7-diphenyl-l,10-phenanthroline) ruthenium (II) in Fluorinated Polymers / A.M. Morin, Wenying Xu, J.N. Demas, B.A. DeGraff// Journal of Fluorescence. 2000. - V.10. - №1. -P. 7-12.

160. Oxygen diffusion and consumption of aortic valve cusps / K.L. Weind, D.R. Boughner, L. Rigutto, C.G. Ellis // J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001. -V.281. - №12. - P. 2604.

161. Oxygen Tension in Rabbit Vitreous and Lens / J. Liang, I. Barazabetto, L. Zheng, J. Dillon // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. - V.43. - №12. - P. 2380.

162. Parker D. A new approach to inline gas monitoring: development of an oxygen sensor / D. Parker, D.T. Delpy, D.N. Halsall // Med. and Biol. Engineering and Computing. 1983. - V.21. - №2. - P. 134 - 137.

163. Performance of calorimetric methods for the investigation of microbial systems in combination with additional sensors / F. Ullrich, M. Winkelmann, R. Hüttl, G. Wolf// Anal, and Bioanal. Chem. 2005. - V.383. - №5. - P. 747-751.

164. Portable Fibre Optic Oxygen Sensor Based on Room-Temperature Phosphor escence Lifetime / J.M. Costa-Fernandez , N. Bördel , J.C. Campo, F.J. Ferrero , M.A. Perez, A. Sanz-Medel // Microchimica Acta. 2000. - V.134. -№3-4.-P. 145-152.

165. Ragheb J. Editorial III: Tissue oxygen tension (PT02) in anaesthesia and perioperative medicine / J. Ragheb, D.J. Buggy // Br. J. Anaesth. 2004. - V.92.- №4. P. 464 - 468.

166. Ramamoorthy R. Oxygen sensors: Materials, methods, designs and applications / R. Ramamoorthy , P.K. Dutta, S.A. Akbar // J. of Materials Sei. 2003. -V.38. - №21. - C. 4271-4282.

167. Regulation of tissue oxygen levels in the mammalian lens / R. McNulty, H. Wang, R.T. Mathias, B.J. Ortwerth, R.W. Truscott, S. Bassnett // J. Physiol. -2004. V.559. - №9. - P. 883 - 898.

168. Richter H.G. Thallium-204 Radiometric Determination of Dissolved Oxygen in Water / H.G. Richter, A.S. Gillespie //Anal. Chem. 1962. - V.34. - №9. -P. 1116.

169. Schönweger G. Temperature-dependent development of cardiac activity in unrestrained larvae of the minnow Phoxinus phoxinus / G. Schönweger, T. Schwerte, B. Pelster // J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 2000.- V.279. №11. - P. 1634.

170. Schubert F. Plant tissue-based amperometric tyrosine electrode / F. Schubert, U. Wollenberger, F. Scheller // Biotechnology Letters. 1983. - V.5. - №4.- P. 239-242.

171. Separation of electrode reactions in multi electrode amperometric sensors / S.L. Somov, G. Reinhardt, U. Guth, U. Schonauer, W. Gilpe// Ionics. 1995. -V.l.-№5-6.-P. 514-520.

172. Stock J. Amperometric titrations / J. Stock. N.Y.: Intersci., 1965. - 230 p.

173. Tanaka S. Measurement of concentration and oxidation rate of S(IV) in rainwater in Yokahama / S. Tanaka, K. Yamanaka, Y. Hashimoto // Japan. ACS Symp. Ser. 1987. - V.349. - P. 158-69.

174. The cutaneous uptake of atmospheric oxygen contributes significantly to the oxygen supply of human dermis and epidermis / M. Stucker, A. Struk, P. Altmeyer, M. Herde, H. Baumgartl, D.W. Lubbers // J. Physiol. 2002. - V.538. - №2. - P. 985.

175. The influence of environmental P02 on hemoglobin oxygen saturation in developing zebrafish Danio rerio / S. Grillitsch, N. Medgyesy, T. Schwerte, B. Pelster // J. Exp. Biol 2005. - V.208. - №1. - P. 309 - 316.

176. Thompson J.K. Separate Spatial Scales Determine Neural Activity-Dependent Changes in Tissue Oxygen within Central Visual Pathways / J.K. Thompson, M.R. Peterson, R.D. Freeman // J. of Neuroscience. 2005. - V.25. -№9. - P. 9046 - 9058.

177. Tsai A.G. Oxygen Gradients in the Microcirculation / A.G. Tsai, P.C. Johnson, M. Intaglietta // Physiol. Rev. 2003. - V.83. - №7. - P. 933.

178. Tumor-dependent Kinetics of Partial Pressure of Oxygen Fluctuations during Air and Oxygen Breathing / L.I. Cardenas-Navia, D. Yu, R.D. Braun, D.M. Brizel, T.W. Secomb, M.W. Dewhirst // Cancer Res. 2004. - V.64. - №9. - P. 6010 - 6017.

179. Vanderkooi J.M. Oxygen in mammalian tissue: methods of measurement and affinities of various reactions / J.M. Vanderkooi, M. Erecinska, I. A. Silver // J. Physiol. Cell. Physiol. 1991. - V.260. - №6. - P. 1131.

180. Verslues P.E. Root Growth and Oxygen Relations at Low Water Potentials. Impact of Oxygen Availability in Polyethylene Glycol Solutions / P.E. Verslues, E.S. Ober, R.E. Sharp // Plant Physiology/ 1998. - V.l 16. - №4. - P. 1403.

181. Vishnoi G. A New Plastic Optical Fiber Sensor for Oxygen Based on Fluorescence Enhancement / G. Vishnoi, M. Morisawa, S. Muto A // Optical Review. 1998. - V.5. - № 1. - P. 13 -15.

182. Vitek V. Polarographic studies with the dropping mercury cathode. P. LVII. The estimation of oxygen contained in gases and solution / V. Vitek // Collect. Czech. Chem. Communs. 1935. - V.7. - №7. - P. 537-547.

183. Warner H. An oxygen partial pressure sensor / H. Warner // Med. and Bio. Engineering and Computing. 1963. - V.l. - №1. - P. 79-84.

184. Wilcock, RJ. Solubility of oxygen-nitrogen mixture in water / RJ. Wil-cock, R. Battino // Nature. 1974. - V.252. - P. 614-615.

185. Winmill R.E. Development of the respiratory response to hypoxia in the isolated brainstem of the bullfrog Rana catesbeiana / R.E. Winmill, A.K. Chen, M.S. Hedrick // J. Exp. Biol. 2005. - V.208. - №1. - P. 213 - 222.

186. Zuev B.K. Solid electrolyte sensor as a detector for gas chromatographic determination of combustible contaminants in air / B.K. Zuev, A.Yu. Olenin // Russian J. of Anal. Chemi. 2006. - V.61. - №2. - P. 147-152.

Информация о работе

Миняев, Михаил Владимирович
кандидата биологических наук
Тверь, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы