Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута

Прохорчук, Егор Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута"

005006488

Прохорчук Егор Борисович

Метил-ДНК связывающие белки с доменами «цинковые пальцы»: молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута.

03.01.03-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

- 8 ДЕК 2011

Москва- 2011

005006488

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии клеток млекопитающих Центра «Биоинженерия» РАН и в лаборатории молекулярных основ онтогенеза Института биологии гена РАН

Оффициальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Арчаков Александр Иванович

Доктор биологических наук, профессор, член-кор РАН Деев Сергей Михайлович

Доктор биологических наук Купраш Дмитрий Владимирович

Ведущая организация- Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ РАН).

Защита состоится 23 декабря 2011 годав 13.00 назаседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу. 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ| Актуальность проблемы.

Полная идентичность двух молекул ДНК не может обеспечить одинаковую реализацию кодируемой ими генетической информации. Примером такого феномена могут служить две женские половые X хромосомы, имеющие практически идентичную первичную последовательность ДНК, но кардинально отличающиеся с точки зрения транскрипции их генов: лишь одна из двух хромосом будет на большем своем протяжении содержать активные гены, в то время, как гены второй X хромосомы будут молчать. В последнее время ученые получают все новые и новые доказательства того, что надгенетические (эпигенетические) механизмы контроля генетической информации играют важнейшую биологическую роль в таких процессах как развитие эмбриона, дифференцировка клеток, дозовая компенсация половых хромосом, развитие онкологических и нейродегенеративных заболеваний. Сложности и относительные неудачи в клонировании позвоночных организмов связаны с удивительной стабильностью эпигенетического профиля, в первую очередь гистоновых модификаций и метилирования ДНК, в процессе перепрограммирования терминально дифференцированной клетки в плюрипотентную. Однако, несмотря на прогресс, достигнутый в понимании роли эпигенетического контроля генной экспрессии в биологических процессах, остается открытым целый ряд вопросов о механизмах реализации эпигенетической информации. В частности, метилирование ДНК является необходимой модификацией для нормального эмбрионального развития мыши. Животные с генетическим нокаутом гена, кодирующего поддерживающую метил ДНК трансферазу, погибают во время эмбриогенеза сразу после гаструляции. Однако, предполагаемые белки-интерпретаторы метилирования ДНК, а именно метил ДНК связывающие белки семейства МВБ ни по отдельности, ни совокупно не являются необходимыми для нормального прохождения эмбриогенеза. Таким образом, либо метилирование ДНК напрямую может ингибировать взаимодействие транскрипционных или иных белковых факторов с их участками узнавания, или же необходимо предположить существование отличного от МВО семейства метил ДНК узнающих белков, которые могут переводить сигналы метилирования ДНК, к примеру, в подавление транскрипции метилированных генов. После полной расшифровки генома человека появилась возможность поиска новых метил ДНК связывающих белков по гомологии с МВТ) доменом, однако, ни один из найденных таким образом новых белков специфически не связывал метилированную ДНК. В данной работе будут описано обнаружение и характеристика функциональных свойств белков, которые объединены в одно семейство за счет способности имеющихся в их составе трех доменов «цинковые пальцы» С2Н2 типа специфически связывать метилированную ДНК. Существование второго семейства метил ДНК связывающих белков существенно расширяет наши представления о механизмах интерпретации метилирования ДНК. Тот факт, что белок Каизо потенциально может быть вовлечен через белок-белковые

взаимодействия в передачу сигналов от клеточной мембраны клетки в ядро, открывает новое направление в изучении эпигенетических механизмов контроля генетической информации как последствия межклеточных контактов.

Цель работы

Проверить гипотезу о существовании у позвоночных организмов метил ДНК связывающих белков, отличных от белков MBD семейства. В случае обнаружения нового семейства таких белков провести их функциональную характеристику с помощью современных методов молекулярной биологии, в частности с использованием технологии генетического нокаута.

Основные задачи исследования

Первой задачей исследования стала характеристика гена, ответственного за метил ДНК специфическое взаимодействие, которое было детектировано in vitro в экспериментах по задержке подвижности ДНК-белковых комплексов, образованных энхансерным элементом гена S100A4 и ядерными экстрактами многих клеточных линий, органов и тканей мыши и человека. После получения достаточных доказательств о том, что описанные ДНК белковые комплексы образованы с участием белка Каизо, встал целый ряд задач по определению биологической роли Каизо у позвоночных:

- получить и охарактеризовать мышей, у которых проведен генетический нокаут гена Каизо.

- определить гены мишени, с регуляторными участками которых Каизо взаимодействует in vivo и уровень транскрипции которых чувствителен к падению Каизо.

- определить морфологические и молекулярные последствия транзиентного понижения уровня Каизо в оплодотворенных ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus.Iaevis.

- выяснить, как катенин р120 может влиять на ДНК связывающие и транскрипционные свойства Каизо при их взаимодействии.

- определить функциональную значимость взаимодействия Каизо с неметилированными последовательностями CTGCNA в составе некоторых генов, вовлеченных в канонические и неканонические сигнальные пути wnt.

- провести биоинформатический поиск гомологичных белков, используя в качестве референсной последовательность аминокислот трех доменов типа «цинковый палец» белка Каизо. В случае нахождения существенных гомологичных молекул провести их детальную характеристику, уделив особое внимание их способности специфически связывать метилированную ДНК.

Научная новизна работы

Свойство белков ZBTB33 (Каизо), ZBTB4 и ZBTB38 специфически связывать метилированную ДНК было открыто впервые мире в процессе получения основных результатов данной

диссертационной работы. Впервые показано, что мышь с удаленным геном Канзо проявляет устойчивость к развитию рака кишечника. Также пионерскими являются все результаты, указывающие на важность Каизо в процессе эмбрионального развития шпорцевой лягушки. Проведение полногеномного картирования участков связывания Каизо было первым примером использования технологии ChIP-Seq в Российской Федерации. Помимо технической новизны следует обратить внимание на то, что данный эксперимент позволил выделить метил ДНК связывающую активность Каизо, как доминирующую in vivo, в то время как связывание неметилированных последовательностей CTGCNA было детектировано на уровне фона. Последнее обстоятельство является убедительным аргументом в споре с рядом лабораторий (Dr Juliet Daniel, Dr Pierre McCrea), которые считают, что реализация основной биологической функции Каизо проистекает через связывание участков CTGCNA, а не метилированных ЦфГ динуклеотидов. Таким образом, данная работа не только открывает новое направление в изучении доменов типа «цинковые пальцы», но и позволяет более точно сфокусировать исследования в этой области на интерпретации сигналов метилирования.

Практическая ценность работы

Способность трех доменов типа «цинковый палец» белка Каизо связывать in vitro метилированную ДНК с высокой плотностью динуклеотидов ЦфГ выгодно отличает их от MBD метил ДНК связывающего домена, который способен узнавать и одиночные метилированные ЦфГ динуклеотиды. Более того, проведенные эксперименты показывают, что ДНК аффинные сорбенты, полученные с использованием «цинковых пальцев» Каизо преимущественно связывают метилированные ЦфГ островки (до 75% все связавшейся ДНК), в то время, как доля метилированных ЦфГ островков в элюированных фракциях сорбента на основе MBD домена белка MBD2 составляет не более 5%. Таким образом, использование аффинных сорбентов на основе белка Каизо может существенно снизить расходы по определению профиля метилирования ЦфГ островков лини клеток, органа или ткани. Это особенно важно при характеристике новообразований. Известно, что метилирование ЦфГ островков в промоторных областях генов раковых супрессоров является одним из молекулярных механизмов, приводящих к трансформации клеток. Конечно же, аффинные сорбенты на основе Каизо не способны привести к определению статуса метилирования геномной ДНК с нуклеотидной точностью, однако для клинических применений это редко требуется. При использовании технологии определения первичной нуклеотидной последовательности нового поколения (Solexa, SOLiD) для анализа связанной Каизо сорбентом геномной ДНК объем такого секвенирования будет на порядок меньше, а значит и дешевле и доступнее для клинических исследователей, чем при использовании MBD сорбентов и тем более при так называемом «бисульфитном секвенировании». Другим направлением практического применения результатов работы может стать лечение онкологических заболеваний.

Мышь с удаленным геном Каизо проявляет устойчивость к развитию рака кишечника, вызванного аномальным уровнем активности сигнального пути wnt. Малые молекулы, которые бы ингибировали активности Каизо (транскрипционную или ДНК связывающую), вероятно, могут стать хорошими кандидатами для создания противоопухолевых препаратов, действие которых можно нужно будет проверять на модельных организмах, а потом и в клинических испытаниях. Причем в последнем случае вполне вероятно важным окажется генотип опухоли и наибольший эффект препаратов следует ожидать у пациентов с опухолями с активным сигнальным путем wnt.

Апробация работы

Основные результаты докладывались на конференциях Американской ассоциации по изучению рака (AACR) в 2001 и 2008 годах в США, в 2005 году на конференции по эпигенетическим механизмам перепрограммирования генома (Капри, Италия), а также на российских конференциях, в частности, на третьем международном съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург 2002, на конференции, посвященной 40-летию журнала «Молекулярная биология» (Москва, 2007 год) и на седьмой международной конференции по биоинформатике регуляции н структуры генома (Новосибирск, 2010).

Публикации

По результатам работы имеется 22 публикации в реферируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих BTB/POZ домен и домен "цинковые пальцы"

Первая часть работы посвящена обнаружению новых метил-ДНК связывающих белков, структурно отличающихся от белков MBD семейства.

1.1 Обнаружение метил-ДНК зависимого связывания белковых комплексов с энхансерным элементом гена S100A4 в экспериментах in vitro.

Во многих тканеспецифичных и дифференциально экспрессирующихся в процессе развития генах, гиперчувствительные к обработке панкреатической дезоксирибонуклеазой I (ДНКазаГ) участки, связаны с областями, участвующими в транскрипционном контроле. Чаще всего они коррелируют со связыванием регуляторных белков с прилегающими последовательностями. С целью выявления новых регуляторных областей гена S100A4 был произведен поиск гиперчувствительных участков к обработке ДНКазоМ. Анализ их распределения в различных линиях клеток, показал, что три гиперчувствительных участка присутствуют внутри EcoRI рестрикционнога фрагмента геномной копии мышиного гена S100A4 (рис. 1). Один из гиперчувствительных участков расположен в районе промотора гена (далее ДГУ1) и связан с транскрипционной активностью гена S100A. Второй (ДГУ2) наблюдается в районе с координатами (+700;+900) (за 0 принят старт транскрипции гена).

¡334 5 6 7 S S 1011 12 13 14

«I I

ЕшМ _„ (-2300) "Tl1

ТАТАЬО*

ЕсоМ

ДГ72 ДГУЗ^2?®®

«А §»- к

■ ьш ш

проба ~

Рисунок 1. Картирование участков, гиперчувствительных к обработке ДНКазой1, расположенных в области с координатами (2.5 т.п.н.; +2.0 т.п.н.) мышиного гена 8100А4.

Ядра, полученные из клеток линии КСМЛ-100

4 3 кпн (дорожки с 1 по 9) и Яас34Е (дорожки с 10 по

14), обрабатывали увеличивающимся

4 2.1 кп.н. ДГУ1 количеством ДНКазы1 (обозначено

треугольниками). Геномную ДНК

4 1.3КП.И. ДГУЗ ,

^ ферментативно гидролизовали рестриктазои

^ 0.8 кп.н. ДГУЗ ЕсоЯ! и гибридизовали с радиоактивно меченой пробой ЕхШ (ПЦР фрагмент третьего экзона, размером 200 п.н). Серые прямоугольники обозначают аз-действующие элементы мышиного гена 8100А4: 1-16 п.н. последовательность; 2 - метилзависимый АР-1 участок; 3 - 1сВ-подобный участок; 4 -микросателлитная последовательность ДНК. Экзоны обозначены черными

прямоугольниками. Гиперчуствительные

участки к обработке ДНКазоШ обозначены стрелками.

Третий (ДГУЗ) расположен во втором интроне в области с координатами + 1300 п.н. ДГУ2 и ДГУЗ, в отличие от ДГУ1 присутствуют во всех протестированных клеточных линиях вне зависимости от транскрипционной активности гена 3100А4 и имеют разную чувствительность к увеличивающимся количествам ДНКазы1 (таблица 1). Разница в структуре гиперчувствительных областей может быть отражением спектра ДНК-белковых взаимодействий в этих районах.

Таблица 1. Представленность гиперчувствительных участков в гене 8100А4 к обработке ДНКазой 1 в мышиных и человеческих клеточных линиях.

Тип клеток Уровень экспрессии мРНК гена S100A4 ДГУ1 ДГУ2 ДГУЗ

КСМЛ-100 +++ +++ . +++ +++

КСМЛ-0 - - + +

VMR-Liv - - + +

VMR-0 - - + +

Rac34E +/- +/- ++ ++

RaclOP - - + +

Jurcat - - + +

Molt-4 ++ ++ +++ ?

СЕМ + + ++ ?

K562 - - ++ ?

1.2 Обнаружение белкового фактора, связывающегося с метилированной последовательностью ДНК,

расположенной с 3' конца ДГУ2.

Анализ нуклеотидной

последовательности протяженного

гиперчувствительного участка с З'-конца ДГУ2 мышиного гена S100A4 выявил короткий CpG-островок с

последовательностью CGCGCCCAACG, содержащий три CpG динукпеотида. Поскольку ранее было показано, что эпигенетический контроль является важным при транскрипции S100.44 (Sonnenberg, Daams et al. 1986), был определен статус метилирования указанного CpG-островка в линиях клеток с различным уровнем активности гена S100A4. С помощью эндонуклеаз, чувствительных к метилированию ДНК, было установлено методом Саузерн блот-гибридизации, что этот участок

гена SI00A4 мыши в клеточных линиях KCMJI-0 и

g g g 3 KCMJT-100 неметилирован, а в Rac34E и RaclOP

i i S ,

:а s u u метилирован (рис.2).

Рисунок 2. Определение характера метилирования Sm последовательности в первом интроне мышиного гена S100A4 в различных линиях клеток. После выделения геномную ДНК из клеток линий КСМЛ-0, КСМЛ-100, Rac34E и RaclOP гидролизовали рестриктазами Hindlll и Hhal и гибридизовали с радиоактивно меченой пробой. Фрагменты ДНК Hindlll-Hindlll и Hindlll-Hhal имели размеры 5 и 1.2 кп.н. соответственно. Экзоны обозначены черными прямоугольниками.

Таким образом, уровень транскрипции гена S100A4 и статус метилирования изучаемой GC богатой

МП

I последовательности не коррелировали друг с другом. Для выяснения факта взаимодействия in vitro белковых факторов с этой последовательностью, были проведены эксперименты по задержке ДНК -белковых комплексов в геле с ядерными белковыми экстрактами из клеточных линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100. При анализе связывания ядерных белковых экстрактов из клеток КСМЛ-0 было выявлено образование двух ДНК-белковых комплексов МК1 и МК2 (рис.3, дорожка 1). Образующийся МК2 комплекс не исчезает при добавлении немеченного метилированного конкурента (рис.3, дорожка 2). Напротив, комплекс МК1 является специфичным к метилированию ДНК (рис.3, дорожки 3 и 4). В формировании МК2

. нышыш

^ неткпкрованкый фрагаенг

ныш-нмп

**» Л незиеткпировалкый :: фрагмент

in it

ateocccAACg

"1 r~~~~

I I

комплекса участвуют белки, связывающие ЫР-кВ подобные последовательности и

микросателлитную ДНК.

Добшш ниык

ЕОККурвИТ

Обработка г ) иечвнкы* ] фратектов I ДНК L

' МПЧЯфШЕкМШХ

н> ама^чп КА»1 "111

12 3 4 5

Рисунок 3. Электрофоретическая задержка ДНК-белковых комплексов в 4%-ном ПААГ, образованных ядерными белковыми экстрактами из клеточной линии КСМЛ-О и радиоактивно меченым метилированным фрагментом первого интрона гена 8100А4 с координатами (+685; +890). МК2 - неспецифичный комплекс. МК1-комплекс специфичный к метилированию всех трех СрО-пар в

изучаемой последовательности. Пробу ферментативно модифицировали 8551 метилтрансферазой (дорожки 1, 2, 3, 4) , НЬа1 ( 6 дорожка), ИтШИ ( 7 дорожка) и НИа1+р1т011 (5 дорожка). Для проверки специфичности связывания в реакцию добавляли 100 кратный избыток немеченого ДНК конкурента: (+685;+890) фрагмент, метилированный Бээ! метилтрансферазой (2 дорожка); (+685; +890) фрагмент (3 дорожка); неспецифичная последовательность ДНК (4 дорожка).

4 Представляет интерес тот факт, что метилирование трех Срв

динуклеотидов происходит в районе открытого хроматина (ДГУ2). Это может предполагать вовлеченность метил-специфического фактора в молекулярные процессы несвязанные с транскрипцией. Сам факт наличия ДГУ2 вне зависимости от активности 8100А4 мог лишь подтверждать данное предположение.

С помощью эксперимента по интерференции метилирования было показано, что в образование МК1 комплекса непосредственно вовлечены гуанин первого Срв динуклеотида на кодирующей цепи (с координатой +839) и гуанин второго СрО динуклеотида на некодирующей цепи ( с координатой +840) ( рис.4). Исходя из всех полученных данных, был сделан вывод, что последовательность, узнаваемая и связываемая белком, "¿Л 2 г ш5ССг]15СССССААт5СС (далее Бт).

Рисунок 4. Эксперимент по интерференции метилирования ДНК-белкового * * комплекса МК1. Двуцепочечный фрагмент ДНК из первого интрона мышиного гена 5100А4 ** « с координатами (+685; +890) обрабатывали ДМС, после чего использовали в качестве ~ >■■>■■ ~ * радиоактивно меченой пробы для эксперимента электрофоретической задержки ДНК* белковых комплексов в геле. На дорожках 1 и 2 показана кодирующая цепь фрагмента ДНК;

* на дорожках 3 и 4 - некодирующая цепь. Последовательности ДНК, не вошедшей в ДНК* * белковый комплекс МК1 показаны на дорожках 1 и 4; а на 2-й и 3-й дорожках, та ДНК, с которой образовался МК1 комплекс. На дорожках 2 и 3 указаны остатки гуанина на кодирующей цепи (+839, обозначен черным овалом) и на некодирующей цепи (+840, обозначен звездочкой), защищенные от действия пиперидина. Знаком вопроса обозначена возможная область защиты О на некодирующей цепи (+837), однако степень его защиты в пять раз ниже уровня защиты в в положениях +839 и +840.

шт

СМСМЯСССЛМЮ ддтдтдддг. Cq.tr 1 *

1.2 Клонирование нового специфичного к метилированию ДНК белка Каизо.

Для идентификации белка, связывающего метилированную последовательность СОСвСССААСО мышиного гена 8100А4 (Эш) была реализована следующая схема эксперимента: гельфильтрационное фракционирование ядерных белковых экстрактов из клеток линии К562 с использованием смолы 8ерЬасгу1 Б-ЗОО; анализ собранных фракций методом электрофоретической задержки ДНК-белковых комплексов в геле с использованием радиоактивно

меченой метилированной Эш последовательности; аффинная хроматография отобранных фракций, дающих образование специфичного МК1 комплекса, на колонке с Бт-сефарозой (рис,5). Анализ аффинных фракций элюированных с колонки ступенчатым солевым градиентом показал, что специфичный к метилированию ДНК белок присутствует во фракции с концентрацией хлорида кальция 300-400мМ (рис.5).

1.5

Ulm

■ф

Рисунок 5. Анализ аффинных белковых фракций на присутствие ^иИВШИМ!«^-'"' специфичного к метилированию ДНК белка методом задержки подвижности ДНК-белковых комплексов в 4% ПААГ. Радиоактивно меченая проба -двуцепочечный олинонуклеотид, содержащий ферментативно модифицированную БбзГ метилтрансферазой Бш последовательность. На 1-й дорожке для контроля образования специфичного МК1 комплекса в реакцию связывания с пробой добавляли ядерные белковые экстракты из клеток линии К562 и 0.4М фракция в дорожки 15 и 16 в присутствии 100 кратного молярного избытка специфичного конкурента ДНК: метилированной и неметилированной Бш последовательности, соответственно. На дорожках с 4-й по 14-ю в реакцию добавляли аффинные фракции, собранные в присутствии 0.1М-1.5М КС1 в буфере. Комплекс МК1 обозначен стрелкой.

Фракционирование 0.4М аффинной фракции в денатурирующем полиакриламидном геле и покраска геля серебром показали, что она содержит смесь белков, основными компонентами которой являлись белки с молекулярной массой 100- 120 к Да. Белки были охарактеризованы методом масс-спектрометрии в сотрудничестве с Доктором Матиасом Манном (EMBL, Heidelberg). Одним из определенных белков оказался белок Каизо. При сравнении аминокислотной последовательности белка Каизо с последовательностями из базы данных выяснилось, что он является человеческим гомологом гена мыши, открытого по способности связываться с катенином р 120 практически одновременно (по состоянию на 1999 год) с данной работой, но независимо, профессором Рейнольдсом из университета Вандербильт (Нэшвилль, CIIIA)(Daniel and Reynolds 1999). Основные домены белка Каизо: на С-конце три ДНК-связывающих домена "цинковые пальцы" типа С2Н2, а на N конце домен под названием BTB/POZ (по сокращенному названию Pox viruses и Zinc finger). Анализ баз данных

0 а

1 I показал, что белок Каизо представлен во многих организмах (рыбах,

- а «

земноводных, млекопитающих).

_ss Рисунок 6. Моноклональные антитела к Каизо суперсдвигают метил-ДНК-белковый комплекс, подтверждая участие Каизо в его образовании. Метилированную Sm пробу инкубировали с ядерными экстрактами из клеток линии К562. К образовавшимся ДНК-белковым комплексам добавляли: на 2-й дорожке - моноклональные антитела к Каизо 6F; на 3-й -неспецифические антитела (к поли АДФ рибозил полимеразе, PARP) не су передвигал и комплекс; на первой дорожке в реакцию связывания антитела не добавляли; инкубировали и разделяли продукты реакции в неденатурирующем 4% ПААГ. Комплекс с Каизо обозначен стрелкой с С. Суперсдвинутый антителами комплекс обозначен стрелкой с SS. Звездочка со стрелкой обозначает ДНК-белковый комплекс с продуктами деградации белковой фракции.

Моноклональные антитела (клон 6F, Upstate), полученные к эпитопам Каизо, с высокой эффективностью суперсдвигают метил-специфичный комплекс МК1 в эксперименте по электрофоретической задержке ДНК-белковых комплексов в геле (рис.6).

Рисунок 7. Анализ распределения Каизо в тканях мыши с помощью блот Нозерн блот-гнбридизацнн. Блот-гибридизация тотальной РНК, выделенной из из разных органов мыши, с [а-,2Р]дАТФ меченой ДНК гена Каизо человека.

Экспрессия Каизо была изучена в различных органах мыши. Максимальная экспрессия гена обнаруживается в печени, селезенке и в почках. Однако, мРНК Каизо размером 5-6 т.л.н. присутствует во всех рассмотренных мышиных органах (рис.7).

1.3 Изучение ДНК связывающих свойств рекомбинантного белка Каизо

Чтобы ответить на вопрос, может ли белок Каизо узнавать метилированную последовательность

ДНК, и какой именно домен ответственен за это узнавание и связывание, был поставлен

эксперимент по задержке ДНК-белковых комплексов в геле с метилированной и

неметилированной последовательностью Sm очищенных рекомбинантных белков GST-Каизо,

полученных за счет трансформации в бактерии различных фрагментов кДНК Каизо. Было

показано (рис.8), что рекомбинантный белок GST-Каизо (1-672 а.о.) образует метил-специфичный

ДНК белковый комплекс с симметрично метилированной последовательностью Sm. Удаление N-

концевого домена BTB/POZ не изменяет метил-ДНК-связывающих свойств Каизо. Минимальный

размер белка, который специфично связывал метилированную последовательность Sm

соответствовал аминокислотам белка Каизо с координатами 480-582, которые содержат три

"цинковых пальца". Следовательно, впервые было показано, что домен типа «цинковые пальцы»

способен специфично узнавать симметрично метилированную ДНК.

Рисунок 8. Изучение ДНК-связывающнх свойств рекомбинантного белка Каизо (гКаизо). В реакцию связывания добавляли различное количество рекомбинантных белков GST-Каизо (1-672 а.о.) и GST-Каизо (113-672 а.о.) 10, 3 и I нг, что указано треугольником над дорожками. Специфичный ДНК-белковый комплекс образуется лишь с метилированной Sm последовательностью ДНК. На правой панели рекомбинантный белок GST-Каизо (410-672 а.о.) образует метил специфичные ДНК-белковые комплексы с последовательностями ДНК Sm. Asm и AASm. Видно, что введение дополнительного нуклеотида между CpG парами 1 и 2 приводит к ослаблению ДНК-белкового комплекса.

Изменится ли сродство рекомбинантных цинковых пальцев белка Каизо к метилированной последовательности, если CpG пары будут разделены I яия—| ficAlSQ/410-672) дополнительными нуклеотидами? Для выяснения предпочтительного расстояния между тремя CpG парами в Sm последовательности и их нуклеотидного окружения был проведен эксперимент по задержке в геле ДНК-белковых комплексов, образованных рекомбинантным белком GST-Каизо (410-672 а.о.) и различными модификациями в Sm последовательности (таблица 2). Показано, что 3-я CpG пара не важна для

гКА1 SO (1-672) fKAISO (113-672) rKAISO 1410-672)

------------. Г Sm ASm AASm

+ - + -_ + - + - + -

•ft- ft..

■ ■ W

^.....Ш-

HH ^^^иии

POZ Zinc Fingers

ii ■■■ i rKAISO (1-672)

I rKAISO (113-672)

связывания, белок Каизо связывает последовательности ДНК, содержащие лишь две Срв пары, в то время как расстояние между 1-й и 2-й Срв парами не должно превышать двух-трех нуклеотидов. Замена метилированного цитозина на тимин приводит к потере связывания (таблица 2). Таким образом, показано, что рекомбинантный белок Каизо проявляет свои метил ДНК-связывающие свойства через "цинковые пальцы".

Таблица 2. Связывание рекомбинантных "цинковых пальцев" белка Каизо с метилированными последовательностями ДНК._

Проба Последовательность ДНК Связывание

Sm CAGCAGCMGMGCCCAAMGCTGGGA ++++

Sm-A CAGCAGCMGAMGCCCAAMGCTGGGA +++

Sm-AA CAGCAGCMGAAMGCCCAAMGCTGGGA ++

VIRTUAL CAGCAGCMGAAAMGAAAMGCTGGGA +

ASm CAGCAGCMGMGCCCAAAMGCTGGGA +++

AASm CAGCAGCMGMGCCCAAAAAMGCTGGGA +++

CCSm CAGCAGCMGMGCAAMGCTGGGA +++

CG3SM CAGCAGCMGMGCCCAACTGGGA +++

lA2Sm CAGCAGCMGAMGCCCAACTGGGA +++

2A2Sm CAGCAGCMGAAMGCCCAAGCTGGGA +

Sm-TG CAGCAGCTGTGCCCAATGCTGGGA -

AACG-Sm CAGCAGCAAMGCCCAACTGGGA +/-

TGCG-Sm CAGCAGCTGMGCCCAACTGGGA +

CGTG-Sm CAGCAGCMGTGCCCAACTGGGA -

CGCA-Sm CAGCAGCMGCACCCAACTGGGA -

CACG-Sm CAGCAGCCAMGCCCAACTGGGA -

Константа диссоциации ДНК-белкового комплекса полноразмерного рекомбинантного белка Каизо и последовательности ДНК Sm, измеряемая в эксперименте по задержке ДНК-белковых комплексов в геле, равна 1 микромолю для неметилированной Sm последовательности и 1 наномолю для метилированной Sm последовательности. Для сравнения, домен MBD связывается с единственной CpG парой в пределах 10 наномолей (Free, Wakefield et al. 2001). То есть Каизо демонстрирует наибольшее сродство к метилированной ДНК из всех известных метил ДНК связывающих белков.

1.4 Белок Каизо является метилзависнмым транскрипционным репрессором in vivo.

Большинство белков BTB/POZ семейства являются репрессорами транскрипции. Будет ли Каизо подавлять транскрипцию репортерных генов в клетках млекопитающих, и будет ли репрессия зависеть от статуса метилирования последовательности ДНК промотора репортерного гена? Чтобы избежать эффекта молчания метилированной ДНК конструкции репортерного гена за счет эндогенных метил- ДНК зависимых репрессоров, таких как MBD1, MBD2 и других, были использовали клетки мышиных фибробластов с генетическим нокаутом гена Mbd2 (в дальнейшем используется обозначение Mbd2(-/-) клетки). В клетках Mbd2 (-/-) уровень репрессии

метилированных репортерных генов значительно снижен, по сравнению с диким типом клеток (Hendrich, Guy et al. 2001). Репортерная конструкция несла в себе ген светлячковой люциферазы (firefly) под контролем SV40 промотора, а также 11 консенсусных участков связывания белка Каизо. Как и ожидалось, уровень транскрипционной активности полностью метилированной репортерной конструкции в клетках Mbd2 (-/-) составил 30-35% от уровня транскрипции неметилированной репортерной конструкции в тех же клетках.

P0Z

I ' I

¿n-lingcrs И И I KAIS0

KAlSOiPOZ

KAISOiZF

KAISOaiPOZ+ZF)

Pgk gene Promot«

> »

1 20-

& s

J 10

Etfcctoi

S 5 i ' I 3

J 2 í 1

KAISO 1POZ JZF i(P02tZF)

Рисунок 9. Белок Канзо In vivo подавляет транскрипции) метилированных

репортерных генов. В эксперименте по временной трансфекции совместно трансфецировали в мышиные клетки Mbd2 (-/-) (серые столбики) и клетки Mbd2 (+/-) (используются в качестве контроля как дикий тип, белые столбики) репортерная конструкция с геном репортером светлячковой люциферазы под контролем SV40 или Pgk промоторов и QMtrfZ;/ конструкция, экспрессирующая различные QMW2-/- формы белка Каизо. Относительная активность репортера представляет из себя процент уровня экспрессии репортерного гена с метилированной конструкции относительно уровня экспрессии репортерного гена с неметилированной конструкции.

Представленные результаты являются усреднением как минимум трех независимых

экспериментов.

Экспрессия в клетках полноразмерного белка Каизо понизила уровень экспрессии репортерной конструкции приблизительно в 6 раз до 5-7% от уровня неметилированного контроля (рис.9). Усиления уровня репрессии репортерного гена не было замечено в случае коэкспрессии в клетках форм белка Каизо без BTB/POZ домена (КаизоДРОг), без '"цинковых пальцев" (KarooAZF) и без всех функциональных доменов (KaH3oAPOZ+ZF). Таким образом, Каизо может восстановить репрессию метилированных генов в дефектных Mbd2 (-/-) клетках, но для этого белку Каизо необходимы одновременно все его функциональные домены, т.е. BTB/POZ домен и "цинковые пальцы".

Чтобы проверить способность Каизо репрессировать промотор, который метилирован в природных условиях, был выбран промотор мышиного гена фосфоглицерат киназы (Pgk), который молчит и метилируется в клетках благодаря инактивации X хромосомы. Этот промотор содержит консенсусные участки связывания белка Каизо и связывается с ним in vitro при наличии метилирования CpG пар в последовательности ДНК Коэкспрессия Каизо в Mbd2 (-/-) клетках заметно снижает уровень транскрипции репортерного гена, находящегося под контролем промотора гена Pgk, в случае метилирования репортерной кострукции с 7% до 2% (рис.9). Схожие результаты по восстановлению репрессии метилированных репортерных конструкций, находящихся под контролем SV40 и Pgk промоторов, в Mbd2 (-/-) клетках были получены для

белков Mbd2 и МеСР2 (Guy, Hendrich et al. 2001; Hendrich, Guy et al. 2001). Таким образом, Каизо является метил зависимым репрессором транскрипции со свойствами, сравнимыми с другими метил-ДНК связывающими белками, такими как Mbd2 и МеСР2.

1.5 Белок Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом Н19 DMR.

Для определения потенциальной способности Каизо участвовать в основных процессах, связанных с метилированием ДНК. были выбраны в качестве модели импринтные гены. Импринтные гены могут быть использованы как уникальная система для изучения эпигенетических процессов: отцовский и материнский аллели отличаются как уровнями метилирования ДНК, экспрессии генов, так и модификациями гистонов. В случае H19/Igf2-noKyca материнский (неметилированный) аллель DMR является внутренним контролем при исследовании процессов, связанных с метилированием ДНК. Для изучения метилспецифичности связывания Каизо с районом HI9 DMR в данном участке был картирован рестрикционный полиморфизм между подвидом Mus. musculus domesticus и видом Mus. spretus (рис. 10а). ПЦР-продукт, соответствующий данному участку может быть полностью расщеплён рестриктазой Haelll только в том случае, если в качестве матрицы для ПЦР была использована ДНК подвида Mus. musculus domesticus.

Рисунок 10, Взаимодействие Каизо с

А Б метилированным аллелем Н19 DMR.

I, „... Kaiso CTCF -Ab's ■ , r

А. Картирование рестрикционного IT T ti t МГ полиморфизма в районе H19 DMR.

Dum. i/i ^^^^^^^^^^^^^^^

Spr. i ? ) ? T ^L» ? ЦГ ^^^^^^^^^^^^^^ ПИ1-' с последующей рестрикцией

продукта НаеШ эндонуклеазой. В dorn »pr dom*spi ^^ ^^ качестве матрицы использована ДИК

+}iatl)j ЧЩР ~ Î следующих видов мышей: Dom. -

„ „, " " " ' ШЬ вЛш - J Mus.musculus domesticus; Spr. - Mus.

+ Нас Ш ö г

spretus; Dom.xSpr. - Mm.domesticus x M.spretus. Б. Иммунопреципитация хроматина с антителами к белку Каизо и CTCF с последующей ПЦР и рестрикцией продукта НаеШ. «-Ab» - контроль без антител; «+» - положительный контроль для ПЦР. МГ - в метилированной форме; ЦГ - в неметшшрованной форме.

В случае, если была использована ДНК вида Mus. spretus или гибрида Mus. musculus domesticus/Mus. spretus ПЦР-продукт, соответственно, не может быть расщеплён вообще или может быть расщеплён только частично. В экспериментах по иммунопреципитации хроматина был использован хроматин, полученный из печени гибридной мыши Mus. musculus domesticus/SDT, причём при скрещивании самец принадлежал линии C57Black (Mus. musculus domesticus), а самка - линии SD7. Данная линия была искуственна получена в лабораторных условиях на основе линии C57Black {Mus. musculus domesticus) и характеризуется тем, что в её хромосомном наборе обе 7 хромосомы частично заменены на хромосомы, принадлежащие виду Mus. spretus. Таким образом, потомство от скрещивания особей линий С57В1аск и SD7 имеет тот же точечный полиморфизм между отцовским и материнским аллелями, что и потомство от скрещивания особей, принадлежащих к видам Mus. spretus и Mus. musculus domesticus (рис. 10a).

Иммунопреципитационньш и алелль-специфический рестрикционный анализ показал, что

белок Каизо взаимодействует только с отцовским метилированным аллелем Н19 DMR, тогда как CTCF можно было детектировать только на неметилированном материнском аллеле (рис. 106). Таким образом, показано, что Каизо in vivo связывается с метилированными последовательностями.

1.6 Семейство Каизо-гомологичных белков

1.6.1 Два новых белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Каизо, узнают метилированную ДНК in vitro.

Белок Каизо связывается с метилированной ДНК за счет цинковых пальцев, поэтому было предположено, что существуют и другие аналогичные белки с цинковыми пальцами, которые смогут узнавать метилированную ДНК. На основе поиска по базе данных данных NCBI, RefSeq д проект были найдены

два белка,

гомологичные Каизо: ZBTB4 и ZBTB38 (рис. 11).

KaiSO iCIVCKRSYVCLTSUUWFmi«WEKK*^R¥CEKVFP ZBTB4 I CAACERSYVTLSSIjaWSbTnÉraRKVFjcP.YCEKVP FCKETFVTYYNLKTHQP.AFH;

ZBTB38 iCWCKRSYVTLSSIJü^Ay\fflK>.T.P.T4'tKrHyCKKVy^

J (674 аа)

ТГ

Ж) (1013 аа) (1195 аа)

гомологичные цинковые пачьцы

■ цинковые пальцы £5 глутамин-оогатып домен ££ пролин-богатый домен Е ВТВ/РОг

Рисунок 1]. ХВТВ4 и 2ВТВ38 содержат цинковые пальцы, гомологичные Каизо. А. Выравнивание участка Каизо, содержащего три цинковых пальца, с ZBTB4 и ZBTB38. Три цинковых пальца выделены. Аминокислоты, совпадающие у трёх белков, отмечены звездочками. В. Структура Каизо, ZBTB4, 2ВТВ38. Белки выровнены по трем цинковым пальцам.

Эти белки имеют три гомологичных цинковых пальца и похожую доменную структуру всего белка : на Ы-конце все три белка содержат ВТВ/Р02 домен. 2ВТВ4 и 2ВТВ38 более схожи друг с другом, чем с Каизо.

Эксперименты по задержке комплексов белок-ДНК показали, что ZBTB4 и ZBTB38, также как и Каизо, обладает сродством к метилированным последовательностям ДНК т v^7ro(pиc.l2а).

со ~ о со со

Spr. (paternal) -Dom. (maternal i _

¿222.

Рисунок 12. ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированной ДНК in vitro и in vivo. ZBTB4 и ZBTB38 подавляют транскрипцию in vivo на метилированных матрицах ДНК. А,-Цинковые пальцы Каизо, ZBTB4, ZBTB38 были экспрессированы в кроличьих ретикулоцитных лизатах. Полученные белки инкубировали с меченой (А. метилированной или неметилированной пробой) и разделяли полученные комплексы в 6% ПААГ.Б-Метил-специфичное связывание Каизо, ZBTB4 и ZBTB38 с метилированным участком DMR локуса Igf2/H19. Верхняя панель: хроматин

t 25 %л

I % 70 \ 1

§» га-

i 5

1 »

иммунопреципитация с антителами, указанными на рисунке. Нижняя панель: ДНК была выделена из агарозного геля (см. верхнюю панель) и рестрицирована НаеШ. В-метилчувствительный экспрессионный анализ.Конструкции, с которых экспрессировались белки, были совместно транзиторно трансфецированы с метилированной, либо неметилированной SV-40 репортёрной конструкцией. Относительная репортёрная активность рассчитывалась следующим образом: уровень экспрессии с метилированного репортёра/уровень экспрессии с неметилировано1 о репортёра* 100. На диаграмме приведены усредненные данные трёх экспериментов.

Используя импринтный локус H19/Igf2 как модельную систему (как было описано раннее), удалось показать, что in vivo ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированным отцовским аллелем HI9 (рис.126). Метил-чувствительный эксперимент подтвердил, что оба гомолога Каизо являются метил-зависимыми репрессорами (рис.12в). Таким образом, ZBTB4 и ZBTB38 ведут себя также как и белки MBD семейства и белок Каизо: связывают метилированные CpG in vitro и in vivo (рис. 12a,б), подавляют транскрипцию с метилированной матрицы (рис. 12в).

Рисунок 13. ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированной ДНК в клетках.. А-

ZBTB4 и ZBTB38 были транзиторно трансфецированы в NIH3T3.

Трансфецированые клетки были

зафиксированы и окрашены либо преиммуной сывороткой (PI), либо антителами к данным белкам. a-ZBTB4 и a-ZBTB38. Затем клетки были обработаны вторичными антителами, конъюгироваными с Alexa Fluor® 488, которые флуоресцируют в том же диапазоне, что и GFP. Сигнал после окрашивания антителами к ZBTB4 и ZBTB38 совпадает с хромоцентрами, окрашенными DAPI.B- RFP-ZBTB4 и RFP-ZBTB38 были транзиторно трансфецированы в dnmtl-/-,p53-/~ клетки, в которых нарушено метилирование. Трансфецированые клетки были

зафиксированы и окрашены DAPI. представлены по два типа клеток I тип клеток: ZBTB4 и ZBTB38 уходят с хромоцентров в клетках с нарушенным метилированием ДНК. II тип клеток, в которых ZBTB4 и ZBTB38 по-прежнему остаются на хромоцентрах.

