Биохимические основы антибактериального действия комплексов переходных металлов

Бородулин, Владимир Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические основы антибактериального действия комплексов переходных металлов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биохимические основы антибактериального действия комплексов переходных металлов"

Г 6 ОД п'5авах р^кописи

БОРОДУЛИН Владимир Борисович

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСОВ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ

03.00.07 — Микробиология 03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Саратов, 1996

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганнческо.! химии Саратовского государственного медицинского университета,

Научный консультант:

член-корреспондент АЕ, доктор медицинских наук, профессор Ю. В. Куляш.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АЕ, доктор медицинских наук, профессор В. А. Блинов,

доктор биологических наук, доцент В. И. Панасенко,

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Ю. Ю. Елисеев.

Ведущая организация: Саратовский государственный университет.

Защита диссертации состоится 25 июня 1996 г. в 13 час. на заседании Диссертационного совета Д.074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан «. ..я+.в^&т...........1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Г. А. КОРНЕЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лекарственная устойчивость микроорганизмов является одной из центральных проблем микробиологии и молекулярной биохимии. Традиционный подход в решении этой задачи — путь синтеза новых антибактериальных соединений — встречает ряд существенных ограничений: во-первых, вследствие низкой, по отношению к микроорганизмам, селективности многих лекарственных препаратов, во-вторых, из-за развития устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам, которая обусловливается, как правило, R-плазмидами — внехромосомпыми генетическими элементами, способными к автономной репликации.

Несомненный интерес представляло бы обнаружение или создание лекарственных соединений, способных специфически связываться с R-плазмидами и обладающих выраженной нуклеазной активностью.

Проблема создания высокоспецифичных фармакологических соединений, способных связываться с заданными последовательностями пар оснований ДНК и оказывать направленное действие на функционирование определенных генов еще далека от своего решения.

В то же время обнаружена ДНК-специфичность ряда соединений, используемых в медицине, в частности, детально изучены молекулярные основы связывания с ДНК антибиотиков нетропсина, дистамицина и их производных (Zasedate-lev et al., 1976; Patel, 1979; Корка et al., 1985; Dervan, 1986). Исследуются механизмы формирования генотоксичности нит-рофурановых соединений и производных псоралена (Barbour et al., 1970; McCalla et al., 1978; Jenkins et al., 1976; Deb-nath et al., 1993; Anders et al., 1983; Sancar et al., 1985).

С другой стороны, за последние 15—20 лет обнаружены обширные классы химических препаратов, проявляющих нук-леазную активность под влиянием различных физических и химических факторов. Присутствие ионов тяжелых металлов

в структуре лекарственных соединений является однйм из условий, способствующих усилению ДНК-разрушающего действия изученных комплексов.

Нуклеазнай активность найдена для антибиотика диста-мицина в комплексе с Fe — ЕДТА и аскорбатом натрия, ме-таллопорфиринов, комплекса меди с фенантролином, антибио-ка адриамицина, некоторых соединений кобальта в присутствии различных восстанавливающих соединений: аскорбата натрия, тиола, ß-меркаптоэтанола (Dervan, 1986; Feinstain et al., 1983; Francois et al., 1988; Groves et al., 1989; Hui et al., 1990; Белков В. M. с соавт., 1995).

Нуклеазная активность ДНК-тропных соединений может появляться под действием рентгеновского излучения в присутствии ионов тяжелых металлов или различного рода восстановителей, а также под влиянием лазерного и УФ-излучений (Anders et al., 1983; Grokhovsky et al., 1990; Lee et al., 1988).

В современной литературе практически нет сведений о комплексном изучении воздействия физических излучений и химических веществ, включая ионы переходных металлов и молекулы ДНК-тропных лекарственных препаратов, применяемых в «линике, на нуклеиновые кислоты, несущие детерминанты антибиотикорезистентности.

Принципиально новым подходом является рассмотрение лекарственной органической молекулы как матрицы, несущей активные группы, способные взаимодействовать сразу с несколькими различными по природе физическими излучениями и .химическими соединениями, что приводит к разрушению плазмидной (хромосомной) ДНК.

Лекарственные вещества, в комплексе с переходными металлами, могут являться наиболее удачной моделью, поскольку ион тяжелого металла формирует в структуре лекарственной молекулы новые активные центры, реагирующие на физические и химические воздействия, что изменяет в целом биологические свойства лекарственного соединения и приводит к появлению у препарата нуклеазоподобпой и цитотокси-ческой активности. Вышеизложенное определило цель и задачи работы.

Цель исследования. Целью настоящей работы является теоретическая и методологическая разработка новых биохимических путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов на основе изучения нуклеазоподобпой и цитотоксической активности лекарственных соединений нит-

рофуранового ряда и их производных в комплексе с переходными металлами под влиянием физических излучений и ряда химических веществ.

Задачи исследования.

1. Изучить цитотоксическое действие па клетки Е. coli HB-101 комплексов переходных металлов в присутствии ас-корбата натрия и перекиси водорода, а также под влиянием лазерного и рентгеновского излучений.

2. Исследовать условия, при которых достигается максимальный антибактериальный эффект комплексов переходных металлов под действием физических и химических факторов.

3. Рассмотреть цитотоксичность комплексов переходных металлов на клетках Е. coli К-12, содержащих плазмиду нит-рофураирезистеитности, в присутствии химических соединений и под влиянием физических излучений.

4. Определить 'нуклеазоподобное действие лазерного и рентгеновского излучений, а также аскорбата натрия и перекиси водорода на плазмидные ДНК, несущие детерминанты антибиотикорезистентности, в присутствии комплексов пере-, ходных металлов; экспериментально выявить реакционные центры, входящие в структуру нитрофурановых комплексов и формирующие нуклеазную активность этих соединений.

5. Исследовать оптические и стереохнмические характеристики комплексообразования с природными и синтетическими ДНК соединений переходных металлов Pd2+, Pt2+, Cu2+, Со2+, имеющих в структуре азотсодержащие гетероциклические лиганды, включая нитрофурановые препараты и их производные.

Научная новизна. Настоящая работа имеет фундаментальный и прикладной характер. В результате изучения влияния физических и химических факторов в сочетании с комплексами переходных металлов на ДНК и бактериальные клетки был открыт принципиально новый подход к традиционным лекарственным средствам, а именно: разработаны конкретные физико-химические представления о лекарственном соединении как органической матрице, несущей активные группы и способной взаимодействовать с различными по природе физическими и химическими факторами, изменяя свою биологическую активность.

Открыты новые пути формирования нуклеазоподобной и цитотоксической активности препаратов нитрофуранового ряда.

Впервые экспериментально показано появление интенсивной нуклеазной активности у комплексов переходных металлов с нитрофураиами под влиянием лазерного и рентгеновского излучений, а также в присутствии аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода.

Обнаружено усиление антибактериального действия некоторых комплексов переходных металлов с нитрофураиами в присутствии аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода.

Исследованы условия, при которых достигается максимальный антибактериальный эффект исследованных комплексов.

Показана возможность преодоления лекарственной устойчивости микроорганизма к нитрофуранам (использовались клетки Е. coli К-12, несущие плазмиду, кодирующую нитро-фуран-резистентность данного штамма) с помощью реакционной системы, содержащей комплекс переходного металла и аскорбат натрия (аскорбат натрия/перекись (водорода).

Изучены оптические и стереохимические характеристики взаимодействия с синтетическими и природными по-лидезоксирибонуклеотидами комплексов переходных металлов Pd2+, Pt2+, Cu2+, Со2+ с азотсодержащими лигандами, в том числе нитрофурановыми лекарственными препаратами.

Впервые экспериментально показано, что образование комплекса переходного металла с нитрофураиами приводит к появлению новых свойств у лекарственной молекулы, в частности к способности взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Обнаружено, что нитрофураны в свободном состоянии не взаимодействуют с ДНК.

Экспериментально идентифицированы химические группы комплекса, реагирующие на физические (лазерное и рентгеновское излучения) и химические (аскорбат натрия, перекись водорода) воздействия. На основании экспериментальных фактов обосновываются оригинальные механизмы, объясняющие превращения лекарственных молекул под действием физических излучений и химических реагентов.

Продемонстрирована принципиальная возможность обнаружения сайт-специфичных мест локализации комплексов переходных металлов на ДНК с помощью рентгеновского и лазерного излучений без участия ферментов (рестриктаз или неспецифических нуклеаз).

В процессе изучения влияния физических и химических

воздействий па органические молекулы лекарственных соединений ннтрофурапового ряда было выявлено несколько активных групп в молекуле лекарственного препарата (ион переходного металла, триазольпое кольцо, азометиновая группа, нитрофурановый хромофор), благодаря изменению свойств которых может изменяться и биологическая активность самой молекулы.

Полученные результаты представляют собой инструмент, с помощью которого можно отыскать похожие химические группы в других классах лекарственных соединений. Более того, результаты диссертации позволяют рассматривать любую лекарственную молекулу как матрицу, способную к превращениям под влиянием соответствующих физических или химических факторов, а задача исследователя сводится к нахождению реакционного центра и подбору условий для «запуска» той или иной химической (биохимической) реакции.

Практическая ценность. Данное исследование открывает новые практические возможности для решения одной из важнейших проблем микробиологии — лекарственной устойчивости микроорганизмов, преодоление которой лежит не на пути синтеза новых химиотерапевтических препаратов, а на комбинированном использовании лекарственного соединения в сочетании с физическими излучениями им химическими соединениями. Показано усиление антибактериального действия медь- и кобальтсодержащих нитрофурановых комплексов переходных металлов в присутствии аскорбата натрия и смеси: аскорбат натрия/перекись водорода.

Показано, что у некоторых нитрофурановых комплексов переходных металлов появляется интенсивная нуклеазопо-добная активность под действием лазерного и рентгеновского излучений, а также в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода.

Полученные результаты применяются в исследованиях для определения специфичных мест локализации на ДНК лекарственных препаратов, обладающих низкой константой связывания.

Данные, представленные в диссертации, используются .в качестве лекционного материала для студентов университета.

Разработан вариант методики (В1'гпЬо1'т е! а!., 1979) выделения плазмид из клинических штаммов. Этот метод внедрен в практику клинической лаборатории Саратовского НИИ травматологии и ортопедии МЗ и МП Российской Федерации

2 Заказ 251

В виде информационного письма «Дополнительный тест для характеристики грамотрицательной госпитальной инфекции в травматологическом стационаре», 1995 г. Рассматривается вопрос о создании на базе клиник г. Саратова единого методического центра для формирования банка данных по плаз-мидам патогенности и вирулентности. Для студентов медицинских университетов, для лечебно-профилактических учреждений и научно-исследовательских институтов разработаны и представлены к печати методические рекомендации «Выделение плазмидной ДНК из условно-патогенных грамот-рицательных микроорганизмов», 1996 г., с целью изучения методов выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток, участвующих в формировании госпитальной инфекции в стационаре. Оформлены два информационных листка № 67-90, 1989 и № 505-90, 1990 г. Имеется авторское свидетельство № 1092918 на изобретение «Пентазамещенные соли тиапирилия, обладающие антимикробной и антифаговой активностью», 1984 г. Получены удостоверения на рационализаторские предложения № 2171, 2172, 2173, 1996 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антибактериальное действие на штамм Е. coli НВ-101 некоторых комплексов переходных металлов с нитрофурана-ми усиливается в присутствии «естественных метаболитов»— аскорбата натрия и перекиси водорода.

2. Увеличивается цитотоксичность препаратов нитрофура-нового ряда в комплексе с переходными металлами в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода при действии на клетки Е. coli К-12, содержащих плазмиду нитрофу-ранрезистентности.

3. Эффективность ингибирования клеточного роста модельных штаммов Е. coli НВ-101 и Е. coli К-12 зависит от условий культивирования клеток.

4. Обнаруживается интенсивная нуклеазоподобная активность лекарственных соединений нитрофуранового ряда в комплексе с переходными металлами под влиянием лазерного и рентгеновского излучений, а также в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода.

5. Выявляется разрушение плазмидной ДНК, несущей детерминанты антибиотикорезистентности под влиянием физических и химических факторов в присутствии лекарственных препаратов.

6. Введение иона переходного металла в структуру лекарственного соединения приводит к формированию новых активных центров, изменяющих биологические свойства лекарственного препарата.

7. ДНК-тропная активность лекарственных препаратов появляется вследствие взаимодействия переходных металлов с нитрогетероциклическими лигандами.

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Саратовского медицинского Университета при консультации заведующего кафедрой, доктора медицинских наук профессора Ю. В. Куляша.

Автор также выражает глубокую признательность и благодарность Г. А. Корниенко, Т. А. Большинсковой, В. И. Ла-бунской, В. Н. Кравцовой, А. Д. Шебалдавой, И. А. Ефп-менко, академику И. В. Доморадскому.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: V Международном конгрессе по химии фурана (Рига, 1988); XVII Всесоюзном Чугаевском совещании по химии комплексных соединений (Минск, 1990); XVIII Выездной сессии секции бионеорганической химии Научного Совета по неорганической химии АН СССР (Бишкек, 1991); I Международной конференции по биокоордннационной химии (Иваново, 1994); VIII Международной конференции по химическим реактивам (Уфа, 1995). За циклы работ, составивших отдельные этапы настоящего исследования, автор являлся с 1993 по 1995 г. персональным стипендиатом University of Oslo Center for Medical Studies (Осло, Норвегия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе в зарубежных и центральных изданиях.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы.

Работа иллюстрирована 17 таблицами и 72 рисунками, включая 41 фотографию. Библиография содержит 251 источник, из них 57 отечественных и 194 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Комплексы переходных металлов и их лиганды. В работе использовались следующие соединения:

I. КгРсЮЦ — тетрахлоропалла'дит (II) калия.

II. Pdn2Cl2 — цис-дихлороддшшрролидонпалладий (II).

III. PdTpHC2Cl2 — тране-дихло'родитригидрокеиметилами-нометанпалладий (II).

IV. РбЭф — N-M-enui-N- (1-окси-1-фенилизопропил) аммоний тетрахло'ропалладиевокислый.

V. Р0Фет — N-эгил-N (1-окси-1-(З-окси-фенил)-этил) аммоний тетрахлоропалладиевокислый.

VI. РсШев — N- (1,3-онси-1- (4-нитрофенил) -изопропил) аммоний тетрахлоропалладиеиокислый.

VII. Рй-тио®синат2 — 5-сульфо-8-меркаитохинолинат палладия.

VIII. [Pd- (триазолат)4]12 — 3-меркапто-4-амино-5-метил-1,2,4-гриазолаг палладия.

IX. Pd(NHs)2Cl2 — транс-дихлородиамминопалладий (II).

X. [Pd (NH3)4]Cl2 — теграмминопалладий (II) хлорид.

XI. Pd (ТрЭгСЬ-транс-дихлородитриазолатпалладий (II).

XII. PdÓ32Cl2 — транс-дихлороди-1-(5-нитро-2-фурфу1ри-

лиденамино)-1,3,4-триазолпалла,дий (II).

XIII. СиФЗгСЬ — транс-дихло|роди-1- (5-нитро-2-фурф;ури-лиденамино)-1,3,4-триазолмедь (II).

XIV СоФЗгСЬ — транс-дихлороди-1-(5-нитро-2-фурфу-рилиденамино) -1,3,4-триазолкобальт (II).

XV. СиТрис2С12 — транс-дихлородитригидроксиметилами-нометанмедь (II).

XVI. K2PtCl4 — тетрахлороплатинит (II) калия.

XVII. Pt®32Cl2 — транс-дихлороди-1-(5-нитро-2-фурфури-лиденамино)-1,3,4-триазолоплатина (II).

XVIII. Солафур — N-(5-нитро-2-фурилаллилидеи-1-ами-догидантоин.

XIX. Фуразонал — N - (5-нитро-фурфурилиденамино) -1,3,4-триазол.

XX. Фуракрилин — 1М-(5-нитро-2-фурилаллилиденамино)-1,3,4-триазол.

XXI. Фуразолидон — 1Ч-(5-нитро-2-фурфурилиден)-3-а'Ми-но-2-оксазолидон.

XXII. 1- (2-фурфурилиденамино)-1,3,4-триазол.

XXIII. 1-(5-метил-2-фурфурилиденамино)-1,3,4-триазол.

Синтез соединений, использовавшихся в диссертации, был

выполнен в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН под руководством доктора химических наук, заведующей лабораторией биокоординационной

химии платиновых металлов И. А. Ефименко, а также в научно-исследовательском институте химии при Саратовском государственном университете под руководством кандидата химических наук А. Д. Шебалдовой.

Физико-химическое исследование комплексов переходных металлов и их лигандов. В работе использовались следующие методы: ВЭЖХ-хроматография (образцы наносились на колонку «Silasorb» С-8, 16X250 мм, 5 кмк, № 78, США; детектор «Gilson», Франция); масс-спектрометрия (плазменная десорбция осколками деления 252Cf, прибор MSBX, г. Сумы, Украина, НПО «Электрон»); УФ-спектроскопия (спектрофотометры «Beckman», «Сагу», США и «Specord UV-VIS», Германия); спектроскопия кругового дихроизма (дихрограф «Jobin Ivon Mark III», Франция). Данные по электронному парамагнитному резонансу были получены на-приборе ЭПР-2 (конструкции Семёнова), амплитуда модуляции 3 эрстеда, скорость магнитной разверстки ~ 120 э/мин, в качестве эталона использовали марганец в кристаллах, МпО.

ИК-спектры снимали на спектрометре «Perkin — Е1-mer-577» (Швеция) в виде суспензии в вазелиновом масле.

Квантовохимические расчеты и конформационный анализ взаимодействия ряда соединений с ДНК исследовали методом конформационного анализа «AMBER» на компьютере IBM PC АТ-486. Использовали лицензированную программу «Hyperchem» фирмы «Avtodesk», адаптированную для изучения комплексов низкомолекулярных соединений с ДНК- Проведены квантовохимические расчеты спектров поглощения солафура по методу ППДП/2 с помощью пакета программ, разработанных в лаборатории рентгеноструктурного анализа ИНЭОС РАН. __

Бактериальные клетки и среды. В экспериментах использовался штамм Е. coli НВ-101 (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгелвгардта РАН) и штамм Е. coli J<-12, ^несущий плазмиду pLD-105, кодирующую устойчивость к нитрофуранам (получен из коллекции академика И. В. Домо-радского). Единичная колония выращивалась в LB-среде (Юг бактотриптона, фирма «Pronadisa», 5 г дрожжевого экстракта, фирмы «Pronadisa», 10 мг NaCl, 50 мг NaOH, «Реахим», о. с. ч. до pH 7,5 и до 1 л дистиллированной воды) при 37° С в течение ночи при интенсивном встряхивании. 5 мкл ночной культуры помещали в 10 мл LB-среды в полипропиленовом .стакане объемом 50 мл, фирма «Nu'pk», и выращивали при

37° С в течение 3 — 4 часов при интенсивном встряхивании до оптической плотности 0,2—0,4 о. е. (Я — 600 нм). Оптическую плотность измеряли па спектрофотометре «Вескгпап». Данная оптическая плотность соответствовала логарифмической фазе роста клеток. Твердая питательная среда готовилась из LB-среды и агара «Bacto Mac Concey Agar Base» (фирма «Difco») в пропорции 1 л LB-среды на 20 г агара, автоклавировалась в течение 30 мин при 2 атм, разливалась на чашки Петри диаметром 60 и 90 мм (10 или 20 мл соответственно), чашки стерилизовались ультрафиолетом 30 мин. В экспериментах использовались только свежеприготовленные твердые питательные среды.

Определение степени ингибирования по росту бактериальных клеток в LB-среде. 5 мкл ночной культуры помещали в 10 мл LB-среды в полипропиленовом стакане объемом 50 мл (фирма «Nunk») и выращивали при 37° С при интенсивном встряхивании до оптической плотности 0,1—0,3 о. е. (X — 600 нм). Аликвоты по 0,5 мл этой суспензии переносили в • стеклянные колбы объемом 100 мл, вносили по 4,5 мл LB-среды, выращивали при 37° С до оптической плотности 0,02—0,05 о. е., добавляли растворы комплексов металлов, аскорбата натрия, перекиси водорода и инкубировали при 37° С при интенсивном встряхивании. Через каждые 20 мин инкубации отбирали аликвоту и определяли оптическую плотность (^, = 600 нм) при 20° С. Во время отбора аликвот встряхивание проб не производилось.

Определение степени ингибирования по числу выросших клеточных колоний. Концентрацию бактериальных клеток в контроле подбирали таким образом, чтобы иметь от 500 до 1000 колоний на чашке. Для учета того, что процедура посева на каждую чашку занимает несколько минут и при этом продолжается рост клеток, в каждой серии экспериментов по ингибированию ставилось два контроля — в начале и в конце серии. Процент выживших колоний бактериальных клеток для каждого образца вычислялся по формуле:

X% = Nx/(Nk1+x-(Nk2-Nk1)/n),

где Х% — процент выживших колоний бактериальных клеток; х — номер образца; п — число образцов в серии; Nki — число колоний в первом контроле; Ыкг — число колоний во втором контроле. Подсчет колоний производили согласно (Мейнелл Дж., 1967). Статистическая обработка результатов

и достоверность полученных данных определяли согласно (Рокицкий П. Ф„ 1973).

Выделение плазмидной ДНК. Использовали клетки Е. coli НВ-101, содержащие плазмиды pUC-1'2, pUC-19, pBR-322 (Ашр+). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Birnboim et al., 1979).

Выделение фрагментов ДНК и методика футпринтинга. После обработки рестриктазами Dde I («Boechringer Mannheim»), Ava II, Eco RI, Hind III, Alu I, Sau 3a («Sigma») фрагменты плазмиды pUC-12 разделяли в 5% полиакрил-амидном геле. Для введения радиоактивной метки по одному из 3' — концов фрагмента использовали соответствующие (cc-32P/NTP («Изотоп», Ташкент), немеченые дезоксири'бо-нуклеозидфосфаты и фрагмент Клёнова ДНК-полимера-зы I Echerichia coli («Boechringer Mannheim»),

Раствор меченого фрагмента ДНК (3000—10000 расп/мин) смешивали с 6-10~5М (Р/2) немеченой ДНК плазмиды pBR322 или ДНК pUC-12. Эти нуклеиновые кислоты использовались как носитель заданной концентрации. Растворы фрагмента, немеченой ДНК и комплексов готовили в одном и том же буфере: 10 мМ NaC104 или 0,1 мМ Трис. HCl, pH 8,0, 2*10~4M NaCl. При обработке образцов ферментами: ДНК-азой I и SI нуклеазой («Sigma»), предварительно растворяли необходимое количество фермента в соответствующем буфере. Концентрации нуклеаз, время обработки образцов и температурный режим реакции подбирали эмпирически. После обработки образцов (рентген, лазер, нуклеаза) использовали методику, описанную Grokhovsky et al., 1990.

