Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные мишени и молекулярные механизмы радиосенсибилизирующего действия нитроимидазолов, нитрофуранов и других нитросоединений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Клеточные мишени и молекулярные механизмы радиосенсибилизирующего действия нитроимидазолов, нитрофуранов и других нитросоединений"

' 0 г. Г О

"--- о ( и _ .г,.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.Н.СЕМЕНОВА

На права* рукописи

КУРОПТЕВА Зоя Вениаминовна

КЛЕТОЧНЫЕ МИШЕНИ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАДИОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ НИТР0ИМИДА30А0В, НИТРОФУРАНОВ И ДРУГИХ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание учоной степени доктора биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Институте химической физики имени H.H. Семенова РАН.

.Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Л.А. Блюменфельд доктор физико-математических наук, профессор Э.К. Рууге доктор биологических наук И.К. Коломийцевп

Ведущая организация: Научно-исследовательский Институт медицинской радиологии РАМН

на заседании Специализированного Совета Д.002.26.07 при Институте химической физики РАН.

Адрес: 117977, Москва, В-334, ГСП-1, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке Института химической Ямзикп РАН.

Автореферат разослан " Т992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат химических наук U.A. Смотряева .

Защита состоится

.„.ij ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ - Ай^укдьность проблемы. Одной из наиболее важных проблем в лучевой терапии злокачественных новообразований и радиобиологии является проблема преодоления резистентности гипоксических клеток опухолей к действию радиации. Гипоксические клетки, содержащиеся практически ео всех исследованных солидных опухолях, более резистентны к действию радиации, чем нормально оксигени-рованные клетки тканей, и в настоящее время считают, что именно присутствие радиорезистентных гипоксических клеток в опухоли является основной причиной, ограничивающей эффективность радиотерапии опухолей. Поскольку гипоксические клетки содержатся преимущественно в опухолях и практически отсутствуют в нормальных тканях, имеются условия для избирательной радиосенсибилизации опухолей. Существует несколько способов преодоления радиорезистентности опухолей - это фракционированное облучение, использование частиц с большими ЛПЗ, таких как нейтроны и протоны, применение гипербарического кислорода, гипертермия, гипергликемия и др. (Desher Е. , Gray L. , 1959, Ellis S. , 1967).

Но одни из этих способов не обеспечивают необходимого усиления радиационного поражения опухолей, другие не всегда возможно использовать из-за трудностей технической реализации (как, например, частицы с высоким значением ЛПЭ). Одним из наиболее перспективных и.доступных в настоящее время путей повышения эффективности радиотерапии опухолей является использование электроноакцепторных радиосенсибилизаторов гипоксических клеток, среди которых наиболее эффективными при использовании в экспериментальной и клинической радиотерапии оказались производные нитроимидазолов (J. С. Asqui th et. al. , 1974; R. L. Wi llson et. al., 1974, a E. Adams et. al., 1984, Пелевина И. И. и co-авт. ,1978, Рябченко Е И. и соавт. , 1982, Киселева Е. С., Дарь-ялова С. JL,i984, и др.). Но использование исследованных соединений в клинике ограничено или недостаточной степенью радиосенсибилизации, или высокой токсичностью, поэтому актуальными остаются поиск и создание соединений с более выраженными радиосенс ибилизируюсими свойствами и меньшей токсичностью. Для целенаправленного поиска таких соединений необходимо знание молекулярных механизмов их биологического действия и тех к.т'-точннх событий, которые е наибольшей степени ответственны за повышение

- 2 -

радиочувствительности гилоксических клеток.

В настоящее время имеется большое количество исследований по совместному действию радиации и нитросоединений на гипокси-ческие клетки (G. Е. Adams et. al., 1976; P. W. Sheldon et. al. , 1974; И. И. Пелевина и др. , 1978, 1984; НИ. Рябченко, 1985; J. М. Brown, 1985) и по цитотоксическому действию нитроимидазолов СЕ. J. Hall et. al., 1975; A. J. Varghese et. al. , 1976; J. E. Biaglow et. al. , 1986). Но молеку.чяоные механизмы сочетанного действия радиации и нитросоединений остаются во многом неясными. Мало информации имеется о механизмах совместного действия этих факторов непосредственно на опухоли животных. Практически отсутствует информация о влиянии нитросоединений на первичные радиационные свободнорадикальные повреждения клеточных компонентов, которые являются инициаторами развития дальнейших повреждений в клетке.

Дель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярных механизмов радиосенсибилизирующего действия нитросоединений, а также путей биотрансформации их в организме животных и влияния на метаболические процессы в тканях опухолей и органов животных. В качестве основных задач исследования были поставлены следующие:

1. Изучить методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии влияние электроноакцепторных нитросоединений на первичные ради-ационно-индуцированные повреждения клеточных компонентов•тканей опухолей и органов животных, для чего провести сравнительный .анализ относительных выходов радикалов биомакромолекул в тканях после введения животным нитросоединений и без введения.

2. Методами ЭПР и 31-Р ЯМР изучить изменения метаболических процессов в тканях опухоли и органов животных при совместном действии нитросоединений и радиации.

3. Изучить клеточные мишени действия ряда нитрофуранов, нитроимидазолов и других нитросоединений.

4. Изучить методом ЭПР пути биотрансформации нитрофуранов и нитроимидазолов -в организме животных.

Б. Установить новые аспекты молекулярного механизма радио-сенсибилизирующего действия нитросоединений.

Научная новизна В работе hoлущены новые данные, вносящие

существенный вклад в понимание молекулярных механизмов радио- • сенсибилизирующего действия нитросоединений, путей биотрансформации этих соединений в организме животных и влияния их ла метаболические процессы в тканях опухолей и органов животных. Впервые сделан вывод о радиационно-индуцированном усилении цитотоксического действия нитроимидазолов как основном факторе в механизме их радиосенсибилизиругацего действия.

Впервые показано, что при облучении тканей опухоли и органов животных в присутствии нитроимидазолов образуется значительное количество анион-радикалов нитрогрулпы этих соединений,' при этом снижается выход радиационных повреждений биомакромолекул клетки. Установлено соотношение между относительными выходами радиационно-индуцированных радикалов биомакромолекул клеток, анион-радикалов нитроимидазолов и гидроксильных радикалов. Показано, что присутствие миэонидазола в тканях приводит к преимущественному снижению выхода радиационно-индуцированных радикалов Н-аддуктов тиминоеых оснований ЛКК и липидных компонентов мембран. Установленное снижение уровня радиационйо-индуцированных радикалов биомакромолекул в тканях с нитроимидазолами, образование при этом значительного количества анион-радикалов нитроимидазолов, а также увеличение в облученной опухоли с кит-роимидазолами содержания нитрозильных комплексов гембелков свидетельствуют о том, что основным Фактором в механизме радиосен-сибилизирукщего действия нитросоединений является радиационно- индуцированное усиление цитотоксического действия этих соединений за счет увеличения содержания продуктов неполного восстановления нитрогруппы. Динамика накопления и интенсивность сигналов ЭПР нитрозильных комплексов гембелков в тканях опухолей при совместном действии радиации и препаратов могут быть использованы при оценке радиосенсибилизирующих свойств нитросоединений. Впервые показано, что нитроимидазолы приводят к увеличение выхода радиационно-индуцированных радикалов аскорбиновой кислоты, что может явиться важным вкладом в понимание механизмов радиосенсибилизирушего и цитотоксического действия нитроимидазолов.

Впервые установлено, что нитроимидазолы, нитрофураны, нитроглицерин в организме животных и в гомогенатах тканей подвер-

гаются биотрансформации с образованием оксида азота, о чем свидетельствует появление в спектрах ЭПР тканей органов и крови животных в первые часы после введения этих соединений интенсивных сигналов ЭПР нитроэильных комплексов Гем-Ю и Ре-Б-МО. Установлено, что введение мизонидазола приводит к ингибированию рибонуклеотидредуктазы - фермента, играющего важную роль в синтезе ДНК.' Впервые изучены изменения энергетического метаболизма тканей опухоли при совместном действии мизонидазола и радиации и показано, что облучение усиливает токсическое действие мизонидазола, связанное с нарушением энергетического метаболизма клеток.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят существенный вклад в развитие представлений о молекулярных механизмах действия радиосенсибилизаторов гипоксических клеток опухолей и могут быть использованы при разработке новых соединений для радиотерапии опухолей и прогнозирования их эффективности.

Предложенные и обоснованные в диссертационной работе аспекты молекулярных механизмов радиосенсибилизирующего действия электроноакцепторных нитросоединений, основанные на эффекте ра-диационно-индуцированного усиления цитотоксического действия этих соединений, являются теоретическим обоснованием путей поиска и создания новых, более активных и менее токсичных. ( по сравнению с используемыми в клинике нитроимидазолами) соединений для повышения эффективности лучевой терапии опухолей.

Разработанные методические подходы, основанные на регистрации методом ЭПР анион-радикалов нитросоединений и нитроэильных комплексов гемсодержащих белков Гем-МО в опухоли при совместном действии нитросоединений и радиации, могут быть использованы на практике при отборе и проверке эффективности новых радиосенсибшшэаторов для лучевой терапии опухолей.

Способ регистрации методом ЭПР радиационно-индуцированных анион-радикалов нитрогруппы может быть использован для изучения' распределения нитросоединений в организме, динамики накопления и выведения их из тканей органов и крови животных.

Результаты работы использованы-в монографии М. К.' Пулато-вой, Г. Т. Рихиревой, 3. В. Куроптевой "Электронный парамагнитный

' - 5 -

резонанс в молекулярной радиобиологии", Москва: Знергоатомиз-дат, 1989.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались: на Всесоюзной конференции "Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей" (Обнинск, 1982), на 8 Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевом поврежде-нии"(Ленинград, 1982), на 14 Ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 1984); на Всесоюзной конференции "Модификация радиочувствительности в экспериментальных условиях" (Фрунзе, 1986); на Всесоюзных конференциях "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1985, 1989, 1990); на 19 Ежегодном совещании европейских обществ ра-диобиологоов (Прага, 1985); на Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей" (Черноголовка, 1987); на I Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987); на 4 рабочем совещании по радиационным взаимодействиям (Лейпциг, 1987), на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989); на 22 Всепольском семинаре "Ядерный магнитный резонанс и его применения" (Краков, 1989); на конкурсах научных работ Ш> АН СССР (1987,.1989, 1990); на Рабочем совещании по исследованию механизмов радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 1990); на Всесоюзной конференции "Метаболические нарушения и их коррекция в онкологии" (Москва, 1991); на 9 Международном Конгрессе по радиационным исследованиям (Торонто, Канада, 1991), на 17 Греевской конференции (Кантербури, Великобритания, 1992).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 39 печатных работах.

На защиту выносятся:

1. Эффект образования оксида азота в результате восстановительной Сиотрансформации нитрофуранов, нитроимидазолов и ряда других нитросоединений.

2. Эффект .образования анион-радикалов' Нитрогруппы при биотрансформации нитросоединений в тканях животных и при облучении тканей с введенными нитросоединениями.

3. Вывод о снижении выхода радиационно-индуцированных ра-

дикалов биомакромолекул клеток в тканях опухолей и органов животных после введения нитроимидазолов.

4. Вывод о преимущественном снижении в тканях с мизонида-эолом выхода радиационно-индуцированных радикалов Н-аддуктов тиминовых оснований ДНК, радикалов жирнокислотных остатков ли-пидов и радикалов разрыва сложноэфирных связей в фосфолипидах и триацилглицеринах.

5. Вывод о радиационно-индуцированном повышении в опухоли содержания токсичных продуктов неполного восстановления нитро-соединений и о радиационном усилении токсического действия нит-росоединений на ткани опухоли.

6. Эффект увеличения выхода радиационно-индуцированных радикалов аскорбиновой кислоты в тканях опухоли, печени и мозга животных под действием мизонидазола.

7. Вывод о том, что основным фактором в механизме радио-сенсибилизирующего действия нитросоединений является индуцированное действием радиации увеличение в опухоли с нитросоедине-ниями токсичных и высокореакционных продуктов неполного восстановления нитрогруппы - нитрозо- и гидроксиламинопроизводных, которые и обеспечивают радиосенсибилизирующ?е действие этих соединений.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава посвящена краткому обзору состояния изучаемой проблемы с обоснованием постановки задач исследования. Описние экспериментальных методик содержится во второй главе. Третья, четвертая, пятая и шестая главы содержат результаты экспериментальных исследований, каждая из них заканчивается заключением с суммированием основных полученных данных. В заключении к диссертации суммированы общие итоги всей работы и перечислены основные выводы. Общий объем диссертации составляет 255 страниц. Экспериментальный материал представлен на 58 рисунках и- в 8 таблицах. Список литературы включает 275 работ отечественных и иностранных авторов.

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ

В ГЛАВЕ 1 представлен обзор литературных данных по .использованию электроноакцепторных нитросоединений для преодоления одной из основных причин, приводящих к радиорезистентности опухолевых клеток - развитию гипоксии в опухоли. Проанализированы данные о путях биогране^ормации нитросоединений в биологических системах и рассмотрены основные направлении исследований по созданию новых радиосечсиби.'ияаторон для луч>-рой терапии опухолей.

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА И ТЕХНИКА ^KCÍIEF'.ÍMEKTOB.

Препараты. Б экспериментах были испольрпмны метрониднзол, очищенный из коммерческого препарате! "Трихолол" (Польша), мизо-нидазол (дар фирмы "Ла Рол", Швейцария), нитрит начрия (FEA-ХЯМ), нитроглицерин (коммерческий препарат) и производные 5-нитрофурана, синтезированные в Институте органического синтеза АН Латвии /* : 5-нитро -2-фуральдегид (Н'ТА), '5-иитрс>-2-фур-фуролоксим (>1165), трифоефат (с<-метил-¿-дичтиламинобутилн-мид-2-(2-5"-нитрофурил-2"-ьинил) хинолин-4-карСоноьой кислоты (М-106, хинифур), гликопир^нозилгидраэид 5-нитрофурана (Ж-100).

Системы. 3 работе были использованы мыши колонии ЗНК массой 20-22 г. В экспериментах исследовалась солидная саркома 37 (С-37)-. Для перевивки, опухоли животным подкожно в область бедра вводили асцитную жидкость С-37 в объеме 0,2 мл (концентрация (15-18)xlOff клеток в 1 мл). Опухоли росли в течение 10-11 дней и достигали 15-20 мм в диаметре.

Объектами исследования служили образцы тканей животных с привитой С-37 и без опухоли после введения препаратов- и облучения опухолей. Образцы опухоли, печени, селезенки, крови, мозга были приготовлены после декапитации животных через различные промежутки времени после воздействий .и заморожены при 77 К. При приготовлении образцов опухоли брали ткани из центральных зон без некрозов.

/* Автор выражает глубокую признательность д. х. н. ЕМ. Суховой за любезно предоставленные для исследований препараты.

При изучении модельных систем использовали гомогенат печени после инкубации с нитросоединениями при комнатной температуре. Для получения гомогената к 8 г печени добавляли 1 мл физраствора и гомогенизировали в течение 3 мин ь гомогенизаторе при температуре ?77 К.

При изучении восстановительного денитроаирования нитрофу-ранов и нитроимидазолов к раствору НЬ в натрийфосфатном буфере при двух значениях рН 6,4 и 7,4 (концентрация 1,8 х 10 М). добавляли аскорбиновую кислоту (АН), затем нитросоединения (НС). Образцы отбирали через различные промежутки времени инкубации при 310 К и замораживали.

Липосомн из лецитина желтка куриного яйца были приготовлены ультразвуковой обработкой (5 мин, 20 кГц) в водяной бане при температуре таяния льда в атмосфере аргона. Затем.растворы были центрифугированы (30 мин, 35000 об/мин, 100000 е). В качестве растворителя использовали тяжелую воду (рБ 5,5).

При приготовлении.и образцов для регистрации спектров

с

Р(31)-ЯМР опухоль изолировали, быстро охлаждали до 4 С и переносили в ампулу ЯМР диаметром 10 мм с охлажденным 0,14 М раствором ИаС1.

Б основном экперименте были взяты три серии: одной группе животных локально облучали опухоль, второй группе вводили препарат, третью группу подвергали совместному воздействию этих двух факторов. Параллельно исследовалась группа контрольных животных, которых не подвергали воздействиям. Схема эксперимента лредставлена- на рис. 2.1.

. Растворы метронидазола и мизонидазола в физиологическом растворе вводили животным внутрибрюшинно в дозе 1 мг на 1г веса животного. Раствор нитрита натрия в вводили внутрибрюшинно в дозе 4 мг на 100 г веса животного.

Облучение образцов тканей органов и опухолей животных. Облучение опухолей животных проводили на рентгеновской установке РУТ-200-20-3 ИХФ АН СССР в дозе 30 Гр при мощности дозы 2,5 Гр/мин. Условия эксплуатации: 210 кВ, 15 мА, использовался медный фильтр толщиной 0,5 мм. Для обеспечения локальности облучения опухоли использовали свинцовые кассеты с отверстиями. Лапка с привитой опухолью закреплялась специальным образом в зоне об-

- 9 -

лучения. Одновременно облучали 5 животных.

Образцы тканей в опытах in vitro подвергали гамма-облучению при 77 К от источника'со на установке ГУРХ 100000 Института электрохимии АН СССР мощностью 12 кГр/час в дозе 10 кГр.

Эксперименты по изучению термостабильности радикалов, индуцированных гамма-излучением, проводили методом . ступенчатого термоотжига Температуру образца контролировали с точностью до 2 К с помощью калиброванной медь-константановой термопары.

Липосомы облучали от источника Co-GO (GB 77, Нейтральный 'институт изотопных и радиационных исследований, Лейпциг, Герма-' ния) с мощностью дозы 20,8 Гр/мин при комнатной температуре, в темноте.

Регистрация спектров и обработка результатов. Спектры ЭП? измеряли на радиоспектрометре Х-диапазона ER 220D фирмы "Bruker" (ФРГ) оснащенном ЭВМ "Aspect 2000" (США) со стандарт. ными программами. Использование ЭВМ позволяло производить накопление спектров ЭПР, вычитание, сложение и двойное интегрирование спектров, измерять интенсивность сигналов,'их полуширину, константы сверхтонкого расщепления, значения, g-факторов.

Временные зависимости построены с использованием амплитуды сигналов ЭПР парамагнитных центров. Это было возможно, так как во всех проведенных экспериментах измерялась полуширина сигналов ЭПР и она оставалась одинаковой для парамагнитных центров одного типа Динамики изменения интенсивности отдельных сигналов в образцах тканей животных, подверженных воздействиям, представлены в виде отношения величины амплитуды сигнала ЭПР в опыте к соответствующей амплитуде сигнала в контроле. При построении динамических кривых для определения содержания парамагнитных центров в каждой точке кривой использовали образцы тканей от 5 экспериментальных животных. В качестве оценки статистического разброса величин интенсивностей сигналов ЭПР образцов тканей разных животных для одной точки кинетической кривой использовали величину среднеквадратичного отклонения для доверительного интервала 90 %.

Спектры 31-Р ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре АС-200, Bruker, на частоте 81,015 МГц при 4°С без вращения образца и без подавления спин-спинового взаимодействия ядер з1Р с

протонами. Значения химических сдвигов сигналов приведены относительно 85% Н3РО4. Нормировка сигналов проведена относительно сигнала внешнего стандарта (динатриевая соль этилендиаминтетра-метилфосфоновой кислоты) с учетом веса ткани. Значение внутриклеточного pH определяли, измеряя химический сдвиг сигнала Р; с использованием калибровочной кривой. Уровни фосфатсодержажих метаболитов получены при интегрировании плошздей сигналов после автоматической коррекции базовой линии спектров.

Спектры 1-Н ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре BS 487 С, Tesla, 80 МГц и спектрометре ЯМР AM 250, Bruker, 250 МГц.

Перекисное окисление липидов изучали по образованию диеновых хромофоров, измеряя поглощение при 233 нм с помощью спектрофотометра SPEC0RD М 40 (VEB Carl Zeiss, Иена, Германия).

ГЛАВА а РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙ ОПУХОЛЕЙ И ОРГАНОВ ЖИВОТНЫХ В ПРИСУТСТВИИ НИТРОСОЕДИНЕНИЯ

Радиационно-индуцированные свободнорадикальные состояния биологических макромолекул и воды в клетке являются короткожи-вушми, но именно они являются инициаторами развития радиационного поражения тканей и органов животных! Тем не менее, при исследовании молекулярных механизмов действия радиосенсибилизаторов гипоксических клеток вопросы влияния этих соединений на содержание и природу первичных радиационно-индуцированных повреждений непосредственно в тканях органов и опухолей животных не были изучены.

Нами было исследовано влияние нитроимидазолов - метронида-зола (МЕТРО) и мизонидазола (МИЗО) - на содержание первичных радиационно-индуцированных повреждений клеточных компонентов в тканях опухолей и органов животных. Для исследования влияния нитроимидазолов на образование первичных радиационно-индуцированных радикалов клеточных компонентов препараты вводили живот-, ным, затем через определенные промежутки времени извлекали опухоли и органы, готовили образцы тканей и облучали их. Для стабилизации короткоживущих радиационно-индуцированных радикальных состояний как облучение и хранение'образцов, так и регистрацию

- и -| 2.00

1-1—»-Н

Рис. 1. Спектры ЭПР гамма-облученных при 77 К образцов тканей опухоли в разные сроки после введения МЕТРО: 1 -без введения; 2 - 1 ч; 3 - 4,5 ч; 4 - 9 ч Лзсле введения препарата; 5 - разность спектров 2 и 1. Условия регистрации спектров ЭПР: микроволновая мощность 64 мкВт, амплитуда модуляции 4 Гс, температура регистрации 77 К. Образцы перед измерением были нагреты до 140 К.

их спектров ЭПР проводили при температуре жидкого азота.

- 12 -

Природа радиационно-индуцированных центров в тканях органов и опухолей животных в настоядее время достаточно хорошо изучена и описана в литературе (Авдеева 0. С. и соавт., 1980; Свистуненко Д. А. и соавт. , 1984, 1986; Пулатова М. К и соавт., 1989).

Анион-радикалы нитроимидазолов в облученных тканях опухолей и органов после введения животным этих соединений. Методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии были исследованы облученные образцы тканей опухоли С37, печени, мышцы, селезенки^ почек, мозга и крови животных без введения и через- определенные промежутки времени после инъекции нитроимидазолов животным и установлено, что в спектрах ЭПР облученных при 77 К образцов тканей органов и опухолей животных в первые 2-3 часа после инъекции МЕТРО и МИЗО регистрируются анизотропные триплетные сигналы, обусловленные анион-радикалами нитрогруппы этих соединений.

Спектры ЭПР облученных образцов опухоли, отобранных через 1, 4,5 и 9 часов после введения животным МЕТРО представлены на рис.1. Можно видеть, что спектры образцов, отобранных через 1 и 4.5 часа отличаются по форме от спектров интактной опухоли или через 9 ч после введения препарата Сигнал ЭПР, полученный как разность между спектрами образцов опухоли через 1 ч после инъекции препарата и без инъекции, приведен на' рис. 1. 5. Этот анизотропный сигнал с триплетной структурой имеет g-фактор 2,005 и по своим параметрам совпадает с известным в литературе сигналом ЭПР анион-радикалсв МЕТРО (Symons М. at al., 1985).

. Спектры ЭПР анион-радикалов МЕТРО в различных системах приведены на рис.2. Это сигнал анион-радикалов, полученный при ферментативном восстановлении МЕТРО в гомогеиате печени при комнатной температуре (рис. 2.1), сигнал того же образца при температуре жидкого азота (2.2), спектр облученного при 77 К водного раствора МЕТРО при pH 7,0 (2.3) и спектр ЭПР облученного образца печени с МЕТРО (2.4), где хорошо видны компоненты триплетного сигнала анион-радикалов МЕТРО.

Интенсивный сигнал ЭПР анион-радикалов МЕТРО наблюдался во всех исследованных тканях органов, взятых в первые 2-3 ч после введения препарата животным. Он'остеЬался интенсивным при всех

- 13 -| 2. 0 05

тс»

Рис. 2. Спектры ЭПР: 1 - анион-радикалов МЕТРО, полученных путем ферментативного восстановления в гомогенате печени при комнатной температуре; микроволновая мощность 20 мВт, амплитуда модуляции 1 Гс, температура регистрации 293 К; 2 - то же, что и 1, образец заморожен при 77 К; 3 - облученного при 77 К водного раствора МЕТРО, рН 7,0; 4 - облученных при 77 К образцов печени через 30 мин после введения МЕТРО животным. Образцы 3 и 4 были нагреты до 140 К Условия регистрации спектров 2-4: микроволновая мощность 2 мВт, амплитуда модуляции 4 Гс, Т - 77 К.

температурах отжига образцов до 210 К Поскольку низкопольная компонента сигнала анион-радикалов МЕТРО почти не перекрывается с сигналами ЭПР радикалов биомакромолекул тканей, по интенсивности этой компоненты в спектрах облученных образцов тканей можно проследить за локализацией этого соединения в органах животных, а также за динамикой его накопления и выведения из организма .С использованием этой методики было установлено, что уже через 30 мин после введения МЕТРО распределен по всем исследованным органам, и в течение 1 часа содержание его изменяется незначительно.

Динамика изменения интенсивности сигналов ЭПР анион-радикалов метронидазола после введения препарата животным в тканях опухоли, печени и крови тавотных показана на рис. 3. Можно проследить, что достаточно высокий уровень МЕТРО сохраняется в тканях примерно 2 часа, постепенно снижается к 5-6 часам, а через 9 часов после введения спектры ЗПР образцов тканей практически уже не содержат сигнал анион-радикалов МЕТРО.

Эти опыты показали, что в спектрах ЭПР облученных тканей

Рис. 3. Изменение интенсивности сигналов ЭПР анион-радикалов МЕТРО в спектрах ЭПР облученных образцов тканей в первые часы после введения препарата: / - кровь, 2 ~ печень, 3 - опухоль. По оси ординат отложена интенсивность первой компоненты сигнала ЭПР анион-радикалов МЕТРО в относительных единицах.

О

1

г з

* 5 6

опухоли и органов в первые 2-3 ч после введения МЕТРО животным регистрируется интенсивный сигнал анион-радикалов этого препарата. Это значит, что инъекция животным электроноакцепуорного соединения - метронидазола приводит к тому, что в тканях при облучении в значительном количестве по отношении к радикалам клеточных компонентов образуются анион-радикалы МЕТРО. Они возникают при захвате электронов, генерируемых при облучении, электроноакцепторными нитрогруппами молекул препарата.

При изучении изменений интенсивности сигнала ЭПР радиаци-онно-индуцированных анион-радикалов МИЗО в опухоли после введе-' ния препарата животным без облучения опухоли и с предварительным ее локальным облучением in vivo было подтверждено, что максимальное накопление препарата в опухоли достигается через 30 мин после введения и показано, что интенсивность сигнала ЭПР анион-радикалов МИЗО, индуцированных радиацией in vitro в образце опухоли, предварительно облученной in vivo на фоне введенного препарата, понижена, следовательно, препарат был израсходован в опухоли при ее локальном облучении.

Снижение выхода радиационно-индуцированных радикалов биомакромолекул в тканях с нитроимидазолами. ' В результате изучения относительных выходов радикалов клеточных компонентов и анион-радикалов нитроимлдазолов в облученных тканях в присутствии этих соединений было установлено, что наряду с образованием анион-радикалов МЕЛТО и МИЗО происходит снижение выходов радиационно- индуцированных радикалов биомакромолекул, причем степень снижения зависела от концентрации препарата в тканях.

Спектры ЭПР облученных при 77 К тканей опухолей и органов животных представляют собой сумму ряда сигналов ЭПР от свобод-норадикальных центров разной природы. Центры различаются по термостабильности, параметрам их сигналов ЭПР и зависимости интенсивности сигналов ЭПР от микроволновой мощности. Эти характеристики парамагнитных центров были использованы для выделения их сигналов из суммарных спектров и идентификации их природы.

Суммарный . сигнал радикалов тканей. Разложение сложных спектров ЭПР гамма-облученных при 77 К образцов тканей опухоли без введения и через 30 мин после введения МИЗО животным на составляющие сигналы ЭПР отдельных клеточных компонентов преде-

тавлены на рис. 4. Спектры ЭПР радиационно-индуцированных центров записаны в оптимальных условиях: значение мощности микро-' волнового излучения соответствует линейному участку кривой на-шцения сигналов.

В результате проведенного сравнительного анализа интегральных интенсивностей как суммарного спектра ЭПР всех радикалов биомакромолекул, так и отдельных сигналов ЭПР облученных образцов тканей с МЕТРО и МИЗО и без них было установлено, что в. образцах опухоли с МИЗО интенсивность сигнала, обусловленного всеми клеточными компонентами (после вычитания сигнала ани-!

Рис. 4. Спектры ЭГГР гамма-облученного при 77 К образца тканей опухоли через 30 мин после введения МИЗО животным (1.Б) и без введения препарата (1. А); и составляющие спектров: сигналы гидроксильных радикалов (2. А и 2. Б); сигналы анион-радикалов МИЗО (а Б); сигналы радикалов ЖАК) (-3. А и 4.Б); суммарные спектры, оставшиеся после разложения (4. А и 5. Б). Условия регистрации спектров ЭПР: микроволновая мощность 64 мкВт, амплитуда модуляции 4 Гс, температура' регистрации 77 К. *

2

2

он-радикалов МИЗО) была ниже, чем в образцах ткани без препарата. Исключение составляли сигналы радикалов аскорбиновой кислоты R(AK), интенсивность которых была выше в образцах тканей с МИЗО. Интегральные интенсивности сигналов радикалов ОН были практически одинаковыми.

Спектры ЭПР тканей после вычитания сигналов радикалов R(AK) и анион-радикалов МИЗО (рис. 4. 4. А и 4. 5. Б) включают в себя сигналы ЭПР радиационно-индуцированных центров, обусловленных радикалами липидов, ДНК, и белков.

Аналогичное сравнение было проведено для спектров ЭПР облученных образцов печени без препарата Как и в предыдущем случае, в образцах печени с МИЗО суммарная интенсивность сигналов

ЭПР клеточных компонентов была ниже, чем в образцах без препа-

»

рата, а интенсивность сигналов радикалов R(AK) была выше.

Изменения интегральной интенсивности сигналов ЭПР анион-радикалов МЕТРО и суммарного сигнала, обусловленного радикалами клеточных компонентов, в облученных образцах тканей 'опухоли в различные сроки после введения МЕТРО животнйм в дозе 0,75 мг на 1 г веса представлены на рис. 5. Можно.видеть, что интенсивности сигналов анион-радикалов МЕТРО и радикалов клеточных компонентов изменяются антибатно - чем больше интенсивность сигнала анион-радикалов МЕТРО в спектре ЭПР ткачей с МЕТРО, тем меньше образуется радикалов клеточных компонентов.

Через 30 мин после введения МИЗО защита клеточных компонентов в опухоли была больше, чем в печени, и больше, чем во все другие сроки после введения препарата. Именно в это время регистрировали максимальное содержание препарата в опухоли при изучении фармакокинетики МИЗО, и-в это время обычро наблюдают максимальную степень радиосеисибилизации при облучении опухолей животных в опытах jл vivo.

Радиката - аддукты К тиминовых оснований ДНК Одними из радикалов клеточных компонентов, образующихся в облученных образцах тканей животных, являются радикалы Н-аддуктов тиминовых оснований ДНК, которые имеют 8-компонентный сигнал ЭПР. Боковые компоненты этого сигнала (1, 2 и 7, 8) не перекрываются' с сигналом ЭПР анион-радикалов МЕТРО,^поэтому имеется возможность наблюдать за изменениями интенсивности этого сигнала в образцах

ВРЕМЯ« ЧАС

Рис. 5. .Изменения интенсивности сигналов ЭПР анион-радикалов ЫЕТРО (А) и уровня суммарного сигнала ЭПР радикалов ткали (Б) в спектрах ЭПР облученных при 77 К образцов тканей опухоли в различные сроки после введения препарата тавотным в дозе 0,75 мг на 1 г веса

тканей в различный сроки после введения препаратов животным. На рис.6 приведены спектры ЭПР селезенки животных через 30 мин после введения ЫИЗО и без введения препарата и изменение йнтен--снвности сигнала радикалов ТН в спектрах селезенки- в рагшгчные сроки посла введения МЕТРО (Б).. Можно, видеть, что сигнал радикалов ТН' имеет минимальную интенсивность в те сроки, когда по данным фармакокинетики наблюдается максимальное содержание пре-

Рис. 6. А - спектры ЗПР гамма-облученных при -77 К образцов селезенки: 1 - без введения' препарата, 2 - через 30 мин после введения МЕТРО животным в дозе 1мг/г. Условия регистрации: микроволновая мощность 0,6 мВт, амплитуда модуляции 2 Гс, температура измерения 77 К. Образцы перед измерением были нагреты до 195 К. Б - Изменение интенсивности сигнала радикалов ТН в спектрах ЭПР селезенки в различные сроки после введения МЕТРО.

парата в тканях селезенки.

Через б ч после введения МЕТРО, когда в тканях селезенки

остается незначительное количество препарата, интенсивность сигнала радикалов ТН также близка к интенсивности его в норме. В образцах, отобранных через 30 мин после введения МИЗО, интенсивность сигнала радикалов ТН почти в 5 раз ниже, чем в бразцах селезенки без препарата.

Радикалы липидных компонентов. При изучении природы ради-ационно-индуцированных центров в тканях животных было установлено, что интенсивность сигналов ЭПР радикалов различных биомакромолекул, возникающих в облученных при 77 К тканях органов, зависит от температуры термоотжига образцов. Различие в термочувствительности радиационно-индуцированных радикалов было использовано для выяснения влияния МИЗО на содержание образующихся при 77 К радиационно-индуцированных радикалов, в равной или различной степени защищаются различные клеточные компоненты в присутствии МИЗО в облученных при 77 К тканях опухолей и органов животных. Для этого были исследованы кривые термоотжига для спектров ЭПР облученных при 77 К образцов тканей органов и опухолей животных в диапазоне температур от 77 К до 240 К. Было установлено, что радикалы липидных компонентов мембран в наибольшей степени защищаются МИЗО при первичном радиационном поражении в тканях опухоли и мозга.

Радиационно-индуцированные радикалы аскорбиновой кислоты в тканях опухолей и органов животных-опухоленосителей. Выше уже отмечалось, что в тканях опухоли и органов животных после введения МИЗО был повышен уровень радиационно-индуцированных ради-

9

калов аскорбиновой кислоты Я(АК). В связи с тем, что имеются данные о повышенном уровне АК в опухолях и влиянии ее на радио-секскбилизирующее действие нитроимидазолов, нами были исследованы изменения интенсивности радиационно-индуцированных радикалов АК в тканях опухоли в процессе ее развития после перевивки и иод действием радиации, а таюяэ з тканях печени, опухоли и селезенки посяе введения нитросоединеиий.

При исследовании динамики изменения интенсивности сигнала ИСАК) б тканк опухоли С 37 в процессе ее развития после перевивки в кышцу лапки и ткани ьаящы лапкк без опухоли того не ответного было установлено увеличение интенсивности сигнала К( АК) на достаточно ранних стадиях развития опухоли, при этом макси-

мальное значение достигалось к 7-8 суткам после перевивки. Интенсивность этого сигнала в тканях мышцы лапки в это время примерно вдвое ниже, чем в опухоли.

Проведенный нами анализ литературных и собственных данных свидетельствовал о том, что интенсивность радиационно-индуциро-ванных сигналов 1?(АК) в тканях пропорциональна содержанию АК. В таком случае полученные результаты позволяют объяснить имеющиеся в литературе противоречивые данные об относительном содержании АК в здоровых и опухолевых тканях, так как на разных' стадиях развития опухоли это содержание может меняться.

Были изучение динамики изменения интенсивности сигналов И(АК) в тканях опухоли и печени в различные сроки после облучения опухоли на фоне введенного МИЗО, а также после облучения опухоли и введения препарата отдельно. После облучения в опухоли происходило снижение уровня радикалов АК в первые 2 часа на 25%.. После введения МИЗО животным в опухоли наблюдалось резкое увеличение интенсивности сигнала 1?(АК) в течение 1 часа более чем в 2 раза, затем медленное снижение, к 6 часу' интенсивность его оставалась увеличенной в 1,6 раза. При облучении опухоли через 30 мин после введения препарата во все сроки после облучения уровень радикалов 1?(АК) примерно на 10-20 X ниже, чем после введения МИЗО.

В печени максимальное количество радикалов НС АК) наблюдалось через 30 мин после введения препарата, а после локального облучения опухоли на фоне введенного МИЗО уровень этих радикалов в печени выше, чем при воздействии препарата отдельно. Этот результат согласуется с полученными нами ранее данными о повышении уровня радикалов ИСАК) в печени после облучения опухолей животных, так как в этом случае увеличение вызывается как введением МИЗО, так и облучением опухоли.

Снижение выхода Р(АК) в образцах опухоли после ее облучения, наиболее вероятно, связано со снижением содержания АК в результате взаимодействия ее с гидроксильными радикалами. Именно этим можно объяснить известный эффект радиозашлтного действия АК Увеличение выхода радикалов АК в образцах опухоли и печени после введения МИЗО может быть^обусловлено увеличением содержания АК в результате активации в печени глюкуронидазного

- 22 -

пути детоксикации ксенобиотиков.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ НА РАДИАЦИОННОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ ЛИПОСОМ.

Радиосенсибилизирующее действие оказывают, в основном, производные нитроимидазолов, обладающие липофильными свойствами. Будучи связанными с мембранами, эти соединения могут влиять на радиационное поражение этих важных клеточных структур, которые, наряду с ДНК, является наиболее критическими мишенями действия радиации на клетку.

В настоящее время достаточно хорошо изучены основные радиационные повреждения в липидах, главных структурообразующих компонентах мембран, - это появление пероксидов, оксидов, альдегидов, образование полимерных продуктов (в основном, на поздних стадиях развития поражения). При облучении фосфолипидов помимо превращений в жирнокислотных частях молекулы происходит также отщепление отдельных ее частей, в том числе фосфата с присоединенной полярной группой, а также неорганического фосфата Для облученных мембран характерно появление новых, несвойственных мембранам фосфолипидов, особенно увеличение количества лизоформ. Лизоформы липидов образуются при отщеплении одного из жирнокислотных остатков молекул фосфо-. и гликолипидов, имеют одну углеводородную цепь (подобно детергентам) и при высоких концентрациях могут вызывать разрушение клеточных мембран.

Нами было исследовано влияние 2 нитросоединений - метрони-дазола (МЕТРО) и нитрофуральдегида (НФА) на радиационное повреждение бислойных лилиднмх мембран (липосом) из лецитина желтка куриного яйца. Такая модель помимо того, что позволяет исследовать основные механизмы действия радиации на мембранные системы, состоящие из основных структурообразующих липидов, представляет интерес ещ-э и потому, что дает возможность научать зл:шш;э иитросоединонйй на радиационное поражение системы, в которой отсутствуют условия для дальнейшего, пострадинциоиного коестакозленка этих соедиг:екий, что едино плч проверки яр^ддэ-кзккой наил гипотевн радкацконно-индуцировлиного усиление, цито-■гоксического действия иитроеоединенМ.

Ранее было показано, что наиболее радиочувствительными группами в молекулах фосфатидилхолина являются олефиновые группы. При изучении действия радиации на липидные компоненты мембран методом Н(1)-ЯМР было установлено, что поражение шрных кислот характеризуется уменьшением интенсивности сигналов ЯМР, обусловленных протонами олефиновых групп и особенно протонами соседних с ними метиленовых групп (lanzini F. at al. ,1984; Barber D. and Thoras J., 1978).

Нами были исследованы спектры Н(1)-ЯМР липосом из фосфатидилхолина, измеренные через 1 день после облучения липосом при комнатной температуре в атмосфере азота и кислорода, в присутствии МЕТРО и НФА, а также спектры необлученных липосом. За поражением олефиновых групп наблюдали по снижению интенсивности сигналов с хим. сдвигом 2,8 и 5,3, обусловленных протонами двух наиболее радиочувствительных групп в липидах - метиленовых протонов, соседних с олефиновыми группами, и протонами олефиновых групп, соответственно. Используя результаты работы (Schre Itter J. , 1979) о составе лецитина из яичного желтка й зная полное количество липидов в исследуемых образцах были рассчитаны величины радиационных выходов G для олефиновых групп при облучении липосом в разных условиях. Результаты этих исследований приведены в табл. 1. Из данных таблицы можно видеть подтверждение хорошо известного кислородного эффекта. Из этих данных такл? следует, что МЕТРО и НФА оказывают защитное действие на жирнокис-лотные цепи липидных мембран при облучении.

Защитное действие нитросоединений наблюдали также при изучении радиационного поражения липосом в присутствии НФА по спектрам Н(1)-ЯМР голоеных групп фосфатидилхолина. На рис.7 показаны изменения спектров Н(1)-ЯМР липосом из яичного лецитина при облучении в дозах 17,0 и 32,2 кГр в присутствии НФА и без добавок. Сигнал ЯМР головной группы N+(CH5)3 в образцах липосом с НФА практически не изменялся после облучения в исследуемых дозах, в то время как сигнал облученных липосом без НФА расщепился и появились сигналы, обусловленные продуктами повреждения молекул липидов бислоя. В присутствии НФА не наблюдалось и образования лизолецитина (сигнал с хим. сдвигом 3,Я2 на рис. 7. Б).

Таблица 1. Радиочувствительность олефиновых групп жирных кислот, определенная по уменьшению плошадей сигналов Н(1)-ЯМР с химическим сдвигом 5,3 м. д.

Радиолитическое поражение

Концен-. Концен- Атмос- Доза Мощность Снижение 6 трация трация фера (кГр) дозы плошади олефи-липидов добавок (Гр/мин) (%) нов

(X веса)

5 — воздух 13,5 3,4 38 15

5 — азот 13,5 3,4 16 6,4

2,5 — воздух 17,0 20,8 24 3,7

2,5 — воздух 32,2 20,8 37 3,1

2,5 МЕТРО 70. мМ воздух 32,2 20,8 34 2,7

2,5 МЕТРО 70 мМ азот 32,2 20,8 22 1,8

2,5 НФА 70 мМ воздух 32,2 20,8 17 1,4

2,5 В1>А 70 ММ азот 32,2 20,8 И 0,9

Защитный эффект нитросоединений на липидные компоненты бислойных мембран был установлен также при исследовании влияния облучения на подвижность холиновых головных групп.

О снижении радиационного повреждения липосом в присутствии ВФА свидетельствовали и результаты измерения спектров оптического поглощения при 233 нм, обусловленого диеновыми конъюгата--ми. Из результатов измерения образования диеновых конъюгатов следовало что в присутствии НФА в растворе липосом во время облучения количество этих продуктов, образующихся в процессе пе-роксидного окисления липидов, снижено. А это свидетельствует и о снижениии пероксидного окисления в присутствии НФА.

Для изучения влияния нитросоединений на проницаемость ли-пидных бислойных мембран была использована методика с использованием ионов Еи( 3+) (Быстров. В. Ф. "и др., 1971). В опытах с НФА было показано, что это соединение'лишь незначительно увеличива-

—I—1111—I . I * I I * 1 I * I—I-

и 1.2 1.1 >г

м.д. к.д.

Рис.7. Спектры Н(1)- ЯМР протонов головной группы фосфати-дилхолина - N (СН^в облученных липосомах с НФА (А) и без добавок (В).

ло проницаемость необлученных липосом для ионов Еи(3+). Результаты опытов с облученными липосомами показали, что облучение липосом в дозе 10 кГр при мощности дозы 78 Гр/мин не оказывало влияния на проницаемость липосом при выдерживании образцов в течение 12 суток после облучения. Липосомы становились значительно более проницаемыми в случае, когда они облучались в присутствии НФА. Это значит, что НФА увеличивает радиационное поражение мембран при низких концентрациях кислорода.

Но значительно более выраженный эффект на проницаемость мембран НФА оказывал, если его добавляли не перед, а непосредственно сразу после облучения липосом. Были рассчитаны константы проницаемости для облученных липосом для ионов Еи(3+) в присутствии НФА и с добавкой НФА после облучения, которые в последнем случае оказались на порядок выше. Эти данные показали, что влияние НФА на проницаемость мембран не может быть объяснено толь-

ко взаимодействием этого соединения с радикалами, образующимися в процессе облучения. При облучении липосом в той же' дозе 10 кГр, но с использованием скорости дозы не 78, а 6 Гр/мин и последующим добавлением НФА константа проницаемости увеличивалась более, чем вдвое. Если учесть хорошо известный факт о существовании обратной зависимости между скоростью дозы облучения и степенью, повреждения липидов мембран, получается, что при увеличении повреждения липидов и влияние НФА на проницаемость ли-пидных мембран также увеличивается. Эти данные дают основание предположить, что НФА более эффективно взаимодействует с продуктами радиационного повреждения липидов, чем с неповрежденными липидами. Такими продуктами могут быть диеновые конъюгаты, например.

Были измерены времена релаксации Т± для протонов НФА, принимающих участие во взаимодействии с необлученными и облученными липосомами. Для протонов в положении 3 и 4 Фуранового кольца, которым соответствует линия с химическим сдвигом 7. 66 м. д. , времена Т ^ для необлученных и облученных растворов НФА с липосомами имели значения (2.11 +-0.02) сек и (1.64+-0. 01) сек соответственно. Т^ для этих же протонов в растворе в отсутствие липосом имело значение (2. 58+-0.01) сек. Эффект связывания увеличивался на 250% для этих протонов, если НФА взаимодействовал с облученными липосомами. Поэтому стимуляция процесса прохождения ионов Еи(3+) в облученные липосомы после добавления НФА вероятнее всего обусловлена дестабилизацией барьера проницаемости .мембран вследствие образования комплексов НФА с продуктами ра-днолиза, образующимися в липидном бислое при облучении (Брг1пг Н. , 1988).

ГЛАВА 5. ОБРАЗОВАНИЕ ОКСИДА АЗОТА ПРИ БКОТРАНСФОРМАЩШ 1Г.ПР01УРЛТОВ, НИТРОШШДДЗОЛОВ М ДРУГИХ КИТРОСОЕ-ДйНЕНИЯ И КЛЕТОЧНЫЕ МИШЕНИ ИХ ДЕЙСТВИЯ.

При кссдэдошиш спектров ЗПР тканей птотиых после введешь нитрсфуратаь:, нитрошщэзолов, гоптоглиц?ркна. нитрита натрия, а тагаа» при инкубации пткх. соединений с гомогенатои реч?ни би::о устаноьлэно, что эти соединения индуцирук.т образование

нитрозильных .комплексов гемсодержащих белков Гем-ИО и железо-серных центров Ре-З-ЫО. Было предположено, а затем и подтверждено, что эти соединения при биотрансформации в организме или в гомогенатах тканей могут в результате восстановительных превращений приводить к образованию оксида азота, который при взаимодействии с гемсодержащими и железосерннми центрами образует регистрируемые нитрозильные комплексы.

Образование нитрозильных комплексов Гем-Ш и Ре-5-Ы0 в организме животных. В спектрах ЗПР образцов печени и крови животных, которым вводили нитрофураны, нитроимидазолы, нитроглицерин и нитрит натрия, в период от 5-30 мин до 2-3 чао после введения регистрировали сигналы ЗПР нитрозильных комплексов Гем-№Э (сигнал с триплетной структурой с й-фактором 2,01 и расщеплением в триплете 17 Гс) и Ре-Б-Ю (сигнал с г-фактором 2,03).

На рис. 8 показаны спектры ЗПР образцов печени без введе-• ния и отобранных через 10 мин (б) и 3 час (в) после введения животным нитроглицерина (НГ) в дозе 0,1 мг/г.

Оксид азота, необходимый для образования нитрозильных комплексов Гем-Ш и Ре-Б-Ш, мог появиться в результате биотрансформации НГ в организме животных.

Одновременно с появлением комплексов наблюдали уменьшение интенсивности сигнала железосерных центров с е-фактором 1,94 и увеличение интенсивности синглетного сигнала ЗПР в свободнора-дикальной области, сопровождаемое уменьшением полуширины этого сигнала Уменьшение полуширины сигнала от 15 до 11 Гс вызвано увеличением вклада в наблюдаемый спектр ЭПР печени сигнала, обусловленного убисемихинояами, который имеет полуширину 7 Гс. Этот сигнал был выделен при вычитании спектров ЭПР печени без введения и после введения НФА. Крона того, регистрируем« фла-во- , и убисемихиноны разделяются по своим релаксационным параметрам и могут быть выделены при игизнении мощности СВЧ (Константинов А. Л. , Рууге Э. К., 1977). Уменьшение интенсивности сигнала ЭПР с (Т-1,94 н появление сигнала ЭПР убтсемихинонов свидетельствуя? о нарушении процгссов'переноса злеетроноз в дьг/.а-телм<оЛ цепи митохондрий (на уров?ю НЛЛН-дегилрогеназного комплекса) , о сдвиге ПЭТ в состояние Сольеэй скисленности (Дтахпг-1 Л. , Вурбаез Д.Е , Вапии А.Ф. и соавт.-, 1900-85).

£.42 г /Г ¿¡раз Ш

Рис. 8. Спектры ЭПР печени животных до введения (1), через 10 мин (2) и 3 ч (3) после введения нитроглицерина (0,1 мг/г); условия регистрации микроволновая мощность 20 мВт, модуляция магнитного поля 3,2 Гс, температура регистрации 77 К.

Интенсивное образование нитрозильных комплексов' было зарегистрировано в печени и крови животных после введения НФА, МИ-30, МЕТРО и МаМОр. Спектры ЭПР нитрозильных комплексов Гем-Ю были получены при вычитании спектров ЭПР образцов печени интак-тных животных из спектров ЭПР образцов печени после введения

указанных нитросоединений. Полученный при вычитании сигнал ЭПР с триплетным расщеплением имеет параметры: г-фактор центральной компоненты триплета 2,01 и расщепление в триплете 17 Гс. Следует отметить, что сигналы ЭПР комплексов Гем-Ш в печени после введения этих соединений животным во-первых, значительно превышали по интенсивности сигналы комплексов Гем-ИО в крови, и во-вторых, имели более широкую низкопольную компоненту и по форме были аналогичны сигналу нитрозильных комплексов цит Р-450-Н0 (О'КееГГе 0. аЬ а1. , 1978). Эти особенности свидетельствуют об образовании не толко комплексов оксида азота с гемоглобином, но и комплексов с другими гемсодержащими белками. Снижение под действием нитросоединений интенсивности сигнала цит Р-450 в первый ч после введения может только подтвердить предположение об образовании нитрозильных комплексов цитохромов. Образование комплексов цитохромов с оксидом азота приведет к ингибированига процессов переноса электронов в электронотранс-портных цепях зндоплазматического ретикулума и митохондрий.

Нитросоединений посредством реакции, приводящей к продуцированию оксида азота и образованию нитрозильных комплексов Гем-ИО, вызывают также убыль функционального гемоглобина, что может привести к временной гемической гипоксии организма и тканей и снижению активности кислород-зависимых ферментов.

При инкубации гомогената печени мышей с нитросоединениями также было зарегистрировано образование нитрозильных комплексов гемсодержащих белков и Ре-З-центров.

В спектрах ЭПР образцов гомогената с НФА сигнал нитрозильных комплексов Гем-МО незначительной интенсивности наблюдался непосредственно сразу же после приготовления образцов смеси при 273 К Последующая инкубация гомогената печени с НФА приводила к резкому увеличению интенсивности сигнала ЭПР этих комплексов. Одновременно происходило , снижение интенсивности сигналов ЭПР ЯСЦ с г-1,94 и цитохрома Р-450. Изучение динамики изменения интенсивности сигналов ЭПР нитрозильных комплексов Гем-Ш в гави- " симости от времени инкубации четырех производных 5-нитрофурана (ВМ, хикифур, производное хгашфура, НФ-35, НФ-165, рис.9) в гомогенате печени при.комнатной температуре показало, что среди, исследованных соединений наиболее интенсивно-происходит.образо-

за -

Рис.9. Динамики увеличения интенсивности сигналов ЭПР нитрозильных комплексов Гем-ИО в. спектрах ЭПР гомогената печени при инкубации его с производными 5-нитро-фурана: 1 - нитрофураль-дегид; 2 - хинифур; 3 -производное хинифура -НФ-35; 4 - НФ-165; 5 -без препар5та

40 ¿,4

вание нитрозильных комплексов в гомогенате печени с НФА. Следует отметить, что это соединение имеет наибольшее сродство к электрону и обладает наибольшей токсичностью' из исследованных иитрафураиовых производных.

Образование оксида азота при восстановлении нитросоедине-ний в растворах гемоглобина. Ранее было показано ПозерЬу Р. а1 а1. ,1978), что токсичность нитрофуранов и нитроимидазолов возрастает в значительной степени в присутствии аскорбиновой кислоты (АК). Поскольку выделение оксида азота в ходе метаболизма нитросоединений может служить дополнительной причиной токсичности этих со-динений, а также усиления их противоопухолевых свойств, более подробное изучение этого процесса представляло значительный интерес. Е связи с этим нами было исследовано вза-

имодействие ряда нитрссоединений с гемоглобином в присутствии аскорбиновой кислоты при разных значениях рН, характерных для нормальных и опухолевых тканей.

К растворам гемоглобина в натрийфосфатном буфере при двух значениях рН 6,4 и 7,4 добавляли АК и выдерживали растворы в течение 24 ч при 310 К с целью восстановления MetHb. Затем добавляли раствор соответствующего нитросоединения в натрийфосфатном буфере с таким расчетом, чтобы соотношение НЬ: НС: АК составляло 1:4:10. Образцы отбирали через различные промежутки времени инкубации растворов при 310 К и замораживали. В спектрах ЭПР образцов, замороженных практически сразу после смешивания растворов наблюдали сигнал с g-2,005 и полушириной 7,5 Гс. При комнатной температуре этот сигнал представлял собой дублет с а-1,8 Гс, принадлежащий радикалам АК При инкубации растворов появлялся сигнал ЭПР нитрозильных комплексов гемового иг лева. .Форма этого сигнала изменялась в зависимости от рН среды и времени выдерживания.

Само по себе появление комплексов Гем-NO при инкубации растворов НЬ с нитросоединениями свидетельствовало о превращениях этих соединений, сопровождающихся выделением N0, в присутствии восстановителя. Инкубация этих соединений с растворами НЬ (без АК) при тех же временах не приводила к появлению каких-либо сигналов ЭПР. Известно, что первичным этапом восстановления нитросоединений является акцептирование электрона с образованием анион-радикала нитрогруппы. То, что в нашем случае не наблюдали появления в спектрах ЭПР растворов НЬ с НС и АК сигналов, которые могли бы принадлежать анион-радикалам нитрогруппы, не противоречит этому положению, так как стационарная концентрация этих радикалов может бьгть низкой вследствие их малой стабильности и находиться за пределами чувствительности мегеда.

Кривые, характеризующие динамику выделения оксида азота (по количеству образовавшихся нитрозильных комплексов Гем-Nû), продстаалзшг на рис. 1С. Доля молекул, раепадахйцихся с выделением ПО, зарьирует э пироких пределах з зависимости ст типа соединения, рН среды я содержания-s ней восстановителя, достигая в елуч;т" нитрофурадьдегяда 10% os общего содертззкй арэпарата.

отметить, что после вадерживанкя раствора Hb+Ш+АК. п

30

го

1о

о I г з * 5 6

о I г з 4 5 а.ч

Й 1

5

v»'

О 1 2 3 V 5 В е.ч

О 1 2 3 * 5 Н,ч

Рис. 10. Динамики появления сигналов ЭПР нитрозильных комплексов НЬ-№Э в растворах НЬ + НС + АК, где НС соответствует: а - НФ-100; б - нитрофуральдегид; в - Ф-165; г - ми-зонидазол; 1 - системы с рН 7,4; 2 - с рН 6,4; 3 - с рН 6,4 при увеличенном в 10 раз содержании АК

2

течение нескольких часов происходило заметное появление осадка, что указывает на разрушение НЬ. Степень этого разрушения может зависеть от рН раствора и природы НС, присутствующего в растворе. Это, по всей вероятности, и является причиной наблюдающегося в некоторых случаях резкого снижения концентрации нитрозильных комплексов в растворе при инкубации (рис.10).

Полученные результаты показали, что при метаболизме нитро-фуранов, нитроимидазолов, нитроглицернина, нитрита натрия в ор-

ганизме животных образуется оксид азота. Показано также, что распад исследованных нитросоединений с выделением оксида азота происходит после восстановления молекул нитросоединений.

Возможность распада нитросоединений с продуцированием оксида азота была продемонстрирована нами как в опытах на животных, так и на модельных системах - в гомогенатах печени и в растворах гемоглобина с аскорбиновой кислотой. Механизм продуцирования оксида азота при биотрансформации нитросоединений в живом организме, наряду с эффективными электроноакцепторными свойствами, может быть ответственен за высокую биологическую активность этих соединений.

4 ГЛАВА 6. СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ И РАДИАЦИИ НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ТКАНЯХ ОПУХОЛЕЙ И ОРГАНОВ ЖИВОТНЫХ

В предыдущих разделах было показано, что нитросоединения снижают уровень радиационных повреждений биомолекул в системах, где отсутствуют условия для дальнейшего пострадиационного восстановления этих соединений. Кроме того, было показано, что нитросоединения подвергаются восстановительной биотрансформации в организме животных и гомогенатах печени, в результате чего образуются продукты, способные продуцировать оксид азота. При этом нитросоединения влияют на ряд важных.биохимических процессов, таких как транспорт кислорода, перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий и системе гидроксилирования эндоплаз-матического ре'тикулума с участием цит Р-450 и др.

Во наиболее важным для выяснения молекулярных механизмов радиосенсибилиэиругацэго-действия нитросоединений является . изучение изменений метаболических процессов.в опухоли при совместном действии на опухоль радиации и нитросоединений, а также реакции организма на эти воздействия з условиях, аналогичных используемым при лучевой терапия опухолей. В .настоявшем разделе* приведены результаты, кссхедоваккя изменений метаболических.парамагнитных центров в тканях опухолей и органов иивотных 'я изменений уровней- фосфатсодержащкк метаболитов в тканях оггухоли после введения ШЗО и МЕТРО, локального облучения опухоли и

- 34 -

после совместного действия этих факторов.

Парамагнитные центры в тканях опухоли и печени при облучении опухоли после введения животным нитроимидазолов.

Были исследованы спектры ЭПР печени и опухоли С 37 животных в различные сроки посл^ введения нитроимидазолов, после локального облучения опухоли как отдельно, так и через 30 мин после введения животным препаратов.

Опухоль. В спектрах ЭПР образцов опухоли, отобранных в ранние сроки развития после перевивки (5-7 сутки), регистрировался дублетный сигнал с е-фактором 2,005 и расщеплением в дублете 20 Гс, обусловленный ферментом рибонуклеотидредуктазой (РР) в активном состоянии (Cory J. at al. , 1985; Пулатова и со-авт.', 1986). По мере развития опухоли в спектрах появлялся и увеличивался по интенсивности сигнал нитрозильных комплексов Гем-NO. Регистрировались также сигналы железосерных центров с g -1,94 1-го комплекса дыхательной цепи митохондрий. Начиная с 7 суток после перевивки опухоли спектр ЭПР в области g-фактора 2,00 является суммой двух сигналов: нитрозильных комплексов Гем-NO и рибонуклеотидредуктазы.

Форма сигнала ЭПР нитрозильных комплексов Гем-NO менялась в процессе развития опухоли. По мере роста опухоли уменьшался вклад широкой компоненты сигнала и увеличивалась интенсивность хорошо разрешенного триплетного сигнала с g - 2,01 и расщеплением в триплете 17 Гс. Появление хорошо разрешенной триплетной структуры в спектре ЭПР комплексов Гем-NO обусловлено взаимодействием оксида азота с -субъединицами гемоглобина в Т-конфор-мации, характеризующейся низким сродством к кислороду.

В спектрах ЭПР экспериментальных опухолей появление хорошо разрешенной триплетной структуры регистрировали на поздние сроки развития опухолей, а при совместном действии на опухоль МИЗО и облучения или МЕТРО и облучения - в первые же часы после воздействий.

Мизонидазол. Изменения интенсивностей сигналов комплексов Гем-NO и железосерных центров после облучения опухоли, введения животным МИЗО и облучения опухоли через 30 мин после_введения

МИЗО животным показаны на рис.11. Можно видеть, что интенсивность сигнала комплексов Гем-ЫО увеличивается в первые 2-3 часа после введения МИЗО, практически не изменяется после облучения опухоли, но резко растет сразу после облучения опухоли с введенным за 30 мин до облучения МИЗО и далее постепенно снижается, но до уровня, который к б часам и даже к 24 часам после облучения остается выше, чем максимальное повышение при введении препарата отдельно.

При введении животным МИЗО изменение сигнала се - 1,94, обусловленного железосерными центрами 1-го комплекса дыхатель-

I

Время,ч

Рис.11. Изменение интенсивностей сигналов ЗПР нитрозильннх комплексов Гем-Ш (1) и яэлезосерных центров дыхательной цепи митохондрий (2) тканей опухолей С 37: А -. после локального облучения опухоли; Б - после введения МИЗО: В -при их совместно» действии. За точку начала отсчета по -оси времени взят момент введения-, препарата. В случае облучений без введения препарата эа начало отсчета принято 30 мин до облучения. Стрелками показано время облучения опухоли,.

ной цепи митохондрий печени, незначительно. Локальное облучение опухоли приводило к увеличению эффектов, вызванных введением препарата отдельно, как это было и в предыдущем случае.

Увеличение содержания комплексов Гем-Ш в опухоли после введения МИЗО могло возрасти в результате распада с отрывом N0 образовавшихся в процессе ферментативной биотрансформации продуктов неполного восстановления МИЗО (нитрозо- и гидроксилами-нопроиэводных). Облучение опухоли с МИЗО вызывает значительно большее образование комплексов Гем-Ш, и это может быть обусловлено образованием значительно большего количества промежуточных продуктов неполного восстановления МИЗО.

Печень. Исследование ткани печени при облучении опухоли и при совместном дёйствии МИЗО и локального облучения опухоли обусловлено тем, что Функциональное состояние печени отражает системный ответ организма на различного рода физические и химические воздействия. В ткани печени регистрируется ряд сигналов ЭПР, обусловленных парамагнитными центрами, принимающими участие в процессах переноса электронов в митохондриях и эндоплаз-матическом ретикулуме, а также в ряде других окислительно-восстановительных процессов. •

Для выяснения влияния изучаемых воздействий на парамагнитные центры печени были исследованы динамики изменения интенсив-ностей сигналов ЭПР этих центров. Были изучены динамики изменения интенсивностей метаболических парамагнитных центров в тканях печени как после локального облучения опухоли, введения МИЗО, так и после облучения опухоли на фоне введенного МИЗО, и было установлено, что более значительные изменения интенсивности сигналов, а именно, снижение сигналов Мо(+5)-содержащих центров, увеличение сигналов цит Р-450 и свободнорадикальных центров вызвало введение МИЗО, а локальное облучение опухоли после введения препарата усиливало те же самые изменения. Облучение опухоли отдельно не вызывало значительных изменений интенсивности сигналов ЭПР метаболических парамагнитных центров.

Фактически, уровень изменений метаболических центров, вызванных введением препарата, является отражением,степени токсического действия этого препарата для исследуемых тканей. В таком случае приведенные выше данные свидетельствуют о том, что

локальное облучение опухоли на фоне введенного МИЗО усиливает токсическое действие МИЗО на печень.

Метронидазол. Как и в предыдущем случае с МИЗО были исследованы изменения-интенсивностей сигналов ЗПР , обусловленных парамагнитными металлокомплексами и свободнорадикальными центрами тканей опухоли С-37 и печени мышей-опухоленосителей в зависимости от времени после введения МЕТРО, облучения опухоли и их совместного действия, и были получены те же самые закономерности, что и под действием МИЗО, но менее выраженные.

Парамагнитные центры в тканях селезенки и крови животных. В тканях селезенки в норме регистрируются, в основном, сигналы ЭПР рибонуклеотидредуктаэы и желеэосерных центров с g - 1,94. Рибонуклеотидредуктаза в активном состоянии обусловливает дублетный сигнал с g --2,005 и а - 20 Гс. В настоящее время показано, что интенсивность сигнала РР коррелирует, с уровнем активности этого фермента (Ehrenberg A. at al. , 1972; Пулатова М. К. и соавт. ,1986). РР является одним из ключевых ферментов в синтезе ДНК в связи с тем, что этот фермент участвует в восстановлении рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов, а эта стадия является скорость-лимитирующей стадией при синтезе ДНК

Изменение интенсивности сигнала РР в тканях селезенки наблюдали в различные сроки, после введения МИЗО, МЕТРО и НФА-100. После введения МИЗО интенсивность этого сигнала увеличивалась незначительно в первые два часа после введения препарата, затем снижалась на 30 X к 6 ч, после чего постепенно повышалась, но к 24 ч после введения еще оставалась сниженной на 15%. Принимая во внимание сигмоидальную зависимость скорости синтеза ДНК от уровня активности РР (Cory J.. Carter G. , 1986) ингибирование активности ферменте на 30 7. может привести к подавлению биосинтеза ДНК на 60 X .

В селезенке животных-опухоленосителей после введения животным МЁТРО в дозе 1 мг/г веса интенсивность сигнала РР увеличивалась почти в 1,5 раза в течение первых 30-45 мин после введения препарата, затем снижалась до значений, близких к интенсивности сигнала в норме. В опухоли введение МЕТРО приводило к. снижению : интенсивности сигнала'РР до 30 X к 9 ч Эти ойыты показали, что нитросоединения могут влиять на .активность одного

ив наиболее важных ферментов синтеза ДНК - рибонуклеотидредук-тазы. А влияя на активность РР, эти соединения могут влиять и на такие фундаментальные процессы в клетке как биосинтез ДНК, процессы репарации и пролиферации клеток. Ингибирование этих процессов под действием нигросоединений может вносить важный вклад в радиосенеибилизируицее и цитотоксическое действие этих соединений.

Кровь. Нитрисоедин^ния после введения их -животным первоначально попадают в кровь, где начинаются их превращения, приводящие к выделению оксида азота. Гемоглобин имеет высокое сродство к N0, поэтому при появлении в крови оксида азота образуются нитрозильные комплексы Гем-ИО. Сигналы ЭПР нитрозильных комплексов Гем-ЫО были зарегистрированы в крови после введения животным всех исследованных нитросоединений, интенсивность сигналов 'этих комплексов зависала от типа соединения. Введение нитросоединений приводило также к увеличению сигналов МеШэ, что указывает на участие этих соединений в окислении атомов железа гемгруппы НЬ до состояния Ре(3+). Образование нитрозильных комплексов Гем-ЫО и повышение уровня МеЬНЬ в крови свидетельствуют об убыли функционального гемоглобина крови и возникновении состояния гипоксии организма.

Существенное влияние оказывали нитросоединения на транс-феррин. При исследовании динамики изменения интенсивности сигналов ЭПР трансферрина в крови после введения МЕТРО, локального облучения опухоли животных и после совместного действия этих факторов было установлено, что во всех трех случаях имело место снижение интенсивности сигнала трансферрина' в' первые 3 часа после воздействий. Снижение интенсивности сигнала Ге(3+)-трансферрина свидетельствует о потере ионов железа белком и образовании апоформы белка. К 26 ч уровень Ге(3+)-трансферрина возвращался к исходному состоянию как после введения МЕТРО, так и после облучения опухоли. В случае совместного действия этих факторов содержание трансферрина к этому времени в 1,5 раза превосходило исходный уровень.

Известно, что трансферрин является- одним _ из важнейших участников процесса кроветворения, а именно , синтеза НЬ, а также синтеза ряда других^ Ре-содержащих белков. В связи с этим,

регистрируемые изменения в уровне транеферрина свидетельствуют о том, что МЕТРО (а также и другие нитросоединенин) затрагивают процессы кроветворения и синтеза железосодержащих белков. Это влияние носит временный характер при одноразовом введении нит-росоединений.

Фосфатсодержащие метаболиты в тканях опухали при облучении опухоли с мизонидазолом. Основную роль в нормальном функционировании клеток и поддержании в норме различных биохимических процессов в клетке играет энергообеспечение клеток. Нами бы.го исследовано методом ЯМР на ядрах фосфора 31 изменение уровня фосфатсодержащих метаболитов в тканях опухоли как после введения МИЗО и облучения опухоли, так и при совместном действии этих факторов.

При всех исследованных воздействиях наблюдали изменения интегральных интенсивностей сигналов, обусловленных фосфатсо-держащими метаболитами, что свидетельствовало об изменении концентраций этих важных энергетических метаболитов в опухоли.

Наиболее существенные изменения в уровнях фосфатсодержащих метаболитов выявлены в облученной опухоли животных, которым за 30 мин до облучения был введен МИЗО. Сразу после облучения наблюдали длительное (до б ч) снижение уровней АТФ и РСг. Наблюдаемое одновременно снижение уровней АТФ и РСг указывает на повышенное потребление АТФ в клетках облученной опухоли с МИЗО, так как в нормально функционирующей живой клетке пул РСг в первую очередь реагирует на изменения энергетических потребностей клетки, а пул АТФ поддерживается практически постоянным. Концентрации АТФ и РСг возвращались к исходным уровням к 24 ч. Сигнал Р ( наиболее значительно увеличивался так же к 6 ч'после введения препарата Наблюдали значительно более длительное, чем (?ри, отдельных воздействиях, снижение интенсивностей сигналов PME и PDE. Ощелачивание цитозоля в этом случае также происходило интенсивнее и носило более длительный характер, чем при отдельных воздействиях.

