Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм D-арабинозы: характеристика бифункциональной арабинокиназы/пирофосфорилазы Leishmania major

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм D-арабинозы: характеристика бифункциональной арабинокиназы/пирофосфорилазы Leishmania major"

О / /

/ / , Учреждение Российской академии наук

^у / ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Ов""""""""" пли

00461

На правах рукописи

Новожилова Наталья Михайловна

Метаболизм D-арабинозы: характеристика бифункциональной арабинокиназы/пирофосфорилазы Leishmania major.

03.01.04-Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москеа2010 2 8 0 ^ 2010

004611991

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и Медицинском Центре Университета Кентукки, США.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, Николай Владимирович Бовин Научный консультант:

профессор биохимии Сальваторе Турко, Медицинский Центр, Департамент Биохимии, Университет Кентукки, США

Официальные оппоненты:

Румш Лев Давидович, доктор химических наук, заведующий лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН

Дружинина Татьяна Николаевна, кандидат биологических наук, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится 27 октября 2010 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-1, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 2-Ь сентября 2010 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лейшманиоз - это заболевание, вызываемое паразитическими простейшими рода Leishmania. По данным ВОЗ им заражены 12 млн. людей в мире, 60 ООО из которых ежегодно умирают. Против этого заболевания нет вакцин, а методы лечения состоят в жесткой химиотерапии с тяжелыми побочными эффектами. Поэтому разработка новых эффективных лекарств и вакцин для лечения лейшманиоза остается актуальной на сегодняшний день задачей.

На протяжении жизненного цикла Leishmania проходит стадию метациклогенеза, когда проциклические промастиготы Leishmania, прикрепленные к эпителию желудка москита-переносчика, трансформируются в метациклические промастиготы, способные проникать в кровоток млекопитающих. На этой стадии L. major синтезирует липофосфогликан (LPG), боковые цепи которого терминированы D-арабинопиранозой (D-Ara). В результате, галектин на эпителии желудка москита перестает узнавать галактозу в составе боковых цепей LPG, что позволяет Leishmania отделиться от поверхности желудка и мигрировать в кровоток человека (D-Ara отсутствует в клетках млекопитающих). Биосинтетические пути с участием этого моносахарида остаются неизвестными, а их изучение может дать ключ к созданию лекарств против лейшманиоза.

Цели и задачи исследования. Данная работа направлена на изучение биосинтеза D-Ara на стадии активации моносахарида до GDP-D-Ara. Основной целью исследования являлась характеризация двух необычных ферментов из L. major, один из которых оказался арабинокиназой-пирофосфорилазой, т.е. синтезировал GDP-D-Ara из D-Ara через промежуточный 0-арабино-1-фосфат в присутствии АТР и GTP. Одной из задач работы являлась идентификация белка-переносчика, транспортирующего GDP-D-Ara из цитозоля в люмен аппарата Гольджи, где происходит синтез D-Ага-содержащих гликоконъюгатов клеточной поверхности Leishmania. В задачи исследования также входило изучение арабинозилирования фосфогликанов L. major на разных стадиях жизненного цикла этого простейшего организма.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что фермент, способный в L. major синтезировать GDP-D-Ara из D-Ara,

является бифункциональным; синтез GDP-D-Ara протекает через промежуточный О-арабино-1-фосфат; измерены кинетические параметры этой реакции и изучено расположение активных доменов в белке. Установлено, что этот фермент отвечает за синтез цитоплазматического GDP-D-Ara, используемого для арабинозилирования LPG клеточной поверхности L. major. Доказано, что у Leishmania, синтезируемый в цитоплазме GDP-D-Ara транспортируется в аппарат Гольджи белком-переносчиком LPG2. Проведен сравнительный анализ известных на сегодняшний день бифункциональных киназ/пирофосфорилаз из различных организмов. Предложен механизм контроля арабинозилирования фосфогликанов клеточной поверхности на протяжении жизненного цикла L. major. Показано, что паразитический простейший организм L. major способен синтезировать фукозо-содержащие фосфогликаны, предложен механизм биосинтеза GDP-L-Fuc.

Публикации и апробация работы. По тематике диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на международных конференциях:

"Annual Conference of the Society for Glycobiology" (Лос-Анжелес, США,

2006)

"Annual Conference of the Society for Glycobiology" (Бостон, США, 2007)

"Annual Conference of the Society for Glycobiology" (Даллас, США, 2008)

"Annual Conference of the Society for Glycobiology" (Сан-Диего, США, 2009).

XXII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2010)

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 173 ссылки. Диссертация содержит 24 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Идентификация бифункциональной арабинокиназы-пирофосфори-лазы в геноме L. major. Донором D-арабинопиранозы (D-Ara) в биосинтезе гликоконъюгатов Leishmania является GDP-D-Ara, но ферменты, осуществляющие его синтез не изучены. Известно, что бактерии (Bacteriodes) и растения (Arabidopsis) могут синтезировать GDP-L-Fuc из L-фукозы (L-Fuc) через промежуточный Ь-фукозо-1-фосфат с помощью бифункционального фермента Ь-фукокиназы/ООР-Ь-фукозопирофосфорилазы (Рисунок 1).

L-Fuc у—L-Fuc-l-Phosphate —^—GDP-L-Fuc ATP A DP СТР РР,

Рисунок Í. Схема синтеза GDP-L-Fuc у Bacteroides fragilis с помощью бифункциональной фукокиназы/пирофосфорилазы FKP.

Т.к. D-Ara и L-Fuc являются структурно родственными моносахаридами, представляется логичным, что биосинтез GDP-D-Ara у Leishmania может протекать по механизмам, схожим с биосинтезом GDP-L-Fuc у других организмов. Чтобы проверить это предположение, геном L .major был изучен на наличие открытых рамок считывания, гомологичных участкам генов фукокиназы и GDP-L-фукозопирофосфорилазы. В результате, на шестнадцатой хромосоме были обнаружены два почти идентичных гена {ImjFl6.0440 и lmjFI6.0480), обладающие высокой схожестью с генами fkp Bacteroides fragilis (клонированный ранее L. Comstock с коллегами) и atIgO1220 Arabidopsis thaliana (клонированный ранее Y. Tsumuraya с коллегами), кодирующими бифункциональные L-фyкoкинaзы/GDP-L-фyкoзoпиpoфocфopилaзы. Открытые

Список используемых сокращений: а.к. - аминокислота; D-Ara - D-арабинопираноза; Ara-1 -Р - арабинозо-1 -фосфат; L-Fuc - L-фукоза; Fue-1 -Р - фукозо-1 -фосфат; АКР - арабинокиназа/пирофосфорилаза; FKP - фукокиназа / пирофосфорилаза; LPG - липофосфогликан; GIPL - гликозилинозитолфосфолипиды.

рамки считывания lmjF16.0440 и lmjF16.0480 соответствуют предполагаемым полипептидам, состоящим из 1187 аминокислот с расчетной молекулярной массой 126.5 кД (Рисунок 2). Единственным различием (три а.к. остатка) между двумя белками является участок 196- 199, а именно PheGlnAsnHis для LmjF 16.0480 и LeuGlnAspTyr для LmjF 16.0440. На N-концах этих белков находятся два высококонсервативных участка, один из которых, VallOO -Lysl 17, обладает высоким сходством с консервативным мотивом пирофосфорилаз, Lys(X)2GlyXThrXMet(X)4Lys, а другой, Asp50 - Gly54,

1 MNVSFU-SU' cklAefkgaa

61 111 GTVULUIACY PIWRRWHRG ■ VDKQRHAPAS SQLSRTL LST;

181 141 DSDVLCFÜW MXVMLSDRAVE ADASL Q "G VLTRKCLGGA

»1 dpeiaglKas WBLRDAEFL :

361 gggeeldpaa GOAMPLLATP

421 481 •SSWVGARWAL MDDAFCGÜVR RDQlilLtGVP SGSTMYMGVR ,

541 CATEQOLGDF LYVATLPLEA

601 LRNSEYYERR MLTLMLA.LVA

661 GVPLPRHSGP TEWWGGVDAA

721 GRGAPLCTAP GRIVAAHYHA

781 RSLVALHDAA ALAELRAAIM

841 AILSGGSVIN VAVELNGQPP

901 PFSIPKAALA LCGFLPEFCA

961 GTVLRSLAEF CKLPWDNHDV

1021 PTVRWMPDSV YTDPRFAACH

1081 TAAMYDAITT GNYKGYARLV

1141 GGYMYMCAKD EACARR1REL

kllad.aaalp akrsflswlr QVPMYRE1VA VLETARLRPI. LDAEDATDGG: HYGTNRQUS SSVIV'QNSVV RNOWALALPP 1ЩМ SbROi-ATGGCAGVDA GDPAAPRARS GNAVALSRQV FASRLMELAL DSFPDERHDP VQVYVRVRED TEYATLREQL CRRVLLIEQM lAYYTGITRM HRTWEQKKRL LTANPPNGNA

LRbCGAKGGV LADNDöRViV ~ MAP-VRIRTL! DLDYMWKPS YDaflRfTAVR AVATÜjü'RES 1ÄPLDGSAAA G\CVbVVP\L SVAELVKAAR ARLAAGQAVW PVLPGPMVAL APAAPFAKGA EAMDAAEPPV EMSVHLDQH PUMMHSIDS

AARFGGHGLE *

LTAGGGVVQDQ AKGIIGEIVR PDGVCNPTVQ RFVEMSVSAS

AVPGLFCG(fF~

ACGDVCVDAR LDEVRRRVAE fAYDiySEFA : PTPPWSVGTP

aaadapagap

; s' ДЦ" ' PAALÖGCGDG

AADGGAAQPL

RTQPRVSAMD

LQQQFFLLDL

AASAGSWAQV

SAAEKARRLA

WGRCPIRIDV

GEQLSVSSFD^

ISLFVAIl|re_.

YGGLFEGLK1

DVLLNNGATL

SIVDIVEPYV

GLQfSRS

ры1и'1(йсо ;AY£AMJ||all

GAI.PS1.AH! А GRHSVCLDVG SALGKNAMA ! LDGVLAPERG LSPVRHUVVE AVI'liAARPYÜ DMXEAALFPV LLRLTDVPAM NRVAQRWEL FSDEGSPSGG LLRASSAEEA AGAWTDTPPY lElRTYATMQN

VQCVPGLPCL QLLREMGGPT WGLTLPGAGO

Рисунок 2. Полипептидная последовательность, кодируемая генами \rnjF16.0440 и ЩР16.048,0. Участок ХХ(}Х соответствует последовательностям у 1т]Р16.0440 и РСШН у 1пуТ16.0480. ОТР-связывающий, пирофосфорилазный и АТР-связывающий (консервативные) мотивы выделены, соответственно, простой, пунктирной и двойной рамками. А.к., выбранные для проведения сайт-направленного мутагенеза (см. ниже) отмечены звездочками.

является одним из трех консервативных GTP-связывающих мотивов AspXXGly. На С-концах также находится консервативный участок Gly950 - Ие958, гомологичный мотиву GlyXGly(X)2Gly(Ser)2GIy, формирующему АТР-связывающий карман у многих киназ. Присутствие этих последовательностей дало основание предполагать наличие киназной и пирофосфорилазной активностей на С- и N-концах белков, соответственно.

Тестирование ферментативной активности белков, кодируемых генами lmjF16.0440 и lmjF16.0480. Для тестирования активности предполагаемых ферментов, гены ImjF16.0440 и ImjF16.0480 были клонированы в плазмидный вектор рЕТ 16Ь*. Клетки E.coli штамма BL21 (DE3)-RIPL трансформировали полученными плазмидами рЕТ 16b-lmjFl 6.0440(ñis)6 и pET\6b-lmjF16.0480{Uis)6. После лизиса индуцированных клеток, белки солюбилизировали и иммобилизовали на аффинном сорбенте TALON за счет гистидинового тэга на N-концах. Иммобилизованные LmjF16.0440 и LmjF16.0480 тестировали на наличие ферментативной активности; реакционная среда содержала ATP, GTP и [3H]D-Ara в качестве субстрата. Тритилированные продукты реакции разделяли и анализировали с помощью анионо-обменной хроматографии. Так как помимо LmjF 16.0440 и LmjF 16.0480 с TALON могли неспецифически связаться другие белки, было необходимо контролировать возможную активность посторонних белков. Для этого проводили контрольные реакции, в которых в качестве источника белка добавляли TALON, инкубированный с лизатом клеток E.coli, трансформированных вектором рЕТ 16Ь без генных вставок.

Результаты тестирования ферментативных активностей рекомбинантных LmjF16.0440 и LmjF16.0480 представлены на рисунке 3. Белок LmjF16.0480 катализировал образование D-Ara-1-фосфата и GDP-D-Ara, в то время как LmjF16.0440 синтезировал только D-Ara-1-фосфат. Когда в реакции присутствовали только неспецифические белки, образования продуктов реакции не наблюдалось. Полученные данные позволяют заключить, что продукт гена ImjF16.0480 действительно действует как бифункциональная

"Генно-инженерные работы по клонированию генов были выполнены Н. вио в лаборатории молекулярной микробиологии Вашингтонского Университета.

арабинокиназа-пирофосфорилаза, т.е. данный фермент обладает D-арабинокиназной и GDP-D-Ага-пирофосфорилазной активностями. В то же время, рекомбинантный белок LmjF 16.0440 обладает только D-арабинокиназной активностью, а его пирофосфорилазная активность или отсутствует вовсе, или настолько мала, что чувствительность используемого метода не позволяла ее детектировать.

В предыдущих исследованиях* М. Ferguson с коллегами нашли, что в цитоплазме L. major помимо GDP-D-Ara также присутствует GDP-L-Fuc. Учитывая, что D-арабинопираноза и L-фукоза структурно похожи, LmjF 16.0440 и LmjF 16.0480 были также протестированы на способность синтезировать GDP-L-Fuc из L-Fuc. Для этого, рекомбинантные белки инкубировали с АТР, GTP и [3H]L-Fuc в качестве субстрата, и продукты реакций анализировали с помощью анионо-обменной хроматографии (Рисунок 4). Как видно из представленных на рисунке 4 хроматограмм, оба фермента обладают бифункциональной активностью по отношению к данному субстрату, т.е. способны синтезировать GDP-[3H]L-Fuc из [3H]L-Fuc.

Таким образом, как LmjF 16.0440 так и LmjF 16.0480, обладают способностью синтезировать GDP-L-Fuc из ATP, GTP и L-Fuc, но только LmjF 16.0480 способен синтезировать GDP-D-Ara из D-Ara. На основании этих данных, ферментам L. major были присвоены следующие имена:

Lmj 16.0440 = FucoKinasePyrophosphorylase=FKP40,

Lmj 16.0480 = ArabinoFucoKinasePyrophosphorylase=AFKP80.

"Turnock D.C. and Ferguson M.A. // Eukaryot Cell. 6:1450-63 (2007).

Фракция

1 *»

Фракция

СОР-А га

ищИЬ.ОШ

Ага-1-Р 1

I | 1 радиснн 1

/ 1 унлсо,

л

"ё и

о,: § £

0,1

Фракция

Рисунок 3. Анализ продуктов ферментативной реакции. Рекомбинантные белки Ьггур 16.0440 и ЬпуБ 16.0480 тестировали на наличие ферментативной активности в реакционной среде, содержащей [ Н]0-Ага в качестве субстрата. Продукты реакции анализировали с помощью анионо-обменной хроматографии на ДЕ-52 в градиенте ЫН4НС03. В контрольной смеси, содержащей только неспецифические белки, продуктов реакции не наблюдается. При добавлении в реакционную смесь белка 1лтуР16.0440 образовывался только Б-Ага-фосфат, в то время как фермент Ьпур 16.0480 синтезировал П-Ага-фосфат и ОБР-Б-Лга.

Фракция

GDP-Fuc

Фракция

LmjF16.0440

Градиент

mijico,

0.2 5

LmjF16.04480

GDP-Fuc

rpatiii&mt XfUICO,

Фрякшш

Рисунок 4. Анализ продуктов ферментативных реакций с участием рекомбинантных белков LmjF 16.0440 и LmjFl 6.0480 L. major. В реакционную среду, содержащую рекомбинантные LmjF 16.0440 и LmjF 16.0480 добавляли [3H]L-Fuc в качестве субстрата. Образовавшиеся продукты разделяли на анионообменнике ДЕ-52 в градиенте NH4HCO3. В отличие от контрольной смеси (содержащей только неспецифические белки), где продуктов реакции не наблюдается, оба исследуемых фермента способны синтезировать GDP-L-Fuc.

ATP и GTP необходимы для активности FKP40 и AFKP80. Чтобы подтвердить необходимость АТР для киназной и GTP для пирофосфорилазной активностей FKP40 и AFKP80, ферментативные реакции проводили в присутствии только одного из трифосфатов, результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Зависимость ферментативных реакций, катализируемых рекомбинантными FKP40 и AFKP80 L. major, от наличия АТР и GTP.

Фермент Субстрат Нуклеотид в реакционной смеси Продукты реакции

FKP40 L-Fuc только АТР только GTP L-Fuc- 1-Р L-Fuc-1-Р, GDP-L-Fuc

AFKP80 L-Fuc только АТР только GTP L-Fuc-1-Р L-Fuc-1-Р, GDP-L-Fuc

D-Ara только АТР только GTP D-Ara-1-Р D-Ara-1-Р, GDP-D-Ara

В отсутствие как АТР, так и GTP, образования продуктов реакции не наблюдалось (данные не представлены). В присутствии только АТР, реакция шла не полностью, и приводила только к арабинозо-фосфату. Когда в реакционной смеси находился только GTP, образовывались небольшие количества GDP-D-Ara, по-видимому, благодаря тому, что фермент был способен частично утилизировать GTP вместо АТР. Однако, в присутствии только GTP реакция шла медленно и выход продуктов реакций был низким, по сравнению с реакцией в присутствии АТР + GTP.

Таким образом, для протекания полноценной реакции необходимо присутствие в реакционной среде обоих трифосфатов: АТР для киназной и GTP для пирофосфорилазной активности исследуемых бифункциональных ферментов.

Изучение кииазиых и пирофосфорилазиых доменов FKP40 и AFKP80 методом сайт-направленного мутагенеза. Расположение доменов и активных центров в бифункциональных ферментах L. major было подробно изучено методом сайт-направленного мутагенеза*.

*Сайт-направленный мутагенез был выполнен Т. Notton в лаборатории молекулярной микробиологии Вашингтонского Университета.

В а.к. последовательности FKP40 были выбраны восемь эволюционно-консервативных а.к. остатков и заменены на аланин, фенилаланин или серин. Полученные мутанты были протестированы на наличие ферментативной активности, результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2. Исследование FKP40 L. major методом сайт-направленного мутагенеза.

Мутант Аминокислотная замена Продукты реакции

Субстрат: Ь-Рис Субстрат: L-Fuc-lP Субстрат: Б-Ага

Контроль дикий тип СОР-ЬРис GDP-L-Fuc О-Ага-1-Р

А Asp 0050 Ala Ычн>1-Р - -

В Ser 0058 Ala Ь^ис-1-Р - -

С Туг 0283 Phe Ычю-1-Р ОБР-Ь-Рис1 - -

D Asp 0432 Ala Ь-Рис-1-Р - -

Е Asp 0836 Ala нет продукта GDP-L-Fuc нет продукта

F Ser 0956 Ala нет продукта GDP-L-Fuc нет продукта

G Asp 0999 Ala нет продукта GDP-L-Fuc нет продукта

Н Gly 1140 Ser Ь-Рис-1-Р СБР-ЬРис1 L-Fuc-l-P GDP-L-Fuc1 О-Ага-1-Р

1 Образование ООР-Ь-Рис происходило в незначительных количествах (менее 5% от количества ООР-Ь-Рис, синтезируемого ферментом дикого типа). "-" тестирование активности с данным субстратом не проводили.

Четыре мутации на Ы-конце привели к потере ферментом пирофосфорилазной, а три мутации на С-конце - киназной активностей, что подтверждает предсказанное (см. стр. 4) расположение пирофосфорилазного

и киназного доменов на N- и С-концах соответственно. Одна из этих мутаций (замена Ser956 на А1а956) находится в С-концевом участке, гомологичном АТР-связывающему консенсусному мотиву GlyXGly(X)2Gly(Ser)2GIy, поэтому, вероятно, потеря киназной активности происходит из-за неспособности белка связывать АТР. Аналогично, когда Asp50 на N-конце, принимающий участие в формировании GTP-связывающего мотива AspXXGly, был заменен на Ala, белок терял способность синтезировать GDP-Fuc, возможно из-за неспособности связывать GTP.

Интересно, что замена Glyl 140, локализованного на С-конце, на серин привела к потере белком пирофосфорилазной активности, не затрагивая при этом киназную. В связи с этим необходимо отметить, что FKP40 и AFKP80 не обладают классическим мотивом Gly(X)4GlyLys мононуклеотид-связывающих белков. Вместо этого, на С-концах обоих белков находится глицин-содержащий участок, сильно напоминающий последовательность XhXhGlyXGlyXXGly (Xh - гидрофобная аминокислота), характерную для динуклеотид-связывающих белков. Glyl 140 находится именно в этом участке, а его замена на аланин приводит к потере пирофосфорилазной активности.

Полученные данные позволяют предположить, что пирофосфорилазный домен разобщен на уровне полипептидной цепи, и часть С-конца играет роль в образовании GTP-связывающего участка. В таком случае, ферментативно-активная форма белка образуется на уровне третичной структуры, причем пирофосфорилазный домен формируется при участии последовательностей, расположенных на N- и С-концах (Рисунок 5).

АВ

С D

N

200

545 600

Е F G Н

1187 аа

ш

пирофосфоршшный домен

кшшнмн домен

■ ■ ш три аминокислоты, по которым различаются /\1KF\S0 н ККР-Ю

Рисунок 5. Предполагаемое расположение киназного и пирофосфорилазного

доменов на полипептидной последовательности РКР40. Буквы (см. табл. 2)

показывают расположение а.к. остатков, выбранных для сайт-направленного мутагенеза.

Определение кинетических параметров для FKP40 и AFKP80. Для

рекомбинантных форм FKP40 и AFKP80 L. major были измерены кинетические параметры, а именно константы Михаэлиса-Ментен (Кт) и максимальная скорость реакции (Vmax), см. таблицу 3.

Таблица 3. Кинетические параметры сродства к субстрату рекомбинантных ферментов FKP40 и AFKP80 L. major.

Фермент Субстрат Km (mM) V * max (цМ/L/min)

FKP40 L-Fuc 0.07 0.06

L-Fuc-1-Р 6.25 0.60

D-Ara 1.23 0.35

D-Ara-1-Р - -

AFKP80 L-Fuc 0.08 0.15

L-Fuc-1-Р 5.30 6.80

D-Ara 2.90 0.50

D-Ara-1-Р 67.0 160.0

Как киназы, оба фермента ведут себя схожим образом. Обращает на себя внимание необычно большое значение Кт = 67 мМ для пирофосфорилазной реакции, катализируемой AFKP80. Такое низкое сродство к арабинозо-фосфату может свидетельствовать о том, что в ферменте каталитические центры расположены близко один к другому, и D-Ara-1-P из киназного центра сразу попадает в пирофосфорилазный. Поэтому, для того чтобы «внешний» арабинозо-фосфат достиг пирофосфорилазного активного центра, потребовалось добавление его значительных количеств, что и отразилось на значении Кт.

Значения Кт для реакции с L-Fuc оказались на два порядка ниже, чем для реакции с D-Ara, что свидетельствует о значительно большем предпочтении обоими ферментами фукозы. Интересно, что на сегодняшний день на клеточной поверхности лейшманий не обнаружено Fuc-еодержащих гликоконъюгатов. Однако, из кинетических данных становится очевидно, что L. major обладает эффективным биосинтетическим аппаратом для активации L-Fuc. Можно предположить, что L. major экспрессирует Fuc-еодержащие гликолипиды на определенных стадиях жизненного цикла,

например, находясь в организме человека. В клетках млекопитающих находится много Fuc-содержащих гликоконъюгатов, поэтому теоретически, Leishmania может получать L-Fuc из окружающей среды и, обладая ферментами для ее активации, включать в гликолипиды клеточной поверхности, что позволило бы паразиту имитировать глико-паттерн хозяйских клеток.

AFKP80 - основной фермент, синтезирующий GDP-[3H1D-Ara в цитозоле Leishmania. Для исследования биологической роли FKP40 и AFKP80 использовали нокаутные мутанты по гену каждого из ферментов: L. major fcp40(-) и L. major afkp80(-). (Генно-инженерные работы по нокаутированию генов были выполнены Н. Guo в лаборатории молекулярной микробиологии Вашингтонского Университета) Каждый ген был замещен генно-инженерной конструкцией, кодирующей антибиотики, которые использовали в качестве селективных маркеров. Так как Leishmania имеет диплоидный геном, было произведено по два раунда замены каждого гена, чтобы удалить обе аллели генов lmjF16.0440 и ImjFl 6.0480. В результате были получены гомозиготные нокаутные линии L. major, способные синтезировать только один из двух исследуемых ферментов: FKP40 в случае с afkp80(-), и AFKP80 в случае с fkp40(-).

Чтобы оценить уровень синтеза GDP-D-Ara каждым из ферментов в отдельности, из клеток L. major дикого типа, fkp40(-) и ajkp80(-) с помощью ультрацентрифугирования получали цитозольные фракции, добавляли к ним [3H]D-Ara и сравнивали количество GDP-[3H]D-Ara, синтезированного ферментами цитозоля (Рисунок 6).

20 000

с L. major

Р? дикий тип

U 15 000 я

U

<

¡Е 10 000

I

Q

®Г 5 000 С

и

L. major ßp40(->

L. major qfkpXO(-)

Рисунок 6. Изучение способности нокаутных мутантов L. majorfkp40(-) и ajkp80(-) синтезировать GDP-D-Ara. Фракции цитозоля из клеток L. major дикого типа, Jkp40(-) и aflcp80(-) инкубировали с 3H]D-Ara и оценивали количество GDP-[3H]D-Ara, синтезированного FKP40 или AFKP80.

Количество GDP-[3H]D-Ara, синтезированного в L. major дикого типа и fkp40(~), было практически одинаковым, в то время как в цитозоле afkp80(-) почти не происходило процесса активации D-Ara. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что AFKP80 является главным ферментом L. major, ответственным за синтез GDP-Ara.

Роль FKP40 и AFKP80 в арабинозилировании боковых цепей липофосфогликана (LPG) L. major. Чтобы проанализировать углеводный состав боковых цепей LPG, образцы LPG L. majorfkp40(-) и afkp80(-), меченных [3H]D-Ara, были подвергнуты мягкому кислотному гидролизу и проанализированы с помощью электрофореза (Рисунок 7).

А

-P-Gal-Man-P-Gal-Man-P-Gal-Man-P-

Gal

I

Ära

Gal Gal

Кислотный гидролиз

I. major I.* major L major

дикого типа aßipSOf-) ßip4tl(~)

Стандарты про мета про «ста иро мета

Рисунок 7. Анализ углеводного состава боковых цепей липофосфогликана (LPG) L. major.

(A) Схема получения олигосахаридных фрагментов. Стрелки на схеме указывают на места разрыва связей в результате кислотного гидролиза.

(B) Электрофоретический анализ олигосахаридных фрагментов LPG промастигот L. major дикого типа, ajkp80(-) и jkp40(-) на проциклической (про) и метациклической (мета) стадиях. Структуры фрагментов LPG, соответствующие каждой полоске, показаны справа. Фрагменты, имеющие D-Ara, идентифицировали по тритиевой метке (соответствующие им полоски на геле отмечены звездочками). В качестве стандартов мол.веса использовали олигомеры глюкозы длиной от двух до семи остатков.

Как и ожидалось, LPG проциклических промастигот у всех проанализированных линий L. major не имеет D-Ara в боковых цепях. Когда клетки L. major дикого типа переходили в метациклическую стадию, на LPG появлялись боковые цепи, терминированные D-Ara. Точно так же вели себя клетки L. major fkp40(-), лишенные фермента FKP40. В отличие от них, метациклические промастиготы L. major afkp80(-) не отличались от проциклических промастигот L. major и не синтезировали арабинозосодержащего LPG.

Количество арабинозилированых боковых цепей LPG у метациклических промастигот L. major в отсутствие AFKP80 снижается (см. таблицу 4) почти в пять раз по сравнению с диким типом, а именно с 29% D-Ага-содержащих боковых цепей LPG у дикого типа до 6% у L. major afkp80(-). В отличие от ajkp80(-), клетки L. major, лишенные FKP40, синтезировали почти такое же количество Ага-содержащего LPG, как и L. major дикого типа (соответственно 27% и 29% боковых цепей LPG L. major flcp40(-) и дикого типа были терминированы D-Ara).

Таблица 4. Сравнение олигосахаридного состава LPG метациклических промастигот L. major дикого типа, afkp80(-) и jkp40(-). Приведено содержание фрагментов LPG по отношению к суммарному количеству олигосахаридов, полученных в результате кислотного гидролиза LPG.

Фрагменты липофосфогликана Дикий тип мета afkp80(-) мета fkp40(-) мета

Gal-Man 17% 31% 17%

Gal-Gal-Man 37% 42% 38%

Gal-Gal-Gal-Man 17% 21% 18%

Ara-Gal-Gal-Man 17% 4% 19%

Ara-Gal-Gal-Gal-Man 12% 2% 8%

Из представленных данных следует, что арабинозилирование боковых цепей LPG L. major fkp40(-) на разных стадиях жизненного цикла не отличается от аналогичного процесса у L. major дикого типа. Напротив, промастиготы с генотипом afkp80(-) и, следовательно, не имеющие фермента AFKP80, практически лишены Ага-содержащих фрагментов боковых цепей LPG даже на метациклической стадии жизненного цикла. Таким образом, AFKP80 является главным ферментом у L. major, ответственным за активацию D-Ara до GDP-Ara, необходимой для арабинозилирования боковых цепей LPG Leishmania.

Транспорт GDP-D-Ara в аппарат Гольджи Leishmania. В большинстве случаев, активированные формы углеводов синтезируются в цитоплазме и затем переносятся в люмен аппарата Гольджи, где они утилизируются соответствующими гликозилтрансферазами в реакциях гликозилирования. Ранее было показано существование в аппарате Гольджи Leishmania мультиспецифичного белка-транспортера LPG2, способного, помимо GDP-Man, переносить также GDP-D-Ara и GDP-L-Fuc.

Чтобы доказать, что LPG2 является единственным транспортером, ответственным за перенос GDP-D-Ara в аппарат Гольджи, клетки L.major дикого типа и нокаутные по гену lpg2 (L.major lpg2(-)) растили в присутствии [3H]D-Ara, после чего измеряли количество [3H]D-Ara, включенной в гликоконъюгаты клеточной поверхности (Рисунок 8).

£ о.

L major дикий тип

X

I

а el а

с

L.major дикий тип

[..major Ы2(-)

L.major

Ш(-)

LPG

Gl PL«

Рисунок 8. Идентификация белка, ответственного за перенос GDP-D-Ara в аппарат Гольджи. Культуры паразита L.major дикого типа и нокаутного по гену lpg2 (L. major lpg2(-)) были метаболитически мечены [3H]-D-Ara. LPG и GIPL клеточной поверхности меченых клеток были экстрагированы, и измерено количество включенной в каждую фракцию [3H]-D-Ara. Нокаутирование гена lpg2, кодирующего мультиспецифичный белок-транспортер LPG2, предотвращало включение D-Ara в состав фосфогликанов клеточной поверхости L. major.

Из приведенных данных видно, что у клеток L. major, нокаутных по гену lpg2, не происходит включения [3H]D-Ara. Отсутствие D-Ara в LPG L. major Ipg2(-) вполне объяснимо, так как потеря LPG2 приводит к прекращению транспорта GDP-Man в аппарат Гольджи, и, соответственно, прекращению синтеза углеводной части молекулы. Таким образом, даже при наличии GDP-Ara, транспортируемой в люмен Гольджи другим белком, у арабинозил-

трансфераз нет акцепторных сайтов для переноса D-Ara на LPG. Этого нельзя сказать о гликозилинозитолфосфолипидах (GIPL), гликозилирование которых происходит по другому биосинтетическому пути, а именно с использованием долихол-фосфат-маннозы в качестве донора. Отсутствие D-Ara в составе GIPL L. major lpg2(-) можно объяснить только прекращением транспорта GDP-Ara в аппарат Гольджи в клетках, лишенных гена Ipg2. Таким образом, синтезируемый в цитоплазме GDP-D-Ara транспортируется в люмен аппарата Гольджи мультифункциональным белком-переносчиком LPG2.

Контроль арабинозилирования липофосфогликана проциклических и метациклических промастигот. У метациклических промастигот L. major количество арабинозилированого LPG в несколько десятков раз больше, чем у проциклических. Очевидно, что паразиту необходимо контролировать процесс арабинозилирования на протяжении своего жизненного цикла. В нашей работе мы попытались ответить на вопрос: как Leishmania осуществляет этот контроль и что является "пусковым механизмом" для резкого увеличения арабинозилирования LPG на метациклической стадии.

Известно, что GDP-D-Ara синтезируется в цитозоле бифункциональным ферментом AFKP80, после чего переносится белком-транспортером LPG2 в аппарат Гольджи. В люмене аппарата Гольджи две D-Ага-трансферазы SCA1 и SCA2 переносят D-Ara от GDP-D-Ara на боковые цепи LPG. Предположительно, любая из этих стадий может служить регулятором процесса арабинозилирования, однако, существующие данные* показывают, что это не так. Уровень активности ферментов SCA1, SCA2, а также AFKP80, измеренный у клеток Leishmania в проциклической стадии был таким же или даже более высоким, чем у клеток в метациклической стадии. Также, проциклические промастиготы L. donovani имели больше мРНК LPG2, чем метациклические. В клеточных линиях L. major, несущих дополнительные плазмиды с генами LPG2, AFKP80 и SCAI/2 и позволяющих им активно экспрессировать эти белки, не обнаруживалось повышенного количества D-Ага-содержащего LPG**. Все вместе эти данные позволяют заключить, что стадии синтеза GDP-D-Ara, транспорта GDP-D-Ara в аппарат Гольджи и переноса D-Ara на боковые цепи LPG не являются регуляторами процесса арабинозилирования. Единственной неизученной стадией остается синтез самой D-Ara. Хорошо известно, что Leishmania способна синтезировать D-Ara из D-Glc, отщепляя от Glc С1-фрагмент, однако ферменты, участвующие в этом процессе, не изучены. Также паразит способен поглощать D-Ara из окружающей среды. Учитывая этот факт, мы попытались понять, как количество D-Ara в цитозоле клеток Leishmania влияет на арабинозилирование LPG.

*Dobson D.E. et al. // J Biol Chem. 278:15523-31 (2003); Ma D. et al // J Biol Cliem. 272:3799805 (1997); Descoteaux A. // Science. 269:1869-1872 (1995).

** Guo H., неопубликованные данные.

Для этого, культуры проциклических промастигот L. major растили в присутствии D-Ara, концентрация которой варьировалась от 0.005 мМ до 0.5 мМ. Из клеток выделяли LPG и анализировали его моносахаридный состав (Рисунок 9). В норме (когда концентрация D-Ara равна нулю) проциклические промастиготы L. major не арабинозилируют LPG. Однако, когда в среде и, соответственно в клетке, появлялась свободная D-Ara, даже в небольшой концентрации 0.005 мМ, в составе LPG появлялась арабиноза, т.е. проциклические промастиготы вели себя как метациклические.

Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что наличие D-Ara в цитоплазме запускает каскад реакций, ведущих к арабинозилированию LPG. Окончательный ответ на вопрос, как осуществляется контроль арабинозилирования LPG, может быть получен после изучения ферментов, синтезирующих D-Ara, однако представленные данные говорят о том, что стадия синтеза D-Ara контролирует стадию синтеза Ага-содержащего LPG.

60

1 50

± 40 "я

+ 30 «

I 20

Я

1 10

о

о

Рисунок 9. Зависимость арабинозилирования боковых цепей липофосфогликана L. major от количества D-Ara в окружающей среде. LPG выделяли из проциклических промастигот L. major, выращенных в питательной среде с разным содержанием D-Ara (от 0 до 0.5 мМ), гидролизовали 2 N ТФУ и полученные моносахариды разделяли с помощью ВЭЖХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные в рамках диссертационной работы исследования позволили охарактеризовать биосинтез D-Ara у паразитического простейшего Leishmania major на этапе синтеза GDP-D-Ara - донора для реакций гликозилирования. Это расширяет знания о биосинтезе редко встречающихся в природе гликоконъюгатов - производных D-арабинопиранозы, а также, о структуре и особенностях работы бифункциональных киназ-пирофосфорилаз, что может быть использовано при дальнейшем изучении этого семейства ферментов.

выводы

1. Ген ImjFl6.0480 паразитического простейшего L. major кодирует бифункциональную арабинокиназу/пирофосфорилазу, способную активировать D-Ara до GDP-D-Ara через промежуточный Ara-1-P в присутствии одновременно АТР и GTP. Продукт другого гена, ImjF16.0440, лишен пирофосфорилазной активности, но способен синтезировать Ara-1-P.

2. Ферменты, кодируемые генами lmjF16.0480 и lmjF16.0440, названные AFKP80 и FKP40, кроме D-Ara могут использовать в качестве субстрата L-Fuc, а именно, синтезировать GDP-L-Fuc в присутствии одновременно АТР и GTP.

3. Киназный домен обоих ферментов L. major расположен на С-конце, а пирофосфорилазный домен формируется при участии последовательностей, расположенных как на N-, так и на С-конце.

4. Белок AFKP80 является главным ферментом L. major, синтезирующим GDP-D-Ara.

5. GDP-D-Ara транспортируется из цитоплазмы в люмен аппарата Гольджи белком-переносчиком LPG2.

6. Синтез свободной D-Ara в цитоплазме запускает и регулирует каскад биосинтетических реакций, ведущих к арабинозилированию боковых цепей липофосфогликана Leishmania.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи

Новожилова Н. М., Бовин Н. В. Метаболизм D-арабинозы: характеристика бифункциональной арабинокиназы/пирофосфорилазы Leishmania major. Acta Naturae (2009) 2: 6-8.

Новожилова H. М., Бовин Н. В. Структура, функции и биосинтез гликоконъюгатов клеточной поверхности Leishmania spp. Биохимия (2010) 75 (6): 770-780

Тезисы докладов на конференциях

1. Novozhilova N.M, Bovin N.V, Beverley S.M, Turco SJ. Characterization of D-Arabinopyranose-containing Glycosylinositolphospholipids from Leishmania major. "Annual Conference of the Society for Glycobiology", Abstract 221, Лос-Анжелес, США, 2006

2. Novozhilova N.M, Capul A.A, Beverley S.M, Turco SJ. Incorporation of D-Arabinopyranose into Leishmania major Glycoconjugates Requires Golgi Nucleotide-sugar Transport Activity."Annual Conference of the Society for Glycobiology", Abstract 123, Бостон, США, 2007

3. Novozhilova N.M, Guo H, Beverley S.M, Turco SJ. Characterization of a Bi-functional Enzymes from Leishmania major involved in Activation of GDP- D-Arabinopyranose. "Annual Conference of the Society for Glycobiology", Abstract 264, Даллас, США, 2008

4. Guo H, Novozhilova N.M, Bandini G, Notton T, Turco S.J, Ferguson M.A, Beverley S.M. A requirement for GDP-Fucose in Leishmania inferred by rescue of D-arabinopyranose/L-fucose salvage mutants (ajkp80-/Jkp80~) by expression of GDP-L-Fuc de novo pathway enzymes from T. brucei. "Annual Conference of the Society for Glycobiology" Сан-Диего, США, 2009.

5. Новожилова H.M., Гуо X., Турко С., Бовин Н.В. Бифункциональная арабинокиназа/пирофосфорилаза Leishmania major: строение, субстратная специфичность и функции. "XXII Зимняя молодежная научная школа" Москва, Россия, 2010

Автор выражает свою признательность д-ру X. Гуо (Dr. Hongjie Guo, University of Washington, USA) за помощь в идентификации и клонировании генов Leishmania и получении гомозиготных нокаутных линий L. major fkp40(-) и L. major fkp80(-)\ Т. Ноттон (Timothy Notton, University of Washington, USA) за помощь в проведении сайт-направленного мутагенеза гена lmjFl6.0440 и проф. С. Турко (Pr. S. Turco, University of Kentucky, USA) за предоставленную возможность выполнения части экспериментальной работы в его лаборатории.

Заказ № 138-а/09/10 Подписано в печать 20.09.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

000 "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 ((>)) \v\vw. с/г. ги; е-таИ:т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Новожилова, Наталья Михайловна

Список использованных сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Лейшманиоз

2.1.1. Переносчики и хозяева

2.1.2. Исторические факты

2.1.3. Виды лейшманиоза

2.1.4. Диагностика и лечение

2.1.5. Вакцины

2.2. Leishmania spp

2.2.1. Жизненный цикл Leishmania

2.2.2. Метациклогенез

2.2.3. Leishmania в искусственной среде

2.3. Гликоконъюгаты клеточной поверхности Leishmania

2.3.1. Липофосфогликан

2.3.1.1. Структура липофосфогликана

2.3.1.2. Липофосфогликан на разных стадиях жизненного цикла Leishmania

2.3.1.3. Функции липофосфогликана

2.3.1.4. Липофосфогликан амастигот Leishmania.

2.3.2. Гликозилинозитолфосфолипиды

2.3.2.1. Строение GIPL

2.3.2.2. Функции GIPL

2.3.3. GP

2.3.4. Протеофосфогликаны

2.4. Биосинтез фосфогликанов Leishmania

2.4.1. Биосинтез GPI-якоря

2.4.2. Биосинтез повторяющихся звеньев липофосфогликана

2.4.3. Модификации боковых цепей липофосфогликана

2.4.4. Биосинтез GIPL

2.5. D-арабинопираноза

2.5.1. Природные арабиносодержащие гликоконъюгаты.

2.5.2. Биосинтез D-арабинопиранозы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Идентификация и характеристика арабинокиназыпирофосфорилазы L. major

4.1.1. Идентификация бифункциональной арабинокиназыпирофосфорилазы в геноме L. major

4.1.2. Тестирование ферментативной активности белков, ^ кодируемых генами lmjF16.0440 и ImjF16.

4.1.3. Сравнение гомологичных ферментов из различных организмов

4.1.4. АТР и GTP необходимы для активности FKP40 и AFKP

4.1.5. Изучение киназных и пирофосфорилазных доменов FKP и AFKP80 методом сайт-направленного мутагенеза

4.1.6. Определение кинетических параметров для FKP40 и AFKP

4.1.7. Фукозо-содержащие гликоконъюгаты L. major

4.2. Биологическая роль FKP40 и AFKP80 в арабинозилировании ^ фосфогликанов клеточной поверхности L. major

4.2.1. Гомозиготные нокаутные мутанты L. major по генам FKP40 и AFKP

4.2.2. AFKP80 — основной фермент, синтезирующий GDP-[ H]D- ^ Ага в цитозоле Leishmania

4.2.3. В отсутствие AFKP80 снижается арабинозилирование ^ фосфогликанов клеточной поверхности L. major

4.2.4. Нокаутирование генов lmjF16.480 и lmjF16.0440 не влияет на синтез повторяющихся звеньев липофосфогликана

L. major

4.2.5. Роль FKP40 и AFKP80 в арабинозилировании боковых ^ цепей липофосфогликана L. major

4.3. Транспорт GDP-D-Ага в аппарат Гольджи Leishmania

4.4. Контроль арабинозилирования липофосфогликана ^ проциклических и метациклических промастигот

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Новожилова, Наталья Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Ген ImjFl6.0480 паразитического простейшего L.major кодирует бифункциональную арабинокиназу/пирофосфорилазу, способную активировать D-Ara до GDP-D-Ara через промежуточный Ara-1-P в присутствии одновременно АТР и GTP. Продукт другого гена, lmjF16.0440, лишен пирофосфорилазной активности, но способен синтезировать Ara-1-P.

2. Ферменты, кодируемые генами ImjF16.0480 и ImjFl6.0440, названные AFKP80 и FKP40, кроме D-Ara могут использовать в качестве субстрата L-Fuc, а именно, синтезировать GDP-L-Fuc в присутствии одновременно АТР и GTP.

3. Киназный домен обоих ферментов L.major расположен на С-конце, а пирофосфорилазный домен формируется при участии последовательностей, расположенных как на N-, так и на С-конце.

4. Белок AFKP80 является главным ферментом L.major, синтезирующим GDP-D-Ara.

5. GDP-D-Ara транспортируется из цитоплазмы в люмен аппарата Гольджи белком-переносчиком LPG2.

6. Синтез свободной D-Ara в цитоплазме запускает и регулирует каскад биосинтетических реакций, ведущих к арабинозилированию боковых цепей липофосфогликана Leishmania.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает свою признательность X. Гуо (Dr. Hongjie Guo, University of Washington, USA) за помощь в идентификации и клонировании генов Leishmania и получении гомозиготных нокаутных линий L. major fkp40(~) и L. major jkp80(-)\ JI. Комсток (Dr. Laurie Comstock, Harvard Medical School, USA) за предоставление плазмид, содержащих клонированные гены Bacteroides fragilis и Arabidopsis thaliana; Т. Ноттон (Timothy Notton, University of Washington, USA) за помощь в проведении сайт-направленного мутагенеза гена lmjF16.0440\ Т. Баррон (Tamara Barron, University of Kentucky, USA), С. Турко (Prof. Salvatore Turco, University of Kentucky, USA) и С. Беверли (Prof. Stephen Beverley, University of Washington, USA) за помощь в обсуждении результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили охарактеризовать биосинтез D-арабинозы у паразитического простейшего Leishmania major на этапе синтеза GDP-D-Ara - донора для реакций гликозилирования. В геноме L. major были обнаружены два гена, отличающиеся по трем а.к. остаткам, один из которых {ImjF 16.0480), кодирует бифункциональную арабинокиназу-пирофосфорилазу, способную активировать D-Ara до GDP-D-Ara через промежуточный Ara-1-P в присутствии АТР и GTP. Продукт второго гена (lmjF 16.0440), не обладал пирофосфорилазной активностью и синтезировал только Ara-1-P. При этом оба фермента, AFKP80 (Arabino/FucoKinase/Pyrophosphorylase) и FKP40 (FucoKinase-Pyrophosphorylase) соответственно, обладали бифункциональной активностью со структурным гомологом D-арабинозы, L-фукозой, т.е. синтезировали GDP-L-Fuc из L-Fuc в присутствии АТР и GTP. Методом сайт-направленного мутагенеза было установлено, что киназный домен ферментов L. major расположен на С-конце, а пирофосфорилазный домен разобщен на полипетидной цепи и образуется при участии последовательностей, расположенных как на N-, так и на С-конце. Измерение кинетических параметров позволило предположить, что оба активных центра бифункциональных ферментов связаны между собой и действуют взаимозависимо, обеспечивая максимальную каталитическую активность белков. Установлено, что AFKP80 является главным ферментом, синтезирующим GDP-D-Ara в цитоплазме L. major. Нокаутирование соответствующего гена (ImjF 16.0480) приводило к прекращению арабинозилирования боковых цепей липофосфогликана клеточной поверхности Leishmania. Цитоплазматический GDP-D-Ara должен попасть в аппарат Гольджи, где происходят реакции гликозилирования. В данной работе показано, что у L. major транспорт GDP-D-Ara в аппарат Гольджи осуществляется белком переносчиком LPG2.

Таким образом, проведенное в рамках диссертационной работы исследование расширяет знания о биосинтезе редко встречающихся гликоконъюгатов - производных D-арабинопиранозы, а также, о структуре и особенностях функционирования бифункциональных киназ-пирофосфорилаз, что может быть использовано при дальнейшем изучении этого семейства ферментов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Новожилова, Наталья Михайловна, Москва

1. Aebischer Т., Moody S.F. and Handman E. Persistence of virulent Leishmania major in murine cutaneous leishmaniasis: a possible hazard for the host. // Infect Immun. 61:220-6 (1993).

2. Ahmed S.B., Bahloul C., Robbana C., Askri S. and Dellagi K. A comparative evaluation of different DNA vaccine candidates against experimental murine leishmaniasis due to L. major. // Vaccine. 22:1631-9 (2004).

3. Ashford R.W., Kohestany K.A. and Karimzad M.A. Cutaneous leishmaniasis in Kabul: observations on a 'prolonged epidemic'. // Ann Trop Med Parasitol. 86:361-71 (1992).

4. Banulus A.L., Hide M. and Prugnolle F. 1971. Leishmania and Leishmaniasis: A Parasite Genetic Update and Advances in Taxonomy, Epidemiology and Pathogenicity in Humans. In Advances in Parasitology Ed. R.M. J.R. Baker, D. Rollinson. Academic Press.

5. Bennett J. Editorial response: choosing amphotericin В formulations-between a rock and a hard place. // Clin Infect Dis. 31:1164-5 (2000).

6. Berman J.D. Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 years. // Clin Infect Dis. 24:684-703 (1997).

7. Berman J.D., Gallalee J.V. and Best J.M. Sodium stibogluconate (Pentostam) inhibition of glucose catabolism via the glycolytic pathway, and fatty acid beta-oxidation in Leishmania mexicana amastigotes. // Biochem Pharmacol. 36:197-201 (1987).

8. Berman J.D., Waddell D. and Hanson B.D. Biochemical mechanisms of the antileishmanial activity of sodium stibogluconate. // Antimicrob Agents Chemother. 27:916-20(1985).

9. Brajtburg J. and Bolard J. Carrier effects on biological activity of amphotericin B. // Clin Microbiol Rev. 9:512-31 (1996).

10. Brennan P.J. and Nikaido H. The envelope of mycobacteria. // Annu Rev Biochem. 64:2963 (1995).

11. Brittingham A., Chen G., McGwire B.S., Chang K.P. and Mosser D.M. Interaction of Leishmania gp63 with cellular receptors for fibronectin. // Infect Immun. 67:4477-84 (1999).

12. Buckner F.S. and Wilson A.J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. // Am J Trop Med Hyg. 72:600-5 (2005).

13. Capul A.A., Barron Т., Dobson D.E., Turco S.J. and Beverley S.M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. // J Biol Chem. 282:14006-17 (2007).

14. Chakraborty A.K. and Majumder H.K. Mode of action of pentavalent antimonials: specific inhibition of type I DNA topoisomerase of Leishmania donovani. // Biochem Biophys Res Commun. 152:605-11 (1988).

15. Cook G.C. Leishmaniasis: some recent developments in chemotherapy. // J Antimicrob Chemother. 31:327-30 (1993).

16. Cox F.E. History of human parasitology. // Clin Microbiol Rev. 15:595-612 (2002).

17. Coyne M.J., Reinap В., Lee M.M. and Comstock L.E. Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation. // Science. 307:1778-81 (2005).

18. Croft S.L., Davidson R.N. and Thornton E.A. Liposomal amphotericin В in the treatment of visceral leishmaniasis. // J Antimicrob Chemother. 28 Suppl В: 111-8 (1991).

19. Denton H., McGregor J.C. and Coombs G.H. Reduction of anti-leishmanial pentavalent antimonial drugs by a parasite-specific thiol-dependent reductase, TDR1. // Biochem J. 381:405-12(2004).

20. Dermine J.F., Scianimanico S., Prive C., Descoteaux A. and Desjardins M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. // Cell Microbiol. 2:115-26 (2000).

21. Descoteaux A. A specialized pathway affecting virulence glycoconjugates of Leishmania. // Science. 269:1869-1872 (1995).

22. Descoteaux A. and Turco S.J. Glycoconjugates in Leishmania infectivity. // Biochim BiophysActa. 1455:341-52 (1999).

23. Desjardins M. and Descoteaux A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. // J Exp Med. 185:2061-8 (1997).

24. Desjeux P. Leishmaniasis. Public health aspects and control. // Clin Dermatol. 14:417-23 (1996).

25. Dever Т.Е., Glynias M.J. and Merrick W.C. GTP-binding domain: three consensus sequence elements with distinct spacing. // Proc Natl Acad Sci USA. 84:1814-8 (1987).

26. Ellis D. Amphotericin B: spectrum and resistance. // J Antimicrob Chemother. 49 Suppl 1:7-10 (2002).

27. Ferguson M.A. Colworth Medal Lecture. Glycosyl-phosphatidylinositol membrane anchors: the tale of a tail. // Biochem Soc Trans. 20:243-56 (1992).

28. Ferguson M.A. The structure, biosynthesis and functions of glycosylphosphatidylinositol anchors, and the contributions of trypanosome research. // J Cell Sci. 112 ( Pt 17):2799-809 (1999).

29. Flohe S.B., Bauer C., Flohe S. and Moll H. Antigen-pulsed epidermal Langerhans cells protect susceptible mice from infection with the intracellular parasite Leishmania major. // Eur J Immunol. 28:3800-11 (1998).

30. Franke E.D., McGreevy P.B., Katz S.P. and Sacks D.L. Growth cycle-dependent generation of complement-resistant Leishmania promastigotes. // J Immunol. 134:2713-8 (1985).

31. Funk V.A., Thomas-Oates J.E., Kielland S.L., Bates P.A. and Olafson R.W. A unique, terminally glucosylated oligosaccharide is a common feature on Leishmania cell surfaces. // Mol Biochem Parasitol. 84:33-48 (1997).

32. Gantt K.R., Goldman T.L., McCormick M.L., Miller M.A., Jeronimo S.M., Nascimento E.T., Britigan B.E. and Wilson M.E. Oxidative responses of human and murine macrophages during phagocytosis of Leishmania chagasi. // J Immunol. 167:893-901 (2001).

33. Glaser T.A., Moody S.F., Handman E., Bacic A. and Spithill T.W. An antigenically distinct lipophosphoglycan on amastigotes of Leishmania major. // Mol Biochem Parasitol. 45:337-44(1991).

34. Goswami M., Dobson D.E., Beverley S.M. and Turco S.J. Demonstration by heterologous expression that the Leishmania SCA1 gene encodes an arabinopyranosyltransferase. // Glycobiology. 16:230-6 (2006).

35. Green P.J., Feizi Т., Stoll M.S., Thiel S., Prescott A. and McConville M.J. Recognition of the major cell surface glycoconjugates of Leishmania parasites by the human serum mannan-binding protein. // Mol Biochem Parasitol. 66:319-28 (1994).

36. Ha D.S., Schwarz J.K., Turco S.J. and Beverley S.M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. // Mol Biochem Parasitol. 77:57-64 (1996).

37. Hanks S.K., Quinn A.M. and Hunter T. The protein kinase family: conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. // Science. 241:42-52 (1988).

38. Harms G. 2003. Лейшманиоз. In Инфекционная дерматология Ed. P.A.M. W. Blackwell Verlag, Berlin, Wien, pp 521-530.

39. Holm A., Tejle K., Gunnarsson Т., Magnusson K.E., Descoteaux A. and Rasmusson B. Role of protein kinase С alpha for uptake of unopsonized prey and phagosomal maturation in macrophages. // Biochem Biophys Res Commun. 302:653-8 (2003).

40. Hong К M.D., Beverley SM, Turco SJ. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous,, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. // Biochemistry. 39:2013-2022 (2000).

41. Ilg T. Proteophosphoglycans of Leishmania. // Parasitol Today. 16:489-97 (2000).

42. Ilg T. Lipophosphoglycan of the protozoan parasite Leishmania: stage- and species-specific importance for colonization of the sandfly vector, transmission and virulence to mammals. // Med Microbiol Immunol. 190:13-7 (2001).

43. Ilg Т., Etges R., Overath P., McConville M.J., Thomas-Oates J., Thomas J., Homans S.W. and Ferguson M.A. Structure of Leishmania mexicana lipophosphoglycan. // J Biol Chem. 267:6834-40 (1992).

44. Ilg Т., Stierhof Y.D., Craik D., Simpson R., Handman E. and Bacic A. Purification and structural characterization of a filamentous, mucin-like proteophosphoglycan secreted by Leishmania parasites. // J Biol Chem. 271:21583-96 (1996).

45. Ilg Т., Stierhof Y.D., Wiese M., McConville M.J. and Overath P. Characterization of phosphoglycan-containing secretory products of Leishmania. // Parasitology. 108 Suppl:S63-71 (1994).

46. Ilgoutz S.C., Mullin K.A., Southwell B.R. and McConville M.J. Glycosylphosphatidylinositol biosynthetic enzymes are localized to a stable tubular subcompartment of the endoplasmic reticulum in Leishmania mexicana. // EMBO J. 18:3643-54 (1999a).

47. Ilgoutz S.C., Zawadzki J.L., Ralton J.E. and McConville M.J. Evidence that free GPI glycolipids are essential for growth of Leishmania mexicana. // EMBO J. 18:2746-55 (1999b).

48. Irwin M. and Leaver A. Use of the orcinol-sulphuric acid reaction in the positive identification of certain monosaccharides from a salivary mucoid. // Nature. 177:1126 (1956).

49. Ishihara H., Massaro D.J. and Heath E.C. The metabolism of L-fucose. 3. The enzymatic synthesis of beta-L-fiicose 1-phosphate. // J Biol Chem. 243:1103-9 (1968).

50. Jha Т.К. Evaluation of diamidine compound (pentamidine isethionate) in the treatment resistant cases of kala-azar occurring in North Bihar, India. // Trans R Soc Trop Med Hyg. 77:167-70(1983).

51. Joshi P.B., Kelly B.L., Kamhawi S., Sacks D.L. and McMaster W.R. Targeted gene deletion in Leishmania major identifies leishmanolysin (GP63) as a virulence factor. // Mol Biochem Parasitol. 120:33-40 (2002).

52. Joshi P.B., Sacks D.L., Modi G. and McMaster W.R. Targeted gene deletion of Leishmania major genes encoding developmental stage-specific leishmanolysin (GP63). // Mol Microbiol. 27:519-30 (1998).

53. Kamhawi S., Ramalho-Ortigao M., Pham V.M., Kumar S., Lawyer P.G., Turco S.J., Barillas-Mury C., Sacks D.L. and Valenzuela J.G. A role for insect galectins in parasite survival.//Cell. 119:329-41 (2004).

54. Kayser O., Olbrich C., Croft S.L. and Kiderlen A.F. Formulation and biopharmaceutical issues in the development of drug delivery systems for antiparasitic drugs. // Parasitol Res. 90 Suppl 2:S63-70 (2003).

55. Khamesipour A., Dowlati Y., Asilian A., Hashemi-Fesharki R., Javadi A., Noazin S. and Modabber F. Leishmanization: use of an old method for evaluation of candidate vaccines against leishmaniasis. // Vaccine. 23:3642-8 (2005).

56. Killick-Kendrick R. Some epidemiological consequences of the evolutionary fit between Leishmaniae and their phlebotomine vectors. // Bull Soc Pathol Exot Filiales. 78:747-55 (1985).

57. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of the leishmaniases: a review. // Med Vet Entomol. 4:1-24 (1990).

58. Kotake Т., Hojo S., Tajima N., Matsuoka K., Koyama T. and Tsumuraya Y. A bifUnctional enzyme with L-fucokinase and GDP-L-fucose pyrophosphorylase activities salvages free L-fucose in Arabidopsis. // J Biol Chem. 283:8125-35 (2008).

59. Larabi M., Pages N., Pons F., Appel M., Gulik A., Schlatter J., Bouvet S. and Barratt G. Study of the toxicity of a new lipid complex formulation of amphotericin B. // J Antimicrob Chemother. 53:81-8 (2004).

60. Lawyer P.G., Ngumbi P.M., Anjili C.O., Odongo S.O., Mebrahtu Y.B., Githure J.I., Koech

61. D.K. and Roberts C.R. Development of Leishmania major in Phlebotomus duboscqi and Sergentomyia schwetzi (Diptera: Psychodidae). // Am J Trop Med Hyg. 43:31-43 (1990).

62. Legare D., Papadopoulou В., Roy G., Mukhopadhyay R., Haimeur A., Dey S., Grondin K., Brochu C., Rosen B.P. and Ouellette M. Efflux systems and increased trypanothione levels in arsenite-resistant Leishmania. // Exp Parasitol. 87:275-82 (1997).

63. Lessa M.M., Lessa H.A., Castro T.W., Oliveira A., Scherifer A., Machado P. and Carvalho

64. E.M. Mucosal leishmaniasis: epidemiological and clinical aspects. // Braz J Otorhinolaryngol. 73:843-7 (2007).

65. Lillico S., Field M.C., Blundell P., Coombs G.H. and Mottram J.C. Essential roles for GPI-anchored proteins in African trypanosomes revealed using mutants deficient in GPI8. // Mol Biol Cell. 14:1182-94 (2003).

66. Lo H., Tang C. and Exley R. Mechanisms of avoidance of host immunity by Neisseria meningitidis and its effect on vaccine development. // Lancet Infect Dis. 9:418-427 (2009).

67. Lovelace J.K., Dwyer D.M. and Gottlieb M. Purification and characterization of the extracellular acid phosphatase of Leishmania donovani. // Mol Biochem Parasitol. 20:24351 (1986).

68. Lucumi A., Robledo S., Gama V. and Saravia N.G. Sensitivity of Leishmania viannia panamensis to pentavalent antimony is correlated with the formation of cleavable DNA-protein complexes. // Antimicrob Agents Chemother. 42:1990-5 (1998).

69. Ma D., Russell D.G., Beverley S.M. and Turco S.J. Golgi GDP-mannose uptake requires Leishmania LPG2. A member of a eukaryotic family of putative nucleotide-sugar transporters. // J Biol Chem. 272:3799-805 (1997).

70. Mauel J. Vaccination against Leishmania infections. // Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2:201-26 (2002).

71. McConville M.J. Glycosylated-phosphatidylinositols as virulence factors in Leishmania. // Cell Biol Int Rep. 15:779-98 (1991).

72. McConville MJ B.A. A family of glycoinositol phospholipids from Leishmania major. Isolation, characterization, and antigenicity. // J Biol Chem. 264:757-766 (1989).

73. McConville M.J. and Blackwell J.M. Developmental changes in the glycosylated phosphatidylinositols of Leishmania donovani. Characterization of the promastigote and amastigote glycolipids. // J Biol Chem. 266:15170-9 (1991).

74. McConville M.J. and Ferguson M.A. The structure, biosynthesis and function of glycosylated phosphatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eukaryotes. // Biochem J. 294 (Pt 2):305-24 (1993).

75. McConville M.J., Mullin K.A., Ilgoutz S.C. and Teasdale R.D. Secretory pathway of trypanosomatid parasites. // Microbiol Mol Biol Rev. 66:122-54; table of contents (2002).

76. McConville M.J., Schneider P., Proudfoot L., Masterson C. and Ferguson M.A. The developmental regulation and biosynthesis of GPI-related structures in Leishmania parasites. // Braz J Med Biol Res. 27:139-44 (1994).

77. McConville M.J., Schnur L.F., Jaffe C. and Schneider P. Structure of Leishmania lipophosphoglycan: inter- and intra-specific polymorphism in Old World species. // Biochem J. 310 (Pt 3):807-18 (1995).

78. McConville M.J., Thomas-Oates J.E., Ferguson M.A. and Homans S.W. Structure of the lipophosphoglycan from Leishmania major. // J Biol Chem. 265:19611-23 (1990).

79. McConville M.J., Turco S.J., Ferguson M.A. and Sacks D.L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. // EMBO J. 11:3593-600 (1992).

80. McCoy J.J., Beetham J.K., Ochs D.E., Donelson J.E. and Wilson M.E. Regulatory sequences and a novel gene in the msp (GP63) gene cluster of Leishmania chagasi. // Mol Biochem Parasitol. 95:251-65 (1998).

81. McGwire B.S., Chang K.P. and Engman D.M. Migration through the extracellular matrix by the parasitic protozoan Leishmania is enhanced by surface metalloprotease gp63. // Infect Immun. 71:1008-10 (2003).

82. McNeely T.B., Rosen G., Londner M.V. and Turco S.J. Inhibitory effects on protein kinase С activity by lipophosphoglycan fragments and glycosylphosphatidylinositol antigens of the protozoan parasite Leishmania. // Biochem J. 259:601-4 (1989).

83. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C. and Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. // Annu Rev Biochem. 53:625-63 (1984).

84. Medina-Acosta E., Karess R.E. and Russell D.G. Structurally distinct genes for the surface protease of Leishmania mexicana are developmentally regulated. // Mol Biochem Parasitol. 57:31-45 (1993).

85. Medina-Acosta E., Karess R.E., Schwartz H. and Russell D.G. The promastigote surface protease (gp63) of Leishmania is expressed but differentially processed and localized in the amastigote stage. // Mol Biochem Parasitol. 37:263-73 (1989).

86. Mengeling B.J., Beverley S.M. and Turco S.J. Designing glycoconjugate biosynthesis for an insidious intent: phosphoglycan assembly in Leishmania parasites. // Glycobiology. 7:873-80 (1997).

87. Menon A.K., Mayor S. and Schwarz R.T. Biosynthesis of glycosyl-phosphatidylinositol lipids in Trypanosoma brucei: involvement of mannosyl-phosphoryldolichol as the mannose donor. // EMBO J. 9:4249-58 (1990).

88. Miao L., Stafford A., Nir S., Turco S.J., Flanagan T.D. and Epand R.M. Potent inhibition of viral fusion by the lipophosphoglycan of Leishmania donovani. // Biochemistry. 34:4676-83 (1995).

89. Moller W. and Amons R. Phosphate-binding sequences in nucleotide-binding proteins. // FEBS. 186:2622-2628 (1985).

90. Moody S.F., Handman E., McConville M.J. and Bacic A. The structure of Leishmania major amastigote lipophosphoglycan. // J Biol Chem. 268:18457-66 (1993).

91. Moss J.M., Reid G.E., Mullin K.A., Zawadzki J.L., Simpson R.J. and McConville M.J. Characterization of a novel GDP-mannose:Serine-protein mannose-1-phosphotransferase from Leishmania mexicana. // J Biol Chem. 274:6678-88 (1999).

92. Mottram J.C. and Coombs G.H. Leishmania mexicana: enzyme activities of amastigotes and promastigotes and their inhibition by antimonials and arsenicals. // Exp Parasitol. 59:151-60 (1985).

93. Mukhopadhyay R., Dey S., Xu N., Gage D., Lightbody J., Ouellette M. and Rosen B.P. Trypanothione overproduction and resistance to antimonials and arsenicals in Leishmania. // Proc Natl Acad Sci USA. 93:10383-7 (1996).

94. Murray H.W. Treatment of visceral leishmaniasis (kala-azar): a decade of progress and future approaches. // Int J Infect Dis. 4:158-77 (2000).

95. Neuber H. Leishmaniasis. // J Dtsch Dermatol Ges. 6:754-65 (2008).

96. Okwor I. and Uzonna J. Vaccines and vaccination strategies against human cutaneous leishmaniasis. // Hum Vaccin. 52009).

97. Olliaro P.L. and Bryceson A.D. Practical progress and new drugs for changing patterns of leishmaniasis. // Parasitol Today. 9:323-8 (1993).

98. Orlandi P.A., Jr. and Turco S.J. Structure of the lipid moiety of the Leishmania donovani lipophosphoglycan. // J Biol Chem. 262:10384-91 (1987).

99. Pastuszak I., Ketchum C., Hermanson G., Sjoberg E.J., Drake R. and Elbein A.D. GDP-L-fucose pyrophosphorylase. Purification, cDNA cloning, and properties of the enzyme. // J Biol Chem. 273:30165-74 (1998).

100. Peters C., Kawakami M., Kaul M., Ilg Т., Overath P. and Aebischer T. Secreted proteophosphoglycan of Leishmania mexicana amastigotes activates complement by triggering the mannan binding lectin pathway. // Eur J Immunol. 27:2666-72 (1997a).

101. Peters С., Stierhof Y.D. and Ilg T. Proteophosphoglycan secreted by Leishmania mexicana amastigotes causes vacuole formation in macrophages. // Infect Immun. 65:783-6 (1997b).

102. Piedrafita D., Proudfoot L., Nikolaev A.V., Xu D., Sands W., Feng G.J., Thomas E., Brewer J., Ferguson M.A., Alexander J. and Liew F.Y. Regulation of macrophage IL-12 synthesis by Leishmania phosphoglycans. // Eur J Immunol. 29:235-44 (1999).

103. Pimenta P.F., Turco S.J., McConville M.J., Lawyer P.G., Perkins P.V. and Sacks D.L. Stage-specific adhesion of Leishmania promastigotes to the sandfly midgut. // Science. 256:1812-5 (1992).

104. Ponte-Sucre A., Heise D. and Moll H. Leishmania major lipophosphoglycan modulates the phenotype and inhibits migration of murine Langerhans cells. // Immunology. 104:462-7 (2001).

105. Proudfoot L., O'Donnell C.A. and Liew F.Y. Glycoinositolphospholipids of Leishmania major inhibit nitric oxide synthesis and reduce leishmanicidal activity in murine macrophages. // Eur J Immunol. 25:745-50 (1995).

106. Puentes S.M., Da Silva R.P., Sacks D.L., Hammer C.H. and Joiner K.A. Serum resistance of metacyclic stage Leishmania major promastigotes is due to release of C5b-9. // J Immunol. 145:4311-6(1990).

107. Puentes S.M., Dwyer D.M., Bates P.A. and Joiner K.A. Binding and release of C3 from Leishmania donovani promastigotes during incubation in normal human serum. // J Immunol. 143:3743-9 (1989).

108. Puentes S.M., Sacks D.L., da Silva R.P. and Joiner K.A. Complement binding by two developmental stages of Leishmania major promastigotes varying in expression of a surface lipophosphoglycan. // J Exp Med. 167:887-902 (1988).

109. Pyle R.L. Clinical pharmacology of amphotericin B. // J Am Vet Med Assoc. 179:83-4 (1981).

110. Reithinger R., Brooker S. and Kolaczinski J.H. Visceral leishmaniasis in eastern Africa-current status. // Trans R Soc Trap Med Hyg. 101:1169-70 (2007).

111. Remer K.A., Apetrei C., Schwarz Т., Linden C. and Moll H. Vaccination with plasmacytoid dendritic cells induces protection against infection with Leishmania major in mice. // Eur J Immunol. 37:2463-73 (2007).

112. Ribeiro J.M., Vachereau A., Modi G.B. and Tesh R.B. A novel vasodilatory peptide from the salivary glands of the sand fly Lutzomyia longipalpis. // Science. 243:212-4 (1989).

113. Russell D.G. and Alexander J. Effective immunization against cutaneous leishmaniasis with defined membrane antigens reconstituted into liposomes. // J Immunol. 140:1274-9 (1988).

114. Ryan K.A., Garraway L.A., Descoteaux A., Turco S.J. and Beverley S.M. Isolation of virulence genes directing surface glycosyl-phosphatidylinositol synthesis by functional complementation of Leishmania. // Proc Natl Acad Sci USA. 90:8609-13 (1993).

115. Sacks D. and Sher A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. // Nat Immunol. 3:1041-7 (2002).

116. Sacks D.L., Brodin T.N. and Turco S.J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. // Mol Biochem Parasitol. 42:225-33 (1990).

117. Sacks D.L. and da Silva R.P. The generation of infective stage Leishmania major promastigotes is associated with the cell-surface expression and release of a developmentally regulated glycolipid. // J Immunol. 139:3099-106 (1987).

118. Sacks D.L., Modi G., Rowton E., Spath G., Epstein L., Turco S.J. and Beverley S.M. The role of phosphoglycans in Leishmania-sand fly interactions. // Proc Natl Acad Sci USA. 97:406-11 (2000).

119. Sacks D.L. and Perkins P.V. Development of infective stage Leishmania promastigotes within phlebotomine sand flies. // Am J Trop Med Hyg. 34:456-9 (1985).

120. Schneider P., McConville M.J. and Ferguson M.A. Characterization of GDP-alpha-D-arabinopyranose, the precursor of D-Arap in Leishmania major lipophosphoglycan. // J Biol Chem. 269:18332-7 (1994).

121. Schneider P., Treumann A., Milne K.G., McConville M.J., Zitzmann N. and Ferguson M.A. Structural studies on a lipoarabinogalactan of Crithidia fasciculata. // Biochem J. 313 (Pt 3):963-71 (1996).

122. Schofield L., McConville M.J., Hansen D., Campbell A.S., Fraser-Reid В., Grusby M.J. and Tachado S.D. CDld-restricted immunoglobulin G formation to GPI-anchored antigens mediated by NKT cells. // Science. 283:225-9 (1999).

123. Scott P., Pearce E., Natovitz P. and Sher A. Vaccination against cutaneous leishmaniasis in a murine model. I. Induction of protective immunity with a soluble extract of promastigotes. //J Immunol. 139:221-7 (1987a).

124. Scott P., Pearce E., Natovitz P. and Sher A. Vaccination against cutaneous leishmaniasis in a murine model. II. Immunologic properties of protective and nonprotective subfractions of soluble promastigote extract. // J Immunol. 139:3118-25 (1987b).

125. Shaw J.J. 2002. New world Leishmaniasis: the ecology of Leishmaniasis and the diversity of leishmanial species in Central and South America. In World Class Parasites: Leishmania Ed. F.J. P. Kluwer Academic Publishers.

126. Sieling P.A., Chatteijee D., Porcelli S.A., Prigozy T.I., Mazzaccaro R.J., Soriano Т., Bloom B.R., Brenner M.B., Kronenberg M., Brennan P.J. and et al. CD 1-restricted T cell recognition of microbial lipoglycan antigens. // Science. 269:227-30 (1995).

127. Soares R.P. and Turco S.J. Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae): a review. // An Acad Bras Cienc. 75:301-30 (2003).

128. Spath G.F., Garraway L.A., Turco S.J. and Beverley S.M. The role(s) of lipophosphoglycan (LPG) in the establishment of Leishmania major infections in mammalian hosts. // Proc Natl Acad Sci USA. 100:9536-41 (2003).

129. Spath GF L.L., Segawa H, Sacks DL, Turco SJ, Beverley SM. Persistence without pathology in phosphoglycan-deficient Leishmania major. // Science. 301:1241-1243 (2003).

130. Sundar S. Drug resistance in Indian visceral leishmaniasis. // Trop Med Int Health. 6:84954 (2001).

131. Tachado S.D., Mazhari-Tabrizi R. and Schofield L. Specificity in signal transduction among glycosylphosphatidylinositols of Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi and Leishmania spp. // Parasite Immunol. 21:609-17 (1999).

132. Titus R.G., Gueiros-Filho F.J., de Freitas L.A. and Beverley S.M. Development of a safe live Leishmania vaccine line by gene replacement. // Proc Natl Acad Sci USA. 92:1026771 (1995).

133. Tonetti M., Sturla L., Bisso A., Benatti U. and De Flora A. Synthesis of GDP-L-fucose by the human FX protein. // J Biol Chem. 271:27274-9 (1996).

134. Tonetti M., Sturla L., Bisso A., Zanardi D., Benatti U. and De Flora A. The metabolism of 6-deoxyhexoses in bacterial and animal cells. // Biochimie. 80:923-31 (1998).

135. Turco S.J. The lipophosphoglycan of Leishmania. // Subcell Biochem. 18:73-97 (1992).

136. Turco S.J. and Descoteaux A. The lipophosphoglycan of Leishmania parasites. // Annu Rev Microbiol. 46:65-94 (1992).

137. Turco S.J., Wilkerson M.A. and Clawson D.R. Expression of an unusual acidic glycoconjugate in Leishmania donovani. // J Biol Chem. 259:3883-9 (1984).

138. Turnock D.C. and Ferguson M.A. Sugar nucleotide pools of Trypanosoma brucei, Trypanosoma crazi, and Leishmania major. // Eukaryot Cell. 6:1450-63 (2007).

139. Van Voorhis W.C. Therapy and prophylaxis of systemic protozoan infections. // Drugs. 40:176-202(1990).

140. Wilson W.D., Tanious F.A., Mathis A., Tevis D., Hall J.E. and Boykin D.W. Antiparasitic compounds that target DNA. // Biochimie. 90:999-1014 (2008).

141. Wyllie S., Cunningham M.L. and Fairlamb A.H. Dual action of antimonial drugs on thiol redox metabolism in the human pathogen Leishmania donovani. // J Biol Chem. 279:39925-32 (2004).

142. Yao C., Donelson J.E. and Wilson M.E. The major surface protease (MSP or GP63) of Leishmania sp. Biosynthesis, regulation of expression, and function. // Mol Biochem Parasitol. 132:1-16(2003).

143. Zaph C., Uzonna J., Beverley S.M. and Scott P. Central memory T cells mediate long-term immunity to Leishmania major in the absence of persistent parasites. // Nat Med. 10:110410 (2004).

144. Zawadzki J., Scholz C., Currie G., Coombs G.H. and McConville M.J. The glycoinositolphospholipids from Leishmania panamensis contain unusual glycan and lipid moieties. // J Mol Biol. 282:287-99 (1998).

145. Zilberstein D. and Shapira M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. // Annu Rev Microbiol. 48:449-70 (1994).