Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Высокотехнологичные методы определения метилирования ДНК

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Высокотехнологичные методы определения метилирования ДНК"

На правах рукописи

ПЕХОВ ВАСИЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ

ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 ЯК5 2311

Москва - 2011

4843496

Работа выполнена в лаборатории геномики и эпигеномики позвоночных Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор биологических наук, Институт общей генетики РАН

Ведущая организация:

Прохорчук Егор Борисович

Брага Элеонора Александровна

Лагарькова Мария Андреевна

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится февраля 2011 г. в ^//

Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-

00

на заседании

исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

Автореферат разослан <<^>> декабря 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук ^ Воюшина Татьяна Львовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Метилирование ДНК - эпигенетический механизм, обнаруженный в геномах как прокариот, так и эукариот. Нарушения метилирования ДНК могут приводить к геномной нестабильности и нарушенной экспрессии генов. Подобные изменения в половых клетках или на ранних этапах онтогенеза способны вызвать фатальные нарушения развития. За последние четверть века многократно показано, что в раковых клетках нарушено метилирование ДНК. При этом наблюдается гипометилирование повторяющихся элементов, что приводит к нестабильности генома. Другие участки, например, Срв-островки промоторов генов-супрессоров опухолевого роста, напротив, гиперметилируются, способствуя быстрому росту раковых клеток. Кроме того, недавно установлена роль ДНК-метилирования в развитии неврологических и ряда других заболеваний, её зависимость от факторов внешней среды. В этой связи в научной и клинической практике применяется большое число методик, направленных на определение метилирования как отдельных последовательностей ДНК или конкретных СрО-динуклеотидов, так и всего генома с нуклеотидным разрешением (метилома).

В основе многих методов определения метилирования лежит обработка ДНК бисульфитом натрия, в результате которой неметилированный цитозин превращается в урацил, а 5-метилцитозин остается неизменным. Бисульфитная обработка предоставляет возможность определить степень метилирования отдельных СрО-динуклеотидов, однако, эти методы остаются трудоемкими и дорогими. После бисульфитной конвертации последовательности ДНК, по-сути, состоят из трех типов оснований, что усложняет обработку результатов. Методы другой группы, основанные на применении метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции, также имеют серьезное ограничение, т.к. зависят от наличия специфических сайтов рестрикции в анализируемой ДНК. Поэтому разработка новых информативных и достоверных методов определения метилирования ДНК остается актуальной задачей.

Сегодня все более широкое применение находят методы обогащения ДНК метилированными фракциями, что достигается путем взаимодействия с ДНК специфических белков, обладающих сродством к метилированным последовательностям. При некоторых недостатках, такой подход, тем не менее, позволяет значительно сократить объем и стоимость исследования, облегчить обработку результатов. Для связывания метилированной ДНК обычно используют антитела к 5-метилцитозину или MBD домен (methyl-CpG-binding domain) метил-ДНК связывающего белка MBD2, принадлежащего к семейству MBD - белков. Однако, известно еще одно семейство метил-ДНК-связывающих белков, включающее Каизо и Каизо-подобные белки. Поскольку эффективность связывания метилированных последовательностей белками MBD2 и Каизо различна - MBD2 обладает сродством к одиночным метилированным CpG, а Каизо - преимущественно к CpGpCpG-тетрануклеотидам - представляет интерес сравнить их с точки зрения использования для определения уровня и участков метилирования ДНК.

Белок Каизо принадлежит к семейству Каизо, которое выделяется по трем характеристикам: 1) способности связывать метилированную ДНК; 2) наличию BTB/POZ домена и 3) наличию нескольких доменов «цинковые пальцы». Три домена «цинковые пальцы» Каизо определяют его уникальные ДНК-связывающие свойства: во-первых, Каизо является метил-ДНК-связывающим белком, а, во-вторых, при определенных условиях в системе in vitro может связывать неметилированную специфическую последовательность CTGCNA. Однако, вопрос о том, какая из этих двух активностей преобладает in vivo, остается спорным. При этом внесение ясности в эту проблему интересно как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения, т.к. определит возможность применения Каизо для определения метилирования ДНК.

Цель и задачи исследования:

Цель данной работы состоит в получении и характеристике аффинного сорбента на основе домена «цинковые пальцы» белка Каизо и применении его для определения метилирования ДНК.

В связи с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Создать сорбент на основе доменов «цинковые пальцы» белка Каизо и описать его свойства в сравнении с метил-ДНК связывающим сорбентом на основе белка MBD2.

2. Применить сорбенты Каизо и MBD2 для сравнительного поиска метилированных участков эукариотического генома (на примере клеточной линии НЕК 293).

3. Определить, какая из двух активностей Каизо - метил-ДНК связывающая или CTGCNA-связывающая - является доминирующей.

4. Применить сорбент Каизо для поиска метилированных участков прокариотического генома (на примере бактерии Helicobacter pylori). Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые создан

аффинный сорбент на основе доменов цинковые пальцы метил-ДНК-связывающего белка Каизо. Сорбент Каизо обладает аффинностью к метилированной ДНК; это свойство может быть использовано для анализа метилирования ДНК. Для сорбента Каизо характерна высокая специфичность в отношении метилированных CG-богатых последовательностей генома -метилированных CpG-островков и промоторов генов. Это свойство отличает сорбент Каизо от сорбента MBD2, который обладает более широкой специфичностью, связывая последовательности с разным CG-составом и уровнем метилирования.

В работе показано, что in vitro Каизо обладает более высокой аффинностью к метилированной ДНК, чем к неметилированной последовательности CTGCNA. Этот вывод, помимо фундаментального, имеет важное практическое значение, которое заключается в том, что сорбент Каизо позволяет получать фракции ДНК, обогащенные именно метилированными последовательностями.

Сорбент Каизо может быть использован как для анализа метилирования отдельных последовательностей ДНК, так и целых геномов, в т.ч. при раковой трансформации. При этом, благодаря повышенной аффинности к CG-богатым последовательностям, сорбент Каизо представляется более предпочтительным,

чем сорбент MBD2, для анализа метилирования раковых клеток, т.к. позволяет с высокой специфичностью обнаруживать гиперметилированные CpG-островки.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 1 декабря 2010 г. Результаты настоящей работы доложены автором диссертации на 13 Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2009 г.), 14 Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2010 г.), Международной конференции «Epigenetics Europe» (Дублин, 2010 г.), III Всероссийской школе-семинаре молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на отечественных и международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка публикаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на Uj страницах машинописного текста и содержат g таблиц и oCf рисунков. Список литературы включает/j"^ источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Создание аффинных сорбентов.

Первая часть данной работы посвящена получению и характеристике сорбента на основе метил-ДНК-связывающих доменов «цинковые пальцы» белка Каизо. Для сравнения и контроля был использован сорбент на основе домена MBD, обладающий аффинностью к метилированным последовательностям (Rauch et al, 2005; Serre et al, 2010; Li et al, 2010), a также сорбент на основе домена СХХС белка CGBP, способный связываться с неметилированными CpG-динуклеотидами (Lee et al, 2001). Для получения сорбентов были использованы экспрессионные конструкции, содержащие:

1. Фрагмент гена Каизо мыши, включающий последовательность доменов «цинковые пальцы» (аминокислотные остатки 344-638) в векторе pGEX4T-l.

2. Фрагмент гена MBD2 человека, включающий последовательность домена MBD (аминокислотные остатки 150 - 411) в векторе pGEX4T-l.

3. Фрагмент гена CGBP мыши, включающий последовательность домена СХХС (аминокислотные остатки 113 -254) в векторе рЕТ23а.

Для очистки экспрессированных химерных белков, содержащих GST (у Каизо и MBD2) или 6 гистидиновых остатков (у CGBP) была проведена аффинная хроматография с использованием глутатион-сефарозы (GE Healthcare, UK) или Ni-агарозы (Qiagen), соответственно. В результате были получены три вида сорбентов: сефароза - GST - Каизо (сорбент Каизо), сефароза - GST - MBD2 (сорбент MBD2) и агароза - 6His - CGBP (сорбент CGBP) (рис. I).

Каизо MBD2 CGBP

Рисунок 1. ДДСН-ПААГ-электрофорез экспрессированных белков: А.ОЗТ-Каизо; Б. ОБТ-МЕЮ2; В. СОВР-бШэ. 10% (А.Б) или 12% (В) ПААГ. Окрашивание - Сооп^е Я250. М -маркер, 1 - культура до индукции, 2 - осадок клеток до очистки, 3 - очищенный химерный белок, аффинно-связанный с сорбентом (обозначен стрелкой).

2. Характеристика аффинных сорбентов.

2-1. Связывание сорбентами коротких фрагментов ДНК.

Для проверки ДНК-связывающих свойств полученных сорбентов были проведены опыты по связыванию ими коротких метилированных и неметилированных фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК были получены из плазмиды риС 18, содержащей СС-богатую вставку (СОИ) (Меекап еГ а1, 1989)

путем вырезания соответсвующими эндонуклеазами рестрикции (рис.2). Связывание ДНК сорбентами проводили в буфере для связывания, содержащим О,IM KCl, после чего элюировали ДНК буферами с возрастающей концентрацией соли. Чем эффективнее взаимодействие между ДНК и белком, тем более высокая концентрация соли требуется для разрушения взаимодействия. Это свойство было использовано для оценки эффективности связывания метилированной и неметилированной ДНК с сорбентами. Элюированные с сорбентов фрагменты ДНК разделяли в ДНК-электрофорезе и анализировали с помощью Саузерн-блот гибридизации.

При работе с сорбентом Каизо фракция ДНК, не связавшейся с сорбентом (О,IM KCl), была обогащена неметилированным фрагментом (рис.3). Неметилированный фрагмент элюировался с сорбента при низкой соли (0,2-0,5М) без выраженного пика. Для метилированного фрагмента был показан пик элюции, приходящийся на фракцию 0,7М KCl, а низкосолевые фракции были обеднены метилированным фрагментом (рис.3). Для сорбента MBD2 было показано, что метилированный фрагмент начинает элюироваться при более высокой соли (0,9М KCl), чем неметилированный (0,3-0,5М KCl) (рис.4). Данные, полученные для сорбента MBD2, полностью соответствовали опубликованным ранее (Rauch et al, 2005). Сорбент CGBP, полученный на основе домена СххС белка CGBP,

Pvull

Рисунок 2. Схема получения фрагментов ДНК. Неметилированный фрагмент (М-, 416 н.п.) получен обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции Pvull. Метилированный фрагмент (М+, 238 н.п.) получен обработкой in vitro метилированной плазмиды эндонуклеазами EcoRI и Pvull. Числами обозначены позиции сайтов рестрикции в векторе pUC 18 со вставкой CG11.

обладающего сродством к неметилированным CpG-динуклеотидам, связывается с неметилироваными фрагментами, которые элюируются при 0,5-0,6М KCl.

Таким образом, сорбент Каизо, подобно сорбенту на основе домена MBD, обладает большей аффинностью к метилированным фрагментам CG 11, чем к неметилированным. Сорбент CGBP, напротив, обладает сродством к неметилированным фрагментам.

А. М- М+ 0.1 0.2 0.3 0.4 0.S 0.6 0.7 0.8 0,9 IM

(1S> (¡Л)

Б.

А

ДНК до 0,2 0.4 0.6 0.8 IM

связывания Молярность KCl е буфере для эпюции м+

Рисунок 3. Связывание сорбентом Каизо фрагментов ДНК. А.Саузерн-блот (зонд - 32Р-меченные М+ и М- фрагменты). Б. График элюции фрагментов ДНК (значения получены оцифровкой Саузерн-блота и нормализацией на фракцию ДНК до связывания (1/5 исходного количества ДНК, использованной для связывания)). М- неметилированный фрагмент, 416 н.п. М+ метилированный фрагмент, 238 н.п.

2-1. Связывание сорбентами геномной ДНК.

Далее было необходимо проверить эффективность связывания полученными сорбентами геномной ДНК. Для этого была использована геномная ДНК из клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека colo320 (АТСС № CCL-220.1™). Для определения способности связывать метилированную ДНК сорбентами Каизо и MBD2 были выбраны два участка

0.2 0,4 0,6 0.8 1М

Мопярность КО е буфере Спя элюции ^ .....

Рисунок 4. Связывание сорбентом МБ02 метилированных фрагментов ДНК. Представлен график элюции фрагментов ДНК (получен так же, как и для сорбента Каизо). М-неметилированные фрагменты, М+ метилированные фрагменты.

ДНК, СО-богатые, но с разным уровнем метилирования. Известно, что СрО-островок промотора гена р 16 СОКЫ2А гиперметилирован в клеточной линии со1о320 (Пехов, 2009)\ участок СрО-островка этого гена был использован в качестве метилированной последовательности. Промотор повсеместно экспрессирующегося гена домашнего хозяйства у-актина был выбран в качестве неметилированной СС-богатой последовательности. Кроме этого, была определена эффективность связывания сорбентом Каизо последовательности СТССЫА (Каизо Связывающий Сайт; КСС); для этого был выбран промотор гена матрилизина (ММР-7), содержащий КСС. После связывания ДНК сорбентами проводили элюцию буферами с возрастающей концентрацией соли. Для определения копийности последовательностей в элюированной ДНК была использована количественная ПЦР в реальном времени. Для каждого гена (р 16, у-актин, матрилизин) была построена калибровочная кривая. Рассчитанная на ее основе копийность была нормализована на содержание ДНК в каждой фракции. Таким образом, было установлено относительное обогащение каждой фракции по той или иной последовательности.

При элюции с сорбента Каизо наблюдается обогащение по промотору р 16 для широкого диапазона фракций (от 0,3 до 0,6М), с максимальным обогащением

ДНК до связывания <1Я)

при ~ 0,6М соли (рис.5а). С увеличением количества ДНК, взятой на связывание, существенных различий в степени обогащения фракций не наблюдается (рис. 5а).

связывания

Рисунок 5. А,Б. Обогащение фракций ДНК, элюированных после связывания с сорбентом Каизо, метилированным промотором гена р16 (А) и содержащим СТССМА промотором матрилизина (Б). Разные графики соответствуют разному исходному количеству ДНК: - 15 мкг; " - 30 мкг; - 60 мкг. В. Обогащение фракций ДНК, элюированных после

связывания с сорбентом Каизо, неметилированным промотором у-актина ("*"). Для сравнения приведены данные об элюции р16 и матрилизина ("*") из А и Б. Использована геномная ДНК клеточной линии со1о 320,

Для этих же фракций обогащения по у-актину не наблюдалось, зато обогащенной оказывалась фракция не связавшейся с сорбентом ДНК (0,1М КС1) (Рис.5в). Пик обогащения промотором матрилизина наблюдался при О.ЗМ КС1 (рис.56). Стоит отметить, что концентрация соли, соотвествующая пику обогащения по матрилизину, оказалась ниже, чем для промотора р16. Это свидетельствует о меньшей эффективности связывания сорбентом последовательности СТОСИЛ в сравнении с метилированной ДНК (рис.5б,в).

Таким образом, сорбент Каизо связывает, хотя и с разной аффинностью, метилированные участки и КСС, однако, не связывает неметилированные последовательности вне контекста КСС.

Рисунок 6. Обогащение фракций ДНК, элюированных после связывания с сорбентом МЕШ2 (А) и СвВР (Б), метилированным промотором генар16 и неметилированным промотором у-актина С0-). Использована геномная ДНК клеточной линии со!о 320.

Для фракций ДНК, элюированных с сорбента MBD2, обогащение промотором р16 было около 0,9-1,1М, а промотором у-актина- при 0,1-0,ЗМ КС1 (рис.ба). Таким образом, MBD2-cop6eHT, подобно сорбенту Каизо, обладает метил-ДНК-связывающими свойствами.

Для фракций, элюированных с сорбента CGBP характерны высокая степень обогащения промотором у-актина при 0,3 - 0,5М соли и отсутствие обогащения промотором р16 (рис.66). Это свидетельствует о том, что сорбент CGBP эффективно связывает неметилированные и не связывает метилированные последовательности ДНК. Таким образом, сорбенты, с одной стороны Каизо и MBD2, и, с другой стороны, CGBP, обладают противоположной аффинностью в отношении метилированной ДНК.

3. Поиск метилированных районов генома клеточной линии НЕК293.

Следующая задача заключалась в сравнительном поиске участков связывания в геноме клеточной линии НЕК 293 (human embryonic kidney) (АТСС № CRL-1573.3™) сорбентами MBD2 и Каизо. После связывания сорбентов с геномной ДНК, сорбенты промывали буферами (содержат 0,3 и 0,7 M КС1 при работе с Каизо и MBD2, соответственно) и элюировали ДНК буферами (1 и 2 M КС1). Элюированную ДНК использовали для приготовления геномных библиотек и последующего геномного секвенирования на приборе Genome Analyzer II (Illumina). Всего для сорбентов Каизо и MBD2 было получено 19,7 и 24,2 млн. чтений длиной 36 нуклеотидов, соответственно. Анализ уникально картированных на геном человека чтений проводили с использованием программы QuEST ( Valouev et al, 2009), выявляя в геноме обогащенные чтениями участки связывания. В участке связывания можно выделить пик (или несколько пиков), что позволяет оценить геномную локализацию сайтов связывания функциональными доменами сорбентов (рис.7). Всего для сорбентов Каизо и MBD2 было идентифицировано 2424 и 16165 участков связывания, при средней длине 1199 и 308 н.п., соответственно. При этом, участок связывания MBD содержит обычно один пик, в то время как для участка связывания Каизо

характерно наличие более одного пика (рис. 7). Таким образом, при относительно небольшом числе участков связывания, в их пределах Каизо ассоциирован с ДНК более «плотно», по сравнению с МЕШ2 в своих участках. Локализованные участки связывания генома сорбентом Каизо расположены преимущественно в Срв-островках (рис.8), в то время как участки связывания МЕЮ2 - как внутри, так и вне Срв-островков.

OVU iD3S.33> |

А. ,

ишшши

1 Я I I

1590061 11595001

Участок связывания сорбентом Каизо

UCSC 0®r<es блееа or. RefSea, U" ifr-or. Genesnfc, CCDS and Соирзгат: QonottU

KgfSC-q Ger>»g

nmw>n wRHfls from oene&nk

ниийп ESTs Thar Have Been so He««

CpG-OCT'pOBOK

Б.

ecl-uess

8C131S44 ЙК096456

ice« ESTs -ЙЮ: 3 3

STS Markers on Genetic (blue) ienes Besea on RefSe«. UniProt,

Sfxf Rao.*

Участок связывания сорбентом MBD2

I ПКЧГИ frVK

S»)

CfiC uiwvts i .W) 1 i 383 B»IH " • LigfTt GruTi)

СрС-островок

Рисунок 7. Примеры типичных участков связывания генома сорбентами Каизо (А) и MBD2 (Б), представленные в интерфейсе программы Genome Browser.

Далее был проведен анализ локализации участков связывания в разных районах генома — промоторах (от -1000 н.п. до точки старта транскрипции), экзонах и интронах генов (от точки старта до точки терминации транскрипции), в З'-концах генов (от точки терминации до +1000 н.п.), а также в межгенных областях (районы, не являющиеся генами, промоторами и 3'-концами генов) (рис.

9).

Оказалось, что значительная доля участков (около 49% и 65% для Каизо и MBD2, соответственно) расположена внутри генов. Однако, основным отличием

сорбента Каизо от МВЭ2 является значительное обогащение промоторными областями участков связывания для сорбента Каизо (рис.9).

Сорбент Каизо Сорбент МВ02

Всего участков

связывания: 2424 16165

■ в Срв-островках □ вне Срв-островков

Рисунок 8. Распределение идентифицированных участков связывания в зависимости от наличия Срв-островков.

1

I 80%

ш 3

8 70% т

0

§ 60% X

н-

? 50%

1 40% х

о 30%

о>

ю 20% о

® 10% О)

? 0%

Рисунок 9. Локализация участков связывания Каизо и МЕЮ2 в различных районах генома клеточной линии НЕК293.

Поиск участков связывания, общих для двух сорбентов, показал, что такие участки локализованы преимущественно в Срв-островках (рис.10). Вне контекста СрО-островков перекрывающихся участков связывания оказалось мало, что

Распределение участков связывания сорбентов по районам генома

Промоторы

Эгеоны и интроны З-области генов Межгенные районы

[□Сорбент Каизо ■ Сорбент МВР2)

вполне согласуется с тем фактом, что участки связывания Каизо встречаются, в-основном, в Срв-островках (рис.8, 10).

в Срв-островках вне СрС-островков

И \ 168: /

■ ■■■■■/■■. , 1 213 /

503 Ц*** 4669 ¿X 9211

Каизо МВ02 Канда МНП2

Рисунок 10. Перекрывание участков связывания Каизо и МВЭ2. В областях пересечения первая цифра обозначает число участков Каизо, вторая - число участков МВ02. Различия в числе перекрывающихся участков связаны с тем, что участок связывания одного сорбента может перекрываться с несколькими участками другого сорбента.

Был проведен анализ последовательностей в участках связывания сорбентов Каизо и МЕШ2. Было проанализировано распределение СО, СвСС и КСС в областях ±50 нуклеотидов вокруг пика - эту область можно оценивать как район, содержащий сайт связывания сорбента (Ка/оиег е/ а/, 2009).

Было показано, что СО-динуклеотиды присутствуют в большинстве участков связывания Каизо (98,6%) и МВБ2 (92,6%) (рис.11). Во-вторых, СССО-тетрануклеотиды присутствуют в 77,4% участков связывания Каизо и лишь в 37,6% участков МВЭ2. Следует отметить, что в промоторных областях эти значения выше, чем в целом по геному - 84,2% и 58% для Каизо и МВЭ2, соответственно. Таким образом, сорбент Каизо в геноме связывает преимущественно Св -богатые районы - СрО -островки, промоторы генов, в то время как сорбент МВР2 - районы с меньшим содержанием цитозина и гуанина. Это заключение подтверждается и Сй-составом участков связывания -содержание Сй, в-среднем, составляет 73% и 63% для участков связывания Каизо и МВВ2, соответственно.

Для КСС не было обнаружено обогащения в случае использования сорбента Каизо относительно МВБ2, который не обладает аффинностью к данному сайту.

Так, последовательность СТОСЫА присутствует лишь в 17,3% участков связывания Каизо (±50 нуклеотидов вокруг пика); сходная величина обнаружена и в участках связывания МВБ2 (21,3%). В промоторах число участков

■ весь геном □ 3-области генов

I промоторы □ экзоны и ингроны

I межгенные районы

Рисунок 11. Представленность последовательностей Сй, СйСй, CTGCNA в участках связывания (100 пар вокруг пика) генома сорбентами Каизо и МЕЮ2.

связывания Каизо, содержащих КСС составляет 15,6%; вариации между различными районами генома незначительны (рис. 11).

Если геном человека разделить случайным образом на отрезки длиной 100 н.п., то 46,4% таких отрезков будут содержать последовательность CG, 1,77% -CGCG и 16,1% - CTGCNA. Таким образом, участки связывания генома сорбентом Каизо обогащены метилированными CG и CGCG последовательностями, но не неметилированной последовательностью CTGCNA. Это позволяет заключить, что in vitro Каизо обладает преимущественно метил-ДНК связывающей активностью.

Необходимо было определить степень метилирования цитозинов в участках связывания Каизо и МВ02-сорбентов. Для этого были проанализированы литературные данные о степени метилирования 190 промоторов генов 21 хромосомы клеточной линии НЕК293 (Zhang et al, 2009). Из 190 районов, 18

оказались перекрывающимися с участками связывания Каизо и все они имели высокую степень метилирования (80-100%). 96 районов перекрывались с участками связывания МЕЮ2, из них 40 были высокометилированы, 12 метилированы в средней степени и 44 слабометилированы. Из районов, которые оказались вне участков связывания сорбентами, свыше 70% неметилированы или слабометилированы, около 12% метилированы в средней степени и около 18% гиперметилированы. Таким образом, свойства домена МЕЮ позволяют связывать как СО-богатые, так и СО-бедные районы генома, что приводит к обнаружению большого числа участков связывания с различным содержанием СО. При этом при проведении анализа возможна ситуация, когда, происходит преципитация одиночного метилированного СрО, в непосредственной близости от которого фрагмент содержит несколько неметилированных. Очевидно, что при дальнейшем анализе этот фрагмент будет детектирован как метилированный. Свойства домена «цинковые пальцы», напротив, позволяют проводить обнаружение СО-богатых районов генома с высокой специфичностью. Эти свойства обусловливают различную специфичность сорбентов - Каизо специфичен к высокометилированным СО-богатым последовательностям, а МЕЮ2 имеет более широкую специфичность, что объясняется высокой чувствительностью. Тем не менее, несмотря на высокую специфичность Каизо к метилированным последовательностям, некоторые метилированные участки не были связаны сорбентом Каизо. Возможно, это связано с тем, что последовательность сайта связывания Каизо имеет более сложную структуру, чем тСй или тСОтСО.

При полногеномном анализе сайтов связывания экзогенных Каизо мыши и Иапю гепо в геноме клеточной линии НЕК293 с помощью ChIP-Seq ранее было установлено, что Каизо как мыши, так и Оато гепо связывают преимущественно СО-богатые последовательности, но не содержащие СТОСЫА мотивы (Ии:оу е( а], 2009). Настоящая работа, основанная на применении сорбента Каизо, полностью согласуется с этими данными. Тем не менее, нельзя однозначно утверждать, что КСС-связывающая активность Каизо не важна для развития

млекопитающих и организмов других таксономических групп. Полученные данные свидетельствуют о том, что метил-ДНК связывающая активность Каизо универсальна и распространяется на весь геном. При этом CTGCNA-связывающая активность Каизо, очевидно, связана с ограниченным числом районов генома; обогащение участков связывания этим мотивом статистически недостоверно.

Преимущественная метил-ДНК-связывающая активность сорбента Каизо также имеет и важное практическое значение. Оно заключается в том, что сорбент Каизо позволяет получать фракции ДНК, обогащенные именно метилированными последовательностями. Иными словами, аффинный сорбент Каизо может применяться для анализа метилирования ДНК генома. При этом, сорбент Каизо позволяет выявить CG-богатые высокометилированные участки генома, преимущественно CpG-островки и промоторы генов. В таком виде метод имеет некоторое сходство с такими методами анализа CG-богатых районов генома как метод ограниченного бисульфитного секвенирования (RRBS) (Meissner, 2008), рестрикционное сканирование генома (RLGS) (Smiraglia, 2007), и метод обогащения CpG-островков с помощью ПЦР (HELP) (Khulan, 2006). Однако, в сравнении с перечисленными методами, предложенный здесь подход, основанный на применении сорбента Каизо и геномного секвенирования, имеет следующие преимущества:

1. Не требуется бисульфитная обработка ДНК.

2. Возможность локализовать метилированные участки генома.

3. Относительно невысокая стоимость, т.к. сорбент Каизо обеспечивает обогащение ДНК метилированными фракциями и нет необходимости секвенировать большой объем данных.

4. Высокая специфичность в отношении CG-богатых метилированных последовательностей.

Правда, подобно другим методам, использующим обогащение, основное ограничение этого подхода связано с тем, что происходит идентификация сайтов связывания функционального домена белка (в данном случае - «цинковых пальцев» Каизо), хотя эти сайты и обогащены метилированными CG- и CGCG-

последовательностями. Кроме того, метод не позволяет проводить анализ уровня метилирования отдельных CpG, ограничиваясь геномными участками.

Метод на основе сорбента Каизо может быть использован при сравнительном анализе метилирования как отдельных последовательностей ДНК, так и целых геномов. При этом специфичность сорбента Каизо к CG-богатым метилированным последовательностям делает его применение более рациональным, чем сорбента MBD2, для анализа геномов с нарушенным метилированием CpG-островков (что часто происходит при раке).

4. Применение сорбента Каизо для поиска CpG-метилированых участков генома Helicobacter pylori.

Следующая задача заключалась в применении сорбента Каизо для поиска метилированных последовательностей генома бактерии Helicobacter pylori. Для этой цели ДНК, выделенную из штаммов бактерии, использовали для связывания с сорбентом Каизо. Анализ был проведен методом гибридизации на микроматрицах элюированной с сорбента Каизо фракции ДНК. Микроматрица содержит 1590 открытых рамок считывания (ОРС) генома Я. pylori. У использованного в работе штамма J99 Н. pylori активны две метилазы, осуществляющие перенос метальной группы на пятый углеродный атом цитозина: Нру99Ш (ОРС 1050; сайт метилирования GCGC) и Нру99Х1 (ОРС 435, сайт метилирования ACGT) (Kong et al, 2000). Таким образом, 5-метилцитозин присутствует в геноме Я. pylori в составе CpG-динуклеотидов, что обусловливает возможность их обнаружения сорбентом Каизо.

Донором метильных групп в реакции метилирования ДНК выступает S-аденозилметионин (SAM), а его предшественником в клетке является аминокислота метионин. Отдавая метальную группу, SAM превращается в S-аденозилгомоцистеин (SAH), который, в свою очередь, может превратиться в гомоцистеин, являющийся предшественником метионина. Поскольку ДНК-метилтрансферазкая реакция зависит от поступления SAM и удаления SAH, соотношение SAM/SAH принято считать «индексом метилирования», который

обозначает вероятность гипер- или гипометилирования ДНК. Поэтому было сделано предположение о возможном влиянии повышенных концентраций метионина в ростовой среде на процессы метилирования генома Н.pylori. Для проверки предположения выполнены две серии экспериментов. В первом эксперименте штаммы инкубировали в течение 48 часов на стандартной питательной среде (контроль) и на средах, дополнительно содержащих 1 и 100 мМ метионина (экспериментальные штаммы J99-1mM-48 и J99-100mM-48). Во втором эксперименте клетки Н. pylori пассировали в среде, содержащей 1 и 10 мМ метионина в течение 2 недель (экспериментальные штаммы ^9-1мМ-2нед. и J99-10мМ-2нед.). После этого определяли статус метилирования генов во всех штаммах. Предложенная система с повышенной концентрацией метионина позволяет смоделировать сравнительный анализ метилирования ДНК.

Было установлено, что с увеличением концентрации метионина увеличивается степень его воздействия: растет число как гиперметилированных генов, так и гипометилированных (Табл.1). Причем при инкубации в течение 48 ч с увеличением концентрации метионина в большей степени увеличивается число гиперметилированных генов, в то время как при 2-недельной инкубации - число гипометилированных генов. В ходе работы не обнаружено общих гиперметилированных генов при разной (48 часов и 2 недели) времени инкубации бактерий с метионином. Вероятно, это отражает различные процессы адаптации микроорганизма к метионину в разных условиях.

Полученные результаты согласуются с литературными данными о влиянии метионина на метилирование генома позвоночных. Так, увеличенное поступление метионина с пищей приводило к изменению соотношения SAM/SAH в печени крыс (Rowling et al, 2002; Regina et al, 1993), гиперметилированию некоторых генов у мышей (Tremolizzo et al, 2002), но не влияло на обще геномное метилирование ДНК (Devlin et al, 2004).

По данным, полученным в настоящей работе, добавление метионина приводит к гиперметилированию небольшого числа генов Н. pylori, 1.9 - 6.9%, в зависимости от условий. Одновременно метионин вызывает гипометилирование

Таблица 1. Влияние метионина на уровень метилирования генома Н.pylori. Показано число генов, метилирование которых изменяется в сравнении с контролем. В скобках указан процент от общего числа ОРС на ДНК-микроматрице (1590).

Экспериментальный штамм Число генов, метилирование которых увеличивается Число генов, метилирование которых уменьшается Общее число генов, на уровень метилирования которых влияет метионин

Инкубация 48 ч

J99-1mM-48 71 (4.5%) 102(6.4%) 173 (10.9%)

J99-100mM-48 109(6.9%) 107 (6.7%) 216(13.6%)

Инкубация 2 недели

,199-1мМ-2нед. 30(1.9%) 110(6.8%) 140(8.8%)

Д99-10мМ-2нед. 39 (2.5%) 264 (16.2%) 303 (19%)

ряда (до 16.2%) генов. Такое избирательное воздействие согласуется с гипотезой о влиянии метионина, выдвинутой для многоклеточных животных. Согласно этой гипотезе, влияние метионина на метилирование ДНК гено- и тканеспецифично и проявляется на отдельных этапах развития (Waterland et al, 2006).

Таким образом, используя сорбент Каизо и гибридизацию на микроматрицах, в модельной системе установлено, что метионин оказывает разнонаправленное действие на метилирование генома Н. pylori. Часть генов гиперметилируется, что потенциально ведет к повышению скорости их мутирования; часть же генов гипометилируется. Эти данные согласуются с эволюционно-генетическими особенностями Н. pylori - высокой генетической гетерогенностью и способностью к быстрой адаптации. Однако, влияние уровня метилирования генома на процессы адаптации Н. pylori требует дополнительного изучения.

выводы.

1. Создан сорбент Каизо на основе доменов цинковые пальцы белка Каизо, обладающий свойством in vitro связывать метилированные последовательности ДНК.

2. Показана возможность применения сорбента Каизо для поиска метилированных участков эукариотического генома (на примере клеточной линии НЕК293).

3. Сорбенты Каизо и MBD2 обладают разной специфичностью: Каизо избирательно связывает CG-богатые участки генома, преимущественно CpG-островки; MBD2 обладает более широкой специфичностью, связывая, районы с разным содержанием CG.

4. Белок Каизо in vitro обладает большей аффинностью к метилированной ДНК, чем к последовательности CTGCNA. Использование сорбента Каизо не приводит к обогащению ДНК последовательностями, содержащими мотив CTGCNA, при анализе клеточной линии НЕК 293.

5. Показана возможность применения сорбента Каизо для поиска метилированных участков генома бактерии (на примере Helicobacter pylori). Установлено, что повышенная концентрация метионина оказывает воздействие на метилирование генома Н. pylori.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. В.М. Пехов. A.M. Мазур, Е.Б. Прохорчук. Создание технологии на основе аффинных смол для оценки уровня метилирования ДНК позвоночных// Биотехнология - 2009 - №4 - С.40-50.

2. В. М. Пехов. Н. Ю. Краснова, А. М. Мазур, О. В. Селезнева, Е. Б. Прохорчук, К. Т. Момыналиев Метилирование CpG-динуклеотидов генома Helicobacter pylori при повышении концентрации метионина//Молекулярная биология - 2010 - Т.44 -№1 - С.170-173.

3. Пехов В.М., Чеканов H.H., Мазур A.M., Прохорчук Е.Б. Среда проживания, но не принадлежность этносу влияет на метилирование ДНК генома. - Материалы 13 Международной Пущинской Школы-конференции молодых ученых «Биология -наука 21 века».- Пущино - 2009. С.35-36

4. Пехов В.М., Чеканов H.H., Мазур A.M., Прохорчук Е.Б. Поиск дифференциально-метилированных ЦфГ-динуклеотидов у жителей города и сельской местности. Материалы 14 Международной Пущинской Школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» - Том 2 - Пущино -2010. С.170-171.

5. Pekhov V.M.. Zhenilo S.V., Prokhortchouk E.B. Application of Methyl-CpG-Binding Proteins Kaiso and MBD2 to Whole-Genome DNA Methylation Analysis -International Conference Epigenetics Europe - 14-15 September 2010 - Dublin, Ireland.

6. Пехов В.М. Использование метил-ДНК связывающих белков Каизо и MBD2 для поиска метилированных участков генома. - Материалы конференции III Всероссийской школы-семинара молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» 6-9 октября 2010 года - Белгород - 2010. С. 113-115.

Подписано в печать:

24.12.2010

Заказ № 4770 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пехов, Василий Михайлович

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1-1. Метилирование ДНК у бактерий.9*

1-1-1. Общие сведения о метилировании ДНК у бактерий.

1-1-21 Особенности метилирования ДНК Helicobacter pylori.

1-2. Метилирование ДНК у эукариот.

1-2-1. ДНК-метилтрансферазы.

1-2-2. CpG-островки.

1-2-3. Изменения в метилировании* генома* млекопитающих в онтогенезе и при раке.

1-2-41 Геномныйшмпринтинг.20

1-2-5. Дозовая компенсация Х-хромосом.

1-2-6. Гистоновые модификации.

1-2-7. Картина метилирования генома.

1-2-8. Метил-ДНК связывающие белки.

1-3. Методы определения метилирования ДНК.

1-3-1.Методы, основанные на^бисульфитной конвертация ДНК.

Применение геномного секвенирования для анализа метилирования ДНК.

Применение микроматриц для анализа метилирования ДНК.

1-3-2. Методы, основанные на расщеплении ДНК эндонуклеазами рестрикции, обладающими различной чувствительностью к метилированным последовательностям.

1-3-3. Использование белков, которые специфически связываются с метилированной ДНК.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2-1. Общие молекулярно-биологические методы.

2-1-1,Олигонуклеотид ы.

2-1-2. Получение генетических конструкций.

2-1-3. Клонирование ПЦР-продуктов.

2-1-4. Получение компетентных клеток.

2-1-5.Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК.

2-1-6. Выделение геномной ДНК из культур клеток.

2-1-7. Капиллярное секвенирование ДНК.

2-1-8. Экспрессия белков и наработка аффинных сорбентов.

2-1-9. Получение коротких фрагментов ДНК.

2-1-10. Связывание ДНК сорбентами и* гибридизация ДНК при тестировании свойств сорбентов.

2-1-114. Количественная ПЦР в реальном времени.

2-2. Геномное секвенирование.

2-2-1.Связывание ДНК сорбентами Каизо и MBD2 при приготовлении^ фракций ДНК для секвенирования:.

2-2-2.Приготовление геномных библиотек для секвенирования.

2-2-3. Обработка данных, полученных в результате декодирования! на приборе Genome Analyzer (IlIumina,CIHA).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3-1. Создание аффинных сорбентов, применяемых для- определения метилирования ДНК.79»

3-1-1. Создание конструкций, экспрессия и очистка белков.

3-1-2. Связывание аффинными сорбентами коротких метилированных и неметилированных фрагментов ДНК.

3-1-3. Связывание сорбентами геномной ДНК.

3-2. Поиск метилированных районов генома клеточной линии

НЕК293.

3-3. Применение сорбента Каизо для поиска CpG-метилированых участков генома Helicobacter pylori.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Высокотехнологичные методы определения метилирования ДНК"

Метилирование ДНК - эпигенетический механизм, обнаруженный в геномах как прокариот, так и эукариот. В ДНК прокариот обнаружены модифицированные основания М6-метиладенин, 5-метилцитозин и редкий Ж-метилцитозин, тогда как в геноме эукариот, в-основном, представлен 5-метилцитозин (1,2). У растений 5-метилцитозин встречается в составе Срв, СрНрв или СрНрН (где Н - А, Т или С) последовательностей, в то время как у позвоночных - обычно в составе СрО - динуклеотидов (3,4). Однако, 5-метилцитозин вне СрО-контекста недавно был обнаружен у млекопитающих (5). Кроме того, у млекопитающих встречается 5-гидроксиметилцитозин, являющийся, возможно, промежуточным звеном в процессе деметилирования (6). У бактерий метилирование ДНК, в первую очередь, связано с активностью систем рестрикции-модификации, позволяющей клетке идентифицировать свой генетический материал и защищать его от чужеродного (7,8). У позвоночных и растений метилирование участвует в защите генома от пролиферации элементов чужеродного происхождения (транспозоны, вирусы и др.), дозовой компенсации половых хромосом, N регуляции экспрессии генов, контроле геномного импринтинга (9). В геноме человека около 80% остатков цитозина в составе СрО динуклеотидов метилированы (10). Нарушения нормального метилирования генома происходит при раковой трансформации клеток. При этом наблюдается гипометилирование повторяющихся элементов, что приводит к нестабильности генома. Другие участки, например, Срв-островки промоторов генов-супрессоров опухолевого роста, напротив, гиперметилируются, способствуя быстрому росту раковых клеток (11). Однако, наши представления об особенностях метилирования генома остаются поверхностными. При этом объективный анализ метилирования на уровне целого генома может внести существенный вклад в развитие представлений об эпигенетической регуляции, в т.ч. при опухолеобразовании.

Существует большое количество методик для определения уровня метилирования ДНК. В основе многих из них лежит обработка ДНК бисульфитом натрия, в результате которой неметилированный цитозин превращается в урацил, а 5-метилцитозин остается неизменным. Обработанную бисульфитом ДНК далее анализируют секвенированием, метил-чувствительной ПЦР, рестрикцией и другими способами. Если необходимо провести полногеномный анализ метилирования, то используют геномное секвенирование или анализ на микроматрицах. Бисульфитная обработка предоставляет возможность определить степень метилирования отдельных CpG-динуклеотидов, однако, эти методы остаются трудоемкими и дорогими. После бисульфитной конвертации последовательности ДНК, по-сути, состоят из трех типов оснований, что усложняет обработку результатов, особенно при геномном секвенировании. Коммерчески-доступные микроматрицы компании Illumina проще в применении, но при этом самые современные из них позволяют проанализировать около 450 тысяч CpG, что составляет менее 2% от всех CpG-динуклеотидов генома человека. Методы другой группы, основанные на применении метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции, также имеют серьезное ограничение, т.к. зависят от наличия специфических сайтов рестрикции в анализируемой ДНК. Поэтому разработка новых информативных и достоверных методов определения метилирования ДНК остается актуальной задачей.

Исследователи часто используют обогащение ДНК метилированными фракциями. При некоторых недостатках, такой подход, тем не менее, позволяет значительно сократить объем и стоимость исследования, облегчить последующий анализ данных. Кроме того, обогащенная ДНК состоит из 4 типов оснований, что значительно облегчает биоинформатическую обработку. Обогащение достигается путем взаимодействия с ДНК специфических белков, обладающих свойством связывать метилированные последовательности. Для этих целей обычно используют 5-метилцитозин-иммунопреципитацию или MBD (methyl-CpG-binding domain) домен метил

ДНК связывающего белка MBD2, принадлежащего к семейству MBD -белков. Однако, известно еще одно семейство метил-ДНК-связывающих белков, включающее Каизо и Каизо-подобные белки (12). Поскольку эффективность связывания, метилированных последовательностей белками MBD2 и Каизо различна - MBD2 обладает сродством; к одиночным метилированным GpG (13), а Каизо - преимущественно к CpGpCpG-тетрануклеотидам (14) - представляет интерес, сравнить их с точки зрения применения для определения метилирования.ДНК.

Белок Каизо принадлежит к семейству Каизо, которое выделяетсяг по трем характеристикам: 1) способности связывать метилированную ДНК;, 2) наличию- BTB/POZ домена и 3) наличию нескольких доменов «цинковые пальцы». Три домена «цинковые пальцы» Каизо определяют его уникальные ДНК-связывающие свойства: во-первых, Каизо является метил-ДНК-связывающим белком (14), а, во-вторых, может связывать неметилированную специфическую последовательность- CTGCNA (15): Однако, вопрос о том, какая из этих двух активностей преобладает m v/vo, остается спорным.

Цель данной работы состоит в получении и характеристике аффинного сорбента на основе доменам «цинковые пальцы» белка Каизо и применении его для определения метилирования ДНК.

В связи с указанной целью были поставлены* следующие задачи:

1. Создать сорбент на.основе доменов «цинковые пальцы» белка Каизо и описать его свойства в< сравнении с метил-ДНК связывающим сорбентом-на основе белка MBD2.

2. Применить, сорбенты, Каизо и MBD2 для сравнительного поиска метилированных участков эукариотического генома (на. примере клеточной линии НЕК 293).

3. Определить, какая из двух активностей Каизо - метил-ДНК связывающая или GTGGNA-связывающая - является доминирующей.

4. Применить сорбент Каизо для поиска метилированных участков прокариотического генома (на примере бактерии Helicobacter pylori):

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пехов, Василий Михайлович

выводы.

1. Создан сорбент Каизо на основе доменов цинковые пальцы белка Каизо, обладающий свойством in vitro связывать метилированные последовательности ДНК.

2. Показана возможность применения сорбента Каизо для поиска метилированных участков эукариотического генома (на примере клеточной линии НЕК293).

3. Сорбенты Каизо и MBD2 обладают разной специфичностью: Каизо избирательно связывает CG-богатые участки генома, преимущественно CpG-островки; MBD2 обладает более широкой специфичностью, связывая, районы с разным содержанием CG.

4. Белок Каизо in vitro обладает большей аффинностью к метилированной ДНК, чем к последовательности CTGCNA. Использование сорбента Каизо не приводит к обогащению ДНК последовательностями, содержащими мотив CTGCNA, при анализе клеточной линии НЕК 293.

5. Показана возможность применения сорбента Каизо для поиска метилированных участков генома бактерии (на примере Helicobacter pylori). Установлено, что повышенная концентрация метионина оказывает воздействие на метилирование генома Н. pylori.

Автор выражает глубокую благодарность к. ф.-м. н. Женило С.В. за неоценимую помощь, оказанную при биоинформатической обработке результатов секвенирования.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией НИИ Физико-химической медицины ФМБА к.б.н. Момыналиеву К.Т. за помощь и содействие в работе со штаммами Helicobacter pylori, а также по анализу бактериальной ДНК на микроматрицах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. В.М. Пехов, A.M. Мазур, Е.Б. Прохорчук. Создание технологии на основе аффинных смол для оценки уровня метилирования ДНК позвоночных// Биотехнология - 2009 - №4 - С.40-50.

2. В. М. Пехов, Н. Ю. Краснова, А. М. Мазур, О. В. Селезнева, Е. Б. Прохорчук, К. Т. Момыналиев Метилирование CpG-динуклеотидов генома Helicobacter pylori при повышении концентрации метионина//Молекулярная биология - 2010 - Т.44 - №1 - С. 170-173.

3. Пехов В.М., Чеканов H.H., Мазур A.M., Прохорчук Е.Б. Среда проживания, но не принадлежность этносу влияет на метилирование ДНК генома. - Материалы 13 Международной Пущинской Школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века».- Пущино - 2009. С.35-36

4. Пехов В.М., Чеканов H.H., Мазур A.M., Прохорчук Е.Б. Поиск дифференциально-метилированных ЦфГ-динуклеотидов у жителей города и сельской местности. Материалы 14 Международной Пущинской Школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» - Том 2 - Пущино -2010. С.170-171.

5. Pekhov V.M., Zhenilo S.V., Prokhortchouk E.B. Application of Methyl-CpG-Binding Proteins Kaiso and MBD2 to Whole-Genome DNA Methylation Analysis - International Conference Epigenetics Europe - 14-15 September 2010 - Dublin, Ireland.

6. Пехов В.М. Использование метил-ДНК связывающих белков Каизо и MBD2 для поиска метилированных участков генома. - Материалы конференции III Всероссийской школы-семинара молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» 6-9 октября 2010 года-Белгород-2010. С. 113-115.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пехов, Василий Михайлович, Москва

1. Vanyushin BF, Belozersky AN, Kokurina NA, Kadirova DX. 5-methylcytosine and 6-methylamino-purine in bacterial DNA. Nature 1968;218:1066-7.

2. Ehrlich M., Wilson G, Kuo KC, Gehrke C. N4-Methylcytosine as a Minor Base in Bacterial DNA. Journal of Bacteriology 1987;169:939-43.

3. Chan SW, Henderson IR, Jacobsen SE. Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet 2005;6:351-60.

4. Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem 2005;74:481-514.

5. Lister R, Pelizzola M, Dowen RH, et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature 2009;462:315-22.

6. Kusano K, Naito T, Handa N, Kobayashi I. Restriction-modification systems as genomic parasites in competition for specific sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences 1995;92:11095-9.

7. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 2002;16:6-21.

8. Bird A. CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature 1986;321:209-13.

9. Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science 1996;274:1672-7.

10. Filion GJP, Zhenilo S, Salozhin S, et al. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Molecular and Cellular Biology 2006;26:169-81.

11. Fraga MF, Ballestar E, Montoya G, et al. The affinity of different MBD proteins for a specific methylated locus depends on their intrinsic binding prperties. Nucleic Acid Research 2003;31:1765-74.

12. Prokhortchouk A, Hendrich B, Jorgensen H, et al. The pl20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes & Development 2001;15:1613-8.

13. Daniel JM, Spring CM, Crawford HC, et al. The pl20ctn-binding partner Kaiso is a bi-modal DNA-binding protein that recognizes both a sequence-specific consensus and methylated CpG dinucleotides. Nucleic Acid Research 2002;30:2911-9.

14. Reisenauer A, Kahng LS, McCollum S, Shapiro L. Bacterial DNA methylation: a cell cycle regulator? Journal of Bacteriology 1999;181:5135-9.

15. Low DA, Weyand NJ, Mahan MJ. Roles of DNA Adenine Methylation in Regulating Bacterial Gene Expression and Virulence . Infection and Immunity 2001;69:7197-204.

16. Heithoff DM, Sinsheimer RL, Low DA, Mahan MJ. An essential role for DNA adenine methylation in bacterial virulence. Science 1999;284:967-70.

17. Suerbaum S, Michetti P. Helicobacter pylori infection. The New England Journal of Medicine 2002;347:1175-86.

18. Gressmann H., Linz В., Ghai R., et al. Gain and loss of multiple genes during the evolution of Helicobacter pylori. PlosGenetics 2005;1:419-28.

19. Момыналиев K.T., Смирнова O.B., Кудрявцева JI.B., Говорун В.М. Сравнительный геномный анализ штаммов Helicobacter pylori. Молекулярная биология 2003;37:625-37.

20. Hofreuter D, Odenbreit S, Pbls J, et al. Genetic competence in Helicobacter pylori: mechanisms and biological implications. Research in Microbiology 2000;151:487-91.

21. Aras RA, Small AJ, Ando T, Blaser M. Helicobacter pylori interstrain restriction-modifcation diversity prevents genome subversion by chromosomal DNA from competing strains. Nucleic Acids Research 2002;30:5391-7.

22. Lin L.-F., Posfai J., Roberts R.J. Comparative genomics of the restriction-modification systems in Helicobacter pylori. Proc Natl Acad Sei USA 2001;98:2740-5.

23. Kraft С, Suerbaum S. Mutation and recombination in Helicobacter pylori: mechanisms and role in generating strain diversity. International Journal of Medical Microbiology 2005;295:299-305.

24. Lindahl Т., Nyberg В. Heat-induced deamination of cytosine residues in deoxyribonucleic acid. Biochemistry 1974;13:3405-10.

25. Kong H, Lin L.-F., Porter N, et al. Functional analysis of putative restriction-modification system genes in the Helicobacter pylori J99 genome. Nucleic Acids Res 2000;28:3216-23.

26. Macintyre G, Atwood C, Cupples C. Lowering S-Adenosylmethionine Levels in Escherichia coli Modulates C-to-T Transition Mutations. Journal of Bacteriology 2001;183:921-7.

27. Момыналиев KT, Рогов СИ, Говорун ВМ. Соответствие нуклеотидов между белок-кодирующими последовательностями штаммов Helicobacter pylori. Молекулярная биология 2005;39:945-51.

28. Hata К., Okano М., Lei Н., Li I. Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice. Development 2002;129:1983-93.

29. Ehrlich M. The ICF syndrome, a DNA methyltransferase 3B deficiency and immunodeficiency disease. Clinical Immunology 2003;109:17-28.

30. Klimasauskas S, Kumar S, Roberts R, Cheng X. Hhal methyl-transferase flips its target base out of the DNA helix. Cell 1994;76:357-69.

31. Klose RJ, Bird A. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. TRENDS in Biochemical Sciences 2006;31:89-97.

32. Brenner C, Deplus R, Didelot C, et al. Мус represses transcription through recruitment of DNA methyltransferase corepressor. The EMBO Journal 2005;24:336-46.

33. Matzke MA, Birchler JA. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nature Reviews Genetics 2005;6:24-35.

34. Hamilton AJ, Baulcombe DC. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 1999;286:950-2.

35. Zhang X, Yazaki J, Sundaresan A, et al. Genome-wide High-Resolution Mapping and Functional Analysis of DNA methylation in Arabidopsis. Cell 2006;126:1-13.

36. Kawasaki H., Taira K. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature 2004;431:211-7.

37. Morris KV, Chan SW, Jacobsen SE, Looney D. Small interfering RNA-indueed transcriptional gene silencing in human cells. Science 2004;305:1289-92.

38. Ehrlich M, Gama-Sosa MA, Huang LH, et al. Amount and distribution of 5, methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.

39. Nucleic Acids Research 1982;10:2709-21.

40. Bird A, Taggart M, Frommer M, et al. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell 1985;40:91-9.

41. Lucífero D, Mann MR, Bartolomei MS, Trasler JM. Gene-specific timing and epigenetic memory in oocyte imprinting. Human Molecular Genetics 2004;13:839-49.

42. Borowczyk E, Mohan K.N., D'Aiuto L, et al. Identification of a region of the DNMT1 methyltransferase that regulates the maintenance of genomic imprints. Proceedings of the National Academy of Sciences 2009;106:20806-11.

43. Santos F, Dean W. Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction 2004;127:643-51.

44. Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic Reprogramming in Mammalian Development. Science 2001;293:1089-93.

45. Linhart HG, Lin H, Yamada Y, et al. Dnmt3b promotes tumorigenesis in vivo by gene-specific de novo methylation and transcriptional silencing. Genes Development 2007;21:3110-22.

46. Verona RI, Mann MR, Bartolomei MS. GENOMIC IMPRINTING: Intricacies of Epigenetic Regulation in Clusters. Annual Review of Cell and Developmental Biology 2003;19:237-59.

47. Bartolomei MS, Webber AL, Brunkow ME, Tilghman SM. Epigenetic mechanisms underlying the imprinting of the mouse HI 9 gene. Genes Development 1993;7:1663-73.

48. Meissner A, Mikkelsen TS, Gu H, et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature 2008;454:766-70.

49. Fitzpatrick GV, Soloway PD, Higgins MJ. Regional loss of imprinting and growth deficiency in mice with a targeted deletion of KvDMRl. Nature Genetics 2002;32:426-31.

50. Sleutels F, Zwart R, Barlow DP. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes. Nature 2002;415:810-3.

51. Mager J, Montgomery ND, de Villena FP, Magnuson T. Genome imprinting regulated by the mouse Polycomb group protein Eed. Nature Genetics 2003;33:502-7.

52. Bourchis D, Bestor TH. Origins of extreme sexual dimorphism in genomic imprinting. Cytogenetic and Genome Research 2006;113:36-40.

53. Fedoriw AM, Stein P, Svoboda P, et al. Transgenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting . Science 2004;303:238-40.

54. Wutz A, Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation. Molecular Cell 2000;5:695-705.

55. Gartler SM, Riggs AD. Mammalian X-chromosome inactivation. Annual Review of Genetics 1983;17:155-90.

56. Marks H, Chow JC, Denissov S, et al. High-resolution analysis of epigenetic changes associated with X inactivation. Genome Research 2009;19:1361-73.

57. Smith KP, Byron M, Clemson CM, Lawrence JB. Ubiquitinated proteins including uH2A on the human and mouse inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands. Chromosoma 2004; 113:324-35.

58. Chadwick BP, Willard HF. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome . Proceedings of the National Academy of Sciences 2004;101:17450-5.

59. Sado T, Fenner MH, Tan SS, et al. X inactivation in the mouse embryo deficient for Dnmtl: distinct effect of hypomethylation on imprinted and random X inactivation. Developmental Biology 2000;225:294-303.

60. Keohane AM, Belyaev ND, Lavender Js, et al. X-inactivation and H4 acetylation in embryonic stem cells. Developmental Biology 1996; 180:61830.

61. Mohandas T, Sparkes RS, Shapiro LJ. Reactivation of an inactive human X-chromosome: Evidence for X inactivation by DNA methylation. Science 1981;211:393-6.

62. Plath K, Talbot D, Hamer KM, et al. Developmentally regulated alterations in Polycomb repressive complex 1 proteins on the inactive X chromosome. The Journal of the Cell Biology 2004;167:1025-35.

63. Rastan S. Non-random X-chromosome inactivation in mouse X-autosome translocation embryos location of the inactivation centre. Journal of Embriology and Experimental Morphology 1983;78:1-22.

64. Clerc P, Avner P. Role of the region 3" to Xist exon 6 in the counting process of X-chromosome inactivation. Nature Genetics 1998;19:249-53.

65. Roth SY, Denu JM, Allis CD. Histone acetytransferases. Annual Review of Biochemistry 2001;70:81-120.

66. Shi Y, Lan F, Maison C, et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 2004;119:941-53.

67. Bernstein BE, Kamal M, Lindblad-Toh K, et al. Genomic maps and comparative analysis of histone modifications in human and mouse. Cell 2005;120:169-81.

68. Martens JH, CT Sullivan RJ, Braunschweig U, et al. The profile of repeat-associated histone lysine methylation states in the mouse epigenome. The EMBO Journal 2005;24:800-12.

69. Ringrose L, Ehret H, Paro R. Distinct contributions of histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes . Molecular Cell 2004;16:641-53.

70. Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 2006;125:315-26.

71. Vettese-Dadey M, Grant PA, Hebbes TR, et al. Acetylation of histone H4 plays a primary role in enhancing transcription factor binding to nucleosomal DNA in vitro. The EMBO Journal 1996;15:2508-18.

72. Shogren-Knaak M, Peterson CL. Switching on chromatin: mechanistic role of histone H4-K16 acetylation. Science 2006;311:844-7.

73. Dhalluin C, Carlson JE, Zeng L, et al. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature 1999;399:491-6.

74. Selker EU. Trichostatin A causes selective loss of DNA methylation in Neurospora. Proceedings of the National Academy of Sciences 1998;95:9430-5.

75. Tamaru H., Selker EU. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 2001;414:277-83.

76. Selker EU, Freitag M, Kothe GO, et al. Induction and maintenance of nonsymmetrical DNA methylation in Neurospora. Proceedings of the National Academy of Sciences 2002;99:16485-90.

77. Fischle W, Tseng BS, Dormann HL, et al. Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature 2005;438:1116-22.

78. Freitag M, Hickey PC, Khlafallah TK, et al. HP1 is essential for DNA methylation in neurospora. Molecular Cell 2004;13:427-34.

79. Lindroth AM, Shultis D, Jasencakova Z, et al. Dual histoné H3 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with CHROMOMETHYLASE3. The EMBO Journal 2004;23:4286-96.

80. Schumacher A, Kapranov P, Kaminsky Z, et al. Microarray-based DNA methylation profiling: technology and applications. Nucleic Acid Research 2006;34:528-42.

81. Zhang Y., Rohde C, Tierling S, et al. DNA methylation analysis of chromosome 21 gene promoters at single base pair and single allele resolution. PLOS Genetics 2009;5:el000438.

82. Cokus S.J., Feng S, Zhang X, et al. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature 2008;452:215-9.

83. Weber M, Hellmann I, Stadler MB, et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nature Genetics 2007;39:457-66.

84. Lister R, CTMalley R, Tonti-Filippini J, et al. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis . Cell 2008;133:523-36.

85. Zilberman D, Gehring M, Tran RK, et al. Genome-wide analysis of Arabidopsis thaliana DNA methylation uncovers an independence between methylation and transcription. Nature Genetics 2007;39:61-9.

86. Doi A., Park I.-N., Wen B., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature Genetics 2009;advance online publication: 1-5.

87. Sen G, Reuter J, Webster D, et al. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature 2010;doi:10.1038:Epub ahead of print.

88. Watt F, Molloy PL. Cytosine methylation prevents binding to DNA of a HeLa cell transcription factor required for optimal expression of the adenovirus late promoter. Genes Development 1988;2:1136-43.

89. Sarraf SA, Stancheva I. Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly. Molecular Cell 2004;15:595-605.

90. Hendrich BD, Guy J, Ramsahoye B, et al. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Development 2001; 15:710-23.

91. Hutchins AS, Mullen AC, Lee HW, et al. Gene silencing quantitatively controls the function of a developmental trans-activator. Molecular Cell 2002;10:81-91.

92. Barr H, Hermann A, Berger J, et al. Mbd2 contributes to DNA methylation-directed repression of the Xist gene . Molecular Cell Biology 2007;27:3750-7.

93. Klose RJ, Sarraf SA, Schmiedeberg L, et al. DNA binding selectivity of MeCP2 due to a requirement for A/T sequences adjacent to methyl-CpG. Molecular Cell 2005;19:667-78.

94. Horike S, Cai S, Miyano M, et al. Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nature Genetics 2005;37:31-40.

95. Chen WG, Chang Q, Lin Y, et al. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation ofMeCP2. Science 2003;302:885-9.

96. Guy J, Hendrich BD, Holmes M, et al. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nature Genetics 2001;27:322-6.

97. Cobb S, Guy J, Bird A. Reversibility of functional deficits in experimental models of Rett syndrome. Biochemical Society Transactions 2010;38:498-506.

98. Kondo E, Gu Z, Horii A, Fukushige S. The thymine DNA glycosylase MBD4 represses transcription and is associated with methylated pl6(INK4a) and hMLHl genes. Molecular Cell Biology 2005;25:4388-96.

99. Park J, Kim SW, Lyons JP, et al. Kaiso/pl20-Catenin and TCF/b-catenin Complexes Coordinately Regulate Canonical Wnt Gene Targets. Developmental Cell 2005;8:843-54.

100. Klug A, Schwabe JW. Protein motifs 5. Zinc fingers. FASEB Journal 1995;9:597-604.

101. Daniel JM, Reynolds AB. The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Molecular and Cellular Biology 1999;19:3614-23.

102. Yoon HG, Chan DW, Reynolds AB, et al. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Molecular Cell 2003;12:723-34.

103. Lopes EC, Vails E, Figueroa ME, et al. Kaiso contributes to DNA methylation-dependent silencing of tumor suppressor genes in colon cancer cell lines. Cancer Research 2008;68:7258-63.

104. De LaRosa-Velazquez I.A., Rincón-Araño H, Benitez-Bribiesca L, Recillas-Targa F. Epigenetic Regulation of the Human Retinoblastoma Tumor Suppressor Gene Promoter by CTCF. Cancer Research 2007;67:2577-85.

105. Ruzov A, Savitskaya E, Hackett J, et al. The non-methylated DNA-binding function of Kaiso is not required in early Xenopus laevis development. Development 2009;136:729-38.

106. Ogden SR, Wroblewski LE, Weydig C, et al. pl20 and Kaiso regulate Helicobacter pylori-induced expression of matrix metalloproteinase-7. Molecular Biology of the Cell 2008;19:4110-21.

107. Ruzov A, Dunican DS, Prokhortchouk A, et al. Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development. Development 2004; 131:6185-94.

108. Prokhortchouk A, Sansom O, Selfridge J, et al. Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer. Molecular Cell Biology 2006;26:199-208.

109. Esteller M. Epigenetics in cancer. The New England Journal of Medicine 2008;358:1148-59.

110. Salnikow K., Zhitkovich A. Genetic and epigenetic mechanisms in metal carcinogenesis and cocarcinogenesis: nickel, arsenic, and chromium. Chemical Research in Toxicology 2008;21:28-44.

111. Tobi EW, Lumey LH, Talens RP, et al. DNA methylation differences after exposure to prenatal famine are common and timing- and sex-specific. Human Molecular Genetics 2009;18:4046-53.

112. Urdinguio RG, Sanchez-Mut JV, Esteller M. Epigenetic mechanisms in neurological diseases: genes, syndromes, and therapies. Lancet Neurology 2009;8:1056-72.

113. Frommer M, McDonald LE, Millar DC, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues inindividual DNA strands. Proceedings of the National Academy of Sciences 1992;89:1827-31.

114. Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, et al. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation . Nucleic Acids Research 2000;28:E32.

115. Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Research 1997;25:2532-4.

116. Dupont JM, Tost J, Jammes H, Gut IG. De novo quantitative bisulfite sequencing using the pyrosequencing technology. Analytical Biochemistry 2004;333:119-27.

117. Ehrich M., Nelson M.R., Stanssens P., et al. Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base-specific cleavage and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences 2005;102:15785-90.

118. Smith E, Jones ME, Drew PA. Quantitation of DNA methylation by melt curve analysis. BMC Cancer 2009;9.

119. Gitan RS, Shi H, Chen CM, et al. Methylation-specific oligonucleotide microarray: a new potential for high-throughput methylation analysis. Genome Research 2002;12:158-64.

120. Idaghdour Y, Storey JD, Jadallah S, Gibson G. A genome-wide gene expression signature of environmental geography in leukocytes of Moroccan amazighs . PLOS Genetics 2008;4:e 1000052.

121. Zvetkova I, Apedaile A, Ramsahoye B, et al. Global hypomethylation of the genome in XX embryonic stem cells. Nature Genetics 2005;37:1274-9.

122. Ammerpohl O., Martin-Subero J.I., Richter J., et al. Hunting for the 5th base: Techniques for analyzing DNA methylation. Biochimica et Biophysica Acta 2009;1790:847-62.

123. Smiraglia DJ, K-MR, Oakes CC, et al. Restriction landmark genomic scanning (RLGS) spot identification by second generation virtual RLGS in multiple genomes with multiple enzyme combinations. BMC Genomics 2007;8.

124. Khulan B, Thompson RF, Ye K, et al. Comparative isischizomer profiling of cytosine methylation: the HELP assay. Genome Research 2006;16:1046-55.

125. Oda M, Glass, Thompson R, et al. High-resolution genome-wide cytosine methylation profiling with simultaneous copy number analysis andoptimization for limited cell numbers. Nucleic Acids Research 2009;37:3829-39.

126. Irizarry R., Ladd-Acosta C., Carvalho В., et al. Comprehensive high-throughput arrays for relative methylation (CHARM). Genome Research 2008;18:780-90.

127. Zilberman D, Gehring M, Tran RT, et al. Genome-wide analysis of Arabidopsis thaliana DNA methylation uncovers an interdependence between methylation and transcription. Nature Genetics 2007;39:61-9.

128. Rauch T, Pfeifer GP. Methylated-CpG island recovery assay: a new technique for the rapid detection of methylated-CpG islands in cancer. Laboratory Investigation 2005;85:1172-80.

129. Serre D, Lee BH, Ting AH. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Research 2010;38:391-9.

130. Li N, Ye M, Li Y, et al. Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology. Methods2010;doi: 10.1016/j.meth.2010.04.009.

131. Jiang C-L, Jin S-G, Pfeifer GP. MBD3L1 is a transcription repressor that interacts with methyl-CpG-binding protein 2 (MBD2) and components of the NuRD complex. The Journal of Biological Chemistry 2004;279:52456-64.

132. Bock C, Tomazou EM, Brinkman AB, et al. Quantitative comparision of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology 2010;28:1106-14.

133. Pomraning KR, Smith KM, Freitag M. Genome-wide high throughput analysis of DNA methylation in eukaryotes. Methods 2009;47:142-50.

134. Meehan RR, Lewis JD, McKay S, et al. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs. Cell 1989;58:499-507.

135. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование. Мир, 1984.

136. Valouev A, Johnson DS, Sundquist А, et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChlP-Seq data. Nature Methods 2008;5:829-34.

137. Lee J-H, Voo KS, Skalnick DG. Identification and Characterization of the DNA binding domain of CpG-binding protein. The Journal of Biological Chemistry 2001;276:44669-76.

138. Carlone DL, Lee J-H, Young SRL, et al. Reduced genomic cytosine methylation and defective cellular differentiation in embryonic stem cells lacking CpG binding protein. Molecular and Cellular Biology 2005;25:4881-91.

139. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. Москва: Высшая школа, 1993.i

140. Creighton ТЕ. Proteins. 2nd ed. NY: W.H.Freeman & Co, 1991.

141. Пехов B.M., Мазур A.M., Прохорчук Е.Б. Создание технологии на основе аффинных смол для оценки уровня метилирования ДНК позвоночных. Биотехнология 2009;4:40-50.

142. Lamprecht S.A., Lipkin М. Chemoprevention of colon cancer by calcium, vitamin D and folate: molecular mechanisms. Nature Reviews 2003;3:601-14.

143. Regina M., Korhonen V.P., Smith Т.К., et al. Methionine toxicity in the rat in relation to hepatic accumulation of S-adenosylmethionine: prevention by dietary stimulation of the hepatic transsulfuration pathway. Arch Biochem Biophys 1993;300:598-607.

144. Rowling MJ, McMullen MH, Chipman DC, Schalinske KL. Hepatic glycine N-methyltransferase is up-regulated by excess dietary methionine in rats. Journal of Nutrition 2002;132:2545-50.

145. Finkelstein J.D., Martin J.J. Methionine metabolism in mammals. Adaptation to methionine excess. J Biol Chem 1986;261:1582-7.

146. Tremolizzo L., Carboni G., Ruzicka W.B., et al. An epigenetic mouse model for molecular and bihavioral neuropathologies related to schizophrenia vulnerability. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:17095-100.

147. Devlin A, Arning E, Bottiglieri T, et al. Effect of Mthfr genotype on diet-induced hyperhomocysteinemia and vascular function in mice. Blood 2004;103:2624-9.

148. Waterland R. Assessing the effects of high methionine intake on DNA methylation. Journal ofNutrition 2006;136:1706S-10S.