Обнаруженные закономерности нарушений фосфатного метаболизма под действием МИЗО характерны для токсического действия препаратов из разных классов на живые клетки (Ейманов В. Е. , Си-бельдина JL А. и соавт., 1989). По изменению рН,' как одного из

показателей проявления токсического действия соединений, было проведено сравнение действия МИЗО и МЕТРО на ткани печени и опухоли. Действительно, МИЗО, более токсичное соединение, чем МЕТРО, вызывало и больший сдвиг рН. Также под действием МИЗО щелочной сдвиг рН для тканей опухоли был больше, чем для тканей печени. Эти различия в изменении рН для печени и опухоли связаны с проявлением известного свойства нитроимидазолов - повышенной токсичности по отношению к гипоксическим клеткам по сравнению с нормально оксигенированными клетками, к которым в данном случае относятся клетки печени.

Усиление дисбаланса в содержании всех изученных фосфатных метаболитов в ткани опухоли при совместном действии- МИЗО и облучения (при той' же направленности изменений) свидетельствует об углублении токсического действия МИЗО. Ранее было предположено, что радиосенсибилизирующее действие нитросоединений обусловлено индуцированным действием радиации увеличением в гипок-сических зонах опухоли содержания токсических продуктов неполного восстановления нитрогруппы этих соединений. Этот вывод был сделан как. на основании изучения первичного радиационного поражения тканей животных в присутствии МЕТРО и МИЗО, так и изучения метаболических парамагнитных центров в облученных in vivo тканях опухоли с МЕТРО и МИЗО и описанных выше. Полученные результаты свидетельствуют о том, что токсическое действие МИЗО на гипоксические клетки опухоли усиливается при последующем облучении опухоли в результате накопления значительного количества токсичных продуктов неполного восстановления. Так, нарушения фосфатного метаболизма опухоли имеют качественно такой же характер, как и без облучения, но сильнее выражены. При этом эффекты, полученные при совместном действии' МИЗО и облучения не могут быть получены суммированием эффектов при отдельных воздействиях. Следовательно, механизмы действия МИЗО и облучения на ткани опухоли не являются независимыми.

Известно, что основным путем энергообеспечения опухоли является гликолиз. Усиление активности гликолитического пути образования АТФ обычно сопровождается эакислением внутриклеточной среды и повышением концентрации промежуточных продуктов гликолиза (РМЕ). При комбинированном действии на ткани опухоли МИЗО

и облучения наблюдается более длительное и глубокое, чем при отдельных воздействиях защелачивание цитоэоля, снижение уровня PME, РСг и АТФ, что позволяет судить о снижении активности гликолиза в данных экспериментальных условиях. Если учесть, что в зонах опухоли с недостаточным кислородным снабжением гликолиз является основным источником энергообеспечения, ингибирование гликолиза может явиться важным фактором в механизме радиосенси-билизирущего действия МИЗО.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При поиске и создании радиосенс^билизаторов для лучевой терапии опухолей значительный эффект в опытах ин виво был получен практически только для нитросоединений. К тому же, в начале 80-х годов уже было известно, что многие нитросоединения обладают противоопухолевой активностью, а также обладают способностью потенцировать действие ряда противоопухолевых препаратов. Поэтому при изучении молекулярных механизмов действия электроноакцепторных радиосенсибилизаторов гипоксических клеток опухолей наше внимание было сосредоточено на изучении молекулярных механизмов действия нитросоединений, для которых была установлена высокая радиосенсибилизирующая активность - это, в основном, производные 2- и 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана

Одним из основных интересующих нас вопросов во всех проводимых исследованиях был вопрос о роли нитрогруппы в проявлении биолгической активности различных нитросоединений. В работе были получены данные о влиянии нитроимидазолов на радиационное поражение тканей на разных стадиях поражения'- начиная с'влияния на образование первичных радиационно-индуцированных радикалов клеточных компонентов, и включая влияние на метаболические процессы в тканях опухоли и органов животных-опухоленосителей в раннем пострадиационном периоде.

Эти данные выявили основные особенности, вызванные присут- ' ствием нитроимидазолюв в облученных тканях животных: это образование ! значительного количества анион-радикалов этих соединен ний и снижение уровня .радиационно-индуцированных повреждений . биомакромолекул. Несмотря на то; что МИЗО и.МЕТРО являются ра-

диосенсибилизаторами, в их присутствии снижается уровень первичных повреждений биомакромолекул. При этом не будет происходить изменении поражения за счет реакций с гидроксильными радикалами, так как выход этих радикалов одинаков в тканях с нитро-имидазолами и без них. То есть непосредственно под действием радиации число первичных радиационных повреждений, возникающих в тканях и являющихся инициаторами развития дальнейших пострадиационных повреждений, в присутствии препаратов меньше, чем без препаратов. При этом возникает дополнительное количество радиационно-индуцированных анион-радикалов нитроимидазолов.

На основании того, что облучение опухоли с нитроимидазола-ми приводит к образованию значительного количества анион-радикалов этих соединений, начальных продуктов восстановления, нами было сделано предположение, подтвержденное затем дальнейшими исследованиями о том, что образование в гипоксических зонах опухоли токсичных продуктов неполного восстановления нитрогруп-пы, повышенное содержание которых индуцируется облучением, является основным фактором в проявлении нитросоединениями радио-сенсибилизируг"ц"го> эф^кта.

Известно, что в процессе полиого шестиэлектронного восстановления нитросоединений образуется следующие продукты: анион-радикалы, нитровопроизводные, гидроксиламинопроизводные л аминопроизводные: . .

1е 1е 2е 2е~

Р-ЫОр -► Р-ЫОр -1* Я-ИО -Р!-ЖОН -К-ИН0

с 2н 2н 2н ^

Было показано (УагсЬеге А., МНЬтоге В., 1978 - 1986) что промежуточные продукты восстановления - нитрозо- и гидроксиламинопроизводные являются во много раз более токсичными, чем исходное нитросоединение и конечный стабильный продукт восстанов-•ления - аминопроизводное.

О повышении в опухоли содержания продуктов неполного восстановления нитроимидазолов свидетельствовало значительное увеличение содержания нитрозильных комплексов Гем-НО, возникающих при взаимодействии гемсодержащих белков с.оксидом азота. Это увеличение отражает увеличение содержания в опухоли продуктов неполного восстановления нитроимидазолов, так как было показано

' - 43 -

(Исиченко Т. С. и соавт. , 1990), что отрыв оксида аэота при восстановлении нитрогетероциклических соединений может происходить на стадиях образования нитрозо- и гидроксилнминопроигводных.

Образование токсичных продуктов (нитрозо- и гидроксилами-нопроизводных) в результате радиационно-индуцированного восстановления нитрогруппы главным образом ответственно за радиосен-сибилизируюшее действие нитросоединений.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Проведено систематическое исследование влияния нитросоединений с потенциальными радиосенсибилизируюшими свойствами на метаболические процессы в тканях животных и на радиационное поражение тканей на равных стадиях поражения - начиная с влияния этих соединений на образование первичных радиационно-индуцированных радикалов клеточных компонентов, и включая влияние на метаболические процессы в тканях опухоли и органов жинот-ных-опухоленосителей в раннем пострадиационном периоде.

Получены следующие основные результаты:

1. Установлено, что нитрофураны, нитроимидазолы, нитрогли- ' церин подвергаются в организме животных и в гомогенатах тканей биотрансформации с выделением оксида азота Об этом свидетельствует появление в спектрах ЭПР тканей органов и крови животных в первые часы после введения нитросоединений (или при инкубации гомогенатов печени с нитросоединениями) сигналов ЭПР нитрозиль-ных комплексов Гем-Ш иРе-Б-МО.

2. Показано,-что образование оксида азота осуществляется в процессе восстановительных превращений нитросоединений, наиболее вероятно, на стадиях образования нитрозо- и гидроксилами-нопроиз водных.

3. Изучено влияние нитросоединений на образование первичных свободнорадикальных радиационных повреждений в тканях опу-1 холей и органов животных и показано, что при действии радиации в тканях с нитросоединениями в значительных количествах по. от--, ношению к радикалам биомакромолекул и радикалам ОН возникают

- 44 - "

анион-радикалы нитросоединений, при этом снижается уровень повреждений клеточных компонентов, а выход радикалов ОН не изменяется.

4. В присутствии нитросоединений в тканях при облучении установлено избирательное снижение выходов радиационно-индуцированных радикалов жиронокислотных остатков липидов, радикалов разрыва сложноэфирных связей в '{оефолипидах и ацилглицеринах и радикалов аддуктов Н тиминовых оснований ДКК.

5. Установлено, что нитрофураны и нитроимидазолы защищают липидные компоненты бислойных мембран от радиационного повреждения. При облучении бислойных мембран из фосфатидилхолин* в присутствии мегронидазола и нитрофуральдегида были значительно снижены выходы диеновых конъюгатов и' поражение олефиновых групп; наблюдали меньшее торможение головных групп, не наблюдалось образование лизолецитина.

6. Изучено изменение уровней фоо^итсод^ржащих метаболитов и рН в тканях опухоли после облучения опухоли, вьедения мизони-дазола и их совместного действия. Установлено, что облучение опухоли на фоне введенного препарата вызывает наиболее значительное снижение уровней АТФ, фоо^жреатина, фосфомоноэфирсв и защелачивание цитозоля, что свидетельствует об ингибировании гликолиза в опухоли.

7. Показано, что введение нитросоединений животным приводит к образованию нитроуильных комплексов Гем-Ш и Ре-5-КО и возникновению г^уической гипоксии, ингибированию системы гид-роксилирования эндоплазмнтического ретикулума, иингибированию ЦЭТ митохондрий, ингибированию'гликолиза, снижению уровней активного состояния рибонуклеоти.дредуктазы. Облучение опухоли после введения нитросоединений усиливало изменения, вызванные препаратами отдельно при одинаковой направленности изменений.

8. Показано, что облучение опухоли после введения животным нитроимидазолов приводит к значительному увеличению в опухоли содержания нитрозильных комплексов Гем-ЯО, повышение уровня которых свидетельствует об индуцированном действием радиации увеличении в опухали промежуточных продуктов неполного восстановления нитрогруппы - нит-розо- и гидрскеиламинопроизводных, дополнительных исючннкоь окоида НеСМ.

9. На основании полученных данных, а именно: снижения уровня радиационно-индуцированных радикалов биомакромолекул в тканях с нитроимидааолами, образования при этом значительного количества анион-радикалов нитроимидазолов, а также увеличения в облученной опухоли с препаратами содержания нитрояильннх комплексов гембелков, был сделан вывод о том, что основным ректором в механизмах радиосенсибилиаирующего действия нитросоедине-ний является радиационно-индуцированное усиление токсического действия этих соединений за счет увеличения содержания индуцированных действием радиации продуктов одно-, двух- и четырех-электронного восстановления нитрогруппы - анион-радикалов, нит-розо- и гидроксиламинопроизводных, токсичных и высокореакцион-носпособных продуктов.

Основные результаты диссертационной работы изложены в еле-, дующих публикациях:

1. Пулатова М. К. , Рихирева Г. Т. , Куроптева 3. Е Электронный парамагнитный резонанс в молекулярной радиобиологии // Москва, Энергоатомиздат, 1989.

2. Куроптева 3. Е , Пулатова М. К. ЭПР исследование молекулярного механизма действия производных 5-нитрофурана на клетку // В сб. тезисов Всесоюзного симпозиума "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород. 19-22 марта 1981 г., с. 11-12.

3. Лужков Е Б. , Куроптева 3. Е . Орлов Е С. , Пулатова М. К. Исследование электронной структуры анион-радикалов биологически активных производных 5-нитрофуранов методами ЭПР и квантовой химии •// Журнал структурной химии, т.22, N б, ,с. 81-87. 1981.

4. Лужков Е Е , Куроптева 3. Е , Пулатова М. К Исследование электронного строения анион-радикалов производных 5-нитрофурана методами ЭПР и квантовой химии // В сб. тезисов Все- * союзного симпозиума "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка, 1981 г. . с. 9-10.

5. Эмануэль Н. М., Пелевина И. И.., Воронина С. С., Пулатова М. К., . Куроптева 3. Е , Сухова Е М. , Лидак М. & ,. Воронова Е А. .Три-

фосфат^- метил- £-диэтиламинобутил^-амида 2- / 2- ( 5-нитрофу-рил-2-вини.п/-хинолин-4-карбоновой кислоты, обладающий ради-осенсибиливирующим действием // Авторское свидетельство М 736587 от ?9 январи 1980 г.

С. Куроптеьн о. В. , Пу.патова М. К. 0 метаболизме производных 5-нитрофурана в организм- животных // В сб. Тезисов докладов 1 Всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982 т. 3, с. 148.

7. Воронина С. С. , Пухова Н. М. , Сморызанова 0. А. , Деденков А. Е , Куроптева 3. В. , Пулатова М. К. Новые подходы к прогнозированию эффективности радиосенсибилизаторов гипоксических клеток и исследование радиосенсибилиэирующей активности нового препарата нитрофуранового ряда // В сб. Тезисов докладов Всесоюзной конкуренции "Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей", Обнинск, 1982, с. 11-13.

8. Куроптева 3. R. , Воронина С. 0. , Сухова Н. М. , Пулатова М. К , Пелевина И. И. Новые радиосенсибилизаторы нитрофураноього • ряда //■ В материалах 8 Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевом повреждении", Ленинград, 1982, с. 188.

9. Шубин r, е. , Куроптева 3. К Исследование методом ЗПР образования окиси азота при восстановлении нитрофуранов и нитрои-мидазолов. I. Растворы гемоглобина // Sludia biophysica, 1983, v. 97, p. 157-1(34.

10. Куроптева 3. В. , Думабаева Т. Т. , Пулатова М. К. Образование окиси азота при метаболизме производных 5-нит{юфурана // -Тезисы докладов 14 ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды. Москва, 1984, с. 586-587.

11. Kuropteva Z. V. , Pulatova М. К. New aspects of molecular mechanisms of action of nitrocompound radiosensitizers // In: Abstracts of 19th annual meeting of European society for radiation biology, Prague, 1985, p. 125.

12. Куроптева 3. В. , Паетушенко O.K. Измене-ния в парамагнитных комплексах кроьи и печени животных под действием нитроглицерина // Доклады АН СССР, 1985, т. 281, N 1, .с. 189-192.

13. Жумабаева Т. Т. , Куроптева 3. В. О молекулярных механизмах р&диосенеибклиаирур».ц-»го .действия нитросоединений // Радио-

- 47 -

биология. ,1986, т. 26, N 5. с. 671-674.

14. Kuropteva 2. V. , Sprinz Н. , Schaf^r Н. . Winkler Е. Effects of 5-nitro-2-furaldehyde on the radiation damage of liposomes // Studia biophysica, 1986, v. 113, p. 187-192.

15. Куроптева 3. E , Думабаева Т. Т. О молекулярных механизмах радиосенсибилиэирующгго действия нитросоединений, новые подходы к прогнозу их эффективности // М?д. радиология, 1986, т. 31, N 12, С. 56-59.

16. Думабаева Т. Т. , Кудрявцев М. Е. , Воронина С. С. , Куроптепа 3.R Влияние метронидазола и локального облучения опухоли на парамагнитные металлокомплексы тканей печени и опухоли // Радиобиология. 1987, т. 27, вып. 3, с. 334-389.

17. Жумабаева Т. Т. , Куроптева 3. Е , Пулатова М. К. Рибонуклео-тидредуктаза в тканях селезенки и опухоли в процессе развития саркомы 37 и под действием метронидазола // В сб. тезисов докладов 1 Всесоюеного совещания "Биофизика рака", Черноголовка, 1987, с. 55.

18. Думабаева Т. Т. , Шубин ЕЕ., Куроптева 3-Е Об активации нитросоединений в опухоли под действием радиации // В Материалах 3 Всесоюзного совещания "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей", Черноголовка, 1987, т. 2. с. 250-252.

19. Sprinz Н. , Frank U., Kuropteva Z. V. , Schafer H. NMR studies on irradiated lecithin Systems // In: Proceedings of Fourth Working Meeting on Radiation Interactions, Leipzig, 1988, p. 319-323.

20. Думабаева Т. Т., Куроптева 3. Е ЭПР исследование молекулярных механизмов совместного действия метронидазола и радиации на ткани -опухоли // В сб.: Материалы 15 научной конфе-,ренции молодых ученых ИХФ АН СССР, 1988 г., с. 54-71, Деп. ВИНИТИ N 1226- В88 ОТ 15,02.88.

21. Жумабаева Т. Т., Кудрявцев Я Б., Куроптева 3. R . Пулатова М. К. Изменение активности рибонуклеотидредуктазы в тканях селезенки и опухоли в процессе развития опухоли и под действием нитросоединений // Тезисы докладов Y1I Всесоюзной кож^ренции "Магнитный резонанс в биологии и . медицине", . Черноголовка, 1989, с. 139-140.

О

22. Куроптевн 3. R , Жумабаева Т. Т. , Кудрявцев М. Е. Исследование методом Э1ТР совместного действия радиации и нитроеоединений на ткани животных // Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка, 1989, с. 141-142.

23. Куроптева 3. В. , Кумабаева Т. Т/, Кудрявцев М. Е. О механизмах рндиоеенсибиливируи^го действия нитроеоединений // Тезисы докладов 1 Бсеоонйного радиобиологического съезда. Пушено, 1989, т. И, с. 357-358.

24. Jurczyk М. II. , Sv Ы uririiko D. А. , Kudryavtsev M. E. , Kuropteva Z.V. Ascorbic, ao.nl radicals induced by radiation in tumor tissues // Gtudia biophysica, 1989, v. 133, p. 19-24.

25. Jurozyk M. U. ; Yushnanov V. E. , 'Khristianovich D.S., Kudryavtsev M. E. , Kuropteva 7,. V. , -Sibeldina L. A. , Pisarski Т. 31-P NMR studies of changes in the murine liver metabolism afl.^r misonidazole aid metronidazole treatment // Studia biophysica, 1989, v. 133, p. 235-240.

26. Sprinz H. . Frank U. , Kuropteva Z.V. , Schafer H. NMR studies on irradiated lecithin systems // Radiat. Phys. Chera (Part C), 1989, v. 34, p. 383-385.

27. Jurczyk M. 1J. , Svist.unenko D. A. , Kudryavtsev M. E. , Kuropteva Z.V. Ascorbic acid radicals induced by radiation in tutnor tissues /V Studia biophysica, 1989, v. 133, N 1, p. 19-24.

28. Sprinz H. , Frank U , Winkler E. , Schafer H. , Kuropteva Z.V. The influence of various factors on the radiation induced structural damage and leakage of liposomes // Radiat. Phys. Chem. , 1990, v. 5, p. Г,45-649.

29. Yushmanov V. E. , Jurczyk M. U. , Khristianovich D.S., Kudryavtsev M. E. , Kuropteva 7. V. , Sibeldina L. A. , Pisarski T. 31-P NMR estinvition of metabolic changes in murine sarcoma 37 tumor cells after tumor irradiation and misonidazole injection to animals // (Aiterialy XXII O^o]nopol.sk lesjo Se'iiinarium na temat "Magnetyczne resonansu Jadrow-цо i jego -astosowan", Krakow, 1990, p. 207-212. (22 ?'Viio.ibCKH."i . семин-ip no ядерному магнитному резонансу и его применениям).

30. fiy.'kti'Oiii: У. К. , i'iUi^iuH Д. Э. , !>фыгин Б. 7L , Го}>6ич*ва JL Б. ,

Гудцова К. В. , Куроптева R , Жумабаева Т. Т. , Шамаев В. И. , Корман Д. Б. Спектры ЭПР рибонуклеотидредуктнзы в опухолевых ' тканях и органов животных-опухоленостителей // Известия АН СССР, серия биологическая, 1990, N 5, с. 737-748.

31. Кудрявцев М. Е. , Жумабаева Т. Т. , Грякалов К. Е , Куроптева 3. В. Влияние нитросоединений на первичное радиационное поражение тканей животных // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка, 1990, с. 9.

32. Юрчик М. У. , Юшманов R Е. , Христианович Д. С. , Кудрявцев М. Е. , Куроптева 3. В. , Сибельдина Л. А. , Писарский Т. ЯМР И ЭПР исследование совместного действия миэонидаэола и облучения на ткани, опухоли животных // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка, 1990, с. 23.

33. Куроптева 3. В. , Пйринц X , Жумабаева Т. Т. , Кудрявцев М. Е. Модификация первичного радиационного поражения биологических систем нитросоединениями // Труды Рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК, Дубна, 1990, с. 220-229.

34. Юшманов В. Е, Христианович Д. С. , Кудрявцев М. Е. , Юрчик М. У. , ' Куроптева 3. R Изменение энергетического метаболизма и рН опухолк С37 под действием мизонидазола и облучения // Материалы Всесоюеной конференции "Метаболические нарушения и их коррекция в онкологии", Москва, 1991, с. 114-115.

35. Kuropteva • 1.4. , Yushmanov V. Е. , Jurczyk М. U., Khristianovich D. S. , Kudryavtsev M.E., Pisarski • Т., Stbeldlna LA. ESR and 31-P NMR study of metabolic changes, in mouse tumor and liver after combined misonidazole and*

'irradiation treatment // Appl. Magn. Resonance,. 1991, v.2, N 3,- p. 495-510. •

36. kuropteva Z. V. ; Zhumabaeva T. 1. , Kudryavtsev M. E. Metronidazole decreases the level Of- radiation-induced radicals of the cell - components // Radiosensitizlng Newsletter, 1991, v. 10, N 2, p. 2-5. .

37. Kudryavtsev M.E., Kuropteva Z. V. Influence ' of nitrocompounds on primary radiation damage of animal ' tumor .

and tissues. // Proceedings of the 9th International Congress of Radiation Research, Toronto, Canada; (Eds. J. D. Chapman, V.C.Dewey, G. F. Whi tmore), Academic Press, 1991, v. 1, p. 462, (P3S-37).

38. Kuropteva Z.V., Yushmanov V. E. , Kudryavtsev M. E. , Khris-tianovich D. 3. , Jurczyk M. U. , Pisarski T. , Sibeldina L. A. Effects of misonidazole and irradiation on mouse tumor metabolism. ESR and 31-P NMR studies. // Proceedings .of the 9th International Congress of Radiation Research, Toronto, Canada, (Eds. J. D. Chapman, W. C. Dewey, a F. Whitmore), Academic Press, 1991, v. 1, p. 461.

39. Yushmanov V. E. , Kuropteva Z.V., Kudryavtsev M. E. , Khris-tianovich D.S., Jurczyk M. U. The mechanism of radlosen-sitizing effect of misonidazole on mouse sarcona 37 tumour

'// Proceedings of the 17th L. H. Gray Conference, 1992, Canterbury* U.K., CIO.

Подписало в печать I5.05.S2. Заказ 601 Форг.ат Гирах IOC

Москва. Типография Росселыозакадеши