Функциональная значимость сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо

Жигалова, Надежда Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональная значимость сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная значимость сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо"

УИ4610769

На правах рукописи

ЖИГАЛОВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА

Функциональная значимость сумоилирования метнл-ДНК-связывающего белка Каизо

(03.01.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 0КТ-

МОСКВА-2010

004610760

Работа выполнена в лаборатории геномики и зпигеномики позвоиочиых Учреждения Российской академии наук Центр «Бноишкснерия» РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук

Прохорчук Егор Борисович

кандидат физико-математических наук Женило Светлана Валерьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Коробко Игорь Викторович

кандидат биологических наук Саложин Сергей Владимирович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. ВА. Энгелъгардга РАН

Защита диссертации состоится «/й» октября 2010 г. в_часов на заседании Совета Д

501.001,76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « • сентября 20 Юг.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И. А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение механизмов регуляции генной активности является ключевой задачей в понимании того, как работает геном. Обратимые изменения активности генов называют «эпигенитическими». По современным представлениям эпигенетика- наука о надгенетических процессах функциональной геномики- в первую очередь рассматривает три класса явлений- метилирование ДНК, гистоновый код и регуляцию генома на уровне интерферирующих РНК. Все три механизма реализации генетической информации вовлечены, в частности у позвоночных организмов, в такие клеточные процессы, как ранний эмбриогенез и гаметогснез, дифференцировка, инактивация X-хромосомы, геномный импринтинг, онкологическая трансформация клеток. Например, нарушение метилирования ДНК может приводить к несвоевременной активации протоонкогенов, а аномально высокий уровень метилирования генов-супрессоров, подавляющих злокачественный рост, будет способствовать продвижению клеток по пути к трансформированному состоянию вплоть до метастазирования. Изучение метилирования ДНК является важным для понимания механизмов возникновения и развития различных заболеваний, а также может служить значимым маркером для ранней диагностики рака.

внутри обоих семейств функциональная значимость каждого белка в организме эукариот уникальна. При изучении свойств и MBD и Каизо подобных белков методами генетического нокаута было показано, что отсутствие одного белка или даже нескольких (Каизо, МеСР2; MBD2 и MBD1) белков не приводит к остановке эмбрионального развития у млекопитающих. На этом фоне контрастом выглядит эмбриональная летальность у мышей с отсутствующим геном поддерживающей метил трансферазы Dnmtl. Таким образом, пока не установлена прямая связь между непреложной важностью самой модификации метилирования ДНК и ее белковыми спутниками, которые долгое время считались ключевыми в интерпретации метилирования и перевода этого сигнала от молекулы ДНК к непосредственно функционированию генома. В то время, как генетический нокаут Каизо у мышей не приводит к ярко выраженному фенотипу (только в случае Каизо7" мышей в модели APC/Min была обнаружена их устойчивость к возникновению рака кишечника), у земноводных (на модели Xenopus laevis) Каизо необходим для нормального развития, и уменьшение его количества приводит к гибели эмбрионов. Тем не менее, обнаруженная роль Каизо в раке кишечника в модели APC/Min открывает новую принципиальную возможность его использования в качестве мишени в терапии онкологических заболеваний. Для достижения этой цели необходимо более глубокое понимание функциональной значимости Каизо в клетках млекопитающих.

Известно, что большое разнообразие функционально активных белков и транскрипционных факторов достигается в клетках эукариот и благодаря постгрансляционным модификациям (ПТМ). Каизо является репрессором транскрипции и, вероятно, как и все транскрипционные факторы, может подвергаться ПТМ, которые потенциально могут оказывать существенное влияние на его свойства и функции. В данной работе охарактеризовано сумоилирование Каизо. Сумоилирование представляет собой процесс ковалентного присоединения белка SUMO к лизину белков-субстратов за счет серии ферментативных реакций. Сумоилирование является малоизученной, но важной ПТМ у эукариот, поскольку может оказывать влияние на клеточную локализацию белков, ядерный транспорт, на спектр взаимодействующих белков и ко-факторов, на их связывание с ДНК, на контроль функций хроматина, и в частности на транскрипцию, репликацию, репарацию и организацию гетерохроматина. Таким образом, определение функциональной значимости сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо позволит полнее раскрыть его роль в регуляции экспрессии генов мишеней.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение роли сумошшрования метнл-ДНК-связывающего белка Каизо в связывании с ДНК, подавлении транскрипции и взаимодействии с белками ко-репрессорами. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Определить, какие аминокислоты белка Каизо подвергаются сумоилированию.

2. Оценить влияние сумоилирования на клеточную локализацию Каизо и на его взаимодействие с белками ко-репресссорами.

3. Охарактеризовать влияние сумоилирования на репрессионные свойства белка Каизо.

4. Определить влияние сумоилирования на спектр участков связывания Каизо в полногеномном масштабе.

Научная новизна и практическая значимость

В представленной работе впервые в мире получены данные о функциональной важности сумоилирования Каизо. В работе продемонстрированы различные аспекты изменения свойств сумоилированного Каизо такие, как внутриклеточная локализация, транскрипционная активность, белок-белковые взаимодействия. Особенностью работы также является использование новейших методических подходов к изучению ДНК-связывающих свойств белка in vivo с привлечением геномного секвенирования на технологических платформах Next Generation Sequencing. Результаты работы могут быть использованы при создании метил ДНК связывающих смол на основе доменов «цинковые пальцы» Каизо. Эти смолы, наравне со смолами на основе MBD, находят свое применение в оценке уровня метилирования геномных районов, что является важной задачей в характеристике этиологии различных заболеваний, включая раковые и сердечно-сосудистые. Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях: 13-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых (Москва, 2009), конференция «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его

непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе I статья в журнале, входящем в перечень ВАК.

Обьем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на/^ч^странице машинописного текста и включают рисунков и С? таблиц. Диссертация состоит из разделов:

"Используемый список сокращений", "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит отечественных и /^(Риностранных источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ П ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Каизо подвергается посттрансляционноп модификации сумоилированню SUMOI.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок Каизо может обладать аномальной подвижностью в ПААГ в том случае, когда ядерные экстракты выделяли в присутствии ингибиторов протеаз NEM - N-этил малеимида («Sigma», США). Одним из возможных вариантов объяснения данного факта является наличие ПТМ, которая ведет к значительным изменениям в подвижности белка и стабилизируется ингибитором протеаз NEM. По литературным данным NEM используют в стабилизации убиквитин-подобных ПТМ, а именно, сумоилирования и убиквитинирования (Rosas-Acosta G. et al., Mol. & Cell. Proteomics, 2005).

Выло решено проверить, может ли белок Каизо действительно подвергаться убиквинтин-подобной ПТМ. Для этого были выделены ядерные экстракты из клеточной линии НЕК293 с добавлением или без добавления ингибитора протеаз -NEM. С помощью иммуноблоттанга (гибридизация с поликлональными антителами на Каизо) был детектирован Каизо-GFP размером 120кДа как в присутствии, так и в отсутствии NEM (рис. 1, а). И только в образце с добавлением ингибитора протеаз, появляется форма белка в районе 130кДа, что предполагает наличие убиквинтин-подобной ПТМ белка Каизо (рис. 1, а).

NEM -Каизо-GFP +

Каизо-GFP* SUMO н

Каизо-GFP н

«P>

М.кДа -170

-130

■ 100

12 3 4

М,кДа • 170

ИБ: Антитела на Каизо

М.кДа -170 -130

■ 100

ИБ: Антитела на Каизо

SUM01-GFP Каизо-GFP

М,кДа -170 -130

-100

ИБ: Антитела на Каизо

Рисунок 1. Каизо сумоилируется 81'\Ю1. о - Иммуноблоттинг (ИБ) ядерных экстрактов трансфецированных Каизо-вРР (+) и нетрансфецированных (-) из клеточной линии НЕК293, полученных в присутствии (+) и отсутствии (-) ингибитора протеаз ЫЕМ (Ы-еЛу1 та1е1гш<1е); б, в - Анализ ядерных экстрактов клеточной линии НЕК293. Иммунопреципитация (ИП): 6- 1-ядерные экстракты, 2-антитела на Каизо, 3-антитела на БиМ01, 4-антитела на 311М02/3; в - 1- антитела на БиМСШЗ. 2-антитела на БиМСМ; г - Анализ клеточных лизатов НЕК293, трансфецированных (+) и не трансфецированных (-) Каизо-вРР и 511М01-0РР. На рис. 1, г стрелочками обозначены: 1-Каиз0-СРР+5иМ01-0РР, 2- Каизо-ОРР+БиМО!, 3- Каизо-ОРР. ИБ: а,б,в,г, - поликлональные антитела на Каизо.

У млекопитающих были обнаружены три изоформы белка SUMO: SUMOl, SUM02/3 (SUM02 и SUM03 гомологичные по строению, но не взаимозаменяемые изоформы). Для того чтобы определить, является ли модификация белка Каизо сумоилированием. был сделан иммунопреципитационный анализ ядерных экстрактов линии клеток НЕК293 с использованием антител на SUMOl и SUM02/3. Результаты иммуноблотгинга показали, что полосы модифицированной и немодифицированной форм Каизо детектируются после иммунопреиипитаиии с SUMOl антителами, но не с SUM02/3 в районе ЮОкДа и 120кДа (рис 1. 6.в).

Данный факт может быть интерпретирован следующим образом: 1) модифицированная форма Каизо - это сумоилированная SUMOl форма белка Каизо, при этом благодаря способности Каизо димеризоваться при иммунопреципитации с антителами на SUMO 1 была детектирована и ^модифицированная форма белка; 2) обе формы Каизо, и модифицированная, и немодифицированная входят в белковый комплекс, в котором присутствует SUM01. На основании этого было решено проверить, может ли белок Каизо модифицироваться SUM01, а не SUM02/3.

Для этого был дополнительно проведен анализ клеточных лизатов НЕК293, трансфецированных только Каизо-GFP. или совместно Каизо-GFP и SUMOl-GFP. Результаты иммуноблоттинга показали, что в случае совместной трансфекции Каизо-GFP и SUMOl-GFP появляется дополнительная полоса в районе между 130кДа и 170кДа (рис. 1, г), которая, по всей видимости, соответствует модифицированному белку Каизо-GFP + SUMOl-GFP. Таким образом, показано, что метил-ДНК-связывающий белок Каизо подвергается SUMOl-посттрансляционной модификации.

2. Сумоилированию подвергается ВТВ домен белка Каизо.

Показано, что в транскрипционных факторах сайты сумоилирования могут располагаться как внутри функциональных доменов, так и за пределами функциональных последовательностей белков. N-концевой домен белка Каизо представлен репрессионным BTB/POZ доменом, принимающим участие в гомо- и гетеродимеризации, взаимодействии с белковыми факторами, а С-концевой домен «цинковые пальцы» отвечает за взаимодействие с белком р 120 и за связывание с ДНК. Для определения домена белка Каизо, который подвергается сумоилированию, были получены конструкции с различными делециями в кДНК Каизо. При этом минимальная конструкция содержала только последовательность, кодирующую ВТВ домен Каизо. Полученные конструкции, в присутствии или отсутствии SUMOl-GFP, трансфецировали в линию клеток НЕК293, затем иммуноперципитировали экстракты с НА-агарозой, и проводили иммуноблотгинг с НА-антителами. На рисунке 2 показано, что в случае трансфекции конструкции, содержащей ВТВ-домен, присутствуют две полосы: одна соответствует ВТВ-домену белка Каизо (3. рис.2), а вторая, по всей видимости, его сумоилированной форме (2, рис.2). В присутствии же SUMOl-GFP можно наблюдать наличие дополнительной полосы в районе между 55кДа и 72кДа (1, рис.2), соответствующей BTB-SUM01-GFP.

Таким образом, именно ВТВ домен белка Каизо подвергается SUM01 модификации в клетках млекопитающих.

ВТВ-НА + +

эимоЧ-СРР - + 1, Рисунок 2. ВТВ домен белка Каизо

'10° необходим для 81_'М01 модификации.

|72 Иммуноблоттинг (ИБ) ядерных экстрактов -55 клеточной линии НЕК 293, трансфецированной (+) -43 и не трансфецированной (-) конструкциями ВТВ-¡1 НА и БиМСН-ОБР после иммунопреципитации с

• 34 НА-агарозой. ИБ: антитела на НА- пептид. На рисунке цифрами и стрелочками укачаны: 1 - ВТВ-НА + БиМСЛ-ОБР, 2 - ВТВ + виМО!, 3 - ВТВ.

-26

3-к;

Чп :

ИБ: Антитела

на НА-пептид

Известно, что BTB/POZ транскрипционный фактор Каизо встречается в организме всех позвоночных животных от млекопитающих -Н. sapiens до рыб - D.rerio. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белка Каизо разных позвоночных животных показал, что ВТВ домен высокогомологичен для человека, мыши, курицы, лягушки и рыбы. Для того чтобы определить, буВ>т ли подвергаться сумоилированию ВТВ домены белка Каизо других позвоночных, были получены конструкции с С-концевым НА-пептидом содержащие последовательность, кодирующую ВТВ домен для X. laeivis (земноводные - хВТВ-НА) и D. rerio (рыбы -dBTB-HA). Конструкции хВТВ-НА и dBTB-HA, в присутствии SUM01-GFP или без SUM01-GFP были трансфецированы в клеточную линию НЕК293. В результате иммуноблоттинга клеточных лизатов оказалось, что и ВТВ домен X. Laivis. и ВТВ домен D. rerio подвергаются SUM01 модификации (рис. 3). Аналогичные данные были получены и для M. musculus (мышь - mBTB-HA).

хВТВ-НА + + - . . dBTB-HA - - + + -SUM01-GFP - +

ВТВ-НА +

Рисунок 3. Сумоилирование ВТВ домена белка 72 Каизо является эволшцчонно консервативным вимси-срр"*' I* * ,55 событием. Иммуноблоттинг (ИБ) анализ клеточных лизатов линии НЕК 293, трансфецированной (+) и нетрансфецированной (-) конструкциями хВТВ-НА, ёВТВ-НА и БиМСИ-ОБР. Иммуноблоттинг (ИБ): антитела на НА-пептид.

ИБ: Антитепа на НА-пептид

Таким образом, сумоилирование ВТВ домена белка Каизо является эволюционно-консервативным событием.

3. Определение сайта необходимого для сумоилирования ВТВ домена белка Каизо.

Далее необходимо было определить аминокислотный остаток, по которому Каизо сумоилируется. Известно, что для SUMO-модификации необходимо наличие аминокислоты лизина. Сумоилирование может осуществляться как по консенсусной последовательности - i|/KXEP, так и вне консенсусной последовательности. Поскольку выше было показано, что сумоилирование является эволюционно-консервативньм событием, то в результате множественного выравнивания аминокислотных последовательностей ВТВ домена белка Каизо разных позвоночных животных, были выделены три консервативных лизина К-5, 42 и 124, как потенциальные сайты для сумоилирования (рис. 4).

5 Л2

D. rirlo

G. galus М. musculus

H. sapiens X. taevis

P. f»rio

C. gaiuit м. тиасЫия Н. sapiens X. iaevib

D. rerfо

G. galus M. museuius

H. sapiens

Рисунок 4. Множественное выравнивание аминокислотной последовательности ВТВ домена белка Каизо разных позвоночных животных. Прямоугольником выделены аминокислотные остатки- лизины, как предполагаемые сайты сумоилирования.

Были получены конструкции с НА-концевым пептидом и ВТВ доменом белка Каизо, содержащие точечные аминокислотные замены: ВТВ(К5А)-НА, ВТВ(К42А)-НА и ВТВ(К124А)-НА. При трансфекции этих конструкций в клеточную линию НЕК293 в присутствии или отсутствии SUM01-GFP было показано, что для сумоилирования ВТВ домена белка Каизо необходим 42 лизин (рис. 5). Как видно на рисунке 5 отсутствие полосы в районе между 55кДа и 72кДа в дорожке 7 говорит о том, что при мутации 42 лизина ВТВ домен не может сумоилироваться.

BTB(K124A)-HA -BTB(K42A)-HA -ВТВ(К5А)-НА • SUM01-GFP " ВТВ-НА -

Рисунок 5. Для сумоилирования ВТВ м.кда * Г* ® 5 домена белка Каизо необходим 42 лизин

юо- — - — Иммуноблоттинг (ИБ) анализ клеточных

лизатов НЕК293, трансфецированных (+) и нетрансфецированных (-) конструкциями Г&'-а»!1!/^;;;;; Каизо(К5А)-НА, Каизо(К42А)-НА,

Каизо(К124А)-НА и ЭиМСН-ОРР. ИБ: Антитела на вРР.

t « втв-НА »

SUM01-GFP

Щ i

26-

123456789 ИБ: Антитепа на GFP

Таким образом, исходя из полученных данных, для сумоилирования ВТВ домена белка Каизо необходим 42 лизин.

Далее была получена конструкция с полноразмерной кДНК белка Каизо. содержащей нуклеотидные замены, приводящие к К42А мутации. Конструкции KaH3o(K42A)-GFP и Каизо-GFP были трансфецированы в клеточную линию НЕК293 в присутствии или отсутствии SUM01-GFP. Иммуноблоттинг анализ клеточных лизатов показал, что при наличии мутации по 42 лизину Каизо представлен в клетке в единственной немодифицированной форме (3, рис.6), и добавление Sumol не оказывает влияния на подвижность белка. В то время как Каизо, способный сумоилироваться, представлен в виде двух форм. сумолированной и несумоилированной (2,3, рис.6), а в присутствии Sumol-GFP добавляется форма белка Каизо, сумоилированного экзогенным Sumol (1,2.3. рис.6). Что подтверждает тот факт, для сумоилирования белка Каизо необходим 42 лизин ВТВ домена

SUM01-GFP + - + Каизо-GFP + + -KaK30(K42A)-GFP - + + М.кДа

- 170

■ 130

Я iff til -100

ИБ: Антитела на Каизо

Рисунок 6. Внесение точечной аминокислотной замены К42А в полноразмерный белок Каизо приводит к потере сумоилирования. Иммуноблоттинг анализ клеточных лизатов НЕК293, трансфецированных и нетрансфецированных

конструкциями Каизо(К42А)-СРР, Каизо-врр и БиМСП-ОРР. ИБ:Антитела на Каизо. На рис. стрелочками обозначены: 1-Каизо-ОРР+5иМО!-ОРР, 2- Каиз0-0РР+511М01, З-Каизо-ОРР.

4. Влияние сумонлирования на транскрипционную активность белка Каизо.

Поскольку сайт сумоилирования у Каизо картирован в ВТВ домене, который отвечает за репрессионные свойства, то важно понять, каким образом отсутствие сумоилирования будет отражаться на репрессионных свойствах белка Каизо. Для выполнения этого эксперимента были использованы иммортализованные фибробласты мыши с генетическим нокаутом гена МВ02. В таких клетках нарушено метил-зависимое подавление транскрипции, приводящее к тому, что экзогенные метилированные конструкции репрессируются лишь частично, оставляя возможности для дальнейшего понижения уровня их активности за счет введения дополнительных белковых факторов. Используя такой метил-зависимый репрессионный анализ, конструкции Каизо-ОРР и Каизо(К42А)-ОРР в концентрации 25нг и 75нг были трансфецированы в мышиные фибробласты МВ02-/- совместно с метилированной и неметилированной репортерной люциферазной конструкцией. Результаты измерения относительной люциферазной активности показали, что несумоилированная форма белка Каизо не теряет своих свойств транскрипционного репрессора (рис. 7, а).

а * «о

2 КС

■е

= во

3 I "

2 р 4С

~ 'х

§ 2С

= о

Рисунок 7. Сумоилирование Каизо приводит к потере репрессионных свойств

белка, а, б - Приведены данные метил-зависимого репрессионного аназиза. По оси у

отложена относительная люциферазная активность, по оси х - концетрации трансфецируемых плазмид. В первой колонке трансфекция пустого вектора; 6 -ЭиМСН-ОРР трансфецировали в концентрации 50нг,

Добавление в данный метил-чувствительный эксперимент БЬ'МСМ-ОРР в концентрации 50нг, привело к потере репрессионных свойств формы белка Каизо, способной сумоилироваться в отличие от несумоилированной формы Каизо(К42А), которая по-прежнему, независимо от присутствия 811М01 является в данной модельной системе репрессором (рис. 7,6).

Таким образом, сумоилирование приводит к потере репрессионных свойств Каизо, а немодифицированная форма белка является репрессором.

5. Влияние сумоилнровання на локализацию белка Каизо в клетках млекопитающих.

Сумоилирование является важным для многих транскрипционных факторов. Так, данная ПТМ может влиять на локализацию белков в клетках позвоночных, определяя тем самым, их функциональную значимость. ;

Для того чтобы понять, как будет влиять сумоилирование на локализацию белка Каизо в клетке, конструкции Каизо-ОРР и Каизо (К42А)-ОРР были транфецированы в клеточную линию человека НЕК293. В результате иммунофлуорисцентного анализа было показано, что в отличие от белка Каизо, не содержащего мутацию, равномерно распределенного в ядре, локализация несумоилированной формы белка Каизо отличается от первой наличием ярко выраженного точечного распределения в ядре (рис. 8, а). Предполагая, что такая локализация ^модифицированной формы белка Каизо может совпадать с гетерохроматином, конструкции Каизо-ОРР и Каизо (К42А)-йРР были транфецированы в мышиные фибробласты, так как покраска ядер мышиных клеток красителем ОАР1 позволяет наблюдать гетерохроматин. Однако оказалось, что и Каизо-ОРР и Каизо (К42А) ОБР имеют одинаковое равномерное распределение в ядрах в мышиных фибробластах (рис. 8, 6).

Таким образом, в мышиных и человеческих клетках немодифицированная форма Каизо локализуется по-разному. Такая разница в локализации может быть объяснена тем, что были выбраны различные модельные системы: с одной стороны раковые клетки, а с другой стороны иммортализованные фибробласты, либо же в рассмотренных организмах сумоилированная форма белка Каизо имеет различную локализацию.

Рисунок 8. Ядерная локализация белка Каизо и его неиодифицированнон формы.

а- Иммунофлуорисцентный анализ клеточной линии НЕК293, трансфецированной конструкциями Каизо-СРР и Каизо(К42А)-ОРР. Несумоилированная форма белка Каизо на фоне равномерного распределения имеет точечную локализацию. 6-Иммунофлуорисцентный анализ мышиных фибробластов, трансфецированных конструкциями Каизо-ОРР и Каизо(К42А)-ОРР. И сумоилированная и несумоилированная формы белка Каизо равномерно распределены в ядре.

6. Влияние SUMOl-модификацни белка Каизо на его способность взаимодействовать с белками ко-репрессорами.

Поскольку сумоилирование влияет на транскрипционную активность белка Каизо и на его локализацию, возможно, данная ПТМ также может влиять на взаимодействие Каизо с белками ко-репрессорами. Картина клеточной локализации немодифицированной формы белка Каизо очень похожа на внутриядерное распределение для белков, входящих в Поликомб группу - PcG (Polycomb group) комплекса Для млекопитающих характерно два комплекса PcG белков: Поликомб репрессионный комплекс 1 - PRC1 (Polycomb repressive complex 1) (НРН, RING1, Bmil) и Поликомб репрессионный комплекс 2 - PRC2 (Polycomb repressive complex 2) (EED, EZH2, YY1. SU(Z)12) Белки группы Поликомб принимают участие в подавлении транскрипции ряда генов в процессе эмбрионального развития и дифференцировки. Показано, что белки, относящиеся к Поликомб репрессионному комплексу I - PRC1 локализуются в ядре виде точек, названных PcG - тельцами. Например, белок Bmil входит в комплекс белков PRC1 и локализуется в ядре в составе PcG -телец в виде точеного распределения (Hernandes-Munoz [. et al.. Mol. Cell Biol ,2005).

Предполагая, что несумоилированная форма белка Каизо может также локализоваться ввиде PcG - телец как и Bmil, были получены следующие конструкции. Каизо-FLAG, Kamo(K42A)-FLAG и Bmil-GFP. которые

трансфецировали в клеточную линию НЕК293. С помощью иммунофлуорисцентного анализа было показано, что ^модифицированная форма белка Каизо колокализуется в ядре с ВгшI в виде точек, которые являются Рсй-тельцами (рис. 9). Таким образом, несумоилированная форма белка Каизо, обладающая репрессионными свойствами, входит в состав Рсй-телец.

Анти-РЬАС Впи1-СРР ОАР1

Каизо-И.АС + ВтП-СРР

KaH30(K42A)-FLAG + Bmil-GFP

Рисунок 9. Несумоилированная форма белка Каизо входит в состав PcG-телец.

Иммунофлуорисцентный анализ клеточной линии НЕК293, трансфецированной Каизо-FLAG, Kamo(K42A)-FLAG и Bmil-GFP. Для идентификации Каизо в иммунофлуорисцентном анализе использовали первичные антитела на пептид FLAG и вторичные антитела меченые Су5 красителем флуорисцирующим красным'"цветом. Стрелками показаны PcG-тельца.

Однако стоит отметить, что и при трансфекции Каизо-FLAG с Bmil-GFP может наблюдаться похожая картина, что подтверждает тот факт, что Каизо в метке представлен в виде двух форм: модифицированной и немодифицированной.

По неопубликованным данным Каизо может напрямую взаимодействовать с Bmil, поэтому было решено применить ко-преципитационный анализ (GST pull down анализ), в котором клеточные лизаты НЕК293, трансфецированные Каизо-GFP, были преципитированны с Bmil-GST. В результате данного эксперимента оказалось, что Каизо независимо от статуса сумоилирования может взаимодействовать с белком Bmi 1 (рис. 10). Однако, сохраняется возможность, что сумоилированная форма белка Каизо взаимодействуете Bmil за счет димеризации с немодифицированной формой.

Каизо-GFP

Bmi1-GST

GST

Каизо-GFP + SUM01

- М, кДа —170

-130

ИБ: Антитела на Каизо

Рисунок 10. Независимо от статуса сумоилирования Каизо взаимодействует с белком группы поликомб ВтП. Ко-

приципитационный анализ белков ВтП-ОБТс Каизо-ОРР Каизо-ОРР трансфецировали в клеточную линию НЕК293.

.Таким образом, впервые показано, что ^модифицированная форма белка Каизо может входить в состав Рев-телец и взаимодействовать напрямую с Вгш 1.

Раннее было известно, что Каизо может входить и в другой репрессионный комплекс с Ы-СоЯ, для которого не описано характерных клеточных локализаций в виде точек. Однако было решено проверить, каким образом сумоилирование может оказывать влияние на это взаимодействие. Для этого по аналогии с ВтП был проведен ко-преципитационный анализ с Ы-СоЯ-СХТ, который также показал, что независимо от модификаций Каизо взаимодействует с Ы-СоЯ, однако количество белка Каизо, принимающего участие в этом комплексе крайне мало (данные не приведены).

7. Анализ сайтов связывания сумаилированной и несумоилированной формы белка Каизо по мышиному геному.

Поскольку с одной стороны немодифицированная форма белка Каизо не теряет репрессионных свойств, а с другой стороны при добавлении 5иМ01 белок Каизо перестает быть репрессором, то возникает вопрос, за счет чего изменяются репрессионные свойства Каизо. Первое возможное объяснение - это изменение взаимодействия с белками ко-репрессорами, однако выше было показано, что белок Каизо взаимодействует с ко-репрессорами Ы-СоЯ и Вгш-1 независимо от еумоилирования, хотя при этом сохраняется возможность взаимодействия модифицированной формы с белками ко-репрессорами за счет димеризации с немодифицированной формой Каизо. Также возможно, Каизо входит и в другие репрессионные комплексы (пока не исследованные), для которых сумоилирование Каизо может быть критичным. С другой стороны, сохраняется возможность, что белок Каизо взаимодействует с различными участками ДНК в зависимости от наличия или отсутствия еумоилирования. Поэтому было решено определить влияние еумоилирования белка Каизо на связывание с ДНК в полногеномной масштабе, используя СЫР-зец метод.

Для этого с помощью вирусной инфекции были получены иммортализованные мышиные фибробласты Каизо-/- стабильно экспрессирующие 1) белок Каизо (способный сумоилнроваться) и 2) несумоилированную форму белка Каизо (К42А). Методом РТ-Г1ЦР было подтверждено, что полученные клеточные линии экспресскруют мРНК Каизо (рис. 11, а). Анализ ядерных экстрактов, полученных из этих же клеток, также подтвердил экспрессию Каизо и Каизо (К42А). В качестве

контроля были использованы фибробласты Каизо-/-, инфецированные пустым вектором (рис. 11,6).

¡500

SÉ о

п s га

«. .. ИБ: Анти-Каизо ИБ: Анти-Актин

Рисунок 11. Анализ полученных клонов Каизо и Каизо (К42А). а - RT-ПЦР кДНК мышиных фибробластов Каизо-/-, стабильно экспрессирующих Каизо и Каизо (К42А) с праймеров на часть кДНК Каизо. б- Иммуноблоттинг (ИБ) ядерных экстрактов мышиных фибробластов Каизо-/-, стабильно экспрессирующих Каизо и Каизо (К42А). Вверху ИБ с антителами на Каизо, внизу контроль - ИБ с антителами на Актин.

Полученные иммортализованные мышиные фибробласты Каизо-/-. стабильно экспрессирующие белок Каизо и его несумоилированную форму, были использованы в иммунопреципитации хроматина с моноклональными антителами на данный белок. Пул ДНК, полученный в результате иммунопреципитации хроматина, использовали для получения библиотеки для секвенирования. Подготовленную геномную библиотеку декодировали на секвенаторе Genome Analyzer GA ("'Illumina", США), длина одного чтения составляла 36 нуклеотидов. Чтения, полученные в результате секвенирования картировали на мышиный геном (mm9 версия). Всего было прочитано 2 - 2,5 Гб, из которых около 1 Гб данных было откартировано на мышиный геном. Число картированных чтений на мышиный геном для клонов Каизо и Каизо (К42А) составило приблизительно 40 млн. Откартированные чтения использовали для поиска пиков, то есть районов, обогащенных чтениями. В качестве контроля были использованы данные, полученные для нокаутных иммортализованных фибробластов, идентифицированных контрольным вектором. Было получено: 391 участок для клеточной линии, экспрессирующей Каизо, и 378 участков для Каизо (К42А) (таблица 2). Средний размер пиков - около 500 пн При сравнении пиков, полученных для обеих клеточных линий оказалось, что Каизо, способный сумоилироваться, и немодифицированная форма Каизо одинаково распределены по мышиному геному, причем 75% участков связывания приходятся на «CpG островки» (таблица 1, рис. 12).

Дальнейший анализ данных показал, что 70,8 % участков связывания с ДНК белка Каизо и его несумоилированной формы приходится на промоторы. 22,3 % на интроны и зкзоны, 13.6% на межгенные районы и около 4% на 3'- концевые районы.

Такое распределение участков, обогащенных чтениями, совпадает с картиной связывания для транскрипционных факторов (таблица 2,3; рис. 12). Причем в случае участков, расположенных в «CpG островках», 84,6% пиков соответствуют промоторным областям (таблица 4) На рисунке 12, полученном в программе Genome Browser, приведен пример участков, обогащенных чтениями для Каизо и Каизо (К42А) для гена Lampl. из которых видно, что белок Каизо независимо от статуса сумоилирования связывается с промоторной областью данного гена, расположенного в «CpG островке». В случае Каизо-/- клеток, инфицированных пустым вектором, не наблюдается каких-либо значимых пиков (рис. 12).

Таблица 1. Анализ полученных данных на Genome Analyzer GA ("Illumina", США).

клон Каизо клон Каизо (К42А) Каизо -/-фибробл асты

Число картированных ридов на мышиный геном (млн) 38.99 47 38

Число участков обагощенных чтениями 391 378 —

Средний размер пиков (кластеров), Ьр (медиана) 517 (443) 457(361) _

% чтений, попавших в кластеры 1.7% 1.4% _

% «СрС островков» 75% 74.2% _

posibotlfsearch jchtO 1Э I58.37c-13159.345 aenr [ juiip~l dear Sizc365bp configure

1 2 3

1 - Katao - •2 - Каизо J - Каизо (K42A)

Рисунок 12. Пример распределении Каизо и Каизо (К42А) в промоторной области гена Lampl. На рисунке представлены данные, полученные в программе Genome Brouser для гена Lampl Белок Каизо и его несумоилированная (клон Каизо (К42А)) форма связываются с промоторной областью гена Lampl, содержащего «CpG островок» Слева на рисунке представлены данные ПЦР, после иммунопреципитации хроматина с антителами на Каизо

Таблица 2.Распределение участков, обогащеннь1х чтениями по мышиному геному. В столбце -мышиный геном- представлено распределение всех чтений, откартированных на геном мыши.

клон Каизо - клон Каизо Мышиный

(К42А) геном

Межгенные районы 13.6% 13.9% 51.5%

Нитроны и Экзоны 22.3% - 18.5%' 45.2%

Промоторы 70.8% 72.0% 1.9%

3' - концевые районы 3.8% 3.9% 1.9%

Таблица 3. Распределение участков связывания белка Канзо по мышиному геному в зависимости от наличия "СрСостровков".

«CpG островки» не «CpG островки»

Промоторы 84.60% 31.00%

Интроны II Экзоны 19.90% 29.90%

Межгенные районы 5.10% 39.20%

З'-концевые районы 2.70% 7.20%

Далее было решено проанализировать нуклеотидный состав полученных участков, чтобы выявить с какой последовательностью ДНК связываются обе формы Каизо in vivo (с Каизо связывающим сайтом - CTGCNA, или же с CGCG). Для этого было проанализировано распределение CG, CGCG: и CTGCNA в районе +/- 100 нуклеотидов вокруг пика связывания белка Каизо, что не выявило существенного обогащения по последовательности CTGCNA. Численные значения распределения приведены в Таблицах 4 и 5.

Таким образом, in vivo белок Каизо в основном связывается с участками, расположенными в промоторных областях генов, содержащих «CpG островки», при этом связывание обеих форм белка Каизо (как белка Каизо, так и его несумоилированной формы) с геномными последовательностями мыши одинаково. Эти данные позволяют предположить, что сумоилирование скорее влияет на взаимодействие ВТВ домена белка Каизо с белками ко-репрессорами, что подтверждается экспериментом по трансфекции в мышиные фибробласты в метил-зависимом эксперименте, нежели на связывание Каизо с сайтами геномной ДНК.

Таблица 4. Представленность СС, СССС, CTGCNA в участках связывания белка (100 пар вокруг пика) Каизо в различных районах генома, совпадающих с «СрС островками».

СС свсв СТСС^

все районы 96.6% 52.0% 20.0%

районы промоторов 100.0% 58.6% 19.7%

районы генов 93.2% 43.8% 23.5%

.межгенные районы 87.2% 27.2% 20.0%

З'-концевые районы 100.0% 41.1% 17.6%

Таблица 5. Представленность СС, СССС, СТСС\А в участках связывания белка (100 пар вокруг пика)Каизо в зависимости от наличия «СрС островков».

! СС \ СССС СТССГЧА

«Срв островки» (293 района) 100.0% 62.6% 19.1%

не «СрС островки» (98 районов) 86.7% 21.4% 23.4%

выводы

1. Определено, что метил-ДНК-связывающий белок Кадао подвергается сумоилированию по 42 лизину в ВТВ домене. • •

2. Показано, что несумоилированная форма белка Каизо на фоне диффузного ядерного распределения имеет точечную .локализацию, которая совпадает с локализацией белка Bmil Поликомб комплекса (PcG) в клетках линии НЕК 293. .........;

3. Установлено, что в системе in vitro Каизо взаимодействует с Bmi 1 и с NCoR.

4. Определено, что сумоилирование Каизо приводит к снижению репрессионной активности белка, а несумоилированная. форма сохраняет репрессионные свойства.

5. Показано, что сумоилирование не влияет на спектр участков связывания Каизо в мышином геноме, и обе формы белка преимущественно связываются с промоторными областями, расположенными в «CpG островках».

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жигалова Н.А., Женило С В., Айтхожина Д.С., Прохорчук Е.Б. Две функции домена «цинковые пальцы» метил-ДНК-связывающего белка Каизо.// Молекулярная биология. - 2010 - Т. 44 - С. 263-274.

2. Жигалова Н.А., Женило СВ., Прохорчук Е.Б. Изучение постгрансляционных модификаций метил-ДНК-связывающего белка Каизо.// 13-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. 28 сентября -2 октября. 2009 -С. 15-16.

3. Жигалова Н.А., Женило СВ., Прохорчук Е.Б. Изучение постгрансляционных модификаций метил-ДНК-связывающего белка Каизо// Горизонты нанобиотехнолопш Материалы всероссийской научной школы для молодежи. 12-16октября. 2009-С. 36-37.

4. Жигалова Н А., Прохорчук Е.Б. Восстановление волосяного покрова de novo у мышей с дефектом гена Каизо после повреждения кожи.. // V Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 16-20марта. 2009 -С.230-231.

5. Zhigalova N, Prokhortchouk Е. Hair follicle regeneration de novo in adult Kaiso-deficient mice skin after wounding. // Benzon symposium No.55. Transcription, chromatin and disease. Copenhagen, Denmark. August 18-21. 2008 - P. 70.

6. Zhigalova N.A, Zhenilo S.V., Prokhortchouk E.B. Kaiso is a bifunctional methyl-DNA-binding protein. The fourth Moscow international congress. // Biotechnology: state of the art and prospects of development. March, 12-16.2007 - P.160.

Подписано в печать:

23.09.2010

Заказ № 4173 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жигалова, Надежда Алексеевна

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Метилирование генома эукариот.

1.1.1. Геномный импринтинг. Х-инактивация.

1.1.2. Динамика изменения метилирования во время эмбриогенеза.

1.1.3 ДНК-метнлтрансферазы.

1.1.4 Роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов.

1.2. Метнл-ДНК-связывающне белки.

1.3. Характеристика белков BTB/BOZ-ceмeнcтвa.

1.3.1. Особенности BTB/POZ домена.

1.3.2. Особенности домена «цинковые пальцы».

1.4. Метнл-ДНК-связывающий BTB/POZ транскрипционный фактор Канзо.

1.5. Посттрансляционные модификации.

1.5.1. Связь между метилированием ДНК и ПТМ гистонов.

1.5.2. Влияние ПТМ на функциональную активность транскрипционных факторов.

1.5.3. Сумоилирование, как уникальная ПТМ в регуляции активности транскрипционных факторов.

1.6. СЫР-эец анализ, как новый метод для нолногеиомного картирования сайтов связывания транскрипционных факторов с ДНК.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы бактерий.

2.2. Клеточные культуры и транзнентнан трансфекция.

2.3. Получение компетентных клеток.

2.4. Выделение тотальной ДНК из тканей и клеток.

2.5. Выделение тотальной РНК из клеток.

2.6. Обратная транскрипция.

2.7. Полимеразная ценная реакция.

2.8. Клонирование ПЦР продукта.

2.9. Плазмнды и конструкции.

2.9.1. Получение конструкций с GFP белком для экспрессии в клетках млекопитающих.

2.9.2. Получение конструкций для экспрессии рекомбннантных белков в клетках E.Coli BL-21.

2.9.3. Получение химерного белка Kan3oAZF-Ubc9.

2.9.4. Получение конструкций, кодирующих функциональные домены Каизо с N-концевым FLAG н С-концевым НА пептидами.

2.9.5. Получение конструкций с ВТВ доменом Каизо, с внесенными точечными аминокислотными заменами.

2.9.6. Получение конструкций с полноразмерным Каизо с внесенной точечной аминокислотной заменой К42А в ВТВ домене.

2.10. Иммунофлуорнсцентный анализ.

2.11. Получение клеточных лизатов.

2.12. Выделение ядерных экстрактов из эукариотическнх клеточных линий.

2.13. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.14. Ко-нрецнпитационный анализ (GST pull-down анализ).

2.15. Иммунопрецнпнтацня и Иммуноблоттинг.

2.16. Метил-зависимый ренрессионный эксперимент.

2.17. Метилирование ДНК с помощью SssI- метилазы.

2.18. Получение имморталнзованных мышиных фибробластов Каизо-/- стабильно экснрессирующнх сумоилированную форму белка Канзо н Каизо (К42А).

2.19. Иммунопрецнпнтацня хроматина.

2.20. Приготовление геномных библиотек для секвенирования.

2.21. Обработка данных, полученных в результате декодирования на Genome Analyzer GA ("Illumina", США).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Метнл-ДНК-свнзывающий белок Каизо подвергается убиквннтин-нодобной носттрансляционной модификации.

3.2. Каизо сумоилируется SUMOl.

3.3. Определение домена белка Канзо необходимого для сумоилирования.

3.4. Сумонлирование ВТВ домена белка Каизо является эволюционно консервативным событием.

3.5. Определение сайта необходимого для сумоилирования ВТВ домена белка Каизо.

3.6. Влияние сумоилирования на транскрипционную активность белка Каизо.

3.7. Влияние сумоилирования на локализацию белка Каизо в клетках млекопитающих.

3.8. Влияние 811М01-модификации белка Каизо на его способность взаимодействовать с белками ко-репрсссорами.

3.9. Анализ сайтов связывания сумоилированной и песумоилированной формы белка Каизо по мышиному геному.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная значимость сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо"

Изучение механизмов регуляции генной активности является ключевой задачей в понимании того, как работает геном. Обратимые изменения активности генов называют «эпигенетическими». По современным представлениям эпигенетика - наука о надгенетических процессах функциональной геномики, которая в первую очередь рассматривает три класса явлений: метилирование ДНК, гистоновый код и регуляцию генома на уровне интерферирующих РНК. Все три механизма реализации генетической информации вовлечены, в частности у позвоночных организмов, в такие клеточные процессы, как ранний эмбриогенез и гаметогенез, дифференцировка, инактивация X-хромосомы, геномный импринтинг, онкологическая трансформация клеток. Например, нарушение метилирования ДНК может приводить к несвоевременной активации протоонкогенов, а аномально высокий уровень метилирования генов-супрессоров, подавляющих злокачественный рост, будет способствовать продвижению клеток по пути к трансформированному состоянию вплоть до метастазирования. Изучение метилирования ДНК является важным для понимания механизмов возникновения и развития различных заболеваний, а также может служить значимым маркером для ранней диагностики рака.

Метилирование ДНК может оказывать влияние на транскрипцию генов либо за счет изменения констант связывания белков транскрипционных активаторов с ранее неметилированной ДНК, либо за счет привлечения транскрипционных факторов, специфически взаимодействующих с метилированной ДНК. Последние могут входить в белковые комплексы с различными гистоновыми трансферазами и за счет них изменять состояние окружающего хроматина. Метил ДНК-связывающие белки классифицируются в семейства. Одно из них состоит из MBD-белков (MBD1, MBD2, MBD4, МеСР2) с характерным MBD (methyl binding domain) доменом, с помощью которого происходит связывание с одиночными метилированными CpG парами. Эти белки участвуют в контроле стабильности генома, раннем эмбриональном развитии, дифференцировке, созревании нейронов и др. Второе семейство состоит из Каизо и Каизо-подобных белков (Каизо, ZBTB4 и ZBTB38) (1). В отличие от MBD белков Каизо взаимодействует с метилированными CGCG через три С-концевых «цинковых пальца» С2Н2 типа. Некоторые исследователи приписывают Каизо способность связывать и неметилированные участки ДНК, содержащие консенсусную последовательность CTGCNA, однако, на сегодня нет веских данных экспериментов in vivo в поддержку этой гипотезы. (2;3). Несмотря на общую доменную структуру белков внутри обоих семейств функциональная значимость каждого белка в организме эукариот уникальна. При изучении свойств и MBD и Каизо подобных белков методами генетического нокаута было показано, что отсутствие одного белка или даже нескольких (Каизо, МеСР2, MBD2 и MBD1) белков не приводит к остановке эмбрионального развития у млекопитающих. На этом фоне контрастом выглядит эмбриональная летальность у мышей с отсутствующим геном поддерживающей метил-трансферазы Dnmtl (4). Таким образом, пока не установлена прямая связь между непреложной важностью самой модификации метилирования ДНК и ее белковыми спутниками, которые долгое время считались ключевыми в интерпретации метилирования и перевода этого сигнала от молекулы ДНК к непосредственно функционированию генома. В то время как генетический нокаут Каизо у мышей не приводит к ярко выраженному фенотипу (только в случае Каизо"А мышей в модели APC/Min была обнаружена их устойчивость к возникновению рака кишечника), у земноводных (на модели Xenopus laevis) Каизо необходим для нормального развития, и уменьшение его количества приводит к гибели эмбрионов (5;6). Тем не менее, обнаруженная роль Каизо в раке кишечника в модели APC/Min открывает новую принципиальную возможность его использования в качестве мишени в терапии онкологических заболеваний. Для достижения этой цели необходимо более глубокое понимание функциональной значимости Каизо в клетках млекопитающих.

Известно, что большое разнообразие функционально активных белков и транскрипционных факторов достигается в клетках эукариот и благодаря посттрансляционным модификациям (ПТМ). Каизо является репрессором транскрипции и, вероятно, как и все транскрипционные факторы, может подвергаться ПТМ, которые потенциально могут оказывать существенное влияние на его свойства и функции. В данной работе охарактеризовано сумоилирование Каизо. Сумоилирование представляет собой процесс ковалентного присоединения белка SUMO к лизину белков-субстратов за счет серии ферментативных реакций. Сумоилирование является малоизученной, но важной ПТМ у эукариот, поскольку может оказывать влияние на клеточную локализацию белков, ядерный транспорт, на спектр взаимодействующих белков и ко-факторов, на их связывание с ДНК, на контроль функций хроматина, и в частности на транскрипцию, репликацию, репарацию и организацию гетерохроматина (7).

Таким образом, определение функциональной значимости сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо позволит полнее раскрыть его роль в регуляции экспрессии генов мишеней.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей работы является изучение роли сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо в связывании с ДНК, подавлении транскрипции и взаимодействии с белками ко-репрессорами.

Задачи:

1. Определить, какие аминокислоты белка Каизо подвергаются сумоилированию.

3. Охарактеризовать влияние сумоилирования на репрессионные свойства белка Каизо.

4. Определить влияние сумоилирования на спектр участков связывания Каизо в полногеномном масштабе.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Жигалова, Надежда Алексеевна

выводы

1. Определено, что метил-ДНК-связывающий белок Каизо подвергается сумоилированию по 42 лизину в ВТВ домене.

2. Показано, что несумоилированная форма белка Каизо на фоне диффузного ядерного распределения имеет точечную локализацию, которая совпадает с локализацией белка Bmil Поликомб комплекса (PcG) в клетках линии НЕК 293.

3. Установлено, что в системе in vitro Каизо взаимодействует с Bmil и с NCoR.

4. Определено, что сумоилирование Каизо приводит к снижению репрессионной активности белка, а несумоилированная форма сохраняет репрессионные свойства.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жигалова Н.А., Женило С.В., Айтхожина Д.С., Прохорчук Е.Б. Две функции домена «цинковые пальцы» метил-ДНК-связывающего белка Каизо.// Молекулярная биология. - 2010 - Т. 44 - С. 263-274.

2. Жигалова Н.А., Женило С.В., Прохорчук Е.Б. Изучение посттрансляционных модификаций метил-ДНК-связывающего белка Каизо.// 13-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. 28 сентября -2 октября. 2009 - С. 15-16.

3. Жигалова Н.А., Женило С.В., Прохорчук Е.Б. Изучение посттрансляционных модификаций метил-ДНК-связывающего белка Каизо.// Горизонты нанобиотехнологии. Материалы всероссийской научной школы для молодежи. 12 -16 октября. 2009 -С. 36-37.

4. Жигалова Н.А., Прохорчук Е.Б. Восстановление волосяного покрова de novo у мышей с дефектом гена Каизо после повреждения кожи. // V Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 1620 марта. 2009 - С.230-231.

6. Zhigalova N.A., Zhenilo S.V., Prokhortchouk E.B. Kaiso is a bifunctional methyl-DNA-binding protein. The fourth Moscow international congress. // Biotechnology: state of the art and prospects of development. March, 12-16.2007 - P. 160.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жигалова, Надежда Алексеевна, Москва

1. Sasai N. and Defossez P.A. Many paths to one goal? The proteins that recognize methylated DNA in eukaryotes. lnt J Dev.Biol. 2009. V. 53, P. 323-334.

2. Daniel JM, Reynolds AB. The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol.Cell Biol. 1999, V. 19, P. 3614-3623.

3. Bestor T.H., Verdine G.L. DNA methyltransferases. Curr.Opin.Cell Biol 1994, V. 6, P. 380-389.

4. Ruzov A., Dunican D.S., Prokhortchouk A., Pennings S., Stancheva I., Prokhortchouk E. et al. Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development. Development. 2004, V. 131, P. 6185-6194.

5. Prokhortchouk A, Sansom O, Sclfridge J, Caballero IM, Salozhin S, Aithozhina D et al. Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer. Mol.Cell Biol. 2006, V. 26, P. 199-208.

6. Meulmeester E, Melchior F. Cell biology: SUMO. Nature. 2008, V. 452, P. 709-711.

7. Hung MS, Karthikeyan N, Huang B, Koo HC, Kiger J, Shen CJ. Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1999, V. 96, P. 11940-5.

8. Tariq M., Paszkowski J. DNA and histone methylation in plants. Trends Genet. 2004, V. 20, P. 244-51.

9. Lander E.S.et al,. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001, V. 409, P. 860-921.

10. Antequera F, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse 4. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1993, V. 90, P. 11995-11999.95

11. Peter A.Jones eal. The Role of DNA Methylation in Mammalian. Science. 2001, V. 293, P. 1068-1070.

12. Davies W, Isles AR, Wilkinson LS. Imprinted gene expression in the brain 8. Neurosci.Biobehav.Rev. 2005, V. 29, P. 421-430.

13. Delaval K, Feil R. Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting 3. Curr.Opin.Genet.Dev. 2004, V. 14, P. 188-195.

14. Okada M, Ymagata K, Hong K., Wakayama T., Zhang H. A role for the elongator complcx in zygotic paternal genome demethylation. Nature. 2010, V. 463, P. 554-558.

15. Rand E, Ben Porath I, Keshet I, Cedar H. CTCF elements direct allele-specific undermethylation at the imprinted HI9 locus. Curr.Biol. 2004, V. 14, P. 1007-1012.

16. Schoenherr CJ, Levorse JM, Tilghman SM. CTCF maintains differential methylation at the Igf2/H19 locus. Nat.Genet. 2003, V. 33, P. 66-69.

17. Rand E, Ben Porath I, Keshet I, Cedar H. CTCF elements direct allele-specific undermethylation at the imprinted HI9 locus. Curr.Biol. 2004, V. 14, P. 1007-1102.

18. Nicholls RD, Knepper JL. Genome organization, function, and imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes. Annu.Rev.Genomics Hum. Genet. 2001, V. 2, P. 153-175.

19. Clerc P, Avner P. Multiple elements within the Xic regulate random X inactivation in mice. Semin.Cell Dev.Biol. 2003, V. 14, P. 85-92.

20. Morey C, Navarro P, Debrand E, Avner P, Rougeulle C, Clerc P. The region 3' to Xist mediates X chromosome counting and H3 Lys-4 dimethylation within the Xist gene. EMBOJ. 2004, V. 23, P. 594-604.

21. Avner P, Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nat.Rev.Genet. 2001, V. 2, P. 59-67.

22. Santos F. and Dean W. Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction. 2004, V. 127, P. 643-651.

23. Macleod D, Clark VH, Bird A. Absence of genome-wide changes in DNA methylation during development of the zebrafish. Nat.Genet. 1999, V. 23, P. 139-140.

24. Adams R.L. DNA methylation. The effect of minor bases on DNA-protein interactions. Biochem.J. 1990, V. 265, P. 309-320.

25. Adams RL. Eukaryotic DNA methyltransferases—structure and function. Bioessays 1995, V. 17, P. 139-145.

26. Bestor TH. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn binding regulatory domain. EMBO J. 1992, V. 11, P. 2611-2617.

27. Li E., Bestor T.H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 1992, V. 69, P. 915-926.

28. Lei H., Oh S.P., Okano M., Juttermann R., Goss K.A., Jaenisch R. et al. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development. 1996, V. 122, P. 3195-3205.

29. Fuks F., Hurd P.J., Deplus R., Kouzarides T. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res. 2003, V. 31, P. 2305-2312.

30. Tatematsu K.I., Yamazaki T., Ishikawa F. MBD2-MBD3 complex binds to hemi-methylated DNA and forms a complex containing DNMT1 at the replication foci in late S phase. Genes Cells. 2000, V. 5, P. 677-688.

31. Sen G.L., Reuter J.A., Webster D.E., Zhu L., Khavari P.A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 2010, V. 463, P. 563-567.

32. Gowher H, Jeltsch A. Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG correction of non-CpA. sites. J.Mol.Biol. 2001, V. 309, P. 1201-1208.

33. Xu GL, Bestor TH, Bourc'his D, Hsieh CL, Tommerup N, Bugge M et al. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene. Nature. 1999, V. 402, P. 187-191.

34. Bourc'his D., Bestor T.H. Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature. 2004, V. 431, P. 96-99.

35. Webster KE, O'Bryan MK, Fletcher S, Crewther PE, Aapola U, Craig J et al. Meiotic and epigenetic defects in Dnmt3L-knockout mouse spermatogenesis. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 2005, V. 102, P. 4068-4073.

36. Gidekel S., Bergman Y. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element. J.Biol.Chem. 2002, V. 277, P. 34521-34530.

37. Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals

38. Nat.Genet. 2003, V. 33, P. 245-254.

39. Esteller M. and Herman J.G. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. J Pathol. 2002, V. 196, P. 1-7.

40. Yang DH, Smith ER, Cohen C, Wu H, Patriotis C, Godwin AK et al. Molecular events associated with dysplastic morphologic transformation and initiation of ovarian tumorigenicity. Cancer. 2002, V. 94, P. 2380-2392.

41. Cameron EE, Bachman KE, Myohanen S, Herman JG, Baylin SB. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nat.Genet. 1999, V. 21, P. 103-107.

42. Hendrich B, Guy J, Ramsahoye B, Wilson VA, Bird A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development

43. Genes Dev. 2001, V. 15, P. 710-723.

44. Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 2004, V. 429, P. 457-463.

45. Fatemi M., Wade P.A. MBD family proteins: reading the epigenetic code. J.Cell Sei. 2006, V. 119, P. 3033-3037.

46. Guy J, Hendrich B, Holmes M, Martin JE, Bird A. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat.Genet. 2001, V. 27, P. 322-326.

47. Lewis JD, Meehan RR, Henzel WJ, Maurer-Fogy I, Jeppesen P, Klein F et al. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. Cell. 1992, V. 69, P. 905-914.

48. Salozhin SV, Prokhorchuk EB, Georgiev GP. Methylation of DNA—one of the major epigenetic markers. Biochemistry (Mosc.). 2005, V. 70, P. 525-532.

49. Klose RJ, Bird AP. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. Trends Biochem.Sci. 2006, V. 31, P. 89-97.

50. Johnston MV, Mullaney B, Blue ME. Neurobiology of Rett syndrome. ./.Child Neurol. 2003, V.18, P. 688-692.

51. Hendrich B, Abbott C, McQueen PI, Chambers D, Cross S, Bird A. Genomic structure and chromosomal mapping of the murine and human Mbdl, Mbd2, Mbd3, and Mbd4 genes. Mamm.Genome. 1999, V. 10, P. 906-912.

52. Ng PIH, Jeppesen P, Bird A. Active repression of methylated genes by the chromosomal protein MBDl. Mol.Cell Biol. 2000, V. 20, P. 1394-1406.

53. Fujita Nea. MCAF mediates MBDl-dependent transcriptional repression. Mol.Biol. Cell. 2003, V. 23, P. 2834-2843.

54. Fujita N. Methyl-CpG binding domain 1 (MBDl) interacts with the Suv39hl-HPl heterochromatic complex for DNA methylation-based transcriptional repression. J.Biol.Chem. 2003, V. 278, P. 24132-24138.

55. Reese BE, Bachman KE, Baylin SB, Rountree MR. The methyl-CpG binding protein MBDl interacts with the pi50 subunit of chromatin assembly factor 1. Mol.Cell Biol. 2003, V. 23, P. 3226-3236.

56. Hendrich B, Guy J, Ramsahoye B, Wilson VA, Bird A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Dev. 2001, V. 15, P. 710-723.

57. Zhang Yeal. Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation. Genes Dev. 1999, V. 13, P. 1924-1935.

58. Nan X, Ng HH, Johnson CA, Laherty CD, Turner BM, Eisenman RN et al. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature. 1998, V. 393, P. 386-389.

59. Nan X, Tate P, Li E, Bird A. DNA methylation specifies chromosomal localization of MeCP2. Mol.Cell Biol. 1996, V. 16, P. 414-421.

60. Hendrich B, Tweedie S. The methyl-CpG binding domain and the evolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet. 2003, V. 19, P. 269-277.

61. Millar CBeal. Enhanced CpG mutability and tumorigenesis in MBD4-deficient mice. Science. 2002, V. 297, P. 403-405.

62. Kim Sun-Mi et.al. DNA demethylation in hormon-induced transcriptional derepression. Nature. 2009, V. 461, P. 1007-1012.

63. Ahmad K.F., Engel C.K., Prive G.G. Crystal structure of the BTB domain from PLZF. Biochemistry. 1998, V. 95, P. 12123-12128.

64. Melnick A., Ahmad K.F., Arai S.A. In-depth mutational analysis of the promyelocytic leukemia zinc finger BTB/POZ domain reveals motifs and residues required for biological and transcriptional functions. Mol.Cell Biol. 2000, V. 20, P. 6550-6567.

65. Ramos S., Khademi F., Somesh B.P., Rivero F. Genomic organization and expression profile of the small GTPases of the RhoBTB family in human and mouse. Gene. 2002, V. 298, P. 147-157.

66. Yong Go Cho et.al. Genetic analysis of the DBC2 gene in gastric cancer. Acta Oncologica. 2008, V. 47, P. 366-371.

67. Read D., Raff J.W. Functional studies of the BTB domainin the Drosophila GAGA and Mod (mdg 4) proteins. Nucleic. Acid Res. Nucleic.AcidRes. 2000, V. 28, P. 3864-3870.

68. Carter M.G., Johns M.A., Zeng X., Zhou L., Zink C., Mankowski J.L. et al. Mice deficient in the candidate tumor supressor gene Hicl ezhibit developmental defects of structures affected in Miller-Dieker syndrome. Hum.Mol. Genet. 2000, V. 9, P. 413-419.

69. Klug A, Schwabe JW. Protein motifs 5. Zinc fingers. FASEB J. 1995, V. 9, P. 597-604.

70. Choo, Y. and Isalan, M. Advances in zinc finger engineering. Curr.Opin.Struct.Biol. 2000, V. 10, P. 411-416.

71. Laity J.H., Dyson H.J., and Wright P.E. DNA-induced alpha-helix capping in conserved linker sequences is a determinant of binding affinity in Cys(2)-His(2) zinc fingers. J.Mol.Biol. 2000, V. 295, P. 719-727.

72. Elrod-Erickson M., Benson T.E., and Pabo C.O. High-resolution structures of variant Zif268-DNA complexes: implications for understanding zinc finger-DNA recognition. Structure. 1998, V. 6, P. 451-454.

73. Choo, Y. Recognition of DNA methylation by zinc fingers. Nat.Struct.Biol. 1998, V. 5, P. 264-265.

74. Sekimata M., Takahashi A., Murakami-Sekimata A., and Homma Y. Involvement of a novel zinc finger protein, MIZF, in transcriptional repression by interacting with a methyl-CpG-binding protein, MBD2. J.Biol.Chem. 2001, V. 276, P. 42632-42638.

75. Sun L., Liu A., and Georgopoulos K. Zinc finger-mediated protein interactions modulate Ikaros activity, a molecular control of lymphocyte development. EMBO J. 1996, V. 15, P. 5358-5369.

76. Georgopoulos K., Winandy S., and Avitahl N. The role of the Ikaros gene in lymphocyte development and homeostasis. Annu.Rev. 1mmunol. 1997, V. 15, P. 155-176.

77. Merika M. and Orkin S.H. Functional synergy and physical interactions of the erythroid transcription factor GATA-1 with the Kruppel family proteins Spl and EKLF. Mol.Cell Biol. 1995, V. 15, P. 2437-2447.

78. Albagli O, Dhordain P, Deweindt C, Lecocq G, Leprince D. The BTB/POZ domain: a new protein-protein interaction motif common to DNA- and actin-binding proteins. Cell Growth Differ. 1995, V. 6, P. 1193-1198.

79. Bardwell VJ, Treisman R. The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif. Genes Dev. 1994, V. 8, P. 1664-1677.

80. Lucifero D, Mann MR, Bartolomei MS, Trasler JM. Gene-specific timing and epigenetic memory in oocyte imprinting. Hum.Mol.Genet. 2004, V. 13, P. 839-849.

81. Isalan M, Klug A, Choo Y. Comprehensive DNA recognition through concerted interactions from adjacent zinc fingers. Biochemistry. 1998, V. 37, P. 12026-12033.

82. Daniel JM, Reynolds AB. The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol.Cell Biol. 1999, V.19, P. 3614-3623.

83. Yoon HG, Chan DW, Reynolds AB, Qin J, Wong J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Mol.Cell 2003, V. 12, P. 723-734.

84. Prokhortchouk A, Sansom O, Selfridge J, Caballero IM, Salozhin S, Aithozhina D et al. Kaiso-deiicient mice show resistance to intestinal cancer. Mol.Cell Biol. 2006, V. 26, P.199-208.

85. Ruzov A, Dunican DS, Prokhortchouk A, Pennings S, Stancheva I, Prokhortchouk E et al. Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development. Development. 2004, V. 131, P. 6185-6194.

86. Ruzov A, Savitskaya E, Plackett JA, Reddington JP, Prokhortchouk A, Madej MJ et al. The non-methylated DNA-binding function of Kaiso is not required in early Xenopus laevis development. Development. 2009, V. 136, P. 729-738.

87. Daniel JM, Reynolds AB. The catenin pl20(cln) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol.Cell Biol. 1999, V. 19, P. 3614-3623.

88. Prokhortchouk A, Hendrich B, Jorgensen H, Ruzov A, Wilm M, Georgiev G et al. The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes Dev. 2001, V. 15, P. 1613-1618.

89. Anastasiadis PZ, Moon SY, Thoreson MA, Mariner DJ, Crawford HC, Zheng Y et al. Inhibition of RhoA by pi20 catenin. Nat.Cell Biol. 2000, V. 2, P. 637-644.

90. Anastasiadis PZ, Reynolds AB. The pi20 catenin family: complex roles in adhesion, signaling and cancer. J.Cell Sci. 2000, V. 113, P. 1319-1334.

91. Daniel JM, Reynolds AB. The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol.Cell Biol. 1999, V. 19, P. 3614-3623.

92. Ogden SR, Wroblewski LE, Weydig C, Romero-Gallo J, O'Brien DP, Israel DA et al. pi 20 and Kaiso regulate Helicobacter pylori-induced expression of matrix metalloproteinase-7. Mol.Biol.Cell. 2008, V.19, P. 4110-4121.

93. Dai S.D., Wang Y., Jiang G.Y., Zhang P.X., Dong X.J. Kaiso is expressed in lung cancer: its expression and localization is affected by pl20ctn. Lung Cancer. 2010, V. 67, P. 205215.

94. Yoon HG, Chan DW, Reynolds AB, Qin J, Wong J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso 199. Mol.Cell. 2003, V. 12, P. 723-734.

95. Yoon HG, Chan DW, Reynolds AB, Qin J, Wong J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Mol.Cell 2003, V. 12, P. 723-734.

96. Filion GJ, Zhenilo S, Salozhin S, Yamada D, Prokhortchouk E, Defossez PA. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Mol.Cell Biol. 2006, V. 26, P. 169-181.

97. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., and Годовикова Т.С. Химические и функциональные аспекты посттрансляционной модификации белков. Acta Naturae. 20096, № 3, С. 32-56.

98. Benayoun BA, Veitia RA. A post-translational modification code for transcription factors: sorting through a sea of signals. Trends Cell Biol. 2009.

99. Benayoun BA, Auer J, Caburet S, Veitia RA. The post-translational modification profile of the forkhead transcription factor FOXL2 suggests the existence of parallel processive/concerted modification pathways. Proteomics. 2008, V. 8, P. 3118-3123.

100. Martin C, Zhang Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 2005, V. 6, P. 838-849.

101. Zegerman P, Canas B, Pappin D, Kouzarides T. Histone H3 lysine 4 methylation disrupts binding of nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressor complex. J.Biol.Chem. 2002, V. 277, P. 11621-11624.

102. Mutskov V, Felsenfeld G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. EMBO J. 2004, V. 23, P. 138-149.

103. Fischle W, Tseng BS, Dormann HL, Ueberheide BM, Garcia BA, Shabanowitz J et al. Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature. 2005.

104. Lindroth AM, Shultis D, Jaseneakova Z, Fuchs J, Johnson L, Schubert D et al. Dual histone H3 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with CHROMOMETHYLASE3. EMBO J. 2004, V. 23, P. 4286-4296.

105. Fuks F, Hurd PJ, Wolf D, Nan X, Bird AP, Kouzarides T. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J.Biol.Chem. 2003, V. 278, P. 4035-4040.

106. Maclaine N.J., Hupp T.R. The regulation of p53 by phosphorylation: a model for how distinct signals integrate into the p53 pathway. Aging. 2009, V. 5, P. 490-502.

107. Sluss H.K., Gannon H., Coles A.H., Shen Q., Eischen C.M., Jones S.N. Phosphorylation of p53 Serine 18 Upregulates Apoptosis to Suppress Myc-Induced Tumorigenesis. Mol Cancer Res. 2010, V. 2, P. 216-222.

108. Mariner DJeal. Identification of Src phosphorylation sites in the catenin pl20ctn. J.Biol.Chem. 2001, V. 276, P. 28006-28013.

109. Xia X., Mariner D.J., Reynolds A.B. Adhesion-associated and PKC-modulated changes in serine/threonine phosphorylation of pl20-catenin. Biochemistry. 2003, V. 42, P. 91959204.

110. Bracaglia G., Conca B., Bergo A., Rusconi L., Zhou Z., Greenberg M.E. et al. Methyl-CpG-binding protein 2 is phosphorilated by homeodomain-interacting protein kinase 2 and contributes to apoptosis. EMBO. 2009, V. 12, P. 1327-1333.

111. Sakai H., Urano T., Ookata K., Kim M., Hirai Y., Saito M. et al. MBD3 and HDAC1, two components of the NuRD complex, are localized at Aurora-A positive centrosomes in M phase. J.Biol.Chem. 2002, V. 277, P. 48714-48723.

112. Meulmeester E, Kunze M, Hsiao HH, Urlaub H, Melchior F. Mechanism and consequences for paralog-specific sumoylation of ubiquitin-specific protease 25 1 .Mol.Cell. 2008, V. 30, P. 610-619.

113. Zhang S.D., Goeres J., Zhang H., Yen T.J., Porter A.C., and Matunis M.J. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression throuth mitosis. Mol.Cell. 2008, V. 29, P. 729-741.

114. Ulrich H.D. The Fast-Growing Business of SUMO Chains. Mol.Cell. 2008, V. 32, P. 301-305.

115. Fan J, Ren H, Fei E, Jia N, Ying Z, Jiang P et al. Sumoylation is critical for DJ-1 to repress p53 transcriptional activity. FEBS Lett. 2008, V. 582, P. 1151-1156.

116. Yang S.H., Sharrocks A.D. SUMO promotes HDAC-mediated transcriptional repression. Mol.Cell. 2004, V. 13, P. 611-617.

117. Uchimura Y., Ichimura T., Uwada J., Tachibana T., Sugahara S., Nakao M. et al. Involvement of SUMO modification in MBD1 and MCAF1-mediated Heterochromatin Formation. J.Biol.Chem. 2006, V. 281, P. 23180-23190.

118. Peter J.Park. ChlP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. 2009, V. 10, P. 669-678.

119. Johnson D.S.et.al. Genoome-wide mapping of in vivo protein-DNA interaction. Science. 2007, V. 316, P. 1497-1502.

120. Говорун В.M., Зубов В.В., Канапин А.А., Куклина И.Р., Лагарькова М.А., Прохорчук Е.Б., Скрябин К.Г., Степанова II.Г., Тараненко С.Б., and Урнов Ф.Д. Биотехнология: взгляд в будущее. Первая половина XXI века. Москва , 2008, С. 68.

121. Valuev A., Johnson S.D., Sundquist A., Medina С., Anton Е., Batzoglou S., Myers R.M., and Sindow A. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChlP-Seq data. Nature Methods. 2008, V. 5, P. 829-832.

122. Martinowich K., Hattori D., Wu H., Fouse S., Ile F., Hu Y., Fan G., and Sun Y.E. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation. Science. 2003, V. 302, P. 793-795.

123. Yoon H.G., Chan D.W., Reynolds A.B., Qin J., Wong J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Mol. Cell. 2003, V. 12, P. 723-734.

124. Jakobs A., Koehnke J., Himstedt F., Funk M., Korn В., Gastel M., and Niedenthal R. Ubc9 fusion directed SUMOylation (UFDS): a mathod to analyze function of protein SUMOylation. Nature Methods. 2007, V. 4, P. 245-250.

125. Rosas-Acosta G., Russell W.K., Deyrieux A., Russel D.H., and Wilson V.G. A universal strategy for proteomic studies of SUMO and other ubiquitin-like modifiers. Molecular and Cellular Proteomics. 2005, V. 4, P. 56-72.

126. Hay R.T. SUMO: a history of modification. Mol.Cell. 2005, V. 18, P. 1-12.

127. Lyst M.J., Nan X., and Stancheva I. Regulation of MBDl-mediated transcriptional repression by SUMO and PIAS proteins. EMBO J. 2006, P. 1-12.

128. Hernandez-Munoz I., Taghavi P., KuijI C., Neefjes J., Lohuizen M. Association of Bmil with Polycomb Bodies is dynamic and requires PRC2/EZH2 and the maintence DNA methyltransferase DNMT1. Mol.Cell Biol. 2005;25:11074-58.

Информация о работе

Жигалова, Надежда Алексеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Функциональная значимость сумоилирования метил-ДНК-связывающего белка Каизо - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы