Метаболом плазмы крови для диагностики и оценки риска возникновения рака простаты, рака легкого и сахарного диабета 2-го типа

Лохов, Петр Генриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболом плазмы крови для диагностики и оценки риска возникновения рака простаты, рака легкого и сахарного диабета 2-го типа
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболом плазмы крови для диагностики и оценки риска возникновения рака простаты, рака легкого и сахарного диабета 2-го типа"

На правах рукописи

Лохов Петр Генриевич

МЕТАБОЛОМ ПЛАЗМЫ КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ОЦЕНКИ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ РАКА ПРОСТАТЫ, РАКА ЛЕГКОГО И САХАРНОГО ДИАБЕТА 2-ГО ТИПА

03.01.04 — БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 7 Ш 2015

005570142

Москва — 2015

005570142

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича" (ИБМХ).

Научный консультант: профессор, доктор биологических наук, академик

Арчаков Александр Иванович

Официальные оппоненты: Гаппаров Минкаил Магомед Гаджиевич,

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт питания», главный научный сотрудник лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии

Шевченко Валерий Евгеньевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина», руководитель лаборатории онкопротеомики

Габнбов Александр Габнбович, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, заместитель директора по научной работе

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства».

Защита состоится 29 октября 2015 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» по адресу 119121, Москва, Погодинская ул., д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ и на сайте www.ibmc.msk.ru

Автореферат разослан ¿3 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Карпова Е.А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Рак простаты, рак легкого и сахарный диабет 2-го типа являются социально значимыми заболеваниями (Постановление Правительства Российской Федерации № 1706-р), приносящими ущерб обществу и требующими социальной защиты населения.

Рак легкого является одной из основных причин смерти в России, от которой умирает 27% онкологических больных (Чиссов и соавт., 2013). Основными причинами высокой смертности от данного заболевания являются его бессимптомное или скрытое воспалением течение на ранних стадиях развития. Широко применяемая рентгенологическая диагностика не пригодна для выявления ранних стадий рака легкого и поэтому существенно не влияет на статистику смертности от данного заболевания (Coleman, 1999). Лабораторная диагностика, основанная на детекции опухолевых маркеров, пригодных для обнаружения рака легкого, характеризуется низкой чувствительностью. Так, по данным Гамбургской Группы по Стандартизации Опухолевых Маркеров чувствительность тестов с использованием карциноэмбрионалыюго антигена (СЕЛ), фрагментов цитокератина 19 (CYFRA) и нейронспецифической энолазы (NSE) составляет всего 58%, 66%, и 59%, соответственно (Maeda et al., 1996; Stieber et al., 1999). Поэтому сегодня удается диагностировать данное заболевание только на поздних стадиях его развития, когда лечение малоэффективно и более чем 75% пациентов уже не удается спасти.

От рака простаты в России умирает 6,8% онкологических больных (4-е место в структуре смертности от онкологических заболеваний) (Чиссов и соавт., 2013). Высокие показатели смертности от этого заболевания обусловлены длительным бессимптомным течением болезни, что является причиной позднего обращения больных к врачу, когда прогноз заболевания становится неблагоприятным. Следует отметить, что рак простаты является основной причиной смертности от онкологических заболеваний в развитых странах (Jemal et al., 2011). Поэтому по мере увеличения средней продолжительности жизни населения актуальность диагностики рака простаты в России будет повышаться. Однако применяемая лабораторная диагностика данного заболевания, основанная на измерении концентрации простатического специфического антигена (ПСА) в крови пациента, малоэффективна (Lein et al., 2003). Так, чувствительность диагностики составляет всего 21% (Ankerst and Thompson. 2006) и дает ложноположительные результаты при простатите и доброкачественной гиперплазии простаты (Nadler et al., 1995).

Сахарный диабет (СД) - группа метаболических заболеваний, при которых пациент имеет устойчиво повышенный уровень глюкозы в крови. В 2011 году по данным Международной диабетической федерации СД имели 366 млн. людей. В России официально зарегистрировано 3 млн. диабетиков, всего же предполагают 9 млн. болеющих диабетом, что делает его самым распространенным эндокринным заболеванием. СД 2-го типа составляет 90% от всех поставленных диагнозов диабета. Сахарному диабету 2-го типа, как правило, предшествует предиабет, которым в развитых странах болеет почти треть взрослого населения (CDC - A Diabetes Report Card 2012J. Лабораторная диагностика СД 2-го типа заключается в измерении уровня глюкозы в крови и, что более важно, в выявлении нарушенной толерантности к глюкозе (НТГ), которая может указывать не только на диабет, но и предиабет, развивающийся при нормальном уровне глюкозы в крови. Своевременно выявленный предиабет является основанием для корректировки образа жизни пациента, назначения диеты, что совместно с медикаментозным лечением может предотвратить или отсрочить развитие СД 2-го типа. Однако, "золотой стандарт" диагностики НТГ — пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) обладает низкой чувствительностью. Только у 56% пациентов при повторном анализе подтверждается предиабет (Mcdonald et al., 1965). При такой низкой эффективности данный тест не соответствует современным требованиям доказательной медицины, а его повсеместное применение является вынужденной необходимостью при отсутствии альтернативы. Более того, ПГТТ тяжело переносится пациентами, так как длится 2 часа, в течение которых пациент должен находиться в лежачем положении. При этом для некоторых людей ПГТТ опасен, так как может вызвать гипергликемический шок (Sagel and Colwell, 1973).

Таким образом, сегодня востребованы любые позитивные изменения в области лабораторной диагностики рака легкого, рака простаты и СД 2-го типа, способные повысить эффективность их ранней диагностики. Поэтому исследования современных аналитических технологий, в том числе используемых в метаболомике, с целью улучшения лабораторной диагностики является актуальным.

Применяемые в метаболомике аналитические технологии позволяют единовременно регистрировать в биопробе почти всю совокупность метаболитов, открывая тем самым возможности для разработки новых лабораторных методов диагностики (Gowda et al., 2008). Метаболиты формируют молекулярный фенотип организма, так как являются субстратами, интермедиатами или продуктами биохимических реакций. Поэтому в метаболоме, как в "молекулярном зеркале", отражаются все, в том числе и патологические, процессы, проходящие в организме. В случае метаболомного анализа крови это дает исключительные возможности для

создания эффективной диагностики многих заболеваний. Таким образом, применение метаболомной технологии для решения проблем лабораторной диагностики и оценки риска возникновения таких социально значимых заболеваний, как рак простаты, рак легкого и СД 2-го типа, является обоснованным, своевременным и актуальным.

Степень проработанности проблемы.

Технологии, используемые в "омных" науках, позволяют одновременно измерять значительные количества биомолекул; например, геномика исследует тысячи последовательностей ДНК, а протеомика — большие количества белков. Данные технологии успешно использовались многие годы в научном поиске. Сегодня ученые пытаются использовать эти технологии в практических целях, чтобы создать новые тесты для диагностики заболеваний, оценки риска их возникновения, предсказания ответа пациента на лечение. Данные тесты объединены общим названием - "омные" тесты. Создан соответствующий международный комитет (Committee on the Review of Omics-Based Tests for Predicting Patient Outcomes in Clinical Trials (Micheel C.M., Nass S.J., Omenn G.S. et al.) по рассмотрению этих тестов, оценке их эффективности и разработке рекомендаций по их внедрению. Однако, являясь мировым трендом в создании новых диагностических методов, сегодня "омные" тесты пока не дошли до стадии практического применения. В особенности это касается "омных" тестов на основе метаболомики, самой молодой из "омных" наук.

Цель диссертационной работы: исследование метаболома плазмы кровн в целях ранней диагностики и оценки риска возникновения заболеваний на примере рака простаты, рака легкого и СД 2-го типа.

Основные задачи исследования.

• Получить масс-спектры метаболомов образцов плазмы крови пациентов с раком

простаты, раком легкого, нарушенной толерантностью к глюкозе и контрольных субъектов.

• Построить модели диагностики на основе метаболомных данных и определить

параметры (точность, чувствительность и специфичность) диагностики и/или оценки риска возникновения заболевания (OR) для рака простаты, рака легкого и нарушенной толерантности к глюкозе.

• Идентифицировать метаболиты, вносящие вклад в диагностику и/или оценку риска

возникновения заболеваний, и показать их отношение к этиологии и/или развитию заболеваний.

• Сопоставить характеристики метаболомной диагностики с результатами анализа

молекулярных маркеров заболеваний, используемых в клинической практике для тех же заболеваний.

• Показать возможность реализации выявленного диагностического потенциала

прямой масс-спектрометрии метаболитов плазмы крови в лабораторной практике.

Научная новизна. Впервые показана применимость "омного" анализа для диагностики рака простаты, рака легкого и нарушенной толерантности к глюкозе. Описаны ранее неизвестные метаболиты-биомаркеры рака простаты и метаболиты, являющиеся факторами риска развития рака легкого и СД 2-го типа. Продемонстрирована универсальность метаболомного анализа, основанного на масс-спектрометрическом измерении метаболитов плазмы крови, для лабораторной диагностики нескольких социально значимых заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метаболом плазмы крови может быть эффективно использован для диагностики и оценки риска возникновения ряда социально значимых заболеваний.

2. Биоинформационный анализ масс-спектров метаболома плазмы крови, полученных прямой инжекцией фракции метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, позволяет выявить мультивариационные характеристики (диагностические сигнатуры), позволяющие диагностировать или оценивать риск возникновения таких социально значимых заболеваний, как рак простаты, рак легкого и СД 2-го типа.

3. Метаболиты, входящие в диагностические сигнатуры, отражают изменения в организме пациента, имеющие непосредственное отношение к этиологии и/или развитию этих заболеваний.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость результатов работы заключается в подтверждении того, что метаболом плазмы крови является своеобразным молекулярным фенотипом всего организма и может быть использован в качестве универсального средства исследования различных заболеваний, в том числе с целью разработки их лабораторной диагностики.

Практическая значимость работы заключается в возможности внедрения метаболомной диагностики в практическую медицину. Разработанные протоколы

анализа являются шаблоном стандартных операционных процедур и лабораторных регламентов для метаболомной диагностики рака простаты, рака легкого и СД 2-го типа. Выявленные в работе метаболиты-биомаркеры заболеваний могут быть использованы в диагностике соответствующих заболеваний как самостоятельно, так и в совокупности с другими, ранее найденными биомаркерами. Разработанные методические подходы метаболомного анализа плазмы крови, биоинформационной обработки данных, а также разработанное программное обеспечение нашли применение в научных исследованиях по поиску низкомолекулярных диагностических сигнатур и маркеров заболеваний в плазме крови.

Личный вклад соискателя научной степени. Соискателем была разработана концепция метаболомного исследования рака простаты; совместно с академиком А.И. Арчаковым была разработана концепция метаболомного исследования рака легкого; совместно с академиком А.И. Арчаковым и академиком И.И. Дедовым была разработана концепция метаболомного исследования СД 2-го типа; соискателем составлен дизайн всех проведенных исследований; был подобран протокол метаболомного анализа плазмы крови, используемый во всех представленных исследованиях; получены масс-спектрометрические данные по метаболомному исследованию рака простаты и рака легкого; были получены под непосредственным руководством соискателя масс-спектрометрические данные, фигурирующие в исследовании СД 2-го типа; была проведена вся статистическая обработка данных, построены и протестированы математические модели; идентифицированы указанные в диссертации метаболиты-биомаркеры заболеваний; разработаны и программно реализованы все описанные в материалах диссертации алгоритмы обработки и корректировки масс-спектрометрических данных; написаны все научные статьи по теме диссертации, где соискатель указан первым автором (в остальных научных статьях вклад соискателя не менее 50%); доложены все устные доклады по теме диссертации, где соискатель указан первым автором в опубликованных тезисах доклада.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на HUPO 6th Annual World Congress (Seoul, 2007), в виде устного доклада на U.S.-Russia Scientific Forum (Moscow, 2011), на конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (Казань, 2012), в виде устного доклада на конференции ФГБУ «ИБМХ» РАМН (Москва, 2013), в виде устного доклада на XX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2013), в виде устного доклада на FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), на V

Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, 2013), на 4lh International Conference on Biomarkers & Clinical Research (Philadelphia, 2013), на XXI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2014), на 5th International Conference on Biomarkers & Clinical Research (Oxford, 2014), в виде устного доклада на HUPO 13th Annual World Congress (Madrid, 2014).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 29 печатных работ, из них 11 статей в научных рецензируемых изданиях, 1 патент, 1 глава в книге, а также 16 публикаций в материалах конференций. Индекс Хирша соискателя ученой степени составляет 8 по данным системы Scopus на 2015 год.

Достоверность научных результатов. Достоверность научных результатов основана на их многосторонней экспериментальной проверке в исследованиях различных заболеваний. В работе использовали 360 образцов плазмы крови, собранных в профильных медицинских учреждениях, что позволило получить статистически достоверные результаты по целевым группам пациентов. Все предложенные статистические модели диагностики заболеваний были протестированы с использованием независимых выборок и были оценены по общепризнанным критериям эффективности диагностических методов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, дискуссии, заключения и списка литературы. Текст диссертации содержит 307 страниц машинописного текста, включая 34 рисунка, 14 таблиц и приложение. Список использованной литературы содержит 398 библиографические записи.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы даны основные определения метаболомики, рассмотрена история ее возникновения, раскрыты особенности метаболомики по отношению к другим "омным" наукам. Описаны методы анализа биоматериала и интерпретации данных, применяемые в метаболомике. Отдельная глава посвящена метаболомике плазмы крови и применению ее в медицинских целях, в том числе в виде "омных" тестов. Рассмотрены также проблемы диагностики и оценки риска возникновения рака простаты, рака легкого и СД 2-го типа, показывающие актуальность диссертационной работы.

МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Методология. Эффективность анализа метаболома плазмы крови, полученного прямой инжекцией фракции метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, для диагностики и оценки риска возникновения заболеваний определена в соответствии с положениями доказательной медицины в первичных поперечных биомедицинских исследованиях типа "случай-контроль" на репрезентативных выборках целевых групп в Российской Федерации. Группы "случай" формировали с учетом стандартных диагностических критериев определения случая (по анкетным данным, данным медицинского осмотра и результатам лабораторной диагностики). Полученные результаты подтверждены тестированием диагностических моделей с применением независимых выборок и расчетом основных статистических критериев достоверности диагностических тестов, принятых в биомедицинских исследованиях (т.е. чувствительность, специфичность и точность теста). Заключение о применимости прямой масс-спектрометрии метаболома плазмы крови в медицине сделаны на основе мета-анализа, включающего результаты исследований по нескольким заболеваниям.

Группы пациентов, задействованные в исследованиях. Пациентами, задействованными в метаболомном исследовании рака простаты, являлись мужчины, обратившиеся в лабораторию ООО «Новые медицинские технологии» г. Воронеж по направлению участковых урологов г. Воронежа и Воронежской области и имевшие подозрение на патологию простаты. Концентрацию общего ПСА в крови пациентов измеряли иммуноферментным способом ("ОнкоИФА-общий ПСА", Алкор Био, Россия). Затем пациентов обследовали в Воронежском областном клиническом онкологическом диспансере (пальцевое исследование, УЗИ, пункционная биопсия), после чего ставили диагноз или признавали здоровыми. Таким образом для метаболомного исследования были отобраны 40 больных со светлоклеточной мелкоацинарной аденокарциномой простаты 2-ой стадии (Т2ЫхМО) до начала лечения и 30 здоровых пациентов. Возраст здоровых пациентов и больных раком простаты составлял 55 — 80 лет.

Метаболомное исследование рака легкого было проведено на пациентах Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (Москва), ранее задействованных в эпидемиологическом исследовании рака легкого (гека е1 а1., 2006). Все пациенты были с первично диагностированным раком до проведения медицинского лечения. В качестве контрольной группы использовали условно здоровых (без диагностированной патологии) пациентов того же возраста, что и пациенты экспериментальной группы. Таблица 1 содержит клинические характеристики этих групп.

Таблица 1. Характеристика выборки пациентов, задействованных в метаболомном исследовании рака легкого.

Характеристика Контрольная группа Пациенты с раком легкого

Количество человек 100 100

Пол (м/ж) 89/11 88/12

Возраст (среднее значение /диапазон) 59/37-71 60/44-76

Курильщиков / не курильщиков 77/23 93/7

BMI (среднее значение) 32,2 30,3

OR развития рака легких для курильщиков (95% CI) 4,0 (1,6-9,7)

Патогистолопргеская форма (Sq/SCLC/Ad/LCC/Mx/NOS) - 58/7/12/4/9/10

Стадия рака (I/II/III/IV) - 24/12/50/14

Стадии рака указаны в соответствии с TNM классификацией. Классификация иатогистологических форм указана в соответствии с Международной Классификацией Заболеваний для Онкологии (Fritz et al., 2000): Sq — сквамозноклеточная карцинома; SCLC — мелкоклеточная карцинома; Ad — аденокарцинома; LCC — крупноклеточная карцинома; Мх — смешанная карцинома; NOS — карцинома с неустановленным патогистологическим типом.

В метаболомном исследовании СД 2-го типа были задействованы пациенты, обратившиеся в поликлинику ФГУ Эндокринологического Научного Центра Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Москва). Концентрации биохимических показателей крови (глюкоза, мочевая кислота, общий холестерин, инсулин, триглицериды, липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), липопротеиды высокой плотности (ЛПВП)) в образцах крови пациентов были измерены на биохимическом анализаторе Architect с4000 (Abbott Diagnostics, США). Гликированный гемоглобин (HbAlc) измеряли на анализаторе Bio-Rad DIO (Bio-Rad Laboratories, Франция). Глюкозотолерантный тест проводили путем перорального получения пациентом 75 грамм глюкозы и измерения уровня глюкозы в крови пациента через два часа. НТГ диагностировали, если уровень глюкозы в крови был между 7,8 и 11,0 ммол/л (WHO, 1999). Результаты ПГТТ использовали для формирования уравновешенных по полу групп пациентов: экспериментальной с НТГ (п = 20) и контрольной (п = 30). Таблица 2 содержит клинические характеристики этих групп.

Таблица 2. Клинические характеристики экспериментальной и контрольной групп пациентов, задействованных в метаболомном исследовании СД 2-го типа.

ХАРАКТИРИСТИКА ВЕЛИЧИНЫ (среднее знач. ± етанд. отклон. 1 диапазон) AUC t-тест <Р)

Контрольная rpvnna Пациенты с НТГ

Количество человек 30 20 - -

Пол (м/ж) 15/15 10/10 0,51 -

Возраст(лет) 53,3 ± 1-1,3 / 32-82 61.8 ± 12,2 / 38-85 0,66 0,03

BMI (кг/м') 35,4 ± 8,2 / 24,5-53,2 33,4 ± 8,9 / 23,2-57,0 0,46 0,66

Уровень глюкозы натощак (ммол/л) 5,5 ±0,3/4,8-6,1 5,6 ±0,3/5-6,1 0,55 0,51

Уровень глюкозы в ПГТТ (ммол/л) 6,4 ±1,0/4,1-7,8 . 9,9± 1,3/8,2-11,0 1,00* 0,00

Инсулин (мкЕд/мл) 16,1 ± 20,0/ 3,3-100,8 14.5 ±7,9/4,9-31,7 0,59 0,74

HbAlc (•/.) |ммол/мол] 5,8 ± 0,4 / 5,1-6,4 (40 ± 4,4 / 32-46) 6,1 ± 0,4 / 5,4-6,6 [43 ±4,4/36-49| 0,77 0,001

IIIIIH (ммол/л) 3.4 ±0.7/1,7-5 J 3.1 ± 1.0 /1.6-1.7 0,41 0,16

Л11В11 ( ммол/л) 1,2 ± 0,4/0,7-1,9 1.1 ±0,4/0,6-1,9 0.40 0,23

Общин холестерин (мОп/л 1 5,2 ± 0,8 / 3,9-6,6 5,1 ±1,2/3.0-6,* 0,47 0.58

Мочевая кислотж (мкмол/л) 374 ±«3/223-514 386 ±83/255-581 0,54 0,61

Трнглнцериды (ммол/л) 1,3 ± 0,6 / 0,5-3,0 1,69 ±0,9/0,8-3,9 0.62 0,07

IIOMA-IR 4.0 ±4.8/0.8-24.2 3,6 ±2,1/1.1-8,6 0,59 0,79

HOMA-P 160 ± 202 / 31-1061 139 ± 76 / 55-283 0,58 0,65

* - ЛЫС для глюкозы в ПГТТ равен 1, так как результат ПГТТ был использован для формирования эксперимеш-альной и контрольной групп.

Со всех пациентов было получено информированное согласие на научное использование полученных образцов крови, а исследования были утверждены в этических комитетах соответствующих учреждений.

Протокол сбора образцов плазмы крови. Образцы крови отбирали из кубиталыюй вены натощак, в объеме 3 мл в пробирки, содержащие K2EDTA (BD Vacutainer, США). Не позднее, чем через 15 мин после забора, кровь центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 мин при 1600 g. Затем 1,2 мл полученной плазмы разделяли на аликвоты, разливая в пластиковые пробирки, и замораживали до температуры -80°С. Для дальнейшего анализа образцы плазмы крови транспортировали в замороженном состоянии в термоконтейнерах в ФГБУ «ИБМХ» РАМН. Хранение образцов до проведения анализа осуществляли при температуре -80°С. Используемые для анализа пробы были заморожены/разморожены не более одного раза. Пробы аннотировали, указав стадию заболевания, пол и возраст больного и т.д., в зависимости от исследуемого заболевания. В исследованиях, входящих в диссертационную работу, допускалось варьирование протокола сбора образцов, не влияющее на результаты метаболомного анализа. Для оценки воспроизводимости метода дополнительно были получены образцы плазмы крови от одних и тех же пациентов (п = 20) с промежутком в 2-7 дней.

Пробоподготовка образцов плазмы крови. Для осаждения белков 100 мкл плазмы крови смешивали с 100 мкл воды (LiChrosolv, Merck, США) и 800 мкл метанола (Fluka, Германия) и инкубировали 10 мин при 4°С. Центрифугированием при 13 тыс. об./мин (центрифуга MiniSpin plus, Eppendorf, Германия) в течение 10 мин осаждали белок и супернатант переносили в чистые пластиковые пробирки (эппендорфы). При температуре 45°С в течение 3 ч упаривали растворитель на вакуумном испарителе (SpeedVac, Eppendorf). Полученный сухой осадок растворяли в 100 мкл 95% раствора ацетонитрила (Acros Organics, США), с добавлением 0,1% муравьиной кислоты (Fluka). Для лучшего растворения осадка пробы обрабатывали ультразвуком (Bandelin RM 40UH, Sonorex Technik, Германия) два раза по 30 сек. Далее пробы центрифугировали 10 мин при 13 тыс. об./мин и полученный супернатант использовали для масс-спектрометрического анализа.

Для метаболомного исследования СД 2-го типа использовали модифицированный протокол пробоподготовки с учетом использования более чувствительного масс-спектрометра. Полученную плазму (10 мкл) смешивали с 10 мкл воды (LiChrosolv) и 80 мкл метанола (Fluka) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре для осаждения белка. После чего образцы центрифугировали при 13 тыс. об./мин (MiniSpin plus) в течение 15 мин. Супернатант разбавляли 50-ю объемами метанола, содержащего 0,1% муравьиной кислоты (Fluka), и использовали для масс-спектрометрического анализа.

Масс-спектрометрический анализ метаболитов плазмы крови. Масс-спектрометрический анализ проводили на гибридном квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре MicrOTOF-Q (Bruker Daltonics, Германия), имеющем электроспрейный источник ионизации. Масс-спектрометр был настроен на приоритетную детекцию ионов в диапазоне m/z 250 — 1500 и точность измерения масс 2-3 ррт. Спектры снимали в режиме детекции как положительно, так и отрицательно заряженных ионов. Время снятия одного спектра 5 мин, поток пробы, подаваемой в электроспрейный источник ионизации, 180 мкл/час. Для инжекции пробы в электроспрейный источник ионизации использовали стеклянный шприц (Hamilton Bonaduz, Швейцария), установленный в шприцевой инжекторный насос (KD Scientific, США). Масс-спектры получали в программе DataAnalysis (версия 3.4, Bruker Daltonics) суммированием записанных пятиминутных сигналов. Для детекции пиков в масс-спектрах использовали алгоритм Sum Peak со следующими параметрами: соотношение сигнал/шум — 1 (при метаболомном исследовании рака простаты — 10); пороговое значение для детекции пиков в относительных единицах 0,005% и 3 - в абсолютных единицах. При данных параметрах детектировали не менее 95% целевых масс-спектрометрических пиков, относящихся к ионам метаболитов, при этом происходило включение в список масс ионов не более 5% нерелевантных (шумовых) пиков. Шумовым пиком в спектре считали пик низкой интенсивности, не имеющий изотопного распределения и не воспроизводящийся в остальных спектрах. Выравнивание масс-спектрометрических пиков осуществляли в соответствии с разработанным алгоритмом (Lokhov et al, 2011).

Для оптимизации протоколов масс-спектрометрического анализа при метаболомном исследовании рака легкого и СД 2-го типа масс-спектрометр был настроен на приоритетную детекцию ионов в диапазоне m/z 50-1000. При метаболомном исследовании СД 2-го типа использовали квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр maXis Impact (Bruker Daltonics, США) и время записи сигнала было снижено до 1 мин.

Идентификация метаболитов. Для масс-спектрометрических пиков, подлежащих идентификации (т.е. чья интенсивность статистически достоверно связана с заболеванием или указывает на риск возникновения заболевания), устанавливали их соответствие конкретным метаболитам из базы "Human Metabolome Database" (http://www.hmdb.ca) и/или Metlin (Scripps Center for Mass Spectrometry, США; http://metlin.scripps.edu). Для этого использовали точно измеренную массу метаболита (при необходимости использовалась дополнительная калибровка спектра по внутреннему стандарту) и паттерн изотопного распределения метаболита в спектре. Для установления изотопного распределения, соответствующего конкретному элементному составу вещества, использовали программу IsotopePattern (Bruker Daltonics, Германия). При метаболомном исследовании рака простаты помимо масс-спектрометрических пиков, чья интенсивность была связана с наличием у пациента рака простаты, также идентифицировали основные мажорные масс-спектрометрические пики, не связанные с болезнью.

Статистический анализ. Для выровненных масс-спектрометрических пиков метаболитов тестом Вилкоксона устанавливали достоверность отличий их интенсивностей между выборкой больных и здоровых пациентов. Для пиков метаболитов, чья интенсивность статистически достоверно (р<0,05) менялась при возникновении болезни, рассчитывали средние значения и стандартные отклонения по группам, соответствующим больным и здоровым пациентам.

При метаболомном исследовании рака простаты статистический анализ осуществляли для 25-ти наиболее интенсивных пиков, регистрируемых в режиме детекции как положительно, так и отрицательно заряженных ионов.

Для определения параметров лабораторной диагностики, таких как специфичность, чувствительность и точность, а также построения ROC (Receiver Operating Characteristic) кривой использовали статистический пакет для социальных наук (-'Statistical Package for the Social Sciences (SPSS)", SPSS Inc., США), версии 10,0 или функцию rocplot программы Matlab (MathWorks, США). Для оценки эффективности диагностики рассчитывали AUC ("Area under ROC curve" — площадь под ROC кривой), используя ту же функцию rocplot. AUC равный 0.5-0,6 показывал, что диагностический тест практически не работает; 0,6-0,7 — тест работает, но не эффективно; 0,7-0,8 — эффективный тест, и 0,9—1,0 — высокоэффективный тест (Metz, 1978).

Диагностика рака простаты по масс-спектру метаболома плазмы крови (Лохов и соавт., 2009). Полученные списки масс отрицательно и положительно заряженных ионов метаболитов объединяли и, используя программный пакет Matlab, переводили в бинарный код, формируя бинарный метаболический фингерпринт плазмы крови

(далее просто фингерпринт). Для этого диапазон детектированных масс разбивали на фрагменты с шагом m/z 0,01, где диапазону, включающему массу иона метаболита, присваивается "Г' и, соответственно, "0" - при отсутствии таковой массы.

Далее метаболические фингерпринты анализировали методом главных компонент (МГК), используя функцию [comp, score] = princomp(X) программного пакета Matlab, где X — матрица, содержащая фингерпринты, comp — матрица главных компонент, score - матрица проекций фингерпринтов на главные компоненты. Для визуализации результатов анализа использовали функцию plot3, которой в качестве входных данных передавали проекции фингерпринтов на главные компоненты.

Для построения модели диагностики использовали метод опорных векторов (SVM - support vector machine), применяя свободно распространяемое программное обеспечение OSU Support Vector Machines Toolbox (версия 3.0, http://sourceforge.net/projects/svm/). Применяли нелинейный SVM классификатор с радиальным ядром (функция RbfSVC) и основными параметрами: у = 1, е= 0,001, С = 1. Входными данными для классификации являлись координаты проекций фингерпринтов на выбранные три главных компонента.

Тестирование модели диагностики проводили способом leave-one-out (Martens and Dardenne, 1998), заключающимся в поочередном удалении из выборки одного экземпляра и обучении классификатора на основе оставшихся экземпляров с последующим тестированием классификатора на экземпляре, не участвовавшем в обучении. Таким образом, модель была протестирована на 70 фингерпринтах, и по результатам тестирования были определены специфичность, чувствительность и точность модельной диагностики, а также построена ROC кривая и вычислена AUC.

Полученные характеристики модели диагностики сравнивали с соответствующими характеристиками диагностики, основанной на концентрации ПСА в крови пациентов. Учитывая возраст больных раком простаты, за нормальные значения концентрации ПСА принимали величины от 0 до 5,36 нг/мл (от 0 до 0,16 х10""М).

Доверительный интервал надежности для характеристик модельной диагностики рассчитывали методом, предложенным Вапником для расчета доверительных интервалов надежности для классификатора с учителем (Вапник, 1984). Расчет проводили для доверительной вероятности 0,95.

Диагностика рака легкого по масс-спектру метаболома плазмы крови. Матрицу бинарных масс-спектрометрических фингерпринтов анализировали МГК, используя функцию princomp программного пакета Matlab. Анализ выявил количество компонентов, включающих в себя основную часть вариации, представленной в матрице. Далее вместо исходных фингерпринтов использовали их проекции на эти

компоненты. Таким образом, была снижена размерность данных, необходимая для последующей классификации фингерпринтов.

Для построения модели диагностики использовали метод опорных векторов, применяя SVM классификатор с линейным ядром программного пакета Matlab (функция svmtrain). Входными данными для классификации являлись координаты проекций фингерпринтов на выбранные главные компоненты.

Тестирование модели диагностики проводили способом repeated random sub-sampling validation, заключающимся в попеременном удалении из выборки (в данном случае 10%) экземпляров и обучении классификатора на оставшихся экземплярах с последующим тестированием классификатора на экземплярах, не участвовавших в обучении. Таким образом, модель диагностики была протестирована 1000 раз на 200-ах фингерпринтах.

Расчет риска возникновения рака легкого на основе метаболитов плазмы крови.

Расчет риска возникновения рака легкого проводили путем вычисления OR (odds ratio) на основе данных об интенсивности масс-спектрометрических пиков метаболитов. OR рассчитывали для каждой стадии заболевания. Оптимальное пороговое значение интенсивности масс-спектрометрического пика для расчета OR определяли путем его изменения от минимального значения ("0") до максимально зарегистрированного значения. Оптимальным пороговым значением выбиралось значение соответствующее максимальному OR.

Расчет диагностического показателя теста на НТГ. Ионы метаболитов, чья интенсивность масс-спектрометрических пиков связана с наличием НТГ (п = 50) были использованы для расчета диагностического показателя теста на НТГ. С этой целью интенсивность пика каждого такого метаболита рассматривалась как некая диагностическая мера, дающая два результата на НТГ, положительный - равный " 1", и отрицательный - равный "0". Значение интенсивности пика, соответствующее максимальной точности определения НТГ, брали за отсечение между положительным и отрицательным результатом. Для расчета диагностического показателя на НТГ все положительные результаты, т.е. единицы, суммировали. Полученный таким образом диагностический показатель указывал на наличие НТГ при превышении порогового значения, соответствующего максимальной точности диагностики НТГ. Масс-спектрометрнческие сигнатуры заболеваний и расчет диагностических показателей на нх основе. Сигнатуры составляли из m/z значений масс-

спектрометрических пиков, интенсивность которых: увеличивается с AUC>0,7 и уменьшается с AUC>0,76 (для диагностики НТГ); увеличивается с AUC>0,8 (для диагностики рака легкого); увеличивается с AUC>0,85 (для диагностики рака простаты). В верхнем индексе для соответствующих m/z значений указывали пороговое значение интенсивности пика, выше которого пик указывает на наличие заболевания, ниже — на его отсутствие. При этом, пороговые значения выражали через квантиль распределения интенсивностей этих пиков, рассчитанный для масс-спектров контрольной выборки. Диагностический показатель на основе сигнатуры рассчитывали путем подсчета (суммирования) количества масс-спектрометрических пиков, превышающих пороговое значение. Оптимальное пороговое значение для диагностического показателя соответствовало максимальной точности диагностики заболевания.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ДИАГНОСТИКА РАКА ПРОСТАТЫ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МЕТАБОЛОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ (Лохов и соавт., 2009).

Высокие показатели смертности от рака простаты обусловлены длительным бессимптомным течением болезни и являются следствием несвоевременной диагностики. Более 60% больных обращаются к врачу уже при наличии метастазов в отдаленных органах. При этом группу риска составляют мужчины старше 50-55 лет (Hankey et al., 1999). Исходя из актуальности диагностики ранних стадий рака простаты и проведения диагностики у граждан определенного возраста, для формирования выборки образцов крови были использованы больные с раком простаты 2-ой стадии 55-ти лет и старше, а так же здоровые добровольцы того же возраста.

В результате прямого масс-спектрометрического анализа в пробах было детектировано примерно 1900 ионов метаболитов (Табл.3). Число ионов метаболитов, зарегистрированных в режиме детекции положительно заряженных ионов, было больше, чем в режиме детекции отрицательно заряженных ионов. Существенных различий в количестве детектируемых ионов у больных и здоровых пациентов не установлено.

Таблица 3. Количество детектируемых ионов, полученных при прямом масс-спектрометрическом анализе метаболитов плазмы крови здоровых добровольцев и больных раком простаты (Лохов и соавт., 2009).

Масс-спектры метаболитов образцов плазмы крови контрольной группы

В режиме детекции положительно заряженных ионов 1041±152*

В режиме детекции отрицательно заряженных ионов 836 ±198

Всего детектировано ионов метаболитов 1877 ±274

Масс-спектры метаболитов образцов плазмы крови больных раком простаты

В режиме детекции положительно заряженных ионов 1037 ±213

В режиме детекции отрицательно заряженных ионов 875 ±194

Всего детектировано ионов метаболитов 1912 ±264

* - указаны среднее значение ± стандартное отклонение

Масс-спектры, полученные в режиме детекции отрицательно и положительно заряженных ионов, имели отличия, сохраняя общий характер распределения масс ионов (Рис. 1, Рис. 2). В режиме детекции положительно заряженных ионов в диапазоне m/z 780-900 наблюдалось характерное распределение интенсивных масс-спектрометрических пиков (Рис. 1), в дальнейшем идентифицированных как ионы фосфолипидов (Табл. 5). В режиме детекции отрицательно заряженных ионов наблюдали похожую картину, но с несколько большей интенсивностью пиков в дипазоне m/z до750 (Рис. 2).

иняенс.

»105. 1,251,000,75-

a.r,i 0,25 0

Рисунок 1. Масс-спектр метаболитов плазмы крови, полученный в режиме детекции положительно заряженных ионов на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре с электроспрейным источником ионизации (Лохов и соавт., 2009).

инвенп кЮ4-

2,5 2,0 1,5 1,00,50-

Рисунок 2. Масс-спектр метаболитов плазмы крови, полученный в режиме детекции отрицательно заряженных ионов на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре с электроспрейным источником ионизации (Лохов и соавт., 2009).

др. метаболиты

фосфат1ца1лхо.шшы

лпофосфптпдшхолины

ILiu

I <85'< I

l.l i: Л.

■1'-- ' t ■ I .11 J . J. 11

llalli, ы... L

m/z

жирные кислоты

гормоны

Д1>. метаболиты

303.2 281,2 327.2

яп о ф о с ф а тидилх о л шы

я п о ф о с ф а т идти у т дн о до>а шы

диглщррпды

¿ílu

Jü

фОСфаТНДИ-ИОЛИНЫ

ф о ( ф ПИ1Д11И т лнодомнны

792,5 816,5

lÍLÍ. .h.ÜL^

m/z

Математическое преобразование масс-спектров в бинарный код позволило получить масс-спектрометрические фингерпринты метаболома плазмы крови. Фингерпринт представляет собой мультивариационную характеристику плазмы крови, где переменными являются бинарные значения, указывающие на наличие или отсутствие определенной массы в масс-спектре. Следует отметить, что для термина "фингерпринт" есть редко употребляемый русский аналог - "пальцевые отпечатки", а также похожий термин - масс-спектрометрический "штрих-код" (англоязычный вариант "bar-code"). Применяя МГК, удалось выявить в фингерпринтах вариацию, ассоциированную с раком простаты. Выбранные три главных компонента, охватывающие 41% всей вариации, позволили эффективно разделить в трехмерном пространстве фингерпринты по признаку принадлежности к пробам больных или здоровых пациентов (Рис. 3). Любые иные комбинации главных компонент либо не позволяли разделить пробы, либо разделение было менее эффективным.

При рассмотрении проекции фингерпринтов на три выбранных главных компонента очевидна возможность разделения их разграничивающей плоскостью на два класса. Для построения такой плоскости использовали метод опорных векторов, который позволяет классифицировать многомерные данные, разделяя их на классы построением гиперплоскости в заданном многомерном пространстве. Формально разделение биопроб на классы является моделью диагностики, направленной на выявление рака простаты, эффективность которой может быть установлена тестированием и определением таких параметров как специфичность, чувствительность и точность.

Эффективность модели диагностики проверялась тестированием 1ете-опе-оШ. Исключая поочередно по одному тестовому фингерпринту из выборки, строили разграничивающую плоскость между проекциями фингерпринтов на три главных компонента, соответствующих образцам плазмы здоровых и больных пациентов,

0 2

Рнсунок 3. Проекции масс-спектромет-рических фингерпринтов метаболома плазмы крови больных раком простаты и здоровых добровольцев на три главных компонента (Лохов и соавт., 2009).

• — проекции фингерпринтов образцов плазмы крови больных раком простаты; о - проекции фингерпринтов образцов плазмы крови здоровых добровольцев.

после чего устанавливали к какому классу будет отнесен тестовый фингерпрннт. Результаты классификации по 70 фингерпринтам (Табл. 4) использовали для построения ROC-кривой (Рис. 4). AUC которой дает представление об эффективности и клинической применимости диагностического метода. Предложенную нами модель диагностики можно отнести к разряду "высокоэффективных", так как она имеет значение AUC более 0,9 (Табл. 4). Следует отметить, что ПСА-тест для той же выборки пациентов имеет площадь под ROC-кривой 0,59, что согласуется с данными из других источников (0.51 и 0.54 для тестовых наборов фирмы Roche и Bayer, соответственно (Lein et al., 2003)) и указывает на то, что применение ПСА-теста для диагностики рака простаты 2-ой степени является сомнительным (Табл. 4).

0.25 0.50 0.75

1 - Специфичность

Рисунок 4. ROC кривые для модели диагностики рака простаты на основе масс-спектрометрических фингерпринтов метаболома плазмы крови (1) и измерения концентрации общего ПСА (2) в плазме крови. Для построения кривой использовали образцы плазмы крови 40 больных раком простаты и 30 здоровых добровольцев. Разделение фингерпринтов на соответствующие группы проводили методом опорных векторов, примененным к проекции фингерпринтов на три главных компонента (Лохов и соавт., 2009).

Таким образом, модель диагностики рака простаты на основе прямого масс-спектрометрического анализа метаболома плазмы крови характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и точностью, значительно превосходящими общепринятый и повсеместно применяемый ПСА-тест.

Таблица. -4. Характеристики модели диагностики рака простаты 2-ой стадии на основе классификации масс-спектрометрических фингерпринтов метаболома плазмы крови и концентрации ПСА в крови пациентов (Лохов и соавт., 2009).

Диагностика на основе масс-спектрометрических фингерпринтов метаболома тазмы крови

Чувствительность 95,0 ±2,5 %

Специфичность 96,7 ±2,1%

Точность 95,7 ±1,6%

AUC 0,99 ±0,01

Диагностика на основе Kotntenmpaifuu ПСА

Чувствительность 35,0 %

Специфичность 83,3%

Точность 51,4%

AU С 0,59 ±0,13

доверительный интервал надежности вычисляли для доверительной вероятности 0.95.

Метаболиты плазмы крови, вносящие вклад в диагностику рака простаты

Для подтверждения релевантности используемых для диагностики ионов метаболитов к развитию рака простаты, была проведена идентификация основных наиболее интенсивных масс-спектрометрических пиков, формирующих фингерпринт. Результаты идентификации представлены в Таблице 5. Согласно этим данным, область интенсивных пиков (m/z >750) в масс-спектре соответствует фракции фосфолипидов. Множественность пиков объясняется вырожденностью остатков жирных кислот, входящих в фосфолипиды. Область m/z ~450-600 соответствует в основном лизоформам фосфолипидов. Низкомолекулярная область (< m/z 400) соответствует метаболитам различных химических классов, выполняющих различные физиологические функции.

Таблица 5. Результаты идентификации метаболитов плазмы крови в метаболомном исследовании рака простаты (ЫкЬоу с1 а1., 2010).

Молекулярный вес Элементный состав Название метаболита Тест Внлкоксона (Р)

Измеренный (m/z) Соответствующий элементному составу (Да)*

Положительно заряженные ноны метабол!Гтов

1 288,2906 288,2897 c„h„no2 сфингозин 0,49

2 302,2442 302,2326 Ci6h31n04 ацилкарнитин 0,00

3 304,2602 304,2635 c2(1h„no арахидоноил амин 0,00

4 360,3225 360,3261 c24h4ino R- арахидоноил амин 0,56

5 377,2680 377,3050 quh-юоз изолитохолевая кислота 0,00

6 437,1928 437,2663 С21Н4|07Р 1 -олеоил-лизоФК 0,06

7 518,3269 518,3241 c26h4sno7p линоленоил-лизоФХ 0,78

8 542,3208 542,3241 c28h48no7p лизоФХ 0,27

9 544,3353 544,3398 c28h50no7p лизоФХ 0,42

10 780,5537 780,5538 cmh^nosp ФХ 0,74

11 804,5503 804,5538 c4(,h78n08p ФХ 0,43

12 806,5628 806,5694 c46h„no8p ФХ 0,84

13 808,5793 808,5851 c46h82no8p ФХ 0,62

14 828,5477 828,5538 c48h78no8p ФХ 0,89

15 830,5617 830,5694 c48h80no8p ФХ 0,87

16 832,5798 832,5851 c48h82no8p ФХ 0,65

Отрицательно заряженные ионы метаболитов

17 303,2238 303,2330 c»h,2o2 арахидоновая кислота 0,90

18 307,0452 307,0337 C,h,jn208p диоксиуридин монофосфат 0,04

19 367,1486 367,1585 c,,H2805s тестостерон сульфат 0,01

днгидроэпиандростерон сульфат

20 369,1632 369,1741 cuhsooss андростерон сульфат 0,05

5 а -дигндростерон сульфат

21 397,1911 397,1871 C,6H,,NOeP глицерофосфохолин 0,41

22 445,3184 445,3113 cahjjfo, дигидроксивитамин /Ь 0,14

23 480,2977 480,3085 c2.,h«no7p лизоФХ 0,53

24 530,2886 530,3241 c27h»no,p лизоФЭ 0,92

25 532,2867 532,3398 C27Hs2NO;P лизоФЭ 0,88

26 557,4414 557,4201 qshsso, диглицерид 0,28

27 593,4630 593,5140 C,7H7„05 диглицерид 0,06

28 792,5106 792,5902 C4f,HuNO,P ФХ 0,46

29 794,5182 794,5694 c45h»2no»p ФХ 0,95

30 816,5114 816,5538 C4711,„NOsP ФЭ 0,34

31 818,5194 818,5694 c47h,2no»p ФЭ 0,19

32 820,5393 820,5851 C„7HmNO»P ФЭ 0,48

33 840,4984 840,5538 c4,h,„no8p ФЭ 0,38

34 842,5192 842,5694 c44h,2no8p ФЭ 0,08

35 844,5391 844,5851 C„HmNO„P ФЭ 0,16

36 850,4731 850,5381 Csc,H7»NO,P ФХ 0,08

37 852,4776 852,5538 Cs„H„NO»P ФХ 0,09

ФК - фосфотидная кислота: ФХ - фосфатидилхолин; ФЭ - фосфатидилтганоламин; R: различные радикалы, например N-бутил или N-пропил а-метил. * - рассчитай для детектируемого нона [М+Н]+, в случае регистрации положительно заряженных ионов, и [М-Н]\ в случае регистрации отрицательно заряженных ионов.

Статистический анализ выявил пики метаболитов, интенсивности которых в масс-спектре достоверно связаны с возникновением болезни. Среди них метаболиты с ni/z 302,2442, 304,2602 и 377,2680, обнаруженные в режиме детекции положительно заряженных ионов, и m/z 307,0452, 367,1486 и 369,1632, обнаруженные в режиме детекции отрицательно заряженных ионов. Для интенсивностей данных метаболитов были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения (Рис. 5).

Результаты идентификации для данных масс приведены в Таблице 5. Следует отметить, что массам 367,1486 и 369,1632 соответствует по два кандидата. Данный факт связан с тем, что кандидаты имеют идентичный элементный состав и, соответственно, идентичное изотопное распределение в спектре, что не позволяет их дифференцировать используемым методом идентификации.

Чтобы подтвердить диагностический потенциал этих метаболитов, данные по интенсивностям масс-спектрометрических пиков использовали для расчета AUC. Было установлено, что метаболиты с массами 302.2442 Да и 304,2602 Да обладают "хорошим" диагностическим потенциалом, так как имеют AUC более 0,8 (Табл. 6).

пололлтельно трясенные ионы метаболитов

377,2680

отрицательно "гпряьенные ноны метаболитов

307,0452 ,

367,1486

х 10

■ I к!

Рисунок 5. Графики средних значений и стандартных отклонений интенсивностей пиков ионов в масс-спектрах метаболитов плазмы крови больных раком простаты (1) и здоровых добровольцев (2). Графики промаркированы соответствующими массами метаболитов (ЬокЬоу е! а1„ 2010).

Таблица 6. Параметры диагностики заболевания рака простаты на основе измерения интенсивности пиков метаболитов в масс-спектрометрическом фингерпринте плазмы крови (ЬокЬоу е! а1., 2010).

Название метаболита т/2 метаболита Пороговое знамение интенсивности Специфичность (%) Чувствительность (%) лис

Ацилкарнитин 302,2442 3283 96,4 94,6 0,97

Арахидоноил амин 304,2602 5750 92,9 86,5 0,86

Изолитохолевая кислота 377,2680 2839 21,4 21,6 0,89*

Дигидроэпиан-дростерон сульфат 367,1486 13452 42,9 40,5 0,64*

5а -дигидростерон сульфат 369,1632 5470 28,6 62,2 0,71*

Концентрация ПСА - 5,36 нг/мл 83,3 35,0 0,59

* - представлены значения 1-АиС, т.к. концентрация соответствующих метаболитов в крови уменьшается при раке простаты.

Таким образом, был проведен масс-спектрометрический анализ метаболома плазмы крови больных раком простаты. Предложенный для этого протокол пробоподготовки позволил наблюдать в масс-спектрометрическом профиле в области

m/z >500 преимущественно масс-спектрометрические пики фосфолипидов и лизофосфолипидов. Более низкомолекулярная область содержит метаболиты различных химических классов, некоторые из которых статистически достоверно отличаются у больных и здоровых пациентов. Были выявлены два метаболита с массами 302,2442 Да и 304,2602 Да, идентифицируемых как ацилкарнитин и арахидоноил амин, вносящих существенный вклад в диагностику, т.к. обладают диагностической силой значительно превышающей существующий ПСА-тест (Табл. 6).

Следует отметить, что результаты идентификации метаболитов подтвердили релевантность диагностики на основе масс-спектрометрических фингерпринтов метаболома плазмы крови к раку простаты. Так, снижение уровня андрогенов в крови больных пациентов согласуется с результатами предыдущих исследований, указывающих на связь низкого уровня тестостерона и рака простаты. Morgentaler и соавт. исследовали гипогонадных мужчин (Morgentaler et al., 1996; Morgentaler and Rhoden, 2006) и установили, что риск развития рака простаты коррелирует со степенью выраженности андрогенной недостаточности. Также известно, что низкое соотношение тестостерон/ПСА является независимым предиктором рака простаты после его нормировки по возрасту и уровню ПСА в крови пациента (Rhoden et al., 2008). Таким образом, обнаруженное снижение концентрации андрогенов в плазме крови больных раком простаты находит подтверждение в предшествующих научных исследованиях и имеет непосредственное отношение к заболеванию раком простаты.

Наблюдаемое падение уровня изолитохолевой кислоты в крови пациентов с раком простаты ранее не было описано. Однако, можно предположить, что это является следствием низкого уровня андрогенов в крови пациента, что приводит к снижению секреции желчных кислот (Ohshima et al., 1996), к которым относится и изолитохолевая кислота.

Изменения в концентрации ацилкарнитинов, наблюдаемые в том числе у больных раком, описаны Vinci и соавт. (2005). Sachan и Dodson (1987), и Malaguarnera и соавт. (2006). Это явление было изучено для поздних стадий рака, когда у пациентов наблюдалась кахексия. В нашем случае, при исследовании ранней стадии рака, увеличение концентрации диметилгепраноил карнитина в крови пациентов с раком простаты, скорее всего, связано с вышеупомянутым низким уровнем андрогенов. Подобная связь концентрации тестостерона в крови с карнитином и ацилкарнитином была ранее описана (Marquis and Fritz, 1965; Carter et al., 1980).

Статистически значимое повышение диоксиуридин монофосфата в крови пациентов с раком простаты вероятно связано с деградацией тРНК, ведущей к

повышению уровня нуклеотидов в крови больных раком (Clio et al., 2009; Hsu et al., 2009; Zheng et al., 2005).

Статистически достоверное изменение уровня арахидоил амина в крови больных раком простаты ранее не было описано. Однако высокая AUC для этого метаболита, равная 0,86, указывает на его высокий потенциал в качестве маркера для ранней диагностики рака простаты.

Таким образом, результаты идентификации метаболитов позволили подтвердить, что диагностика рака простаты по метаболому плазмы крови основана на выявлении в крови процессов, релевантных развитию заболевания. Более того, результаты идентификации выявили несколько метаболитов, потенциально пригодных для ранней диагностики рака простаты.

ДАГНОСТИКА РАКА ЛЕГКОГО НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МЕТАБОЛОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ

В данном исследовании в результате проведенной пробоподготовки образцов плазмы крови и прямого масс-спектрометрического анализа в образцах было детектировано примерно полторы тысячи ионов метаболитов. Существенных различий в количестве детектированных ионов у больных и здоровых пациентов выявлено не было (1580 ±110 и 1535 ±152, соответственно; средние значения ± стандартное отклонение). В спектрах наблюдали равномерное распределение масс ионов различных метаболитов до m/z 450-500, после чего в районе с большим значением m/z наблюдали характерное распределение интенсивных масс-спектрометрических пиков, относящихся, согласно данным предшествующего исследования (Lokhov et al., 2010), к фракции фосфолипидов (включая их лизоформы). Учитывая, что различные и наиболее информативные метаболиты детектируются до m/z 500, именно эта область была выбрана для формирования масс-спектрометрических фингерпринтов.

Математическое преобразование масс-спектров в бинарный код позволило получить фингерпринты, представляющие собой мультивариационные характеристики плазмы крови, где переменными являются бинарные значения, указывающие на наличие или отсутствие определенной массы в масс-спектре. Применяя МГК, была существенно снижена размерность использованных масс-спектрометрических данных путем замены самих фингерпринтов на их проекции в пространстве главных компонент. Причем, выбранные для этого первые семь главных компонент охватывали ~80% всей вариации, представленной в исходных фингерпринтах.

К проекциям фиигерприптов в пространстве семи главных компонент успешно был применен классификатор с учителем (SVM). Формально разделение проб плазмы на классы является моделью диагностики, направленной на выявление рака легкого, эффективность которой может быть установлена тестированием и определением таких параметров как специфичность, чувствительность и точность. Эффективность модели диагностики проверяли тестированием repeated random sub-sampling validation, по результатам которого была вычислена чувствительность, специфичность и точность модельной диагностики (Табл. 7).

Таблица 7. Характеристики модели диагностики рака легкого на основе классификации масс-спектрометрических фингерпринтов метаболома плазмы крови (Lokhov et al., 2012).

Стадии заболевания Параметры диагностики (%)

Чувствительность Специфичность Точность

1 стадия га. норма 100,0 92,4 93,9 ±0,12*

2 стадия ш\ норма 91,4 92,4 92,3 ±0,13

3 стадия норма 92,3 92,4 92,4 ±0,11

4 стадия г.?. норма 93,0 92,4 92,5 ±0,13

1,2 стадии vs. норма 97,1 92,4 93,6 ±0,12

1-3 стадии г.у. норма 94,3 92,4 93,3 ±0,10

1-4 стадии га норма 94,1 92,4 93,3 ±0,10

* - доверительный интервал надежности, вычисленный для доверительной

вероятности 0,95 и рассчитанный по Вапнику (Вапник, 1984).

Таким образом, были получены данные, указывающие на высокую точность диагностики рака легкого на основе масс-спектрометрических фингерпринтов метаболома плазмы крови. Использованная при этом статистическая модель, основанная на редукции многомерных данных, представленных в фингерпринтах, до семи переменных с последующей их классификацией, показала возможность диагностики рака легкого на любой стадии развития, включая бессимптомно протекающие ранние стадии. Однако, можно предположить, что высокая чувствительность диагностики первой стадии (100%, см. Табл. 7), скорее всего не связана с детекцией метаболитов в плазме крови, непосредственно выделяемых опухолью, так как малые размеры опухоли и отсутствие тканевой и клеточной специфичности большинства метаболитов делает это невозможным. Отраженные в фингерпринте факторы, предопределяющие развитие опухоли, например, курение и токсическое воздействие на организм, могли привести к наблюдаемой высокой точности ранней диагностики. Чтобы подтвердить это, была проведена идентификация метаболитов плазмы крови, вносящих вклад в диагностику рака легкого. Результаты идентификации представлены в Таблице 8.

Таблица 8. Метаболиты плазмы крови, входящие в масс-спектрометрический фиигерпринт и имеющие АПС > 0,8 для различных стадий развития рака легкого (ЬокЬоУ е1 а!.. 2013).

Метаболит (химический идентификатор С11ЕВ1) Молекулярный вес Детектируемый ион Элементный состав Значение AUC

Измеренный (m/z) Соответствующий элементному составу (Да) I Ст II адия III эака IV I-IV

1. Халфенпрокс (СНЕВ[:39368| 477,086 477,087 [М+Н]+ C24H2,BrF20, 0,91 0,91 0,81 0,81 0,81

2. Перметрин (СНЕВ134Ч11) 391,079 391,086 [М+Н]+ C21H20CI2O4 0,81 0,76 0,79 0,77 0,77

3. Я-бензол: * Этилбензойная кислота (КА) Метилфенилуксусная кислота (МА) ацетонизол (ЫА) Диметилбензойная кислота (ИА) бензенпроиионат (ЫА) 151,081 151,075 [М+Н]+ C9H10O2 0,91 0,93 0,91 0,91 0,91

4. Сульфон биотина 277,084 277,085 [М+Н]+ C,0H16N,O5S 0,80 0,81 0,73 0,71 0,71

5. Креатинин (СНЕВ1:16737) 114,068 114,066 [М+Н]+ CjHjNJO 0,81 0,77 0,73 0,69 0,72

6. не идентифицирован 248,956 - [М+Х]' - 0,80 0,79 0,69 0,67 0,69

7. не идентифицирован 220,952 - [М+Х]' - 0,93 0,91 0,80 0,78 0,80

ChEBI (Chemical Entities of Biological Interest) свободно распространяемая база данных низкомолекулярных веществ, разработанная Европейским Институтом Биоинформатики (European Bioinformatics Institute - EBI). * - Является обобщенным названием нескольких метаболитов, имеющих бензольное кольцо, соединенное с боковым радикалом, содержащим С=0, -0-, -ОН или -СООН группу.

Статистический анализ показал, что диагностическая сила метаболитов не имеет положительной корреляции со степенью развития рака и наиболее выражена для ранних стадий рака (Табл. 8). Данный факт подтвердил возможную связь этих метаболитов с причиной развития рака, нежели с самим раком. Если так. то метаболиты плазмы крови могут быть использованы для расчета риска возникновения рака. Чтобы определить потенциал метаболитов в оценке риска возникновения рака легкого, для них был рассчитан (Ж (Рис. 6).

стадия рака

Рисунок 6. Диаграмма (Ж значений для метаболитов плазмы крови, указывающих на развитие рака легкого. (Ж рассчитаны с использованием образцов плазмы крови больных раком легкого разных стадий. Размер круга указывает на величину (Ж, рассчитанную по интенсивностям. Серые круги указаны для метаболитов, чьи концентрации увеличиваются при раке легкого, а черные - для метаболитов, чьи концентрации уменьшаются. (Ж величины для халфенпрокса, перметрина, сульфона биотина и Я-бензола отмечены цифрами от 1 до 4, соответственно.

Численные значения ОН для основных метаболитов, указывающих на высокий риск развития рака легкого и детектированных в режиме регистрации положительно заряженных ионов, указаны в Таблице 9.

Таблица 9. Значения О К риска возникновения рака легкого, рассчитанные на основе интенсивностей масс-спектрометрических пиков метаболитов плазмы крови.

Метаболит (химический идентификатор ChEBI) OR (95% CI )

I Стадия p II ака легкого III IV

1. халфенпрокс (СНЕВюзв«) 219 (25- 1905) 288 (27 - 3063) 65 (9 - 495) 27 (3 -167)

2. перметрин (Chebi349id 43 (8 -220) 12 (2-98) 12 (3-58) 4 (0,3-43)

4. Сульфон биотина (na) 80 (10-652) 42 (5-347) 32 (7-139) 2 (0,7-7)

3. R-бензол (na) 124 (15-1056) 192 (19- 1928) 100 (13 -775) 53 (6 - 507)

Идентификация метаболитов подтвердила их релевантность в отношении этиологии рака. Халфенпрокс и перметрин, которые выражено ассоциированы с раком, являются синтетическими инсектицидами. Халфенпрокс сейчас запрещен для использования в Европейском союзе, однако в России халфенпрокс на момент сбора образцов крови для исследования применялся в сельском хозяйстве. Перметрин — другой широко используемый инсектецид — классифицирован IARC как "не классифицированный по своей канцерогенности для человека — группа 3" (Occupational Exposures in Insecticide Application and some pesticides. France: Lyon; 1991). В США перметрин был классифицирован ЕРА, как канцероген для животных, на основе ряда исследований на моделях мышей, где потребление перметрина привело к возникновению рака легкого ("Permethrin Facts", US ЕРА, June 2006). Однако недавние исследования не выявили прямой связи между перметрином и каким-либо раком у человека (Rusiecki, 2007). Поэтому повышенный уровень инсектицидов в крови, скорее всего, опосредованно связан с этиологией рака легкого. Например, наиболее распространенная причина рака легкого - длительное воздействие на организм табачного дыма (Tobacco and cancer, 1992; Ruano-Ravina et al, 2003). Табачный дым ингибирует цитохром Р450 2Е1 (Van Vleet et al., 2001), который катаболизирует пестициды (Lang et al., 1997; Mutch et al., 2006). Таким образом, повышенный уровень инсектицидов в крови больных раком может быть вызван ингибированием цитохрома.

Другим метаболитом, указывающим на риск возникновения рака легкого с

большим OR, был сульфон биотина, который представляет собой окисленный биотип

(также известен как витамин Н). Высокий уровень сульфона биотина, установленный

в плазме крови больных раком легкого, также подтверждается данными недавних метаболомных исследований, которые показали, что с раком легкого связано увеличение уровня гидроксиизовалерьяновой кислоты в крови и моче (Ног! е1 а1., 2011; Сагго1а с! а1., 2011), что является следствием дефицита биотина в организме (Моек й а1., 2002). Возможной причиной ускоренного катаболизма биотина, ведущего к дефициту его в организме и одновременному увеличению уровня его окисленных форм в биологических жидкостях, может быть курение табака (5еа1еу е1 а1., 2007).

К-бензол, идентифицированный в данном исследовании и показавший высокое значение СЖ, ранее уже был обнаружен в выдыхаемом воздухе больных раком легкого (Реп£ й а1., 2009). Бензольные кольца часто встречаются в ксенобиотиках и пестицидах, включая халфенпрокс и перметрин. Более того, метилфенил уксусная кислота, которая также соответствует элементному составу К-бснзола, является метаболитом распространенных гербицидов (Ыотен е1 а1., 1983). Поэтому Я-беизол, присутствующий в плазме, может являться продуктом деградации гербицидов попавших в организм. Другое возможное объяснение нахождения Я-бензола в крови это поступление в организм во время курения этиленбензойной кислоты, которая также соответствует элементному составу Я-бепзола и является компонентом табачного дыма (ТЬе^ат е1 а1., 1980).

Таким образом, метаболиты плазмы крови отражают воздействие на организм факторов, вызывающих рак легкого. Прямой масс-спектрометрический анализ низкомолекулярной фракции крови позволил выявить эти метаболиты и оценить на их основе риск возникновения рака легкого.

Следует отметить, что возможность использования прямого масс-спектрометрического анализа плазмы крови, как для диагностики, так и оценки риска возникновения рака легкого, является не совсем обычной ситуацией для лабораторной диагностики. Эта ситуация является следствием выраженной роли внешнего воздействия на организм в возникновении рака легкого и способности метаболома плазмы крови отражать это воздействие высокими значениями О Я (до 300). На сегодняшний день максимальное измеренное значение (Ж для рака легкого достигало лишь 55 и оценивалось по уровню котинина в крови (ВойеИа, 2006). При значительно больших значениях (Ж, т.е. когда шанс возникновения заболевания у пациента крайне высок, можно уже говорить о диагностике заболевания с высокими значениями Лис. Практический смысл такой интеграции диагностики и оценки риска возникновения заболевания заключается в том, что если при положительных результатах диагностики наличие заболевания не будет подтверждено, то можно говорить о высоком риске заболевания у пациента. Или наоборот, если рассчитанное

значение 011 крайне высоко, то необходимо обязательно проверить пациента на наличие рака легкого, т.к. вероятность того, что пациент уже болен, крайне высока.

ДИАГНОСТИКА НАРУШЕННОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ К ГЛЮКОЗЕ (НТГ) НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МЕТАБОЛОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ

При метаболомном исследовании СД 2-го типа математический аппарат обработки масс-спектрометрических данных был изменен. Вместо классификации бинарных масс-спектрометрических фингерпринтов был введен диагностический показатель. Подобное изменение явилось следствием адаптации результата метаболомного анализа плазмы крови к его последующему практическому применению.

Масс-сггектрометрическим анализом метаболома плазмы крови детектировали ионы метаболитов, связанные с наличием у пациентов НТГ. Метаболиты, чья концентрация в крови увеличивалась при НТГ с АГГС более 0,7 или уменьшалась с АиС более 0,76, были использованы в модели диагностики НТГ для расчета многопараметрического диагностического показателя.

0,8-

0 I X

X р

я >

0,4

ROC кривая

Точность 90% Специфичность 90% Чувствиткльность 90%

0,2-

AUC = 0,93

-,-,-,-р_

0,2 0,4 0,6 0,8 1 - Специфичность

Рисунок 7. ROC кривая для модели диагностики НТГ на основе прямого масс-спектрометрического анализа метаболома плазмы крови. Точка, указанная на ROC кривой, соответствует максимальной точности диагностики. Площадь под ROC кривой (т.е. AUC) выделена затемнением.

AUC для диагностики НТГ на основе совокупности метаболитов плазмы крови составила 0,93, что указывает на пригодность прямого масс-спектрометрического анализа метаболома плазмы крови для диагностики НТГ (Рис. 7). Точность, чувствительность и специфичность были равны 90%. Точность диагностики не достигла максимально возможного значения, так как контрольная и экспериментальная группы формировались на основе ПГТТ, который, в свою очередь, также имеет погрешность.

Следует отметить, что основным недостатком применяемого в клинике ПГТТ для выявления НТГ является его низкая воспроизводимость (Mcdonald et al., 1965; Ко et al., 1998). Уровень глюкозы в крови колеблется в широких пределах и его коэффициент вариации (CV — coefficient of variation; процентное соотношение стандартного отклонения величины к ее среднему значению) в 2-х часовом ПГТТ составляет ~25% (Mcdonald et al., 1965), что и приводит к очень низкой воспроизводимости результатов. Такой высокий CV неприемлем для биоаналитических тестов, где значение равное 15%, рассматривается как максимально допустимое ("U.S. FDA", 2001).

Уровень метаболитов в крови также имеет высокий CV (медиана CV 46%) (Crews et al., 2009). Как следствие, метаболические тесты с применением масс-спектрометрических методов характеризуются низкой воспроизводимостью, что мешает их внедрению в клиническую практику (Strathmann and Hoofnagle, 2011). Применение диагностики, основанной на использовании совокупности связанных с НТГ метаболитов, устраняет этот недостаток. Расчет многопараметрического диагностического показателя привел к усреднению ошибки, заложенной в измерении отдельных метаболитов. В результате CV диагностического показателя на НТГ составил 8,4%, что существенно ниже показателей CV, допустимых для биоаналитических тестов. Вследствие малого значения CV измеренная в эксперименте воспроизводимость модели диагностики па НТГ составила 85%, что значительно лучше, чем для ПГТТ.

Метаболиты плазмы крови, вносящие вклад в диагностику НТГ

Для подтверждения релевантности используемых для диагностики НТГ ионов метаболитов развитию СД 2-го типа, была проведена идентификация ионов метаболитов, задействованных в расчете многопараметрического диагностического показателя. Результаты идентификации метаболитов, уровень которых в крови увеличивался при НТГ с AUC > 0,7, представлены в Таблице 10.

Таблица 10. Метаболиты плазмы крови, уровень которых увеличивается при НТГ с величиной А11С более 0,7 (ЪокЬоу е1 а1„ 2014).

Метаболит (идентификационный номер в базе*) Молекулярный вес Детектируемый нон Элементный состав Тест Вилкоксона (P) AUC

Измеренный (ш1г) Соответствующий элементному составу (Да)

2,3-Буталдиол (НМОВОЗНб) 135,0390 135,0392 [M+2Na-H]+ c,H,„o2 0,0027 0,76

Линолеамид {\letlin Ш 43435) 280,2631 /302,2432 280,2635/302,2454 [M+H]7[M+Naf C,„H,,NO 0,0012 0,77

Олеамид (НМОВ02117) 282,2778 282,2791 [M+Hf C„H,sNO 0,0178 0,71

Стеарамид (ШТОВ34146) 284,2916 284,2948 [М+Н]* C„H„NO 0,0052 0,74

Децендикислота (ШТОВОО&ОЗ) 223,0943 223,0941 [M+Naf ciohl604 0,0288 0,72

а- или р-кетооктановая кислота (НМЦВ13211 илиНМОВЮ721) 181,0827 181,0835 [M+Na]* c,Huo3 0,0335 0,71

Октановая кислота (НМОВ00392) 165,0859 165,0886 [M+Na]* с,нио2 0,0183 0,73

Яблочная кислота (НМОВ00156) 178,9882 178,9927 [M+2Na-H]* C4H„Os 0,0204 0,72

Глюкуроновая кислота (НМПВ00127) 239,0164 239,0138 [M+2Na-H]* c6h,0o7 0,0303 0,71

Фосфогликолевая кислота (НМОВ00816) 200,9532/ 156,9831 200,9535/ 156,9897 [M+2Na-H]* / [M+H]* C2HsO(,P 0,016 0,74

П-крезол сульфат (НМОВ11635) 211,0033 211,0035 [M+Na]* c,hi04s 0,0050 0,76

Орнитин (НМОВ00214) 133,0962 133.0972 [m+h]* CSH,2N;0; 0,0227 0,72

Фосфатидилхолин181'140 (НМОВ08097) 366,7848 366,7805 [M+2h]2* c41,h„no,p 0,058 0,71

* - "HMDB" буквенная часть идентификационного номера записи данных метаболита из базы "Human Metabolome Database" (http://www.hmdb.ca) (Wishart et al., 2007); "Metlin ID" буквенная часть идентификационного номера записи данных метаболита из базы Metlin (Scripps Center for Mass Spectrometry, США; http://metlin.scripps.edu) (Smith et al., 2005).

Следует отметить, что метаболическая картина плазмы крови при развитии диабета уже описана. Поэтому, чтобы подтвердить релевантность метаболитов, используемых для диагностики НТГ, была установлена связь идентифицированных метаболитов с развитием СД 2-го типа. В частности известно, что амиды жирных кислот, также известные как эндоканабиоиды, к которым относятся выявленные в исследовании линолеамид, олеамид и стеарамид, играют важную роль при развитии СД 2-го типа (Табл.10). Активация эндоканабиоидной системы приводит к увеличению потребления пищи (Engeli et al., 2005) и ухудшению кардиоваскулярного профиля (увеличение веса, индекса массы тела, объема талии, увеличение в крови уровня инсулина и адипонектина) (Sipe et al., 2005). Повышенный уровень жирных кислот, который зарегистрирован у пациентов с НТГ, также подтверждается ранее полученными данными. Так, метаболический синдром, выявляемый у предиабетиков, характеризуется повышенным уровнем липидов (Fonseca, 2005), в том числе и жирных кислот (Suhre et al., 2010).

Увеличение фосфатидилхолина также может являться проявлением метаболического синдрома, связанного с НТГ и характеризующегося липидными нарушениями.

Децендикислота относится к дикарбоновым кислотам, увеличение экскреции которых с мочой обнаружено у диабетиков, и которые рассматриваются как маркеры окислительного воздействия на жирные кислоты (Inouye et al., 2000). Увеличенный уровень в крови децендикислоты в нашем исследовании может указывать на усиление подобного окисления при НТГ.

а-Кетооктановая кислота — кетокислота с разветвленным углеродным радикалом, является интермедиатом в катаболизме лейцина. Недавно было установлено, что лейцин и другие аминокислоты с разветвленной углеродной цепью являются биомаркерами риска развития диабета (Wang et al., 2011). Другая кетокислота — р-кетооктановая кислота, образуется из малонил-коэнзима. Высокий уровень р-кетооктановой кислоты был установлен у пациентов с избыточным весом и диабетом (Bandyopadhyay et al., 2006). Одна из этих двух, а возможно и обе кетооктановые кислоты вносят вклад в диагностику НТГ. Используемый метод идентификации метаболитов не позволяет различить а- и р-кетокислоты.

П-крезол сульфат — метаболит микробов, является также вторичным метаболитом п-крезола. Известно, что диабетики имеют высокую концентрацию как свободного, так н общего п-крезола в своей крови (Meijers et al., 2008).

Орнитин - аминокислота, произведенная в цикле мочевой кислоты. Уровень орнитина в плазме крови диабетиков повышен в результате снижения активности аргиназы (Kashyap et al., 2008).

Фосфогликолевая кислота является субстратом для триозофосфат изомеразы. В литературе нет данных о повышении ее уровня в связи с наличием НГТ у пациента.

Бутандиол продуцируют различные микроорганизмы в процессе, известном как бутандиоловое брожение (Geckil et al., 2004). В этом процессе бутандиол является одним из продуктов анаэробного брожения глюкозы. Связь этого метаболита с НТГ отражает известную роль кишечной флоры в развитии СД 2-го типа (Qin et al., 2012).

Среди идентифицированных метаболитов, характеризующихся низким уровнем при НТГ, только изменение уровня ионов калия было достоверно. Известно, что уровень калия понижен при диабетическом кетоацидозе. В организме происходит интенсивное выведение положительно заряженных ионов калия через почки, вместе с отрицательно заряженными кетонами, повышение уровня которых зарегистрировано при НТГ. Таким образом, зарегистрированное снижение ионов калия тоже связано с развитием диабета.

Идентификация других метаболитов, характеризующихся низким уровнем при НТГ, была осложнена ввиду особенностей используемого метода ионизации. При электроспрейной ионизации анализируемые вещества образуют квазиионы, в том числе и с калием. В данном исследовании у пациентов с НТГ уровень калия значительно менялся и, как следствие, менялся уровень образующихся калийсодержащих квазиионов. Поэтому для анализа метаболитов крови, характеризующихся низким уровнем при НТГ, необходимо использование других методов ионизации.

Таким образом, прямой масс-спектрометрический анализ метаболома плазмы крови позволяет диагностировать НТГ на основе метаболической картины крови, отражающей развитие СД 2-го типа у пациента. Дальнейшие исследования на более крупных выборках помогут более полно охарактеризовать эффективность такой диагностики, однако уже сейчас данный тест можно рассматривать как более воспроизводимую, быструю и щадящую пациента альтернативу используемому в клинике ПГТТ.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИГНАТУРЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Проведенные метаболомные исследования подтвердили возможность использования прямого масс-спектрометрического анализа метаболома плазмы крови в диагностике и оценке риска возникновения заболеваний. Показаны его преимущества по отношению к существующей лабораторной диагностике. Однако

непосредственное применение результатов этих исследований в клинике проблематично. Связано это с тем, что "омные" технологии, включая метаболомику, не измеряют абсолютные значения концентраций веществ. Например, масс-спектрометрический анализ дает информацию о концентрации метаболита через интенсивность соответствующего ему пика в масс-спектре. При этом уровень интенсивности пика зависит от используемого протокола пробоподготовки образца, типа масс-спектрометра, его технических характеристик, настройки линз, детектора и т.д. Поэтому масс-спектрометрические фингерпринты, успешно используемые в исследованиях типа "случай-контроль", не применимы в лабораторной диагностике, так как носят относительный характер. Другая проблема заключается в том, что метаболом является многопараметрической, т.е. включающей множество параметров, характеристикой, требующей его преобразования в один параметр - диагностический показатель. Используемый для этого математический аппарат, как правило, подразумевает многостадийную обработку данных, включающую снижение размерности масс-спектрометрических данных и их классификацию (собственно диагностику) с применением различного рода классификаторов. При этом разнообразные алгоритмы, используемые в метаболомных исследованиях типа "случай-контроль", также не пригодны для применения в лабораторной диагностике. Таким образом, в медицинской практике может быть использован только тот метаболомный анализ плазмы крови, который соответствует критериям лабораторной диагностики по воспроизводимости и обработке результатов.

Используемый в диссертационной работе метаболомный анализ на основе прямого масс-спектрометрического анализа низкомолекулярной фракции плазмы крови является наиболее приемлемым вариантом для лабораторной диагностики. Отсутствие промежуточных стадий разделения метаболитов, вносящих искажения в результаты анализа, позволяет получить масс-спектр низкомолекулярпых веществ максимально приближенный к реальному метаболому крови, что обеспечивает воспроизводимость результатов метаболомного анализа в различных диагностических лабораториях.

Математический аппарат, по мнению соискателя, для лабораторной диагностики должен основываться на сигнатурах (наборах значений переменных, формирующих специфическую картину), записанных с применением квантилей, т.е. значений, которые заданная переменная величина не превышает с фиксированной вероятностью. Если интенсивность масс-спектрометрического пика метаболита обладает диагностической силой, то для интенсивности этого пика можно определить оптимальное пороговое значение, выше которого интенсивность пика будет указывать на наличие заболевания, ниже — на его отсутствие. Данное пороговое

значение можно выразить через квантиль распределения интенсивности этого пика, рассчитанный с использованием масс-спектров контрольной выборки.

Таким образом, сигнатура, включающая m/z масс-спектрометрических пиков, связанных с заболеванием, и их пороговые значения, выраженные в квантилях, не использует абсолютные значения интенсивности масс-спектрометрических пиков и не зависит от условий получения масс-спектров (т.е. сигнатура записана через параметры распределения входящих в нее переменных и поэтому в какой-то степени аппаратно-независима).

Перевод сигнатуры в диагноз осуществляется путем расчета диагностического показателя по принципу суммирования количества ионов метаболитов в сигнатуре, интенсивность масс-спектрометрических пиков которых превысила указанное в квантилях пороговое значение (см. описание расчета диагностического показателя для НТГ). Подобный расчет прост и не требует дополнительного математического преобразования, поэтому оптимален для лабораторной диагностики.

Ниже представлены записанные по такому принципу масс-спектрометрические сигнатуры для диагностики рака простаты, рака легкого и НТГ:

Масс-спектрометрическая сигнатура для теста на рак простаты:

300,22"' 304,26°' 318,23°' 322,25°' 336,24°'

302,240'"; 305,26°'5; 320,25'°°; 330,26®"'; 357,23"'"

303,241'' 306,26'™ 321,24°' 334,23°'

Точность диагностики рака простаты (аденокарциномы) 2-ой стадии по данной сигнатуре составляет 96% (специфичность 100%, чувствительность 97%, АЦС 1,00). Результат теста считается положительным при значениях диагностического показателя >7.

Масс-спектрометрическая сигнатура для теста на рак легкого:

151,075"' 268,891°' 391,086°' 479,085°'

153,024°"; 270,888°'87; 477,087°'"'; 480,089°'";

210,935°'7°; 278,088°'"; 478,091°'86; 481,091"'73

Точность диагностики рака легкого 1-1У стадий по данной сигнатуре составляет 88% (специфичность 99%, чувствительность 77%, АиС 0,93). Результат теста считается положительным при значениях диагностического показателя >7.

По данной сигнатуре можно также оценить риск возникновения рака легкого. Для значений диагностического показателя до 7 (Ж в среднем одинаковое и колеблется около 30. При значениях диагностического показателя 8 и 9 (Ж равно 217 и 313, соответственно. При значениях диагностического показателя 10 и более (Ж согласно формуле расчета стремится к бесконечности.

Масс-спектрометрическая сигнатура для теста на НТГ:

133,097 , 135,039 ; 149,057'72; 165,089°'71; 177,1240,89; 178,993"'85' 181 citi«.75.

211,004°"; 223,094"

181,084 ; 200,973" '"; 228,924i№; 239,014°'";

250,0450-71; 256,155°'7*; 256,261°"'; 263,085°' 278,2440'79; 280,264°'2; 282,279°'7"; 284,295°':

297,228"'"; 366,833"'77 114,896°" 152,046' 250,865' 306,827°

6'"; rUJ.

302,245"' ; 367,119° 116,896° 172,854° 256,981"

310,874°"°; 376,8 Ю"'75; 122,925°"; 238,839°"; 260,896°";

312,327""''; 434,819°"; 124,923°"; 248,868°"; 298,795°"; 304,740пЛ

175,1450'71

204,9520'77

248,242°'

272,943°'

296,221°'

324,253°

494,773°'

139,914°

249,872°

Точность диагностики НТГ по данной сигнатуре составляет 90% (специфичность 90%,

чувствительность 90%, АиС 0,93). Результат теста считается положительным при значениях диагностического показателя >22. Сигнатура работает при нормальных значения глюкозы в крови (не более 6,1 ммоль/л).

Воспроизводимость пороговых значений, выраженных в квантилях, была продемонстрирована на примере диагностической сигнатуры рака легкого. Для этого пороговые значения для метаболитов, включенных в сигнатуру, были переведены в квантили с использованием двух, не пересекающихся контрольных выборок, каждая из которых содержала по 50 масс-спектров. Полученные таким образом пороговые значения в квантилях сравнили (Рис. 8), и коэффициент детерминации Я2 аппроксимации их линейной регрессии составил 0,80, что подтвердило воспроизводимость пороговых значений, выраженных в квантилях у независимых выборок.

■ выборка N91 □ выборка №2

А)

Б)

г метаболитов

квантиль

Рисунок 8. Воспроизводимость пороговых значений масс-спектрометрической сигнатуры рака легкого, выраженных в квантилях и рассчитанных на масс-спектрах плазмы крови двух независимых контрольных выборок. А) Визуальное сравнение. Б) Линейная экстраполяция. Я2 коэффициент детерминации линейной аппроксимации.

Таким образом, независимая выборка позволяет перевести пороговые значения сигнатуры в пороговые значения интенсивностей масс-спектрометрических пиков, что дает возможность использования сигнатуры с разными масс-спектрометрами.

Рекомендации по применению результатов диссертационной работы.

Результаты диссертационной работы рекомендуется использовать для внедрения метаболомной диагностики в клиническую медицину. Разработанные протоколы масс-спектрометрического анализа и обработки полученных результатов могут являться основой для написания стандартных операционных процедур и лабораторных регламентов для метаболомной диагностики рака простаты, рака легкого и НТГ, а также других заболеваний, для которых будет впоследствии найдена и записана в унифицированной форме масс-спектрометрическая сигнатура.

выборка №1

0.9

Выводы

1. Метаболом плазмы крови может быть эффективно использован для диагностики и

оценки риска возникновения ряда социально значимых заболеваний.

2. Масс-спектр метаболома плазмы крови, полученный прямой инжекцией фракции

метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, является мультивариационной характеристикой, позволяющей достоверно диагностировать или оценивать риск возникновения таких социально значимых заболеваний, как рак простаты, рак легкого и сахарный диабет 2-го типа.

3. Метаболиты, вносящие вклад в диагностику или оценку риска возникновения

заболеваний, отражают изменения в организме пациента, имеющие непосредственное отношение к этиологии и/или развитию этих заболеваний.

4. Масс-спектр метаболома плазмы крови, полученный прямой инжекцией раствора

метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, содержит масс-спектрометрическую сигнатуру рака простаты (аденокарциномы) 2-ой стадии. Чувствительность (97%), специфичность (100%) и точность (96%) диагностики на ее основе существенно превышают характеристики иммуноферментного ПСА-теста (35%, 83% и 52%, соответственно) для той же выборки пациентов.

5. Масс-спектр метаболома плазмы крови, полученный прямой инжекцией раствора

метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, содержит масс-спектрометрическую сигнатуру рака легкого. Чувствительность, специфичность и точность диагностики на ее основе составляют 77%, 99%, 88%, соответственно. Точность диагностики с применением данной сигнатуры выше на ранних стадиях и уменьшается по мере развития заболевания. Точность диагностики с применением сигнатуры значительно выше, по сравнению с применяемыми в медицине онкомаркерами данного заболевания.

6. Масс-спектр метаболома плазмы крови, полученный прямой инжекцией раствора

метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, содержит масс-спектрометрическую сигнатуру, указывающую на риск возникновения рака легкого. Превышение пороговых значений концентраций в крови веществами, входящими в сигнатуру, указывает на увеличение шанса возникновения рака легкого ((Ж) в десятки и сотни раз, что делает ее эффективным средством оценки риска возникновения заболевания.

7. Масс-спектр метаболома плазмы крови, полученный прямой инжекцией раствора

метаболитов в источник ионизации масс-спектрометра, содержит масс-спектрометрическую сигнатуру НТГ. Точность диагностики равная 90% (специфичность 90%, чувствительность 90%, воспроизводимость 85%) позволяет рассматривать прямую масс-спектрометрию метаболома плазмы крови в качестве эффективной альтернативы используемому сейчас ПГТТ для диагностики НТГ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1а. Лохов, П.Г. Масс-спектрометрические методы в метаболомике / П.Г. Лохов, А.И.

Арчаков // Биомедицинская химия. — 2008. — № 54. — С. 497-511. lb. Lokhov, P.G. Mass spectrometry methods in metabolomics / P.O. Lokhov, A.I. Archakov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B. — 2009. — Vol. 3. — № 1, — P. 1-9.

2a. Лохов, П.Г. Метаболический фингерпринтинг плазмы крови больных раком предстательной железы / П.Г. Лохов, М.И. Даштиев, Л.В. Бондарцов, А.В. Лисица, С.А. Мошковский, А.И. Арчаков // Биомедицинская химия. — 2009.

— №55, —С. 247-254.

2b. Lokhov, P.G. Metabolic fingerprinting of blood plasma from patients with prostate cancer / P.G. Lokhov, M.I. Dashtiev, L.V. Bondartsov, A.V. Lisitsa, S.A. Moshkovskii, A.I. Archakov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B. — 2010, —Vol. 4. —№ 1, —P.37^11.

3. Lokhov, P.G. Metabolite profiling of blood plasma of patients with prostate cancer / P.G.

Lokhov, M.I. Dashtiev, S.I. Moshkovskii, A.I. Archakov // Metabolomics. — 2010.

— Vol. 6, —№ 1, —P. 156-163.

4. Лохов, П.Г. Способ диагностики онкологических заболеваний предстательной

железы на основе ацилкарнитина и арахидоношт амина / П.Г. Лохов, А.И. Арчаков, С.А. Мошковский, М.И. Даштиев. Патент РФ, Номер публикации 2445000 от 20.03.2012.

5. Lokhov, P.G. Diagnosis of lung cancer based on direct-infusion electrospray mass

spectrometry of blood plasma metabolites / P.G. Lokhov. O.N. Kharibin, A.I. Archakov // International Journal of Mass Spectrometry. — 2012. — Vol. 309. — P. 200-205.

6. Lokhov, P.G. Blood plasma metabolites and the risk of developing lung cancer in Russia

/ P.G. Lokhov, O.P. Trifonova, D.L. Maslov, A.I. Archakov // European Journal of Cancer Prevention: the Official Journal of the European Cancer Prevention Organisation (ECP). — 2013. — Vol. 22. — № 4. — P. 335-341. 7a. Трифонова, О.П. Метаболомное профилирование крови / О.П. Трифонова, П.Г. Лохов, А.И. Арчаков // Биомедицинская химия. — 2014. — Т. 60. — № 3. — С. 281-294.

7b. Trifonova, O.P. Metabolomic profiling of blood plasma / O.P. Trifonova, P.G. Lokhov, A.I. Archakov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B. — 2013. — Vol. 7.

— №3,—P. 179-186.

8а. Лохов, П.Г. Масс-спектрометрический анализ низкомолекулярной фракции крови как способ унификации терапевтического лекарственного мониторинга / П.Г. Лохов, Д.Л. Маслов, О.П. Трифонова, Е.Е. Балашова, А.И. Арчаков // Биомедицинская химия. — 2014. — Т. 60. —№ 2. — С. 201-216. 8b. Lokhov, P.G. Mass spectrometry analysis of blood low-molecular fraction as a method for unification of therapeutic drug monitoring / P.G. Lokhov, D.L. Maslov, O.P. Trifonova, E.E. Balashova, A.I. Archakov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series В. — 2014, — Vol. 8, —№ 1, — P. 1-10.

9. Trifonova, O.P. Postgenomics diagnostics: metabolomics approaches to human blood

profiling / O.P. Trifonova, P.G. Lokhov, A.I. Archakov // OMICS: A Journal of Integrative Biology. —2013, —Vol. 17.—№ 11.—P. 550-559.

10. Moshkovskii, S. OMICS for tumor biomarker research in: Biomarkers in Disease:

Methods, Discoveries and Applications. Biomarkers in Cancer / S. Moshkovskii, M. Pyatnitsky, P. Lokhov, A. Baranova; V.R. Preedy, V.B. Patel (Eds.). — Netherlands: Springer, 2015. — P. 1-22.

11. Lokhov, P.G. Diagnosing impaired glucose tolerance using direct infusion mass

spectrometry of blood plasma metabolites / P.G. Lokhov, O.P. Trifonova, D.L. Maslov, E.E. Balashova, A.I. Archakov, E.A. Shestakova, M.V. Shestakova, I.I. Dedov // PLoS One. — 2014. — Vol. 9. — № 9. — e 105343.

12. Лохов. П.Г. Диагностика нарушенной толерантности к глюкозе прямым масс-

спектрометрическим анализом метаболитов плазмы крови / П.Г. Лохов, О.П. Трифонова, Д.Л. Маслов, Е.Е. Балашова, А.И. Арчаков, Е.А. Шестакова, М.В. Шестакова, И.И. Дедов // Проблемы эндокринологии. — 2014. — № 3. — С. 4-9.

13а. Лохов, П.Г. Масс-спектрометрический анализ липидома плазмы крови, как способ диагностики заболеваний, оценки эффективности и оптимизации лекарственной терапии / П.Г. Лохов, Д.Л. Маслов, Е.Е. Балашова. О.П. Трифонова, Н.В. Медведева, Т.И. Торховская, О.М. Ипатова, А.И. Арчаков, П.П. Малышев, В.В. Кухарчук, Е.А. Шестакова, М.В. Шестакова, И.И. Дедов // Биомедицинская химия. —2015. — №61. — № 1. —С. 7-18. 13b. Lokhov, P.G. Mass spectrometry analysis of blood plasma lipidome as the method of disease diagnostics, evaluation of effectiveness and optimization of drug therapy / P.G. Lokhov, D.L. Maslov, E.E. Balashova, O.P. Trifonova, N.V. Medvedeva, T.I. Torkhovskaya, O.M. Ipatova, A.I. Archakov, P.P. Malyshev, V.V. Kukharchuk, E.A. Shestakova, M.V. Shestakova, I.I. Dedov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B. — 2015. — Vol. 9. — № 2. — P. 95-105.

Материалы трудов конференций

14. Lokhov, P.G. Metabolome profiling of plasma from patients with prostate cancer / P.G.

Lokhov, A.V. Lisitsa, A.I. Archakov // HUPO 6th Annual World Congress, October 6-10, 2007, Seoul, Korea. — Molecular & Cellular proteomics. — 2007. — October.— P. 243.

15. Lokhov, P.G. Bioinformatics treatment of human metabolome profile for diagnostics /

P.G. Lokhov, A.I. Archakov // U.S.-Russia Scientific Forum, Moscow, November, 16-18,2011, — Сборник тезисов. — 2011. — С. 20.

16. Лохов, П.Г. Метаболиты плазмы крови и риск развития рака легкого / П.Г. Лохов,

О.П. Трифонова, Д.Л. Маслов, А.И. Арчаков // Постгеномпые методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. III международная научно-практическая конференция. 22-24 ноября, 2012, Казань. — Сборник тезисов. — 2012. — С. 167.

17. Лохов, П.Г. Метаболиты плазмы крови и риск развития рака легкого / П.Г. Лохов,

О.П. Трифонова, Д.Л. Маслов, А.И. Арчаков // Конференция Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича" РАМН, 4-5 июня 2013. — Сборник тезисов.—2013.—С. 10.

18. Трифонова, О.П. Метаболическое профилирование плазмы крови для оценки

риска развития рака легкого / О.П. Трифонова, Д.Л. Маслов, П.Г. Лохов, А.И. Арчаков // XX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Москва, 15-19 апреля 2013 года. — Сборник тезисов. — 2013. — С. 155.

19. Маслов, Д.Л. Прямая масс-спектрометрия как метод оценки влияния экзогенных

липидов на состав плазмы крови / Д.Л. Маслов, О.П. Трифонова, П.Г. Лохов // XX Российский национальный конгресс «Человек н лекарство» Москва, 15-19 апреля 2013 года. — Сборник тезисов.—2013. — С. 103. 0. Лохов, П.Г. Метаболомика и терапевтический лекарственный мониторинг / П.Г. Лохов, Д.Л. Маслов, О.П. Трифонова, Е.Е. Балашова, А.И. Арчаков // XX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Москва. 15-19 апреля 2013 года. — Биомедицинская химия. — 2014. — Т.60. — № 2. —

C.223.

21. Trifonova, О.P. Risk assessment of lung cancer development on the basis of mass

spectrometry analysis of blood plasma metabolites / O.P. Trifonova, P.G. Lokhov,

D.L. Maslov, A.I. Archakov // FEBS Congress 2013, July 6th-11th, St. Petersburg, Russia. — FEBS Journal. — 2013. — Vol. 280(Suppl. 1). — P. 309.

22. Lokhov, P.G. Metabolic fingerprinting of blood plasma as a diagnostic and risk

assessment tool for diabetes / P.G. Lokhov, O.P. Trifonova, D.L. Maslov, M.V. Shestakova, E.A. Shestakova, I.I. Dedov, A.I. Archakov // FEBS Congress 2013.

July 6th-11th, St. Petersburg, Russia. — FEBS Journal. — 2013. — Vol. 280(Suppl. 1). —P. 631-632.

23. Трифонова, О.П. Расчет риска возникновения рака легкого на основе

метаболического профиля плазмы крови / О.П. Трифонова, П.Г. Лохов, Д.Л. Маслов, А.И. Арчаков // V Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биологии. нанотехнологий и медицины", г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013г. — Сборник тезисов. — 2013, — С. 127-128.

24. Маслов, Д.Л. Лабораторная диагностика заболеваний методом прямого масс-

спектрометрического анализа липидома плазмы крови / Д.Л. Маслов, О.П. Трифонова, П.Г. Лохов // V Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013г. — Сборник тезисов. — 2013, —С. 98-99.

25. Archakov, A.I. From analog to digital biomarkers in diagnostics / A.I. Archakov, A.V.

Lisitsa , P.G. Lokhov, S.A. Moshkovskii // 4th International Conference on Biomarkers & Clinical Research. July 15-17, 2013, Courtyard by Marriott Philadelphia Downtown, USA. — Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis.

— 2013, —Vol. 4, —№3—P. 136.

26. Lokhov, P.G. Diagnosing impaired glucose tolerance using direct mass spectrometry of

blood plasma metabolites / P.G. Lokhov, O.P. Trifonova, D.L. Maslov, E.B. Balashova, M.V. Shestakova, E.A. Shestakova, I.I. Dedov, A.I. Archakov // 5th International Conference on Biomarkers & Clinical Research. April 15-17, 2014, St Hilda's College - University of Oxford, UK. — Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. — 2014. - Vol. 5. - №2 - P. 125.

27. Лохов, П.Г. Диагностика нарушенной толерантности к глюкозе прямым масс-

спектрометрическим анализом метаболитов плазмы крови / П.Г. Лохов, О.П. Трифонова, Д.Л. Маслов, Е.Е. Балашова, А.И. Арчаков, Е.А. Шестакова, М.В. Шестакова, И.И. Дедов // XXI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Москва, 7-11 апреля 2014 года. — Сборник тезисов. — 2014. — С. 73.

28. Trifonova, O.P. Characterization of blood plasma metabolome of healthy men by mass

spectrometry approach / O.P. Trifonova, P.G. Lokhov // HUPO 13lh Annual World Congress, October 5-8, 2014, Madrid, Spain. — "Abstracts Book - HUPO 2014".

— 2014, —P. 289.

29. Lokhov, P.G. Diagnosing impaired glucose tolerance using direct mass spectrometry of

blood plasma metabolites / P.G. Lokhov, O.P. Trifonova // HUPO 13th Annual World Congress, October 5-8. 2014, Madrid, Spain. — "Abstracts Book - HUPO 2014", —2014, —P. 298.

Подписано в печать 04.06.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 7712-5-15 Типография ООО "АП-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Информация о работе

Лохов, Петр Генриевич
доктора биологических наук
Москва, 2015
ВАК 03.01.04

Автореферат

Метаболом плазмы крови для диагностики и оценки риска возникновения рака простаты, рака легкого и сахарного диабета 2-го типа - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы