Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм перекиси водорода в эритроцитах и механизм защиты гемоглобина от окислительной деструкции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм перекиси водорода в эритроцитах и механизм защиты гемоглобина от окислительной деструкции"

министерство здравоохранения российской фндера11ии российский госудлРстиЕШШЯ нндииинския утшкрситот

f Па apaimx рукописи УДК.ЬЗе.В:(577.158.7*546.215)

ТИТОВ ВЛАДИМИР ВРЬЕВИЧ

"М8ТАШЛИЗИ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА В ЭРИТРОЦИТАХ И МЕХАНИЗМ. ЗАЩИТЫ ГЕМОГЛОБИНА ОТ ОКИСЛИТШ1ЫЮЙ ДКСТРУЩКИ'

Специальность 03.00.02. Биофизика. Автореферат tía соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1993

t'rtftoTa выполнена ita кафедре биофизики Российского государственного медицинского униаерситета.

Научные руководители: академик РЛИ11, доктор биологических наук Владимиров O.A. доцент, кандидат биологических наук Натре»reo D.M.

Официальные "тпонеиты: . вещуций научный сотрудник Института ОСцой Патологии РАМН, докп медицинских наук Иикувкин Е.В.; ведущий научный сотрудник Института Окоанологии РАИ. кандидат мздицинских ваук Панданов Д. Б.

Бодуцая оргадгиэация: Науч1ю-исследоватальский институт физико-химической медицины ИЗ Российской федерации.

Защита состоится " "__-_1993г. и часов на заседа-

нии специализированного сонета при Российском государственном кэлицин-скок университете |ю адросу: 117437 г.Ноеква, ул.Остроьитяпова. д.1.

: диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета.

Литорофорат разослан " "__1893г.

Учений сещютарь специализированного сооото К-084-14-04

доц гг, кандидат медицинских паук Бурсиский К.В.

01ЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАГОТЦ

Актуальность исследовании

Эритроциты иг> всех клоток оргпиизма наиГхшоо иодиоржени окислитель Ной деструкции н связи с постот шмми процессами окптч.'шщии д<!:юкси№шд НИИ, м результате котор»и с опродолонной шчхлгтиосп« об^хзуи/гсм кисло 1ЮД1ПЛ! радикгиш и по{*жись оодорода (Н1яга II. е!; а!.. 1 'Л'12; Могян Н 1908). Последний нвляется долгхлииущим, хорошо щ» >|1ик<до1(им >к.*|к)3 /¡ноли Гичоскио мембраны соединением, способном окислить гемоглобин и другии физиологически вахииа макромолекулы (УаяВДиЫи Т. е1 а!.. 1913 3; ТикаЬая -Ы М. еЪ а!.. 1980).

Степень токсичности перекиси нодррода ощюдсшиитси соотношением пу той во метаболизма, среди которих можно поделить доо группы:

1) ферментатипиш: каталазный и перокси;^Ш1ШЙ пути, но сннзанные с генерацией кислородных радикалом;

2) неферментнткиныв: даэлохение иорекиси ьодо!«.)да при изаимодой^гг-вии с ионами металлов поромонной валентности (но типу I*.-акции Фиитона), с Некоторыми органическими молекулами. При '.угон генерируигтсй весьма 1*»-зкциоимосооссхашй и токсичный гидроксил-радикал и другие кисло|юдние |>а цикали.

- По мнении роди авторов (М»зга II. еЬ в1., 1072; Уапа^исЫ Т. е1 а!., 1ИПЗ) в перекисной деструкции эритроцитов ооюьную роль играет окислииио дерокиоио водорода гемоглобина, шкжунцзе за соий деструкцию момБданы, Зднако механизм этого окисления в физиологических условиях неизвестен. 1от, в ча спчкхгги, нсности в следующих вопросах: пв1«кис;ыо или образумим-«1ся ш« ее распады радикалами окисляемся гемоглобин? Непо^ надетое! он > |ли опосредовашю поражаются шш этом ого активные центры? Генерируют ли «м гемоглобин в процессе его пцзвраи^иия п мтт1>могл<>Ы1н активные фо(*ш [ислсчюда? Наконец, какую |юль игт«ст о6[»азу««цийсн в щюцессо порекисиой (еструкдии гомоглоОина митгемоглобиц? В опкжении мотгемоглобшш из

постно, что он способен кэтализиронать окислоимо псрскисыо всуютда ряда физиологически одхных пмцеств, о частности, лскорбата (Ко il in D. et al.,-103.'»; Di 1 *if 1 K. ol. «1., 10Ь7). Однако, но ясно, имсхзт ли адось мосто классическая пероксидлзнмл реакция, или же процосс сопряяон со соободио-радикалышм разрушенной НгОа?

Шзт ясности и о иол росе о той, какова роль Кяталапи и глутатиоипо-(юксидшы о защите эритроцитов от порокисной деструкции, что, по-видимому, обусловлено отсутствием совоюешшх методик оиредшюиия физиологической :»М«кт>пжос и цаншх фориннтои в биообъектах, а потому клинические даиши об их роли чрезвычайно противоречивы (Aebi H. el al., 1971; Cohen G. et al., 1863).

Тем ко менее, no мишил ряда авторов (Cohen G. et al., 1864; Horoe H., 1908) паракисиая деструкция гимоглобипа является составной часты» большинства гемолитических процессов, а в ряда . случаев играет в пи» водучую роль (Cohen G. et al... 10C4).

Учитгшая выше сказанное, вопрос о нехянизмо взаимодействия гемоглобина с HaOs. и его защиты от окислительной деструкции пилится актуальный ка с точки зрения фундаментальной науки, так и » спота возможности. раскрытия механизма возникновения 1 да i-емолитичооких анемий.

Цель и задачи исследования

Целью пастогацой работа являлось пияевеиио механизма ворекисной дес.рукции гемоглобина под действием субфизиалогичоских концентраций НаОа, а также роли ферментативных и нефорнептативиых антиокиелмтвлой в ««•о защити.

В работе были поставлены и решались следующие задачи:

1) Разработка методик, с помощь» которых было бы возможно дифферпп-ци[*ишть пути метаболизма пороки си и шцюдолнть эФФоктишюсть фуикцио- • цироь-шия антиокислителыых формвнтов.

2) Выяснить механизм перокисиой деструкции гоноглобина при физиоло-

гичосюис концентрациях ПяОа. Путем применении лоиушек кислородник радикален определить роль последних о данной процессе.

3) Путем применения специфических ижжатодои тиснить (юль Цхгрмон татинпих аптиокиелт-елей о :*ащито гемоглобина от перекиспой деструкции.

•4) Исслоцонать механизм порокои/иэного окисления <1<'кор4*дта как одного из возможных зиепьеи взаимодействия форментатипшм и ноф«рн>-п татишшх антиокислителей в защито эриттюцитои о-г окисли-нмнлой д(«ггрук ции.

Ь ) Установить, имоотся ли аютиэтетпио между моханипмдми окислении перякисыо водорода ря;и вещестн, катализируемыми мсятсиоглобинон и iui-роксидлзой хрена.

Научная новизна

С аомоцы» калориметрического метода шюршв экс:пе1>иментально «продолен -гепдсжюА :лМмкт катапазного, пероксидгглюГо и сиободно(кщи|шл1.1Клч> (па типу рвши«ии . Фептона>- процессов• ра'ыюхштя перекиси водо1*>д<1. Определенные нами величины теплового эффекта указанных ирьцосоов рашш соответственно 20.24, ва.25 н 50.6 ккал в расчета па 1 моль разрушенной порвкисн. Из этш'о гакхо следует, что тешююй аффект разложения Ч.Ои зашеит от пути œ мвта£олимма.

Шоря^о на эритроцитах и их гвмолизатах. а такхо на изолированном гемоглобине показано, 'гго гемоглобин в а:>(ю&ных услопинх способен подвергаться цеп»кху процессу окисления до мотгемогловина, индуктором и м<>-диато1*>м которого ншшется перекись водорода, образующаяся в процессе île novo. Данный процесс предотвращается каталаэой. Аыти1Ь1;|икали«10 ррооара-rii L-1'истидин и Oi-токоферол во оказывают на нага никакого влияния.

Покапано, что мотгомоглобин способен катализировать окисление Moi«»-кисыо иодо|юда аскорбата и некоторых других веществ как обычная гииопая пероксидазл с те« хо т*миюгв'М аффектом; какого-либо илшшия на эчхтг процесс ьптирэднкальние щхжараты uu оказывают.

Тлнжс, благодаря примонкпию кадоримотрии, впервые установлено, что шнюксидазноо окисление аскорбата, вопреки утвердившимся в литература сш>мам (Ytinazaki I., 1957). реализуется ио мохаиигаму, включающему дне стядин: формоитатигтую и нефедаентатиниуп. Вклад последней увеличивается о ростом рН среды. вследствие чего стехлометричоское соотнииенио моаду разрушенной перекисью и окислешшм аскореатон также возрастает с увеличением рН. Из-за отсутствия у продуктов окисления аскорбота характерных максимум«» в видимой и в ультрафиолетовой областях спектра с одной стороны, и но1*х)на*1ь_оти контроля содержания перекиси титронотрическими методами в система, содержащей аскорСат, с другой стороны, данную нофор-ментатиннуп стодив процесса невозможно било зафиксировать оптическими моголами.

Научно-практическая значимость работы

Настоящая работа может быть отнесена к области фу!<дамептат.иых ИССЛСДО! «ний .

Калор^язтрический метод, разработанный и обоснованный в данной Pi ore, может бить применен для определения катшиггичоской эффективпости каталазы и пороксидазы в биообг jKTax, как в туч них исследованиях так и о стшико.

Обнаруженное в работа явление ицдуомроаанного перекисью водорода аутоокислоаия гемоглобина, по-видимому, нохот быть ключевин эоепам ряда ге>«>литичиских процессов. Л потому устойчивость гемоглобина к аутоохме-лению, зависящая от интегральной »¡фиктивности антиокислителыпи систем гнчп-роцитов может Сьггь важным диагностическим параметром для оценки предрасположенности к гемолитическим кризам.

В рабиго отмечены иодоетотки суадстоуюиих методов опре<№яския малых концентраций перекиси водорода в Сиоовъоктах, основании* на применен«« чероксидазной реакции с использованием субстратов, /уиатх при окислояии-продукты, способные флуоресцировать, либо индуцировать хемилюминос-

ценцию, с последующей регистрацией в аналитических целях этих п.^ымопюп :(К1е1сЬег И. еЬ а1., 1982). Из-эа (присутствии а объекте пооганопмтолой (аскорбат, глутатион) и тушителей хемилюминесценцни, результаты получен ныв при помощи выше указанных методик могут бить суи»эсггаенни искшсии. Поэтому, нами для определения микроколичеств перекиси водо|«ода ы био объектах предложено использовать эритроциты, в иото1»±х каталаэа ипаити пирована азидом натрия, как бжадетектор па НаОг. Вследствие спуска по-'рекисыо водорода процесса цепного аутоокисления го«оглобиил в зрит|юци-тах при таких услопинх, данный мотод позволяет с высокой точностью (до ¿Ю-'Н) . измерять концентрации] перекиси водорода в биообгьектах, вне зави "симости от содержания в них восстановителей и тушителей.

Ащхзбации работ

Результаты работы были доложены и обсуждены на заседании моии 30 марта 1990г., а также на совместной конфе1*;нции кпЦе/цт биофизики . медкко - биологического факультета РГМУ и отдала биофизики ПИИФХМ 20 января 1993г.

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в В печатных работах.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Обьем работы составляет 140 страниц машинописного текста. Список цитируемых работ включает 26 отечественных и 184 иностранных авторов.

Содержание работы В раздела "Обзор литературы" приведены сведения о структуре гймо-

глобинл, механизме оксигенации• дезоксигенации и причинах, способствующих путоокиолению гемоглобина (гипотеза Currell R. Н. et al., 1975). Анализ литгчытугм показывает, что в подавляющем большинстве случаев окислительная деструкция ¡•емоглобина в аэробных условиях сопровождается выбросом гупероксиднога анион-рядикала (Goldbirg В. et а!., 1870; friiiowlch I., t98ö), кгггорый способен дисмутировать в перекись водорода. Последняя гтляотся инсоко-'ф^ективным окислительным агентом по отношению к гемоглобину (Кувг Р. et »1-, 1975; Doyle И. et н1., 1905). Поэтому пхтигопле Формы кислорода и перекись водоро/va - важное звено окислительной деструкции гемоглобина п присутствии кислорода.

Приведены имеющиеся на сегодняшний допь данные о механизма функционирования антиокислителыалс ферментов: сугюроксидцисмутязы, глутотиондан роксидаэы, каталазы и о пероксидазной активности мотгомоглобияа. Анализ методик оиредоления Функциональной эффективности данных ферментов, а том число каталазы, показал, что в литературе имоются противоречия относи-тольпо тох или иных вдггиокислитсльннх фегсжюнтов в защите гемоглобина, которые обусловлены несовертец'- иом применяемых хетодих. Для преодоления пгг.-л щхггиворечий необходимы новые методические подходы. .

Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие методы:

1. Гель-фильтрации (для получения гемоглобина)

2. Динамической калориметрии (для определения каталитической я1фок-тивпости каталазы и пероксидазы).

3. Саектрофотометрим в ультрпфиолетогюм и видимом диапазонах £ для спектро»Ктэметрин мутных сред использовалась сфера Ульбрихта).

4. "чрманганатометрический (для определения концентрации перекиси водорода).

в

Результаты исследовании

1. Функционально значимые параметры каталазы и их оценка при (юмощи калормметричс-ското метода.

Первой задачей Hacrroniueix) исследования била («ура»ютка hutuiihk, позволницих определять каталитическую зффектиипееть антиокислительных ($»)[«<мггов и диОДеринцирооать пути разложения перекиси водо1<ода.

До сих пор ни било меггодик, сносокшх дифференцидопать зти пуш н определять их соотношений примопителыю к биообыгктам. Исть метода*", контролирумцие убыль iH-ijeKJ-tCH, но не отмечающие на вопрос: каким путем? (Doers R. el al., 1952; АеЫ II., 1904). Мотодики, («¡гистрирумцие спюич\ чшл радикалы (ЭПР, хемшиоминосцеиции), опять таки но длит однозначное количественного отнота о синий с ииоокой рыак1(ионной способность» последних, болиним количеством мише«к>й в биообъектах и ши|хжой возможносп*> различных 1>ексмбин<лций сиободш« радикалов. и то хо щкш гх^зможпосги к<1лормметрии в этом плане но изучены.

И'.» данных, представленных на рис.1, следует, что разложение нереки си водорода фирменным препаратом каталазы (" Servn", ФРГ) сшцхлюядаытеи выделением течиид. При одинаковой началыюй концентрации перекиси кино -тнческио криэдэ выходят на один и тот же уровень (рис.1). В точке выхода кривой на плато перекись водоГюда отсутстиуот, что показано нермаютша -томотрическим методом. В то хо иромн количистыо топлоты, видолившейсн к моменту mxo/ia кинетической кривой па плато, щ»ммо щюиорциопалыю ко личоству рагиюхишиейея пс-[>еки<и водорода (Рис.2). Тепловая эффективность катала; того пути рскмюхения НзОа значительно отличается от (.-оотвити твупцс<м> показателя пероксидазного и овободнорадикального пути (рис.2) Значение теплового эффекта разложении hojuikhch водорода каталаэой, исхс» дя и:> данных рнс.2, получено р<шиым 20.24 ккал/Н. Заметим, что тепловой зффект каталазь! >й {кзакции экспериментально получен пани прим'лштчлым к водной фа:ю в (клмалышх условиях, для которой точные теоретические

Рис.1, Рис.2.

■исЛ. Кинетические кривые теплопродукции при разложении НаОа катзллгюй.(П2О2>о - 18.8 шИ, концентрация каталаэы (M): 1) 5.2»10~в; 2) 4.16* 10-"; 3) 2.08*10-® ,4) и 5) аналогичны 1), но в (4) фериопт был предварительно проинкубирован при 100°С в течение 10 минут, в <5) реакционная среда иэпачалыто содержала 15нН НцНз. Do всех образцах присутствовало 40шН КЫзГО«, рП 7.4. Впод И2О2 прои:;'« '1ился в момент, указанный стрелкой.

Гис. 2. Зависимость максимального уровня теплопродукции при разрушении Н2О2 различными путями от концентрации введенной перекиси. Г".)кционш1Я срода изначально содержала: 120мМ МЬРО*, рН 7.4. 1) И1»М каталазы, 2) 24 ИМ FeSO* 3) 8.S*10"«H П&роксидаэы хрена(Рх), 7.0*10-аИ аскорбата (Alla).

Рис.3. Рис.4.

Гис.З. Кинетически© кривые тошющюдукдии при {»эложопии ШОг биообъектами. (1Ы>я)о = 18.В ИМ.

1 - изолированная каталаэа 2.1*).0"М;

2 - гемолизат эритроцитов человека 3.3*10-°М гемоглобина (На);

3 - 1«иогенат печени крысы 0.47мг/мл

4 - ЦОЛЫ1ЫО эритроцйти чюяолека 3.3*10 йМ.П».

5,6,7,В -.аналогичны соответственно.1,2,3.4 + 15мН НаНз Реакционная среда содорхшш 340 мМ НаС1, 20 мН КИгРОч, рН 7.4. И|чэд НгОг производился в момент, указанный стрелкой.

Рис. 4 . Записимость тангенса угла наклона начального пр!молинейно»*о. участка кикотической кривой тогшочродукци.и от концентрации каталазы. Тангенс 0£ равняется Д(НяОя) <мМ)/Д1<с).

Д(НлОг) определилась, исходя иэ д.л\иы:( рис. 2(1). (НяО-.;>и -10.Т)мИ

10

опенки данного параметра в лито[«1ГУ(ю отсутствуют. При наличии н |*;îii; циошюй средо 15 мИ амида натрия, отсутствии катализы либо при ео nixtji верительной инактивации 10 минутной инкубацией при 1 00-ч:, тешимцюдумцин отсутствует, а перекись 1>одородл в ролкциошкгй сродо сохрашю-н-п (рис.1). Таким образом киле-гика ч-онлопродукции о-плллает кинотику 1>а:ик> жешш перекиси нодо()ода. Последней сп|>аг1(;дли1ю и дли каталаац н еостаье биологических обьектои (рис.3). Знание всей кинетики важно н связи со способность«» каталазы инактивиронаться в процессе 1*;аиции. Так на рис.!» (кривы»; 1,2) кинетика теплопродукции при повторном июдо перокиси води рода отличается от кинетики в случае первоначального ео ввода. Последи» я» «1*от (игл. объяснено частичной инактивацией фермента в щюцосео роакции В количественном отношений устойчивость каталоэы к субстратной инак! и Ш1ЦИИ ножот оцениваться 1Ю доли (и процентах) сохраношюй активности фе|мента поело однократио!-о запуска процесса при фиксщюваппой начальной концентрации НаОз, вызывгигхией инактивацию. При малых концентрация* пе|»» -киси водорода отличив кинотик первого и повторного ввода отсутствует (кривые 3,4 рис.5). Именно при таких условиях тангенс угла наклона на чального прямолинейного участка кинетической кривой, но котЬ[юму oui*.-делилась агашик-ть каталазы, прямо пропорционален начальной концентрации фермента (рис.4).

Устойчивость Фермоша к субстратной инактивации снижается по нем» роста начальной конпент1>ации перекиси (рис.В). 11а ноо сильно влияет так жо ионная сила i>ac"TBOj»a (табл.1). Нами установлено, чти ферменты из |ща ных источников могут иметь различную устойчивость к субст1«т1юй иьакчи нации, имея ш<и этом одинаковые значения активностей. Так каталаза топ кого кишечника ki*îc , подвергшихся паготомии, имеет на 2UÏ оольшу» устойчивость к субепштной инактивации чем н кон'пюлыюй грувпи (Мибуловский A.D. и др-, 1992), То осп. усг< -йчивсють к су(хг[мт|к<и инактивации • важный параметр, кочч>|*л"1 может нести информации! о скипи* нлч пил-минских щюнессах. Ии лт-вдюту!», например, известно, чти у

(«v'Miwx с: шюйцлрсним типом ак.тгалазомии синтезируется фермент с низкой устойчивостью к температурной инактишзции <5hapira К. et а]., 1Я74). Аналогично модно предположить возможность синтеза фермента с пониженной У1Г|-ойчи1к>сть»> к cyfSoYt-отной инактивации.

Таблица 1.

.Зависимость активности и устойчивости к субстратной инактивации и'юлиро!л"1Ш!ой каталазы и фермента в гемолизато здотпкщитов от ионной сили реакционной среди

---------------.--'.......... сю-ьект Состав реакционной среды и ее ионная сила (1> Активность фермента » Устойчивость фермента к суСстратаой инактивации

районная кпталмэл 2.09»10-в м 20 ИМ И)гГО4 1=0.02 2.58t0.08 73.7+2.0

110 мМ NaCl 40 мН КНгРСЦ 1=0.15 2.56*0.00 61.311.-8

150 мМ ИаС1 40 мМ KIbPCU 1-0.19 2.521.0.00 Л2.0£1.5

Гемолиэат человеческих ирИТ{Ю-китон -4.41*10-°М Ив 20 мМ ЮЬРО« l=w.02 12.2+0.35 81.ь±2.о

110 мМ НяС| 40 МП КШРО. 1-0.15 12.3*0.40 60.0j;l .5

Примечании. При определении пктивиости испольиовапась {1Ь0:>)о41 ве#10-ам. Устойчивость к субстратной инактивации оиг-едилялась после 1члакции с (Нг0а)<»-7.5*10-ам. * - Активность иэолмровняного фермопто определялась как ( '(I...Л!)/1И«к<чщ.формот'а)*10-в, а гемолиаата: (<l(lla02Vdt(Hb))*10-l . , .

П. Лугойкислспио оксигьмо юОшш, индуцированное перекисью во/юрода. При воздействии перекиси водорода на эритроциты и гнмояизатц эрн-tjxmwtob, к кито;мм для инактивации катала:«* добовлят l^vfli азида »тт-1.Ч1Н. происходит окислопие гемоглобина (табл.2).

¿lH2<ynnM

A я

(H2aj0mM

Рис.5. Рис.6.

Рис.6. Кинетический кривые разложения IlaOa каталазой посла иериого (1,3) и повторного (2,4) ввода перекиси и реакционную среду. (IbCks)o- 76.2 вМ и 1,2 и 18,8иМ в 3,4. (кг1тала:ш)=2,О0*1О-°м; 40 пМ KllaPOt, рН 7.4. Виод Нг.Ог производился в момент, указанный ст(хэлкой.

Рис.в.Зависимость иеличины субстратной инактинации каталазы (А) от вачальной концентрации ИгОг.

А = 100Ï - 2 потери активности поело реакции с НгОа. Активность опоределллась при (Ца02)о"1В.ЙмМ. Состав реакцирнной среды: 1.2Ь*10-ВМ каталазы, 110 мМ НаС1, 40 иН КН2РО4. pli 7.4.

Рис.7.

рис.7. Спектр светопоглощения оксигемоглобшщ kikjcu до и посла введении Н2О2.

(Нп02)о= 1.2*10 &М, (Нг(Ь)о= 2.8#10-?М, рН 7.4. 1) спектр до внесения ЦэОг, 2) спустя 50 кинут поело впесонил 1Ы>.>. И качесп« коитролей исиользонались образцы, не содержащие 1Ы>2, а также содерхлщие 10-ВМ каталазы, n которые вносилась П2О2 п иопцошчыции 2.П*Ш"7М. В этих случаях о течение« 50 минут спектры ue щкгторненали Изменений.

Таблица 2.

Окисление гемоглобина в эритроцита* и их ix-нолизатах ноп дойстииом (различных концентраций ШОя

концентрация

ге;малиэат Dura

0|ЖТР0ЦИТЫ 1)47«

о 0«

0.30010.010 0.300+0.010 0.26010.012 0.22010.014 0.lODiO.OlO 0.2У010.010

0.275Ю. 010 0.27G10.010 О.24010,041 0. 2ЮЮ.015 O.lBOtO.Oll 0.2001.0.011

З.Ь. 7.0 10.!» 10. 5*

Примечание: начальная концентрация гемоглобина н i-емолиза-тги и суспензии r-wTjoHvrron крысы - 7.О»10-°Н. Для ингибировл-ния каталазы рас. иоры эритроцитов и гомолизатов осред вводом IlzOz о течение 10 минут инкубировались с 15 мИ МаИэ. После 40 минут инкубации с ПгОг п[>и 20<>С пробы фотимопжровались при 57G I. оптическая плотность образцов, lie тодержаиих ПгОг. за это время не изменялась. Э1>итроннты при данных условиях гемолизу но подвергались. * - образны не содержали НаЯэ

Этот ко процесс идет и при воздействии переписи водорода на иэоли- , роюшиый гемоглобин ( рис .7,8). lia в аггсутстиио активной каталазы екчад-' кись водорода. некггая в исходной концентрации на два порядка иониея, чем , концентрация гемоглобина, способна в точение часа индуцировать окисловио последнего ь количество, ва порядок иренышасчем начальную концентрацию, самой перекиси (рис.7,8), ». J свидетельствует о наличии Цедаого ад»-цесса окисления гемоглобина. Но у любого цепного процесса должен бмть ? как инициатор, так и медиатор. Экспериментальные данные показывают, что каталаза в концентрации 10~"М полностыв «локирует цоппоо окисление как исходно, так и будучи добавленной в ходе процесса, ког/w капичестно о>"1с. »того гемоглобина . уже превышает изначальное количество перекиси водорода (табл.3). В то. же время дибунол, ОС -токоферол, 1,-гистиднн в копцснп>ацях 10-«Н ва цетюй процесс ее влияли, Присутствие в роак-ционной срода хелаторо. нотаялрв переменной оалеппюсти о-феиаятролила также но сказывалось »а параметрах процосся. Кэ всего этого cnenyw, что медиатором также является нарекись водорода, вновь обрпзутгжаяея в хода П'сл iyt, ,ли гемоглобина.

Злмотим, «гго кинетика дойного процесса по является кинетикой реакции uTopoi-o порядка, так как при уменьшении исходной кошцчгграции с тих

реагентов в дна раза кинетика увеличения процентное содержания мтт-.ч«>-глобина практически не менялась (рис.9). Нначо говоря, лимитирует ни стадия непосрелствонного взаимодействия гемоглобина с перекисью во/кнюдм а, по-видимому, процессы, гцхггекахадио в глобуле.

Таблица 3.

Ипгибировпние каталаэой процесса окисления гемоглобина под действием перекиси гюдорода.

Добавки:

ПгОг'кпталаэа II2O2

ЯгОа+каталаэа

Z метгомоглобина

до ввода Н2О2

7.5 i 0.22 7.5 1 0.23 7.5 1 0.25 7.5 i D.22

через 15 минут поело внода НгОя

7.5 ¿ 0.25 30.П1 2.05 28.Oí 2.10

чезроп G0 мин. после ввода 1Ь0г

7.Bt 0.21) 7.5* 0.21 62.0»; 2.23 2B.()¿ 1.42

Примечание: к 10мл 1.2М0-"М НпОг добавлялись 0.2мл 1.4*10 °Н 1ЬОг и 0.1мл 10"вИ каталлзи. Катала;« введена 2) до НгОг 4) чо|«а 14 ниыут поело 11гОг.

Таким образом можно предположить, что перекись водо|*эда п малых концентрациях (Ю-®- Ю-'М) запускает процесс аутоокиеления гемоглобина, но не яиляется вепосродстпенным его окислителем, ибо яутоокислопио пн блкууются тол1.ко п кислородной среде. Н дейстпитолыго, кпк ело дует из таблиц 4 и 3, в вакуума лутоокиолиние по ихегг (табл.4), а поело нцугжп воздуха возобновляется (табл.5). По данным Еувг Р. и некоторых др)тих исследователей, доэоксигемоглобии окисляется на ■ два порядка быст|»т> оксигемоглобина, так как активный центр свободен и перекиси водород легче проникнут», к нему и окислить его. По зги датшв получены при нс-полкоовалти бол1лих (Ш-^М) концентраций перекиси водорода. П нпгог-м случае (т.КЗл.5> в(*»мени контакта гемоглобина с порекисыо водорода в условиях вакуума было бы достаточно (исходя из данных Вуог Р. е1 я!., 1975), .чтобы вея перекись водорода щюроагиротила с деэокс:игемоглг>бии':>ч Однако тот факт, что после ттуска воздуха цепной пгюцеоо (пэобпогутлег и конечное количество мггггемог лобииа оказывается не ' монытм, чем в кон

i'ixvio, говорит о том, что перекись в данном случае прореагировала и ос-иовиом, ии с активным центром, а модифицировала гемоглобин таким обра-som, чч-о он стал значительно более подвержен аутоокислению в гцжсутспиии кислорода- То есть под действием физиологических концентраций НаОа upe-оеладаот не окисление ею непосредственно активного центра, а щюисходит главным образом модификации апофо1*»<л1та, снижающая устойчивость i-емо-пмбина к аутоокислепию.

Таблица 4.

Окисление гемоглобина крысы под »хзэдействием IbOa и нрисуготвии и в отсутствие кислорода

Условия инкубации X метгемоглобина

N Вакуум ИгОа исходно 7 нинуг после ввода

НгОг или просто ин-

кубгщи^ в случаях 1.2

1 + - 7.0 t 0.4 7.7fc 0.8

?. - - 7.D i. 0.4 7.ÜÍ. 0.4

и ♦ 7.1 ± 0.5 7.2t 0.4

4 - t 7.0 t 0.5 64.ܱ 2.1

Примечание: 10 мл 1.2 * 10-°Н гемоглобина крысы помещалось в вакуумную юовоту. 11 условиях вакуума 0.2 мл перекиси водорода вводилось и 01*;ду. Начальная концонтдоции ВгОа В сре/!" - П.8 »10;'М. Спусти 7 минут цоопе ввода НаСЪ в кювету впускался >юздух. Через 7 секунд поело оч'к1*лия впускного клапана в среду вводился 0.1 мл 10• ВМ каталази для П1юдотирАщеция дапиюйвюго окисления. Затем пробы фотометриропались. Образцы, но подвергавшиеся вакууиизации, также инкубировались ы вакуумной книюте.

Таблица 5.

Окисление гемоглобина kiucu после инкубации с ШОг в вакууме

N Вакуум Время контакта С 1Ы>2 в вакууме (мин) X метгемоглобина

до иакуумиэации и ввода НгОг спустя 50 кинут после В1юда НгОг

1 - 7.0 í 0.4 64.0 t 2.0

г + 3 Б.8 i 0.4 67.0 i. 3.0

3 + 7 7.1 ± 0.5 66.0 ± 2.8

□римечешие: всо условия аналогичны приведенным в табл.5, за исключением того, что начальная концентрация ШСы в реакционной среди -2.В * Ш 7И. Каталаза иосло впуска воздуха не вводилась.

Но может ли такое же аутоокислонио имееть место и при воздействии

на г>/н»гио£*ш друхих. индукторов окисления в ирисугстыии кислорода? Пани

MtHb я

Mt Hb*

t,mm

t.miri

Рис.О.

Рис.О.

Рис.8. Окислении ПдЮ* крмси под воздействием 1ызлизных концентраций

ПаОя.

Начальная кончетргщия НгОг равна: 1) 7*10-7Н; 2) 3.S»10''H; 3) i.4*10-7M Начальная концентрация гемоглобина jbo всех случаях 3. 2* 10-,|Н. Введение НгОг ирризоодили в момент, указанный стрелкой.

Рис.О, Окисление ИпОа kjujch под воздействием НгОа при одинакопом начальном сгкэтч юлении реагентов, по разных их концентрациях. Реакционная среда изначально содержала:

1) 1,2* Ю-» М НЮ» и 2,8* Ю-7 М НяОг

2) 2,4* 10"» М ШОл и 5,6* J0*7 М ИгОз

3) 1,2* Ю-» Н'ПлОз и 1,4* 10-' Н НаОя

4) 2,4* 10-» М НвОг и 2,8* 10"7 М ПгОа

Ввод ОзОз щюизподилсл в номопт, указанный спюлкой.

Q col • . 0 "J. '

[Н202]0тМ

. Рис.10. Рис.11.

Рис. 10. Кинетические кримлэ теплопгюдукции при пероксиддзмои окислении Рида субстратов: 1) 1 ■ ■ п.чфтол, 2) фенол, 3) серо-гоним, 4) Л1Ы, рН 7.4, {1Т20а).>-3.7й*10-»Н'( <Px)o-.7*10-7 (3-3) и 1.88*30 <4) ; начЗшмгмо концентрации. субстрата: 1,2 - 7.Í«!!!-1 , 3 - 2'.0*10-z ,л -5. Г;*П)""М. П экспериментам о ! - нл^гго-пом, фонолой, серого) шнек я с роде п|«сутстоо1«ала холеная кислота (10 ZM).

Гнс. ¡3. Зависимости количества тегиш, наделивпбгося при пороксиде-з • ПОМ окисяонии аскгчХята от начальной конаекп^-идии IfcCte при роэличмга ЭОДЧСИЧИХ . oil: 1 ''.4, 2 - 5.0, (Рх)-8.0*1Р-"М. . (ЛПя)^7.С*1и-"М. Количество ии/г-лниичнсн тггшэти оцсиип/ичи после вд-да кшорим<;Трич..»::.':>» кривей плаго.

зафиксировало, что каталаэа ( 10 ВМ) оказывает защитный иффокт (, >Х) при спонтанном аутоокислении изолированного гемоглобина, происходящего без применения како1х>- либо индукто{>а. Такой же згицитный аффект каталазы имеют «*/ото и при окислении гемоглобина под действием глутарового ал1*цогида (0.65Х) или гидразина <10^М).

U. Пероксидазноо окислении acKojxiaTa. Нотгемоглобин как геновал по-(кжеи^за.

Из литературы известно, что мспте»юглобин способен катализи1ювать окисление чорекнеыи водорода Рида вещоств, ивлницихся ие1кжсидазными субстратами (KuLlin D. et al., ШЗЬ; Dalziol К. et al., 18í>7). Последними могут быть и физиологически значимые вещества, из которых ми прежде всего иниолим аскорбат, поскольку он:

1 ) Универсальный восстаноиитойь, вишюхаишй практически во все Окислительный процессы внутри южггки (Uielskl В., 1U02; llalliwoll В. et

al., íauio.

2) tío мнению iiokotoi*jx исследователей (Galariü D. et al., 1í)80) система мотмиоглобин - аскорбат ивлиется основным детоксикаторпм от перекиси водог*лда в мышцах. Опнх-итилию здягпюцигов определен!юго мнения пет, хотя аскорбат в них также содержится в концентрации близкой к 10 ьн (Anos В. ut al., lUBl; Hugíioa D. et al., 1068).

Яинод, ЧТО acKOi>e>ciT является пероксидаэпим суОеТ1»агон сделан ва основании того, toi и системе, содержащей пероксидазу, перекись водорода и аскорбаг, зарогистри|>ована убыль аскорбата (но снижению Dzos) и появлений еноО >дпорадикши.иого гцюдукта (методом SUP) (Yanazaki I. et el., 1 öbV. 1 !¡UU. lUb 1,1 .iü'J > . Ь шее глубоким изучение механизма данного процесса было затруднено исуюдсгиио отсутствия у щюдуктов окисления аско|>6ата iHJivjxt.liiajA спектральных харакчч-члютик.

Как следует из давних, представленных на рис. 1U, окислоние 1>азлич-KUX суостратов нецжисы) Bo/joix^iia, катализируемое _гмроксидаг«)й Х(<ена еощишожлаотон индил* нием гепла, количество кото1ЮГо, виделиншх^ч.'л к Mola

центу выхода кривой на плато, не зависит от природы субстрата и пряно пропорционально концентрации введенной перекиси при условии избытки субстрата (рис.10,11). При отсутствии субстрата, пероксидазы или поре-киси, теплопродукции Не вабяадается. Нэ всего вышесказанного можно заключить, что кинотика теплопродукции при пероксидаэной реакции есть кинотика разложения перекиси. Тепловой зЧФект пероксидаэной реакции, опродо-ленний нами, равен 69.25 ккал в расчет« na 1М разрушенной перекиси, что значительно отличается от аналогичного показателя каталазпого процесса (20.24 ккал/Н) и свободнородиколыюго по тину фентонп (58.5 ккнл/М) (рис.2).

Аскорбат является дпухэкиилалонтным донором, а серскись - /юухзкгы-t валонпшм окислителем, поэтому логично ожидать стехиометрии 1:1 iii»i окислении ппрохисмо водорода аско{>бата. lio реально такая стехиометрия иа&подается лить при рН 5. 0!>и рН 7.4 стехиометрия между аско1*>атом и перекисью водорода составляет 1:2 (рис.11). Последнею может, быть лиОо результатом Солее глубокого окисления аскорСата при рИ 7.4, ли(<о при данном■ ¡точении [я процесс идет ik> гцмщмгшалмга другому пут. Из наших экспоримемггапыллс данных слодуот, что аскорбат, окисленный при рП 3, способен подвергнуться дальнейшему окислению при ptl 7.4 (рис.12). Причём на характер кинетических кривых в данном случае концентрация перокиулазы во влияет. То есть имеются основания предполагать, что данная реакция нефермептзтивная. Стехиометрия со 1:1, то есть суммарно получается то до, что и при рН 7.4 изначально (рис.12А). Аитирадииальпыо iipejiafVTnj: дибунол, L-гистидии в концентрации 5«10-«М, а также холзторн металлов переменной валентности ЭДТА и о-фенаитролип в копцевпиции 10~ян. но оказывали влияния на параметры кинетики теплог1*здукции и стехиом^ггрии.

■ Наличием днух пжхтлолыю текущих реакций при рП 7.4 в отличие от рИ 5 мокло об-ьяснить и сггсутстпио прямой злписимости между количоечтюм 1>язло«шсейся по.рокиси, опрод&лошгай колориметрически, и о ни елейного оч-корбата, определенного сгкжтро,!'отомет1>нческ.и при 2R5 нм (рис. 13): при рН

O cal

Рис. 12.

Рис. 12. Кинетические кривые теплопродукции при окислении перекисью Ьидорода при рН 7.4 продуктов, полученных в {хюультата иероксидазного Окислении AJI.t гц>и рН Ь.О.

(Рд) :: 8.5*1« °М, (ЛНг)а- 7.0И0-ЗМ; йуфир 0.12М KII2PO4. После окисления Alls при pli 5.0 juiuhum количеством Н2О2 рН с(хдды доводилась до 7.4 и в момент, указанный стрелкой, вводилась Н2О2 В начальных копцошткнфиих:

1) 2.4*10 гН; 2> 1.2*Д0-2Ц; 3) 6»10~эм; 4) 3.5*10 аМ.,в момент, указанный стролкой, » среду понторно ввели НгОа в начальной концент{>ации

Рис.12Д. Зависимость количества ииделивлег'ося теши при окислении перекисью иодо[юдл при pil 7.4 продуктов пороксидазното окислении АШ при pli 5.0 or на'ылыюй концентрации tteOa. <Рх) - в. 5*10~вМ, <АИа)о = 7.0*10-эн.

D

га

Рис;. 13. Зависимость между снижением оптической плотности цм 2С5 им и (исходом II2O2 при педоксидпзном окислеис аскорбиновой кислоты.

(Рх) ; 1.1*10 <Л1Ь)>, - 7.0*10"3М

1) 1>11 Ь 0; 2) ри 7.4; 3) (Рд> ; 4.0*10-ьн н|ад рП 7.4.

В к<июриметрическуи кювету шюдилась ИгСЬ и н;\ч;у|ыюй концентрации 3*10 JH. Поело нихода кинетической к1Х<вой на плате, из кюветы ррои'.имднлеи отбор 0.1 мл, lilVijvHJiatrl, нован порция ll.rOví. Огсбдаиныо fvijuinnjiwi-i. 11 сто раз 413мМ фос(&т1ым ъуфе1>ом 1>М 7.4 и фогемитриропались.

2V

7.4 часть перекиси расходуется «га ноферментатипную реакцию.

Так как скорость фе[мпптлтитюй реакции зависит от концентрации фермента, а нефермептативной - нет, то логичтю предположить, что по мер« увеличения концентрации пероксидазы, зависимость при pH 7.4 будет при-ближатся к таковой при pH 5. Данные рис.13 (2,3) подтворилают это предположение.

Окислений аскорбата перекисью катализируется и метгемоглобиш*« (рис.14). Данная реакция имеет тот «а тепловой эффект, что и в случае п пероксидаэой хрена.

При совместном пероксидазном окислении аскорбата с рядом субст^ю * тов. даюцих окрашенный продукт, последний, как следует из рис.15(в,б), появляется спустя некоторый латентный период поело ввода HzOa.

Величина латентного периода возрастает с увеличением концентрации аскорбата. Do мнению ряда исследователей (Yanazaki I., 1957; White --Steven!» В., 1082; Thompson R., 1937), последнее объясняется тем, что аскор-бат достапапливаот окислешою продукты соокисляею« субстратов до тех пор, пока во израсходуется сам.

Аналогичное imnemie наблюдается и при совместном окислении аскорбата о вциеупоняпупвда субстратами, катализируемом метгемоглобином ( рис. 1С). L-гистидия я о-феиантролин в концентрации 10-"*H пч оказывали никакого плияния на ход кинетических кривых рис.15 и 10. Из всего »«досказанного можно эяхлючить, что процессы» идущий п присутствии порокси «аэи ярена и метгомоглобина, имеют одинакопый мехлни:»«, то ость мятпчю-глобил в данном случпо функционирует как классическая пороксид.чза.

Эффективное«» мет-гемоглобина как гюроксидази гю omoiiieni«> к поклр-бату нихо, чем у нерокощази хронп более чем на порядок (рис.14), но если учесть, что конценпетция иот-омоглобина в ;>рип«ците в гюрме состан-лнет 10••'М, то момю гаши'лть, что мотгеноглобнц - ИаОг лллячтея гдМ>"к типяой окислителыюй системой, отособпой окислять, как ксенобиотики, т-.к и эндогенные физиологически iviiiiiü; ctxvumemm.

Рис.14. Кинетический кривые теплопродукции, при окислении ряда Boute сто перекисиа водорода, катализируемом мотгемоглобниом и нероксидазой лрона: .

Состав реакционной среди: 4Q МИ КНаГО«, М)гН холата, рН 7.4

1) 1.25*10-®И Htm» , (Alia)о -1.4«1U-2H

2) 6.0 *10-»Н ИШЬ , (ФепоЛ)о-Ь.О*10

3) 1.8 *10«И Рх , (АНа)о =1.4*10-2« <Нг02)о-е*10~3М

Еьсщ tUiO-j производился в момент, указанный стрелкой.

D D

. Рис.16. Кинетические кривые накоплении продуктов пероксидаэного окислении ряда субстратов в щаюутс-пэди и в отсутствии аекорбата. 1) бен «идинл, 2) 1-нафтола, 3) фенола, 4) зстрадиола.

Реакционная среда изначально содержала (А): 40юИ KH2FO4, 0.52И этанола, 10 i!H халата, 1.2* 10~7Н гюроксидазы.6*10~ЙИ пероксищазного субстрата. (Ня0г)«>--10-зн. Окислсиио 1-нафтола и фонола конпхэлиронали при длине iv i/it'ií (К); 440UM к длина оптического пути (1)- 5см, эстрадиола -sip«V ЛЬпм и 1- 5см,бонзидипа - при А -Г>40нм и 1-2см. Ш*1Д НиОа производили в момент,указанный стрелкой.pli везде 7.4.

(Ь) Оостш) {юакпиошюй с(«ди и все обозначения аналогичны (А), ио ü, iv.:.jx случаях п;ли;уи:тву1гг 1,12*10 4М а^хорбата. H¿vJ-' i»i ноыоиг, с<х/гн»ггстнуквдий т. 0 по оси абсцисс.

¿i

Гис. 16. Кинетичехига крииыо накопления продуктов окисления 1«1ип. суСстра-гов перскисио водорода, катализируемого мптгчжоглобипом н присутствии и в отсутствии аског>батп.

Реакционная среда изначально содержала: 4ПпН КН2РО4, 10-®Н хола'гп, 2,0*10-гН метгомоглобина и 1) 1.15»10-аН бензидина, 2)10-«Н 1-нафтола, 3) 2«10-гН фенола, 4) не содержала сувстцчта; Ь,6,7-1,2,3 по ♦ 5.0»10 Г,К аско1<бата, рН 7.4, (1Ь0г)о- 10"аМ.

Момопт ввода перекиси н реакционную сре.ду указан стрелкой.1-2св.

В связи с большой концентрацией глутатиона, аскорбата и других поо -

становитолей, псе методики определения концентрации перекиси в биообъектах, оеновшшыо на иероксидаэной реакции с получ«жием окрашенных, либо флуоресцирующих продуктов, л тлкжо продуктов, способных индуци[хз1»ать хокклхаминесценцип, (Р1е1с1юг Н. е1 п1., 100 2) мо1-ут дать для биообъектом искаженные значения. В связи с этим нами Н1х»дложопо использовать эритроциты с злиш'ибированной а иих каталаэой в качостпо биодо-тектора на пе(*>ютсь. Такой детектор, благодаря запуску цепного процесса окисления гемоглобина, япляп ¡егося реагентом па ПгОг п зритроцитпх, обладает высокой чувстттглыкхгп,к> (до 1П-7Н ПгОг). Вследствие плохой проницаемости н»:нГ>г<он эритроцитов для гюссттювителей и кислородных радикалов, их вглчтие на {«эультпта 1лц*?деле11ин НяОя с пом(лч>л> Данного биодотскторо долхт* '.»<ть несуиг.'стлоннн. Кот-ролом, по отношения к кото рому оцегтвпется получаемый результат, могут быть эрит|хщиты (гомо-тпа ты), куда азид добавляется опугггя ЛП минут после прибавления orivy.i i, содиржшятга перекись. Ир>» г»мощи данного биод^гоктгли, калиб1Ю1та ктч>-Р'л-о прюгу^нл в таблице 2, н.лм у/цлось измерить концент1>ацип пгчхжиси м водянистой нлмгч» крме, л такхо показать, что при УФ облучении таких г»?

коств как асКорбат, 1-нафтол и фонол образуется перекись (табл.1 7).

Таблица е.

Количество перекиси водорода, образующейся после Облучения ультрафиолетовым светом различных ноществ

Нощество Копцент|>ация ИгОа поело облучения, 10''М

Трилов U 4.4 t 0.25

Аско11бат З.Ь 0.12

Фенол 2.1 i 0.07

1 ■ нафтол 90 ±. 2.Ü0

Физиологический раствор 0 i. 0.01

Примечание: Ueo вещества п концентрации ü«lU°M облучались я кинете объемом 10 мл дозой 1.8*10-а Эйнштейн/м2.

Таблица 7.

Содиркашю перекиси водорода а разли<шых биооОьоктах

Биообъект Концентрация ИгОа (10~7Н)

тиогенат мозга белой хркы 5 мг/мл после УФ облучения в дозе 1.725*10-» Эц/м* водншк-гая влага глаза белых крыс хрусталик крыс 0 t 0.09 В.2 t 0.02 3.8 ± 20.0 0.3 * 0.2 •

шииди

1) Методой динамической калориметрии впервые зкснериминтальво установлены - тепловые- эффекты каталазной и пероксидазной реак1(ий. Покааздо, что в случае пероксидазной реакции величина топлово1-о аффекта не зависит и>Г птродц окисляемого субстрата. Количество выделившейся теплого прямо проио(*1ионсшыю количеству раалохившейся перекиси водорода при действии как каталазы- так-, и пв|юксидазы, что позволяет -вести непрерывную регистрации) кинетики роакций, избегая «ртефактов, с котогами связгию использовании оптических методов.

2) Установлено, что устойчивость к субстратной инактивации может Сыть различной у каталаз из разных источников. 11а величину субст|>атиой инактивации каталпаи оказывают влияние концентрация перекиси, ионная сила с|х.'ды. Таким обдазом, атот параметр ■ наряду с каталитической актив-

ность» отражает структурные особенности данного («рмента, выявление которых может иметь практическое значение.

3) Перокись водорода в палых концентрациях С Ш ^-Ю 'М) способна в присутствии кислорода инициировать окислевио гемоглобина, вследствие которого число окисленных ген-групп может на порядок и более превышать начальное количество перекиси, что свидетельствует о цепном характер этого процосса. В вакуумо данное явление не наблюдается. В связи с тем, что антирадикальные препараты не оказывают никакого аффекта на данный процесс, а каталаоа способна ого но только предотвратить, (го и в люеоП момент остановить, будучи добавленной после НгОя, можпо заключить, что перекись водорода но только индуктор, но и медиатор цепного окисления,! образующийся заново в ход» процесса.

4) Пенной процесс ваблюдлется как в растворо изолированного гемоглобина, так и в эритроцитах и их гемолизатах, если каталаза была при этом ингибмрована азидом нпт1>ия. В связи с тем, что каталаза оказывает защитный эффект » при окислении гемоглобина, индуцированном рядом иэоесптх индукторов метгомоглобинемии, модно предположить, что данный процесс, является важным звеном в раэмитии метгемоглобинемий и гемолитических ономий 1п »1»о.

.5) Мотгемоглобия является эффективной гомооой пероксидазой, окис-люощей пероксидазныо субстраты с том же тепловым эффектом, что и перок -екдаза хрена. Лптираликалмадо а1-снты на вытоувдэашо» параметры не нлияктг.

3) Лскорбат является пороксидаэным субстратом, окисляипимся перекисью водорода с том же теплота« эффектом, что и другие иэвестпыо субс траты. При физиологических значениях р(1 имеет место совокупность фермой* тптитюго и нофермонтатгоягого процессов окисления аскорбата перекись» водорода )имегаянх равные топлЬвыо эФ1х>к'ш.

7) Предложен меггод определения ПяОя с чувствительностью до Ю-7М. осноздгашй на запуска перекисью гэодорода цепного окисления гемоглобина.

Данный метод ие подвержен артифактам, свойственным сущестоуилци» хомшио минесцонтним и флуоресцентным методам из-за влиянии на них содержащихся и биообъектах аекорбата, глутатиона и других реакционно активных соединений. С помощи» нр»2дложеиио1-о метода Ыию установление, что при УФ облучении р»ща физиологически важных веществ, и частности, ueKOTojux питиоксидантов, обязуется перекись водорода.

Публикации по материалам дисс^цп-ации

1. Титов (i.D., Петренко D.M., Владимиров U.A. Изучение реакции ка-г.шши с |1о(«кис|л> водорода калориме-п>ическим м<.-годом. Биофизика, !Я08, г.33, Ы1, о.162.

2. Петренко D.H., Титов II.Ю. Калориметрйчоский метод ощюдоления зффиктишюсти функционировании каталази и биоооыжчах. ионр. мед. хим., 1008, т.35, И8, с.143.

3. Титов B.D., Петров В.А., Петренко U.M., Владими]юв U.A. Диффе-ренциалышй колориметрический метод определения микроколи'юотв порокиси подогни в биообъектах с использованием гемоглобина. U сб. Теоретические» зкечюримонталыше и прикладные исследования биожм-ических систем. 1ЧЗД. Романов U.A. H. 2-МСШГМИ им. Н.И.Пир01хша, 1091, с.217.

4. Титов D.D., Нютренко Ю.Н., Петров В.А., Владимиров U.A. Механизм окисления оксигомоглобина, индуцированного перекисью водорода. БЭСМ., liltfl, т. 112, К/, о.48.

5. Титов 13. В., Петренко D.H., Нот рои U.A. Калориметрическое исследование окисления аскорбИ1юиой кислоты пероксидазой хрена. Биофизика, 1ЙЬ2, т.37, Н1, о. 17.

6. Цибулевский A.D., Титов U.U., Петренко D.M. Изменение векоторих двойств каталази тонкой кишки крыс щ>и ваготомии. Ват. физиол. и аксн. таран., »882, ИЗ. с.44.