Продукты расщепления фрагмента идентифицировались сравнением с A+G — расщеплением по Махаш et al., 1977.

Методом футпринтинга можно с точностью до 1 нуклео-тида указать место связывания комплекса или лиганда на фрагментах плазмиды.

Агарозный гель-электрофорез плазмидной ДНК после обработки комплексами переходных металлов. Кроме метода футпринтинга — электрофореза, в полиакриламидном геле — использовали также дополнительной метод — агарозный гель-форез, также регистрирующий взаимодействие комплексов переходных металлов с ДНК. Образцы, содержащие плазмидную ДНК (pBR-322, pUC-19, «Sigma») и комплексы переходных металлов, подвергали стандартной обработке рестриктазами, рентгеновскому или лазерному облучению.

Использовались следующие нуклеазы: Sau ЗА, Нра II .(«Sigma»); 1% агароза (А 6013, «Sigma», Type I: Low ЕЕ0); буфер TBE XI.

Нуклеиновые кислоты и синтетические полидезоксирибо-

нуклеотиды. В экспериментах использовались следующие препараты поли (с!А)-поли (dT), Ег58= 12000 м-1-см*"1, поли (dG) - поли (dC), Е258= 14 800 м-1-см-1, поли /d (G— С) • • поли /(G —С)/, Е254=16800 м-1-см-1, поли /d(А — Т)/-поли /d(А — Т)/, Е2бо= 13 600 м-1 • см-1, фирмы «Р. L. Biochemi-cals», США. ДНК фага Т2 (65% AT, Е260 = 13200 • см"1), ДНК из тимуса теленка (58% AT, Е2со= 13300 м-1 • см-1) фирмы «Sigma». Коэффициент молярного поглощения рассчитывался на 1 моль пар оснований ДНК- Концентрацию полинуклеотидов и комплексов в растворе определяли на спектрофотометрах «Beckman» и «Сагу» производства США. Синтетические полимеры и ДНК растворяли в буфере Ю-4 М. Трис. HCl; 2-10-4 М NaCl и диализовали против необходимого буфера. Ионная сила варьировалась от 10_4М до 0,15М NaCl.

Источники рентгеновского и лазерного излучения. Для облучения образцов рентгеновскими лучами использовали рентгеновскую трубку БХВ — 7, материал анода — вольфрам, U = 35 кВ, 1 = 80 мА, мощность дозы 0,5 М рад/час (Лаборатория радиационной химии, химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова).

Полихроматическое рентгеновское излучение вольфрама представлено квантами с энергией от единиц до 35 кэВ с максимумом в области 22,5 кэВ. Облучение проводилось при 5° С в течение 2 минут через стенки реакционной пробирки фирмы «Eppendorf» объемом 0,5 мл из полипропилена со средней толщиной стенок 1 мм, что приводило к практически полной фильтрации мягкого рентгеновского излучения (менее 10кэВ), Halpern, 1982.

При облучении образцов лазерным излучением пользовались в качестве источника УФ-излучения азотным газовым импульсным лазером ЛГИ-505 (длина волны 337 нм, длительность импульса 10 не, средняя мощность 150 мВт). Время облучения 1 —60 минут.

Гибкий световод лазера опускали в затемненную полипропиленовую пробирку фирмы «Eppendorf» объемом 1,5 мл на такое расстояние, чтобы фокус излучения находился приблизительно в центре раствора, объем раствора варьировался от 20—30 мкл до 2 мл. - - .......... • • .

В качестве источника лазерного излучения, кроме лазера ультрафиолетового диапазона = 337 им), характеристики которого описаны выше, применяли инфракрасный полупроводниковый лазер на галлия арсениде (АЛТ «Узор»), длина волны излучения которого — 890 нм, длительность импульса 70 не, частота — 1500 Гц, мощность в импульсе-— 4 Вт. Мощность лазерного излучения контролировали с помощью ИМО-2Н.

В качестве основного дозиметрического параметра нами была выбрана плотность дозы, поглощенной колонией микроорганизмов (Н) в Дж/см2. Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета прикладных программ на IBM PC/AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В СОЧЕТАНИИ С КОМПЛЕКСАМИ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ Е. coli

Подавление роста клеток Е. coli комплексами переходных металлов в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода.

Культивирование клеток штамма Е. coli НВ-101 в условиях, способствующих интенсивному клеточному делению (LB — среда, 37° С, максимальная аэрация среды) в присутствии СиФЗгС^ (СоФ32СЬ2) и «естественных метаболитов» — аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода приводит к выраженному эффекту ингибирования роста клеток. Подавление клеточного роста комплексами ФЗ обнаруживалось в двух независимых экспериментах: по изменению оптической плотности среды и с помощью подсчета выросших колоний па твердой питательной среде. При сравнении числа клеточных колоний в контроле и опыте с использованием критерия соответствия, обнаруживается достоверное различие между фактическими и теоретическими ожидаемыми результатами, причем значение оказывается существенно выше пороговой величины (Р<0,001). Выращивание клеток Е. coli НВ-101 в условиях культивирования, тормозящих клеточный рост (20° С, отсутствие проточной аэрации), приводит к усилению эффекта ингибирования бактерий аскорбатом натрия в присутствии комплексов фура-зонала с медью и кобальтом (Р<0,001).

3 Заказ 251

Возможно, в условиях интенсивного клеточного деления (37° С, аэрация среды) возрастает скорость потребления ас-корбата натрия делящимися клетками как питательного субстрата, что приводит к формированию метаболических путей утилизации аскорбата натрия отличных от окислительно-восстановительной реакции с участием комплексов переходных металлов.

Подавление роста клеток комплексами ФЗ в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода наблюдалось при инкубации в течение 3 часов при 20°. Выраженный антибактериальный эффект обнаруживают оба комплекса. Вероятное объяснение этому эффекту заключается в активном участии перекиси водорода в окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в системе металл — триазольное кольцо (Р<0,001).

Таким образом, впервые показана возможность подавления роста бактериальных клеток при совместном использовании комплексов переходных металлов и «естественных» клеточных метаболитов — аскорбата натрия и перекиси водорода.

Эффективность ингибирования клеточного роста зависит от [условий проведения эксперимента: концентрации препаратов, условий культивирования клеток. Отмечается значительное усиление антибактериального действия комплексов переходных металлов в сочетании с аскорбатом натрия и перекисью водорода по сравнению с исходными комплексами — Си(ФЗ)2С12, Со(ФЗ)гС12 — и их лигандом — фуразоналом.

Впервые обнаружено ингибирование комплексами переходных металлов в присутствии «естественных метаболитов» роста клеток штамма Е. соН К-12, который содержит плазмиду рЬД-105 с детерминантом резистентности к нитрофуранам и их комплексам. Культивирование бактериальных клеток (37° С, максимальная аэрация ЬВ-среды) в присутствии фу-разонала и СиФЗгСЬ не вызывало подавления клеточного роста. Однако при добавлении в среду аскорбата натрия (перекиси водорода) наблюдалось падение оптической плотности среды, содержащей микроорганизмы. Подсчет числа живых клеточных колоний Е. соН К-12 (рЬД-105), выращенных при 37° С и 20° С, в контроле и опыте обнаруживает достоверные различия в величине критерия (Р<0,001), причем значение %2 значительно превышают пороговые величины достоверности.

Таким образом, 'наблюдался эффект, который можно охарактеризовать как явление «преодоления лекарственной устойчивости микроорганизма к препаратам нитрофураново-го ряда».

Действие лазерного излучения (ЛИ) с нитрокомплексами переходных металлов на клетки Е. coli. Мы пользовались двумя основными методиками, с помощью которых обнаруживали фотодействие лазерного излучения па бактериальные клетки:

1) облучению подвергались колонии клеток, выросшие на твердой питательной среде, и

2) облучали раствор бактериальных клеток (среда LB) с последующим высевом на твердую питательную среду.

Возможны несколько механизмов воздействия ЛИ на бактериальные клетки:

1) тепловой шок вследствие прямого термического действия излучения;

2) термомехапическое повреждение клеток вследствие возникновения упругих колебаний ультразвукового диапазона, обуславливающих объемное расширение ткани и образование пузырьков пара на границе раздела фаз; этот эффект объясняется более быстрым объемным расширением ткани по сравнению со скоростью передачи теплового колебания соседним молекулам;

3) фотохимическое превращение нуклеиновых кислот и белков в полосе поглощения их хромофоров;

4) ионизация молекул и образование свободных радикалов при прямом воздействии ЛИ; ,

5) многофотонное поглощение, приводящее к разрыву химических связей в молекулах хромофоров;

6) фотолиз.

Прямое действие светового потока, фотолиз и многофотонное поглощение возможны лишь при большой энергетической плотности ЛИ порядка 1024 кванта/см2 • с. Максимальное количество фотонов, полученных в наших экспериментах, не превышало 10'7 квант/см2-с, поэтому эти механизмы можно во внимание не принимать. Кроме того, изученные нами длины волн (337, 890 нм) не совпадают с полосами поглощения нуклеиновых кислот и белка.

Прекращение роста бактериальных клеток под воздействием УФ ЛИ регистрируется, начиная с плотности поглощенной дозы 30 Дж/см2. Более того, отмечается термомеханический эффект разрушения бактериальных колоний. При этом

на поверхности агара образовывался кратер глубиной до 0,5 мм.

Данные, полученные нами в ходе исследований, свидетельствуют о наличии изменений антибиотикочувствительно-сти штаммов Е. coli под влиянием УФ и ИК ЛИ, в основном к антибиотикам-макролидам (неомицин, гентамицин, стрептомицин), точкой приложения которых в бактериальной клетке является белок L — b рибосом. Более вероятным представляется не модификация мишени (белок L — Ь) под действием лазерного излучения, а изменение проницаемости клеточных мембран для соответствующих антибиотиков.

Изменение в агарозном геле профилей электрофоретиче-ской подвижности плазмид pUC-19, выделенных из облученных клеток Е. coli ЛИ с длиной волны 337 нм, обнаружено не было, что указывает на отсутствие конформационных изменений сахарофосфатного остова плазмиды. Данный результат не является неожиданным, так как максимум повреждающего действия света на нуклеиновые кислоты отмечается при длине волны излучения 254 им,, то есть в полосе поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований ДНК.

При исследованиях совместного действия лазерного излучения и нитрофурановых комплексов (Рс1Ф32С12; СиФЗгС12; СоФЗгС12; Р1Ф32С12) обнаружен эффект аддитивности в подавлении роста клеток Е. coli НВ-101.

Предварительное облучение нитрофуранов (солафур, фу-разонал) и их комплексов лазерным излучением с длиной волны 337 нм приводило к резкому снижению антибактериальных свойств указанных соединений.

Определялась также антибактериальная активность сола-фура до и после облучения лазером методом серийных разведений на штамме Е. coli НВ-101. Бактерицидная концентрация солафура 33 мкг/мл среды. После 15 минут облучения антимикробная активность нитрофурана полностью исчезла.

Таким образом, не обнаружено воздействия па нуклеиновые кислоты бактериальных клеток ЛИ с длинами волн 337 и 890 нм.

Отмечено изменение чувствительности бактериальных клеток к антибиотикам-макролидам, что объясняется, вероятно, изменением проницаемости клеточных мембран.

Обнаружен термомеханический эффект воздействия УФ ЛИ на бактериальные клетки при плотности поглощенной мощности более 30 Дж/см2.

Можно предположить, что биологические эффекты, обнаруженные клиницистами при действии ЛИ на раневую поверхность (ускорение репаративных процессов, очищение раны о г бактериальных и некротических масс и так далее), не связаны с прямым действием ЛИ на геном бактериальных клеток.

Изучение влияния рентгеновского излучения совместно с комплексами переходных металлов па бактериальные клетки Е. coli. Использован метод подсчета колоний. Изученные нами комплексы переходных металлов (Pd2+, Pt2+, Cu2+) не обнаруживают явления Auger-эффекта при различных режимах и условиях облучения бактериальных клеток.

Соединения, содержащие нитрофурановые заместители, не являются радиосенситивными средствами, повышающими чувствительность бактериальных клеток к рентгеновскому излучению при совместном использовании данного излучения и нитрофурановых препаратов. Обнаружена аддитивность подавления клеточного роста при суммарном действии нит-рофурапов и рентгеновского излучения.

Выяснение действия комплексов переходных металлов в присутствии химических соединений и под влиянием физических излучений на биологические системы мы продолжили на плазмидах бактериальных клеток Е. coli, исходя из предположения, что найденная нами цитотоксическая активность комплексов на клетках обнаружит себя в виде нуклеазного действия на ДНК-

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ВЗАИМОДЕИСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ С ПЛАЗМИДАМИ

Расщепление плазмидной ДНК комплексами переходных металлов в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода. Изучена нуклеазная активность комплексов СиФ32С12 и СоФ32С12 в присутствии «естественных метаболитов» — аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода. Комплекс СиФЗгС12 расщепляет нуклеиновые кислоты в обоих случаях, то есть с использованием аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода, а комплекс СоФ32С12 разрушал ДНК только в присутствии смеси. Комплексы Pd632Cl2 и Р1Ф32С12 не расщепляли полидезоксирибонуклео-тиды. Получены данные в пользу того, что нуклеазная активность комплекса СиФ32С1г в присутствии аскорбата натрия

объясняется окислительно-восстановительными реакциями, протекающими в системе металл — триазольное кольцо и не связана с образованием кислородсодержащих реакционных частиц.

Комплексное соединение СиФ32С12 одинаково эффективно «разрушает» ДНК в растворах, насыщенных кислородом воздуха, и в растворах с предварительной продувкой азотом. В то же время сульфат меди «работает» только в аэробных условиях. Этот факт указывает на принципиальные различия в механизмах расщепления ДНК сульфатом меди и катионом меди, связанным с триазольиым кольцом. Поскольку Си2+ в составе Си504 требует обязательного присутствия кислорода, то можно предположить, что ключевыми факторами расщепления являются или кислородсодержащие частицы типа ОН, Н02 и другие, или сам ион меди в одной из степеней окисления (Си+ или Си3+).

Первое предположение применительно к комплексу СиФЗгСЬ можно отвергнуть, так как расщепление плазмид-ной ДНК происходит независимо от присутствия кислорода в растворах комплекса ДНК- Поэтому либо придется объяснить явление разрушения ДНК комплексом СиФ32С12 через протекание окислительно-восстановительной реакции без участия кислорода в системе Си2+ — триазол — аскорбат, с образованием продуктов восстановления (окисления) меди (Си+, Си3+), либо каким-то еще химическим процессом, приводящим к возникновению реакционных частиц, природа которых отлична от кислородсодержащих радикалов и от продуктов восстановления (окисления) меди, поскольку:

1. Не было спектрофотометрически зарегистрировано образование частиц Н02 '(А,Макс. = 228 нм, е=1400 м-1-см-1) и 02 (Ямакс,= 243 нм, е=2350 м-1-см-1) в присутствии аминотриазола и хлорида кобальта в аэробных условиях. Фуразонал, СиФЗ?С12 и СоФ32С12 содержали в своем растворе диметилформамид, который сильно поглощал свет, начиная с области 254 нм.

2. Сходство продуктов реакции в растворах аскорбат — СиФ32С12 в токе воздуха и токе азота.

3. В случае СиФ32С12 анаэробные условия замедляли, а в случае СоФ32С12 рез'ко ускоряли процессы окислительно-восстановительных превращений аскорбата натрия.

4. Кроме того, методом ЭПР не было обнаружено восстановление иона кобальта в присутствии аскорбата натрия в составе комплекса СоФ32С12, в отличие от иона меди.

5. На основании спектрофотометрических данных можно утверждать, что фур азан ал взаимодействует с аскорбатом натрия в аэробных (воздух) и анаэробных (азот) условиях по разным механизмам, несмотря на примерно одинаковую скорость деструкции аскорбата натрия в водных растворах. Ключ к разгадке этих механизмов, вероятно, заключен в структуре и окислительно-восстановительных свойствах триазольного кольца.

6. Не отмечалось ингибирование расщепления сахарофос-фатного остова ДНК смесью аскорбата натрия/СиФЗгСЬ в присутствии азида натрия — №N3 (ингибитор синглегного кислорода), супероксиддисмутазы ¡(ингибитор супероксид-аниона) и каталазы (ингибитор перекиси водорода).

7. Электрофореграмма показывает расщепляющее действие комплекса СиФЗгСЬ совместно с аскорбатом натрия в аэробных условиях в присутствии бензоата натрия, известного ингибитора ОН-радикалов.

8. Не происходило расщепление ДНК под действием смеси СиБО^аскорбат натрия в системе, предварительно продутой жидким азотом.

9. Не отмечалось разрушения плазмидной ДНК в присутствии смеси фуразонал/аскорбат натрия в аэробных условиях. Последний факт интересен тем, что, как установлено нашими исследованиями, фуразонал (и другие нитрофураны) не способен непосредственно взаимодействовать с ДНК, и следовательно, если бы происходила генерация активных частиц вне мест связывания лиганда (а это справедливо для свободно диффундирующих ОН-радикалов и других), то повреждение сахарофосфатного остова ДНК имело бы место.

Представленные выше доказательства позволяют утверждать о существовании еще одной окислительно-восстановительной реакции с участием ионов Си2+ и Со2+, координационно связанных с триазольпым кольцом нитрофурановых ли-гандов в присутствии аскорбата натрия.

Таким образом, исследования физико-химических процессов, протекающих на комплексных соединениях, мы можем дополнить, кроме классических химических методов (ЯМР, ЭПР, УФ-, ИК-спектроскопия и так далее), тест-системой с участием химико-биологических соединений (суперскручен-ная плазмидная ДНК, фрагменты плазмиды риС-12, аскор-бат натрия, перекись водорода, бензоэт натрия, нитрофура-новые соединения и их комплексы),

Действие лазерного излучения на плазмиды в сочетании с комплексами переходных металлов. Плазмидная ДНК в присутствии комплексов Pd032Cl2 и СиФ32С12 подвергалась разрушению при действии лазерного излучения (Х = 337 нм), причем комплекс СиФ32С12 связывался избирательно с АТ-сайтами, входящими'в нуклеотидную последовательность. В то же время в присутствии СоФ32С12 расщепление ДНК не наблюдалось. Вероятно, это связано со слабыми комплексообразующими свойствами СоФ32С12 по отношению к парам оснований ДНК.

В случае комплекса Р1Ф32С12 отмечалось расщепление ДНК в АТ-богатых клетках, однако разрушение сахаро-фос-фатного остова нуклеиновой кислоты было менее интенсивным и менее избирательным в сравнении с комплексом СиФ32С12. Возможно, это объясняется для Pt®32Cl2 стери-ческими затруднениями при ориентации хромофоров (фура-зонал) относительно сахаро-фосфатного остова ДНК.

-Для объяснения феномена разрушения нуклеиновой кислоты в присутствии комплексов, содержащих нитрофурано-вые лиганды, были исследованы фотохимические превращения самих нитрофурановых хромофоров.

Несмотря на широкое применение антимикробных нитрофурановых препаратов в медицинской практике, до настоящего времени нет единой точки зрения на механизм их биологического действия. Большинство исследователей связывают проявление биологической активности питропроизвод-ных различных гетероциклов с восстановлением нитрогруп-пы (Золотарева Г. Н. и соавт., 1992; Луке'виц Э., 1993).

В частности, важными промежуточными частицами, обуславливающими биохимическую активность нитрофуранов, оказались их свободные анион-радикалы (Гавар Р. А. с соавт., 1965).

Интересные результаты были получены по фотохимическим превращениям нитрофурановых, -пиррольных, -имида-зольных и бензамидиновых соединений при их облучении ультрафиолетовым излучением различной мощности (Kemu-la et al., 1976; Nielsen et al., 1988; Nishiwaki et al., 1990; Ajana et al., 1988). Так, например, установлена способность нитросоединений переходить в триплетное состояние с последующей фотоизомеризацией или фотодеструкцией (Groen et. al., 1974). Однако в литературе не встречается данных о фотопревращениях нитрофурановых лекарственных средств nOAt

действием лазерного излучения с длиной волны 337 им, широко применяемого в клинической практике.

В связи с этим в настоящей работе мы изучили действие лазерного излучения с К = 337 им на такие нитрофурановые соединения/как К—соль Ы- (5-нитрофурилаллилиден) -1-амн" догидантоина (солафур), М-(5-нитрофурфурилиден) -3-амино-2-оксазолидон (фуразолидон), N — (5-нитрофурфурилидена-мино) — 1,3,4-триазол (фуразонал), N — (5-нитрофурилалли-диденамино)-1,3,4-триазол (фуракрилин), а также аналоги фуразонала без 5-нитрогруппы: 1-(2-фурфурилиденамино)-1,3,4-триазол и его 5-метилгомолог.

Для фуразонала, фуракрилииа и фуразолидона отмечается характерное исчезновение «длинноволнового горба» с максимумом поглощения в районах 330—380 им и гипсо-хромный сдвиг «коротковолнового горба» в случае фуразонала и фуракрилина.

Для аналогов фуразонала отмечались два эффекта: гипо-хромия и гипсохромный сдвиг максимума поглощения.

Таким образом, фотохимические превращения имели место, независимо от наличия или отсутствия нитрогруппы в составе молекулы, а также от структур «хвоста» — триазол (фуразонал и его аналоги, фуракрилин), гидантоин (солафур) или оксазол (фуразолидон).

При снятии ИК-спектров солафура до и после облучения лазером (Я=337 нм) не обнаружено изменений характеристических частот в области 1500— 1700 см-1 (облучению подвергали как сухой солафур, так и водный раствор сола-фура).

Поэтому мы воспользовались более прямым методм определения структуры получаемого в результате облучения лазером соединения, а именно: после облучения подвергли раствор питрофурана высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС-метод), выделили фракции, лиофилизировали их, сняли спектр поглещения фракций до и после облучения и провели масс-спектромегрический анализ.

Масс-спектрометрия не зафиксировала различий между исходными нитрофуранами и продуктами их фотопревращений.

Из масс-спектрометрического анализа следуют, по меньшей мере, четыре очень важных вывода: во-первых, в процессе фотохимических реакций не происходит фотодимеризации молекул нитрофуранов; во-вторых, не образуется частиц с су-

щественно меньшей молекулярной массой, то есть не происходит распада молекул нитрофуранов; в-третьих>, не происходит отщепления нитрогруппы или замены ее на гидрокси-радикал; в-четвертых, маловероятно присоединение молекулы воды к связям нитрофуранов, поскольку молекулярный вес воды в 18 атомных единиц массы был бы зафиксирован масс-спектрометрическим анализом.

Хотя последнюю версию мы не можем исключить полностью, так как молекулы воды могли диссоциировать при хро-матографическом анализе.

Поэтому наиболее вероятно предположить, что молекулы нитрофуранов подвергаются фотоизомеризации (возможно, с участием нитрогруппы) либо атакуются молекулами растворителя, которые впоследствии диссоциируют при хромато-графическом анализе.

Изучение фотопревращений нитрофуранов при их фотовозбуждении необходимо начать с поиска реакционных центров в молекулах.

С помощью пакета программ «Hypercheme» были рассчитаны электронные плотности высшей занятой (HOMO) и низшей свободной (LVMO) молекулярных орбит алей молекул солафура и фуразонала.

Наибольшая локализация электронной плотности на LVMO — орбитали у фуразонала оказалась в двух районах: на атоме кислорода фуранового цикла и атоме азота около азометинавой связи —CH = N—, расположенной между триа-зольным и нитрофурановым кольцами. У молекулы солафура также оказалось два места с наибольшей локализацией электронной плотности на LVMO — орбитали: карбонильной кислород гидантоинового кольца и атом азота около азомети-товой связи — CH = N —, расположенной между нитрофурановым и гидантоиновым кольцами. Итак, у двух различных соединений был обнаружен реакционный центр — группа, являющаяся по своей природе основанием Шиффа, — СН = = N — группа. Принимая во внимание стюсбоность NaBHi селективно восстанавливать связь — C=N — при наличии в молекуле других кратных связей, мы провели восстановление солафура с помощью именно NaBH4. Спектральная картина восстановленного солафура аналогична таковой после воздействия на него лазерного излучения: исчезает пик С Яга ах = 380—400 нм и происходит гипсохромный сдвиг полосы с Ятах=290 им при одновременном гипохромном эффекте,

Возможное объяснение происходящих фотохимических превращений фурановых азометинов может быть дано в рамках геометрической 'изомерии (Беккер Г. О., 1976). Вследствие я—я* перехода происходит ослабление сопряженной азоме-тиновой связи, что может привести к повороту одного из фрагментов молекулы на 90° или 180° вокруг оси C = N. Подобные сии-, антиизомерные превращения имели место при УФ-облучении 5-нитроф|урфуральдоюсина и 5-нитрофуразона-ла (Kemula et al„ 1969).

В пользу возможности фотоизомеризации азометинов свидетельствуют кинетические и термодинамические данные по фотопревращению солафура (Бородулин В. Б. с соавт., 1992).

Изомеризация нитрофуранового цикла в З-гидроксиими-нофурановый, как описано в работе Hunt et al., 1972, представляется маловероятной, так как это превращение не объясняет изменение в случае фурановых азометинов без 5-нит-рогруппы. Для солафура была построена графическая зависимость разностей величин оптического поглощения (относительно контроля) при Х=400 и 292 им облученного и исходного вещества от времени протекания реакции. Данные зависимости представляют собой линейные диаграммы, что указывает на образование конечного продукта фотохимической реакции непосредственно из исходного, то есть без участия промежуточных соединений (метод описан Беккер Г. О., 1976).

Таким образом, впервые показано, что под действием лазерного излучения с длиной волны 337 нм происходят фотохимические превращения фурановых и нитрофурановых азометинов, важная роль в которых принадлежит азометиновой связи — С —N.

Определены кинетические и термодинамические параметры фотохимических процессов, протекающих в различных растворителях. Установлено, что константы фотопревращений солафура в полярных и неполярных растворителях отличаются почти на порядок, что указывает на зависимость фотохимического процесса от природы растворителя. Обнаружено, что константы фотохимических реакций солафура зависят также от температуры раствора, что указывает на существенный вклад в энергию активации и свободную энергию активированного комплекса энтропийно-термодинамического фактора, а следовательно, и структуры растворителя в делом. - .

Установлена зависимость между константами фотохимических превращений ннтрофурана и диэлектрической проницаемостью среды. В средах с низкой диэлектрической проницаемостью скорость фотопревращепий солафура возрастала на порядок. Этот факт может найти применение при работе с биологическими системами, в частности водо- и жиронасы-щенными структурами, такими, как цитоплазма или клеточная мембрана.

Исследование совместного действия рентгеновского излучения и комплексов переходных металлов на плазмиды. Разрушение плазмидной ДНК происходило также под действием рентгеновского излучения, что обнаружено в сериях независимых экспериментов (метод футпринтинга и метод электрофореза в агарозном геле). Комплексы СиФ32С12 и Р1Ф32С12 интенсивно расщепляли плазмидную ДНК под влиянием рентгеновского излучения, в то же время СоФ32С12 и Рс1Ф32С12 не обнаруживали нуклеазоподобного действия. Вероятное объяснение этому явлению заключается в том, что комплекс РаФ32С12 не участвует в окислительно-восстановительных реакциях, инициируемых рентгеновскими лучами из-за инертности иона Рс1, а комплекс СоФ32С12 обладает слабыми ком-плексообразующими свойствами по отношению к парам оснований и сахарофосфатному остову ДНК в целом.

Определение мест преимущественного связывания комплексов переходных металлов на плазмидных ДНК. Изучалась специфичность связывания комплексов на ДНК с помощью рентгеновского и лазерного излучений без участия ферментов. Расщепление ДНК в местах связывания протяженного комплекса происходит в том случае, если в структуре данного соединения имеются реакционные группы, реагирующие на указанные выше излучения. Предлагаемый метод позволяет более точно определить места связывания препарата на ДНК, так как, во-первых, реакционные группы, с большей долей вероятности, будут подвергать расщеплению под действием лазерного и рентгеновского излучений те места ДНК, около которых эти группы локализованы, и, во-вторых, исключается «возмущающее» действие на двойную спираль ДНК ферментов, с помощью которых исследуется сайт-специфическое взаимодействие комплексов и лигандов с нуклеиновыми кислотами.

При действии рентгеновского излучения сайт-специфическими местами для комплекса Р{Ф32С]2 на фрагменте плазмиды риС-12 оказались места: ОТС — 2 места, СТО; — 2,

GTG — 3, TGC — 1 место. Интересно отмстить следующее: мотив TG на этом полимере встречался б раз и мотив GT — 6 раз; из распознанных мест TG оказались 5 мест и GT — тоже 5 мест, причем в 5 случаях эти места перекрывались, а в трех случаях — нет. Если мы рассмотрим сайт CTGC(T), то таких мест комплексом распознается 6 из 8, имеющихся на данном отрезке фрагмента pUC-12. Подобные результаты показывают, что это место является специфическим для платинового комплекса.

Следует также обратить внимание на тот факт, что фура-зонал самостоятельно не способен связаться с полимером нуклеиновой кислоты.

Обнаружены профили расщепления ДНК лазерным излучением з '.присутствии комплексного соединения СиФЗгСЬ. Легко видеть, что местами наиболее вероятного разрушения плазмидной ДНК являются как АТ-, так и GC-пары оснований ДНК, однако наибольшее количество расщепленных мест приходится на АТ-пары оснований.

Расщепление фрагмента плазмиды рентгеновским излучением в присутствии комплекса устанавливает, что, как правило, все разрывы ДНК приходятся на GC-сайты нуклеиновой кислоты.

Таким образом, если сопоставить места разрывов после обработки ДНК рентгеновским и лазерным излучением в присутствии комплекса, то получим мотивы: ACG, GC(T)AA, TGAA, причем разрывы ДНК под действием рентгеновского излучения приходились, в основном, на GC-пары оснований, а под действием лазерного излучения — на АТ-сайты.

Следует подчеркнуть, что, несмотря на присутствие во фрагменте ДНК протяженных последовательностей типа CCCGGGG и GGGTTTT, расщепления их комплексом под действием рентгеновского и лазерного излучения не происходило. Этот факт можно объяснить, если считать, что в состав нитрофуранового комплекса входят, как минимум, два реакционных центра, способных связываться со строго определенными парами оснований ДНК- Ясно, что подобными центрами могут быть только элементы, входящие в структуру комплекса и взаимодействующие с физическими излучениями. На наш взгляд, к таким элементам можно отнести ион меди, реагирующий на рентгеновское излучение, и нитрофу-рановый хромофор, взаимодействующий с лазерным излучением (Hunt el al., 1972; Kemula et al., 1976). Можно предположить, что преимущественным местом связывания иона меди

на ДНК. являются ОС-богатые участки, а нитрофурановый хромофор взаимодействует с АТ-богатыми сайтами.

Таким образом, впервые продемонстрирована способность комплексных соединений платины и меди с фуразоналом, являющимся лекарственным препаратом, расщеплять нуклеиновую кислоту под действием рентгеновского и лазерного излучений.

Показана возможность использования различных по природе физических излучений, взаимодействующих с комплексным соединением, для выявления мест связывания комплекса на ДНК. Установлены преимущественные места локализации нитрофуранового комплекса на фрагменте ДНК.

Следующий шаг в наших исследованиях был сделан в направлении изучения взаимодействия комплексов переходных металлов с нуклеиновыми кислотами с помощью прямых физико-химических методов, что обусловлено следующими причинами: во-первых, до настоящего времени не изучено комп-лексообразование с ДНК соединений нитрофуранового ряда; во-вторых1, эффекты нуклеазоподобного действия нитрофура-новых препаратов могли быть обусловлены не прямым взаимодействием комплексов с ДНК, а генерацией активных частиц в растворе и их диффузией по направлению к сахаро-фосфатному остову ДНК.

Взаимодействие комплексов переходных металлов Рс12+, Си2+, Со2+ с природными и синтетическими нуклеиновыми кислотами

Изучение взаимодействия комплексов переходных металлов с нуклеиновыми кислотами представляет отдельную трудоемкую задачу. Рутинная последовательность основных этапов исследований такого характера может быть представлена следующим образом:

— выбор метода регистрации комплексообразования с ДНК;

— выбор экспериментальных условий, оптимальных для изучения взаимодействия комплексов с ДНК;

— определение участка ДНК, с которым связывается комплекс (неорганический фосфат, сахар, пары оснований);.

— установление мест локализации связанных молекул комплекса на двойной спирали ДНК;

— измерение протяженности участка, накрываемого молекулой комплекса;

— выяснение конформации участка двойной спирали ДНК;

— изучение природы связей, образующихся между комплексом и нуклеиновой кислотой;

— исследование оптических, стереохимических и термодинамических характеристик процесса взаимодействия комплекса с ДНК;

— применение молекулярных моделей для проверки предполагаемых пространственных структур комплексов с ДНК.

Задачу изучения взаимодействия ДНК с комплексами переходных металлов полезно разделить на три части:

1. Исследовать связывание >с ДНК нитрофуранов, являющихся главными лигандами комплексов переходных металлов.

2. Изучить комплексообразование с нуклеиновыми кислотами солей переходных металлов, являющихся центральными комплексообразующими ионами, в частности солей палладия, поскольку литературных данных, посвященных связыванию этого металла с протяженными ДНК практически не существует. Взаимодействие с ДНК солей СиЗО^ СиС12, СоСЬ, КгР^Ц достаточно полно описано в литературе.

3. Изучить взаимодействие полидезоксирибонуклеиновых кислот с гетероциклическими азотсодержащими комплексами палладия, платины, меди и кобальта, включая комплексы с нитрофурановыми лекарственными соединениями.

Следует отметить, что азотсодержащие комплексы выбраны нами таким образом, чтобы проследить зависимость между структурой лиганда, входящего в состав комплекса, и способностью комплекса к взаимодействию с ДНК. Лиганды можно расположить в ряд по мере усложнения их структуры:

группа МН3 •—тригидроксиметиламинометан —>-

—>- пирролидон —>- триазол —>-—V 3-меркапто-4-амино-5-метил-1,2,4-триазол —>■ —»- нитрофуран.

Такое разделение комплексов и их лигандов может решить следующие задачи:

1. Доказать непосредственное участие лигандов — солафу-ра, фуразонала и фуракрилина во взаимодействии с нуклеиновыми кислотами.

2. Определить роль центрального атома металла в связывании комплекса с ДНК, а также его участие в окислительно-восстановительных реакциях при действии физических и химических факторов. В качестве таких металлов выступают

Ионы металлов подгруппы платины — Pd2+ и Pt?+, а также «металлы жизни» Со2+, Си2+.

3. Выяснить значение цис- и транс-изомерии лигандов в комплексах при их взаимодействии с ДНК.

4. Установить расположение (плоскостное или аксиальное) реакционных центров комплексов переходных металлов, принимающих участие в образовании химических связей с парами оснований нуклеиновых кислот.

5. Изучить влияние ионов внешнекоординационной сферы комплексов на процессы взаимодействия с ДНК-

6. Исследовать влияние размеров лиганда, находящегося в координации с центральным ионом металла, на взаимодействие комплекса с парами оснований ДНК.

7. Изучить влияние входящего в комплекс лиганда (простые азотсодержащие лиганды: NH3-rpynna, трис-группа, триазол; сложные азотсодержащие системы '(пирролидон, фу-разонал) на взаимодействие комплекса с нуклеиновыми кислотами.

Наиболее подходящим методом для изучения взаимодействия комплексов переходных металлов с протяженными полимерами нуклеиновых кислот гомо- и гетеронуклеотидного состава оказался метод кругового дихроизма, поскольку комплексы не обладали собственным дихроизмом в полосе поглощения нуклеиновых кислот, а спектральные изменения после связывания комплексов с ДНК оказывались весьма значительными.

Проведенные нами исследования показали, что ионы переходных металлов, как входящие в состав многих ферментов «металлы жизни» — Си2+ и Со2+, так и «чужеродные метал-ли» — Pd2+ и Pt2+, формируют в структуре лекарственной молекулы новые активные центры, изменяющие в целом биологические свойства лекарственного соединения. Так, экспериментально показано, что образование комплекса переходного металла с питрофуранами приводит к способности взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Нитрофураны в свободном состоянии не координируются с ДНК- Однако способность комплексов переходных металлов к координации с ДНК зависела от строения комплекса: СоФ32С12 практически не взаимодействовал с нуклеиновыми кислотами в отличие от комплексов палладия, платины и меди.

Установлено, что катионы палладия, хелатированные по четырем валентным орбиталям, лежащим в одной плоскости (соединения VII и VIII), не 'взаимодействуют с нуклеиновыми

кислотами. Таким образом, можно предположить, что комплексы палладия не могут атаковать полимер в аксиальном направлении, а только в плоскости комплекса.

Комплекс Р(1(ЫНз)4С12 способен связываться с ДНК. По всей видимости, это явление можно объяснить тем, что в растворах диметилформамида и диметилсульфоксида МНз-группа диссоциирует от иона палладия и замещается на молекулу растворителя, у комплекса появляется возможность для взаимодействия с основаниями ДНК. В то время как комплексы VII и VIII лишены такой возможности из-за сте-ричееких и координационных трудностей.

Кроме природы центрального иона и количества лигандов, им хелатированных, па способность комплекса к взаимодействию с ДНК влияло строение лиганда, тип полидезоксирибо-нуклеотида и его конформация. Параметрами, отражающими тонкие процессы взаимодействия комплексов с нуклеиновыми кислотами, являются молярный дихроизм — 8 (оптическая характеристика) и феноменологический стереохимический параметр — 1о (структурная характеристика). Величина молярного дихроизма коррелировала со стереохимическим параметром, и обе величины зависели от структуры комплексного соединения и копформации нуклеиновой кислоты. Величина молярного дихроизма имела наименьшее значение на природной ДНК, находящейся в В-конформации, для комплекса транс-РёФЗгСЬ, имеющего наиболее протяженные лиган-ды — молекулы фуразонала. У комплекса транс-Рс1(МНз)2С12 величина е имела наибольшее значение на том же типе ДНК. Для остальных типов транс-комплексов палладия значения молярного дихроизма занимали промежуточное положение. Установлено, что па природной ДНК транс-Рс1Ф32С12 «накрывает» пять пар оснований ДНК, то есть располагается вдоль оси полимера, а комплекс транс-РсИрисоСЬ — около 0,5 пар оснований. Отметим, что фуразопал и тригидроксиметилами-нометан являются протяженными лигандами и, следовательно, величины е и 10 отражают структурные особенности расположения комплексов на ДНК, относительно оси симметрии второго порядка полимера. Можно, полагать, что транс-Рс^ФЗгСЬ располагается вдоль оси полимера, а транс-Рс1Трис2С12 перпендикулярно или под значительным углом к оси ДНК.

Между комплексом и парами оснований ДНК, вероятнее всего, возникает координационная связь, так- как не -проис-

ходило диссоциации комплекса с ДНК под влиянием хлорида натрия, ни гуанидинхлорида, ни мочевины даже при концентрации 6—8М. Этот факт дает весомые указания на существенную роль именно координационных связей в стабилизации комплексов переходных металлов на ДНК, хотя, по всей видимости, нельзя исключить и другие виды химических связей: электростатических, гидрофобных, вандерваальсовых взаимодействий или водородных связей с парами оснований

днк.

Геометрия лигандов, координированных с ионом палладия, позволяет нам высказывать предположение о механизме взаимодействия комплексов с ДНК- Так, в комплексе цис-РёПгСЬ остатки пирролидона расположены под углом 35—40° к плоскости центрального иона, то есть в целом молекула не является плоской. Поскольку интеркаляция комплекса Рс1П2С12 невозможна из-за неплоского строения молекулы комплекса, постольку этот комплекс взаимодействует с ДНК по механизму внешнего присоединения. Поскольку характер спектральных изменений для комплексов КгРйСЬ, Р(Ш2С12, Рс1Трис2С12, Рс1ЭФ и других был сходным, мы заключили, что взаимодействие РсШ2С12 и других комплексов происходит за счет внешнего присоединения к ДНК, а не за счет интеркаляции.

Комплексы Рс1Эф, РёФет, РсШев отличаются друг от друга только внешиекоординационным ионом. Сходство спектров кругового дихроизма ДНК тимуса теленка в присутствии данных комплексов позволяет высказать предположение об отсутствии влияния иона внешней сферы на процессы координации комплексов с нуклеиновыми кислотами.

Практически для всех изученных комплексов сайт-специфические места связывания были определены или с использованием физических излучений (лазерного и рентгеновского), или по усилению расщепления ДНК нуклеазой ¿1. Отметим, что нуклеаза расщепляет сахарофосфатный остов ДНК преимущественно в тех местах, где имеются деформации вторичной структуры ДНК. В свою очередь, искажение вторичной структуры полидезоксирибонуклеотида указывает на вероятное место локализации комплекса. Очевидно, интенсивность и место расщепления ДНК различными комплексами определяется локальными различиями во вторичной структуре ДНК и взаимной ориентацией активной группировки по отношениям к парам оснований и сахарофосфатному остову нуклеиновой кислоты,

Нуклеаза Б!, обладающая повышенной чувствительностью к деформациям вторичной структуры ДНК,, интенсивно расщепляла нуклеиновую кислоту в местах связывания с ней комплексов Р<Ш2С14 и Р(1Трнс2С12- Этот факт, вероятно, указывает на значительные деформации, возникающие во вторичной структуре ДНК при взаимодействии с ней указанных выше комплексов. Таким образом, комплексы, обладающие малыми размерами при взаимодействии с нуклешшвыми кислотами, выбывают значительные локальные деформации вторичной структуры полимера, затрагивая, вероятно, сахаро-фосфатный остов ДНК в отличие от систем, содержащих в своей структуре нитрофурановые соединения и, следовательно, являющиеся более протяженными.

Действительно, это подтверждается малыми величинами молярного дихроизма при связывании комплексов МеФ32С12 (Ме — Рй2+, р£2+, Си2+) с ДНК тимуса теленка, по сравнению с комплексами КгРйСЬ, Рс1П2С12 и Рс1Трис2С12. Так, например, величина молярного дихроизма для комплекса КгРйСЦ при его взаимодействии с тимусной ДНК равна 4.3, а величина молярного дихроизма для комплекса Рс1Ф32С12 при взаимодействии с тимусной ДНК — 0,4. По-видимому, возникают стерические препятствия при «подходе» более «громоздкой» молекулы к полимеру, что имеет своим следствием уменьшение константы связывания комплекса с полимером и отсутствие конкуренции за связывающее место с нуклеазой Фермент просто «сбрасывает» комплекс с нуклеиновой кислоты и расщепляет ее сахаро-фосфатный остов в том месте, где находился комплекс.

Для комплексов РаФ32С12, Р1Ф32С12, СиФ32С12, СоФ32С12 получен отрицательный результат футпринтового анализа. В то же время взаимодействие комплексов Рс1Ф32С12, Р1Ф32С12 и СиФ32С12 с ДНК доказано методом кругового дихроизма и анализом электрофореграмм в агарозном геле с использованием ферментов — рестриктаз.

С другой стороны, комплексы Рс1П2С12, Рс1Трис2С12, СиТрис2С12 обнаруживали определенную специфичность связывания с нуклеиновыми кислотами, что подтверждено анализом электрофореграмм в полиакриламидном геле, то есть методом футпринтинга. Точность данного результата обусловлена малыми размерами самого комплекса.

Проанализировав несколько типов фрагментов ДНК, различных по своей природе, мы установили'следующие сайт-специфические места для комплексов Рс1Трис2С12 и РсШгСЬ: АС-

и СО-мотивы. Причем для комплекса Рс1Трис2С12 мотив АС встречался в 10 случаях из 14. Для комплекса Р<Ш2С12 — мотив АС— в 5 случаях, мотив Сй — в 5 случаях, мотив йС в двух случаях из 13 узнаваемых последовательностей.

На основании полученных результатов мы можем утверждать, что для комплексов палладия, координированных с трисом и пирролидоном, ведущим мотивом является аде-нин (гуанин) цитидиловое звено. Кроме того, различия в ли-гандах, возможно, и приводят к различиям в местах посадки на полимере. Однако следует иметь в виду, что это различие может быть обусловлено изомерией лигандов в комплексах, так как Рс1П2С12 является цис-изомером, а Р(1Трис2С12 представляет из себя транс-изомер. Интересно отметить, что в обоих мотивах присутствует пуриновое основание — аденин или гуанин.