Известно, что в ядрах мышиных. 1 клеток области различных хромосом, содержащие большие и малые сателлитные повторы, которые метилированы, агрегируют и образуют структуры, называемые хромоцентрами. Эти структуры хорошо детектируются с помощью микроскопа, поскольку они хорошо окрашиваются специальным красителем DAPI. Оба белка ZBTB4 и ZBTB38 при трансфекции в мышиные клетки были локализованы в хромоцентрах (рис. 13а). Для того чтобы понять, за счёт чего ZBTB4, ZBTB38 в клетках оказываются на хромоцентрах, а именно, влияет ли то, что ДНК в хромоцентрах метилирована на локализацию данных белков, были использованы клетки с нарушением метилирования. Это мышиные эмбриональные фибробласты, у которых удалён | каталитический домен ДНК-метил трансферазы-1. В данных клетках значительно понижен уровень метилирования ДНК (но всё же, остаточное метилирование присутствует благодаря de

PI "-ZB1B4

DAPI DAPI

RFPZBTB4 if 1 RFP-ZBTB4

DAPI 1

69% 31%

PI Г/-2ВТВ38

ЩШНи 1 1 шш DAPI

вгр-гвтвзв r.FP-ZBTBM

DAPI CAPI «л»

62% 38%

novo метилтрансферазам DNMT3a,3b). Но, поскольку, удаление Dnmt-1 летально для клеток, так как клетки умирают по р53 зависимому пути (Jackson-Grusby et al., Nat. Genetics,2001), то были использованы клетки, в которых отсутствуют и Dnmt-1 и р53 (клетки были любезно предоставлены/ профессором Бёрдом (Adrian Bird), которые жизнеспособны, в качестве контроля использовали мышиные эмбриональные фибробласты с удаленным геном р53. При трансфекции в контрольные клетки RFP-ZBTB4 и RFP-ZBTB38 эти белки были локализованы в хромоцентрах. При трансфекции в (dnmtl-/-,p53-/-) клетки ZBTB4 и ZBTB38 в примерно 60% клеток оказываются распределенными диффузно по всему ядру и только в 30-40% клеток по-прежнему локализованы в хромоцентрах (рис.136). Аналогичная ситуация наблюдалась при трансфекции в эти же клетки другого метил-ДНК связывающего белка МеСР2. Возможно, что данные белки могут также узнавать саму структуру гетерохроматина, а не только статус метилирования ДНК. Тем не менее, данный эксперимент позволяет сделать вывод, что ZBTB4 и ZBTB38 связывается с метилированой сателлитной ДНК in vivo.

Таким образом, было обнаружено новое семейство белков, узнающих метилированную ДНК и являющихся метил-зависимыми репрессорами.

2. Удаление гена Каизо в различных организмах

Для выяснения биологической функции белка Каизо в живых организмах было решено произвести удаление гена, кодирующего белок Каизо, из геномов различных видов организмов: лягушки (хКаизо), рыбы (с1Каизо) и мыши.

2.1 хКаизо необходим для нормального развития лягушки Xenopus Laevis Для изучения возможного участия Каизо в регуляции развитии лягушки были проведены инъекции антисмысловыми олигонуклеотидами морфолино хКаизо (КМО), соответствующими 5'-нетранслируемому району и первым шести кодонам, в эмбрионы лягушки на стадии деления двух клеток. Это привело к эффективному подавлению трансляции белка Каизо (рис. 14). Инъекция Юнг контрольных олигонуклеотидов морфолино не повлияла на развитие эмбрионов (см. таблицу 3, рис. 14а).

Таблица 3. Эксперимент по микроинъекции олигонуклеотидов морфолино в эмбрионы лягушки

МО/РНК инъецированная Фенотип на стадиях 15-21 Фенотип на стадиях 33/34

Успешная нейруляци я Гибель во время нейруляци и Гибель после нейруляци и Spina bifida (незакрытая нервная трубка и короткая ось) Нормальны й фенотип на стадии 33/34

Контрольное МО 10 нг КМО Юнг КМ0 5нг КМО 0.5 нг 46 (92%) 0 0 72 (72%) 0 97 (100%) 0 25 (50%) 0 2 (4%) 0 24 (48%) 4 (4%) 4 (8%) 0 1 (2%) spina bifida 28 (28%) spina bifida 24 (24%) короткая ось 44 (88%) 0 44 (44%)

КМО 5 нг/750 пг дикий тип ЬКаизо 28 (61%) 11 (24%) 16 (35%) 7(15%) 12 (26%)

КМО 5 нг/375 пг дикий тип ЬКаизо 22 (44%) 26 (52%) 17 (34%) 5 (10%) 2 (4%)

КМО 5 нг/750 пг СЗ1 мутантный 0 0 25 (50%) 23 (46%) 2 (4%)

ЬКаизо

750 пг дикий тип ЪКаизо 58 (97%) 0 2 (3%) 8 (13%) 50 (83%)

Инъекция КМО в количестве от 0.5нг до Юнг привела к потере способности эмбрионов к дальнейшему развитию и возникновению различных, зависящих от дозы КМО, фенотипических изменений эмбрионов (см, таблицу 3, рис. 14,б-д). Характерной чертой инъекции 5нг КМО является появление белых апоптотических клеток вблизи бластопора в стадии нейруляции (рис.14). На стадии 21-22 КМО развитие останавливается, и поверхность эмбрионов покрывается белыми апоптотическими клетками, которые связаны с эффектом сшелушивания клеток с поверхности эмбрионов (рис. 14в). Введение меньших доз КМО приводит к появлению менее значительных фенотипических отклонений с задержкой закрытия бластопора на стадии 15 (рис. 14г). Большинство из развившихся инъецированных КМО эмбрионов до стадии головастика короче в длину или имеют нарушения верхних дорсальных структур (spina bifida) (рис. 14д).

Фенотипически эффект введения в эмбрион КМО похож на картину развития эмбрионов, у которых снижен уровень ДНК-метил-трансферазы! (xDnmtl) (Stancheva and Meehan 2000) (рис. 14e).

Рисунок 14. Фенотип эмбрионов лягушки с пониженным уровнем белка хКаизо. А- введение в эмбрион Юнг контрольных МО (СМО), стадия 15; Б,В-после введения в эмбрионы 5 нг КМО, стадия 15 и 21соответсвенно; Г- после введения в эмбрион 0.5 нг КМО, стадия 15;. Д- набор фенотипов у эмбрионов с введенным КМО (0.5нг): 44% эмбрионов выглядят нормальными на стадии 38 (верхний эмбрион). 29% неспособны развить нормальные дорсальные структуры (spina bifida, нижний эмбрион). Другие фенотипы являются промежуточными между приведенными двумя случаями; Е- фенотип эмбрионов с введенным Юнг МО к xDnmtl. Стрелками указаны апоттготические клетки; Ж- Имунноблот ядерных белковых экстрактов из эмбрионов лягушки дикого типа и инъецированных 5 нг КМО с использованием специфических антител к хКаизо. Сверху указаны стадии развития эмбрионов.

Картина при удалении хКаизо и xDnmtl похожа, а ранее было показано, что снижение общегеномного уровня метилированной ДНК в эмбрионах лягушки приводит к активации транскрипции генов приблизительно на два цикла развития раньше нормы (Stancheva and Meehan 2000; Stancheva, El-Maarri et al. 2002).

Поэтому наличие преждевременной активации генов в эмбрионах лягушки со сниженным уровнем белка хКаизо в результате введения КМО было решено проверить путем измерения включения на стадиях бластулы и гаструлы радиоактивно меченного изотопом серы [35S]-yT<t> в

эмбрионах лягушки дикого типа и в инъецированных КМО. Как и ожидалось, в контрольных эмбрионах дикого типа активное включение УТФ начиналось после стадии сдвига в средней бластуле (MidBlastulaTransition). Однако, в эмбрионах с введенными КМО, у которых был снижен уровень белка хКаизо активное включение радиоактивно-меченного начался на два

цикла раньше (рис.15), в полной аналогии с эффектом

снижения уровня Dnmtl в эмбрионах nHryuiKH(Stancheva and Meehan 2000).

Рисунок 15. Снижение уровня белка хКаизо ведет к преждевременной активации транскрипции генов, регулируемых \Dnmtl. А- Детекция активации транскрипции генов путем измерения включения радиоактивно меченного [358]-УТФ в эмбрионах дикого типа (\УТ) и в эмбрионах, инъецированных 0,5 нг КМО; Б- Анализ методом ПЦР в реальном времени РНК из эмбрионов, собранных на стадии 8, дикого типа (\УТ), инъецированных 5нг КМО и 5нг ДМО, на наличие транскриптов генов хОа-25, хВеГ, хЕ)гак1, регулируемых хКаизо и хОппи1. Ген хООС был выбран в качестве контроля.

Полученные данные позволяют предположить, что **

уХ)птй и хКаизо принимают участие в одном и том же

пути, подавляя экспрессию генов в эмбрионах лягушки до стадии МВТ.

Стада Puurnu КМО-Ст8 ДМО-СТ8

— — •:»?>

«иос

2.2 (1Каизо является необходимым для развития Оапю Кегю

Для определения роли белка Каизо в развитии рыб был поставлен эксперимент, аналогичный проведенным на лягушке. Были использованы флуоресцентно меченые морфолино к (Жаизо, которые имеют ту же специфичность действия, что и немеченые. Морфолино ¿КМО инъецировали в эмбрионы на стадии 1-4 клеток. По прошествии 24 и 48 часов развития проводился анализ морфологии и проводился подсчет выживших эмбрионов (рис.16). Эмбрионы с введенными морфолино имели значительно больший процент смертности к 48 часам развития: 89% по сравнению с 17% у эмбрионов с введенными контрольными неспецифическими морфолино.

Рисунок 16. Белок Каизо йато гепо необходим для развития рыб. Фенотип КМО инъецированных эмбрионов сравнивался с контрольными через 24 часа после оплодотворения. На нижней панель приведен флуоресцентный анализ через 24 часа после введения флуоресцентно меченых морфолино к с!Каизо.

Большинство эмбрионов с введенными контрольными морфолино (83%) развивались нормально, однако среди ёКМО эмбрионов лишь 2.5% развились нормально, остальные имели различные дефекты развития: отставание в развитии (8.5%), осевые дефекты и неполное формирование головы. 2.5% нормально

О<уо 2 э °

развившихся dKMO эмбрионов, однако, имели ненормальные нервные ответы, по сравнению с контрольными эмбрионами (данные не приведены). Эти эффекты введения dKMO в эмбрионы рыб аналогичны ранее описанным эффектам истощения белка dDnmtl(Stancheva and Meehan 2000), что повторяет картину, которая наблюдалась в экспериментах у лягушки, описанных выше.

2.2 Создание и анализ мыши с генетическим нокаутом по гену Каизо 2.2.1. Генетический нокаут гена Каизо в мыши не приводит к проявлению патологического фенотипа

Генетический нокаут гена Каизо в мыши был осуществлен методом кондиционного нокаута. Для подтверждения делеции гена Каизо использовали методы иммуноблота и Нозерн блот-гибридизации (рис. 17). Анализ ядерных белковых экстрактов из печени мыши дикого типа и с нокаутом по гену Каизо методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле показал, что метил-специфичный комплекс KGB не образуется в случае ядерных белковых экстрактов из печени мыши с нокаутом по гену Каизо.

д "-' Рисунок 17. Поодтверждение наличия нокаута по гену, кодирующему

« и «t ko ko wt и Каизо. A. Нозерн-блот анализ тотальной РНК из тканей (мозг, печень, почки, селезенка) животных дикого типа и нокаутных по гену Каизо. EtBr - агарозный гель, прокрашенный бромистым этидием перед блотированием. Б. Иммуноблот ядерных экстрактов ткани «экю Щ Iff (печени) животных дикого типа и нокуатных по Каизо. WT -ткани животных дикого типа;

КО - нокаутных по гену Каизо. Полоса Каизо соответствует молекулярному весу 1 ООкД. Нижняя панель демонстрирует иммуноблот на IkB-альфа белок как внутренний контроль.

Антитела к белку Каизо эффективно сдвигают KGB, но не оказывают влияния на другие ДНК-белковые комплексы, образующиеся в случае мутантных по Каизо экстрактов (рис. 18).

Несмотря на то, что у лягушки и у рыбы отсутствие Каизо приводило к остановке развития эмбрионов, мыши, мутантные по гену Каизо, не показали ни какого патологического фенотипа и могут поддерживаться в

111.: ШЫр1и ah's

виде устойчивой линии более 10 поколений

Рисунок 18. Анализ ядерных белковых экстрактов из печени мыши дикого типа и с нокаутом по гену Канзо методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле. В качестве радиоактивно меченой пробы использовали фрагменты ДНК либо с метилированной (M+CG11), либо неметилированной (CGI I) последовательностью ДНК Нижний ДНК-белковый комплекс, образованный M+CG11 и ■ белковыми экстрактами дикого типа, является метил-специфичным комплексом, образованным Каизо (KGB). На дорожках альфа-Каизо нанесены реакции связывания с добавленными в реакцию специфическими антителами к белку Каизо (ZFH6).

ко

Мыши имели нормальный вес, давали

жизнеспособное потомство нормального размера. В работе (Yoon, Chan et al. 2003) было показано, что в клетке Каизо взаимодействует с корепрессором N-CoR. Известно, что N-CoR участвует в

процессах регуляции развития центральной нервной системы, эритроцитов и тимоцитов. Было решено проверить влияние отсутствия белка Каизо на функции этих тканей. Однако анализ кровяных телец мыши с удаленным Каизо не выявил серьезных отличий от крови мыши дикого типа по составу фракций белых и красных кровяных телец и их морфологии. Для определения роли Каизо в поддержании плюрипотентности стволовых клеток и их воспроизведении были получены клеточные линии нейрональных стволовых клеток из Каизо +/> и Каизо "/у ЭС клеток. Нейрональные стволовые клетки нокаутные по гену Каизо не отличаются по морфологии и эффективности пролиферации от стволовых клеток нейронов мыши дикого типа. Дифференцировка полученных нейрональных стволовых клеток в постмитотические нейроны и астроциты показала, что обе клеточные линии были неотличимы друг от друга. Значит, функция Каизо не важна для нейрональной специализации, Каизо не влияет на выживаемость стволовых клеток нервной системы, а также на дифференцировку нейрональных и астроглиальных клеток ех vivo.

2.2.2. Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl.

Методом гибридизации на микрочипах был проведён глобальный анализ изменения уровня экспрессии 30 тыс. генов у Каизо-нокаутных мышей. Идентифицирован ряд генов, транскрипция которых оказалась изменена при отсутствии Каизо. Геном с наиболее выраженным увеличением уровня экспрессии оказался ген Tctexl, кодирующий лёгкую цепь динеинового комплекса (Tai, Chuang et al. 1998). Данные гибридизации были подтверждены Нозерн-блот анализом, для которого была использована РНК, полученная из органов (печени и мозга) мышей дикого типа и нокаутных по Каизо (рис. 19). Уровень экспрессии Tctexl оказался в 4,4±0,6 раза выше в печени нокаутных животных, чем в печени животных дикого типа и в 2,6±0,2 раза выше в мозге животных с делецией гена, кодирующего Каизо, чем в мозге животных дикого типа (рис. 186).

Рисунок 19. Увеличение уровня экспрессии гена Tctexl в тканях мышей, нокаутных по Каизо. А. Нозерн-блот анализ тотальной РНК, выделенной из печени животных дикого типа и Каизо-нокаутных. Верхняя панель - гибридизация с зовдом к мРНК гена Tctexl, нижняя панель - гибридизация с пробой к 26S рРНК. Б. Статистический обсчет результатов Нозерн-блот гибридизации РНК, выделенной из печени и мозга животных дикого типа и нокаутных по Каизо. EJI/MM2 - удельная интенсивность радиоактивности геля в районе специфического транскрипта. WT

при анализе оазы данных tntrez мар viewer оыло установлено, что в геноме мыши

содержится два гена Tctexl-, на 17 и 6 хромосомах. При этом ген, находящийся на 17 хромосоме

имеет более сложную интрон/экзонную структуру и включает 5 экзонов, тогда как кодирующая

часть гена, расположенного на 6 хромосоме состоит из одного экзона (рис.20а). Анализ

- ткани животных дикого типа, КО - нокауных по Каизо.

последовательностей генов Tctexl позволил идентифицировать рестрикционный полиморфизм в

последовательностях мРНК (в гене, расположенном на 17 хромосоме, сайт узнавания

рестриктазой MspI отсутствует, рис.20в).С помощью иммунопреципигации хроматина было

показано, что Каизо взаимодействует только с CpG-островком гена Tctexl, расположенного на 17

хромосоме. Интересно отметить, что ацетилирование гистонов НЗ и Н4, являющееся маркером

активного хроматина, было детектировано в той же области одновременно со связыванием Каизо.

При этом ни взаимодействия Каизо, ни ацетилирования гистонов в районе промотора гена,

расположенным на 6 хромосоме детектированно не было (рис. 206). ОТ-ПЦР рестрикционный

анализ показал, что в препаратах тотальной РНК, полученной как из органов животного дикого

типа, так и из органов Каизо-нокаутной мыши не содержится транскрипт, соответствующий гену

Tctexl, расположенному на 6 хромосоме (рис. 20в, нижняя панель). Таким образом, можно

заключить, что Каизо взаимодействует только с

геном Tctexl, расположенным на 17 хромосоме,

тогда как на 6 хромосоме, вероятно, находится

« нетранскрибируемый псевдоген.

Рисунок 20. Каизо взаимодействует с геном Tctexl на 17, но не на 6 хромосоме. А. Схематическое изображение двух генов Tctexl, расположенных на 17 и 6 хромосомах. Стрелками обозначены экзоны; направление стелки — направление транскрипции. Б. Взаимодействие Каизо с CpG-островком гена Tctexl in vivo. Иммунопреципитация хромати-на с антителами ZFH6 -поликлональными к Каизо; anti-Ac НЗ - к ацетилированному гистону Н34 anti-Ac Н4 - к ацетилированному гистону Н4; PI - сыворотка крови кролика; «-Ab» - контроль без антител; «-/+» -отрицательный и положительный контроли для ПЦР, ш соответственно. В. В тканях животных как дикого типа, так Гаи с делецией Каизо экспрессируется только ген, 'л s * ^ расположенный на 17 хромосоме. Верхняя панель -полиморфизм в последователь-ностях мРНК двух генов. Заштрихованный нуклеотид - полиморфизм, нарушающий сайт узнавания рестриктазой Mspl. Нижняя панель - ОТ-ПЦР и расщеплением ПЦР-продукта ферментом Mspl

CpG

СрО Б

17 хромосома

6 хромосома

17 хромосома

6 хромосома :

и*

V <г

'ЯЙ«Н t Paflón 2

Поскольку Каизо взаимодействует с метилированной ДНК, то было решено проверить статус метилирования участка в районе CpG-островка гена Tctexl методом бисульфитного

секвенирования. Для исследования была использована ДНК, полученная из печени мышей дикого типа и с делецией гена, кодирующего Каизо.

Рисунок 21. Анализ CpG-островка гена Tctexl.

Делеция гена Каизо не приводит к изменению метилирования ДНК в районе CpG-островка гена Tctexl. Верхняя панель - плотность метилирования ЦфГ-динуклеотидов на 17 хромосоме в районе гена Tctexl. Серые прямоугольники - экзоны; стрелка - направление

транскрипции. Районы 1 и 2 - участки, для которых был исследован статус метилирования.

Были проанализированы две области: «-189; -57» и «+160; +460» по отношению к точке старта транскрипции.

В области «-189; -57» метилирование ДНК детектировано не было (проанализировано по 10 клонов для ДНК животных дикого типа и Каизо-нокаутных). Область «+160; +460» характеризуется малым процентным содержанием метилированных CpG-динукпеотидов (проанализировано 20 клонов для ДНК животных дикого типа и 21 - для Каизо-нокаутных), причем уровень метилирования ДНК не зависит от присутствия Каизо (рис. 21).

Поскольку ген Tctexl экспрессируется и в нормальном организме, можно предположить, что Каизо является модулятором активности гена Tctexl, взаимодействуя с остаточным метилированием ДНК в промоторной области. Таким образом, в результате проведенных исследований продемонстрирована возможность взаимодействия Каизо-содержащего белкового комплекса с последовательностями ДНК, подвергающимися метилированию в результате таких процессов, как геномный импринтинг, опухолеобразование и подавление транскрипции мобильных элементов. То, что нокаут Каизо не приводил к изменению в экспрессии большинства исследованных генов, может быть объяснено наличием «избыточного» количества метил-ДНК-связывающих белков.

2.2.3. Делеция гена Каизо в мыши приводит к изменению структуры хроматина в районе Н19 DMR, но не влияет на уровень экспрессии Н19 и IGF2

Как было показано выше (см. рис. 106) Каизо может связываться in vivo с метилированным

отцовским аллелем в районе Н19 DMR. Для изучения функциональной роли Каизо в районе Н19

DMR были проведен анализ структуры хроматина в районе Н19 DMR (ацетилирование и А

метилирование гистона НЗ, убиквитинирование гистона Н2А)

— у? 99 ^— ^ МГ 0 помошью хроматин иммунопреципитации в животных

5 = £ а дикого типа и нокаутных по гену Каизо.

^ у * ^ Рисунок 22. Взаимодействие Каизо с метилированным аллелем Н19

*д 7 -г 2 * 1)М К. Делеция Каизо приводит к исчезновению убиквитинирования

5 й л § "I на отцовском аллеле Н19 ПМК. А. верхняя панель - картирование

ацШ Пию ЛЖ ЛШЧ иш рестрикционного полиморфизма в 03-районе Н19 ИМЯ. А (нижняя

¿а: .. ■ щт- Щш панель),Б. Иммунопреципитация хроматина с указанными на рисунке

__антителами с последующей ПЦР и рестрикцией продукта НаеШ. «-АЬ» -

»'Т ко контроль без антител; «+» - положительный контроль для ПЦР ЦфГ-

< а < а динуклеотид, содержащий цитозин: МГ - в метилированной форме; ЦТ - в неметилированной форме.

5 а i

1 Í I 1 1

+ При использовании антител к метилированному по остатку К9 "И» ш «у

3 » либо К27 гистону НЗ или к ацетилированному по остатку К9 __ко гистона НЗ разницы в распределении модификаций хроматина

«л1 КО

между отцовским и материнским аллелями для нокаутных по гену Каизо животных и животных дикого типа детектировано не было (рис.22). Также было

исследовано убиквитинирование гистона Н2А в районе Н19 DMR. Показано, что данная модификация характерна только для отцовского метилированного аллеля. При этом делеция Каизо приводила к полному исчезновению данной эпигенетической модификации в районе Н19 DMR (рис.226). Таким образом, можно заключить, что Каизо способен привлекать убиквитинирование гистона Н2А к метилированным последовательностям ДНК.

Полученные при анализе распределения модификаций хроматина данные позволяют предположить, что Каизо играет важную роль в регуляции экспрессии генов Н19 и Igf2. Поскольку эпигенетические маркёры импринтных генов образуются во время гаметогенеза, можно было ожидать, что отсутствие Каизо во время спермато- или оогенеза приведёт к нарушению импринтинга в исследуемом локусе. Для проверки данного предположения было проанализировано потомство от скрещивания Каизо-нокаутного самца с самкой дикого типа, а также реципроктного скрещивания самца дикого типа с Каизо-нокаутной самкой. В обоих экспериментах животные дикого типа принадлежали к линии SD7. Поэтому потомство от данных скрещиваний имело рестрикционный полиморфизм между отцовским и материнским аллелями как в кодирующей последовательности гена Н19, так и в кодирующей последовательности гена Igfi (рис. 23).

Рисунок 23. Рестрикционный полиморфизм в кодирующих последовательностях генов HI9 и Igf2.Делеция Кашо не влияет на уровень экспрессии Н19 и Igf2. А. Схематическое изображение ОТ-ПЦР амгошфицированных

фрагментов с указанием

рестрикционного полиморфизма. Б.Обратная транскрипция с последующим расщеплением

рестриктазами NlaHI либо BsaAI. В качестве матрицы для ОТ-ПЦР взята тотальная РНК, выделенная из ткани мышей, полученных от

скрещиваний M.spretus (с) х M.m.domesticus ($) и ш (о) х M.spretus (9).В.Аллель-специфичная ПЦР в реальном времени. В качестве матрицы для ОТ-ПЦР взята тотальная РНК, выделенная из тканей печени мышей, полученных от скрещивания Каизо-нокаутной самки и самца линии SD7.

При анализе мРНК, выделенной из тканей этих мышей не было детектированно разницы в содержании транскриптов генов Н19 и Igf2 между нокаутными животными и животными дикого типа либо гетерозиготными по Каизо (рис. 23в). Таким образом, отсутствие Каизо во время гаметогенеза не влияет на формирование эпигенетических маркёров импринтинга. 2.2.4 Задержка развития рака кишечника в Аре Мш/+ мыши с удаленным геном Каизо Ряд фактов привел к мысли о возможном участии Каизо в процессах неопластической трансформации кишечника. Во-первых, накоплено много данных об участии метилирования ДНК в подавлении экспрессии генов в процессе патогенеза рака кишечника (Kondo and Issa 2004). Во-вторых, белок Каизо может взаимодействовать с белком р120-катенином, который в 25% опухолей

кишечника перестает экспрессироваться и в 40% опухолей он ненормально экспрессируется или ненормально распределен в клетке (Thoreson and Reynolds д 2002; Kelly, Spring ei al. 2004).

Рисунок 24. Удаление гена Каизо приводит к уменьшению размера опухолей и увеличению продолжительности жизни Аре Мш/+ мышей. А-Диаграмма Каплана -Майера кривых выживания Каизо ",у Аре м"1+ мышей (пунктирная линия) и Каизо +/у Аре Мш/+ мышей (непрерывная линия). Мыши Каизо "у Аре Мт/+ живут значительно дольше (в среднем 317 дней, серая вертикальная линия) мышей Каизо +/у Аре MuV+ (в среднем 217 дней, черная вертикальная линия, Р=0.006 [log шкала] ). Б- Количество опухолей не изменяется с удалением гена Каизо. Прямоугольники показывают количество аденом на мышь, возникающих к 180 дню и к моменту гибели животного. Горизонтальная линия в прямоугольнике обозначает среднее

количество по мышам. Серые прямоугольники незакрашенные - Каизо "/у Аре М|,1/+ мыши.

Каизо +/у Аре мшгг мыши, Ни каких существенных

Г+1

различий между Каизо _/у Аре Min/+ и Каизо +/у Аре Мш/+ мышами не было обнаружено ни на 180 день (Р= 0.10 [Манн-Витней], п>20 ), ни в момент гибели (Р= 0.62 [Манн-Витней], п>20). С- Размер опухолей, измеряемый по плошади, меньше в мышах Каизо "/у Аре Min/+ на 180 день (Р= 0.001 [Манн-Витней], п>114), но не к моменту гибели (Р= 0.55 [Манн-Витней], п>239). Серые столбики - Каизо +/у Аре Мт/+ мыши, незакрашенные - Каизо "у Аре + мыши. Указаны стандартные отклонения от среднего значения.

В третьих, Каизо вовлечен в Wnt сигнальный путь (Kelly, Otchere et al. 2004; Kim, Park et al. 2004; Gregorieff and Clevers

2005; Park, Kim et al. 2005; Spring, Kelly et al. 2005), который часто нарушен в опухолях кишечника. Чтобы проверить участие Каизо в образовании рака кишечника, была использована мышиная модель человеческой болезни familial adenomatous polyposis Аре M,n/+(Su, Kinzler et al. 1992). Ape Min/+ мыши страдают от образования множественных полипов кишечника, возникающих в течении первых шести месяцев их жизни. Мышь, с удаленным геном Каизо, был а скрещена с Аре м,п/+ мышью. Изучение выживаемости и частота возникновения опухолей проводили в их потомках самцах Каизо ~/у Аре М|П/+.

Было зафиксировано значительное увеличение выживаемости Каизо "/у Аре Mln/+ самцов, по сравнению с мышами Каизо + у Аре Min/+ (рис. 24а). Опухоли возникали на 180 день, к моменту А гибели животных их количество было сравнимо между мышами обоих

генотипов (рис. 246), но размер полипов был значительно меньше на 180 день у мышей с удаленным геном Каизо (рис.24в).

Рисунок 25. Недостаток уровня белка Каизо не изменяет уровень апоптоза или скорость митоза ни в нормальном эпителии кишечника, ни в эпителии аденом мыши, а- отсутствие значимых различий в уровне апоптоза в нормальном эпителии (4.18±0.96 v 4.66±0.84, п=3 р=0.51 Манн Витней) или в эпителии аденом (3.93±0.14 v 0.30±0.31, п=3 р=0.65 Манн Витней) мышей дикого типа и мышей с удаленным геном Каизо. б- Отсутствие значимых различий в скорости митоза в нормальном эпителии (0.69±0.26 v 0.91±0.24, п=3 р=0.38 Манн Витней) или в эпителии аденом (0.389±0.06 v 0.379±0.06, п=3 р=0.10 Манн Витней) мышей дикого типа и мышей с удаленным геном Каизо. Уровень апоптоза в эпителии аденом значительно ниже уровня апоптоза в эпителии нормальной слизистой ( р=0.04, Манн Витней, как показано ранее в Bedi et al, 1995, Cfncer Res 55: 1811-1816). Черные столбики - Каизо +/у Аре

корма аденома

норма алеиома норма аденома

незакрашенные столбики -

Каизо 25

Аре мышь. Указаны стандартные отклонения.

Анализ полипов мышей с геном Каизо и без гена Каизо не выявил существенных различий в митотических индексах или в уровне апоптоза ни в нормальном эпителии, ни в аденомах (рис. 25), доказывая тем самым, что уменьшение скорости роста полипов в мышах без гена Каизо не вызвано уменьшением потенциала клеточного деления или усилением клеточной гибели. Для дальнейшего изучения вопроса вовлечения Каизо в процессы неопластической трансформации кишечника, был проверен уровень экспрессии гена Каизо в опухолях кишечника мышиной модели миС2"Л, у которой развиваются злокачественные опухоли кишечника, как у человека при болезни хронического воспаления брюшины.

Мис2 -/- МЫШИ

слоистая 1 слизистая 2 Рисунок 26. Уровень

О H О H экспрессии Каизо выше в

опухолях кишечника мыши.а-

"" " ......111 -^Knitto Иммуногистохимическое

-^Аетни окрашивание срезов опухолей ^^^^^^^^^^^^^^^ кишечника и нормальной

слизистой антителами к Каизо 6F Мис2~ мышей с указанным увеличением, б- Иммуноблот анализ двух пар опухолей кишечника Mue!" * мышей и соответствующих нормальных слизистых, взятых в качестве контроля. Блот гибридизовали с антителами к белку Каизо 6F и к белку актин, для нормализации количества нанесенного в лунку общего количества белков.

Было проведено иммуногистохимическое окрашивание срезов и иммуноблот анализ MUC2"'" опухолей, нормальную слизистую этих же мышей использовали в качестве контроля. Оба метода показали значительное увеличение содержания белка Каизо в клетках опухолей, по сравнению с контролем (рис. 26). Полученные данные предполагают участие Каизо в неопластической трансформации кишечника, так как отсутствие Каизо приводит к сдерживанию роста опухолей в APC Ml,l/+ мышах, и в опухолях кишечника мыши повышен в2? ' уровень экспрессии белка Каизо. Это предполагает, что Каизо

может метил-зависимо подавлять экспрессию генов. На этом этапе исследования важным является обнаружение реальных генов мишеней Каизо в клетках кишечника, вовлеченных в раковую трансформацию.

2.2.5. Каизо является метил-чувствительным регулятором генов опухолевых супрессоров в раковых клетках кишечника.

Для определения роли Каизо в репрессии генов опухолевых супрессоров в раке кишечника были выбраны две линии клеток: Со1о320 и НСТ116, представляющие данный вид рака. Было показано, что Каизо экспрессируется в этих клеточных линиях (данные не приведены). С помощью methylight assay был проанализирован статус метилирования промоторных участков 93

НОРМАЛЬНАЯ СЛИЗИСТАЯ ОПУХОЛЬ

Щрр 20х. ¿»'''ЯГмМЯ .-.v.'"*

И- <ц Smra ЙЩР

ï ! ЧГ> < - V' ■. ppdV»;»: - 40*

7"Й "" ijj ^ fîjfi «». > А ... Л* £L0ît JCL'S"

W Ï"

генов. Эта выборка генов включала в себя те локусы, для которых показано гиперметилирование в

i различных видах рака. Гиперметилирование было характерно для 57% генов в Со1о320 и 24% генов в НСТ116. Для дальнейшего анализа были выбраны три гена, гиперметилированные в обеих клеточных линиях: CDKN2A, HIC1, MGMT. CDKN2A является опухолевым супрессором, который инактивирует комплекс циклин D-cdk4/6, блокирует гиперфосфорилирование Rb, что приводит к остановке клеточного цикла (Sherr and Roberts 1995). HICl является транскрипционным репрессором и может регулировать SIRT1 при различных повреждениях (Chen, Wang et al. 2005). Подавление транскрипции MGMT приводит к нарушению в системе репарации и приводит к геномной не ст аби ль но cth(Es tel 1 ег 2002). Для определения

i взаимодействия Каизо с промоторами CDKN2A, ШС1, MGMT in vivo была проведена

i количественная иммунопреципитация хроматина, в результате которой продемонстрировано, что

i Каизо взаимодействует in vivo с промоторами выбранных генов в Со1о320 и НСТ116 клеточных линиях (рис.27а,в). Известно, что в клеточной линии НСТ116 ген CDKN2A инактивируется благодаря гиперметилированию одного аллеля и мутации другого аллеля (Myohanen, Baylin et al. 1998). Для того чтобы определить, с каким аллелем взаимодействует Каизо, полученный пул ДНК в результате иммуноперципитации хроматина был проанализирован с помощью метил-чувстительной рестрикцией. Оказалось, что Каизо в НСТ116 связывается с метилированным

1 аллелем промотора гена CDKN2A (рис.27с,д).

Рисунок 27. Каизо связывается с метилированными промоторами в раковых клетках кишечника. Количественный ChIP анализ был проведен на Со1о320 (А) и НСТ116 (В) для определения связывания Каизо с промоторами CDKN2A, MGMT, HICl.По оси Y отложено обогащение имуннопреципиации с антителами к Каизо или к IgG относительно ДНК до иммунопреципитации. C-ChIP с антителами к Каизо был выполнен на клетках НСТ116, в которых промотор CDKN2A полуметилирован (1 дорожка).2 и 3 дорожки-ПЦР после рестрикции MspI и Hpall соотвественно фрагментов ДНК после ChIP (Каизо связывается только с метилированным аллелем).Д -После ChIP был проведен ПЦР в реальном времени после обработки фрагментов ДНК рестриктазами MsplH Hpall.

Далее, необходимо было определить, зависит ли подавление транскрипции выбранных гиперметилированных генов от Каизо.

Рисунок 27. Каизо подавляет транскрипцию 8метилированных генов раковых клетках кишечника.После обработки клеток Со1о320 (а), НСТ116 (В) siRNAl (черные) и SÍRNA2 (серые) на Каизо был определен уровень мРНК генов CDKN2A,

; в

/ / / i

CNP - НСТИ6 с**

G 1 ' * i

El кэ*о

COKN2A MGMT МО

I, ti

CDKN2A MGMT

MGMT, HIC1 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

Для этого, используя 2 разных siRNA на Каизо (siRNA 1 и SÎRNA2), был понижен уровень клеточного белка Каизо. С помощью количественного ОТ-ПЦР было показано, что снижение уровня Каизо приводит к повышению уровня, как мРНК (рис.28), так и белка (данные не приведены) для CDKN2A, HIC1, MGMT в обеих клеточных линиях. Таким образом, удаление Каизо приводит к реактивации данных локусов. Для того чтобы определить, каким образом удаление Каизо оказывает влияние на транскрипцию генов опухолевых супрессоров, был проверен статус метилирования промотора CDKN2A в Со1о320 и НСТ116 в присутствии и отсутствии Каизо. Для этого был использован MassArray анализ, который позволяет определить количество метилированных CpG в заданной последовательности. Были выбраны два участка в промоторе гена CDKN2A: один из участков содержал два консенсусных сайта для Каизо (Chr9 21,964,659-21,964,922), второй участок (Chr9 21,966,178-21,966,699), в состав которого не входят сайты для Каизо. Было показано, что удаление Каизо не приводит к каким-либо изменениям в статусе метилирования промотора CDKN2A. Эти данные были также подтверждены с помощью бисульфитного сиквенса (данные не приведены). Таким образом, метилирования промоторов генов, которые связаны с опухолеобразованием, недостаточно для подавления их транскрипции, более того их уровень экспрессии частично зависит от присутствия Каизо. Подобная ситуация наблюдалась при удалении другого метил-ДНК-связывающего белка MBD2(Sansom, Berger et al. 2003).Также известно, что гистон-деацетилазы вносят свой вклад в снижении уровня транскрипции метилированной ДНК. Таким образом, в подавлении транскрипции генов с метилированным промотором могут участвовать несколько механизмов.

Поскольку Каизо может оказывать влияние на экспрессию генов супрессоров опухолевого роста, то было решено проверить, оказывает ли влияние удаление Каизо на чувствительность клеток рака кишечника к различным видам раковой терапии. Для этого клеточные линии Со1о320 и НСТ116 трансфецировали двумя видами siRNA на Каизо или контрольными siRNA. Через 24 часа после трансфекции клетки были синхронизированы с помощью сывороточного голодания. После синхронизации было изучено влияние Каизо на клеточный цикл: через 24 и 48 часов после синхронизации была произведена оценка, на какой стадии клеточного цикла находятся клетки. Для клеток нетрансфецированных или трансфецированных контрольными siRNA в Со1о320 через 24 и 48 часов 51% и 57% клеток соответственно находилось в G1 фазе клеточного цикла. В клетках с siRNA на Каизо в Со1о320 через 24 часа было 68% и 62% клеток в G1 фазе (данные приведены для двух разных siRNA), а через 48 часов - 71% и 76%. В случае линии клеток НСТ116, для нетрансфецированных клеток и контрольных клеток через 24 и 48 часов процент клеток в G1 фазе составил 51%. В случае использования siRNA на Каизо через 24 часа после сывороточного голодания процент клеток в G1 фазе был 61% и 66%, а через 48 часов - 78% и 56%. Для определения влияния противораковых препаратов на клетки с пониженным уровнем

Каизо был использован этопозид в концентрации 50(шю1/Ь. После трансфекции siRNA на Каизо клетки обрабатывали этопозидом и оценивали смертность клеток с помощью окрашивания acridine orange/этидиум бромидом через 48 и 72 часа. Для контрольных и нетрансфецированных Со1о320 было показано, что смертность клеток составляет 10% и 11% через 48 и 72 часа после обработки. Для клеток с siRNA на Каизо смертность через 48 часа составила 20-23%, а через 78 часов - от 25 до 35%. Для линии клеток НСТ116 были получены следующие данные: для контрольных и нетрансфециро-ванных клеток смертность была замечена менее чем у 5% клеток (через 48 и 72 часа), тогда как при siRNA на Каизо смертность составила 22-28% через 48 часов и 24-27% через 72 часа. При использовании нормальных фибробластов из кишечника удаление Каизо не оказывало какого-либо влияния на уровень экспрессии генов CDKN2A, MGMT, Н1С1 и не приводило к изменению в клеточном цикле или смерти клеток при использовании этопозида. Таким образом, удалось показать, что Каизо участвует в подавлении транскрипции метилированных генов, которые вовлечены в регуляцию клеточного цикла и выживание клеток. Каизо способствует пролиферации раковых клеток и устойчивости к противораковым реагентам.

3. Две функции домена "цинковые пальцы" белка Каизо

Как было сказано выше, белок Каизо был определен одновременно в лаборатории доктора Рейнольдса как партнер р 120 кагенина в дрожжевой двугибридной системе (Daniel and Reynolds 1999). Им же было показано, что Каизо может специфически взаимодействовать и с неметилированной ДНК- CTGCNA, названной Каизо связывающим сайтом (КСС). Таким образом, белок Каизо может взаимодействовать как с метилированной ДНК, так и с неметелированными последовательностями, содержащими КСС. И если предположить существование некоторого сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поверхности клетки в ядро, приводящего к выключению генов, то изучение функциональной значимости взаимодействия Каизо с р120 катенином особенно важно.

Взаимодействие катенина р120 с Каизо опосредованно через Arm домен, таким образом, катенин р120 может формировать белковый комплекс либо с Е-кадхерином, либо с белком Каизо. Исходя из возможности связывать как метилированную ДНК, так и неметилированную, Каизо может влиять на транскрипцию как генов, содержащих метилированные регуляторные элементы, так и генов, для промоторов которых характерно наличие последовательности КСС. Так КСС последовательность характерна для промоторов таких генов например, как Matrilysin, Siamois и Wntll(Daniel and Reynolds 1999; Daniel, Spring et al. 2002). Данная часть работы посвящена определению функциональной значимости как взаимодействия Каизо с р 120 катенином, так и взаимодействия Каизо с метилированной ДНК и последовательностями, содержащими КСС. 3.1 Взаимодействие белка Каизо с р120 катенином и метилированной ДНК носат взаимоисключающий характер

3.1.1. Ядерная и цитоплазматическая локализация белка Каизо в клетках млекопитающих.

Влияние р120 катенина на клеточную локализацию Каизо.

Для метил-ДНК-связывающего белка Каизо определена ядерная локализация в клетках млекопитающих, однако способность его к взаимодействию с р 120 катенином в цитоплазме, предполагает возможность цитоплазматической локализации Каизо (Daniel and Reynolds 1999; Daniel, Spring et al. 2002). Используя метод иммунофлуоресцентного анализа на различных клеточных линиях, трансфецированных Каизо-GFP, было показано, что Каизо находится в ядре, однако и в цитоплазме наблюдается незначительное количество Каизо. Таким образом, метил-ДНК-связываюгций белок Каизо может находиться в клетках млекопитающих не только в ядре, но и в цитоплазме.

Используя метод имммунофлуоресцентного анализа, было решено оценить влияние высокого уровня экспрессии р 120 катенина на локализацию Каизо в клеточных линиях HeLa. При высоком уровне экспрессии р120 в клетках наблюдается «ветвящийся» фенотип, связанный с инактивацией RhoA и/или активацией Racl белков (Reynolds, Daniel et al. 1996; Anastasiadis and Reynolds 2001). Каизо-FLAG и pl20-GFP были совместно трансфецированы в клеточную линию человека HeLa. В результате повышенного уровня экспрессии р120 катенина, полноразмерный Каизо делокализовался из ядра в цитоплазму (рис. 29а). Исходя из того, что домен «цинковые пальцы» Каизо отвечает за связывание белка с ДНК, было решено проверить, как будет локализоваться Каизо в клетке без этого домена.

Рисунок 29. Локализация белка Каизо при повышенной экспрессии р120 катенина. а -

Совместная трансфекция поноразмерного Кант ( I -672) Каизо (конструкция Kaa30(l-672)-FLAG) с - pl20-GFP р 120 катенином (конструкция pl20-GFP) в клеточную линию HeLa.. б - Совместная трансфекция конструкции Каизо без домена «цинковые пальцы» (KaH3o(l-490)-FLAG) с р 120 катенином (pl20-GFP) в клеточную линию HeLa. Для идентификации Каизо в иммунофлуорисцентном анализе

Канад ( I -490) использовались антитела на FLAG пептид + plîO-GFP

При совместной

трансфекции pl20-GFP с Каизо (аа l-490)-FLAG в линию клеток HeLa наблюдалась четко выраженная ядерная локализация белка, несмотря на сохранение ветвящегося фенотипа клеток (рис. 29 б).

На основе полученных данных можно предположить, что р120 катенин, несущий сигнал ядерной локализации способен взаимодействовать с Каизо и приводить к делокализации белка из ядра в цитоплазму, тем самым, понижая его транскрипционную активность и вовлекая Каизо в другие молекулярные механизмы жизнедеятельности клетки.

3.1.2. Определение функционального домена белка Каизо, ответственного за взаимодействие с р120 катенином

Для определения функционального домена белка Каизо, необходимого для взаимодействия

с р120 катенином была использована дрожжевая двугибридная система Cytotrap («Stratagene»,

США). В результате делеционного анализа с р 120 катенином было показано, что провзаимодействовали только полноразмерный белок Каизо (аа 1-672), и последовательность, содержащая домен «цинковые пальцы» белка Каизо (аа 490-578). Далее были предприняты попытки более детального картирования сайта связывания белка Каизо с р 120 катенином. С помощью двухгибридной системы было показано, что для взаимодействия с р 120 необходимы второй и третий «цинковые пальцы». Таким образом, можно предположить, что функциональным доменом для взаимодействия Каизо с р 120 катенином являются 2 и 3 «цинковые пальцы», которые вероятно, способны формировать структуру необходимую для данного белок-белкового взаимодействия.

3.1.3. Функциональный домен «цинковые пальцы» белка Каизо необходим для взаимодействия с р120 катенином in vivo

Для подтверждения достоверности результатов, полученных в дрожжевой двугибридной системе, оценка необходимости домена «цинковые пальцы» белка Каизо для взаимодействия с р120 катенином была осуществлена в in vivo эксперименте с помощью коиммунопреципитационного анализа. Имуннопреципитационный анализ показал, что Каизо взаимодействует с р120 только при наличии "цинковых пальцев" (рис. 30). Таким образом, данные, полученные в in vivo эксперименте, подтверждают результаты дрожжевой двугибридной системы." делеция домена «цинковые пальцы» белка Каизо приводит к невозможности

^.у^лрсшяштш» образования комплекса Каизо/р120.

Рисунок 30. Домен «цинковые пальцы» белка Каизо необходим для взаимодействия с р120 катенином in vivo. Схематичное изображение конструкций белка Каизо. Представлен результат коиммунопреципитации белка Каизо и его делеций с р120 катенином.

3.1.4. р120 катенин влияет на ДНК - связывающую активность белка Каизо

Исходя из описанных выше результатов по взаимодействию домена «цинковые пальцы» Каизо с р 120, можно предположить, что р120 катенин будет влиять на ДНК-связывающую активность Каизо, поскольку именно "цинковые пальцы" отвечают за связывание с ДНК.

Рисунок 31. р120 катенин ингибирует ДНК связывающую активность Каизо. А. Полноразмерный рекомбинантный Каизо-GST преинкубировали с р 120 катенином, треугольники показывают увеличение добавляемого количества р 120, количество добавляемого Каизо указано над треугольниками. Б. Полноразмерный рекомбинантный MBD1-GST, преинкубировали с р 120 катенином, треугольники показывают увеличение добавляемого количества р 120, количество добавляемого MBD1 указано над треугольниками., не- неспецифический сигнал (связан с использованием экстрактов клеток sf9, так как его интенсивность увеличивается с возрастанием концентрации экстракта), проба- не связавшаяся меченая ДНК- проба.

POZ..... |>. a Я

Р02 L

POZ

.WÍÍ

kpia ш

GST-Каизо I-A72 Б GST-MBDI

О.Бмкл 1 мил Змкл 4 мкл O.Smwi 1 мкл 2мкл 4мкп

ж^З ^3

ЫШМ

Для подтверждения этой гипотезы был проведен эксперимент по задержке ДНК-белковых комплексов в ПААГ. При увеличении концентрации рекомбинатного белка Каизо (или МБШ1 в качестве контроля) происходило возрастание интенсивности комплекса белок-ДНК, что говорит о специфичности данного взаимодействия. Однако, добавление увеличивающегося количества р 120 катенина практически полностью ингибирует связывание Каизо с ДНК и никак не влияет на взаимодействие белка МЕЮ1 с ДНК (рис.31).

Задачей следующего эксперимента стало подтверждение данных, полученных в ДНК-белковых сдвигах, на модели клеточной линии НеЬа. Для этого клетки НеЬа трансфецировали конструкцией, кодирующую химерный белок Каизо-УР16, превратив его из репрессора метилированных генов в активатора (УР16-содержит сильный активационный домен). Экспрессия Каизо-УР16 приводила к увеличению активности гена репортера, который находился под контролем метилированного промотора 5У40 (рис. 32а), Однако, добавление в трансфекцию вектора, кодирующего р 120, приводило к заметному снижению активационного потенциала белка Каизо-УР16(рис.32а). При этом М1Ж1-УР16 зависимая активация репортера оказалась нечувствительна к присутствию р!20 катенина (рис.326).

м Vpl&deJUPOZ 150 Hi * Vpl6dcltaPOZ 'р

■ VplbdellaPOÍ.p

■ Vpl6dcl(aPOZ tp

■ Vpl6delldP02 'i . VplfcdílWPOZ»!

Рисунок 32. pl20 катенин подавляет метил-ДНК-связывающую активность белка Каизо без BTB домена, а, б - Измерение активности люциферазы, а - р120 подавляет способность конструкции Каизо vp 16 без BTB домена активировать транскрипцию с метилированных матриц, б - р 120 не оказывает эффекта на способность конструкции MBD1- VPI6 активировать транскрипцию с метилированных матриц

Таким образом, взаимодействие белка Каизо с метилированной ДНК и с катенином р120 носят взаимоисключающий характер, что позволяет говорить о двух различных функциях белка Каизо в ядре и цитоплазме. В ядре Каизо связывается с метилированными участками ДНК и участвует в подавлении транскрипции. Роль Каизо в цитоплазме окончательно не определена. На данный момент времени можно предположить существование сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поверхности клетки в ядро.

3.2. Определение значимости взаимодействия Каизо с метилированной ДНК и с последательностями, содержащими неметилированный КСС.

3.2.1. Функция Каизо узнавания метилированной последовательности ДНК эволюционно консервативна.

Используя поиск по базе данных NCBI, были найдены гомологичные последовательности

Ollgo S*1 s Hmat Sm S Hmat

dKaleoZFs Ollgo: Sm S Hmat

A/kWH AAA\

гена Каизо у лягушки Xenopus Laevis (хКаизо), рыбы Danio rerio (ёКаизо), курицы ^Каизо). Сравнение последовательностей аминокислот этих белков показало, что BTB/POZ домен, первый и второй "цинковые пальцы" наиболее консервативны, в то время как третий «цинковый палец» ZF3 гораздо более вариабелен (рис.32а). Было показано, что все рекомбинантные белки (лягушки, рыбы, а также и курицы), содержащие три "цинковых пальца" (ZFl-3-His), способны специфично связываться с метилированной последовательностью ДНК Sm, но не с его неметилированным аналогом (рис.336). "Цинковые пальцы" Каизо курицы имеют одинаковое сродство к Hmat последовательности и метилированной последовательности Sm, в то время как хКаизо лягушки обладает значительно меньшим сродством к Hmat, в то время как связывание ФСаизо рыбы с Hmat не детектируется.

Рисунок 33. Метил-ДНК связывающая активность Каизо эволюционно консервативна. А- Сравнение аминокислотных последовательностей «цинковых пальцев» белков Каизо курицы, лягушки, мыши и рыбы. Б-эксперимент по задержке ДНК-белковых комплексов в геле с рекомбинантными белками His-ZFl-З хКаизо, ФСаизо, gKan30 и пробами ДНК: метилированной Sm, неметилированной S, и матрилизином Hmat в присутствии 2 мкг pdlC неспецифического конкурента ДНК. Стрелки указывают на специфический ДНК-белковый

комплекс. В- метил-чувствительный репрессионный анализ в mbd2-/- клетках показал, что все ортологи Каизо являеются метил-чувстительными

репрессорами.

Полноразмерные белки Каизо лягушки и рыбы, наработанные и почищенные из 293 клеток, имели те же ДНК-связывающие свойства, что и соответсвующие им рекомбинантные белки, содержащие только "цинковые пальцы". С помощью метил-чувстительного эксперимента на mbd2-/- клетках удалось подтвердить, что свойство Каизо быть метил-чувстительным а ь репрессором является эволюционно i^..т гт —■—_________ —Кам|П __—i i ___-i консервативным (рис.ЗЗв).

Рисунок 34. Взаимодействие

рекомбинантного Каизо с

последовательностью «матрилизин» и Sm пробой (метилированной и

неметилированной). А. Эксперименты с использованием рекомбинантных «цинковых Í пальцев» Kan30(KaH30-ZF). Б. Эксперименты с использованием полноразмерного

рекомбинантного белка (Каизо).Треугольники I - возрастающие количества белка. Стрелка -СВ^Г ( ^ iü I на ДНК-белковый комплекс.

L* II-II

Omock □ hKaiso В dKalso ■ XKai»o

JjL

*é

Sm M- Sm XI •

uaipicfH ши Sm V1

Необходимо также отметить, что для белка Каизо-гр, содержащего только три "цинковых пальца", было показано одинаковое

сродство как к олигонуклеотиду «матрилизин», содержащему КСС, так и к метилированному «8т» (рис.34а). Полноразмерный Каизо эффективно взаимодействовал только с метилированной «Бт» пробой, тогда как связывание с последовательностью «матрилизин» возможно было детектировать только при высоких концентрациях белка с помощью задрежки ДНК-белковых комплексов рекомбинатного Каизо (рис.346).

3.2.2. Белок (1Каизо, не связывающийся с КСС, может спасти эмбрионы лягушки от развития уродств при истощении белка хКаизо.

Уникальные свойства белка Жаизо по связыванию ДНК и специфичному подавлению транскрипции генов дают возможность проверить достаточность связывания Каизо с метилированной ДНК для восстановления фенотипа хКМО эмбрионов. Хотя выше было показано, что для проявления фенотипа достаточно инъецировать в эмбрион Юнг МО, однако было решено воспроизвести условия эксперимента, описанного в (Kim, Park et al. 2004), и было введено 40нг МО в эмбрионы лягушки на стадии двух клеток. При совместном введении в эмбрионы на стадии двух клеток РНК Жаизо и хКМО удается значительно увеличить число эмбрионов с нормальным протеканием гаструляции (стадия 12) от 10% до 45%. К 14 стадии (нейруляции) смертность снижена до 18% по сравнению с 80% для хКМО морфантов (рис. 35а,б хКМО+ сКаизо). Присутствие РНК сЖаизо позволяет почти половине (46%) эмбрионам успешно завершить стадию гаструляции/нейруляции, в то время как ни одному хКМО эмбриону это не удается сделать (рис.35).

Рисунок 35. Белок (1Каизо, также как и ЬКаизо, могут спасти эмбрионы лягушки с истощенным белком хКаизо. А- Фенотипы неинъецированных контрольных эмбрионов (и =150), эмбрионов, инъецированных контрольными МО (п = 53) и хКМО, коинъецированных с ¿Каизо РНК (п = 84) (KMO+dKaroo). Указаны стадии развития эмбрионов. FITC окрашивание демонстрирует контроль инъецирования флуоресцентно меченных МО, стрелками указана нейронная складка. Б- Диаграммы показывают процент нормальных эмбрионов и эмбрионов с дефектами развития в экспериментах по спасению хКМО эмбрионов коиньекцией РНК сГКаизо или РНК Каизо человека (ЫСаизо). Погибшие эмбрионы не учитывались. Указаны стадии развития.

К стадии головастика процент выживших Жаизо/хКМО эмбрионов невелик, однако стоит отметить, что наблюдается небольшой процент полноценно развитых

■ Cmuu Бпфнлз и Коротия Оа (Ст 30)

эмбрионов, несмотря на присутствие в них морфолино (рис. 35). Эти спасенные эмбрионы

внешне отличаются от остановившихся в развитии хКМО эмбрионов, доживших до поздних стадий развития. Важно отметить, что способность к восстановлению фенотипа хКМО эмбрионов РНК Жаизо не отличалась от РНК дикого типа ЬКаизо, который связывается и с метилированными последовательностями ДНК Sm и с неметилированной ДНК Hmat (рис.35). Этот эксперимент говорит о том, что способность к связыванию последовательности ДНК CTGCNA белком Каизо не важна для спасения хКМО эмбрионов, в то время как связывание метилированных последовательностей ДНК важно для компенсации проблем раннего развития.

З.З.З.Определенне участков связывания белка Каизо по мышиному геному. С одной стороны белок с1Каизо, не узнающий КСС, может компенсировать уродства, возникающие у лягушки при отсутствии хКаизо, с другой стороны сохраняется возможность, что в клетке Каизо сязывается с обоими видами последовательностей, и роль этого взаимодействия с КСС остается не раскрытой. Для того чтобы определить какая активность белка Каизо (связывание с метилированной ДНК или с последовательностями, содержащими КСС) преобладает в клетке была проведена хроматин иммунопреципитация с антителами к Каизо на фибробластах дикого типа и нокаутных по гену Каизо в качестве контроля. Пул ДНК, полученный в результате иммунопреципитации хроматина, использовали для получения библиотеки для секвенирования. Полученную геномную библиотеку декодировали на секвенаторе Genome Analyzer GA ("Illumina", США), длина одного чтения составляла 36 нуклеотидов. Чтения, полученные в результате секвенирования картировали на мышиный геном (mm9 версия). Число картированных чтений на мышиный геном составило приблизительно 39 млн.

Фибробласты дикого типа Нокаутные по гену Кашо фибробласты

Число картированных чтений па мышиный геном (млн) 38.99 3S

Число участков обогащенных чтениями 391 —

Средний размер пиков (кластеров), Ьр (медиана) 517 (443) —

% чтений, попавших в кластеры 1.7% —

Откартированные чтения использовались для поиска пиков, то есть районов, обогащенных чтениями. В качестве контроля были использованы данные, полученные для нокаутных по гену Каизо фибробластов. Был получен 391 участок для клеточной линии дикого типа (табица 4). Средний размер пиков - около 500 пн. Анализ нуклеотидного состава участков связывания Каизо не выявил обогащения по последовательности СТССЫА (рис.36). В тоже время в участках связывания белка Каизо наблюдалось значительное обогащение по СО и СйСв последовательностям. Таким образом, полногеномный анализ не выявил обогащения по последовательностям, содержащим КСС, и ещё раз подтвердил важность метил-ДНК связывающей активности Каизо.

% 100

5 75

6 " I SO

$: =</; Рисунок 36. Участки связывания Каизо обогащены СС, ( (.('(I

полногемное последовательностями, но не КСС. На диаграмме представлено количество распределение учас1и)в_ содрежащих СИ, СОСа, КСС последовательности (темные столбики) по сравнению с распределением данных последовательностей в геноме (светлые столбики).

3.3.4. Взаимодействуя с хКаизо, белок хТсВ не может И__активировать \Уп1-сигнальный путь через взаимодействие с

(¡Р3 бета-катенином.

С одной стороны выше было показано, что для Каизо в геноме предпочтительными участками связывания является метилированная ДНК, содержащая CG и CGCG последовательности а не CTGCNA-содержащие последовательности. С другой стороны была опубликована pa6oTa(Kim, Park et al. 2004), в которой показано, что одной из прямой регулируемых мишеней белка Каизо у лягушки является ген Siamois, промотор которого содержит КСС последовательность. Было решено более детально исследовать данный ген и его регуляцию посредством Каизо.

хКаизо

BTB/POZ

ZF1 ZF2ZF3

GST-

• BTB/POZ

GST GST

— ZF123 ZF12 GST-ZF23

; xTcf3drt jgPH!? .......

Г КАИЗО ZFs GST

inputs

.sifiili z al 1

FLTCF- 4 TCF4-LEF dC(Nsi)TCF4 tlN-Ndo-TCF4

Рисунок 37. Домен "цинковые пальцы" Каизо взаимодействует с HMG доменом Tcf белков. А. Схема конструкций с различными участками хКаизо, использованных в копреципитации; Б. копреципитация in vitro полученных xTcf3 или Тс П cl и с указанными рекомбинантными белками. В. Конструкции с Tcf4, которые были использованы для in vitro трансляции; р-кат - домен, взаимодействующий с р катенином; TLE - TLE/Groucho связывающий домен; CtBP-связывающий домен; HMG- ДНК связывающий домен Г. Копреципитация делеционных Tcf4 и "цинковыми пальцами" Каизо лягушки (хКаизо-GST-ZF). В качестве контроля был использован GST. Д. Задержка подвижности в геле комплексов in vitro транслированного xTcfë и олигонуклеотидов, содержащих сайт для связывания xTcfi (TCF bs-oligo). К комплексам добавляли химерные белки GST с различными делениями Каизо.

Для этого, используя метод хроматин-иммунопреципитации, было показано, что транзиторно экспрессированные белки dKaroo или хКаизо в клетках лягушки А6 не связываются с промотором гена Siamois. Однако одним из основных регуляторов транскрипции Siamois является TCF

6enoK(Houston, Kofron et al. 2002), и возможно Каизо вовлечен в регуляцию транскрипции данного

гена не за счет взаимодействия с ДНК, аза счет белок-белковых взаимодействий.

Белки семейства TCF содержат следующие структурные домены: HMG домен, отвечающий за связывание с ДНК (консенсусный сайт -А/ТА/ТСААА); N-концевой домен, взаимодействующий с р-катенином и С-концевой домен, необходимый для связывания с CtBPl(Roose, Molenaar et al. 1998). Используя рекомбинантные белки, удалось показать, что для взаимодействия хКаизо с полноразмерным хТсО и доминантно-негативным хТсО (xTcfidn), у которого отсутствует домен, связывающийся с р-катенином, достаточно трех "цинковых пальцев" хКаизо (рис.37а,б).

Способность Каизо связываться с xTcf3 - эволюционно консервативна, поскольку, "цинковые пальцы" Каизо у рыбы (dZFl-З), курицы (gZFl-З) также взаимодействует с xTcf3 (рис.376). Анализ различных делеций Tcf4 с помощью ко-преципитации позволил определить, что для взаимодействия необходим HMG домен Tcf4 (рис.37в,г). Далее, с помощью эксперимента по задержке в геле комплекса xTcf3 и ДНК в присутствии полноразмерного хКаизо, GST-xZFl-3 или GST-dZFl-З было показано, что трех цинковых пальцев Каизо достаточно с одной стороны для предотвращения образования комплекса xTcD/ДНК (рис.37г), с другой стороны данный домен Каизо не оказывает влияние нахТсй/р-катенин комплекс.

В клетке xTcf3 находится в основном в ядре, причем в 40% клеток имеет диффузное распределение по ядру, а в 60% клеток данный белок имеет точечную ядерную локализацию. хКаизо в мышиных фибробластах детектируется в ядре, причем распределен он диффузно. В присутствии же хКаизо или с1Каизо хТсО перераспределяется по всему ядру, без четко выраженных структур. Таким образом, Каизо может оказывать влияние на внутриядерную локализацию хТсВ.

Для подтверждения способности Каизо конкурировать с ДНК за связывание с Тс£3 была поставлена хроматин иммунопреципитация в клетках трансфецированных только хТсй или совместно с Каизо. Было показано, что в клетках А6 myc-xTcD связывается с Siamois промотором. Однако, в присутствии НА-хКаизо или Т7-(1Каизо myc-xTcD делокализуется с данного участка ДНК (рис.38а). Таким образом, можно говорить о том, что Каизо препятствует взаимодействию хТсО с ДНК. Стоит отметить, что при тех же самых условиях детектировать хКаизо или сЖаизо на промоторе Siamois не удалось.

Для определения влияния Каизо на транскрипционную активность Тс£3 была использована SuperTopflash репортерная система. В состав SuperTopflash Wnt репортерной плазмиды входит ген люциферазы, который находится под промотором, содержащим несколько сайтов для связывания TCF3/4. Люцифераза активируется введением в систему экзогенного р-катенина. При котрансфекции хКаизо или Жаизо активация люциферазы уменьшалась в 4-7 раз (рис.386). Если же люцифераза находилась под контролем промотора с мутантными сайтами для связывания с TCF3, то её активность не зависела от добавления как р-кагенина, так и от наличия Каизо

(рис.386). Отсюда можно сделать вывод, что взаимодействие Каизо с HMG доменом TCF3/4 блокирует способность TCF связываться с ДНК и препятствует р-катенин-зависимой активации транскрипции. С другой стороны для определения, каким образом ТсО может оказывать влияние на ДНК-связывающую активность Каизо, была использована следующая система: в клетки трансфецировали метилированную репортерную плазмиду, xKarooZFVP16 (эта конструкция содержала участок, кодирующий "цинковые пальцы" Каизо и активационный домен VP16) и xTcf3. Как оказалось, xTcf3 оказывает влияние на репортерную активность в данной модельной системе (рис.38в).

Рисунок 38. Каизо влияет на ДНК-связывающую активность xTcf3, что сказывается на его репресионных и активационных функциях. А- С

помощью хроматин

иммуно преципитации показано, что после трансфекции в А6 клеточную линию конструкции myc-xTcf3 xTcfi связывается с промотором Siamois. Введение в данную систему хКаизо или dKarao предотвращает связывание хТсО с данным промотором. Б-Увеличение уровня экспрессии хКаизо и dKaroo приводит к подавлении транскрипционной активности р-катенина в HeLa клетках. SuperTopFlash (SuperTop) был использован как репортёр Wnt, SuperFopFlash (SuperFop) содержит мутантные сайты для Tcf3 и является контролем. В- Уровень экспрессии с метилированного люциферазного репортёра увеличивается при котрансфекции с хКаизоУР 16.Связывание с метилированным промотором репортёра осуществляется благодаря цинковым пальцам Каизо, а активационные свойства- за счет активационного домена VP16. Увеличение количества xTcf3HMGVP16 (Tcf3VP16) снижает активационный потенциал хКаизоУР 16. И наоборот, активация репортерной люциферазы (с промотором Siamois) за счет xTcf3HMGVP16 подавляется в присутствии хКаизоУР 16.

Таким образом, Каизо и xTcfi могут оказывать взаимное влияние на связывание с ДНК. Аналогично, xKaœoZFVPlô подавляет активацию Siamois промотора, которая осуществляется благодаря xTcf3HMGVP16 (рис.38в).

Полученные результаты указывают на то, что хКаизо и xTcf3 взаимно предотвращают связывание с ДНК, что может оказывать влияние как на репрессионный путь, связанный с Каизо, так и с Tcf3 (рис. 39).Таким образом, Каизо участвует в регуляции транскрипции гена Siamois не за счет взаимодействия с КСС последовательностью в его промоторе, а за счет белок-белковых взаимодействий.

гсуо СЫр. Inpute

xTcf3-myc + + ■*- + + + - + *+ -xKaiso + - - - + * -

dKaiso - - + .- . + -- - + . ^

пгтзш СЕД

оа

Рисунок 39 Модель взаимного влияния Каизо и Тс(3 на ДНК-связывающую активность друг друга. А-

Схематическая

схема

г »

активации генов-мишеней Тс{3 в зависимости от присутствия или отсутствия Р-катенина. Для активации (З-катенин заменяет вгоисЬо/ОВР в комплексе с ТсБ. Б-Репрессионная модель Каизо для генов \¥пМ1ути, предложенная в работе(2). В, Г- Модель, предложенная в данной работе: хКаизо препятствует связыванию хТШ с ДНК за счет белок-

Л.кжмроынмс

рспрсам

&10КМ{*Ши1ИГ рпфспм

белкового взаимодействия.

Каизо при этом с ДНК не связывается. Д, Т7.-Тс В потенциально может препятствовать связыванию Каизо с его метилированными сайтами узнавания (отмечены закрашенными кружочками).

1. Каизо (гВТВЗЗ) и Каизо подобные белки (2ВТВ4 и гвтв38) составляют семейство метил ДНК-связывающих белков, которые используют три домена «цинковые пальцы» С2Н2 типа для узнавания симметрично метилированных ЦфГ динуклеотидов и ВТВ домен для модулирования транскрипции.

2. Мышь с генетическим нокаутом гена Каизо обладает устойчивостью у развитию рака кишечника, возникающего вследствие аномальной активации сигнального пути \уЩ.

3. Уменьшение уровня Каизо в раковых клетках приводит к реэкспрессии некоторых генов раковых супрессоров, которые исходно молчали и имели высокий уровень метилирования промоторов. Причем промоторные области остаются метилированными при увеличении транскрпционной активности генов в ответ на уменьшение уровня Каизо. Каизо- транскрипционный репрессор метилированных генов раковых супрессоров.

4. Транзиторное блокирование трансляции мРНК гена Каизо в оплодотворенных ооцитах шпорцевой лягушки приводит к гибели эмбрионов на стадии нейруляции. В эмбрионах с транзиторно уменьшенным уровнем экспрессии Каизо начало экспрессии генов зиготы происходит на две стадии раньше, чем в контрольных эмбрионах дикого типа. Каизо-неспецифический репрессор транскрипции генов зиготы у шпорцевой лягушки.

5. В геноме иммортализованных фибробластов мыши Каизо преимущественно связывает участки, содержащие СОСв поледовательности, а не СТОСЫА.

6. Каизо может взаимодействовать с ТСИЗ и модулировать его ДНК связывающую способность, что влечет за собой изменения в активности зависимых генов.

7. Взаимодействие с катенином р 120 происходит с доменом «цинковые пальцы» белка

ВЫВОДЫ

Каизо. Такое взаимодействие приводит не только к уменьшению ДНК связывающих свойств Каизо, но и к ослаблению действия сигнала ядерной локализации Каизо. Р120-может регулировать ДНК связывающие свойства Каизо и его внутриклеточную локализацию.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1) Прохорчук Е.Б., Тульчинский Е.М., Георгиев Г.П., Луканидин Е М. Анализ гомологичных последовательностей ДНК в первом интронегена mtsl мыши и человека: кВ-подобный сайт и микросателлитная ДНК//Генетика. 1996-Т. 32-С. 1317-1325.

2) Tulchinsky Е, Prokhortchouk Е, Georgiev G, Lukanidin Е. A kappaB-related binding site is an integral part of the mtsl gene composite enhancer element located in the first intron of the gene // The Journal of Biological Chemistry. 1997-V. 72- P. 4828-4835.

3) Prokhortchouk EB, Prokhortchouk AV, Rouzov AS, Kiselev SL, Lukanidin EM, Georgiev GP. A minisatellite "core" element constitutes a novel, chromatin-specific activator of mtsl gene transcription // Journal of Molecular Biology. 1998-V. 280- P. 227-236.

4) Смирнов A C., Рузов A.C., Гнучев H.B., Прохорчук Е.Б Механизмы поддержания высокого конститутивного уровня NF-kB в клетках аденокарцином мыши // Доклады академии наук (Биохимия, биофизика, молекулярная биология). 2000- Т. 373- С. 148-149.

5) Смирнов А.С., Буданов A.B., Рузов А.С., Иванов A.B., Прохорчук A.B., Гнучев Н.В., Прохорчук Е.Б. Высокий конститутивный уровень NF-kB необходим для жизнеспособности клеток аденокарциномы мыши - возможная роль р53 // Молекулярная биология. 2000- Т.34- С. 775-782.

6) Прохорчук А.В., Прохорчук Е.Б. Обнаружение и анализ нового мышиного ДНК-связывающего белка, специфичного к метилированию // Доклады академии наук (Биохимия, биофизика, молекулярная биология. 2000-Т. 370- С. 24-26.

7) Smimov AS, Ruzov AS, Budanov AV, Prokhortchouk AV, Ivanov AV, Prokhortchouk EB High constitutive level of NF-kappaB is crucial for viability of adenocarcinoma cells // Cell Death & Differentiation. 2001- V. 8- P. 621-630.

8) Прохорчук A.B., Айтхожина Д.С., Саблина A.A., Рузов А.С., Прохорчук Е.Б. Каизо- новый член семейства BTBVPOZ , белков специфично связывается с метилированной ДНК // Генетика. 2001- Т. 37- С.737-744.

9) Prokhortchouk A, Hendrich В, J0rgensen Н, Ruzov A, Wilm М, Georgiev G, Bird A, Prokhortchouk Е The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor // Genes & Development. 2001- V. 15- P. 1613-1618.

10) Prokhortchouk E, Hendrich В Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs? // Oncogene. 2002- V. 21- P. 5394-5399.

11) Ruzov A, Dunican DS, Prokhortchouk A, Pennings S, Stancheva I, Prokhortchouk E, Meehan RR Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development // Development. 2004- V. 131- P. 6185-6194.

12) Саложин C.B., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров // Биохимия. 2005- Т. 70- С.525-532.

13) Filion GJ, Zhenilo S, Salozhin S, Yamada D, Prokhortchouk E, Defossez PA . A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription // Mol Cell Biol. 2006- V. 26-P.169-181.

14) Delia Ragione F, Tiunova A, Vacca M, Strazzullo M, Gonzalez E, Armstrong J, Valero R, Campanile C, Pineda M, Hulten M, Monros E, D'Esposito M, Prokhortchouk E. The X-linked methyl binding protein gene Kaiso is highly expressed in brain but is not mutated in Rett syndrome patients // Gene. 2006-V.373-P. 83-89.

15) Prokhortchouk A, Sansom O, Selfridge J, Caballero IM, Salozhin S, Aithozhina D, Cerchietti L, Meng FG, Augenlicht LH, Mariadason JM, Hendrich B, Melnick A, Prokhortchouk E, Clarke A, Bird A. Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer // Mol Cell Biol. 2006- V. 26- P. 199-208.

16) Orlov SV, Kuteykin-Teplyakov KB, Ignatovich 1A, Dizhe EB, Mirgorodskaya OA, Grishin AV, Guzhova OB, Prokhortchouk EB, Guliy PV, Perevozchikov AP. Novel repressor of the human FMR1 gene - identification of p56 human (GCC)(n)-binding protein as a Kriippel-like transcription factor ZF5// FEBS J. 2007- V. 274- P. 4848-4862.

17) Prokhortchouk E, Defossez PA. The cell biology of DNA methylation in mammals // Biochim Biophys Acta. 2008. V- 1783- P. 2167-2173.

18) Lopes EC, Vails E, Figueroa ME, Mazur A, Meng FG, Chiosis G, Laird PW, Schreiber-Agus N, Greally JM, Prokhortchouk E, Melnick A. Kaiso contributes to DNA methylation-dependent silencing of tumor suppressor genes in colon cancer cell lines // Cancer Res. 2008- V. 68- P. 7258-7263.

19) Ruzov A, Hackett JA, Prokhortchouk A, Reddington JP, Madej MJ, Dunican DS, Prokhortchouk E, Pennings S, Meehan RR. The interaction of xKaiso with xTcB: a revised model for integration of epigenetic and Wnt signalling pathways // Development. 2009- V. 136- P. 723-727.

20) Ruzov A, Savitskaya E, Hackett JA, Reddington JP, Prokhortchouk A, Madej MJ, Chekanov N, Li M, Dunican DS, Prokhortchouk E, Pennings S, Meehan RR. The non-methylated DNA-binding function of Kaiso is not required in early Xenopus laevis development // Development. 2009- V. 136- P. 729-738.

21) Пехов B.M., Краснова Н.Ю., Мазур A.M., Селезнева О.В., Прохорчук Е.Б., Момыналиев К.Т. Метилирование CpG-динуклеотидов генома Helicobacter pylori при повышении концентрации метионина // Молекулярная биология. 2010- Т. 44- С. 170-173.

22) Жигалова Н.А., Женило C.B., Айтхожина Д.С., Прохорчук Е.Б. Две функции домена "цинковые пальцы" метил-ДНК-связывающего белка Каизо // Молекулярная биология. 2010- Т. 44-С. 263-74.

Подписано в печать: 18.11.2011

Заказ № 6310 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Прохорчук, Егор Борисович

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

4.1 Метилирование генома эукариот.

4.2 Геномный импринтинг. Х-инактивация.

4.3 Инактивация X хромосомы.

4.4 Динамика изменения метилирования во время эмбриогенеза.

4.5 ДНК-метилтрансферазы.

4.6 Метилирование ДНК при опухолеобразовании.

4.7 Гидроксиметилцитозин.

4.8 Метил-ДНК-связывающие белки.

4.9 Связь между метилированием ДНК и ПТМ гистонов.

4.10 Характеристика белков BTB/BOZ-семейства.

4.10.1 Особенности BTB/POZ домена.

4.10.2 Особенности домена «цинковые пальцы».

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Получение мыши нокаутной по гену Каизо.

5.2 Инактивация гена Каизо у лягушки Xenopus Laevis.

5.3 Инактивация гена Каизо у рыбы Danio rerio.

5.4 ChIP-seq анализ, как новый метод для полногеномного картирования сайтов связывания транскрипционных факторов с ДНК.

5.4.1 Особенности ChIP-seq анализа.

5.4.2 Приготовление геномных библиотек для секвенирования.

5.4.3 Обработка данных, полученных в результате декодирования на Genome Analyzer GA ("Illumina", США).

6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих BTB/POZ домен и домен "цинковые пальцы".

6.1.1 Обнаружение метил-ДНК зависимого связывания белковых комплексов с энхансерным элементом гена S100A4 в экспериментах in vitro.

6.1.1.1 Определение гиперчувствительных к обработке ДНКазоМ участков в первом и втором интронах гена S100A4 мыши.

6.1.1.2 Структурный и функциональный анализ консервативного района в первом интроне гена S100a4.

6.1.1.3 Функциональный анализ Sa последовательности энхансера гена S100A4 в контексте нуклеотидной последовательности ДНК.

6.1.1.4 Изучение ДНК-белковых взаимодействий с Sa последовательностью in vivo.

6.1.1.5 Определение в системе in vitro точных координат ДГУ2. Исследование белковых факторов, связывающихся с Sa последовательностью.

6.1.1.6 Обнаружение белкового фактора, связывающегося с метилированной последовательностью ДНК, расположенной с 3' конца ДГУ2.

6.1.2 Ген Каизо кодирует белок, который является метил-ДНК связывающей субъединицей комплекса МК1.

6.1.2.1 Клонирование нового специфичного к метилированию ДНК белка Каизо.

6.1.2.2 Изучение ДНК связывающих свойств рекомбинантного белка Каизо.

6.1.2.3 Белок Каизо является метил-зависимым ранскрипционным репрессором in vivo.

6.1.2.4 Белок Каизо взаимодействует с областью HI9 DMR in vitro.

6.1.2.5 Каизо дифференциально взаимодействует с разными участками HI9 DMR.

6.1.2.6 Определение профиля связывания Каизо в Н19/Igf2^0Kyce.

6.1.2.7 Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом HI9 DMR.

6.1.3 Семейство Каизо-гомологичных белков.

6.1.3.1 Два белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Каизо, узнают метилированную ДНК in vitro.

6.1.3.2 ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированную ДНК in vivo.

6.1.3.3 ZBTB и ZBTB38 являются метил-зависимыми репрессорами.

6.1.3.4 Картина экспрессии ZBTB4 и ZBTB38.

6.2 Удаление гена Каизо в различных организмах.

6.2.1 хКаизо необходим для нормального развития лягушки Xenopus Laevis.

6.2.1.1 Эмбрионы лягушки в отсутствии хКаизо подвергаются апоптозу

6.2.1.2 Потеря функциональной активности белка Каизо в эмбрионах лягушки приводит к преждевременной активации экспрессии генов на стадии бластулы

6.2.1.3 Белок Каизо лягушки хКаизо является общегеномным репрессором транскрипции генов в развивающемся эмбрионе.

6.2.2 с1Каизо необходимым для развития Danio Rerio.

6.2.3 Создание и анализ мыши с генетическим нокаутом по гену Каизо.

6.2.3.1 Получение мыши нокаутной по гену Каизо.

6.2.3.2 Изучение мыши, нокаутной по гену Каизо.

6.2.3.3 Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl.

6.2.3.4 Разница в экспрессии Tctexl не зависит от разницы в строении Т-комплекс-содержащего локуса.

6.2.3.5 Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования CpG-островка гена Tctexl.

6.2.3.6 Зависящее от метилирования взаимодействие Каизо с широким спектром последовательностей ДНК in vitro.

6.2.3.7 Каизо взаимодействует с регуляторными областями «молчащих» генов р!б, IAP и генов, расположенных на неактивной Х-хромосоме, но не гена матршизин.

6.2.3.8 Делеция Каизо приводит к изменению структуры хроматина в районе H19DMR.

6.2.3.9 Делеция Каизо не влияет на экспрессию генов Н19 и Igf2.

6.2.3.10 Экспрессия IAP-элемента, а также генов Xist и Wntll не зависит от взаимодействия Каизо с их регуляторными последовательностями.

6.2.3.11 Задержка развития рака кишечника в Аре М|п/+ мыши с удаленным геном Каизо.

6.2.3.12 Каизо является метил-чувствительным регулятором генов опухолевых супрессоров в раковых клетках кишечника.

6.3 Две функции домена "цинковые пальцы" белка Каизо.

6.3.1 Взаимодействие белка Каизо с р 120 катенином и метилированной ДНК носят взаимоисключающий характер.

6.3.1.1 Ядерная и цитоплазматическая локализаци белка Каизо в клетках млекопитающих.

6.3.1.2 Определение функционального домена белка Каизо, ответственного за взаимодействие с р120 катенином.

6.3.1.3 Функциональный домен «цинковые пальцы» белка Каизо необходим для взаимодействия с pi20 катенином in vivo.

6.3.1.4 pi20 катенин влияет на ДНК - связывающую активность белка Каизо

6.4 Определение значимости взаимодействия Каизо с метилированной ДНК и с последательностями, содержащими неметилированный КСС.

6.4.1 Функция Каизо узнавания метилированной последовательности ДНК эволюционно консервативна.

6.4.1.1 Белок Каизо является метил-чувствительным репрессором у лягушки Xenopus Laevis.

6.4.1.2 Белок Каизо является метил-чувствительным репрессором у рыбы Danio rerio.

6.4.2 Первых двух "цинковых пальцев" Каизо достаточно для связывания с метилированной последовательностью ДНК.

6.4.3 Белок (Жаизо может спасти эмбрионы лягушки от развития уродств при истощении белка хКаизо.

6.4.4 Ни (Жаизо, ни хКаизо не могут связываться с последовательностью ДНК CTGCNA из промоторных областей генов Siamois и xWntl 1.

6.4.5 In vivo Каизо связывается предпочтительно с метилированными CpG богатыми последовательностями ДНК, а не с последовательностями, содержащими CTGCNA.

6.4.6 Определение участков связывания белка Каизо по мышиному геному.

6.4.7 Взаимодействуя с хКаизо, белок xTcf3 не может активировать Wnt-сигнальный путь через взаимодействие с бета-катенином.

6.4.7.1 Каизо взаимодействует с HMG доменом TCF3 "цинковыми пальцами"

6.4.7.2 хКаизо влияет на ДНК-связывающую активность хТсО.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Прохорчук, Егор Борисович

8. ВЫВОДЫ

1) Каизо и Каизо-подобные белки (2ВТВ4 и гВТВ38) составляют семейство метил ДНК-связывающих белков, которые используют три домена «цинковые пальцы» С2Н2 типа для узнавания симметрично метилированных Срв динуклеотидов. Все белки семейства Каизо проявляют свойства характерные для транскрипционных репрессоров репортерных генов в модельных экспериментах на клеточных линиях.

2) Мышь с генетическим нокаутом гена Каизо обладает устойчивостью к развитию рака кишечника, возникающего вследствие аномальной активации сигнального пути \vrit.

3) Каизо является транскрипционным репрессором метилированных генов раковых супрессоров. Уменьшение уровня Каизо в раковых клетках приводит к экспрессии некоторых генов раковых супрессоров, которые исходно молчали и имели высокий уровень метилирования промоторов. Примечательно, что промоторные области остаются метилированными при увеличении транскрипционной активности генов в ответ на уменьшение уровня Каизо.

4) Транзиторное блокирование трансляции мРНК гена Каизо в оплодотворенных ооцитах как лягушки Хепорш.1аеу18, так и рыбы Башо гепо приводит к гибели эмбрионов на стадии нейруляции. В эмбрионах лягушки с транзиторно уменьшенным уровнем экспрессии Каизо начало экспрессии генов зиготы происходит на две стадии раньше, чем в контрольных эмбрионах дикого типа. Таким образом, Каизо - неспецифический репрессор транскрипции генов зиготы у шпорцевой лягушки.

5) В геноме иммортализованных фибробластов мыши Каизо преимущественно связывает участки, содержащие СвСО поледовательности, а не СТвСКА.

6) Каизо может взаимодействовать с ТСБЗ и модулировать его ДНК-связывающую способность, что влечет за собой изменения в активности \vrit зависимых генов.

7) Белок Каизо взаимодействует с катенином р120 с помощью домена "цинковые пальцы". Такое взаимодействие приводит не только к уменьшению ДНК-связывающих свойств Каизо, но и к ослаблению действия сигнала ядерной локализации Каизо. Катенин р120 может регулировать ДНК-связывающие свойства Каизо и его внутриклеточную локализацию.

9. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность за то, что многие ученые разделили интерес к этому проекту и предоставили на различных этапах ее выполнения саму возможность осуществить весь спектр работ- Георгиеву Г.П., Эдриану Бёрду (Adrian Bird), Ричарду Михану (Richard Meehan) и Скрябину К.Г. В получении изложенных результатов мне помогали мои аспиранты и сотрудники: Анна Прохорчук, Алексей Рузов, Дана Айтхожина, Сергей Саложин, Светлана Женило, Александр Мазур, Надежда Жигалова, Николай Чеканов, Василий Пехов. Особо хотел бы отметить неоценимую помощь в подготовке материалов работ, обсуждении хода изложения материала, которую мне оказали Светлана Женило и Анна Прохорчук.

Отдельная благодарность моим зарубежным коллегам, которые участвовали в проведении экспериментов на животных- Алану Кларку (Alan Clarke) и его сотрудникам, Ари Мельнику (Ari Melnick) и его сотрудникам, Алу Рейнольдсу (AI Reynolds) и его сотрудникам.

10. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Прохорчук Е.Б., Тульчинский Е.М., Георгиев Т.Н., Луканидин Е.М. Анализ гомологичных последовательностей ДНК в первом интронегена mtsl мыши и человека: кВ-подобный сайт и микросателлитная ДНК // Генетика. 1996-Т. 32-С. 1317-1325.

2) Tulchinsky Е, Prokhortchouk Е, Georgiev G, Lukanidin Е. А карраВ-related binding site is an integral part of the mtsl gene composite enhancer element located in the first intron of the gene // The Journal of Biological Chemistry. 1997-V. 72- P. 4828-4835.

4) Смирнов А.С., Рузов A.C., Гнучев H.B., Прохорчук Е.Б Механизмы поддержания высокого конститутивного уровня NF-кВ в клетках аденокарцином мыши // Доклады академии наук (Биохимия, биофизика, молекулярная биология). 2000- Т. 373- С. 148-149.

5) Смирнов А.С., Буданов А.В., Рузов А.С., Иванов А.В., Прохорчук А.В., Гнучев Н.В., Прохорчук Е.Б. Высокий конститутивный уровень NF-kB необходим для жизнеспособности клеток аденокарциномы мыши -возможная роль р53 // Молекулярная биология. 2000- Т.34- С. 775-782.

7) Smirnov AS, Ruzov AS, Budanov AV, Prokhortchouk AV, Ivanov AV, Prokhortchouk EB High constitutive level of NF-kappaB is crucial for viability of adenocarcinoma cells // Cell Death & Differentiation. 2001- V. 8- P. 621-630.

8) Прохорчук А.В., Айтхожина Д.С., Саблина А.А., Рузов А.С., Прохорчук Е.Б. Каизо- новый член семейства BTBYPOZ , белков специфично связывается с метилированной ДНК // Генетика. 2001- Т. 37- С.737-744.

9) Prokhortchouk A, Hendrich В, Jorgensen Н, Ruzov A, Wilm М, Georgiev G, Bird A, Prokhortchouk Е The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor // Genes & Development. 2001-V. 15-P. 1613-1618.

10) Prokhortchouk E, Hendrich В Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs? // Oncogene. 2002- V. 21- P. 53945399.

16) Orlov SV, Kuteykin-Teplyakov KB, Ignatovich IA, Dizhe EB, Mirgorodskaya OA, Grishin AV, Guzhova OB, Prokhortchouk EB, Guliy PV, Perevozchikov AP. Novel repressor of the human FMR1 gene - identification of p56 human (GCC)(n)-binding protein as a Kruppel-like transcription factor ZF5// FEBS J. 2007- V. 274- P. 4848-4862.

17) Prokhortchouk E, Defossez PA. The cell biology of DNA methylation in mammals // Biochim Biophys Acta. 2008. V- 1783- P. 2167-2173.

19) Ruzov A, Hackett JA, Prokhortchouk A, Reddington JP, Madej MJ, Dunican DS, Prokhortchouk E, Pennings S, Meehan RR. The interaction of xKaiso with xTcf3: a revised model for integration of epigenetic and Wnt signalling pathways // Development. 2009- V. 136- P. 723-727.

21) Пехов B.M., Краснова Н.Ю., Мазур A.M., Селезнева O.B., Прохорчук Е.Б., Момыналиев К.Т. Метилирование CpG-динуклеотидов генома Helicobacter pylori при повышении концентрации метионина // Молекулярная биология. 2010- Т. 44- С. 170-173.

22) Жигалова Н.А., Женило С.В., Айтхожина Д.С., Прохорчук Е.Б. Две функции домена "цинковые пальцы" метил-ДНК-связывающего белка Каизо // Молекулярная биология. 2010- Т. 44- С. 263-74.

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ результатов проведенных экспериментов позволяет сказать, что был открыт новый класс метил-ДНК связывающих белков, которые используют домен типа «цинковый палец» для связывания метилированной ДНК. Ограничивается ли этот класс только Kaiso, ZBTB4 и ZBTB38, определить весьма затруднительно, поскольку гомология последовательности аминокислот в контексте «цинкового пальца» С2Н2 типа с белками Каизо семейства теоретически не является обязательным условием для узнавания симметричных метил-CpG. Более того, можно предположить, что будут существовать белки, которые обладают похожей ДНК связывающей специфичностью, но имеют принципиально иной ДНК связывающий домен. И это предположение находит свои подтверждения в факте обнаружения новых метил ДНК-связывающих доменов: SRA [191,192] и bHLH у белка RBP-J [193]. Однако, подавляющее большинство опубликованных экспериментальных данных и классические учебники (к примеру, «Гены» под редакцией Льюина, издание 9) указывают на устоявшееся представление о двух семействах метил-ДНК-связывающих белков: MBD и Каизо.

Внимания заслуживает и тот факт, что альтернативная точка зрения целого ряда научных групп и в первую очередь группы доктора Джульетты Даниэл из Канады (J Daniel) о том, что функциональная активность Каизо в системах in vivo связана с узнаванием неметилированной последовательности CTGCNA, не нашла своего подтверждения в данной работе. В масштабах генома вероятность связывания Каизо с указанной последовательностью, определенная методами хроматин иммунопреципитации, находится в пределах статистической погрешности эксперимента, в то время как связывание с метилированными последовательностями намного превышает фоновые показатели. Конечно же, нельзя исключить, что в каких-то отдельных случаях эта активность

Каизо используется клеткой, однако, это утверждение будет носить только частный характер.

Несмотря на то, что наше понимание роли Каизо и родственных ему белков существенно продвинулось вперед с момента их открытия в 1999 году, все же остаются без ответа многие вопросы о функциональных процессах, которые зависят от Каизо. В частности, встает вопрос о взаимозаменяемости функций белков Каизо семейства. Возможно ли получение мышей с ярко выраженными фенотипическими аномалиями при создании двойных и тройных генетических нокаутов по генам семейства? В лаборатории Пьера Де Фоссеза, CNRS, Париж (Pierre DeFossez) получены и уже находятся в пути в Россию животные с генетическим нокаутом гена ZBTB4. Так что скоро станет возможным проверка и этой гипотезы о взаимозаменяемости, по крайней мере, двух белков: Каизо и ZBTB4.

Возможен ли альтернативный взгляд на Каизо не только как на участника машины по подавлению транскрипции, но и как на важного игрока в системе репарации ДНК. Последняя гипотеза является весьма привлекательной с той точки зрения, что метилированные ЦТ богатые области могут легко переходить в Z форму, которая сильнее подвержена мутагенному воздействию, чем классические А и В формы. Такое мутагенное воздействие может приводить к дезаминированию метилированных цитозинов и их переходу в тимины. Есть некоторые предварительные обнадеживающие результаты, подтверждающие эту гипотезу. Но предстоит пройти еще долгий путь до научно обоснованного утверждения о вовлеченности Каизо в иные процессы, нежели только репрессия транскрипции метилированных генов.

Все эти обстоятельства открывают перспективы для изучения белков Каизо семейства с новой точки зрения. Данные, которые были и будут получены, пополнят наши знания не только о фундаментальных процессах, лежащих в основе жизнедеятельности клетки, но и, быть может, откроют путь к лечению тех болезней, которые сопряжены с изменениями в геномных профилях метилирования ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Прохорчук, Егор Борисович, Москва

1. Martin Caballero I, Hansen J, Leaford D, Pollard S, Hendrich BD (2009) Themethyl-CpG binding proteins Mecp2, Mbd2 and Kaiso are dispensable for mouse embryogenesis, but play a redundant function in neural differentiation. PLoS One 4: e4315.

2. Hung MS, Karthikeyan N, Huang B, Koo HC, Kiger J, et al. (1999)

3. Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases. Proc Natl Acad Sei U S A 96: 11940-11945.

4. Tariq M, Paszkowski J (2004) DNA and histone methylation in plants. Trends1. Genet 20: 244-251.

5. Meissner A, Mikkelsen TS, Gu H, Wernig M, Hanna J, et al. (2008) Genomescale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature 454: 766-770.

6. Lister R, Pelizzola M, Dowen RH, Hawkins RD, Hon G, et al. (2009) Human

7. DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature 462: 315-322.

8. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum С, Zody MC, et al. (2001) Initialsequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860-921.

9. Deaton AM, Bird A (2011) CpG islands and the regulation of transcription.1. Genes Dev25: 1010-1022.

10. Bird AP (1986) CpG-rich islands and the function of DNA methylation.1. Nature 321: 209-213.

11. Antequera F, Bird A (1993) Number of CpG islands and genes in human andmouse. Proc Natl Acad Sei U S A 90: 11995-11999.

12. Jones PA, Takai D (2001) The role of DNA methylation in mammalianepigenetics. Science 293: 1068-1070.

13. Macleod D, Charlton J, Mullins J, Bird AP (1994) Spl sites in the mouseaprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes Dev 8: 2282-2292.

14. Lienert F, Wirbelauer C, Som I, Dean A, Mohn F, et al. (2011) Identificationof genetic elements that autonomously determine DNA methylation states. Nat Genet 43: 1091-1097.

15. Delaval K, Feil R (2004) Epigenetic regulation of mammalian genomicimprinting. Curr Opin Genet Dev 14: 188-195.

16. Okada Y, Yamagata K, Hong K, Wakayama T, Zhang Y (2010) A role for theelongator complex in zygotic paternal genome demethylation. Nature 463: 554-558.

17. Rand E, Ben-Porath I, Keshet I, Cedar H (2004) CTCF elements directallele-specific undermethylation at the imprinted H19 locus. Curr Biol 14: 1007-1012.

18. Schoenherr CJ, Levorse JM, Tilghman SM (2003) CTCF maintainsdifferential methylation at the Igf2/H19 locus. Nat Genet 33: 66-69.

19. Nicholls RD, Knepper JL (2001) Genome organization, function, andimprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 153-175.

20. Augui S, Nora EP, Heard E (2011) Regulation of X-chromosomeinactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet 12: 429-442.

21. Clerc P, Avner P (2003) Multiple elements within the Xic regulate random Xinactivation in mice. Semin Cell Dev Biol 14: 85-92.

22. Morey C, Navarro P, Debrand E, Avner P, Rougeulle C, et al. (2004) Theregion 3' to Xist mediates X chromosome counting and H3 Lys-4 dimethylation within the Xist gene. EMBO J 23: 594-604.

23. Sado T, Okano M, Li E, Sasaki H (2004) De novo DNA methylation isdispensable for the initiation and propagation of X chromosome inactivation. Development 131: 975-982.23. de Napoles M, Mermoud JE, Wakao R, Tang YA, Endoh M, et al. (2004)

24. Polycomb group proteins RinglA/B link ubiquitylation of histone H2Ato heritable gene silencing and X inactivation. Dev Cell 7: 663-676.

25. Silva J, Mak W, Zvetkova I, Appanah R, Nesterova TB, et al. (2003)

26. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enxl polycomb group complexes. Dev Cell 4: 481-495.

27. Plath K, Fang J, Mlynarczyk-Evans SK, Cao R, Worringer KA, et al. (2003)

28. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science 300: 131-135.

29. Bernardino J, Lombard M, Niveleau A, Dutrillaux B (2000) Commonmethylation characteristics of sex chromosomes in somatic and germ cells from mouse, lemur and human. Chromosome Res 8: 513-525.

30. Csankovszki G, Nagy A, Jaenisch R (2001) Synergism of Xist RNA, DNAmethylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol 153: 773-784.

31. Stancheva I, Meehan RR (2000) Transient depletion of xDnmtl leads topremature gene activation in Xenopus embryos. Genes Dev 14: 313-327.

32. Macleod D, Clark VH, Bird A (1999) Absence of genome-wide changes in

33. DNA methylation during development of the zebrafish. Nat Genet 23: 139-140.

34. Santos F, Dean W (2004) Epigenetic reprogramming during earlydevelopment in mammals. Reproduction 127: 643-651.

35. Adams RL (1990) DNA methylation. The effect of minor bases on DNAprotein interactions. Biochem J 265: 309-320.

36. Adams RL (1995) Eukaryotic DNA methyltransferases—structure andfunction. Bioessays 17: 139-145.

37. Bestor TH (1992) Activation of mammalian DNA methytransferase bycleavage of a Zn binding regulatory domain. EMBO J 11: 2611-2617.

38. Li E, Bestor TH, Jaenisch R (1992) Targeted mutation of the DNAmethyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915-926.

39. Lei H, Oh SP, Okano M, Juttermann R, Goss KA, et al. (1996) De novo

40. DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development 122: 3195-3205.

41. Fuks F, Hurd PJ, Déplus R, Kouzarides T (2003) The DNAmethyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res 31: 2305-2312.

42. Tatematsu KI, Yamazaki T, Ishikawa F (2000) MBD2-MBD3 complex bindsto hemi-methylated DNA and forms a complex containing DNMT1 at the replication foci in late S phase. Genes Cells 5: 677-688.

43. Sen GL, Reuter JA, Webster DE, Zhu L, Khavari PA (2010) DNMT1maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature 463: 563-567.

44. Gowher H, Jeltsch A (2001) Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a

45. DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG correction of non-CpA. sites. J Mol Biol 309: 1201-1208.

46. Xu GL, Bestor TH, Bourc'his D, Hsieh CL, Tommerup N, et al. (1999)

47. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene. Nature 402: 187-191.

48. Bourc'his D, Bestor TH (2004) Meiotic catastrophe and retrotransposonreactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature 431: 96-99.

49. Webster KE, O'Bryan MK, Fletcher S, Crewther PE, Aapola U, et al. (2005)

50. Meiotic and epigenetic defects in Dnmt3L-knockout mouse spermatogenesis. Proc Natl Acad Sei U S A 102: 4068-4073.

51. Gidekel S, Bergman Y (2002) A unique developmental pattern of Oct-3/4

52. DNA methylation is controlled by a cis-demodification element. J Biol Chem 277: 34521-34530.

53. Jaenisch R, Bird A (2003) Epigenetic regulation of gene expression: how thegenome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet 33 Suppl: 245-254.

54. Shima K, Nosho K, Baba Y, Cantor M, Meyerhardt JA, et al. (2011)

55. Prognostic significance of CDKN2A (pi6) promoter methylation and loss of expression in 902 colorectal cancers: Cohort study and literature review. Int J Cancer 128: 1080-1094.

56. Yang DH, Smith ER, Cohen C, Wu H, Patriotis C, et al. (2002) Molecularevents associated with dysplastic morphologic transformation and initiation of ovarian tumorigenicity. Cancer 94: 2380-2392.

57. Cameron EE, Bachman KE, Myohanen S, Herman JG, Baylin SB (1999)

58. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the reexpression of genes silenced in cancer. Nat Genet 21: 103-107.

59. Hendrich B, Guy J, Ramsahoye B, Wilson VA, Bird A (2001) Closely relatedproteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Dev 15: 710-723.

60. Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA (2004) Epigenetics in humandisease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457-463.

61. Beaujean N, Hartshorne G, Cavilla J, Taylor J, Gardner J, et al. (2004) Nonconservation of mammalian preimplantation methylation dynamics. Curr Biol 14: R266-267.

62. Santos F, Hendrich B, Reik W, Dean W (2002) Dynamic reprogramming of

63. DNA methylation in the early mouse embryo. Dev Biol 241: 172-182.

64. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, et al. (2009)

65. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethyicytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324: 930-935.

66. Penn NW, Suwalski R, O'Riley C, Bojanowski K, Yura R (1972) Thepresence of 5-hydroxymethylcytosine in animal deoxyribonucleic acid. Biochem J 126: 781-790.

67. Kriaucionis S, Heintz N (2009) The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324: 929-930.

68. Ko M, Huang Y, Jankowska AM, Pape UJ, Tahiliani M, et al. (2010)1.paired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature 468: 839-843.

69. Ito S, D'Alessio AC, Taranova OV, Hong K, Sowers LC, et al. (2010) Roleof Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature 466: 1129-1133.

70. Ficz G, Branco MR, Seisenberger S, Santos F, Krueger F, et al. (2011)

71. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature 473: 398-402.

72. Branco MR, Ficz G, Reik W (2011) Uncovering the role of 5hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nat Rev Genet.

73. Ito S, Shen L, Dai Q, Wu SC, Collins LB, et al. (2011) Tet proteins canconvert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science 333: 1300-1303.

74. He YF, Li BZ, Li Z, Liu P, Wang Y, et al. (2011) Tet-mediated formation of5.carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science 333: 1303-1307.

75. Szulwach KE, Li X, Li Y, Song CX, Han JW, et al. (2011) Integrating 5hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet 7: el002154.

76. Xu Y, Wu F, Tan L, Kong L, Xiong L, et al. (2011) Genome-wide regulationof 5hmC, 5mC, and gene expression by Tetl hydroxylase in mouse embryonic stem cells. Mol Cell 42: 451-464.

77. Wu H, D'Alessio AC, Ito S, Wang Z, Cui K, et al. (2011) Genome-wideanalysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Genes Dev 25: 679-684.

78. Williams K, Christensen J, Pedersen MT, Johansen JV, Cloos PA, et al.2011) TET1 and hydroxymethylcytosine in transcription and DNA methylation fidelity. Nature 473: 343-348.

79. Pastor WA, Pape UJ, Huang Y, Henderson HR, Lister R, et al. (2011)

80. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature 473: 394-397.

81. Wu H, D'Alessio AC, Ito S, Xia K, Wang Z, et al. (2011) Dual functions of

82. Tetl in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Nature 473: 389-393.

83. Valinluck V, Tsai HH, Rogstad DK, Burdzy A, Bird A, et al. (2004)

84. Oxidative damage to methyl-CpG sequences inhibits the binding of the methyl-CpG binding domain (MBD) of methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2). Nucleic Acids Res 32: 4100-4108.

85. Li Z, Cai X, Cai CL, Wang J, Zhang W, et al. (2011) Deletion of Tet2 inmice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood 118: 4509-4518.

86. Dawlaty MM, Ganz K, Powell BE, Hu YC, Markoulaki S, et al. (2011) Tetlis dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell 9: 166-175.

87. Fatemi M, Wade PA (2006) MBD family proteins: reading the epigeneticcode. J Cell Sci 119: 3033-3037.

88. Lewis JD, Meehan RR, Henzel WJ, Maurer-Fogy I, Jeppesen P, et al. (1992)

89. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. Cell 69: 905-914.

90. Meehan RR, Lewis JD, Bird AP (1992) Characterization of MeCP2, avertebrate DNA binding protein with affinity for methylated DNA.

91. Nucleic Acids Res 20: 5085-5092.

92. Nan X, Meehan RR, Bird A (1993) Dissection of the methyl-CpG bindingdomain from the chromosomal protein MeCP2. Nucleic Acids Res 21: 4886-4892.

93. Stancheva I, Collins AL, Van den Veyver IB, Zoghbi H, Meehan RR (2003)

94. A mutant form of MeCP2 protein associated with human Rett syndrome cannot be displaced from methylated DNA by notch in Xenopus embryos. Mol Cell 12: 425-435.

95. Guy J, Hendrich B, Holmes M, Martin JE, Bird A (2001) A mouse Mecp2null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat Genet 27: 322-326.

96. Chen WG, Chang Q, Lin Y, Meissner A, West AE, et al. (2003) Derepressionof BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2. Science 302: 885-889.

97. Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF, Kohwi-Shigematsu T (2005) Loss ofsilent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nat Genet 37: 31-40.

98. Chao HT, Chen H, Samaco RC, Xue M, Chahrour M, et al. (2010)

99. Dysfunction in GABA signalling mediates autism-like stereotypies and Rett syndrome phenotypes. Nature 468: 263-269.

100. Hendrich B, Bird A (1998) Identification and characterization of a family ofmammalian methyl-CpG binding proteins. Mol Cell Biol 18: 6538-6547.

101. Ng HH, Jeppesen P, Bird A (2000) Active repression of methylated genes bythe chromosomal protein MBD1. Mol Cell Biol 20: 1394-1406.

102. Fujita N, Watanabe S, Ichimura T, Ohkuma Y, Chiba T, et al. (2003) MCAFmediates MBD1-dependent transcriptional repression. Mol Cell Biol 23: 2834-2843.

103. Fujita N, Watanabe S, Ichimura T, Tsuruzoe S, Shinkai Y, et al. (2003)

104. Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interacts with the Suv39hl-HPlheterochromatic complex for DNA methylation-based transcriptional repression. J Biol Chem 278: 24132-24138.

105. Reese BE, Bachman KE, Baylin SB, Rountree MR (2003) The methyl-CpGbinding protein MBD1 interacts with the pi50 subunit of chromatin assembly factor 1. Mol Cell Biol 23: 3226-3236.

106. Zhang Y, Ng HH, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Bird A, et al. (1999)

107. Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation. Genes Dev 13: 19241935.

108. Ng HH, Zhang Y, Hendrich B, Johnson CA, Turner BM, et al. (1999) MBD2is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex. Nat Genet 23: 58-61.

109. Hendrich B, Tweedie S (2003) The methyl-CpG binding domain and theevolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet 19: 269-277.

110. Hendrich B, Hardeland U, Ng HH, Jiricny J, Bird A (1999) The thymineglycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG sites. Nature 401: 301-304.

111. Millar CB, Guy J, Sansom OJ, Selfridge J, MacDougall E, et al. (2002)

112. Enhanced CpG mutability and tumorigenesis in MBD4-deficient mice. Science 297: 403-405.

113. Kim MS, Kondo T, Takada I, Youn MY, Yamamoto Y, et al. (2009) DNAdemethylation in hormone-induced transcriptional derepression. Nature 461: 1007-1012.

114. Martin C, Zhang Y (2005) The diverse functions of histone lysinemethylation. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 838-849.

115. Zegerman P, Canas B, Pappin D, Kouzarides T (2002) Histone H3 lysine 4methylation disrupts binding of nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressor complex. J Biol Chem 277: 11621-11624.

116. Mutskov V, Felsenfeld G (2004) Silencing of transgene transcriptionprecedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. EMBO J 23: 138-149.

117. Fischle W, Tseng BS, Dormann HL, Ueberheide BM, Garcia BA, et al.2005) Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature 438: 1116-1122.

118. Freitag M, Hickey PC, Khlafallah TK, Read ND, Selker EU (2004) HP1 isessential for DNA methylation in neurospora. Mol Cell 13: 427-434.

119. Lindroth AM, Shultis D, Jasencakova Z, Fuchs J, Johnson L, et al. (2004)

120. Dual histone H3 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with CHROMOMETHYLASE3. EMBO J 23: 4286-4296.

121. Fuks F, Hurd PJ, Wolf D, Nan X, Bird AP, et al. (2003) The methyl-CpGbinding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J Biol Chem 278: 4035-4040.

122. Kelly KF, Daniel JM (2006) POZ for effect--POZ-ZF transcription factors incancer and development. Trends Cell Biol 16: 578-587.

123. Ahmad KF, Engel CK, Prive GG (1998) Crystal structure of the BTBdomain from PLZF. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 12123-12128.

124. Ramos S, Khademi F, Somesh BP, Rivero F (2002) Genomic organizationand expression profile of the small GTPases of the RhoBTB family in human and mouse. Gene 298: 147-157.

125. Cho YG, Choi BJ, Kim CJ, Song JH, Zhang C, et al. (2008) Genetic analysis of the DBC2 gene in gastric cancer. Acta Oncol 47: 366-371.

126. Read D, Butte MJ, Dernburg AF, Frasch M, Kornberg TB (2000) Functional studies of the BTB domain in the Drosophila GAGA and Mod(mdg4) proteins. Nucleic Acids Res 28: 3864-3870.

127. Carter MG, Johns MA, Zeng X, Zhou L, Zink MC, et al. (2000) Micedeficient in the candidate tumor suppressor gene Hicl exhibit developmental defects of structures affected in the Miller-Dieker syndrome. Hum Mol Genet 9: 413-419.

128. Klug A, Schwabe JW (1995) Protein motifs 5. Zinc fingers. FASEB J 9:597.604.

129. Choo Y, Isalan M (2000) Advances in zinc finger engineering. Curr Opin1. Struct Biol 10: 411-416.

130. Laity JH, Dyson HJ, Wright PE (2000) DNA-induced alpha-helix cappingin conserved linker sequences is a determinant of binding affinity in Cys(2)-His(2) zinc fingers. J Mol Biol 295: 719-727.

131. Elrod-Erickson M, Benson TE, Pabo CO (1998) High-resolution structuresof variant Zif268-DNA complexes: implications for understanding zinc finger-DNA recognition. Structure 6: 451-464.

132. Wood AJ, Lo TW, Zeitler B, Pickle CS, Ralston EJ, et al. (2011) Targetedgenome editing across species using ZFNs and TALENs. Science 333: 307.

133. Soldner F, Laganiere J, Cheng AW, Hockemeyer D, Gao Q, et al. (2011)

134. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell 146: 318-331.

135. Choo Y (1998) Recognition of DNA methylation by zinc fingers. Nat Struct1. Biol 5: 264-265.

136. Sekimata M, Takahashi A, Murakami-Sekimata A, Homma Y (2001) Involvement of a novel zinc finger protein, MIZF, in transcriptional repression by interacting with a methyl-CpG-binding protein, MBD2. J Biol Chem 276: 42632-42638.

137. Sun L, Liu A, Georgopoulos K (1996) Zinc finger-mediated protein interactions modulate Ikaros activity, a molecular control of lymphocyte development. EMBO J 15: 5358-5369.

138. Georgopoulos K, Winandy S, Avitahl N (1997) The role of the Ikaros genein lymphocyte development and homeostasis. Annu Rev Immunol 15: 155-176.

139. Merika M, Orkin SH (1995) Functional synergy and physical interactionsof the erythroid transcription factor GATA-1 with the Kruppel family proteins Spl and EKLF. Mol Cell Biol 15: 2437-2447.

140. Prokhortchouk A, Hendrich B, Jorgensen H, Ruzov A, Wilm M, et al.2001) The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes Dev 15: 1613-1618.

141. J. Sambrook EFF, T. Maniatis (2000) Molecular cloning A laboratorymanual on the web: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

142. Pierce TS (2011) Protein methods library. Rockford, USA: Thermo Fisher

143. Scientific Inc. pp. Your guide to protein methods and proteomics research techniques.

144. Hensey C, Gautier J (1998) Programmed cell death during Xenopus development: a spatio-temporal analysis. Dev Biol 203: 36-48.

145. Cordenonsi M, Dupont S, Maretto S, Insinga A, Imbriano C, et al. (2003)1.nks between tumor suppressors: p53 is required for TGF-beta gene responses by cooperating with Smads. Cell 113: 301-314.

146. Detrich HW, 3rd, Westerfield M, Zon LI (1999) Overview of the Zebrafishsystem. Methods Cell Biol 59: 3-10.

147. Nasevicius A, Ekker SC (2000) Effective targeted gene 'knockdown' inzebrafish. Nat Genet 26: 216-220.

148. Park PJ (2009) ChlP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet 10: 669-680.

149. Johnson DS, Mortazavi A, Myers RM, Wold B (2007) Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science 316: 1497-1502.

150. Pepke S, Wold B, Mortazavi A (2009) Computation for ChlP-seq and

151. RNA-seq studies. Nat Methods 6: S22-32.

152. Valouev A, Johnson DS, Sundquist A, Medina C, Anton E, et al. (2008)

153. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChlP-Seq data. Nat Methods 5: 829-834.

154. Grigorian MS, Tulchinsky EM, Zain S, Ebralidze AK, Kramerov DA, et al.1993) The mtsl gene and control of tumor metastasis. Gene 135: 229238.

155. Lakshmi MS, Parker C, Sherbet GV (1993) Metastasis associated MTS1and NM23 genes affect tubulin polymerisation in B16 melanomas: a possible mechanism of their regulation of metastatic behaviour of tumours. Anticancer Res 13: 299-303.

156. Tulchinsky E, Prokhortchouk E, Georgiev G, Lukanidin E (1997) A kappaB-related binding site is an integral part of the mtsl gene composite enhancer element located in the first intron of the gene. J Biol Chem 272: 4828-4835.

157. Collick A, Dunn MG, Jeffreys AJ (1991) Minisatellite binding protein Msbp-1 is a sequence-specific single-stranded DNA-binding protein. Nucleic Acids Res 19: 6399-6404.

158. Sonnenberg A, Daams H, Calafat J, Hilgers J (1986) In vitro differentiationand progression of mouse mammary tumor cells. Cancer Res 46: 59135922.

159. Daniel JM, Reynolds AB (1999) The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol Cell Biol 19: 3614-3623.

160. Menissier-de Murcia J, Molinete M, Gradwohl G, Simonin F, de Murcia G1989) Zinc-binding domain of poly(ADP-ribose)polymerase participates in the recognition of single strand breaks on DNA. J Mol Biol 210: 229233.

161. Free A, Wakefield RI, Smith BO, Dryden DT, Barlow PN, et al. (2001)

162. DNA recognition by the methyl-CpG binding domain of MeCP2. J Biol1. Chem 276: 3353-3360.

163. Murrell A, Heeson S, Bowden L, Constancia M, Dean W, et al. (2001) Anintragenic methylated region in the imprinted Igf2 gene augments transcription. EMBO Rep 2: 1101 -1106.

164. Murrell A, Heeson S, Reik W (2004) Interaction between differentiallymethylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and HI9 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet 36: 889-893.

165. Kiefer H, Chatail-Hermitte F, Ravassard P, Bayard E, Brunei I, et al. (2005)

166. ZENON, a novel POZ Kruppel-like DNA binding protein associated with differentiation and/or survival of late postmitotic neurons. Mol Cell Biol 25: 1713-1729.

167. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, et al. (2000)

168. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 5237-5242.

169. Lehnertz B, Ueda Y, Derijck AA, Braunschweig U, Perez-Burgos L, et al.2003) Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin. Curr Biol 13: 1192-1200.

170. Jorgensen HF, Ben-Porath I, Bird AP (2004) Mbdl is recruited to bothmethylated and nonmethylated CpGs via distinct DNA binding domains. Mol Cell Biol 24: 3387-3395.

171. Jackson-Grusby L, Beard C, Possemato R, Tudor M, Fambrough D, et al.2001) Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nat Genet 27: 31-39.

172. Sasai N, Matsuda E, Sarashina E, Ishida Y, Kawaichi M (2005) Identification of a novel BTB-zinc finger transcriptional repressor, CIBZ, that interacts with CtBP corepressor. Genes Cells 10: 871-885.

173. Stancheva I, El-Maarri O, Walter J, Niveleau A, Meehan RR (2002) DNAmethylation at promoter regions regulates the timing of gene activation in Xenopus laevis embryos. Dev Biol 243: 155-165.

174. Altmann CR, Bell E, Sczyrba A, Pun J, Bekiranov S, et al. (2001) Microarray-based analysis of early development in Xenopus laevis. Dev Biol 236: 64-75.

175. Yoon HG, Chan DW, Reynolds AB, Qin J, Wong J (2003) N-CoR mediates

176. DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Mol Cell 12: 723-734.

177. Zhao X, Ueba T, Christie BR, Barkho B, McConnell MJ, et al. (2003) Micelacking methyl-CpG binding protein 1 have deficits in adult neurogenesis and hippocampal function. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 6777-6782.

178. Ying QL, Stavridis M, Griffiths D, Li M, Smith A (2003) Conversion ofembryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol 21: 183-186.

179. Tai AW, Chuang JZ, Sung CH (1998) Localization of Tctex-1, a cytoplasmic dynein light chain, to the Golgi apparatus and evidence for dynein complex heterogeneity. J Biol Chem 273: 19639-19649.

180. Drewell RA, Goddard CJ, Thomas JO, Surani MA (2002) Methylationdependent silencing at the H19 imprinting control region by MeCP2. Nucleic Acids Res 30: 1139-1144.

181. Kim SW, Park JI, Spring CM, Sater AK, Ji H, et al. (2004) Non-canonical

182. Wnt signals are modulated by the Kaiso transcriptional repressor and pl20-catenin. Nat Cell Biol 6: 1212-1220.

183. Kondo Y, Issa JP (2004) Epigenetic changes in colorectal cancer. Cancer1. Metastasis Rev 23: 29-39.

184. Kelly KF, Spring CM, Otchere AA, Daniel JM (2004) NLS-dependentnuclear localization of pl20ctn is necessary to relieve Kaiso-mediated transcriptional repression. J Cell Sci 117: 2675-2686.

185. Thoreson MA, Reynolds AB (2002) Altered expression of the catenin pl20in human cancer: implications for tumor progression. Differentiation 70: 583-589.

186. Gregorieff A, Clevers H (2005) Wnt signaling in the intestinal epithelium:from endoderm to cancer. Genes Dev 19: 877-890.

187. Kelly KF, Otchere AA, Graham M, Daniel JM (2004) Nuclear import of the

188. BTB/POZ transcriptional regulator Kaiso. J Cell Sei 117: 6143-6152.

189. Park JI, Kim SW, Lyons JP, Ji H, Nguyen TT, et al. (2005) Kaiso/pl20catenin and TCF/beta-catenin complexes coordinately regulate canonical Wnt gene targets. Dev Cell 8: 843-854.

190. Spring CM, Kelly KF, O'Kelly I, Graham M, Crawford HC, et al. (2005)

191. The catenin pl20ctn inhibits Kaiso-mediated transcriptional repression of the beta-catenin/TCF target gene matrilysin. Exp Cell Res 305: 253-265.

192. Su LK, Kinzler KW, Vogelstein B, Preisinger AC, Moser AR, et al. (1992)

193. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science 256: 668-670.

194. Laird PW, Jackson-Grusby L, Fazeli A, Dickinson SL, Jung WE, et al.1995) Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation. Cell 81: 197-205.

195. Eads CA, Nickel AE, Laird PW (2002) Complete genetic suppression ofpolyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt 1 -hypomorphic Mice. Cancer Res 62: 1296-1299.

196. Sansom OJ, Berger J, Bishop SM, Hendrich B, Bird A, et al. (2003) Deficiency of Mbd2 suppresses intestinal tumorigenesis. Nat Genet 34: 145-147.

197. Hsieh CJ, Klump B, Holzmann K, Borchard F, Gregor M, et al. (1998)

198. Hypermethylation of the pl6INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis. Cancer Res 58: 3942-3945.

199. Issa JP, Ahuja N, Toyota M, Bronner MP, Brentnall TA (2001) Acceleratedage-related CpG island methylation in ulcerative colitis. Cancer Res 61: 3573-3577.

200. Sato F, Shibata D, Harpaz N, Xu Y, Yin J, et al. (2002) Aberrant methylation of the HPP1 gene in ulcerative colitis-associated colorectal carcinoma. Cancer Res 62: 6820-6822.

201. Velcich A, Yang W, Heyer J, Fragale A, Nicholas C, et al. (2002) Colorectalcancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2. Science 295: 1726-1729.

202. Soubry A, van Hengel J, Parthoens E, Colpaert C, Van Marck E, et al.2005) Expression and nuclear location of the transcriptional repressor Kaiso is regulated by the tumor microenvironment. Cancer Res 65: 22242233.

203. Antequera F, Boyes J, Bird A (1990) High levels of de novo methylationand altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell 62: 503514.

204. Jones PA, Baylin SB (2002) The fundamental role of epigenetic events incancer. Nat Rev Genet 3: 415-428.

205. Luongo C, Moser AR, Gledhill S, Dove WF (1994) Loss of Apc+ inintestinal adenomas from Min mice. Cancer Res 54: 5947-5952.

206. Esteller M (2002) CpG island hypermethylation and tumor suppressorgenes: a booming present, a brighter future. Oncogene 21: 5427-5440.

207. Sherr CJ, Roberts JM (1995) Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependentkinases. Genes Dev 9: 1149-1163.

208. Chen WY, Wang DH, Yen RC, Luo J, Gu W, et al. (2005) Tumor suppressor

209. HIC1 directly regulates SIRT1 to modulate p53-dependent DNA-damage responses. Cell 123: 437-448.

210. Chen WY, Zeng X, Carter MG, Morrell CN, Chiu Yen RW, et al. (2003)

211. Heterozygous disruption of Hie 1 predisposes mice to a gender-dependent spectrum of malignant tumors. Nat Genet 33: 197-202.

212. Myohanen SK, Baylin SB, Herman JG (1998) Hypermethylation can selectively silence individual pl6ink4A alleles in neoplasia. Cancer Res 58: 591-593.

213. Bakker J, Lin X, Nelson WG (2002) Methyl-CpG binding domain protein 2represses transcription from hypermethylated pi-class glutathione S-transferase gene promoters in hepatocellular carcinoma cells. J Biol Chem 277:22573-22580.

214. Lopez-Serra L, Ballestar E, Ropero S, Setien F, Billard LM, et al. (2008)

215. Unmasking of epigenetically silenced candidate tumor suppressor genes by removal of methyl-CpG-binding domain proteins. Oncogene 27: 35563566.

216. Pruitt K, Zinn RL, Ohm JE, McGarvey KM, Kang SH, et al. (2006) Inhibition of SIRT1 reactivates silenced cancer genes without loss of promoter DNA hypermethylation. PLoS Genet 2: e40.

217. Daniel JM, Spring CM, Crawford HC, Reynolds AB, Baig A (2002) Thepl20(ctn)-binding partner Kaiso is a bi-modal DNA-binding protein that recognizes both a sequence-specific consensus and methylated CpG dinucleotides. Nucleic Acids Res 30: 2911-2919.

218. Anastasiadis PZ, Moon SY, Thoreson MA, Mariner DJ, Crawford HC, et al.2000) Inhibition of RhoA by pi20 catenin. Nat Cell Biol 2: 637-644.

219. Anastasiadis PZ, Reynolds AB (2000) The pi20 catenin family: complexroles in adhesion, signaling and cancer. J Cell Sci 113 ( Pt 8): 1319-1334.

220. Behrens J (1999) Cadherins and catenins: role in signal transduction andtumor progression. Cancer Metastasis Rev 18: 15-30.

221. Ireton RC, Davis MA, van Hengel J, Mariner DJ, Barnes K, et al. (2002) Anovel role for pl20 catenin in E-cadherin function. J Cell Biol 159: 465476.

222. Davis MA, Ireton RC, Reynolds AB (2003) A core function for pl20catenin in cadherin turnover. J Cell Biol 163: 525-534.

223. Davis MA, Reynolds AB (2006) Blocked acinar development, E-cadherinreduction, and intraepithelial neoplasia upon ablation of pl20-catenin in the mouse salivary gland. Dev Cell 10: 21-31.

224. Reynolds AB, Daniel JM, Mo YY, Wu J, Zhang Z (1996) The novel cateninpl20cas binds classical cadherins and induces an unusual morphological phenotype in NIH3T3 fibroblasts. Exp Cell Res 225: 328-337.

225. Anastasiadis PZ, Reynolds AB (2001) Regulation of Rho GTPases bypl20-catenin. Curr Opin Cell Biol 13: 604-610.

226. Klug A (1999) Zinc finger peptides for the regulation of gene expression. J1. MolBiol 293:215-218.

227. Laity JH, Lee BM, Wright PE (2001) Zinc finger proteins: new insightsinto structural and functional diversity. Curr Opin Struct Biol 11: 39-46.

228. Pavletich NP, Pabo CO (1991) Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A. Science 252: 809-817.

229. Kane DA, Kimmel CB (1993) The zebrafish midblastula transition. Development 119: 447-456.

230. Bostick M, Kim JK, Esteve PO, Clark A, Pradhan S, et al. (2007) UHRF1plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells. Science 317: 1760-1764.

231. Frauer C, Hoffmann T, Bultmann S, Casa V, Cardoso MC, et al. (2011)

232. Recognition of 5-hydroxymethylcytosine by the Uhrfl SRA domain. PLoS One 6: e21306.

233. Bartels SJ, Spruijt CG, Brinkman AB, Jansen PW, Vermeulen M, et al.2011) A SILAC-based screen for Methyl-CpG binding proteins identifies RBP-J as a DNA methylation and sequence-specific binding protein.1. PLoS One 6: e25884.

Информация о работе

Прохорчук, Егор Борисович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы