Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм ганглиозидов в тканях крыс при различных уровнях тиреоидных гормонов в организме

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм ганглиозидов в тканях крыс при различных уровнях тиреоидных гормонов в организме"

АКАДОМ НАУК РЕОПШШКИ УЗБЕКИСТАН

институт шохиад

На правах руконаоа

УСУАНОВА Г^дьоро Уйгуновпа

НЕТАБОМЗЫ ГАЛГЛИ03ИД0В В ТКАНЯХ КРШ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УРОВНЯХ ТИЕЕОЦЩШ ГОРЮНОВ В ОРГАНИЗМЕ

03.00.04 - биохшия

АВТОРЕФЕРАТ

даосортацяи ка соаоканае ученой' степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1ЬЭ1

Работа выполнена в лаборатория йпавдш лишадов Ияствгута бнгашмав АН РУз.

Научный рукозодктель - член-корреспондент Ш РУа,

профессор Т.О.Саатов

Офлциальные оппоненты;

Доктор хршчэокях наук Э.В.Дятловицкая Доктор медицинских паук, профессор А.А.Абидов

Вадуидая организация - кафедра бнохшия Ташкентского Государственного педиатрвчеоного института Ш РУз

Занята состоятся 1991 г. в ^^ часов

на заседании Специализированного Совета Д 015.16.01 по защите • диооертаций на соискание ученой отешнв доктора наук пря Йнотв-туте бясюшии АН РУз по адресу: 700107, Ташкент, проспект М.Горького, 58.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бдсшшшз АН РУз.

Автореферат разослан " 991 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета ------

доктор биологически наук С.А.Бурханов

ОБЩАЯ ^ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопрос о механизмах действия глрэовдных гормонов на клетку является одним из наиболее интересных и наименее изученных. Установлена способность гормонов щитовидной железы как регуляторов самого пшрокого диапазона действия. В слатаом механизме регуляций метаболизма клетки и реализации эффектов тиреоидных гормонов ведущая роль принадлежит состоянию структурных компонентов ллаз~ матических мембран клеток. ,

Гликосфянгаллгшды - универсальные компоненты мембран оукариотичео-ких клеток. Углеводные цепи гликосфинголипидов направлены в менкле-точноэ пространство и формируют барьер на подетупах к липидному бя-слои мембран. Таким образом, эти молекулы наиболее доступны для внешних воздействий и являются клеточными маркёрами и рецепторами. Комбинация различных: видов ганглиозидов и порядок юс расположения на мембране определяют специфичность мембранной поверхности (Hakomciy, 1975; tecleen» IS83) и способность клетки к взаимодействию с другими клетками. Установлено, что ганглиозиды участвуют в процессах клеточного узнавания, в контроле и дифференцировка клеток (Бергельсон, 1982; Авро~ ва, 1988), рецепции гормонов (Fishman, Вгайу, 1976; Yamakawa, 1978), вирусов (Букранокая, 1982; Таранова, 1988), токсинов (Haimgrer;, I98D; Fishman» 1982), являются иммуномодуляторами (Дятловицкая, 1984). Установлено изменение состава и содержания ганглиозидов при трансформациях клеток (накгыпигу, 1986; Дятловицкая и др., 1984, 1987, 1989). Однако до сих пор в литературе практически отсутствуют данные относительно изменения содержания и обмена ганглиозидов при метаболических нарушениях. Качественные и количественные изменения состава липлдов, в частности, ганглиозидов, а также изменение интенсивности обмана их при различных функциональных состояниях и гормональных воздействиях оказывают, безусловно, заметное влияние на течение внутриклеточного обмена, конформацию мембранных белков-фэрментов, а следовательно, и на процесс возникновения патологии. Очевидно, что понимание молекулярных основ действия адреоадных гормонов на может быть достигнуто без четких представлений о природе гормониндуцированных физико-химических, а значит, структурных переотроек в мембранном комплексе, роль гангдаозвдов в котором трудно пареоценить.

Данное исследование выполнено в рамках Всесоюзной комплексной целевой научно-технической программы и планов НИР лаборатории биохимия липидов ИБХ АН РУз по теме: "Изучение структурно-^ункциональншс изменений плазматических мембран при сахапном диабете и других эндокринных нарушениях". Шифр 074.05. № Гоо. .регистрация 01.86.0 009538

Цель я згупачи исследования, Целью настоящей работы явзалось азуче* ние влияния тиреседных гормонов на состав, оодерзание и метаболическую активность ганглиозадов в тканях различных органов крыс. В соответствии с цель» бшш поставлены следующие задачи:

- изучение состава я содержания ганглиозадов тканей в норме, при гшо- и гипертираозе¡

<- определение активности сиалвдазы тааной в норме и при тиреоид-ной патологии}

- исследование действия тяреоидных гормонов на интенсивность включения меченых предшественников в состав индивидуальных гаш ляозидов в различных органах;

- исследование роли отдельных фракций ганглиозадов в связывании тироксина плазматическими мембранами.

Научная новизна,работы. Впервые проведено исследование влияния тараоидвых гормонов на состав, содержание и обменную активность ганглиозвдов в тканях крио, Установлено, что избыток гормонов щитовидной железы в организме приводит ií увеличению как содержания всех выделенных фракций ганглиозадов, так я возрастанию их обменной активности. У врио с удаленной щитовидной явлвзоЙ. выявлено снижение уровня ганглиозвдов с одновременным накоплением фракций монооиалогаиглиозадов в исследованных органах. Показано, что избыток тироовдных гормонов в организма приводит к существенному увеличению включения ' меченых предшественников во все фракции ганглиозадов, в то время как дефицит гормонов оказывает ингибиругаций эффект на включение метки в ганглиозиды всех исследованных органов.

Впервые показано, что гангляозид, хроыатографичеокая подвйаность которого равна таковой фракция 6у3 из мозга крупного рогатого скота, в печени в наабольией степени акцептирует на себр тироксин. Возможно, что этот ганглиозид, природу которого предстоят изучить в дальнейшем, связан о рецептором тиреоидных гормонов или является его составной частью.

Научно-практическая ценность работы» Впервые проведено систематическое исследование состава, содержания и интенсивности обмена ганглиозвдов в тканях крно при избытке и недостатке тирвовдннх гормонов' в организме. Установлена взаимосвязь ыевду уровнем тиреоадных гормонов в организма л активностью сиалвдазы изученных органов. Полученные данные свидетельствуют о регулирующем влиянии тиреоидннс гормонов на содержание и метаболизм ганглиозадов в тканях крыс. Показана существенная роль ганглиозвда GMa в связывании тироксина плазмам-ческами мзмйраиамя печени и мозга крыс.

Совоиушюогь полученных результатов обогащают теоретические ана-

ния о механизме доИствия тиреойднцх гормонов на метаболизм клетки, дополняют новшяя сведениями механизмы функционирования мембранных липвдов в Mffiux системах и представляют интерес для специалистов, занимающихся проблемами липвдологии и мембранологии. Кроме того, результаты доследования способствуют разработка научно обоснованных штодов коррекции метаболических нарушений при rimo- и гипертиреозе.

Длробацпд работы, Осногапга результаты диссертационной работы били доложены на Ш Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент, I9B3); 1У Всесоюзном симпозиуме по биохимии лишдов (Кизв, Г983); П Воеооюзном оимпоздумо "Метаболизм, структура и функции сердечной мышцы" (Ташкент, 1983); УШ Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" (Рига, 1985); I конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1986); П съезде кардиологов Узбекистана (Ташкент, 1988); X Объединенном симпозиуме биохимических обиеств СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, IS89); У конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем я структура работа. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов я их обсуждения, заключения я выводов. Работа изложена на /^/страницах щшинопиои, иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 235 наименований, в том числе 166 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИМЫ И' МЕТОДЫ ИССВДОВШИ

В экспериментах были использованы взрослые крысы-самцы масоой I5C-200 г. Все животные были разделены на 3 группы: I) контрольные, 2) тирвовдэтгаомпрованные, 3) глиертиреовдшю. Все группы животных содержались в одинаковых условиях на обычном рационе. Гипертиреоз у крыс вызывали внутрлбршинным введением Т4 в течение 7 дней из расчета ICO мкг гормона на ICO г массы тела животного. Критерием оценки тиреовдного статуса служили уровень ОБИ крова л изменение масон тела животного. В опыт брались скелетные мышцы, потев, селезенка, сердце, печень, головной мозг экспериментальных животн;гх.

Гангляозады из тканей экстрагировали по методу Фольча (1957) в модификации Бергельсона и да. (1981).

Очиоетгу выделениш ханглиоздцов производили дазатогра$ией ra ceje-дексе G-25 ь ча ДЭАЭ-деллплозе, затем подвергали диализу и лиофяли-эирозали. О количестве ввдело.чных гянглиозидов судили по содержания

в еик скаковой кислоты, которое определяли перйодат-резорциновым методом ( Jourdian, 1971).

Разделение ганглиозидов на фракция осуществляли методом ТСХ по >.к тоду Дятловицкой (1981) о некоторыми собственными модификациями. Иде тификацию выделенных фракций производили сравнением значений Rf ввд? ленных нами фракций и фракций ганглиозадов мозга быка ("Serva ФР] а также кошерчэских фракций (" sigma", СМ).

Активность эндогенной оиалидазы тканей определяли методом Sohengi (IS70).

Интенсивность обмена ганглиозадов изучали по включению Д-1-6~14С-глюкозы и Д-1-3Н-галакгозы в состав ганглиозадов тканей.

Очищенные ПМ из ткани печени выделяли методом Ray (1970) в мод;: факации В.Боейкова (1976), а из ткани мозга методом Krichnan г Balaram (1976).

О чистоте выделенных мембран судили по увеличению активности маркерных ферментов в процессе очаотки (5'-нуклеотадази и МФазы).

Для изучения роли ганглиозадов в связывании T« плазматическими

ТА

мембранами в условиях i» tito крысам вводили С-Т4 из расчета 0,06 мкКюря на 100 г массы тела животного. Экстракцию а разделение ганглиозадов производили упомянутыми ранее методами.

Для проверки ■результатов экспериментов в условиях in vir» была произведена инкубация фракций, выделенных методом ТСХ, зп v-itre в среде, содержащей 10 мня (0,001 мкКюри) в течение I часа.

Освобождалась от несвязавшегося гормона. Ганглиозиды, связанные с меткой использовали для подочета радиоактивности.

Все полученные результаты были статиотическя обработаны с вычислением степени достоверности по Стьюденту (Сквайрас, 1971).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние тиреоидннх гормонов на содержание ганглиозадов в различных тканях крыс. 'Наш в сравнительном аспекте был изучен ганглиозид-ный состав тканей крыс в норме, при гипертяреозе и пооле тираоидэк-томии. Полученные результаты показали, что минимальное количество ганглиозидов содержится в скелетной мымцв, а максимальное - в головном мозге. Содержание ганглиозадов в остальных исследованных органах возрастает в следующем порядке: селезенка<почки <сердце<печень.

Как видно' из рисунка I, избыток тиреоидных гормонов в организме приводил к увеличению суммарного содержания ганглиозидов во всех исследованных тканях, причем наибольшее возрастание содержания ганглиозидов иаблвдалось в ткали печени (до 80!?), в остальных органах оодер-

к

Еч

1,2

0,6

S 0,4

Ъ

W

th

nh

гН

30

25

20.

h

1 2.3 4 5 6

РясД. Содержание суммарных ганглиоэидов в тканях различим органов крыс в норме я при тиреовдной патологии 1-скелетнда мышцы; 2-почки; 3-сэлезенка; 4-сердце; 5-пэченъ; 6-мозг. сз - контроль; и - тиреоидэктомия; ш - гяпертиреоа

жаняе ганглиоэидов возрастало в пределах от 20 до 40$ по отношению к контролю. У тиреоидэктомированных крыс выявлено снижение уровня суммарных гангляозидов почтя во всех исследованных органах за исключением селезенки.

Из*подученных результатов дотекает;' что содержанке ганглиоэидов в различных органах крнс самым тесним образом связано с тиреоидины статусом организма, и степень изменения уровня ганглиоэидов в разннх органах зависит от степени отзывчивости органа к действию тиреоидных гормонов. По-видимому, выявленные нами изменения в ганглиоэидногл составе при гиреоадной патологии является одноЗ из главннх причин нарушения транспортных и рецепторных овойств мембран.

Тонкослойной хроматографией суммарных ганглиоэидов тканей из скелетных мншц, почек, сердца и печени было вццелено по 6 фракций, из селезенки - 7, из ткани мозга - 9 фракций ганглиоэидов.

Поскольку гангляоэадам мозга посвящено множество исследований, я они изучены достаточно подробно, а структура большинства гапглиозидов висцеральных органов до сих пор не установлена, при разделения гапг-

лиозвдов из исслодованных органов мы использовали нанесенные параллельно ганглиозвдц из мозга крупного рогатого скота я коммерческие ганглиозеды. Идентификацию проводили путем сравнения значений Rf. Фракции ганглвозидов висцеральных органов уоловко обозначали по названиям фракций ганглаоэадов мозга быка, мигрирующих на хроматограм-мах параллельно с выделенными нами фракциями.

Из результатов проведенных нами исследований следует, что для каждого органа характерен строгий набор- индивидуальных гянглиозкдов, 55 процентное соотношение отдольиых фракций также имеет органную специфичность, что свидетельствует в пользу ввдБанутоЙ ранее гипотезы о том, что ганглиозеды служат маркерами меточной поверхности (Нако-тоту, 1986; зтеппехиаггл , 1980). Следовательно, ганглиозвдный спектр мембран во многом определяет их функциональное состояние, а хотя бн сколько-нибудь значительное нарушение спектра ганглиозадов может существенно изменять такие параметры мембран, как жесткость, проницаемость, отзывчивость.

Как показали результаты наших исследований, во всех изученных органах профиль ганглиозадов претерпевает сущетовенные изменения в зависимости от концентрации мреоццных гормонов в организме.

3 сердечной ткани крыс нами выявлены в убывающем по количеству порядке следующие фракции: бщ (26$)> е[/й (24Я—СД1а (24Я>бД1 (13*) ^вд (9%)?-^ (6%) (табл.1).

Как видно из таблД, гареоидоктомия приводит к снижению уровня всех фракций ганглиозидов б сердечной ткани, кроме фракции, мигрирующей на хроматоградше параллельно с фракцией Сщ из мозга быка. Уровень этой фракции был на 60$ вше, чем в контроле, что, по-видимому, объясняется достаточно высокой резистентностью этого ганглио-зида к действию сиалвдазц вследствие структурной особенности оляго-сахаридной цепочки. Снижение уровня остальных фракций было неодинаковым. Так например, содержание ганглиозадов, имеющих в своей структуре более двух остатков сааловых кислот, падало на 20-30$ по сравнению с контрольным уровнем. Количество сиалових кислот во фракциях ®Мз и ®Д1а сшжалось более, чем в 3 раза, что связано, вероятно, о двухкратной активацией оиалидазы в миокарде крыс с удаленной щитовидной железой. Снижение уровня всех фракций ганглиозидов у тиреоид-эктошрованных крыс является, по-ввдимиду, одной из причин подавления водно-электролитного обмена при тиреовдзктомии. Немаловажное значение здесь также имеет снижение Ка+,К+ стимулируемой активности

Рвс.4. Удельная радиоантивиость *4С-глшозы в отдельных фракциях ганглиозидов мозга крыо в норма и при тяреоидной патологии (п. =8)

фракциях:, причем существенное ее снижение выявлено во фракциях дя~ и трясиалоганглиозидов. В ткани мозга гипертиреоидных крыс наблюдалось существенное возрастание УР всех фракций. Наиболее ярко выг раженная стимуляция тиреоидными гормонами обменной активности выявлена ви фракциях 0д1а и Включение метки в эти фракции на 30$ и 65/2 превышало контрольные показатели. Подобная тенденция распределения радиоактивности была показана и при введении меченой галактозы.

Уникальное сочетание особенностей структуры, физико-химических свойств, локализации, а также метаболических превращений ганглио-вйдов позволяли выдвинуть предположение об их способности кодировать омгшрический опыт (Крепе, Ашмарина, 1982), а контактные свойства в сочетании с гетерогенностью молекулярных форм обеспечивают формирование функциональной сети нейронов, необходимой для хранения и передачи информации, для механизма обучения и памяти (те«а-тап« , 1984). Известно, что в этих процессах наиболее предпочтительная роль отводится более сложным молекулярным формам ганглио-зпдов (з,-вппвгь»1га , 1970). Поэтому выявленные резкие изменения метаболической активности именно этих форм ганглиозидов в ткани мозга при различных концентрациях тиреоидных гормонов в организме могут объяснить возникающие при тиреоидной патологии функциональные нарушения в ЦНС.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что тиреоидине гормоны оказывает влияние на содержание и обмен индивидуальных фракций ганглиозадов во всех исследованных органах, причем влияние это достаточно тканеспецифично.

Участие ганглиозидов в связывании тироксина плазматическими уомбранауя. Необходимым условием для реализации действия тиреоидных гормонов является их взаимодействие с ПМ. Ключевым моментом в эффекта тиреоидных гормонов на уровне мембран, безусловно, является модификация, которой подвергаются мембранные липиды. Преимущественная локализация ганглиозидов на наружной поверхности ПМ, где они, создавая "опушенность" разветвленными олигосахаридными цепочками, направленными в межклеточное пространство, а также такие уникальные свойства их молекул, как большое структурное разнообразие углеводных цепей, предполагают, как нам кажется, их участие в связывании тиреоидных гормонов ПМ.

Для выяснения ролл отдельных фракций ганглиозидов в связывании Т4 мембранами печени и мозга были проведены зкопорикенты о введение?.! животным *4С-Т4 о дальнейшим определением распределения ме-

10

8.

6-

ъ

w

22

Ш - мозг □ - печень

J2L

G,

TI ®Д1в %а вД2 °Цз %

G,

te

Рис.б. Связывание 14С-Г4 отдельными фракциями гаиглнозвдоа Ш печена и мозга крно in vitró

о Й

к Щ

и

3

140 120 10040 -30 -

20

10 -

gg - мозг □ -печень

Ж

É

'О % °Д1в GJIa вД2 ^э %

Рис. &. Связывание ^C-Tj отдельными фракциями гапглиояидив печена и мозга крно in viro

4

ченого гормона между ганглиозиднымя фракциями ПМ. Для проверки результатов, полученных в экспериментах in vivo , совместно о Ф.Я. Талановой и О.У.Кахаровой были проведены эксперименты по изучению распределения меченых гормонов во фракциях ганглиозидов in vitro.

Анализ полученных результатов проведенных исследований как в условиях in viyc, так и в условиях in vitro, показал, что накопление метки в обоих случаях наблвдалось преимущественно во фракции GMg, причем связывание метки этой фракцией было более выражено в опытах о ПМ печени по оравнению о ПМ мозга (рис.5 и 6). По-видимому, это различие связано о более высоким процентным содержанием фракций GM3 в мембранах печени. Из приведенных данных логично следует предположение о преимущественной роли ганглиозида Су3 в связывании шреоидных гормонов -Ш клеток, особенно гепатоцитов.

Возможная роль гангляозида,соответствующего по хроматографичес-кой подвижности фракции G{i3, заклзочаетоя либо в связывании о последующей передачей гормона на рецептор, либо в том, что он, свя. зываяоь о Т4 конформационно преобразует фосфогликолипидное микроокружение рецептора, приводящее к его активации. Не исключено, что этот ганглиозид является составляющэй частью рецепторного комплекса, как в случае тиреогропного гормона.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что кавдый орган крыо характеризуется строгим спектром индивидуальных ганглиозидов, который подвергается существенному изменению под влиянием гормонов щитовидной железы.

2. Установлено повышение уровня как суммарных ганглиозидов, так и их отдельных фракций в тканях при гипертиреоза. Тираоядэктомия приводила к пониканий содержания ганглиозидofe' в исследованных органах крыо.

3. Выявлена стимуляция активности сиалидазы исследованных тканей при гиреоидной патологии.

4. Установлена прямая корреляционная зависимость между возрастанием метаболической активнооти отдельных фракций ганглиозидов при гипартиреозе и содержанием их в нормальных тканях. При гипотиреозе скорость включения меченых предшественников в состав ганглиозидов была замэтио шике контрольных значений.

5. Показана важная роль ганглиозвда 0Мз в мембранной рецепции тиреоидшх гормонов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Саатов Т.С., Бурхансв.С.А., Устном Т.У. Изучение ганглнозид-:о состава клеточных мембран различных органов крыс/Д! Сов.-Двей-рокий симп. Биологические мембрапы.Структура и функция. Тез.докл., пкент.~1983.-С.113.

2. Саатов Т.О., Бурхаков СЛ., Усманова Г.У. Ганглдозвдн тканой злачянх органов крыс в норм я при тиреопдной патологпя//1У Безо, мп. по биохимии липпдов. Тез.докл., ILiqb.-I983.-C.Q4.

3. Саатов Т.О., Зайнутдяггов Б., Усманова Г.У. Тиреоидине гормонн рзгуляцяя метаболизма ляпидов в сердечной мшцв//й Вс90.симп. таболязм, структура я функция сердечной ?.жшцы.-Таяжент.~1983.-

4. Усманова Г.У., Бурхапов С.А., Саатов Т.О. Влияние тиреоидннх )рмояов на содержание гаягляозидов в тканях различных органов крвд// iH УзССР.-1983.-5 6.-С.45-46.

5. Саатов Т.С., Еурхэнов С.А., Усманова Г.У. Изменение гангляо-здного состава различных органов крно под действием тиреоидннх гор-знов//Бп ох имл я. -1984,~Т.49,выа.8.-С.1291-1294.

6. Усманова Г.У., Саатов Т.О. Влияние тиреоадгок гормонов па остав а биосинтез ганглиозвдов в сердечной мшцо/Двадоал. 3-го бъедия.симя.бяохим.обще ств СССР-ГДР.-Рига.-1985.-С.143-144.

7. Казаков И., Усманова Г.У., Дуртаев X. Влияние ганглиозвдов на роводимость биолойных липидных мембран, модифицированных ядом наука//

Ковф.биохимяков Узбекистана. Тоз.докл.-Ташкент.-ISS3.-СЛCO-IOI.

8. Саатов Т.С., Усманова Г.У. Изменение состава, содержания а |бМ9НН0й активности ганглиозвдов оордечной ткани//П съезд кардиоло» 'ов Узбекистана. Тез.докл.-Ташквнт.-1988.~С.227.'

9. Усманова Г.У., Саатов Т.О. Гормональная рефляция метаболизма •англяозядов тяаяя//Х Обьэдия.сиш.бйсшш. обществ СССР-ГДР. Кэха-шзш регуляции клеточной активности.-Ташкент.-М.,1989.-С.84.

10. Усманова Г.У. Метаболизм ганглиозядов в тканях крыс при экс-юриментальном гипертиреозе/Д Конф.биохимиков респ. Ср.Азия я Казахстана.-Ташкент.-1991 .-C.II5.

21

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Г4 - тироксин

ТСХ - тонкослойлая хроматография

ПМ - плазматическая мембрана

CK - сиэловыэ кислоты

УР * удэлъпан радиоактивность

ЦНС - центральная нервная система СБН - связанный с балком Я од