Одно из основных направлений наших исследований связано с поиском реакционных центров в молекулах комплексных соединений, определяющих нуклеазную активность нит-рофурановых препаратов. На основании экспериментальных фактов обосновываются оригинальные механизмы, объясняющие превращения лекарственных молекул под действием физических излучений и химических реагентов.

Экспериментально идентифицированы химические группы как молекул лигандов, так и комплекса в целом, реагирующие на физические (лазерное, рентгеновское излучение) и химические (аскорбат натрия, перекись водорода) воздействия.

Согласно литературным данным, можно было бы ожидать наличие в молекулах комплексов (металл-нитрофуран) следующих реакционных центров.

1. Переходные металлы (Рс1, Р1:, Си, Со).

Интерес исследователей к металлам обусловлен их способностью комллексироваться с нуклеиновыми кислотами. Кристаллографические (БшаттаШап е1 а1., 1979) и физико-химические (Шишниашвили Д. М. с соавт., 1971; ВоиЫп е! а1., 1984) работы подтвердили возможность координации переходных металлов с азотистыми основаниями ДНК- Преимущественным местом локализации металлов на ДНК является атом N (7) гуанина, поскольку обладает наибольшей основностью (Минченкова Л. Е., 1967).

2. Атом переходного металла .(Рс^-Р^, Си), принимающий

участие и реакциях Auger-эффекта с вовлечением пар оснований или сахарофосфатного остова ДНК.

Согласно Halpern, 1982, имеет место Auger-эффект иа атомах платины и меди. В результате этого явления образуются многозарядные положительные ионы Cun+ и Ptn+. Реакции нейтрализации такого заряда приведут к окислению атомов, вблизи которых находится многозарядный ион, и, в конечном итоге, к разрыву двойной спирали ДНК.

3. Атом переходного металла (Си2+, Со2+), участвующий в окислительно-восстановительных реакциях вместе с аскор-батом «атрия и перекисью водорода (Grokhovsky et al., 1992).

4. Нитрогруппа, возбуждающаяся под действием лазерного излучения и переходящая в триплетное состояние либо образующая нигрозорадикал.

Известна большая группа иитросодержащих соединений (Nielsen et al., 1988; Nishiwaki et al., 1990), которые под действием УФ- и лазерного излучений способны инициировать разрывы в цепях ДНК. Считается, что разрушение ДНК есть следствие образования гидроксильных радикалов в реакционной системе. Не исключается также механизм изомеризации питрогруппы (Hunt et al., 1972) или переход нитро-группы в триплетное состояние с последующим участием в химических реакциях (Kemula et al., 1976).

5. Нитрофурановый хромофор в целом и нитрогруппа в частности, модифицирующиеся в активные частицы под влиянием рентгеновского излучения, поскольку Buchko et al., 1993, обнаружили радиосенситивные свойства метронидозола-нитроимидазольного соединения, применяющегося для лечения анаэробных бактериальных инфекций.

6. Нитрогруппа фурановых соединений, принимающая участие в биохимических реакциях восстановления под действием клеточных редуктаз I и II.

Нитрофурановый хромофор способен изменять свою структуру под влиянием рентгеновского (Kappen et al., 1989), лазерного (Hunt et al., 1972) излучений, а также аз биохимических реакциях с участием нитроредуктаз (Debnath et al., 1993; MoCalla et al., 1978).

Считают, что восстановление нлтрогруппы является обязательным этапом в проявлении ДНК-тропных свойств нит-рофурановых препаратов, однако остался неизученным вопрос о возможности прямого связывания нитрофуранов с клеточной ДНК. Генотоксичность нитрофурановых соединений по-

казана исключительно на клеточном уровне, однако отсутствуют работы по комплексообразованию нитрофуранов с нуклеиновыми кислотами.

Базируясь на экспериментальном материале и сравнивая между собой комплексы Рс1Ф32С12 и Р1Ф32С12, мы пришли к интересному заключению, что в основе расщепляющего действия переходных металлов лежит не Auger-эффeкт, как принято считать большинством исследователей (На1регп, 1982; ОгокЬоуэку е1 а!., 1990), а окислительно-восстановительные процессы, протекающие с участием тяжелого металла, саха-рофосфатного остова ДНК и свободных радикалов, образующихся в результате облучения образца рентгеновским излучением, так как ни в одном эксперименте с использованием комплексов палладия (К2Рс1С14, Рс1П2С12, Рс1Ф32С12, Рс1Трис2С12) мы не получали расщепления фрагментов ДНК-

В то же время комплекс Р1Ф32С12 демонстрировал разрушение ДНК на электрофореграммах футпринтинга и агароз-ногогель-фореза. Следует учесть, что ион Р1 более легко может вступать в окислительно-восстановительные реакции по сравнению с катионом палладия.

В эксперименте показано, что действие лазерного излучения, вероятнее всего, затрагивает азометиновую группу — НС=Ы (основание Шиффа), являющуюся центральной частью лиганда, и способствует изомеризации нитрофурано-вого лиганда вокруг этой связи. Не исключено, что в момент изомеризации может происходить захват протона азометино-вой группой от дезоксирибозы или азотистых оснований нуклеиновой кислоты, находящихся вблизи этой группы.

Было установлено, что аминотриазольное кольцо в отличие от гидантоинового окисляет аюкорбат натрия. Окисление аскорбата катализируется ионами переходных металлов — Си2+ и Со2+, причем кинетическая константа для комплекса Со2+-фуразонал на несколько порядков меньше по сравнению с комплексом Си2+. Кинетика превращения аскорбата резко замедляется в токе азота для комплекса СиФ32С12 и увеличивается для СоФ32С12. В основе нуклеаз-ной активности комплекса СиФ32С12 в присутствии аскорбата натрия лежат окислительно-восстановительные реакции в системе металл-триазольное кольцо, а не образование активных кислородсодержащих частиц.

Таким образом, экспериментально мы установили несколько реакционных центров в молекулах комплексных соединений.

1. Благодаря иону переходного металла комплексное соединение с нитрофуранами в качестве лигандов может взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами.

2. Ион переходного металла Си) участвует в окислительно-восстановительных реакциях под влиянием рентгеновского излучения.

3. Триазолыюе кольцо также может участвовать в окис-лителыго-восстановительных реакциях совместно с ионом переходного металла (Сц2+, Со2+) в присутствии аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода.

4. Лазерное излучение, возможно, приводит в возбуждение не только нитрогруппу, но и азометиновую группу — И = СН, находящуюся между ф,урановым кольцом и циклическими хромофорами (триазольное, гидантоиновое кольцо и др.).

Таким образом, нашими исследованиями мы попытались обосновать нетрадиционный путь преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов, который связан не с синтезом новых классов химиотерапевтических препаратов, а с поиском или введением в лекарственную молекулу активных групп, способных реагировать с физическими излучениями и химическими соединениями, являющимися «естественными метаболитами» для клетки и организма в целом. При воздействии на активные центры физическими и химическими агентами происходит образование реакционной частицы из лекарственного препарата, что приводит к возникновению цито-токсической и нуклеазоподобной активности лекарственного соединения.

Этот путь представляется более привлекательным, так как, во-первых, не потребует значительных научных и материальных усилий по синтезу новых классов препаратов, во-вторых, в качестве матрицы могут использоваться препараты, нашедшие широкое применение в медицине, в-третьих, маловероятно возникновение адаптации бактериальной клетки к физическим излучениям (лазерное, рентгеновское и др.), в-четвертых, используя совместно модифицированную молекулу и физический (химический) фактор, мы можем получить принципиально новый механизм действия химиопрепара-та на микроорганизмы.

В процессе изучения влияния физических и химических факторов на органические соединения нитрофуранового ряда было выявлено несколько реакционных центров (ион переходного металла, триазольное кольцо, азометиновая группа,

нитрофурановый хромофор) в молекуле лекарственного препарата, при воздействии на которые может изменяться и биологическая активность самой молекулы.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработаны новые теоретические принципы и методические подходы в решении проблемы лекарственной устойчивости микроорганизмов. Изучены новые пути формирования нуклеазоподобной и цитотоксической активности традиционных лекарственных препаратов нитрофуранового ряда.

2. Предложена модель, позволяющая представить лекарственную органическую молекулу как матрицу, которая содержит активные группы, способные взаимодействовать с различными по природе физическими и химическими факторами, что приводит к изменению биологической активности лекарственного соединения, которое проявляется в виде повышенной нуклеазоподобной и цитотоксической активности используемого препарата. Модель разработана на основе комплексов переходных металлов с нитрофурановыми лекарственными соединениями, так как особенности структуры нит-рогетероциклических соединений в координации с тяжелыми металлами позволяют ряд независимых факторов: ион тяжелого металла, лазерное и рентгеновское излучения, ДНК-тропность и мутагенность нитрофурапов, действие клеточных редуктаз на нитрофураны и влияние «естественных метаболитов» на лекарственное соединение — учитывать интегрально.

3. Обнаружено антибактериальное действие на модельный штамм Е. coli НВ-101 лекарственных соединений — комплексов переходных металлов — СиФЗг'СЬ и СоФЗгСЬ аз сочетании с «естественными метаболитами» — аекорбатом натрия и смесью аскорбат натрия/перекись водорода. Изучены и подобраны условия, при которых достигается максимальный цитотоксичный эффект исследованных комплексов.

4. Показана возможность преодоления лекарственной устойчивости микроорганизма к нитрофуранам с "помощью реакционной системы СиФ32С1г (СоФЗгСЛг) и аскорбат натрия (аскорбат натрия/перекись водорода) на клетках Е. coli К-12, несущих плазмиду рЬД-105, кодирующую нитрофуран-резистентность данного штамма Е. coli.

5. Впервые обнаружено расщепление плазмидной ДНК,

несущей детерминанты антибиотикорезистентности, рентгеновским излучением в присутствии нитрофурановых комплексов платины и меди. Расщепление ДНК происходит по ОТ нуклеотидным последовательностям в присутствии комплекса Р1Ф32С12 и по GC-сайтам в присутствии СиФ32С12. В то же время не установлено разрушения ДНК в присутствии комплексов палладия и кобальта. Нуклеазная активность комплексов платины и меди при облучении рентгеновскими лучами обусловлена окислительно-восстановительными реакциями, протекающими на переходных металлах.

6. Экспериментально выявлены места расщепления плаз-мидной ДНК под действием лазерного излучения в присутствии комплексов СиФ32С12 (АС и АА-сайты), РёФ32С12 и Р1Ф32С12. Получены данные об участии азометиновой группы в фотохимических превращениях лекарственных комплексов.

7. Установлена впервые нуклеазоподобная активность в отношении пламзидной ДНК комплексов СиФ32С12 и СоФ32С12 в присутствии «естественных метаболитов» — аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода. Расщепление ДНК с помощью аскорбата натрия обусловлено окислительно-восстановительными реакциями, протекающими в системе металл-триазольное кольцо, и не связано с образованием кислородсодержащих реакционных частиц.

8. Впервые изучена возможность применения различных по природе физических излучений, взаимодействующих с комплексным соединением, для выявления мест связывания комплекса на плазмидной ДНК без участия ферментов — нуклеаз. Такими местами для СиФ32С12 оказались сайты ACG, GC(T)AA, ТСАА. На примере этого комплекса показано, что использование в одной молекуле хромофора (фуразонал) и переходного металла (медь) позволяет точно локализовать места посадки комплекса на нуклеиновой кислоте при воздействии лазерным и рентгеновским излучением.

9. Проведено систематическое изучение оптических и сте-реохимических характеристик процесса взаимодействия азотсодержащих комплексов переходных металлов Pd2+, Pt2+, Cu2+, Со2+ с природными и синтетическими полидезоксири-бонуклеотидами.

10. Впервые обнаружено, что образование комплекса переходного металла с нитрофуранами приводит к появлению новых свойств у лекарственной молекулы, в частности способности к взаимодействию с нуклеиновыми кислотами. Экс-

периментально установлено, что нитрофурапы в свободном состоянии не взаимодействуют с ДНК-

11. Обнаружены различия в характере координации комплексов переходных металлов с нуклеиновыми кислотами. Связывание комплексных соединений с ДНК зависит как от структуры самого комплекса (природа центрального иона; цис-, транс-изомерия; размеры и стерическое расположение лигандов в пространстве), так и от строения природных и синтетических ДНК-

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. 3 а с е д а т е л е в А. С., Гурский Г. В., Ж узе А. Л., Г р о-X от» с кий С. Л., Б о род улин В. Б., X а р а т и ш в и л и М. Г., Гот-тих Б. П. Молекулярные основы нуклеотид-специфичного связывания с ДНК протяженных лигандов, содержащих пятичленные ароматические г§тероциклы//М.атер. 6 симп. по конформавдонным изменениям биополимеров в растворах «Конформационные изменения биополимеров в растворах»: — Тбилиси, — 1985. — С. 138. — 138.

2. X а р а т и ш в и л и М. Г., Бородулин В. Б., Грохов-ский С. Л., Жузе А. Л., За се дате л ев А. С., Гурский Г. В., Г о т т и X Б. П. Взаимодействие синтетических аналогов антибиотика нетропсина с ДНК и полинуклеотидами. Константы связывания и возможная структура комплексов//Матер. 6 симп. по конформационным изменениям .биополимеров в растворах «Конформационные изменения биополимеров в растворах»: — Тбилиси. — 1985. — С. 138. — 138.

3. Г от тих Б. П., 3 а с е д а т е л е в А. С., Жузе А. Л., Б и б ил а ш в и л и В. П., X о р л и н А. А,, Г у р с к и й Г. В., С к а м р о в А. В., Бородулин В. Б., Рыбалкин И. Н., Станчев Б. AT-специфические лиганды: конструирование, связывание с ДНК, биологическая активность//«1/ Всесоюзный биохимический съезд»: Тез. симп. докладов.— Киев. — 1986. Т. 1. С. 136—166.

4. Бородулин В. Б., 3 а с е д а т е л е в А. С., Гурский Г. В., Гроховский С. Л., Г отт их Б. П., Жузе А. Л. Взаимодействие лиганда бис-нетропспнового типа с поли (с1А)-поли (dT): оптические, структурные и . энергетические характеристики АТ-специфического связыва-ния//Молекуляр. биология. — 1986. — Т. 20. — Вып. 4. — С. 1144—1149.

5. Бородулин В. Б., Заседателев А. С., Гурский Г. В., Гроховский С. Л., Готтих Б. П., Жузе А. Л. Взаимодействие лекситропсина с ДНК: отрицательный результат попытки обнаружения сложной AT/GC-специфичности связывания//Докл. АН СССР. — 1987 — Т. 294. — С. 1243—1247.

6. Zhuze A., Nikolaev V., Grokhovsky S., Gottikh В., Leinsoo T., Sidorova N.. Borodulin V., Surovaya A., Streltsov S., Zasedatelev A., GurskyG. Approach to rational design of DNA sequence-specific agents using derivatives oí the antibiotic netropsin//6-th Mediterranean Congress of Chemotherapy. Abstract — Taor-mina. — 1988. — P. 289—289.

7. К u I y a s с h Yu. V., К ut sema ko R. T., Borodulin V. В., Lashek. 0, B.t .Si a.riseya L- G. Mechanism oí antibacterial nitrofu-•

3£L

rans drugs//V-fh International Symposium of niirofuran chemistry. Abstract. Plenary lectures. — Riga. — 1988. — P. 15—15.

8. Куляш Ю. В., Лепилин А. В., Куцем а ко Р. Т., Райго-родский 10. М„ Курднн Ю. А., Бородулин В. Б. Применение низкочастотного ультразвука в комплексном лечении воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области//Информационный листок № 67— 90. — Изд. ЦНТИ. — Саратов. — 1989. — С. 1—3.

9. Куляш Ю. В., Куцем а ко Р. Т., Бородулин В. Б., Л а-шек О. Б., Старцев а Л. Г., Разумовская И. А. Экспериментальный попек эффективных методов лечения стафилококковых инфек-ЦИЙ//В сб.: Медицинская наука — практическому здравоохранению. — Изд. СГУ, Саратов. — 1989. — С. 41—44.

10. Б о л ь ш и и с к о в а Т. А., Бородулин В. Б., Лабун-ская В. И., Кравцова В. Н., Шебалдова А. Д., Цветко-ва О. Н., К у л я ш Ю. В. Действие комплексов палладия (II) и меди (II) с триоксиметиламинометаном на ДНК и ее структурные фрагменты// XVII Всесоюзное Чугаевское совещание по химии комплексных соединений: Тез. докл. — Минск. — 1990. — Часть 4. — С. 604—604.

11. Л е п и л и н А. В., Куляш Ю. В., Ран городски й. Ю. М., К у ц е м а к о Р. Т., Г о л ь б р а й х А. Е., Бородулин В. Б. Применение магнитных полей для профилактики и лечения гнойно-инфекционных осложнений переломов нижней челюсти//Информационнып листок. № 505— 90. — Изд. ЦНТИ. — Саратов. — 1990. — С. 1—2.

12. Бородулин В. Б., Шебалдова А. Д., Больши ненова Т. А., Кравцова В. Н., Плотников О. П. Биологическая активность комплексов меди (II) с тр1Юкснметпламинометаном//ХУШ Выездная сессия секции бионеорганической химии Научного совета по неорганической химии АН СССР: Тез. докл. — Бишкек. — 1991. — С. 117|— 117.

13. Б о р о д у л и н В. Б., Архипов а О. В., К У Ц е м а к о Р. Т., Куляш IO. В. Фотохимические превращения 1-[[}-(5'-нитрофурил-2')-ак-' рилиденамино]-гидантоина под действием лазерного излучения с длиной' волны 337,1 нм//В сб.: Низкоинтенсивные лазеры в эксперименте и клинике. — Саратов. — 1992. — С. 11—15.

14. Бородулин В. Б., Утц С. Р., Мартыщенко Л. Г., Г н е т-ней А. М., Куляш Ю. В., Куцем а ко Р. Т., Тучин В. В., Барабанов А. 10. Влияние лазерного излучения ультрафиолетового, видимого и инфракрасного диапазонов на нуклеиновые кислоты и бактериальные клетки//В сб.: Ннзконптенсивные лазеры в эксперименте и клинике. — Саратов. — 1992. — С. 15—20.

15. Бородулин В. Б., Больший скова Т. А., Кравцова В. Н., Шебалдова А. Д. Действие уизлучения на ДНК и продукты ее взаимодействия с биологически активными комплексами Pd (II)// //Матер, конф. «Биоповреждения в промышленности»: Тез. докл — Пенза. — 1993. — 4. I. — С. 9-9.

16. Гнетнев А. М., Позднякова Б. Я-, Мартыщенко Л. Г., Бородулин В. Б. Антибиотикорезистентность, обусловленная плазми-дами, у грамотрицательных бактерий, выделенных от больных с осложненными травмами//Ортопедия, травматология и протезирование. — 1994. — № 4. — С. 20—25.

17. Б о р о д у л и н В. Б., Ше б а л д о в а А. Д., Корниенко Г. К. Разрушение ДНК. комплексами переходных металлов.с. 1-(5-нитро-фурфу--рилденамино)-1,3,4-триазолом под действием лазерного излучения//! меж-

дунар. конф. по биокоординац. химии: Тез. докл. — Иваново. — 1994. — С. 73—73.

18. Гудима С. О., Me мел ов а Л. В., Бород улин В. Б., Походок Д. К., Медников Б. М., Толкачев О. Н., Кочетков С. Н. Кинетический анализ взаимодействия обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека с алкалоидами//Молекуляр. биология. — 1994. — Т. 28. — Вып. 6. — С. 1308—1314.

19. Ш е б а л д о в а А. Д., Б о р о д у л и н В. Б., К о р и и е н к о Г. К-, Большинскова Т. А., Кравцова В. Н. Комплексы переходных металлов с азотосодержащими лигандами в реакции взаимодействия с ДНК//8 Междунар. конф. по химическим реактивам «Реактив 95»: Тез. докл. — Уфа. — 1995. — С. 82—82.

20. Гнет не в А. М., Жаденов И. И., Позднякова Б. Я., Бородулин В. Б. Дополнительный тест для характеристики грамот-рицательной госпитальной инфекции в травматологическом стационаре.// Информационное письмо. — Саратов. — 1995. — С. 1—7.

21. Харченко В. Г., Кожевникова Н. И., Куликова Л. К., Бородулин В. Б. Пентазамещенные соли тнапирилия, обладающие антимикробной и антифаговой активностыо//Авторское свидетельство № 1092918. — 15 янв. 1984. — С. 1—6.

22. Z a s ed a t el е v A. S., Borod u lin V. В., Grokhov-sky S. L., Ni kit in A. M., S aim a no va D. V., Zhuze A. L., G u r s k y G. V., S h a f e r R. H. Mono-, di- and trimeric binding of a bis-netropsiin to DNA//FEBS Lett. — 1995. — V. 375,— P. 304—306.

23. Бородулин В. Б. Сайт-специфическое расщепление ДНК нит-рофурановым комплексом меди под действием рентгеновского и лазерного излучений//Молекуляр. биология. — 1996. — Т. 30. •— Вып. 4. — С. 790— 795.

24. Бородулин В. Б. Тест для характеристики грамотрицательной госпитальной инфекции в стационарах//Проблемы новаторской деятельности ученых, изобретателей и других творческих работников в условиях реформирования экономики: Тез. докл. I областной конференции, 16 апреля, 1996 г. — Саратов, 1996. — С. 148—149.

25. Zasedatelew A. S., N i k i t i n A. M., S a 1 m a n о v a D. V., Borod u lin V. В., Grokhovsky S. L., Zhuze A. L., G u r-sky G. V. and Shaffer R. H. Study of new structural motifs for DNA-ligand interactions//Second Russian — German Symposium on Protein — Nucleic Acid Interaction, Structural and Pharmacological Aspects. — Berlin; November 4—7. — 1995. — P. 40—40.

26. Бородулин В. Б., Гнетнёв A. M. Выделение плазмидной ДНК из условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов//Учебно-методическое пособие. — Саратов. — 1996. — С. 1—7.

Подп. к печ. 17.05.96. Печ. л. 2,5. Тираж 100. Заказ 251.

ОАО «Полиграфист», г. Саратов, пр. Кирова, 27.

Информация о работе

Бородулин, Владимир Борисович
доктора медицинских наук
Саратов, 1996
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы