Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранные липиды в формировании морфогенетического ответа у базидиальных грибов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембранные липиды в формировании морфогенетического ответа у базидиальных грибов"

На правах рукописи

Сеник Светлана Викторовна

Мембранные липиды в формировании морфогенетического ответа у базидиальных грибов

03.01.02 - «Физиология и биохимия растений» 03.02.12 - «Микология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ДЕК 2012

Санкт-Петербург - 2012

005047406

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Котлова Екатерина Робертовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Терёшина Вера Михайловна

кандидат биологических наук Емельянов Владислав Владимирович

Ведущая организация:

ФГБУН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ Российской академии наук

Защита состоится 19 декабря 2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 002.211.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботанический институт им. В. Л. Комарова Российской академии наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 2. Тел. (812) 34637-42, факс (812) 346-36-43.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Автореферат разослан 19 ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

О.С. Юдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Способность к морфогенезу - одно из фундаментальных свойств живых организмов, проявляющееся в образовании одно- или многоклеточных структур определенной формы. У высших грибов морфогенез представляет собой образование разнообразных по размеру и форме клеток (от сферических дрожжеподобных до высокополяризованных клеток мицелия), а также организацию из них сложных нетканевых структур (плодовых тел, склероциев и др.).

Неотъемлемым свойством клеток, участвующих в морфогенетическом ответе, является способность к дифференцировке - приобретению морфологической и функциональной специализации. Процессы дифференцировки грибных клеток затрагивают изменения типа роста (диморфизм), формы клеток, паттерна ветвления и септирования гиф, химического состава цитоплазмы, органелл, клеточной стенки и мембран. Морфологическое разнообразие клеток у представителей разных таксонов грибов изучено достаточно подробно (Stalpers, 1978; Clemenfon, 2004), в то время как молекулярно-физиологические основы дифференцировки исследованы на ограниченном круге модельных объектов, большинство из которых составляют дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans, мицелиальные грибы Neurospora crassa, Aspergillus spp. и др. аскомицеты (Moore, 1998; Воусе, Andrianopoulos, 2006).

Данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе клеточной дифференцировки и морфогенеза у базидиальных грибов, фрагментарны. При этом в литературе имеются лишь отдельные сведения об участии липидов в регуляции этих процессов. В частности, получены данные о взаимосвязи состава мембранных фосфолипидов и процессов, связанных с физиологией грибных спор (экзогенный и эндогенный покой, прорастание), формированием плодовых тел (Михайлова и др., 1993; Феофилова и др., 1998, 2004; Sakai, Kajiwara, 2004, 2005; Терёшина и др., 2007). Выявлены морфогенные свойства отдельных молекулярных видов сфинголипидов, высказано предположение о зависимости состава этой группы липидов от интенсивности ростовых процессов и степени цитодифференцировки (Kawai, 1983, 1989; Котлова и др., 2009). При этом до сих пор остается неисследованным участие мембранных липидов в образовании специализированных клеток и анаморф, не сформулировано целостное представление о функционировании всего комплекса липид-зависимых регуляторных систем в процессе развития грибов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выявление взаимосвязи процессов синтеза определенных классов мембранных липидов и основных этапов развития базидиальных грибов. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) на примере нескольких модельных видов проследить, как меняется состав и содержание мембранных липидов в ходе развития поверхностных культур базидиальных грибов;

2) выявить универсальные изменения липидного компонента мембран, происходящие на определенных этапах морфогенеза базидиомицетов;

3) установить изменения в составе и содержании мембранных липидов, возникающие в условиях нарушения развития грибных культур, вызванного дефицитом элементов минерального питания;

4) оценить биоэффекторные (морфогенные) свойства отдельных классов и молекулярных видов липидов (с использованием специфических ингибиторов синтеза и экзогенных липидов, введенных в среду культивирования).

Научная новизна. В работе использован оригинальный подход к изучению роли липидов в морфогенезе базидиомицетов, заключающийся в комплексном исследовании динамики их состава в процессе нормального и нарушенного развития поверхностных культур грибов, изучении участия экзогенных липидов и ингибиторов их синтеза в формировании морфогенетического ответа.

Получены новые сведения о составе мембранных фосфо-, сфинго- и бетаиновых липидов у имеющих прикладное значение базидиомицетов Flammulina velutipes, Pholiota highlandensis, Schizophyllum commune, а также ранее не изученного в этом плане Abortiporus biennis.

На основании результатов исследования изменения соотношения двух основных классов мембранных фосфолипидов, фосфатидилхолинов (ФХ) и фосфатидилэтаноламинов (ФЭ) в онтогенезе четырех видов базидиомицетов выдвинута гипотеза об обратной зависимости между относительным содержанием ФХ и степенью клеточной дифференцировки.

Впервые показано, что недостаток элементов питания в поверхностных культурах базидиомицетов может сопровождаться индукцией синтеза липидов бетаинового типа. Накопление бетаиновых липидов происходит на фоне появления монилиоидных гиф и подавления плодообразования.

Получены новые сведения о зависимости биоэффекторных свойств гликоцерамидов (ГлЦер) от их структуры.

Практическая значимость результатов.

Изучение эндогенных механизмов регуляции роста и морфогенеза грибов открывает пути к развитию способов управления скоростью роста и направлением развития патогенных и аллергенных грибов, грибов-биодеструкторов памятников архитектуры и библиотечных фондов, экономически важных культур съедобных грибов и грибов-продуцентов ценных вторичных соединений, а также редких охраняемых видов и грибов, используемых в биодеградации ксенобиотиков. Результаты исследования способствуют расширению представлений о биоэффекторных свойствах липидных молекул, которые могут быть востребованы для разработки подходов к управлению процессами роста и развития грибов посредством модификации их метаболизма.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 48-й, 50-й и 52-й Международных конференциях по фундаментальным исследованиям липидов ICBL (Финляндия, Турку, 2007; Германия, Регенсбург, 2009; Польша Варшава, 2011), рабочем

совещании «Microbial Lipids, From Genomics to Lipidomics FEBS» (Австрия, Вена, 2010), 7 Конгрессе по липидомике «Lipidomics congress: Lipids in All States» (Франция, Англет-Биарритц, 2010), II и III съездах микологов России (Москва, 2010, 2012), III Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), 7 Международной конференции «Mushroom Biology and Mushroom Products» (Франция, Аркашон, 2011), Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (Санкт-Петербург, 2012), Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012)

Связь работы с научными программами. Работа проводилась в рамках исследований по плану НИР лаборатории биохимии грибов БИН РАН, поддержана грантами РФФИ (№ 09-04-01634а, 11-04-01704а, 12-04-31213) и грантами Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № П1167, П1373).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, включающего 614 наименований. Работа изложена на 195 страницах, содержит 9 таблиц и 54 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объекты исследования. В качестве объектов исследования были использованы 4 штамма из Коллекции Культур базидиомицетов Ботанического института им. B.J1. Комарова РАН: Flammulina velutipes LE BIN 1483 СPhysalacriaceae), Pholiota highlandensis LE BIN 1124 (Strophariaceae), Schizophyllum commune LE BIN 1503 (Schizophyllaceae), принадлежащие к nop. Agaricales, и Abortiporns biennis LE BIN 055 (Meruliaceae), относящийся к nop. Polyporales. Выбранные штаммы характеризуются равномерным ростом в условиях поверхностной культуры, относительно четкой сменой стадий жизненного цикла, стабильным образованием плодовых тел в ответ на внешний стимул (освещение).

Постановка эксперимента. Культуры выращивали в чашках Петри на агаризованной среде. Культивирование проводили в течение 14 сут (A. biennis - 6 сут) при 25°С в термостате в темноте, затем в климатической камере (Sanyo MLR-351H, Япония) с температурой 20°С. Культивирование в камере проводили в темноте и, параллельно, при освещении 2000 лк (световой режим 12:12).

В большинстве экспериментов (изменение состава липидов в онтогенезе, опыты с ингибиторами и экзогенными липидами) культуры выращивали- на агаризованной среде на основе неохмеленного сусла производства Василеостровской пивоварни (Россия) (сусло, разведенное до 4° по Баллингу - 1 л, агар - 15 г). В одном из экспериментов (изменение состава липидов F. velutipes в процессе нарушенного развития) использовали среды, приготовленные на основе солодовых (мальц) экстрактов Biokar Diagnostics (Франция) и Fluka (Германия) (мальц-экстракт - 15 г/л, агар - 20 г/л), а также концентрата сусла Senson (Финляндия) (солодовый экстракт Maltax 10, разведенный до 4° по Баллингу - 1 л, агар - 15 г). Для анализа липидов и изучения морфологических характеристик использовали 7-35 сут (F'. velutipes), 1-39 сут (Р. highlandensis), 5-28 сут (S. commune) 3-11 сут (A. biennis) вегетативный мицелий, а также мицелий с плодовыми телами (F. velutipes) и отделенные от мицелия плодовые тела (P. highlandensis, S. commune, A. biennis).

В экспериментах с экзогенными липидами использовали ФХ (тип XVI-E, Sigma, Германия) и гликоцерамиды (ГлЦер), в т.ч. выделенные из плодовых тел базидиомицета Р. патеко, корней проростков пшеницы, а также коммерческий препарат, полученный из бычьего мозга (Sigma, Германия). Молекулярный состав ГлЦер

установлен методом ESI-MS/MS на масс-спектрометре 7-Т LTQ FT Thermo (Германия). Липиды вводили в среду в виде растворов в этаноле (ГлЦер) или метаноле (ФХ), в контрольные варианты вносили соответствующее количество растворителя.

В экспериментах с ингибиторами синтеза сфинголипидов культуры выдерживали в темноте при 25 °С в течение 7-14 сут. На 3-и, 6-е и 12-е сут мицелий опрыскивали водными растворами ингибиторов, в т.ч. 30 цМ мириоцином (Sigma, Германия), 50 цМ фумонизином Bl, (Sigma, Германия) и 100 цМ 1-фенил-2-деканоиламино-З-морфолино-1-пропанолом (PDMP) (Sigma, Германия). Ингибиторы синтеза ФХ фарнезол, клофибрат и безафибрат (Sigma, Германия) вводили в среду в виде растворов в DMSO в концентрациях 200цМ и ImM.

Экстракция, разделение и идентификация липидов. Липиды экстрагировали изопропанолом, затем смесью изопропанол-хлороформ (1:1) (Nichols, 1963). Индивидуальные компоненты липидов анализировали методом двумерной ТСХ на стеклянных пластинах (Merck, Германия) в системе растворителей: хлороформ/метанол/вода (65:25:4 по объему) - первое направление и хлороформ/ацетон/метанол/уксусная кислота/вода (50:20:10:10:5 по объему) - второе направление (Benning et al., 1995). Индивидуальные классы липидов идентифицировали, используя стандартные свидетели и реагенты на функциональные группы (Новицкая, 1972; Кейтс, 1975).

Анализ содержания индивидуальных классов липидов. Количество индивидуальных классов глицеро- и сфинголипидов определяли на денситометре ДенСкан (Ленхром, Россия). Хроматограммы анализировали в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым, используя ФХ (Sigma, Германия) и бычьи цереброзиды (Larodan, Швеция) в качестве стандартов.

Анализ жирных кислот. ЖК липидов анализировали методом ГЖХ-МС в виде метиловых эфиров, которые получали путем гидролиза липидов с 2.5% H2S04 в метаноле при 70°С в течение 2 часов (Conconi et al., 1996). В рутинных исследованиях использовали хроматограф Кристалл 5000.1 (Россия) с капиллярной колонкой НР-23 (30 м х 0.32 мм х 0.25 мкм). Температурный режим термостата: 3 мин при 170°С, затем линейное повышение до 220°С со скоростью 4°С/мин. Температура испарителя - 250°С, детектора - 230°С. Газ-носитель - азот. Содержание ЖК в пробе рассчитывали по площади пиков с помощью программы Хроматэк-Аналитик 1 (Россия).

ЖК идентифицировали, сравнивая время удерживания полученных пиков со стандартами, а также по масс-спектрам, полученным на газо-жидкостном хроматографе Agilent 6850 (США) с

квадрупольным масс-спектрометром 5975С в качестве детектора. Капиллярная колонка Supelco Omega Wax 250 (США) (30 м х 0.25 мм х 0.25мкм), температура испарителя - 250°С, детектора - 250°С, деление потока - 1:20, скорость газа-носителя (гелий) - 1.0 мл/мин, температурный режим термостата — 170°С с повышением до 220°С со скоростью 4°С/мин.

Для идентификации ЖК использовали масс-спекгро-метрическую библиотеку NIST и значения времен удерживания, которые сопоставляли с имеющимися свидетелями (Sigma, США).

Анализ молекулярных видов липидов. Состав молекулярных видов ГлЦер, ФХ и ДГТС определяли по значению m/z с помощью времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом и электрораспылительным источником ионов (ESI-TOF) ВПМС МХ5310. Спектры получали в режиме положительных ионов, в диапазоне 150-2000 m/z. Распыляющее напряжение на капилляре - 3.3 кВ, температура десольвирующего газа - 50°. Образцы растворяли в смеси метанол-ацетонитрил-муравьиная кислота (49 : 49 : 2). Объем пробы 10—50 мкл, скорость подачи пробы 1—5 мкп/мин.

Статистическую обработку материалов проводили в программах Microsoft Excel 2007 и Origin 6.1. Полученные данные выражали в виде М ± тм, где М - средняя арифметическая, тм - ошибка средней арифметической. Степень корреляции оценивали по значению коэффициента Пирсона. Достоверность различий между контролем и опытом оценивали по критерию Стьюдента при доверительном уровне Р]=95%. Количество независимых биологических повторностей - 3- 5.

Результаты и обсуждение

Глава 1. Изменение состава мембранных липидов в процессе роста и развития поверхностных культур базидиомицетов

1.1. Интенсивность роста и особенности морфологии поверхностных культур базидиомицетов в процессе развития

Для выявления зависимости состава мембранных липидов базидиомицетов от стадий их развития, характеризующихся появлением определенных типов клеток и/или клеточных структур, было исследовано несколько видов грибов, отличавшихся интенсивностью роста в культуре, наличием тех или иных типов дифференцированных клеток, особенностями развития плодовых тел.

Развитие F. velutipes и P. highlandensis (до созревания плодовых тел) длилось 35 - 39 сут (рис. 1 А, Б). Активная дифференцировка гиф

начиналась после 14 сут (в культурах F. velutipes образовывались дейтероплазматические зернистые гифы, а в клетках P. highlandensis появлялись многочисленные вакуоли и развивались вздутия) (рис. 2). У F. velutipes появление анаморф (конидии) было отмечено преимущественно на начальных этапах развития. У P. highlandensis анаморфы (хламидоспоры) образовывались только на поздних стадиях (28-35 сут). Культуры S. commune и A. biennis отличались ускоренным ростом и/или развитием - созревание плодовых тел завершалось к 28 сут и 11 сут, соответственно (рис. 1 В, Г). К 14 сут в культурах S. commune происходила дифференцировка вегетативных гиф (образование шипообразных выростов). Морфология вегетативных гиф A. biennis менялась незначительно, развитие культуры шло в направлении массового образования хламидоспор (рис. 2).

Рис. 1. Кривые роста поверхностных культур базидиомицетов. А — F. velutipes, Б — P. highlandensis, В - 5. commune, Г - A. biennis. • - развитие в темноте, о — развитие в условиях освещения. СУ - стадия развития вегетативного мицелия, - стадия образования плодовых тел.

Р. уе/иИрех

1—7 сут: тонкостенные гиалиновые гифы, артроконидии

2-28 сут:

и

дейтероплазмати-ческие гифы, артроконидии

Р. highlandensis

3-7 сут: тонкостенные гиалиновые гифы 4 — 28 сут: вакуолизиованные гифы,

хламидоспоры,гифы с вздутиями

S. commune

5-5 сут: тонкостенные гиалиновые гифы

6-14 сут: гифы с

шипообразными выростами

A. biennis 7-3 сут: тонкостенные гиалиновые гифы 8 - 11 сут: терминальные

собранные в грозди

Рис. 2. Изменение микроморфологии базидиомицетов в ходе роста и развития культур (без освещения). 1-2 - фазовый контраст, 3-8 -дифференциально-интерференционный контраст (Э1С), масштаб -10 цт.

1.2. Состав и содержание индивидуальных классов липидов

Основные мембранные липиды изученных видов грибов были представлены ФХ и ФЭ. Значительно меньше содержалось фосфати-дилсеринов (ФС), фосфатидилинозитов (ФИ), дифосфатидилглицеринов (ДФГ), фосфатидных кислот (ФК) и ГлЦер, на отдельных стадиях онтогенеза в следовых количествах присутствовали лизо-ФХ (рис.3).

По мере развития вегетативного мицелия количество индивидуальных классов липидов у F. velutipes и P. highlandensis менялось незначительно, в то время как у S. commune и A. biennis, отличавшихся наиболее интенсивным ростом в культуре, на начальных этапах онтогенеза было зарегистрировано резкое уменьшение содержания ФХ и/или ФЭ. При этом во всех культурах, за исключением A. biennis, в процессе развития культур происходило снижение соотношения ФХ/ФЭ. Максимальное значение этого индекса наблюдалось в 7 сут культурах F. velutipes, характеризовавшихся отсутствием дифференцированных вегетативных гиф и активным конидиогенезом, к 28 сут (стадия массового образования специализированных клеток) это соотношение снижалось более чем в 2 раза. Развитие культур P. highlandensis, отличавшихся сравнительно невысокими темпами цитодифференцировки, сопровождалось меньшим снижением значения ФХ/ФЭ. В культурах S. commune резкое снижение значения ФХ/ФЭ зарегистрировано на самых ранних этапах развития - к 14 сут индекс ФХ/ФЭ уменьшился вдвое. Интересно, что у этого вида цитодифференцировка также отмечена на ранних стадиях развития (на 14 сут в массовом количестве появлялись дифференцированные гифы с шипообразными выростами). В культурах A. biennis, морфогенез которых шел не в направлении дифференцировки вегетативных гиф, а по пути массового образования хламидоспор, индекс ФХ/ФЭ не снижался. Таким образом, полученные данные демонстрируют существование физиологически обусловленной взаимосвязи между индексом ФХ/ФЭ и степенью дифференцировки гиф.

Сравнительный анализ липидов мицелия и плодовых тел также выявил некоторые закономерности. Как правило, по сравнению с мицелием, в плодовых телах содержалось большее количество липидов. Кроме того, в исследованных видах на фоне снижения относительного содержания минорных липидов возрастала пропорция ФХ, ФЭ и ФС. Усиление аккумуляции ФС в ходе плодообразования может быть связано с участием липидов этого класса в апоптозе, который является частью морфогенетической программы развития плодового тела (Phillips et al., 2003; Fedorova et al., 2005).

М+ПР м+пт

rill

Возраст культуры,сут

Рис. 3. Изменение содержания основных мембранных глицеро- и сфинголипидов в ходе роста и развития поверхностных культур F. velutipes (1), P. highlandensis (2), S. commune (3) и A. biennis (4) в темноте (А) и на свету (Б). 1 - ФХ, 2 - ФЭ, 3 - ФК, 4 - ДФГ, 5 - ФС, 6 - ФИ, 7 - ГлЦер. М -мицелий, ПР - примордии, ПТ - плодовые тела.

Относительное содержание ГлЦер в ходе вегетативного развития не менялось, однако, у F. velutpes и A. biennis, возрастало на стадии образования плодовых тел.

1.3. Состав жирных кислот

Исследование состава ЖК основных фосфолипидов - ФХ и ФЭ -у 4-х видов базидиомицетов показало, что эти соединения этерифицированы преимущественно пальмитиновой (С 16:0), стеариновой (С18:0), олеиновой (С18:1д9) и линолевой (С18:2Л9,12) кислотами. В меньшем количестве присутствуют а-линоленовая (С18:3Л912,15), С15:0 и С16:1 кислоты. У F. velitipes и P. highlandensis обнаружены также С 12:0, С 14:0 и С 17:0 ЖК. В некоторых культурах

F. velutipes А - мицелий (7 сут) Б - мицелий с плодовыми телами (35 сут)

P. highlandensis А - мицелий (7 сут) Б — плодовые тела (39 сут)

S. commune

А - мицелий (5 сут)

Б - плодовые тела (28 сут)

другие С16;0

С16:0 другие^ | ^_С18:1) С18:3„

A. biennis

А - мицелий (3 сут)

Б - плодовые тела (11 сут)

Рис. 4. Состав ЖК фосфатидилхолинов базидиомицетов.

другие

идентифицированы длинноцепочечные арахиновая (P. highlandensis, A. biennis) и бегеновая ЖК (F'. velutipes, P. highlandensis). У F. velitipes выявлена достаточно редкая для грибов С16:2Л912 кислота. Состав ЖК F. velitipes и S. commune характеризовался более высоким относительным содержанием а-линоленовой кислоты в составе ФХ -4-8% от суммы ЖК. Фосфолипиды A. biennis отличались максимальным относительным содержанием С 18:2 кислоты (до 90%).

Развитие культур грибов сопровождалось модификациями в составе ЖК. В частности, образование плодовых тел коррелировало с увеличением степени ненасыщености за счет увеличения относительного содержания С18:2, иногда С18:1 (ФЭ P. highlandensis) и С18:3 (ФХ и ФЭ F. velutipes) кислот (рис. 4). В ходе развития поверхностной культуры S. commune наблюдалось изменение соотношения изомеров С 18:1 кислоты.

Интересно, что в молекулах ФХ у изученных базидиомицегов соотношение С16/С18 ЖК, как правило, было вдвое ниже, чем в молекулах ФЭ, что может быть следствием преимущественного синтеза ФХ и ФЭ у этих видов по пути Кеннеди (в этом случае ферменты, катализирующие присоединение ЦДФ-холина и ЦДФ-этаноламина к диацилглицеринам (ДАГ), могут отличаться специфичностью по отношению к различным молекулярным видам ДАГ, в т. ч. этерифицированным С16 или С18 кислотами).

1.4. Молекулярный состав сфинголипидов (на примере

F. velutipes)

Процесс дифференцировки вегетативных клеток мицелия F. velutipes происходил на фоне модификаций молекулярного состава ГлЦер. На начальных стадиях роста поверхностной культуры F. velutipes синтезировались ГлЦер, содержащие в качестве сфингоидного основания эпоксидированный метилсфингодиенин (d 18:1 A8-4-ePoxy.9-Met), По мере роста и специализации клеток мицелия во фракции ГлЦер начинали доминировать молекулярные виды с обычным для базидиомицегов метилсфингодиенином (dl8:2 A8'4'9"Met) (табл. 1).

Глава. 2. Изменения в составе мембранных липидов в процессе нарушенного развития поверхностных культур F. velutipes (дефицит элементов минерального питания)

В процессе подбора оптимальных условий для поверхностного культивирования F. velutipes было обнаружено, что на агаризованной среде на основе солодового (мальц) экстракта Biokar Diagnostics происходит образование монилиоидных гиф, нехарактерных для

культур данного штамма, выращенных на сусло-агаре, и не развиваются плодовые тела. Была поставлена задача - выяснить, сопутствуют ли атипичной макро- и микроморфологии культуры какие-либо изменения в составе мембранных липидов.

Табл. 1. Особенности распределения молекулярных видов ГлЦер (% от суммы) в поверхностных культурах V. velutipes

[M+Na]+ m/z Сфингоидное основание/ЖК Возраст культуры, сут

7 14 28 35

мицелий мицелий + примор-дии мицелий + плодовые тела

736 dl8:lA8'4-epoxy'"-Me,/14:l-OH 3.1 - 5.8 2.6

738 ё18:1Л8,4-ероху^Ме1/14:0_0]н 11.7 0.9 10.6 14.2

750 dl 8:2 A8'4'y_Met/l б-.О-ОН 12.7 20.8 34.3 31.8

760 dl 8:2 Д8АУ~Ме718:1 0.0 25.8 4.5 9.8

762 d 18:2 As,4'y-MeV18:0 10.7 - 36.3 13.2

766 dl8:1 Д«.4-ерОху.У-Мй/16:0_он 53.7 49.8 2.4 20.2

778 dl8:2AS,4,v-Met/18;OOH 5.1 - 4.0 4.2

794 dl 8:1 Д8-4-еРохУ.у-Ме'/18-.0-ОН 2.9 2.7 2.2 3.9

А Б

Рис. 5. Мицелий поверхностной культуры F. velutipes на стадии 9 (А), и 39 (Б) сут (нарушенное развитие). Условия культивирования: среда мальц-агар Biokar Diagnostics, 15°С, без освещения. Микрофотографии сделаны в режиме D1C.

Культуры выращивали на среде, приготовленной на основе солодового экстракта Biokar Diagnostics, а также, для сравнения, на средах с мальц-экстрактом Fluka, концентратом сусла Senson и неохмеленным суслом производства Василеостровской пивоварни. Сравнительный анализ состава этих сред показал, что мальц-экстракты по сравнению с сусловыми средами содержат в два раза меньше азота и фосфора, а также уступают по количеству калия, магния, железа, микроэлементов и углеводов.

Культуры F. velutipes, выращенные на «бедных» средах (мальц-агары), отличались более низкими темпами накопления биомассы и меньшей плотностью воздушного мицелия. Для них было характерно появление монилиоидных гиф на поздних этапах развития (рис. 5) и отсутствие базидиом. Эти изменения сопровождались индукцией синтеза липидов бетаинового типа диацилглицерилтриметил-гомосеринов (ДГТС), наличие которых нехарактерно для F. velutipes. На среде, приготовленной на основе мальц-экстракта Biokar Diagnostics, накопление ДГТС оказалось более существенным и происходило на более ранних стадиях развития. Анализ изменений состава и содержания липидов в онтогенезе F. velutipes, культивируемой на этой среде, выявил, что параллельно с постепенным накоплением ДГТС происходят изменения в содержании фосфолипидов, в т.ч. значительное (в 2 раза) снижение относительного содержания ФХ (рис. 6), что косвенно свидетельствует о компенсаторных отношениях ФХ и ДГТС.

ft

f

ft; L

'&Ш

Возраст культуры, сут Рис. 6. Изменение содержания основных мембранных глицеро и-, сфинголипидов в ходе нарушенного развития поверхностной культуры F. velutipes. Условия культивирования: среда мальц-агар Biokar Diagnostics, 15°С, без освещения, с.м. - сухая масса. 1 - ФХ, 2 - ФЭ, 3 - ДГТС, 4 - ФК, 5 - ФС, 6 - ФИ, 7 - ДФГ, 8 - ГлЦер.

Сходство структур и физико-химических свойств этих двух классов липидов, в т. ч. близкие значения температур фазового перехода и вязкости, позволили выдвинуть гипотезу о функциональной взаимозаменяемости ФХ и ДГТС в мембране (Sato, Murata, 1997). По данным ESTlVIS анализа, ФХ F. velutipes на 30-50% были представлены 18:2/18:2 молекулярным видом, тогда как преобладающим молекулярным видом ДГТС являлся 16:0/18:2 (40-50%). В ходе развития культуры состав ЖК фосфо- и бетаиновых липидов принципиально не менялся, за исключением линоленовой кислоты, относительное содержание которой в ФХ и ФЭ постепенно уменьшалось.

Исследована зависимость образования ДГТС от факторов внешней среды (температуры, освещения). Установлено, что наиболее активная аккумуляция ДГТС происходит при температуре 15°С в отсутствии света.

Глава 3. Рост, морфогенез и состав липидов F. velutipes в условиях модифицированного метаболизма сфинголипидов

3.1. Действие ингибиторов синтеза сфинголипидов

С целью выяснения роли ГлЦер в регуляции роста и развития базидиальных грибов были проведены исследования действия ингибиторов их синтеза, в т.ч. мириоцина, фумонизина и 1-фенил-2-деканоиламино-З-морфолино-1-пропанола (PDMP). Мириоцин блокирует конденсацию пальмитоил-КоА и серина, т.е. первую реакцию пути биоситеза ГлЦер, приводя к истощению всех классов сфинголипидов, образующихся de novo. Фумонизин В1 ингибирует работу сфинганин-1М-ацилтрансферазы, катализирующей перенос ацильной группы на молекулу сфинганина (Desai et al., 2002). PDMP блокирует последнюю реакцию биосинтеза ГлЦер - присоединение глюкозы к церамиду (Kobayashi et al., 2006).

Все использованные ингибиторы синтеза ГлЦер подавляли интенсивность роста культур (рис. 7). На стадии 7 сут мицелий, обработанный мириоцином или фумонизином, становился более рыхлым по сравнению с плотным однородным мицелиальным матом в контроле. Области с паутинообразным воздушным мицелием чередовались с лизированными участками. На среде с PDMP рост тормозился в меньшей степени, но после 30 сут культивирования в колониях снижалась интенсивность образования плодовых тел.

Под воздействием мириоцина в культуре появлялись дифференцированные толстостенные гифы с нерегулярными

перегородками (рис. 7.2 Д), а также усиливалась степень агрегации гиф: появлялись различные сплетения, «косички» и «пучки» (рис. 7.2 А, Б, В, Г). Обработка культур фумонизином способствовала усиленному ветвлению апикальных частей гиф, появлению вздутий (рис. 7.3 А), а также возникновению «косичек» (рис. 7.3 Б). Кроме того, был зарегистрирован необычный способ конидиогенеза: образование конидий путём фрагментации не специализированных конидиогенных гиф, а крупных вегетативных дикариотических гиф (рис. 7.3 В, Г). Культуры, обработанные РОМР, были сопоставимы с контрольными за исключением более высокого уровня конидиогенеза.

12 3 4

Рис. 7. Морфология колоний и микроморфология вегетативного мицелия поверхностных культур базидиального гриба F. velutipes (возраст культур - 7 сут). 1 - контроль, 2 - ЗОцМ мириоцин, 3 - 50цМ фумонизин, 4 -100рМ PDMP. Микрофотографии сделаны в режиме DIC, масштаб - 10 цт.

Анализ состава фосфо- и сфинголипидов после обработки культур F. velutipes ингибиторами выявил не только ожидаемые изменения во фракции общих ГлЦер, но и изменения в содержании фосфолипидов, подтверждая существование перекрёстных взаимодействий между этими двумя группами липидов (рис. 8). В культурах, обработанных мириоцином, на стадии 7 сут зарегистрировано снижение концентрации всех фосфолипидов. На стадии 14 сут содержание фосфолипидов восстанавливалось. При этом в составе ГлЦер 7 сут культур, обработанных мириоцином, соотношение молекулярных форм с m/z 750 и 766 значительно увеличивалось, становясь сопоставимым с ГлЦер культур, находящихся на стадии торможения ростовой активности и

усиления дифференцировки клеток. При обработке культур фумонизином в течение 7 сут содержание ФХ уменьшалось вдвое, а к 14 сут происходило двукратное увеличение содержания ФХ и ФЭ. РОМР к 14 сут в 4 раза повышал соотношение ФХ/ФЭ.

ГЬёт- .-an | г-РЙи р Ii ии |

ФК ДФГ Ф№4>С ГпЦер

Рис. 8. Эффект ингибиторов синтеза ГлЦер на содержание фосфолипидов и ГлЦер в 7 сут (А) и 14 сут (Б) культурах К \elutipes. 1 - контроль, 2-30 цМ мириоцин, 3-50 цМ фумонизин, 4-100 цМ РЭМР.

3.2. Действие экзогенных ГлЦер

Известно, что функциональная активность ГлЦер напрямую зависит от их структуры - длины цепи, количества и положения двойных связей в сфингоидном основании и жирной кислоте (Kawai, Ikeda, 1983; Дятловицкая, 1998; Pinto, 2002). Для выяснения роли структурных особенностей ГлЦер в проявлении определенной физиологической активности было изучено влияние смесей молекулярных видов ГлЦер, выделенных из грибов (плодовые тела Pholiota патеко), растений (корни пшеницы) и тканей животных (бычий мозг) на рост и развитие F.velutipes. Анализ их состава, проведенный методом ESI+MS/MS, показал, что грибные ГлЦер на 97% представлены одним молекулярным видом, содержащим d 18:2A4 s'9Me,/l 6:0(ОН) церамид. ГлЦер, выделенные из растительных и животных тканей, оказались гетерогенными. Смесь ГлЦер пшеницы состояла из соединений, содержащих dl8:2 с 16:0(ОН) или 18:0(ОН) (30%), dl8:2 с длинноцепочечными гидрокси-кислотами С20 и С24 ряда (25%), tl8:l с 24:0(ОН) или 24:1 (ОН) (35%). Смесь ГлЦер, выделенных из бычьего мозга, была представлена соединениями, содержащими dl8:1 с 14:0(ОН) или 18:0(ОН) (37%), dl8:1 с длинноцепочечными гидрокси-кислотами С20 и С24 ряда (39%), tl8:l с 14:0(ОН) или 18Ю(ОН) (24%).

Показано, что избыток ГлЦер, выделенных из плодовых тел Р. патеко и содержащих 9-метил-сфингадиенин (dl8:2A4'8'9Met) в качестве

сфингоидного основания, способен тормозить рост культур, ускорять дифференцировку клеток и развитие плодовых тел.

После 8 сут культивирования на средах с добавлением ГлЦер (10 мкг/мл) рост колоний F.velutipes на среде с грибными и растительными ГлЦер заметно подавлялся, в то время как ГлЦер, выделенные из животных тканей, практически не влияли на интенсивность роста мицелия. В культурах с растительными ГлЦер было выявлено образование спиралеобразных гиф. Другие ГлЦер каких-либо морфологических изменений не вызывали. Синусоидальный рост гиф был зарегистрирован у Candida albicans в ответ на изменение плотности среды и недостаток питательных веществ (Brand et al., 2009). Было показано, что эта морфогенетическая реакция опосредуется работой сигнальных систем, включающих активацию Са+-транспортеров. Более подробно механизмы, лежащие в основе спирального роста, не изучались. Известно только, что к ротации кончика гифы приводит регулярное круговое перемещение апикального центра Spitzenkorper (Gooday, 1993).

Ни в одном из экспериментов ожидаемого накопления эндогенных ГлЦер зарегистрировано не было. При этом ГлЦер, выделенные из корней пшеницы, вызывали увеличение содержания ФХ, в то время как ГлЦер, выделенные из бычьего мозга, напротив, снижали количество липидов этого класса.

Сопоставление полученных результатов (влияние на рост, морфологию и состав липидов F.velutipes) с данными по молекулярному составу смесей экзогенных ГлЦер позволяет заключить, что в определении морфогенных свойств принципиальное значение имеет длина цепи ЖК. Очевидно, наибольшей активностью обладают ГлЦер с гидрокси-кислотами средней длины. Степень ненасыщенности сфингоидного основания также влияет на свойства ГлЦер: молекулы с d 18:2 основанием оказались более активными по сравнению с соединениями, содержащими d 18:1. Значение количества гидроксильных групп в сфингоидных основаниях пока оценить невозможно, т.к. смеси ГлЦер растений и животных содержали сопоставимые количества молекулярных видов с ди- и тригидрокси-основаниями. Существенное значение, по-видимому, имеет также наличие метального радикала в составе сфингоидного основания.

Глава 4. Рост, морфогенез и состав липидов F. velutipes в условиях модифицированного метаболизма ФХ

4.1. Действие ингибиторов синтеза ФХ на рост, морфогенез н состав мембранных липидов Flammulina velutipes

Метаболизм ФХ у грибов подробно изучен на S. cerevisiae, синтезирующем ФХ в реакциях последовательного трехступенчатого метилирования ФЭ. Специальных исследований, направленных на изучение путей синтеза ФХ и ФЭ у базидиомицетов, не проводилось. В связи с этим в экспериментах, связанных с воздействиями на метаболизм ФХ, были выбраны ингибиторы ферментов, катализирующих образование ФХ в реакциях метилирования ФЭ (путь метилирования), в т.ч. безафибрат и клофибрат (Nishimaki-Mogami et al., 1996), а также фарнезол - ингибитор реакции с участием ЦДФ-холина (путь Кеннеди) (Joo, Jetten, 2010).

Введение в среду культивирования безафибрата и клофибрата, ингибирующих метилтрасферазные реакции, не влияло на интенсивность роста колонии и морфологию мицелия. В культурах, выращенных на среде с 200 рМ фарнезолом, ингибитором ЦДФ-холин:ДАГ-холин-фосфотрансферазы, наблюдалось значительное снижение скорости роста F. velutipes, а ImM фарнезол практически полностью останавливал рост колонии. Однако торможение ростовых процессов в этих культурах не сопровождалось усилением дифференцировки клеток. В мицелии, выращенном на средах с этим ингибитором, содержалось такое же количество специализированных клеток, как и в контроле. Отличительной особенностью этих культур являлось развитие многочисленных синусоидально изогнутых вегетативных гиалиновых гиф (рис. 9).

1 2

Рис. 9. Морфология культур F. velutipes в условиях действия ингибиторов синтеза ФХ. 1 - контроль (0,1 % этанола), 2 - фарнезол (200 рМ). Микрофотографии сделаны в режиме фазового контраста, масштаб - 10 Lim.

Анализ состава лииидов Р. уеЫгрея при воздействии ингибиторов не выявил изменений в содержании ФХ и других фосфолипидов. По-видимому, в условиях ингибирования одного из путей синтеза ФХ происходит компенсаторное усиление работы другого альтернативного пути биосинтеза.

4.2. Действие экзогенных ФХ

Как было показано, преобладающими молекулярными видами ФХ Г. \>е1 иПрех, а также многих других видов базидиоицетов, являются 18:2/18:2, 16:0/18:2. Введение в среду экзогенных ФХ (в концентрации 20 мг/л), выделенных из тканей животных и представленных преимущественно нехарактерным для базидиальных грибов молекулярным видом 16:0/18:1, ингибировало рост мицелия Г. чеШгрея на ранних этапах развития культуры (рис. 10), а на поздних этапах усиливало пигментацию колонии. В 7 сут культурах, выращенных в присутствии экзогенных ФХ, происходило уменьшение диаметра гиф до 1.3 - 2.2 мкм, часто наблюдающееся у данного штамма при старении культуры, а также образовывались синусоидально изогнутые гифы, что свидетельствует о нарушении их ориентации в пространстве и/или полярного роста.

1 2

Рис. 10. Морфология культур Р.уеЫгрез, выращенных на среде с экзогенными ФХ (7 сут, без света). 1 - контроль, 2 - ФХ. Микрофотографии сделаны в режиме масштаб — 10 цм.

Таким образом, культуры, выращенные на средах с экзогенными ФХ с нетипичным для Р. чеЫИрея молекулярным составом, имели ряд черт стареющей культуры (низкая скорость роста, утоньшение гиф, отклонения в процессах полярного роста), но при этом в них не образовывались дифференцированные клетки (пустые толстостенные гифы, гифы с частыми перегородками), характерные для данного штамма на поздних этапах развития. Иными словами, внесение экзогенных ФХ приводило к торможению роста без усиления процессов клеточной дифференцировки. Интересно, что эта морфогенетичекая реакция сопровождалась двукратным увеличением соотношения ФХ/ФЭ, что ещё раз подтверждает существование связи высоких значений ФХ с недифференцированным состоянием клетки (рис.11).

□ контроль

□ ФХ

ДгЙД

ФЭ ФК КЛ ФС ФИ ГлЦер

ДАГ СЖК ТАГ Ст

Рис. 11. Изменение содержания полярных (А) и нейтральных (Б) мембранных липидов в 7 сут мицелии К \elutipes при культивировании на средах с экзогенными ФХ. ДАГ — диацилглицерины, СЖК - свободные жирные кислоты, ТАГ - триглицериды, СТ - стерины.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ЖК - жирные кислоты

ГлЦер - гликоцерамиды

ДАГ — диацилглицерины

ДГТС -диацилглицерил-

триметилгомосерины

ДФГ - дифосфатидилглицерины

ТАГ — триацилглицерины

ФГ - фосфатидилглицерины ФИ - фосфатидилинозиты ФК - фосфатидные кислоты ФС - фосфатидилсерины ФХ - фосфатидилхолины ФЭ — фосфатидилэтаноламины

выводы

1. Развитие поверхностных культур базидиальных грибов Flammulina velutipes, Pholiota highlandensis, Schizophyllum commune и Abortiporus biennis сопровождается изменениями состава мембранных липидов. Взаимосвязь липидного состава и морфологии грибов прослеживается на стадиях усиления процессов дифференцировки (накопление специализированных вегетативных клеток и анаморф) и образования плодовых тел.

2. Среди универсальных реакций фосфолипидного обмена, характерных для нескольких видов базидиомицетов, можно выделить следующие: 1) по мере дифференцировки клеток в культурах снижается значение индекса ФХ/ФЭ; 2) при формировании плодовых тел возрастает суммарное содержание ФХ, ФЭ и ФС на фоне уменьшения концентрации минорных липидов (ФК, ДФГ, ФИ), при этом увеличивается концентрация молекулярных видов ФХ и ФЭ, этерифицированных С18:2А9,12 и С18:2 ,12, кислотами.

3. Нарушение развития культуры Flammulina velutipes, вызванное недостатком элементов минерального питания, сопровождается индукцией синтеза липидов бетаинового типа (ДГТС). Накопление ДГТС наблюдается на фоне появления монилиоидных гиф и подавления образования плодовых тел.

4. В процессе дифференцировки поверхностной культуры F. velutipes происходят изменения в составе молекулярных видов сфинголипидов. Наблюдается снижение относительного содержания ГлЦер с сИ8:1А4,8"эпокси'9"мс™л сфингоидным основанием и увеличение пропорции ГлЦер с с118:2Л4'8-9-метш1.

5. Ингибирование начальных этапов синтеза сфинголипидов приводит к нарушениям монополярного роста, усилению ветвления и образованию необычных агрегаций грибных гиф; ингибирование реакции гликозилирования свободных церамидов замедляет образование плодовых тел и усиливает конидиогенез.

6. Биоэффекторные свойства ГлЦер зависят от структуры их гидрофобной части, в т.ч. степени ненасыщенности сфингоидного основания, длины и степени гидроксилирования ЖК.

7. Нарушения метаболизма ФХ сопровождаются изменениями интенсивности роста колонии F. velutipes. При этом ингибирование синтеза ФХ de novo (путь метилирования) не приводит к каким-либо изменениям, в то время как ингибирование реакции с участием ЦДФ-холина (путь Кеннеди) вызывает торможение ростовых процессов и изменение направления роста клеток (образование спиральных гиф) без

усиления их дифференцировки. Снижение интенсивности роста грибной колонии происходит также при внесении смеси экзогенных ФХ нетипичного для грибов молекулярного состава (с преобладанием 16:0/18:1).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Котлова Е.Р., Сеник С.В., Кюхер Т., Шаварда АЛ., Кияшко А.А., Псурцева Н.В., Зубарев Р.А. Изменения в составе мембранных глицеро-и сфинголипидов в ходе развития поверхностной культуры Flammulina velutipes II Микробиология. Т.78., №2. 2009. С. 226-235.

2. Сеник С.В., Новиков А.В., Котлова Е.Р. Структурное разнообразие гликоцерамидов в плодовых телах базидиальных грибов // Растительные ресурсы. Т.47, вып. 4. 2011. С. 131-140.

3. Senile S.V., Kotlova E.R., Psurtseva N.V., Novikov A.V., Khanin V.A., Shavarda A.L. Effect of exogenous sphingolipids on growth and metabolism in surface cultures of basidial fiingi // Proceedings of the 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (ICMBMP7) 2011. P. 96-102.

4. Сеник C.B., Котлова E.P., Новиков A.B., Шаварда A.JI., Псурцева

H.В. Образование диацилглицерилтриметилгомосеринов в поверхностной культуре базидиомицета Flammulina velutipes II Микробиология. 2012. Т. 81, № 5. С. 578-586.

Тезисы конференций

I. Kotlova E.R., Senik S.V., Kocher Т., Shavarda A.L., Sinyutina N.F., Psurtseva N. V., Zubarev R.A. Glycosylceramides from Flammulina velutipes: variety of molecular species, metabolism and involvement in fungal differentiation // Chemistry and Physics of Lipids. V. 149. 2007. P.S82.

2. Kotlova E.R., Senik S.V., Sinyutina N.F., Kiicher Т., Shavarda A.L., Novikov A.V., Psurtseva N.V., Zubarev R.A. The sphingolipid synthesis inhibitors affect phospholipid turnover in the basidial fungus Flammulina velutipes II Abstracts of XV Congress of European Mycologists, September 16 - 21, 2007. Saint-Petersburg, 2007. P. 95-96

3. Котлова E.P., Сеник C.B., Кияшко А.А., Шаварда A.JI. К вопросу о действии ингибиторов синтеза гликоцерамидов на рост, морфологические характеристики и липидный состав грибов // Современная

25

микология в России. Т. 2.; Материалы 2-го съезда микологов России. М.; Национальная академия микологии. 2008. С. 153-154.

4. Senik S.V., Kotlova E.R., Kiyashko А.А., Shavarda A.L., Artemenko K.A., Zubarev R.A. Sphingolipid synthesis inhibitors affect growth, morphology and metabolism of basidial fungus Flammulina velutipes И Chemistry and Physics of Lipids. V.160. 2009. P.30.

5. Сеник C.B., Котлова E.P., Кияшко A.A., Новиков А.В. Динамика изменений липидного компонента мембран в процессе морфогенеза базидиальных грибов // Иммунология, Аллергология, Инфектология. №1.2010. С.37-38.

6. Senik S.V., Kotlova E.R., Kiyashko А.А., Shavarda A.L., Novikov A.V. Characterization of basidial fungus Flammulina velutipes subjected to inhibition of sphingolipid pathway: growth, morphology, and metabolic profile // Book of abstracts. FEBS Workshop Microbial Lipids. 13-15 May 2010, Vienna, Austria. P. 65.

7. Senik S.V., Kotlova E.R., Shavarda A.L., Novikov A.V. Biosynthesis of diacylglyceryltrimethylhomoserines in basidial fungi depends on chemical composition of the growth medium // Book of abstracts. 7th Lipidomics Congress «Lipids in all states». 3-6 October 2010, Anglet - Biarritz, France. P. 105.

8. Сеник C.B., Котлова E.P., Новиков A.B., Шаварда A.JI. Экзогенные гликоцерамиды в регуляции роста и развития базидиальных грибов // Тезисы докладов. Третий Международный Симпозиум «Клеточная сигнализация у растений». 26 июня - 1 июля 2011, Казань, Россия. С. 171-172.

9. Senik S.V., Kotlova E.R., Novikov A.V., Novikov A.V., Shavarda A.L. Growth regulation activity of glycosylceramides and their metabolites in basidial fungus Flammulina velutipes II Chemistry and Physics of Lipids. V. 164, Supplement 1, 2011, P. S33. Abstracts from the 52nd International Conference on the Bioscience of Lipids (Poland).

10. Сеник C.B., Котлова E.P. Влияние минерального питания на образование бетаиновых липидов у агарикоидных базидиомицетов // Современная микология сегодня. Т.З. Тезисы докладов третьего съезда микологов России. Москва, 2012. С. 85-86.

11. Сеник С.В., Котлова Е.Р., Богомолова Е.В., Кирцидели И.Ю. Бетаиновые липиды у аско- и базидиомицетов: разнообразие и особенности регуляции // Сборник тезисов П(Х) Международной Ботанической Конференции молодых ученых. Санкт-Петербург, 11-16 ноября 2012. С. 69.

Подписано в печать «19» ноября 2012 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 3110.

Типография «Восстания — 1» 191036, Санкт-Петербург, ул. Восстания, д.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сеник, Светлана Викторовна, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской Академии Наук

04201351 586 На правахрукописи

СЕНИК Светлана Викторовна

МЕМБРАННЫЕ ЛИПИДЫ В ФОРМИРОВАНИИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО ОТВЕТА У БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

03.01.05 - «Физиология и биохимия растений» 03.02.12 - «Микология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -кандидат биологических наук Е.Р. Котлова

Санкт-Петербург - 2012

Содержание

Список принятых сокращений..................................................................................................................4

Введение..........................................................................................................................................................................5

Гл. 1. Обзор литературы..............................................................................................................................................9

1.1. Морфогенез базидиальных грибов и его регуляция..................................................9

1.1.1. Общая характеристика............................................................................................................9

1.1.2. Прорастание покоящихся клеток (спор/конидий)..........................................10

1.1.3. Вегетативный рост мицелия..............................................................................................11

1.1.4. Дифференцировка вегетативного мицелия..........................................................15

1.1.5. Анаморфы..........................................................................................................................................18

1.1.6. Телеоморфы......................................................................................................................................23

1.2. Мембранные липиды грибов: состав, особенности метаболизма, изменчивость в процессе онтогенеза и в условиях действия внешних факторов............................................................................................................................................................30

1.2.1. Жирные кислоты..........................................................................................................................^ \

1.2.2. Глицеролипиды............................................................................................................................37

1.2.3. Сфинголипиды..............................................................................................................................43

1.2.4. Молекулярные механизмы регуляции метаболизма мембранных

49

липидов......................................................................

1.3. Регуляторная активность мембранных липидов............................................................51

1.3.1. Регуляция посредством изменения физико-химических свойств

51

мембраны....................................................................

1.3.2. Регуляция посредством прямого связывания и изменения

функциональных характеристик мембранных белков..........................54

1.3.3. Липид-зависимые сигнальные системы..................................................................56

Гл. 2. Материалы и методы исследования..........................................................................................73

2.1. Объекты исследования..............................................................................................................................73

2. 2. Методы исследования..............................................................................................................................77

2.2.1. Условия культивирования....................................................................................................77

2.2.2. Морфологические исследования....................................................................................77

2.2.3. Анализ индивидуальных классов мембранных глицеро- и

сфинголипидов................................................................

2.2.4. Условия проведения модельных экспериментов с ингибиторами

и экзогенными липидами................................................... g2

2.3. Статистическая обработка данных................................................ ^

Гл. 3. Результаты и обсуждение........................................................... ^

3.1. Изменение состава мембранных липидов в процессе роста и развития поверхностных культур базидиомицетов....................................... 84

3.1.1.Интенсивность роста и особенности морфологии поверхностных культур базидиомицетов в процессе развития....................... 84

3.1.2. Состав и содержание индивидуальных классов липидов............ ^

3.1.3. Состав жирных кислот...................................................... ^

3.1.4. Молекулярный состав сфинголипидов (на примере F. velutipes).. j ^

3.2. Изменения в составе мембранных липидов в процессе нарушенного развития поверхностных культур F. velutipes (дефицит элементов минерального питания).............................................................. 117

3.3. Рост, морфогенез и состав липидов F. velutipes в условиях модифицированного метаболизма сфинголипидов........................................... 128

3.3.1. Действие ингибиторов синтеза сфинголипидов........................ ^д

3.3.2. Действие экзогенных ГлЦер................................................

3.4. Рост, морфогенез и состав липидов F. velutipes в условиях модифици-

142

рованного метаболизма ФХ.........................................................

3.4.1. Действие ингибиторов синтеза ФХ на рост, морфогенез и состав мембранных липидов F. velutipes......................................... ^^

3.4.2. Действие экзогенных ФХ на рост, морфогенез и состав мембранных липидов F. .................................................... "7

Выводы........................................................................................... 150

Заключение...................................................................................... 151

Список литературы............................................................................. 155

Список принятых сокращений

ЖК - жирные кислоты

ГлЦер - гликоцерамиды

ГлИФЦер - гликоинозитолфосфоцерамиды

ИФЦер - инозитолфосфоцерамиды

ДАГ - диацилглицерины

ДГТС - диацилглицерилтриметилгомосерины

ДФГ - дифосфатидилглицерины

ДГДГ - дигалактозилдиацилглицерины

МАПК - митоген-активируемая протеинкиназа

МГДГ - моногалактозилдиацилглицерины

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПК - протеинкиназа

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ТАГ - триацилглицерины

ФГ - фосфатидилглицерины

ФИ - фосфатидилинозиты

ФК - фосфатидные кислоты

ФЛ - фосфолипаза

ФС - фосфатидилсерины

ФХ - фосфатидилхолины

ФЭ - фосфатидилэтаноламины

ЭПС - эндоплазматическая сеть

8АМ - 8-аденозилметионин

/

Введение

Актуальность темы исследования. Способность к морфогенезу - одно из фундаментальных свойств живых организмов, проявляющееся в образовании одно- или многоклеточных структур определенной формы. У многоклеточных животных и растений морфогенез реализуется в пространственном распределении клеток в ходе эмбриогенеза и, на более поздних стадиях развития, образовании истинных тканей. У высших грибов морфогенез представляет собой образование разнообразных по размеру и форме клеток (от сферических дрожжеподобных до высокополяризованных клеток мицелия), а также организацию из них сложных нетканевых структур (плодовых тел, склероциев и др.).

Неотъемлемым свойством клеток, участвующих в морфогенетическом ответе, является способность к дифференцировке - приобретению морфологической и функциональной специализации. Процессы дифференцировки грибных клеток затрагивают изменения типа роста (диморфизм), формы клеток, паттерна ветвления и септирования гиф, химического состава цитоплазмы, органелл, клеточной стенки и мембран. Морфологическое разнообразие клеток грибов изучено достаточно подробно у представителей разных таксонов (Stalpers, 1978; Clemen9on, 2004), в то время как молекулярно-физиологические основы дифференцировки и морфогенеза исследованы на ограниченном круге модельных объектов, большинство из которых составляют дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans, мицелиальные грибы Neurospora crassa, Aspergillus spp. и др. аскомицеты (Moore, 1998; Воусе, Andrianopoulos, 2006).

Данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе клеточной дифференцировки и морфогенеза у базидиальных грибов, фрагментарны. При этом в литературе имеются лишь отдельные сведения об участии липидов в регуляции этих процессов. В частности, получены данные о взаимосвязи состава мембранных фосфолипидов и процессов, связанных с физиологией грибных спор (экзогенный и эндогенный покой, прорастание), формированием плодовых тел (Михайлова и др., 1993; Феофилова и др., 1998, 2004; Sakai, Kajiwara, 2004, 2005; Терёшина и др., 2007). Выявлены морфогенные свойства отдельных молекулярных видов сфинголипидов, высказано предположение о зависимости состава этой группы липидов от интенсивности ростовых процессов и степени цитодифференцировки (Kawai, 1983, 1989; Котлова и др., 2009). При этом до сих пор остается неисследованным участие мембранных липидов в образовании специализированных клеток и анаморф, не сформулировано целостное представление о функционировании всего комплекса липид-зависимых регуляторных систем в процессе развития грибов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выявление взаимосвязи процессов синтеза определенных классов мембранных липидов и основных этапов развития базидиальных грибов. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) на примере нескольких модельных видов проследить, как меняется состав и содержание мембранных липидов в ходе развития поверхностных культур базидиальных грибов;

2) выявить универсальные изменения липидного компонента мембран, происходящие на определенных этапах морфогенеза базидиомицетов;

3) установить изменения в составе и содержании мембранных липидов, возникающие в условиях нарушения развития грибных культур, вызванного дефицитом элементов минерального питания;

4) оценить биоэффекторные (морфогенные) свойства отдельных классов и молекулярных видов липидов (с использованием специфических ингибиторов синтеза и экзогенных липидов, введенных в среду культивирования).

Научная новизна. В работе использован оригинальный подход к изучению роли липидов в морфогенезе базидиомицетов, заключающийся в комплексном исследовании динамики их состава в процессе нормального и нарушенного развития поверхностных культур грибов, изучении участия экзогенных липидов и ингибиторов их синтеза в формировании морфогенетического ответа.

Получены новые сведения о составе мембранных фосфо-, сфинго- и бетаиновых липидов у имеющих прикладное значение базидиомицетов Flammulina velutipes, Pholiota highlandensis, Schizophyllum commune, а также ранее не изученного в этом плане Abortiporus biennis.

На основании результатов исследования изменения соотношения двух основных классов мембранных фосфолипидов, фосфатидилхолинов (ФХ) и фосфатидилэтаноламинов (ФЭ) в онтогенезе четырех видов базидиомицетов выдвинута гипотеза об обратной зависимости между относительным содержанием ФХ и степенью клеточной дифференцировки.

Впервые показано, что недостаток элементов питания в поверхностных культурах базидиомицетов может сопровождаться индукцией синтеза липидов бетаинового типа. Накопление бетаиновых липидов происходит на фоне появления монилиоидных гиф и подавления плодообразования.

Получены новые сведения о зависимости биоэффекторных свойств гликоцерамидов (ГлЦер) от их структуры.

Практическая значимость результатов. Изучение эндогенных механизмов регуляции роста и морфогенеза грибов открывает пути к развитию способов управления скоростью роста и направлением развития патогенных и аллергенных грибов, грибов-биодеструкторов памятников архитектуры и библиотечных фондов, экономически важных культур съедобных грибов и грибов-продуцентов ценных вторичных соединений, а также редких охраняемых видов и грибов, используемых в биодеградации ксенобиотиков. Результаты исследования способствуют расширению представлений о биоэффекторных свойствах липидных молекул, которые могут быть востребованы для разработки подходов к управлению процессами роста и развития грибов посредством модификации их метаболизма.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 48-й, 50-й и 52-й Международных конференциях по фундаментальным исследованиям липидов ICBL (Финляндия, Турку, 2007; Германия, Регенсбург, 2009; Польша Варшава, 2011), рабочем совещании «Microbial Lipids, From Genomics to Lipidomics FEBS» (Австрия, Вена, 2010), 7 Конгрессе по липидомике «Lipidomics congress: Lipids in All States» (Франция, Англет-Биарритц, 2010), II и III съездах микологов России (Москва, 2010, 2012), III Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), 7 Международной конференции «Mushroom Biology and Mushroom Products» (Франция, Аркашон, 2011), Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (Санкт-Петербург, 2012), Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012).

Связь работы с научными программами. Работа проводилась в рамках исследований по плану НИР лаборатории биохимии грибов БИН РАН, поддержана грантами РФФИ (№ 09-04-01634а, 11-04-01704а, 12-04-31213) и грантами Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (ГК № П1167, П1373).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Благодарности. Автор выражает сердечную благодарность Котловой Екатерине

Робертовне, чьи идеи и опыт легли в основу работы, за руководство, неоценимую помощь и

поддержку в процессе подготовки диссертации. Искреннюю признательность хочется

выразить всем сотрудникам лабораторий биохимии грибов и аналитической фитохимии

БИН РАН за помощь в проведении экспериментов и ценные консультации. Особую

признательность выражаю заведующей лабораторией биохимии грибов БИН РАН

7

Псурцевой Надежде Васильевне и сотруднику лаборатории Кияшко Анне Александровне за ценные рекомендации при подборе объектов исследования, советы и указания, данные при проведении морфологических исследований. Глубокую благодарность хочется выразить Беловой Нине Васильевне за обсуждение результатов и интерпретацию полученных данных в свете новейших представлений в области экспериментальной микологии и химии природных соединений. Автор выражает искреннюю признательность Наталии Фёдоровне Синютиной - основателю школы растительной липидологии в Санкт-Петербурге и идейному вдохновителю исследований структуры и метаболизма сфинголипидов. Глубокую благодарность автор выражает заведующему лабораторией аналитической фитохимии БИН РАН Шаварде Алексею Леонидовичу за неоценимую помощь в организации и проведении хроматографических и масс-спектрометрических исследований, а также консультации в области структурного анализа низкомолекулярных соединений. Отдельно хотелось бы поблагодарить сотрудника лаборатории аналитической фитохимии Виноградскую Марию Анатольевну за всестороннюю помощь и ценные обсуждения. Большую признательность автор выражает сотруднику лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии Института аналитического приборостроения РАН Александру Валерьевичу Новикову за помощь в проведении анализа состава молекулярных видов липидов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Также автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой физиологии и биохимии растений СПбГУ Сергею Семёновичу Медведеву за организацию работ в научно-образовательном центре Санкт-Петербургского государственного университета, в частности, исследований с использованием ГЖХ-МС. Автор благодарит сотрудников лаборатории экологии растительных сообществ БИН РАН Наталью Вадимовну Алексееву-Попову, Ирину Валерьевну Дроздову и Аллу Игоревну Беляеву за содействие в проведении анализа элементного состава питательных сред.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфогенез базидиальных грибов и его регуляция 1.1.1. Общая характеристика

Морфогенез базидиальных грибов включает разнообразные процессы, в ходе которых образуются многочисленные типы специализированных клеток - вегетативных гиф (этап развития вегетативного мицелия) и генеративных структур (этапы бесполого и полового размножения) (рис. 1).

Для описания типов гиф и органов спороношения в данной работе была принята следующая терминологиия: «вегетативная гифа» - недифференцированая гифа вегетативного мицелия, «генеративная гифа» - недифференцированная гифа плодового тела (базидиомы) (Сіешеп^оп, 2004), анаморфа - орган бесполого размножения, ни морфологически, ни кариологически не соответствующий совершенной стадии; телеоморфа - репродуктивный орган, морфологически и/или кариологически специализированный для распростарнения мейоспор или их гомологов (партеногенетических базидиоспор) ^єгєбідЬ, 1979; Решетников, 1991).

Рис. 1. Жизненный цикл базидиальных грибов: 1 - прорастание базидиоспоры (вегетативный рост); 2 - образование пресоматического гомокариотического мицелия (вегетативный рост); 3 и 5 - образование анаморф (бесполое размножение); 4 - соматогамия и образование дикариотического мицелия с пряжками (вегетативный рост); 6 - формирование телеоморф; 7 - кариогамия и формирование базидиоспор (половое размножение) (по С1етеп90п, 2004).

1.1.2. Прорастание покоящихся клеток (спор/конидий)

Развитие колонии базидиального гриба начинается с прорастания споры (или конидии). Спора представляет собой особую стадию жизненного цикла и является клеткой, находящейся в состоянии покоя (Феофилова, 2003). При этом покой грибов отличается от покоя бактерий и растений: споры грибов находятся в состоянии не анабиоза, а гипометаболизма (при этом снижение интенсивности метаболизма не превышает 50%) (Феофилова и др., 2012). Процесс прорастания сопряжен с выходом клетки из покоящегося состояния и переходом к активному росту - сначала изотропному, а затем поляризован