Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо"

На правах рукописи УДК 577.21

АЙТХОЖИНА ДАНА САБИРОВНА

Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо

специальность 03.00.26- молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Институте Биологии Гена РАН Научные руководители:

Академик РАН, доктор биологических наук Георгиев Г.П. Кандидат биологических наук, Прохорчук Е.Б.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Равин Н.В.

Кандидат биологических наук Коробко И.В.

Ведущая организация:

Институт Общей Генетики им. НИ. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится 6 апреля 2006 года в 11-00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.037.01 при Институте Биологии Гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Молекулярной Биологии им. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова д. 32.

Автореферат разослан ¿марта 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

канд. фарм. наук

ДООСА_ 4S40

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

В последнее время особую важность приобретают исследования, направленные на понимание процессов, приводящих к возникновению раковых заболеваний. Одним из наиболее перспективных направлений является изучение молекулярных механизмов действия белковых факторов, связанных со злокачественным перерождением клеток.

ß-, у- катенины, а также р120- это семейство многофункциональных белков, содержащих в своем составе так называемый Arm- домен, состоящий из 10 или более Arm повторов (Peifer et al., 1994). Эти белки входят в состав мультибелковых катенин-кадхериновых комплексов, основным составляющим которых является трансмембранный гликопротеин Е-кадхерин, обеспечивающий межклеточную систему адгезии эпителиальных клеток, посредством взаимодействий своих внеклеточных доменов. Нарушение функционирования этой системы, связанное с дефектами каких- либо компонентов связывают с метастатическим фенотипом в 50% случаев карцином человека (Behrens, 1999; Yap 1998). Ключевая роль катенина р120 заключается в его способности посттрансляционно стабилизировать Е- кадхерин (Ireton et al., 2002; Davis et.al, 2003), и влиять на силу адгезии клеток, а также регулировать динамику цитоскелета (Anastasiadis et al., 2000, Grosheva et.al., 2001).

Каизо, новый член семейства BTB/POZ домен содержащих транскрипционных факторов, был впервые охарактеризован как партнер р120 в дрожжевой двугибридной системе (Daniel et.al., 1999). У позвоночных большинство BTB/POZ белков (HIC-1, Вс1-6, PLZF, ZF5, MIZ-1) являются регуляторами транскрипции и ассоциируются либо с ростом, либо подавлением роста опухолей (Chang et al., 1996, David et. al., Staller et al. 2001). Лучше всего это показано на примере Вс1-6- белка, прямо ответственного за возникновение лимфом В- клеток. Вс1-6 является транскрипционным репрессором различных генов, включая циклины D1 и D2 (Dent et al., 2002, Kusam et al., 2004).

Каизо также является репрессором транскрипции, причем Каизо специфически связывает метилированную ДНК посредством трех доменов «цинковые пальцы» СгН2 типа (Prokhorchouk et al., 2001). Как было показано мыши, с генетически удаленным геном Каизо приобретают устойчивость к возникновению рака кишечника (Prokhorchouk et al., 2006).

Исходя из выше сказанного, возрастает важность изучения взаимодействия Каизо и катенина р120, особенно если предположить существование некоторого сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поваркиоути г Timm _в.ядро, приводящего к

РОС, НАЦИОНАЛЬНАЯ,

выключению некоторых метилированных тенор. только Каизо с

СЯе---- - 1

pi20, но и Е-кадхерин могут являться компонентами такого сигнального каскада. Таким образом, становиться понятно, что изучение подобного взаимодействия способно внести существенный вклад в понимание процессов как опухолеобразования, так и функционирования нормальной соматической/ эмбриональной клетки при транслировании эпигенетической информации. Цели и задачи работы.

Основной целью настоящей работы было подтверждение взаимодействия белков Каизо и р120 и in vitro, и in vivo, а также определение того, влияет ли взаимодействие с р120 на главную охарактеризованную функцию Каизо- связывание с ДНК. В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи: -установить внутриклеточную локализацию Каизо и р120 -картировать домен Каизо, ответственный за взаимодействие с катенином р120 -определить, как фосфорилирование Каизо может влиять на связывание с р120 -определить, как взаимодействие с pi20 влияет на способность Каизо репрессировать транскрипцию

Научная новизна и практическая ценность работы.

Хотя в первой же работе, посвященной Каизо было обнаружено его взаимодействие с р120, функциональное значение этого взаимодействия до сих пор не ясно. При первичном анализе Каизо были сделаны попытки идентифицировать домен этого белка, ответственный за связывание с катенином р120 (Daniel et al 1999), и этот домен был охарактеризован как С- концевая область белка расположенная за доменом «цинковые пальцы» (там же). Однако, при исследованиях проведенных в нашей лаборатории эти данные не подтвердились. Необходимо отметить, что определение сайта связывания белков очень важно для изучения их взаимодействия. Наиболее важными данными, полученными в этой работе является то, что р120 способен ингибировать взаимодействие Каизо с ДНК, а также экранировать сигнал ядерной локализации Каизо, приводя таким образом к перемещению Каизо в цитоплазму.

Существует множество примеров того, что посттрансляционные модификации, которым подвергаются белки (в частности фосфорилирование) являются важными факторами регуляции белок- белковых взаимодействий. В представленной работе впервые показано, что Каизо фосфорилируется по остаткам серина, причем в нашем случае эта модификация напрямую не влияет на взаимодействие с р120.

Изучение клеточной локализации белка Каизо, его ядерной и цитоплазматической фракций может иметь не только фундаментальное значение. При анализе некоторых видов опухолей было показано, что клетки, расположенные по краям опухоли и

характеризующиеся ускоренными темпами роста имеют повышенный уровень ядерного Каизо по сравнению с клетками, расположенными в центре опухоли (Soubiy et al, 2005). Конечно, для более полной картины необходимо изучение большего количества опухолей, но тем не менее уже ясно, что изучение факторов, влияющих на локализацию белка Каизо в клетках может способствовать более глубокому пониманию процессов опухолеобразования. Апробация работы

Результаты работы были представлены на ПТ Международном съезде Биохимического общества (Санкт- Петербург, 2002) и на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005). Публикации

По теме работы опубликовано 4 печатные работы. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя 195 источников. Диссертация содержит 3 таблицы и 26 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Каизо и р120 находятся в разных белковых комплексах в ядерных экстрактах клеток эритролейкемии человека К562

Тот факт, что Каизо был впервые охарактеризован как белок, взаимодействующий с р120 в дрожжевой двугибридной системе является несколько неожиданным, так как при дальнейшем изучении Каизо оказалось, что он обладает четко выраженной ядерной локализацией. При этом р120 находится в основном или в местах межклеточных контактов (взаимодействуя с Е-кадхерином), или в цитоплазме (регулируя активность Rho GTPa3). Однако, некоторые авторы (van Hengel et.al., 1999, Roczniak- Ferguson, 2003) описывают в некоторых типах клеток присутствие и ядерной фракцией белка р120, например в некоторых нейрональных типах клеток характеризующихся недостатком N-кадхерина или коннексина 43, а также в карциномах и фибробластах, характеризующихся пониженным уровнем Е-кадхерина (там же), в частности в линии клеток К562.

Для того, чтобы определить, находятся ли в ядре Каизо и р120 в одном и том же комплексе, нами было проведено хроматографическое разделение белковых комплексов из ядерных экстрактов клеток хронической эритролейкемии человека (линия клеток К562). Экстракты разделялись на суперозе 6, посредством гель- фильтрации.

При анализе фракций методом Вестерн- блот анализа с использованием антител на Каизо и р120 оказалось, что эти белки находятся в разных белковых комплексах, отличающихся по молекулярной массе (рис I А,Б).

A. Буферный объем 669 кДа 443кДа

Гл'ЖШ 1 1

Э 2 46 8 10 12 1416 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 К

Б.

Э 2 4 б 8 10 12 14 16 1820 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 К

B.

' гц| «• , -

) МШшш»,,,,.

мши^шлИ • ¡г- 6iiii.ii■.;■ 1»: ;;;

Э 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48

Рис 1 Анализ фракций, полученных после гель- фильтрации на суперозе-6 ядерных белковых экстрактов из линии клеток К562

А- Вестерн-блот анализ с использованием поликлональных антител на Каизо Нанесены четные фракции, номера фракций указаны снизу, сверху указана молекулярная масса стандартов, Э- экстракт до разделения, К- рекомбинантный белок

Б- Вестерн-блот анализ с использованием поликлональных антител на р120, фракции нанесены в той же последовательности, что и на рис. 1 А.

В- эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле с использованием фракций полученных с помощью гель- фильтрации, и ДНК-пробы, содержащей консенсусный сайт связывания Каизо Нанесены все фракции, их номера указаны снизу

Для подтверждения этих результатов, с полученными фракциями также был проведен эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле. В качестве ДНК-зонда использовалась метилированная ДНК, содержащая сайт связывания Каизо. Результаты приведены на рис 1 В.

Эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов полностью подтверждает данные Вестерн- блот анализа, то есть в ядре Каизо и р120 входят в состав различных комплексов, и скорее всего не взаимодействуют между собой.

Белок Каизо фосфорилируется по остаткам серина, расположенным в ВТВ/РОЪ домене, эта модификация не влияет на связывание Каизо с р120

Каизо- белок отличающийся аномальной подвижностью при электрофорезе в акриламидном геле- при молекулярной массе в 70 кДа он мигрирует как белок массой 100

кДа, и при этом в экспериментах по Вестерн- блотгингу при покраске антителами Каизо проявляется в виде двух полос. По нашему предположению, в эукариотических клетках он подвергается пост- трансляционным модификациям. При изучении литературных данных было обнаружено, что некоторые другие белки, например продукт гена-репрессора опухоли ретинобластомы pRb также представляют собой две полосы в Вестерн- блоттинге (diCaprio et al, 1989). При этом известно, что pRb фосфорилирован по остаткам серина и треонина (Lees etal, 1992). С целью подтверждения того, что Каизо фосфорилирован, нами был проведен эксперимент по дефосфорилированиго тотальных белковых экстрактов клеток линии HeLa и иммунопреципитатов, полученных с использованием моноклональных антител, специфичных для Каизо рис. 2.

А' ИП Б' ТЛ

+ - +

ит «■»► щт^и

Рис 2. Вестерн- блот анализ. + - с обработкой Х- фосфатазой. - - без обработки Х- фосфатазой. на гель нанесены:

А- иммунопреципитация (ИП) тотальных белковых лизатов из линии клеток HeLa с использованием моноклональных антител на Каизо. Б- тотальные белковые лизаты (TJ1) из линии клеток HeLa. стрелками указаны две полосы, соответствующие Каизо

Как видно из рис.2, верхняя из двух полос, соответствующих Каизо исчезает при обработке Х- фосфатазой, и это позволяет сделать вывод о том, что Каизо подвергается фосфорилированию.

Для того, чтобы проверить, фосфорилированы ли функциональные домены Каизо, а именно ВТВ и домен цинковые пальцы белка Каизо были созданы следующие конструкции: в вектор pFLAG-CMV-2, кодирующий FLAG пептид на N- конце был внесен второй пептид- НА на С- конец. ВТВ домен (аа 2-137) и цинковые пальцы (аа 489672) были вставлены в этот вектор. Данные конструкции трансфецировались в линию клеток HeLa, тотальные клеточные лизаты иммунопреципитировались специфическими антителами на FLAG пептид, а Вестерн-блот анализ проводился с помощью антител на НА.

А. Б.

ВТВ ЦП ВТВ ЦП

+ -+ - +- +

Рис 3 Вестерн- блот анализ. + - с обработкой Х- фосфатазой. - - без обработки Х- фосфатазой на гель нанесены'

две дорожки слева (ВТВ)- трансфекция линии клеток HeLa конструкцией Flag-BTB-HA, две дорожки справа (ЦП) трансфекция конструкцией Flag-ЦП-НА А- экспозиция 1 минута. Б- экспозиция 5 минут

Так как трансфекция различных конструкций проходила с разной эффективностью, приведены две различные экспозиции, наилучшим образом отражающие результаты для конструкции «цинковые пальцы» и ВТВ. Из приведенных на рис. 3 данных видно, что в отличие от ВТВ домена цинковые пальцы не фосфорилируются.

Для определения того, какие именно аминокислотные остатки Каизо фосфорилированы, был проведен анализ фосфорилирования аминокислот (Phosphoamino Acid Analysis- РАА), результаты которого приведены на рис. 4.

Из приведенных данных видно, что Каизо в основном фосфорилирование затрагивает остатки серина.

свободная -:

метка

серии

треонин

i

тирозин

неспецифичный сигнал

Рис 4 Карта фосфорилирования аминослот- Каизо фосфорилирован по остаткам серина, пунктиром показано расположение фосфорилированных стандартов Стрелками указано положение свободной метки и неспецифического сигнала

Работа по установлению сайтов фосфорилирования ВТВ домена продолжается в нашей лаборатории.

Для того, чтобы определить, влияет ли фосфорилирование, которому подвергается Каизо на взаимодействие с р120, был проведен эксперимент по совместной трансфекции в линию клеток HeLa плазмиды pl20-GFP и одной из следующих конструкций: полноразмерный Каизо, Каизо без цинковых пальцев (аа 1-490), Каизо с цинковыми пальцами без фланкирующей С- концевой последовательности (аа 1-590), схематичное изображение использованных в эксперименте конструкций приведено на рис. 5Б. Иммунопреципитация проводилась с использованием антител на р120, половина реакции обрабатывалась Х- фосфатазой. Результаты приведены на рис. 5. В дорожках, куда наносились иммунопреципиты из клеток, в которых трансфекция не проводилась, или трансфецировался только р120, нет положительных сигналов, как и в дорожке, где для трансфекции использовалась конструкция Каизо без цинковых пальцев. То есть при делеции домена цинковые пальцы не возможно коиммуноприципитировать Каизо с катенином р!20. При этом необходимо отметить, что обработка Х- фосфатазой не влияет на образование комплекса между Каизо и р120, так как в дрожках 4 и 6 наблюдаются положительные сигналы вне зависимости от того, инкубировались ли иммунопреципитаты с Х- фосфатазой или нет. Исходя из приведенных данных, был сделан вывод, что фосфорилирование по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене не влияет на взаимодействие Каизо с катенином р120. Этот результат кратко проиллюстрирован на рис. 5.

ИП р120. Вестерн-блот Каизо ИП р 120, Вестерн-блот Каизо ИП Каизо, Вестерн-блот без добавления Х-фосфатазы Х-фосфатаза добавлена Каизо

123456123456123456

'"<••• '* f'"» " ' ф

ыт.

Б.

1ГЙШГ11

сазккз..

Isíhsí

L

~i 672

Рис. 5. Результаты эксперимента по коиммунопреципитации Каизо с р120 из линии клеток НеЬа с использованием антител на р120:

А- 1- иммунопреципитация из клеток, в которых трансфекция не проводилась, 2-иммунопреципитация из клеток где для трансфекции использовалась вода, 3- трансфекция проводилась конструкцией 120-СРР 1А, 4- при совместной трансфекции конструкциями р120<1рр 1А с полноразмерным Каизо (аа 1-672), 5- при совместной трансфекции конструкциями р12(МЗРР 1А с Каизо без цинковых пальцев (аа 1-490), 6- при совместной трансфекции р120-СРР 1А Каизо без фланкирующей С- концевой последовательности (аа 1590) Стрелками указаны иммунопреципитаты, серая стрелка показывает присутствие белка Каизо без цинковых пальцев (аа1-490)

Б- схематичное изображение результата эксперимента по коиммунопреципитации- для взаимодействия с р120 Каизо необходим домен цинковые пальцы

В дифференцированных клетках линии РС12 Каизо локализован не только в ядре

Так как в ядерных экстрактах из линии клеток К562 белки Каизо и р120 входят в состав различных комплексов, был проведен иммунофлуоресцентный анализ различных линий клеток, трансфецированных конструкцией Каизо- ОРР, для поиска тех из них, в которых у Каизо, наблюдается не только ядерная локализация. В результате этого анализа выявлено, что в зрелых клетках РС-12 (дифференцированных под действием фактора роста нервов), с так называемым «ветвящимся» фенотипом (большое количество и длина отростков) у Каизо наблюдается необычный тип клеточной локализации- он находится не только в ядре, но и в цитоплазме- рис. 6.

Зеленый- Каизо-ОРР ДАПИ

Рис 6 Клетки РС-12 имеют ветвящийся фенотип, Каизо в них распределен диффузно по всей клетке. Слева- Каизо-ОРР, справа-ДАПИ.

Таким образом, нами показано, что Каизо в клетках млекопитающих может находится не только в ядре, но и в цитоплазме.

Также необходимо отметить, что при трансфекции полноразмерного Каизо в линии клеток НеЬа и НЕК293 наблюдается незначительное количество (около 5% от общего количества белка) Каизо в цитоплазме, причем при трансфекции конструкции Каизо не содержащей ВТВ/РОг домена эта цитоплазматическая фракция полностью исчезает, и весь белок локализуется в ядре (данные не приведены). Клеточная локализация Каизо регулируется ингибитором №-кВ (1кВ)

Недавно было показано (Уооп et.aU, 2003), что в линии клеток НеЬа Каизо является частью высокомолекулярного Ы-СоЯ комплекса (размером до 2 МДа), в состав

которого также входят HDAC3, TLB1, TLBR1 и другие белки Причем Каизо взаимодействует напрямую с N-CoR, а не субъединицами, входящими в состав комплекса, посредством N- концевого BTB/POZ домена. В линии клеток HeLa Каизо является стехиометрическим компонентом комплекса N-CoR и способен привлекать этот комплекс к промоторной области гена МТА2, причем этот эффект зависит от статуса метилирования ДНК.

В последнее время появилось несколько работ, посвященных изучению клеточной локализации N-CoR. Например, было показано (Espinosa et.al, 2002, 2003), что сигнальные пути NF-kB и Notch, являющихся регуляторами множества клеточных процессов контролируются, в частности, и посредством ядерно-цитоплазматического транспорта N-CoR. В частности, так как было показано что различные стимулы, стабилизирующие цитоплазматическую фракцию р65 вызывают цитоплазматическую локализацию N-CoR, было решено исследовать влияние устойчивой к деградации мутированной формы ПсВа на клеточную локализацию Каизо. Так как Каизо входит в состав N-CoR, мы ожидали, что при экспрессии стабильной формы ингибитора NF-kB Каизо также будет локализован в цитоплазме.

Результаты эксперимента по трансфекции линии клеток HeLa конструкциями Каизо-GFP и DcBa-dsRED (вектор pDsRedl-Nl, Clontech), а также по их совместной трансфекции приведены на рис.7, причем необходимо отметить, что последовательность IkBa несла точечные мутации Ser32—>А1а, Ser36—>А1а (обеспечивают устойчивость к деградации, подробнее описано в Smirnov et al.,). А. Зеленый- Каизо Красный- IkB ДАПИ

в.

Рис 7 Результаты эксперимента по трансфекции линии клеток НеЬа следующими конструкциями:

А- конструкцией Каизо- ОРР Белок Каизо преимущественно локализован в ядре Б- конструкцией ИсВос-скКЕО Белок 1кВа локализуется в цитоплазме.

В- совместно конструкциями, экспрессирующими Каизо-ОРР и 1кВос-скЯЕО Белок Каизо локализуется в цитоплазме

Г- то же, что и в В. Белок Каизо распределен по всей клетке

Как видно из приведенных данных, конструкция полноразмерный Каизо-ОРР имеет преимущественно ядерную локализацию, а мутированный 1кВа локализован в цитоплазме. При совместной трансфекции клеток этими конструкциями наблюдалось два типа клеток: только цитоплазматический Каизо (таких клеток было 61%) и Каизо, диффузно распределенный по всей клетке (39%.)

Эти результаты показывают, что Каизо может находиться в цитоплазме, не только в определенном типе клеюк, но и менять свою клеточную локализацию под действием некоторых факторов.

Характеристика сигнала ядерной локализации белка Каизо

В большинстве типов клеток Каизо находится в ядре, и так как его молекулярная масса превышает 50кДа, он не может проникать в ядро с помощью пассивной диффузии через ядерную пору Исходя из этого, мы предположили, что в последовательности Каизо содержится сигнал ядерной локализации, обеспечивающий импорт белка в ядро Для нахождения сигнала ядерной локализации в векторе рРЬАв- ОРР была получена серия конструкций с делециями различных районов человеческого варианта белка Каизо. Клеточная локализация полученных белков в клетках линии НЕК293 определялась с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Результаты анализа проиллюстрированные на рис. 8, свидетельствуют о том, сигнал ядерной локализации Каизо располагается в районе аминокислотных остатков 456-476.

256

J

306

506

1

""506

"506

436 506

гн

456 506

[_n

476 506

+ + +

+ Б.

+ Зеленый-+

+

Каизо

ДАЛИ

В.

Зеленый-Каизо

ДАЛИ

Рис 8 Характеристика сигнала ядерной локализации Каизо Линия клеток НЕК293 трансфецировалась конструкциями Каизо- ОРР для поиска сигнала ядерной локализации А- Схематическое изображение конструкций, использованных для поиска сигнала ядерной локализации. Цифрами указаны начало и конец аминокислотной последовательности. + обозначает ядерную локализацию белка, - цитоплазматическую. Б- Пример ядерной локализации Каизо В- Пример цитоплазматической локализации Каизо.

Анализ ортологов Каизо показал, что сигнал ядерной локализации Каизо располагается перед доменом «цинковые пальцы», и высоко консервативен у различных организмов:

Mus musculus Xenopus laevis Homo sapiens Консенсус

^PPNKRMKVKH479 ""PNRKRMKLKH488 472MANKRMKVKH482 ---KRMK - К -

Для подтверждения функциональности охарактеризованного нами сигнала ядерной локализации в конструкцию с полноразмерным Каизо и ОРР была внесена делеция консенсусной части N1^ (аа 475-481). При трансфекции линии клеток НЕК293 указанной конструкцией наблюдалось исключение Каизо из ядер рис 9. Результаты иммунофлуоресценции говорят о том, что найденный сигнал ядерной локализации необходим для ядерного транспорта Каизо и регуляции клеточной локализации белка.

А. Зеленый -Каизо ДАГТИ

Рис 9 Линия клеток НЕК293 трансфецировалась следующими конструкциями'

А- при трансфекции конструкции Каизо без сигнала ядерной локализации белок находится в

цитоплазме

Б- при трансфекции конструкции, экспрессирующей полноразмерный Каизо белок локализован в ядре.

Таким образом. охарактеризованная последовательность является функциональным сигналом ядерной локализации.

Определение домена Каизо, ответственного за взаимодействие с р120

Для выявления домена, взаимодействующего с р120 был проведен анализ с помощью дрожжевой двугибридной системы. Так как белок Каизо является репрессором транскрипции, оптимальной системой для скрининга была выбрана Су1о1гар (Stratagene). В такой системе взаимодействие белков происходит в цитоплазме.

Конструкции, экспрессирующие различные участки Каизо были клонированы в вектор р808, а конструкция, соответствующая полноразмерному белку р120 была клонирована в вектор рМуг.

В первичном анализе было использовано 7 конструкций в векторе рвОв: полноразмерный белок Каизо (аа 1-672), а также фрагменты, содержащие домен цинковые пальцы, разной длины: аа 446-672, аа 454-672, аа 462-672, аа 471- 672, аа 446578, аа 490-578. Все короткие конструкции содержали полный домен цинковые пальцы, и различались только по длине фланкирующей С- и Ы- концевой последовательности. В результате из всех конструкций с р120 реагировали только полноразмерный белок, и самая короткая последовательность- р808- 6, рис. 10.

pSOS

PSOS 2 „1 I"

psos-б +

psos 7 ,ШМШИ.,-a l" ■ ■ 4,2+

psos-8 j=mnc=ira-f

pSOS-9 J**,,

Рис 10 Схемы конструкций, использовавшихся для поиска домена Каизо, взаимодействующего с р120 и результаты анализа по взаимодействию в дрожжевой двугибридной системе.

+ или- минус показывает рост или отсутствие роста на селективной среде в присутствии галактозы при 37°С Цифрами указано начало и конец аминокислотной последовательности

Как видно из рис. 10, конструкции 1-6 содержат участок Каизо, обеспечивающий взаимодействие с р120. Отсутствие взаимодействия для конструкций 1-5 может быть объяснено наличием в последовательности сигнала ядерной локализации, не позволяющему осуществляться взаимодействию происходящему в цитоплазме, а конструкция 6, не несущая этот сигнал, взаимодействовала с р120 даже сильнее, чем полноразмерный белок.

Объяснением того, что полноразмерная конструкция взаимодействует с р120 возможно является присутствие в цитоплазме небольшого количества такого белка, содержащего BTB/POZ домен (как в случае линий клеток HeLa и НЕК293), в то время как остальные конструкции локализуются исключительно в ядре. Для подтверждения данной гипотезы нами была создана следующая плазмида: к конструкции pSOS-1 (аа 446- 672), и ранее не взаимодействовавшей с р120 был добавлен ВТВ домен Каизо, и такая конструкция pSOS -7 дает положительный сигнал при анализе. При делеции сигнала ядерной локализации из конструкции pSOS-1, (конструкция pSOS- 8), также наблюдается взаимодействие с р120. Для более полного картирования сайта связывания нами также были проанализированы плазмиды несущие либо первые два цинковых пальца (pSOS-9, аа 490-552), либо второй и третий пальцы (pSOS- 10, аа 518-581). В результате было

показано, что для взаимодействия с р120 необходимы второй и третий домены цинковые пальцы.

Недавно было показано, что Каизо не единственный белок, осуществляющий взаимодействие с метилированной ДНК посредством цинковых пальцев С2Н2 типа, он является членом семейства метил-ДНК связывающих белков (РШоп et.aU 2006). У человека найдены 2 таких белка: 2ВТВ4 и гВТВЗЗ. У этих белков также есть несколько доменов «цинковые пальцы», три из которых гомологичны цинковым пальцам Каизо. Схема строения и анализ гомологии этих белков с Каизо приведен на рис.11. А.

СГУСГОВУУСЬТЗЬККНгаП&НЕККУЕ СКУСЕКУРРЬАЕУНТКНЕ1Ш+ГСЕНЯУСЖЛАСОКЗР1КУОРМ38Н1 СААСЕ118У\ГТС|88ЫЖН8КУНВМ1?1гКУ£ СРУСЕКУРА1АБУНТ1ШЕУИИТСЕЕК¥0рХРСИЕТРУТУУМЬКТНО1?А1 (^СтаВУ^ЬЗЗЬЕИЩОТНВИККГГГЧСНУСТШ^

Б.

Каизо гвтв4 11111 £ВТВ38

■ ВТВ/РОг ^ Глутамин-богатый домен

| Цинковые пальцы ^ Пролин- богатый домен

Рис 11 А- анализ гомологии доменов цинковые пальцы белков Каизо, 2ВТВ4 и 2ВТВ38, последовательности цинковых пальцев обведены, одинаковые аминокислотные остатки обозначены звездочками.

Б- Строение белков Каизо, 7ВТВ4 и гВТВ38 (по материалам РШоп й а1., 2006)

Так как Каизо- подобные цинковые пальцы этих белков очень схожи с цинковыми пальцами Каизо было решено проверить их в дрожжевой двугибридной системе на возможность взаимодействия с р120. Они оба не взаимодействовали с р120.

Исходя из того, что для взаимодействия с р120 необходимы второй и третий палец Каизо, а также учитывая тот факт, что 7ВТВ4 и 7ВТВЗЗ не взаимодействуют с р120, мы предполагаем, что ответственным за связывание с р120 является третий цинковый палец Каизо, как самый вырожденный, и характеризующийся наименьшим сходством последовательности в Каизо и Каизо- подобных белках.

Полученные нами результаты являются несколько неожиданными, так как домен цинковые пальцы прочно ассоциируется с ДНК- связыванием, хотя с другой стороны существуют данные, что этот домен способен принимать участие и в белок- белковых взаимодействиях (ЫишоШ е! а1,1999).

pi 20 способен маскировать сигнал ядерной локализации белка Каизо

Известно, что при высоком уровне экспрессии pi20 в клетках наблюдается «ветвящийся» фенотип (Reynolds et al, 1996), связанный с инактивацией RhoA и/или активацией Racl (Anastasiadis et al, 2001) Такой фенотип напоминает зрелые дифференцированные PC-12 клетки, поэтому было решено исследовать клеточную локализацию Каизо в таких клетках, а также влияние удаления домена цинковые пальцы, ответственного за взаимодействие с р 120 на локализацию Каизо

При совместной трансфекции с pl20-GFP в линию клеток HeLa использовались конструкции, несущие полноразмерный Каию в векторе для экспрессии в клетках эукариот pFLAG-CMV-2 или Каизо без цинковых пальцев (аа 2-490) в том же векторе (в эксперименте по иммунофлуоресценции использовались антитела на FLAG пептид (подробнее Prokhortchouk et.al., 2001)). Полноразмерный Каизо распределялся по всей клетке как и в клетках PC-12 (см. выше), а при экспрессии конструкции без цинковых пальцев, у Каизо наблюдалась четко выраженная ядерная локализация, несмотря на сохранение ветвящегося фенотипа клеток, то есть в отсутствие домена цинковые пальцы Каизо р120 терял функцию «вытягивания» Каизо в цитоплазму- рис. 12. В качестве контроля приведены результаты трансфекций только полноразмерного или Каизо без домена «цинковые пальцы». Видно, что без добавления р120 и полноразмерный Каизо, и Каизо без «цинковых пальцев» локализованы в ядре.

А. Красный-Каизо Зеленый-р 120 ДАПИ Б. Красный-Каизо ДАПИ

В. Красный- Каизо Зеленый-р120 ДАПИ Г. Красный- Каизо ДАПИ

Рис 12 В линию клеток НеЪа трансфецировались следующие конструкции:

А- при совместной трансфекции полноразмерного Каизо с р120-ОРР последний способен

вытягивать полноразмерный белок Каизо в цитоплазму.

Б- при трансфекции полноразмерного Каизо в отсутствие р!20 белок Каизо локализован в ядре.

В- при совместной трансфекции конструкции Каизо без цинковых пальцев и р120-СРР Каизо не способен взаимодействовать с р120 и имеет ядерную локализацию

Г- при трансфекции конструкции Каизо без домена «цинковые пальцы» белок локализуется в ядре.

Таким образом можно сделать вывод о том, что р120 способен экранировать сигнал ядерной локализации белка Каизо, и вызывать цитоплазматическую локализацию полноразмерного Каизо.

Влияние р120 на функциональную активность белка Каизо

Основной охарактеризованной функцией домена цинковые пальцы является связывание с ДНК. Так как взаимодействие с р120 приходится на этот же район белка, было бы логично предположить влияние р 120 на ДНК- связывающую активность Каизо. Для этого был проведен эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле. В 4

качестве пробы использовалась полностью метилированная радиоактивно меченная проба, содержащая консенсусный сайт связывания Каизо: 5'-CAGCAGCMGMGCCCAAMGCTGGGA -3', где М- метилированный цитозин, подробнее в (Prokhortchouk et al., 2001) В эксперименте использовался полноразмерный рекомбинантный белок Каизо с GST, экспресированный в клетках F.Coli (кДНК полноразмерного белка была клонирована в вектор pGEX-2T вектор, белок чистился на GST- сефарозе, элюция проводилась в нативных условиях с помощью глутатиона). В эксперименте использовались наиболее распространенные изоформы р120 1А и ЗА. р120 характеризуется наличием нескольких изоформ, причем разные изоформы экспрессируются в различных типах клеток. Изоформы 1-4 возникают из-за использования 4-х разных ATG старт- кодонов, они также могут различаться наличием С-концевых А, В и С экзонов (подробнее Anastasiadis et.al, 2000). Изоформа 1 имеет N-концевой двуспиральный домен, и экспрессируется, в основном, в фибробластах. Изоформа 3 не имеет этого домена, и экспрессируется в эпителиальных клетках. Последовательности, кодирующие изоформы р120 1А и ЗА были клонированы в вектор pFASTBACl, белки (1А и ЗА совместно трансфецировались) экспрессировапись в клетках насекомых sf9, с помощью системы Bac-to Вас. В качестве контроля специфичности эффекта р 120 на ДНК- связывающую активность Каизо был проведен аналогичный эксперимент с использованием рекомбинантного белка MBD1 (получен тем же методом, что и Каизо). Результаты эксперимента по задержке ДНК- белковых комплексов в геле приведены на рис. 13. »

Количество Каизо-GST Количество MBD1-GST

А. 0,5 мкл 1мкл 2 мкл 4 мкл Б. 0,5 мкл 1мкл 2 мкл 4 мкл Кол-во р120 ^-"l ---Я --"1 ---Я Кол-во р120

Рис 13 р 120 ингибирует взаимодействие Каизо с метилированной ДНК in vitro А- эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле с использованием полноразмерного рекомбинантного Каизо, его количество указано, треугольники показывают увеличение добавляемого количества р120

Б- эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле с использованием полноразмерного рекомбинантного MBD1, его количество указано, треугольники показывают увеличение добавляемого количества р120. не- неспецифический сигнал, проба- не связавшаяся ДНК- проба

В эксперименте использовались 4 различные концентрации белков Каизо и MBD1, при увеличении концентрации белка происходит возрастание интенсивности комплекса, что говорит о специфичности При этом добавление увеличивающегося количества pi 20 никак не влияет на взаимодействие ДНК и MBD1, но практически полностью ингибирует связывание ДНК с Каизо

Наблюдаемый в эксперименте и с Каизо, и с MBD-1 неспецифический сигнал, связан с использованием экстрактов клеток s<9, так как его интенсивность увеличивается с возрастанием концентрации экстракта.

Для подтверждения полученных с помощью метода задержки ДНК- белковых комплексов в геле in vitro данных нами был проведен in vivo эксперимент с использованием конструкции, в которой репрессионный ВТВ домен Каизо был заменен активационным доменом VP16 (Каизо vpl6 без ВТВ). В этом in vivo эксперименте учитывается влияние р120 и на клеточную локализацию Каизо, и на его ДНК-связывающие свойства. Каизо является репрессором транскрипции, и подавляет уровень транскрипции метилированной матрицы по сравнению с неметилированной с 13% до 4% в MBD2 -/- клетках, но р120 сам по себе оказывает влияние на уровень транскрипции метилированной матрицы в этой системе (данные не приведены). Поэтому было решено было заменить репрессионный ВТВ домен Каизо был на С- концевую часть вирусного

регуляторного белка VP16, содержащую активационный домен (Gossen et. al, 1994) и, таким образом исследовать влияние р 120 на способность полученного белка Каизо VP16 без ВТВ активировать транскрипцию- рис. 14А. Эта конструкция трансфецировалась в линии клеток HeLa, вместе с метилированной и неметилированной репортерной конструкцией (pGL-2), в которой ген люциферазы находился под контролем промотора SV-40, и кроме того, содержалось 48 CG и 11 CGCG (подробнее в Prokhortchouk et al., 2001), также в эксперименте использовалась конструкция экспрессирующая р120. При отсутствии Каизо активность метилированной репортерной конструкции относительно неметилированной была близка к 0. При добавлении Каизо VP16 без ВТВ, уровень активности метилированного репортера достиг 15% от неметилированного, из чего можно сделать вывод, что Каизо VP16 активирует транскрипцию с метилированной плазмиды. Однако, при добавлении увеличивающегося количества конструкции, экспрессирующей р120, отношение активности метилированной матрицы к неметилированной упало до 3%-х процентов рис. В качестве контроля специфичности данного эффекта нами использовалась конструкция, содержавшая MBD домен белка MBD-1 (аа 1-72) с той же последовательностью VP16 рис. Видно, что эффект, вызываемый добавлением р120 является специфическим, рис. 14. А.

VP16

Б.

Каизо

Каизо УР16 без ВТВ

1-контроль

2-Каизо УР16 без ВТВ

3- Каизо УР16 без ВТВ+ 25 нг р120

4- Каизо УР16 без ВТВ+ 50 нг р120

5- Каизо УР16 без ВТВ+ 100 нг р120

6- Каизо УР16 без ВТВ+ 200 нг р120

7- Каизо УР16 без ВТВ+ 400 нг р120

в.

■ 1-контроль

■ 2- MBD1-VP16 □ 3- MBD1-VP16+ 50 нг о120 а 4- MBD1-VP16+ 100 нг р120

Рис 14 р120 препятствует активированию транскрипции метилированной матрицы белком Каизо VP16 без ВТВ.

А- схема строения полноразмерного Каизо и Каизо VP16 без ВТВ.

Б- Измерение активности люциферазы р120 подавляет способность конструкции Каизо VP16 без ВТВ активировать транскрипцию с метилированных матриц in vivo Показана относительная активность репортерного гена люциферазы

В- Измерение активности люциферазы р120 не оказывает эффекта на способность конструкции MBD1- VP16 активировать транскрипцию с метилированных матриц in vivo

Таким образом можно предположить, что взаимодействие белка Каизо с метилированной ДНК и с катенином р120 носят взаимоисключающий характер. Уровень и клеточная локализация катенина р120 не изменены при генетическом нокауте Каизо

В нашей лаборатории впервые получена мышь, с генетически удаленным геном Каизо (Prokhortchouk et al., 2006). Для того, чтобы определить, как влияет удаление Каизо на уровень и клеточную локализацию р120 в клетках иммортализованных фибробластов, полученных из этой мыши, была проведена трансфекция конструкции Каизо-GFP в эти клетки. Результаты иммунофлуоресцентного анализа с использованием специфических к р120 моноклональных антител 6Н11, приведены на рис. 15.

А. Зеленый- Каизо-GFP Б. Красный- р120

Рис 15. Иммунофлуоресцентный анализ клеток с генетическим нокаутом Каизо, трансфецированных конструкцией Каизо- вРР А- клетки, получившие Каизо указаны стрелками.

Б- иммуннофлуоресцентное окрашивание с использованием антител на р 120

Как видно из рис.15, клетки с Каизо не отличаются по уровню р 120 от клеток, не получивших Каизо после трансфекции. Локализация р120 также не изменена. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что при геномном нокауте Каизо не происходит изменения уровня и локализации катенина р120.

В заключение хотелось бы выдвинуть гипотезу о двух различных функциях белка Каизо, выполняемых им в ядре и цитоплазме. То есть Каизо в большинстве случаев находится в ядре, где связывается с метилированными участками ДНК, и не взаимодействует с р120, но при некоторых обстоятельствах выходит в цитоплазму, где при взаимодействии с р120 выполняет неизвестную нам функцию, возможно не связанную с ДНК- связыванием.

Для подтверждения или опровержения данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования.

выводы

1. Определено, что связывание с катенином р120 препятствует взаимодействию Каизо с метилированной ДНК, и подавляет активацию транскрипции с метилированных матриц конструкцией Каизо УР16 без ВТВ.

2. Установлено, что Каизо для взаимодействия с р120 необходимы второй и третий домены цинковые пальцы С2Н2 типа.

3. Охарактеризован функциональный сигнал ядерной локализации, показано, что р!20 может маскировать этот сигнал.

4. Показано, что при трансфекции мутированной формы ПсВа в 61% клеток белок Каизо локализован в цитоплазме.

5. Определено, что Каизо является фосфобелком, и фосфорилируется по 2-м или 3-м остаткам серина, расположенным в ВТВ домене.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Prokhortchouk А, Sansom О, Selfridge J, Caballero IM, Salozhin S, Aithozhina D, Cerchietti L, Meng FG, Augenlicht LH, Mariadason JM, Hendrich B, Melnick A, Prokhortchouk E, Clarke A, Bird A. "Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer".

Mol Cell Biol. 2006 Jan; 26(1): 199-208.

2. Прохорчук A.B., Айтхожина Д.С., Саблина A.A., Рузов A.C., Прохорчук Е.Б., «Каизо- новый член семейства BTB\POZ , белков специфично связывается с метилированной ДНК», Генетика, 2001, Т37, №6, С.737-44.

3. Айтхожина Д.С., Прохорчук A.B. «Участие нового метил-ДНК связывающего белка Каизо в регуляции процессов дифференцировки высших эукариот» Ш Международный съезд Биохимического общества, Тезисы научных докладов, С.413, Санкт- Петербург, 2002

4. Айтхожина Д.С., Прохорчук A.B., Рузов A.C., Прохорчук Е.Б «Метил- ДНК связывающий репрессор Каизо взаимодействует с катенином р120» Материалы международной школы- конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», С. 53-55, Москва, 2005.

Для заметок

Для заметок

Заказ № 203/02/06 Подписано в печать 28 02.2006 Тираж 80 экз. уел п л 0,92

4 ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76, (095) 778-22-20 /) www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

lÖOG А A5AÖ

p- 4 5 4*1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Айтхожина, Дана Сабировна

Используемые сокращения.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Белки MBD семейства.

1.2. Белок Канзо и его особенности.

1.3 ДНК- связывающий домен цинковые пальцы.

1.4 р120- катенин и его особенности.

1.5 Белки NF-kB и IkB семейств: роль и регуляция.

1.6 Регуляция ядерного транспорта: NLS, NES и их регуляция.

1.7 Дрожжевая другибридная система.

2. Материалы и методы.

2.1 Методики.

2.2 Полимеразная цепная реакция.

2.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.4 Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.5 Конструкции.

2.5.1 Конструкции, использованные в экспериментах по определению клеточной локализации Каизо.

2.5.2 Конструкции для поиска сигнала ядерной локализации.

2.5.3 Конструкции для дрожжевой двугибридной системы.

2.5.4 Конструкции, использованные в экспериментах по иммунопреципитации.

2.5.5 Получение конструкций, кодирующих функциональные домены Каизо с N- концевым FLAG и С- концевым НА пептидами.

2.5.6. Получение конструкций для эксперимента no in vitro фосфорилированию

Каизо.

2.6 Работа с дрожжами.

2.6.1 Культивирование дрожжей.

2.6.2 Получение дрожжевых компетентных клеток.

2.6.3 Трансформация дрожжевых компетентных клеток.

2.6.4 Маттинг.

2.7 Выделение ядерных белковых экстрактов.

2.8 Гель- фильтрационная хроматография.

2.9 Вестерн блот- гибридизация со специфическими антителами.

2.10 Иммунопреципитация и разделение белков в денатурирующем SDS- ПААГ.

2.11 Клеточные линии и трансфекции.

2.12 Иммунофлуоресцентный анализ.

2.13 Экспрессия рекомбинантных белков.

2.14 Эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле.

2.15 Анализ статуса фосфорилирования белка Каизо.

2.15.1 Дефосфорилирование с помощью А,- фосфатазы.

2.15.2 Мечение белков 32Р in vivo.

2.15.3 Получение пептидов при помощи обработки трипсином.

2.15.4 Картирование фосфорилированных пептидов.

2.15.5 Анализ фосфорилирования аминокислот.

2.15.6 Анализ статуса фосфорилирования функциональных доменов белка

Каизо.

2.15.7. In vitro фосфорилирование Каизо.

2.16 Метилирование ДНК с помощью SssI- метилазы.

2.17 Тест на способность Каизо функционировать как метил- зависимый репрессор.

2.18 Тест на способность Каизо функционировать как метил- зависимый активатор.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1 Каизо и р120 находятся в разных белковых комплексах в ядерных экстрактах клеток эритролейкемии человека К562.

3.2 Каизо подвергается пост- трансляционной модификации.

3.3 Каизо фосфорилирован по остаткам серина.

3.4 Каизо содержит 2 или 3 сайта фосфорилирования.

3.5 Каизо фосфорилирован по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене.

3.6 МарКарКЗ киназа не фосфорилирует Каизо in vitro.

3.7 Фосфорилирование белка Каизо по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене не препятствует связыванию Каизо с р120.

3.8 В дифференцированных клетках линии РС12 Каизо распределен по всей клетке.

3.9 Клеточная локализация Каизо регулируется ингибитором NF-kB (IkB).

3.10 Характеристика сигнала ядерной локализации Каизо.

3.11 Анализ взаимодействия Каизо с р120 в дрожжевой двугибридной системе.

3.12 р120 способен маскировать сигнал ядерной локализации белка Каизо.

3.13 Влияние р120 на функциональную активность белка Каизо.

3.14 Уровень и клеточная локализация катеннна р120 не изменены при генетическом нокауте Каизо.

4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо"

Одним из ключевых направлений молекулярной биологии является исследование строения и функций белков, связанных с злокачественным перерождением клеток. Поэтому изучение взаимодействия двух белков непосредственно вовлеченных в опухолеобразование кажется вдвойне интересным.

Р", у- катенины, а также р120- это семейство многофункциональных белков, содержащих в своем составе так называемый Arm- домен, состоящий из 10 или более Arm повторов. Эти белки входят в состав мультибелковых катенин- кадхериновых комплексов, основным составляющим которых является трансмембранный гликопротеин Е-кадхерин, обеспечивающий межклеточную систему адгезии эпителиальных клеток, посредством взаимодействий своих внеклеточных доменов. Нарушение функционирования этой системы, связанное с дефектами каких- либо компонентов связывают с метастатическим фенотипом в 50% случаев карцином человека. Ключевая роль катенина р120 заключается в его способности посттрансляционно стабилизировать Е- кадхерин и влиять на силу адгезии клеток, а также регулировать динамику цитоскелета.

Каизо, новый член семейства BTB/POZ домен содержащих транскрипционных факторов, был впервые охарактеризован как партнер р120 в дрожжевой двугибридной системе. У позвоночных, большинство BTB/POZ белков (HIC-1, BcI-6, PLZF, ZF5, MIZ-1) являются регуляторами транскрипции и ассоциируются либо с ростом, либо подавлением роста опухолей. Лучше всего это показано на примере Вс1-6- белка, прямо ответственного за возникновение лимфом В- клеток. Вс1-6 является транскрипционным репрессором различных генов, включая циклины D1 и D2.

Каизо также является репрессором транскрипции, причем Каизо специфически связывает метилированную ДНК посредством трех доменов «цинковые пальцы» С2Н2 типа. Как было показано мыши, с генетически удаленным геном Каизо приобретают устойчивость к возникновению рака кишечника.

Исходя из выше сказанного, возрастает важность изучения взаимодействия Каизо и катенина р120, особенно если предположить существование некоторого сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поверхности клетки в ядро, приводящего к выключению некоторых метилированных генов. Предположительно, не только Каизо с р 120, но и Е-кадхерин могут являться компонентами такого сигнального каскада. Таким образом, становиться понятно, что изучение подобного взаимодействия способно внести существенный вклад в понимание процессов как опухолеобразования, так и функционирования нормальной соматической/ эмбриональной клетки при транслировании эпигенетической информации.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Айтхожина, Дана Сабировна

4. Выводы

1. Определено, что связывание с катенином р120 препятствует взаимодействию Каизо с метилированной ДНК, и подавляет активацию транскрипции с метилированных матриц конструкцией Каизо УР16 без ВТВ.

2. Установлено, что для взаимодействия Каизо с р120 необходимы второй и третий домены цинковые пальцы С2Н2 типа.

3. Охарактеризован функциональный сигнал ядерной локализации, показано, что р120 катенин может маскировать этот сигнал.

4. Показано, что при трансфекции мутированной формы 1кВа в 61% клеток белок Каизо локализован в цитоплазме.

5. Определено, что Каизо является фосфобелком, и фосфорилируется по 2-м или 3-м остаткам серина, расположенным в ВТВ домене.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Айтхожина, Дана Сабировна, Москва

1. Hung,M.S. et al. Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96, 11940-11945 (1999).

2. Antequera,F. & Bird,A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90, 11995-11999 (1993).

3. Plath,K., Mlynarczyk-Evans,S., Nusinow,D.A. & Panning,B. Xist RNA and the mechanism ofX chromosome inactivation. Artrtu. Rev. Genet. 36, 233-278 (2002).

4. Gribnau,J., Hochedlinger,K., Hata,K., Li,E. & Jaenisch,R. Asynchronous replication timing of imprinted loci is independent of DNA methylation, but consistent with differential subnuclear localization. Genes Dev. 17, 759-773 (2003).

5. Clark,S.J., Harrison,J. & Molloy,P.L. Spl binding is inhibited by (m)Cp(m)CpG methylation. Gene 195, 67-71 (1997).

6. Hendrich,B. & Bird,A. Identification .and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins. Mol. Cell Biol. 18, 6538-6547 (1998).

7. Ng,H.H., Jeppesen,P. & Bird,A. Active repression of methylated genes by the chromosomal protein MBD1. Mol. Cell Biol. 20, 1394-1406 (2000).

8. Fujita,N. et al. MCAF mediates MBD1-dependent transcriptional repression. Mol. Cell Biol. 23, 2834-2843 (2003).

9. Fujita,N. et al. Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interacts with the Suv39hl-HP1 heterochromatic complex for DNA methylation-based transcriptional repression. J. Biol. Chem. 278, 24132-24138 (2003).

10. Reese,B-E., Bachman,K.E., Baylin,S.B. & Rountree,M.R. The methyl-CpG binding protein MBD1 interacts with the pi 50 subunit of chromatin assembly factor 1. Mo/. Cell Biol. 23, 3226-3236 (2003).

11. Hendrich,B. et al. Genomic structure and chromosomal mapping of the murine and human Mbdl, Mbd2, Mbd3, and Mbd4 genes. Mamm. Genome 10, 906-912 (1999).

12. Zhang,Y. et al. Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation. Genes Dev. 13, 1924-1935 (1999).

13. Ng,H.H. et al. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex. Nat. Genet. 23, 58-61 (1999).

14. Hendrich,B., Guy,J., Ramsahoye,B., Wilson,V.A. & Bird,A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Dev. 15,710-723 (2001).

15. Hendrich,B., Hardeland,U., Ng,H.H., Jiricny,J. & Bird,A. The thymine glycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG sites. Nature 401, 301-304(1999).

16. Millar,C.B. et al. Enhanced CpG mutability and tumorigenesis in MBD4-deficient mice. Science 297, 403-405 (2002).

17. Johnston,M.V., Mullaney,B. & Blue,M.E. Neurobiology of Rett syndrome. J. Child Neurol. 18, 688-692 (2003).

18. Fuks,F. et al. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J. Biol. Chem. 278,4035-4040 (2003).

19. Jones,P.L. et al. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat. Genet. 19, 187-191 (1998).

20. Nan,X. et al. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature 393, 386-389 (1998).

21. Daniel,J.M. & Reynolds,A.B. The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol. Cell Biol. 19, 3614-3623 (1999).

22. Ireton,R.C. et al. A novel role for pi20 catenin in E-cadherin function. J. Cell Biol. 159, 465-476 (2002).

23. Prokhortchouk,A. et al. The pl20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes Dev. 15, 1613-1618 (2001).

24. Yoon,H.G., Chan,D.W., Reynolds,A.B., Qin,J. & Wong,J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Mol. Cell 12, 723-734 (2003).

25. Prokhortchouk,A. et al. Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer. Mol. Cell Biol. 26,199-208 (2006).

26. Ruzov,A. et al. Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development. Development 131, 6185-6194 (2004).

27. FiIion,G.J. et al. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Mol. Cell Biol. 26, 169-181 (2006).

28. Lewin B. "Genes". Oxford University Press, Oxford (1997).

29. Леднева P.K & Копытов A.M. Структурные аспекты ДНК-белкового узнавания. Отдел оперативной печати и информации Химического факультета МГУ, Москва (1999).

30. Pavletich,N.P. & Pabo,C.O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A. Science 252, 809-817 (1991).

31. Choo,Y. Recognition of DNA methylation by zinc fingers. Nat. Struct. Biol. 5, 264-265 (1998).

32. Choo,Y. & Isalan,M. Advances in zinc finger engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 411-416(2000).

33. Elrod-Erickson,M., Benson,T.E. & Pabo,C.O. High-resolution structures of variant Zif268-DNA complexes: implications for understanding zinc finger-DNA recognition. Structure. 6,451-464 (1998).

34. Hyre,D.E. & Klevit,R.E. A disorder-to-order transition coupled to DNA binding in the essential zinc-finger DNA-binding domain of yeast ADR1. J. Mol. Biol. 279, 929-943 (1998).

35. Laity,J.H., Dyson,H.J. & Wright,P.E. DNA-induced alpha-helix capping in conserved linker sequences is a determinant of binding affinity in Cys(2)-His(2) zinc fingers. J. Mol. Biol. 295, 719-727 (2000).

36. Nagaoka,M., Nomura, W., Shiraishi, Y. & Sugiura,Y. Significant effect of linker sequence on DNA recognition by multi-zinc finger protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282,1001-1007 (2001).

37. Choo,Y. & Klug,A. A role in DNA binding for the linker sequences of the first three zinc fingers ofTFIIIA. Nucleic Acids Res. 21, 3341-3346 (1993).

38. Dovat,S. et al. A common mechanism for mitotic inactivation of C2H2 zinc finger DNA-binding domains. Genes Dev. 16,2985-2990 (2002).

39. Jantz,D. & Berg,J.M. Reduction in DNA-binding affinity of Cys2His2 zinc finger proteins by linker phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 7589-7593 (2004).

40. Sekimata,M., Takahashi,A., Murakami-Sekimata,A. & Homma,Y. Involvement of a novel zinc finger protein, MIZF, in transcriptional repression by interacting with a methyl-CpG-binding protein, MBD2. J. Biol. Chem. 276, 42632-42638 (2001).

41. Sun,L., Liu,A. & Georgopoulos,K. Zinc finger-mediated protein interactions modulate Ikaros activity, a molecular control of lymphocyte development. EMBOJ. 15, 5358-5369(1996).

42. Georgopoulos,K., Winandy,S. & Avitahl,N. The role of the Ikaros gene in lymphocyte development and homeostasis. Annu. Rev. Immunol. 15, 155-176 (1997).

43. Merika,M. & Orkin,S.H. Functional synergy and physical interactions of the erythroid transcription factor GATA-1 with the Kruppel family proteins Spl and EKLF. Mol. Cell Biol. 15,2437-2447(1995).

44. Reynolds,A.B., Roesel,D.J., Kanner,S.B. & Parsons,J.T. Transformation-specific tyrosine phosphorylation of a novel cellular protein in chicken cells expressing oncogenic variants of the avian cellular src gene. Mol. Cell Biol. 9, 629-638 (1989).

45. Reynolds,A.B., Herbert,L., Cleveland,J.L., Berg,S.T. & Gaut,J.R. pl20, a novel substrate of protein tyrosine kinase receptors and of p60v-src, is related to cadherin-binding factors beta-catenin, plakoglobin and armadillo. Oncogene 7, 2439-2445 (1992).

46. Hirohashi,S. & Kanai,Y. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci. 94,575-581 (2003).

47. Angst,B.D., Marcozzi,C. & Magee,A.I. The cadherin superfamily: diversity in form and function. J. Cell Sci. 114, 629-641 (2001).

48. Chen,H., Paradies,N.E., Fedor-Chaiken,M. & Brackenbury,R. E-cadherin mediates adhesion and suppresses cell motility via distinct mechanisms. J. Cell Sci. 110,345-356 (1997).

49. Reynolds,A.B., Daniel,J.M., Mo,Y.Y., Wu,J. & Zhang,Z. The novel catenin pl20cas binds classical cadherins and induces an unusual morphological phenotype in NIH3T3 fibroblasts. Exp. Cell Res. 225, 328-337 (1996).

50. Thoreson,M.A. et al. Selective uncoupling of pl20(ctn) from E-cadherin disrupts strong adhesion. J. Cell Biol. 148, 189-202 (2000).

51. Bienz,M. beta-Catenin: a pivot between cell adhesion and Wnt signalling. Curr. Biol. 15, R64-R67 (2005).

52. Kikuchi,A. Tumor formation by genetic mutations in the components of the Wnt signaling pathway. Cancer Sci. 94, 225-229 (2003).

53. Anastasiadis,P.Z. & Reynolds,A.B. The pl20 catenin family: complex roles in adhesion, signaling and cancer .J. Cell Sci. 113, 1319-1334 (2000).

54. Reynolds,A.B. et al. Identification of a new catenin: the tyrosine kinase substrate pl20cas associates with E-cadherin complexes. Mol. Cell Biol. 14, 8333-8342 (1994).

55. Aono,S., Nakagawa,S., Reynolds,A.B. & Takeichi,M. pl20(ctn) acts as an inhibitory regulator of cadherin function in colon carcinoma cells. J. Cell Biol. 145, 551-562 (1999).

56. Ohkubo,T. & Ozawa,M. The transcription factor Snail downregulates the tight junction components independently of E-cadherin downregulation. J. Cell Sci. 117, 1675-1685 (2004).

57. Mariner,D.J. et al. Identification of Src phosphorylation sites in the catenin pl20ctn. J. Biol. Chem. 276,28006-28013 (2001).

58. Xia,X., Mariner,D.J. & Reynolds,A.B. Adhesion-associated and PKC-modulated changes in serine/threonine phosphorylation ofpl20-catenin. Biochemistry 42, 91959204 (2003).

59. Anastasiadis,P.Z. & Reynolds,A.B. Regulation of Rho GTPases by pl20-catenin. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 604-610 (2001).

60. Kim,L. & Wong,T.W. The cytoplasmic tyrosine kinase FER is associated with the catenin-like substrate ppl20 and is activated by growth factors. Mol. Cell Biol. 15, 4553-4561 (1995).

61. Piedra,J. et al. pi20 Catenin-associated Fer and Fyn tyrosine kinases regulate beta-catenin Tyr-142 phosphorylation and beta-catenin-alpha-catenin Interaction. Mol. Cell Biol. 23, 2287-2297 (2003).

62. Xu,G. et al. Continuous association of cadherin with beta-catenin requires the nonreceptor tyrosine-kinase Fer. J. Cell Sci. 117, 3207-3219 (2004).

63. Konstantoulaki,M., Kouklis,P. & Malik,A.B. Protein kinase C modifications of VE-cadherin, pi20, and beta-catenin contribute to endothelial barrier dysregulation induced by thrombin. Am. J. Physiol Lung Cell Mol. Physiol 285, L434-L442 (2003).

64. Ratcliffe,M.J., Rubin,L.L. & Staddon,J.M. Dephosphorylation of the cadherin-associated pl00/pl20 proteins in response to activation of protein kinase C in epithelial cells. J. Biol. Chem. 212, 31894-31901 (1997).

65. Ratcliffe,M.J., Smales,C. & Staddon,J.M. Dephosphorylation of the catenins pi 20 and pi00 in endothelial cells in response to inflammatory stimuli. Biochem. J. 338,471-478 (1999).

66. Wong,E.Y. et al. Vascular endothelial growth factor stimulates dephosphorylation of the catenins pl20 and plOO in endothelial cells. Biochem. J. 346, 209-216 (2000).

67. Chen,X., Kojima,S., Borisy,G.G. & Green,K.J. pl20 catenin associates with kinesin and facilitates the transport of cadherin-catenin complexes to intercellular junctions. J. Cell Biol. 163, 547-557(2003).

68. Yanagisawa,M. et al. A novel interaction between kinesin and pi20 modulates pi20 localization and function. J. Biol. Chem. 279, 9512-9521 (2004).

69. Davis,M.A., Ireton,R.C. & Reynolds,A.B. A core function for pl20-catenin in Cadherin turnover. J. Cell Biol. 163, 525-534 (2003).

70. Le,T.L., Yap,A.S. & Stow,J.L. Recycling of E-cadherin: a potential mechanism for regulating Cadherin dynamics. J. Cell Biol. 146, 219-232 (1999).

71. Le,T.L., Joseph,S.R., Yap,A.S. & Stow,J.L. Protein kinase С regulates endocytosis and recycling of E-cadherin. Am. J. Physiol Cell Physiol 283, C489-C499 (2002).

72. Xiao,K. et al. Mechanisms of VE-cadherin processing and degradation in microvascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 278,19199-19208 (2003).

73. Xiao,K. et al. Cellular levels of pi 20 catenin function as a set point for Cadherin expression levels in microvascular endothelial cells. J. Cell Biol. 163, 535-545 (2003).

74. Baki,L. et al. Presenilin-1 binds cytoplasmic epithelial Cadherin, inhibits cadherin/pl20 association, and regulates stability and function of the cadherin/catenin adhesion complex. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 98,2381-2386 (2001).

75. Fujita,Y. et al. Hakai, a c-Cbl-like protein, ubiquitinates and induces endocytosis of the E-cadherin complex. Nat. Cell Biol. 4,222-231 (2002).

76. Kintner,C. Regulation of embryonic cell adhesion by the Cadherin cytoplasmic domain. Cell 69, 225-236(1992).

77. Nieman,M.T., Kim,J.B., Johnson,K.R. & Wheelock,M J. Mechanism of extracellular domain-deleted dominant negative cadherins. J. Cell Sci. 112, 1621-1632(1999).

78. Zhu,A.J. & Watt,F.M. Expression of a dominant negative cadherin mutant inhibits proliferation and stimulates terminal differentiation of human epidermal keratinocytes. J. Cell Sci. 109, 3013-3023 (1996).

79. Hermiston,M.L. & Gordon,J.I. Inflammatory bowel disease and adenomas in mice expressing a dominant negative N-cadherin. Science 270, 1203-1207 (1995).

80. Karayiannakis,A.J. et al. Expression of catenins and E-cadherin during epithelial restitution in inflammatory bowel disease. J. Pathol. 185, 413-418 (1998).

81. Thoreson,M.A. & Reynolds,A.B. Altered expression of the catenin pi 20 in human cancer: implications for tumor progression. Differentiation 70, 583-589 (2002).

82. Birchmeier,W. & Behrens,J. Cadherin expression in carcinomas: role in the formation of cell junctions and the prevention of invasiveness. Biochim. Biophys. Acta 1198, 1126 (1994).

83. Frixen,U.H. et al. E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells. J. Cell Biol. 113, 173-185(1991).

84. Vleminckx,K. & Kemler,R. Cadherins and tissue formation: integrating adhesion and signaling. Bioessays 21, 211-220 (1999).

85. Anastasiadis,P.Z. et al. Inhibition of RhoA by pl20 catenin. Nat. Cell Biol. 2, 637-644 (2000).

86. Noren.N.K., Liu,B.P., Burridge.K. & Kreft,B. pl20 catenin regulates the actin cytoskeleton via Rho family GTPases. J. Cell Biol. 150, 567-580 (2000).

87. Grosheva,I., Shtutman,M., Elbaum,M. & Bershadsky,A.D. pl20 catenin affects cell motility via modulation of activity of Rho-family GTPases: a link between cell-cell contact formation and regulation of cell locomotion. J. Cell Sci. 114, 695-707 (2001).

88. Magie,C.R., Pinto-Santini,D. & Parkhurst,S.M. Rhol interacts with pl20ctn and alpha-catenin, and regulates cadherin-based adherens junction components in Drosophila. Development 129, 3771-3782 (2002).

89. Pettitt,J., Cox,E.A., Broadbent,I.D., Flett,A. & Hardin,J. The Caenorhabditis elegans pi20 catenin homologue, JAC-1, modulates cadherin-catenin function during epidermal morphogenesis. J. Cell Biol. 162,15-22 (2003).

90. Myster,S.H., Cavallo,R., Anderson,C.T., Fox,D.T. & Peifer,M. Drosophila pi20catenin plays a supporting role in cell adhesion but is not an essential adherens junction component. J. Cell Biol. 160, 433-449 (2003).

91. Espinosa,L., Santos,S., Ingles-Esteve,J., Munoz-Canoves,P. & Bigas,A. p65-NFkappaB synergizes with Notch to activate transcription by triggering cytoplasmic translocation of the nuclear receptor corepressor N-CoR. J. Cell Sci. 115, 1295-1303 (2002).

92. Espinosa,L., Ingles-Esteve,J., Robert-Moreno,A. & Bigas,A. IkappaBalpha and p65 regulate the cytoplasmic shuttling of nuclear corepressors: cross-talk between Notch and NFkappaB pathways. Mol. Biol. Cell 14, 491-502 (2003).

93. Bonizzi,G. & Karin,M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25, 280-288 (2004).

94. Ghosh,S., May,M.J. & Kopp,E.B. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu. Rev. Immunol. 16, 225-260 (1998).

95. Li,Q. & Verma,I.M. NF-kappaB regulation in the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2, 725-734 (2002).

96. Silverman,N. & Maniatis,T. NF-kappaB signaling pathways in mammalian and insect innate immunity. Genes Dev. 15, 2321-2342 (2001).

97. Karin,M. & Ben Neriah,Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-kappa.B activity. Annu. Rev. Immunol. 18, 621-663 (2000).

98. Hatada,E.N. et al. The ankyrin repeat domains of the NF-kappa B precursor p 105 and the protooncogene bcl-3 act as specific inhibitors of NF-kappa B DNA binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 2489-2493 (1992).

99. Huxford,T., Huang,D.B., Malek,S. & Ghosh,G. The crystal structure of the IkappaBalpha/NF-kappaB complex reveals mechanisms of NF-kappaB inactivation. Cell 95, 759-770(1998).

100. Jacobs,M.D. & Harrison,S.C. Structure of an IkappaBalpha/NF-kappaB complex. Cell 95, 749-758 (1998).

101. Malek,S., Huang,D.B., Huxford,T., Ghosh,S. & Ghosh,G. X-ray crystal structure of an IkappaBbeta x NF-kappaB p65 homodimer complex. J. Biol. Chem. 278,23094-23100 (2003).

102. Ghosh,S. & Karin,M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell 109 Suppl, S81-S96 (2002).

103. Rothwarf,D.M. & Karin,M. The NF-kappa B activation pathway: a paradigm in information transfer from membrane to nucleus. Sci. STKE. 1999, RE1 (1999).

104. Ben Neriah,Y. Regulatory functions of ubiquitination in the immune system. Nat. Immunol. 3,20-26 (2002).

105. Alkalay,I. et al. Stimulation-dependent I kappa B alpha phosphorylation marks the NF-kappa B inhibitor for degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 10599-10603 (1995).

106. DiDonato,J. et al. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its ubiquitination and degradation. Mol. Cell Biol. 16, 1295-1304 (1996).

107. Scherer,D.C., Brockman,J.A., Chen,Z., Maniatis,T. & Ballard,D.W. Signal-induced degradation of I kappa B alpha requires site-specific ubiquitination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92,11259-11263 (1995).

108. Ghosh,G., van Duyne,G., Ghosh,S. & Sigler,P.B. Structure of NF-kappa B p50 homodimer bound to a kappa B site. Nature 373, 303-310 (1995).

109. Muller,C.W., Rey,F.A., Sodeoka,M., Verdine,G.L. & Harrison,S.C. Structure of the NF-kappa B p50 homodimer bound to DNA. Nature 373, 311-317 (1995).

110. Zhong,H., May,M.J., Jimi,E. & Ghosh,S. The phosphorylation status of nuclear NF-kappa B determines its association with CBP/p300 or HDAC-1. Mol. Cell 9, 625-636 (2002).

111. Chen,L.F. & Greene,W.C. Shaping the nuclear action of NF-kappaB. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 392-401 (2004).

112. Beg,A.A., Sha,W.C„ Bronson,R.T. & Baltimore,D. Constitutive NF-kappa B activation, enhanced granulopoiesis, and neonatal lethality in I kappa B alpha-deficient mice. Genes Dev. 9,2736-2746 (1995).

113. Sha,W.C., Liou,H.C., Tuomanen,E.I. & Baltimore,D. Targeted disruption of the p50 subunit of NF-kappa B leads to multifocal defects in immune responses. Cell 80, 321-330(1995).

114. Caamano,J.H. et al. Nuclear factor (NF)-kappa B2 (pl00/p52) is required for normal splenic microarchitecture and B cell-mediated immune responses. J. Exp. Med. 187, 185-196(1998).

115. Franzoso,G. et al. Mice deficient in nuclear factor (NF)-kappa B/p52 present with defects in humoral responses, germinal center reactions, and splenic microarchitecture. J. Exp. Med. 187,147-159 (1998).

116. Paxian,S. et al. Abnormal organogenesis of Peyer's patches in mice deficient for NF-kappaBl, NF-kappaB2, and Bcl-3. Gastroenterology 122, 1853-1868 (2002).

117. Dobrzanski,P., Ryseck,R.P. & Bravo,R. Differential interactions of Rel-NF-kappa B complexes with I kappa B alpha determine pools of constitutive and inducible NF-kappa B activity. EMBOJ. 13, 4608-4616 (1994).

118. Ryseck,R.P. et al. RelB, a new Rel family transcription activator that can interact with p50-NF-kappa B. Mol. Cell Biol. 12, 674-684 (1992).

119. Dobrzanski,P., Ryseck,R.P. & Bravo,R. Both N- and C-terminal domains of RelB are required for full transactivation: role of the N-terminal leucine zipper-like motif. Mol. Cell Biol. 13,1572-1582 (1993).

120. Weih,F. et al. Multiorgan inflammation and hematopoietic abnormalities in mice with a targeted disruption of RelB, a member of the NF-kappa B/Rel family. Cell 80, 331-340 (1995).

121. Kontgen,F. et al. Mice lacking the c-rel proto-oncogene exhibit defects in lymphocyte proliferation, humoral immunity, and interleukin-2 expression. Genes Dev. 9,1965-1977(1995).

122. Klement,J.F. et al. IkappaBalpha deficiency results in a sustained NF-kappaB response and severe widespread dermatitis in mice. Mol. Cell Biol. 16, 2341-2349 (1996).

123. Kerr,L.D. et al. The proto-oncogene bcl-3 encodes an I kappa B protein. Genes Dev. 6, 2352-2363 (1992).

124. Franzoso,G. et al. Critical roles for the Bcl-3 oncoprotein in T cell-mediated immunity, splenic microarchitecture, and germinal center reactions. Immunity. 6, 479-490 (1997).

125. Schwarz,E.M., Krimpenfort,P., Berns,A. & Verma,I.M. Immunological defects in mice with a targeted disruption in Bcl-3. Genes Dev. 11, 187-197 (1997).

126. Lee,S.H. & Hannink,M. Characterization of the nuclear import and export functions of Ikappa B(epsilon). J. Biol. Chem. 277, 23358-23366 (2002).

127. Li,Z. & Nabel,G.J. A new member of the I kappaB protein family, I kappaB epsilon, inhibits RelA (p65)-mediated NF-kappaB transcription. Mol. Cell Biol. 17, 6184-6190 (1997).

128. Simeonidis,S., Liang,S., Chen,G. & Thanos,D. Cloning and functional characterization of mouse IkappaBepsilon. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 94, 14372-14377 (1997).

129. Grumont,R.J. & Gerondakis,S. Alternative splicing of RNA transcripts encoded by the murine pi05 NF-kappa B gene generates I kappa B gamma isoforms with different inhibitory activities. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 91,4367-4371 (1994).

130. Inoue,J., Kerr,L.D., Kakizuka,A. & VermaJ.M. I kappa B gamma, a 70 kd protein identical to the C-terminal half of pi 10 NF-kappa B: a new member of the I kappa B family. Cell 68, 1109-1120 (1992).

131. Marok,R. et al. Activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB in human inflamed synovial tissue. Arthritis Rheum. 39, 583-591 (1996).

132. Biswas,D.K. et al. NF-kappa B activation in human breast cancer specimens and its role in cell proliferation and apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 101, 10137-10142 (2004).

133. Gasparian,A.V. et al. The role of IKK in constitutive activation of NF-kappaB transcription factor in prostate carcinoma cells. J. Cell Sei. 115, 141-151 (2002).

134. Robe,P.A. et al. In vitro and in vivo activity of the nuclear factor-kappaB inhibitor sulfasalazine in human glioblastomas. Clin. Cancer Res. 10, 5595-5603 (2004).

135. Romieu-Mourez,R. et al. Roles of IKK kinases and protein kinase CK2 in activation of nuclear factor-kappaB in breast cancer. Cancer Res. 61, 3810-3818 (2001).

136. Greten,F.R. et al. IKKbeta links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer. Cell 118,285-296 (2004).

137. Gorlich,D. & Kutay,U. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 607-660 (1999).

138. Fried,H. & Kutay,U. Nucleocytoplasmic transport: taking an inventory. Cell Mol. Life Sci. 60, 1659-1688 (2003).

139. Jans,D.A., Xiao,C.Y. & Lam,M.H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? Bioessays 22, 532-544 (2000).

140. Mosammaparast,N. & Pemberton,L.F. Karyopherins: from nuclear-transport mediators to nuclear-function regulators. Trends Cell Biol. 14, 547-556 (2004).

141. Goldfarb,D.S., Corbett,A.H., Mason,D.A., Harreman,M.T. & Adam,S.A. Importin alpha: a multipurpose nuclear-transport receptor. Trends Cell Biol. 14, 505-514 (2004).

142. Weis,K. Regulating access to the genome: nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell 112,441-451 (2003).

143. Kohler,M. et al. Evidence for distinct substrate specificities of importin alpha family members in nuclear protein import. Mol. Cell Biol. 19, 7782-7791 (1999).

144. Mason,D.A., Fleming,R.J. & Goldfarb,D.S. Drosophila melanogaster importin alphal and alpha3 can replace importin alpha2 during spermatogenesis but not oogenesis. Genetics 161, 157-170 (2002).

145. Miyamoto,Y. et al. Differential modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272,26375-26381 (1997).

146. Sekimoto.T., Imamoto,N., Nakajima,K., Hirano,T. & Yoneda,Y. Extracellular signal-dependent nuclear import of Statl is mediated by nuclear pore-targeting complex formation withNPI-1, but not Rchl. EMBOJ. 16, 7067-7077 (1997).

147. Mosammaparast,N. et al. Nuclear import of histone H2A and H2B is mediated by a network of karyopherins. J. Cell Biol. 153, 251-262 (2001).

148. Muhlhausser,P., Muller,E.C., Otto,A. & Kutay,U. Multiple pathways contribute to nuclear import of core histones. EMBO Rep. 2, 690-696 (2001).

149. Leslie,D.M. etal. Characterization of karyopherin cargoes reveals unique mechanisms of Kap 121 p-mediated nuclear import. Mol. Cell Biol. 24, 8487-8503 (2004).

150. Senger,B. et al. Mtrl Op functions as a nuclear import receptor for the mRNA-binding protein Npl3p. EMBOJ. 17, 2196-2207 (1998).

151. Pollard,V.W. et al. A novel receptor-mediated nuclear protein import pathway. Cell 86, 985-994(1996).

152. Jakel,S. & Gorlich,D. Importin beta, transportin, RanBP5 and RanBP7 mediate nuclear import of ribosomal proteins in mammalian cells. EMBOJ. 17,4491-4502 (1998).

153. Fischer,U., Huber,J., Boelens,W.C„ Mattaj,I.W. & Luhrmann,R. The HIV-1 Rev activation domain is a nuclear export signal that accesses an export pathway used by specific cellular RNAs. Cell 82,475-483 (1995).

154. Sweitzer,T.D. & Hanover,J.A. Calmodulin activates nuclear protein import: a link between signal transduction and nuclear transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93, 14574-14579(1996).

155. Briggs,L.J. et al. The cAMP-dependent protein kinase site (Ser312) enhances dorsal nuclear import through facilitating nuclear localization sequence/importin interaction. J. Biol. Chem. 273, 22745-22752 (1998).

156. Drier,E.A., Huang,L.H. & Steward,R. Nuclear import of the Drosophila Rel protein Dorsal is regulated by phosphorylation. Genes Dev. 13, 556-568 (1999).

157. Riviere, Y., Blank,V., Kourilsky,P. & Israel,A. Processing of the precursor of NF-kappa B by the HIV-1 protease during acute infection. Nature 350, 625-626 (1991).

158. Craig,E., Zhang,Z.K., Davies,K.P. & Kalpana,G.V. A masked NES in INIl/hSNF5 mediates hCRMl-dependent nuclear export: implications for tumorigenesis. EMBOJ. 21,31-42(2002).

159. Beals,C.R., Clipstone,N.A., Ho,S.N. & Crabtree,G.R. Nuclear localization of NF-ATc by a calcineurin-dependent, cyclosporin-sensitive intramolecular interaction. Genes Dev. 11, 824-834 (1997).

160. Kaffman,A., Rank,N.M. & 0'Shea,E.K. Phosphorylation regulates association of the transcription factor Pho4 with its import receptor Psel/Kapl21. Genes Dev. 12,2673-2683(1998).

161. Ferrigno,P., Posas,F., Koepp,D., Saito,H. & Silver,P.A. Regulated nucleo/cytoplasmic exchange of HOG1 MAPK requires the importin beta homologs NMD5 and XPOl. EMBOJ. 17, 5606-5614 (1998).

162. Zhu,J. & McKeon,F. NF-AT activation requires suppression of Crml-dependent export by calcineurin. Nature 398,256-260 (1999).

163. Beg,A.A. et al. I kappa B interacts with the nuclear localization sequences of the subunits of NF-kappa B: a mechanism for cytoplasmic retention. Genes Dev. 6, 1899-1913(1992).

164. Stommel,J.M. et al. A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellular localization and p53 activity by NES masking. EMBOJ. 18, 1660-1672 (1999).

165. Saporita,A.J. et al. Identification and characterization of a ligand-regulated nuclear export signal in androgen receptor. J. Biol. Chem. 278, 41998-42005 (2003).

166. Fineberg,K. et al. Inhibition of nuclear import mediated by the Rev-arginine rich motif • by RNA molecules. Biochemistry 42, 2625-2633 (2003).

167. Chan,C.K. & Jans,D.A. Synergy of importin alpha recognition and DNA binding by the yeast transcriptional activator GAL4. FEBS Lett. 462, 221-224 (1999).

168. Chan,C.K. & Jans,D.A. Enhancement of MSH receptor- and GAL4-mediated gene transfer by switching the nuclear import pathway. Gene Ther. 8, 166-171 (2001).

169. Tago,K., Tsukahara,F., Naruse,M., Yoshioka,T. & Takano,K. Regulation of nuclear retention of glucocorticoid receptor by nuclear Hsp90. Mol. Cell Endocrinol. 213, 131138 (2004).

170. Keegan,L., Gill,G. & Ptashne,M. Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein. Science 231, 699-704 (1986).

171. Brent,R. & Ptashne,M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43, 729-736 (1985).

172. Triezenberg,S.J., Kingsbury,R.C. & McKnight,S.L. Functional dissection of VP 16, the trans-activator of herpes simplex virus immediate early gene expression. Genes Dev. 2, 718-729(1988).

173. Fields,S. & Song,0. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246 (1989).

174. Chevray,P.M. & Nathans,D. Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jun. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 5789-5793 (1992).

175. Dalton,S. & Treisman,R. Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612 (1992).

176. Stutz,F., Neville,M. & Rosbash,M. Identification of a novel nuclear pore-associated protein as a functional target of the HIV-1 Rev protein in yeast. Cell 82,495-506 (1995).

177. Chien,C.T., Bartel,P.L., Sternglanz,R. & Fields,S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88, 9578-9582 (1991).

178. Gyuris,J., Golemis,E., Chertkov,H. & Brent,R. Cdil, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791-803 (1993).

179. Vojtek,A.B., Hollenberg,S.M. & Cooper,J.A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell 74, 205-214 (1993).

180. Golemis,E.A. & Khazak,V. Alternative yeast two-hybrid systems. The interaction trap and interaction mating. Methods Mol. Biol. 63, 197-218 (1997).

181. Chevray,P.M. & Nathans,D. Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jun. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 5789-5793 (1992).

182. Bartel,P., Chien,C.T., Sternglanz,R. & Fields,S. Elimination of false positives that arise in using the two-hybrid system. Biotechniques 14, 920-924 (1993).

183. James,P., Halladay,J. & Craig,E.A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics 144, 1425-1436 (1996).

184. Gilbert,H.F. Molecular and cellular aspects of thiol-disulfide exchange. Adv. Enzymol. Relat Areas Mol. Biol. 63, 69-172 (1990).

185. Feng,S., Kapoor,T.M., Shirai,F., Combs,A.P. & Schreiber,S.L. Molecular basis for the binding of SH3 ligands with non-peptide elements identified by combinatorial synthesis. Chem. Biol. 3, 661-670 (1996).

186. Kadonaga,J.T. & Tjian,R. Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 5889-5893 (1986).

187. Singh,H., LeBowitz,J.H., Baldwin,A.S., Jr. & Sharp,P.A. Molecular cloning of an enhancer binding protein: isolation by screening of an expression library with a recognition site DNA. Cell 52, 415-423 (1988).

188. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley&Sons, Inc., New York (1992).

189. Sambrook J, Fritsch E.F. & Maniatis T. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).